JP2018537090A - 神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
a)ヒトTrkB以下の残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341のうち1以上と相互作用し得るか;
b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近し得るか;
c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372の群から選択される残基が変異したヒトTrkBと、突然変異を持たないヒトTrkBに比べて変更された親和性で結合し得るか;
d)ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
b)ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
(a)配列番号28内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号28内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(c)配列番号27内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
「TrkB」は、本明細書で使用する場合、天然、内因性または組換え型のTrkBタンパク質を意味する。TrkBは、リガンドである脳由来神経栄養因子(BDNF)またはニューロトロフィン−4(NT−4/NT−4/5)の受容体である。BDNFおよびNT−4は両方ともTrkBと結合することができ、多くの一般的なシグナル伝達経路を活性化し得る。非共有結合性ホモダイマーリガンドであるBDNFまたはNT−4は、受容体チロシンキナーゼであるTrkBを活性化する。活性化されたTrkBは、(a)細胞生存、(b)ニューロン修復、および/または(c)ニューロン可塑性を調節することができる。
1.抗体またはそのフラグメントと抗原に由来するペプチドとの結合(有意な結合を示すペプチドは、「エピトープ」を含むと見なされる)。
2.水素重水素交換(非複合体形成抗原に比べて重水素組み込みに耐性のある複合体形成抗原に由来するペプチドは、「エピトープ」を含むと考えられる)。
3.突然変異誘発試験(例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発、結合タンパク質との結合を有意に変更する抗原の変異位置は「エピトープ」の一部を形成すると考えられる)。
1.BDNFに誘導性される、およびNT−4により誘導される促進作用を増強する
2.TrkBの細胞表面レベルを維持する
3.カニクイザルTrkBとの交差反応性
a)以下のヒトTrkB残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373およびGlu341のうち1以上と相互作用し得るか;
b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近し得るか;
c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
d)ヒトTrkBと結合し、かつ、
非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
b)ヒトTrkBと結合し、かつ、重非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて水素の組み込みに対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;または
c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
(a)Y32のI、H、F、T、N、C、E、もしくはDによる置換;I34のV、MもしくはWによる置換;およびN35のH、E、Q、S、YもしくはTによる置換のうち1つまたは組合せを有するCDRH1の変異体;および/または
(b)I51のL、V、T、SもしくはNによる置換を有するCDRH2の変異体;および/または
(c)Y102のH、V、I、S、DもしくはGによる置換を有するCDRH3の変異体;および/または
(d)L33のM、V、IもしくはFによる置換;およびH34のA、G、N、S、VもしくはFによる置換のうち1つもしくは組合せを有するCDRL1の変異体;および/または
(e)V51のA、TもしくはGによる置換を有するCDRL2の変異体;および/または
(f)Q89のS、G、FもしくはLによる置換;Q90のHもしくはNによる置換;L96のP、Y、R、I、WもしくはFによる置換のうち1つもしくは組合せを有するCDRL3の変異体
を含んでなり得る。
(a)配列番号30内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号30内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号30内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号29内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号29内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号29内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち1以上を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
(a)配列番号30内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号30内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号30内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号29内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号29内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号29内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも2つのCDR、少なくとも3つのCDR、少なくとも4つのCDRまたは少なくとも5つのCDRまたは6つ総てのCDRを含んでなる。
(a)配列番号32内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号32内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号32内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号31内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号31内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号31内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち1以上を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
(a)配列番号32内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号32内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号32内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号31内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号31内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号31内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも2つのCDR、少なくとも3つのCDR、少なくとも4つのCDRまたは少なくとも5つのCDRまたは6つ総てのCDRを含んでなる。
実施形態1.BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用を増強するTrkB結合アゴニスト。
(a)(i)配列番号27からのCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号28からのCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択されるCDRのいずれかのうちいずれか1つもしくは組合せ;または
(ii)各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有する(i)のCDR変異体;または
(b)配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/もしくは配列番号41の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVL領域
を含んでなるTrkB結合アゴニスト。
(a)配列番号6のCDRH1;
(b)配列番号7のCDRH2;
(c)配列番号8のCDRH3;
(d)配列番号3のCDRL1;
(e)配列番号4のCDRL2;および/または
(f)配列番号5のCDRL3
のうちいずれか1つまたは組合せを含んでなるTrkB結合アゴニスト。
(a)ヒト化VH領域、またはヒト化重鎖(HC)配列;および/または
(b)ヒト化VL領域、またはヒト化軽鎖(LC)配列
を含んでなる、実施形態15〜18のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
(a)配列番号40のVH領域;および/または
(b)配列番号41のVL領域
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
(a)配列番号42と少なくとも80%同一の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43と少なくとも80%同一の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、実施形態15〜21のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
(a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
TrkB受容体に対するマウスモノクローナル抗体は、HEK293−6E細胞株発現および精製を用いて作製された組換えヒトTrkB細胞外ドメイン(以下、TrkB−ECDと呼称、配列番号1、D1−D2−D3−D4−D5−JM、C32−H430、399アミノ酸)によるBalb/cマウスの免疫誘導により作製した。免疫誘導に用いたTrkB−ECDは、GSAリンカーを介してFLAGタグを付加し、C末端にHisタグ(5His残基)を有した(FLAGタグ−GSA−C32−H430−His5)。ハイブリドーマ融合クローンのスクリーニング(約3000ウェル)は、(i)直接的抗原ELISA(すなわち、TrkB−ECDと結合する)と(ii)TrkB活性化依存性NFATプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイ(すなわち、TrkBのアゴニスト)の間に相関を示したクローンを選択することにより行った。この選択基準により、マウスアゴニスト抗体1G11、3A3(3B3と同じ抗体配列)、8E5、5D11(3E10と同じ)、5C7(5E6と同じ抗体配列)、3A4、および2A1を発現する複数のハイブリドーマクローンの同定に至った。
1G11は、ヒトTrkB−ECDと、表面プラズモン共鳴で決定した場合に約42nM(kon=5.66×104/Ms、koff=0.00239/秒)の親和性で結合することを示した。1G11の親和性を表3に、同定された他のアゴニスト抗体の親和性とともに示す。
TrkAまたはTrkBまたはTrkCのいずれかを発現するCHO−K1細胞におけるTrk活性化依存性NFATプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイを用いたTrkファミリー受容体に対する1G11の選択性の評価から、1G11はTrkB受容体発現細胞でリポーター遺伝子発現を選択的に誘導したが、TrkAまたはTrkC受容体発現細胞では供試濃度(0.00006〜125nM)では誘導しなった。対照として、同族リガンド(TrkAに対してはNGF、TrkBに対してはBDNFおよびTrkCに対してはNT−3)は、対応するTrk受容体発現細胞において匹敵するレベルのリポーター遺伝子発現を誘導した。1G11はまた、汎ニューロトロフィン受容体p75NTRとの結合能に関しても試験した。細胞に基づく結合アッセイは、p75NTR受容体に対する1G11の検出可能な結合を示さなかった。TrkBアゴニストの受容体選択性を表3にまとめる。
1G11は、齧歯類(マウス、ラット)、カニクイザル、およびヒトTrkB受容体と結合し、活性化する。2A1および5D11はまた、ラット、マウスおよびヒトTrkB受容体も活性化する。興味深いことに、3A3および8E5は、ヒトTrkB受容体のみを活性化し、齧歯類TrkB受容体を活性化しない。この種交差反応性は、異種細胞株または対応する種に由来する初代細胞またはヒトiPSC由来細胞において組換え発現されたTrkB受容体を用いて試験した。TrkBアゴニストの種選択性を表3にまとめる。
CHO−K1を安定発現するヒト全長TrkB受容体(配列番号2)を1G11で処理すると、TrkBのリン酸化レベル(pTrkB、Y515)により測定した場合に3.1±2.1nM(平均±S.D.、n=8)の平均EC50でTrkBの活性化をもたらした。TrkBアゴニストのTrkB活性化効果を表3にまとめる。1G11はそれ自体、同族リガンドBDNF(ならびにNT−4)最大応答の約30〜40%のTrkB受容体を活性化する。
TrkB受容体に対する1G11の活性化効果を、BDNFの存在下および不在下の両方でTrkBリン酸化により判定した。BDNFの存在下でのTrkBアゴニストの競合効果は、TrkBリン酸化の低下として定義された。全長TrkB受容体を過剰発現すCHO細胞における、飽和BDNF濃度(10nM、EC100)の存在下でのTrkBリン酸化に対する種々の濃度の1G11の効果の評価は、1G11がTrkBに関してBDNFと競合しないことを明らかにした。BDNFと競合することが同定された唯一TrkBアゴニストが5D11であり、これはBDNFにより誘導されるTrkBリン酸化を約50%低下させた。TrkBアゴニストのBDNF競合結果を表3にまとめる。
TrkBアゴニストmAbのエピトープ結合特性を分析するために、競合アッセイを、TrkBアゴニストが互いに競合し合うかを決定し、TrkB上の類似または重複するエピトープと結合するものを一緒に分類することを可能とするように設定した。TrkB−ECDをチップ表面に固定し、単一のTrkBアゴニストmAbをTrkBとの結合のためにフローセルに注入した。次に、第2のTrkBアゴニストmAbを注入し、第1のTrkBアゴニストmAbの存在下でのTrkB−ECDに対するその結合能を評価した。競合は、第2のTrkBアゴニストの結合が20%未満である「無し」;第2のTrkBアゴニストの結合が20〜60%である「部分的」;および第2のTrkBアゴニストの結合が60%を超える「有り」として分類した。従って、第2のTrkBアゴニストの結合「無し」は競合無しと結論付けられ、よって、非重複エピトープと結合するこれら2つのTrkBアゴニスト、あるいはまた第1のTrkBアゴニストの結合は、TrkB−ECDコンフォメーションを第2のTrkBアゴニストが結合できないような様式で変化させる。「部分的」および「有り」は、TrkB上の類似または重複するエピトープとの結合に関する2つのTrkBアゴニストの競合として結論付けられた。
BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用に対する1G11の増強効果を、BDNFの存在下でTrkBリン酸化レベル(pTrkB、Y515)を測定することにより評価した。全長TrkB受容体(配列番号2)を過剰発現するCHO細胞における、飽和BDNF濃度(10nM、EC100)の存在下でのTrkBに対する種々の濃度の1G11の効果の評価は、図2に示されるように最大応答で表した場合、処理30分後のTrkB活性の化定常レベルを増強するという結果を示した(BDNF−100%;BDNF+1G11−約100%〜145%)。
同様に、1G11は、NT−4と競合できず、かつ、飽和レベルのNT−4の存在下でNT−4により誘導されるTrkBの促進作用に対する「増強」効果を示し得なかった(NT−4−100%;NT−4+1G11−約130%;表3)。従って、3A3および8E5もまたNT−4により誘導されるTrkBの促進作用に対して増強効果を有すると予想される。
1G11は、濃度依存的にヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株において神経突起の生存を増進し、神経突起の成長を誘導した(それぞれ平均EC500.025±0.01nMおよび0.19±0.06nM)。1G11は、ラット脳および脊髄由来ニューロン、マウス脳由来ニューロンで内因的に発現されたTrkB受容体、およびCHO細胞において組換え発現されたカニクイザルTrkBを活性化した。
従来技術によりTrkBアゴニストの配列決定を行った。CDRをKabatにより決定し、表4に1G11、3A3、8E5、および5D11に関して示す(注:異なるナンバリング慣行により決定された1G11に関するCDR領域は表1に示す)。1G11(配列番号27および28)、3A3(配列番号29および30)、8E5(配列番号31および32)、ならびに5D11(配列番号33および34)のそれぞれの全長マウス配列(重鎖および軽鎖)も表4に示す。
TrkB一次アミノ酸配列はマウス、ラット、カニクイザルおよびヒト間で保存性が高く(全長配列の95%)、特に、実施例1で同定された総てのTrkBアゴニストが結合する細胞外ドメインで保存されている。TrkB上の結合エピトープを決定するために、ドメイン欠失およびアラニンスキャニング突然変異誘発(表面プラズモン共鳴を使用)によるエピトープマッピング試験ならびにTrkB ECD(配列番号1)を用いたX線結晶試験を行った。TrkB ECDは、5つのドメイン(D1−D3:C32〜C194; D4:G195〜V283;D5:H284〜G380)と短い膜近接JM領域(W381〜H430)を含む。エピトープマッピング試験に用いたTrkB−ECDは、GSAリンカーを介してFLAGタグが付加され、C末端にHisタグ(5His残基)を有した(FLAGタグ−GSA−C32−H430−His5)。
TrkBのD5ドメイン(残基286〜384)はリガンド(BDNF/NT−4)との結合に関して全長TrkBに取って代わり得ることが知られている。TrkBのリガンド結合部位内には、「保存パッチ」と「特異性パッチ」の2つの接触領域が存在する。保存パッチ内のTrkB D5の接触残基は、AB、C’DおよびEF βシートの間のループとD5ドメインのC末端に由来する。TrkBの保存パッチはリガンド(BDNF/NT−4)の軸に結合する。特異性パッチにおけるTrkB D5の接触残基は、ABED βシートの外面に由来する。TrkBの特異性パッチは、非配位形態では配向をとらず、TrkBとの結合時に配向するようになるリガンド(BDNF/NT−4)のN末端と結合する。BDNF/NT−4ホモダイマーと2つのTrkB D5ドメインの間の構造的相互作用を図3にまとめる。
種々のTrkBドメイン欠失変異体を用いた1G11の最初の表面プラズモン共鳴結合分析により、1G11はTrkB−ECD(C32〜H430)、D4−D5ドメイン変異体(P197〜H430)、およびD5ドメイン変異体(H284〜H430)と結合するが、D1−D3ドメイン変異体(C32〜L196)とは結合しないことが明らかになった。
・1G11キメラFab1残基との直接的相互作用
Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375
・1G11キメラFab1残基との直接的相互作用、および水を介した間接的相互作用
Lys372、Gln373
・水を介した間接的相互作用のみ
Glu341
TrkB−ECD内、ほとんどはD4−D5−JMドメイン内の約80の単一点アラニン突然変異体を用いた3A3の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として9つのアミノ酸が同定された(E398、Y397、D399、Y400>D394、I396>V395、N389、T402)。このデータを表5にまとめる。これらの残基は総て、TrkBのD5ドメインのC末端で、膜貫通領域のN末端であるJM領域にある(図7参照−JM残基はβ−ストランド形状を用いて延伸した)。この膜近接(JM)領域は、結晶構造が存在しなければ、長いフレキシブルリンカー領域であると仮定される。このJM領域もリガンドとの結合に重要であり得ると思われる。
8E5の結合エピトープを決定する目的で、アラニンスキャン突然変異誘発研究も結晶学的研究も行われなかった。しかしながら、8E5はTrkBとの結合に関して1G11(および3A3)と競合し、従って、これらのエピトープは何らかの形で重複し(上記の実施例1.6参照)か、またはJMもしくはD5ドメインとの結合が他の抗体の結合エピトープを変化させてコンフォメーション変化をもたらし得ることに着目することが重要である。8E5はまた、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強も示す(上記実施例1.7参照)。8E5は3A3と同様にヒトTrkB特異的であると事実は、このエピトープも3A3と同様に、おそらく、その配列が齧歯類とヒトの間で異なるJM領域内にあることを暗示している(表5参照)。
TrkB−ECD内、ほとんどはD4−D5−JMドメイン内の約80の単一点アラニン突然変異体を用いた5D11の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として6つのアミノ酸が同定された(N350>H299、D349>H300、K328、K333)。このデータを表5にまとめる。図8は、5D11のエピトープはリガンド結合部位(D5ドメインのAB、C’DおよびEF βシート間のループ;およびD βシート)にあることを示す。これは、TrkBリン酸化アッセイで測定した場合に5D11がBDNFと競合するという事実と完全に一致する。
実施例1および2からの結果に基づけば、(i)TrkBのBDNF結合部位に近接し、特に、リガンドのN末端と結合する特異性パッチの近位にあるTrkBエピトープと結合し、かつ、BDNF/NT−4の存在下で増強または安定化されるTrkBとの結合を可能とするTrkBアゴニスト:すなわち、TrkB−BDNF増強剤;(ii)リガンド結合部位内にまたはそれに近接して結合し、かつ、受容体とリガンドの間の相互作用を不安定にするTrkBアゴニスト:すなわち、BDNF競合物;および(iii)BDNF結合部位から離れたエピトープに結合するTrkBアゴニスト、すなわち、増強機能を持たない単純なアゴニストが存在する。
数種の他の潜在的タンパク質パートナーの存在下または不在下での、hisタグを有するD5−JM TrkBの交換比をモニタリングするためにHDX−MSを使用した。以下のタンパク質溶液は、個々の成分を、50mMリン酸Na、150mM NaCl pH7.0の非重水素化H2Oバッファーを希釈することにより調製した。
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);1G11 mAb(40μM;総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);3A3 mAb(40μM総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);BDNF(40μM;総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);1G11 mAb(20μM);BDNF(20μM)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);3A3 mAb(20μM);BDNF(20μM)
1G11の存在下のTrkBは、TrkBペプチドに見られる重水素交換速度の特性に有意な変化を示した。画分の重水素化合物更新の違いのプロット(図9)は、TrkBペプチド領域284〜291に強い重水素化保護を示す。これは検討した総ての時点にわたって強い保護を維持し、この領域がTrkBと1G11との相互作用におそらく重要であることを示唆する。より微妙な交換保護がTrkBの中央領域およそ316〜380に見られ、ここにおける付加的残基がこの相互作用に役割を果たし得ることを示唆する。
3.1 ヒト化
1G11、3A3および5D11をヒト化した。これらの配列は次の通りである。
ヒト化1G11重鎖可変(VH)領域−配列番号40;軽鎖可変(VL)領域−配列番号41;重鎖(HC)−配列番号42;軽鎖(LC)−配列番号43;HCをコードするDNA−配列番号44;LCをコードするDNA−配列番号45。
ヒト化3A3重鎖可変(VH)領域−配列番号46;軽鎖可変(VL)領域−配列番号47;重鎖(HC)−配列番号48;軽鎖(LC)−配列番号49;HCをコードするDNA−配列番号50;LCをコードするDNA−配列番号51。
ヒト化5D11重鎖可変(VH)領域−配列番号52;軽鎖可変(VL)領域−配列番号53;重鎖(HC)−配列番号54;軽鎖(LC)−配列番号55;HCをコードするDNA−配列番号56;LCをコードするDNA−配列番号57。
TrkBに対する抗体の結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴、ならびにTrkBリン酸化アッセイを含むいくつかのアッセイで、ヒト化1G11をマウス1G11と比較した。これらのアッセイにおいて、ヒト化1G11は1G11に匹敵し、ヒト化の成功が確認される。ヒト化1G11は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、1:1結合様式で、それぞれ約55nMおよび約60nMの親和性で組換えヒトおよびカニクイザルTrkB−ECDと結合した。ヒト化1G11は、ヒト全長TrkB受容体を安定に過剰発現するCHO−K1細胞において、リン酸化TrkBのレベルにより測定した場合、EC50 0.65±0.14nM(平均±SD、n=3)でヒトTrkB受容体を活性化した。ヒト化1G11はヒトTrkB受容体を選択的に活性化したが、ヒトTrkAまたはTrkC受容体を選択的に活性化することはなく、また、齧歯類(マウス、ラット)、カニクイザルおよびヒトTrkB受容体と交差反応し、これらを活性化する。
ニューロン生存のSRAラットモデル
ニューロン生存に対する1G11のin vivo効果を、引き抜き(一側性)により誘発される脊髄運動ニューロン変性のラットモデルで評価した。簡単に述べれば、若年成体スプラーグ・ドーリー(sprague-dawley)ラットにおいて手術により第4腰髄節(L4)から前根を引き抜き、1週間回復させた後、静脈内に(単回ボーラスとして)またはくも膜下腔内(持続的)に1G11による介入を行った。持続的くも膜下腔内注入の場合、カテーテルをくも膜下腔に、L4−L5間の椎間孔を通して挿入し、他端を首の背部の比較に埋め込んだalzet 2002ミニ浸透圧ポンプに接続した。抗体介入まで、ビヒクル処方物をそのポンプにロードし、0.5μl/時の速度で送達した。
ニューロン生存(上記の通り)に対する1G11の効果に加え、1G11の機能的効果をコンジェニックB6Cg−Tg(hSOD1G93A)1Gur/Jトランスジェニックマウスにおいて検討した。hSOD1 Tgマウスは、疾患が発症および進行すると、種々の歩行パラメーターに減損を示す。ビヒクル処方物(陰性対照)はそうではなかったが、1G11(0.3mg/kg)は、雌のコホート(約3.5か月齢)において、28日間2週間毎に(介入期間中2回)尾静脈ボーラス注射により投与した場合に、hSOD1−ビヒクル対照に比べてhSOD1マウスで種々の程度まで歩行特徴を有意に改善し、走行速度、歩調(歩/秒)、歩行周期時間、および立脚時間は野生型同腹子のものにほぼ匹敵し;歩調に対する効果は比較的大きくなく;揺動速度に対する効果はずっと低かった。これらの結果は、1G11は、静脈内に投与した場合、hSOD1G93Aトランスジェニックマウスにおける歩行欠陥を改善することができたことを示す。
脊髄ChAT陽性ニューロンに対する1G11の効果を評価するために、雄マウス(試験の開始時におよそ50日齢、各群12個体のマウス)に表7に従って投与を行った。試験は無作為化、プラセボ・アイソタイプ対照、二重盲検様式で行った。
配列番号1 TrkB-ECD
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Claims (55)
- BDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強する、TrkB結合アゴニスト。
- 細胞表面のTrkBレベルを維持する、TrkB結合アゴニスト。
- TrkBのD5ドメインのβシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域に含まれるエピトープと結合する、TrkB結合アゴニスト。
- a)ヒトTrkBの以下の残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373およびGlu341のうち1以上と相互作用するか;
b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近するか;
c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか;
d)ヒトTrkBと結合し、かつ非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるか;または
e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
TrkB結合アゴニスト。 - TrkBの膜近接領域(W381−H430)内に含まれるエピトープと結合する、TrkB結合アゴニスト。
- a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか;
b)ヒトTrkBと結合し、かつ非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるか;または
c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
TrkB結合アゴニスト。 - TrkBとの結合に関して(a)配列番号27の重鎖配列と配列番号28の軽鎖配列;または(b)配列番号29の重鎖配列と配列番号30の軽鎖配列;または(c)配列番号31の重鎖配列と配列番号32の軽鎖配列を有する参照抗体と競合する、TrkB結合アゴニスト。
- (a)配列番号28内に存在するCDRL1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号28内に存在するCDRL3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(c)配列番号27内に存在するCDRH3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。 - (a)配列番号3内に存在するCDRL1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号5内に存在するCDRL3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(c)配列番号8内に存在するCDRH3、または1、2もしくは3つのアミノ酸を有するその変異体
を含んでなる、請求項8に記載のTrkB結合アゴニスト。 - CDRL1内の修飾は残基R28、S30およびN32(配列番号28からナンバリング)になく、CDRL3内の修飾は残基N92およびS93(配列番号28からナンバリング)になく、かつCDRH3内の修飾は残基R97、Y99およびE100(配列番号27からナンバリング)にない、請求項8または請求項9に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRL1内の修飾は残基I29にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRL1内の修飾は残基N31にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRL3内の修飾は残基S91およびW94にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
- (a)配列番号3内に存在するCDRL1;
(b)配列番号5内に存在するCDRL3;および
(c)配列番号8内に存在するCDRH3
を含んでなる、請求項9に記載のTrkB結合アゴニスト。 - 配列番号27内に存在するCDRH2もしくはその変異体、または配列番号40内に存在するCDRH2もしくはその変異体をさらに含んでなり、前記変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する、請求項8〜14のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRH2が配列番号7内に存在する、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、請求項15に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRH2内の修飾は残基R50(配列番号27からナンバリング)にない、請求項15または請求項16に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRH2内の修飾は残基Y57(配列番号27からナンバリング)にない、請求項17に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRH2が配列番号7内に存在する、請求項16に記載のTrkB結合アゴニスト。
- (a)配列番号28内に存在するCDRL2、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体、および
(b)配列番号27内に存在するCDRH1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
をさらに含んでなる、請求項8〜19のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。 - (a)CDRL2が配列番号4内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体であり;かつ
(b)CDRH1が配列番号6内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、
請求項20に記載のTrkB結合アゴニスト。 - CDRL2内の修飾は残基Y50(配列番号28からナンバリング)になく、かつCDRH1内の修飾は残基Y33(配列番号27からナンバリング)にない、請求項20または請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDRH1内の修飾は残基S31(配列番号27からナンバリング)にない、請求項20または請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。
- (a)CDRL2が配列番号4内に存在し;かつ
(b)CDRH1が配列番号6内に存在する、
請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。 - 配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/または配列番号41の配列と少なくとも76%同一の配列を含んでなるVL領域を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
- (a)配列番号42と少なくとも90%同一の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43と少なくとも85%同一の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。 - 配列番号40または配列番号42に対応する47番がCys、Ser、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnである、請求項25または請求項26に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDR配列が請求項8〜24のいずれか一項に定義される、請求項25〜27のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- CDR配列が請求項8〜24にいずれか一項に定義され、かつ同一性の割合がCDRを除く配列で計算される、請求項25〜27のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- (a)配列番号40のVH領域;および/または
(b)配列番号41のVL領域
を含んでなる、請求項25に記載のTrkB結合アゴニスト。 - (a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、請求項26に記載のTrkB結合アゴニスト。 - TrkBとの結合に関してBDNFおよび/またはNT−4と競合しない、請求項2〜31のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- アゴニストがBDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強する、請求項3〜31のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- BDNFにより誘導されるまたはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用の増強効果が、TrkB結合アゴニストの不在下に比べたTrkB結合アゴニストの存在下での、飽和濃度のBDNFまたはNT−4の存在下でのTrkBの活性化の増大により測定される、請求項1または請求項33に記載のTrkB結合アゴニスト。
- TrkBの活性化の増大がTrkBのリン酸化のレベルの上昇により測定される、請求項34に記載のTrkB結合アゴニスト。
- 飽和濃度のBDNFまたはNT−4の存在下でのTrkBのリン酸化が、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、または少なくとも150%に比べ、TrkB結合アゴニストの不在下では100%である、請求項35に記載のTrkB結合アゴニスト。
- 細胞表面のTrkBレベルを維持する、請求項1または請求項3〜36のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- ヒトおよびカニクイザルTrkBのリン酸化のEC50に5倍以内の差を示す、請求項1〜37のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
- 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列。
- 重鎖をコードする配列番号44;および/または軽鎖をコードする配列番号45を含んでなる、請求項39に記載のTrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列。
- 請求項39または40に定義される1以上の核酸配列を含んでなる、1以上の発現ベクター。
- 請求項39もしくは40に定義される1以上の核酸配列、または請求項41に定義される1以上の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
- 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの生産のための方法であって、請求項42に定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる、方法。
- 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストと薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の1つまたは組合せとを含んでなる、医薬組成物。
- 療法において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
- 神経障害の処置において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
- 神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
- 必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 必要とする対象において神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 神経障害の処置のための請求項44に定義される医薬組成物の製造における、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの使用。
- 神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための請求項44に定義される医薬組成物の製造における、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの使用。
- 障害が神経変性疾患、視神経症、網膜変性病態、難聴を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および別のCNS障害である、請求項46もしくは47に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、請求項48もしくは49に記載の方法、または請求項50もしくは51に記載の使用。
- 障害が視神経症である、請求項52に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
- 障害が筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、アルツハイマー病(AD)、運動ニューロン病、パーキンソン病、プリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパシー、緑内障、前部虚血性視神経症(AION)、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア視神経症、中毒性視神経症 外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢黄斑変性、色素性網膜炎、神経性難聴、内耳性難聴、耳鳴、感音性難聴、混合性難聴、不安、気分障害、鬱病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、サルコペニア、肥満、オピオイド誘発性嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害および脳卒中である、請求項52に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
- 処置が細胞生存、および/またはニューロン修復、および/またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、請求項46〜54のいずれか一項に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
Applications Claiming Priority (7)
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