JP2018537090A - 神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト - Google Patents

神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト Download PDF

Info

Publication number
JP2018537090A
JP2018537090A JP2018525563A JP2018525563A JP2018537090A JP 2018537090 A JP2018537090 A JP 2018537090A JP 2018525563 A JP2018525563 A JP 2018525563A JP 2018525563 A JP2018525563 A JP 2018525563A JP 2018537090 A JP2018537090 A JP 2018537090A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
trkb
seq
binding agonist
sequence
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018525563A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7039468B2 (ja
JP2018537090A5 (ja
Inventor
テジンダー、カウル、ビンダー
ディン、チョン
フェン、シュ
ジアン、ウェンチン
アラン、ピーター、ルイス
マ、インリ
グハン、ナガッパン
ラダ、シャー、パーマー
チウ、ヤンシェン
ヤン、リウチン
チャン、チン
ジョウ、ヤンジャオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Original Assignee
GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd filed Critical GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Publication of JP2018537090A publication Critical patent/JP2018537090A/ja
Publication of JP2018537090A5 publication Critical patent/JP2018537090A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7039468B2 publication Critical patent/JP7039468B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06Antimigraine agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16Anti-Parkinson drugs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20Hypnotics; Sedatives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22Anxiolytics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24Antidepressants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • A61P27/06Antiglaucoma agents or miotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16Otologicals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04Anorexiants; Antiobesity agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

本発明は、TrkB結合アゴニスト、ならびに神経障害および他の障害の処置におけるそのようなアゴニストの使用に関する。本発明はまた、CDR、可変領域、重鎖および軽鎖、ならびにそれらの変異体配列を含んでなる特定のTrkB結合アゴニストに関する。

Description

本発明は、TrkB結合アゴニスト、ならびに神経障害および他の障害の処置におけるそのようなアゴニストの使用に関する。本発明はまた、CDR、可変領域、重鎖および軽鎖、ならびにそれらの変異体配列を含んでなる特定のTrkB結合アゴニストに関する。
神経障害は、世界中で罹患率および有病率が増えており、よって、療法が差し迫って必要である。しかしながら、神経障害は家族型および散発型の両方で表現型が不均質であり、未知の病因を持つ場合が多い。従って、単一の病態機序を標的とすることは、たとえその病態機序の性質がその疾患の重要な「駆動因子」であるとしても、有意な臨床利益を伴って疾患の改善をもたらす見込みが低い。
神経毒性物質の蓄積、炎症、脂質代謝、酸化ストレス、自己貪食、タンパク質分解およびミトコンドリア機能不全を含むいくつかの機構および経路が神経疾患などの神経障害に関連付けられている。しかしながら、それらがこの疾患の原因であるかまたは一次および/または二次傷害の結果であるかは依然として不明である。結果として、これらの個々の機序のいくつかに基づく療法は臨床上奏効しなかった。神経疾患の疾患修飾療法を開発するための多くの努力は、脳における不適切に折り畳まれた毒性タンパク質の蓄積がいくつかの神経変性疾患の重要な病原因子とみなされることを考えて毒素軽減アプローチに従うものであった。しかしながら、アルツハイマー病におけるAβなどの毒性タンパク質を低下させることによる臨床奏効は限定されたものであったが、軽度疾患の患者における最近の治験は有望な結果を示す。
病因(その病態に至る生物学的機序)の標的化は、防止(prophylactic)または予防(preventative)的処置に好適なプローチであり得るが、病態生理学(その病態内で作動する内因性の生物学的機序)の標的化は、既存の神経障害における治療的介入のためのより良いアプローチとなり得る。
ニューロンの生存、機能、可塑性、および恒常性に役割を果たす内因性の神経栄養的および神経保護的経路を標的とすることによる、このもう1つの病態生理学的治療アプローチを使用することが可能である。内因性機構が神経障害において有意にダウンレギュレーションを受けている可能性があることを示す証拠がある。
ニューロトロフィンは、中枢および末梢神経系(それぞれCNSおよびPNS)の発達、維持および機能を調節する内因性の成長因子である。神経成長因子(NGF)ファミリーのリガンドは、主として高親和性Trk受容体[NGFに対するTrkA、BDNF(脳由来神経栄養因子)およびNT−4(ニューロトロフィン4、NT−4/5)に対するTrkB、NT−3(ニューロトロフィン3)に対するTrkC]を介して、かつまた低親和性汎ニューロトロフィン受容体であるp75NTRと結合することにより、シグナルを伝達する。Trk受容体を介するシグナル伝達は通常、細胞生存を増進するが、Trk受容体の不在下でのp75NTRを介したニューロトロフィンのシグナル伝達は、一般に、アポトーシスを助長する。
in vitroおよびin vivoの両方において、CNSニューロンの生存および機能の増進におけるBDNF−TrkB経路の役割を裏づける前臨床的証拠がある。さらに、BDNFを用いた4つの治験がALSにおいて実施されている。加えて、健常ボランティアにおけるTrkBアゴニスト抗体の皮下注射による第I相二重盲検プラセボ対照単一用量漸増試験(治験NCT01262690、スポンサー:ファイザー社)が、浮上した感覚症状の安全性への懸念のために終了した(試験結果は公開されていない)。
要約すると、TrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復または増進が有益であり得る神経障害および他の障害の処置の必要が依然としてある。
本発明は、BDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用を増強するTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、TrkBのD5ドメインのβシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域内に含まれるエピトープと結合するTrkB結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「エピトープ」は、TrkB結合タンパク質と接触する抗原(TrkB)の部分、例えば、TrkB結合タンパク質の4.5Å以内に接近するTrkBの部分を意味する。一つの実施形態では、このTrkB結合アゴニストは、BDNFと競合しない。TrkBこの領域と結合するアゴニストは、
a)ヒトTrkB以下の残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341のうち1以上と相互作用し得るか;
b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近し得るか;
c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372の群から選択される残基が変異したヒトTrkBと、突然変異を持たないヒトTrkBに比べて変更された親和性で結合し得るか;
d)ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
本発明はまた、TrkBの膜近接領域(W381−H430)内に含まれるエピトープと結合するTrkB結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「エピトープ」は、TrkB結合タンパク質と接触する抗原(TrkB)の部分、例えば、TrkB結合タンパク質の4.5Å以内に接近するTrkBの部分を意味する。一つの実施形態では、このTrkB結合アゴニストは、BDNFと競合しない。この領域に結合するアゴニストは、
a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
b)ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
本発明はまた、TrkBとの結合に関して、(a)配列番号27の重鎖配列と配列番号28の軽鎖配列;または(b)配列番号29の重鎖配列と配列番号30の軽鎖配列;または(c)配列番号31の重鎖配列と配列番号32の軽鎖配列を有する参照抗体と競合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、このTrkB結合アゴニストは、BDNFと競合しない。本発明はまた、細胞表面のTrkBのレベルを維持するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、このアゴニストは、BDNFの不在下でTrkBを活性化する。
本発明はまた、(i)配列番号27由来のCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号28由来のCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択されるCDRのいずれか1つもしくは組合せ;または(ii)各CDRにおいて1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有する(i)のCDR変異体を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。特定の実施形態では、特定のCDRは、配列番号27または配列番号28内に存在するが、他のCDRは、配列番号27または配列番号28内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、
(a)配列番号28内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号28内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(c)配列番号27内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、以下のCDR:(a)配列番号6のCDRH1;(b)配列番号7のCDRH2;(c)配列番号8のCDRH3;(d)配列番号3のCDRL1;(e)配列番号4のCDRL2;および/または(f)配列番号5のCDRL3のいずれか1つまたは組合せを含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/または配列番号41の配列と少なくとも76%同一の配列を含んでなるVL領域を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、(a)配列番号42と少なくとも90%同一の重鎖(HC)配列;および/または(b)配列番号43と少なくとも85%同一の軽鎖(LC)配列を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列を提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストをコードする核酸配列を提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される1以上の核酸配列を含んでなる1以上の発現ベクターを提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される1以上の核酸配列、または本明細書で定義される1以上の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストをコードする核酸配列、または本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニストの生産のための方法であって、本明細書で定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる方法を提供する。この方法の一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストが発現され、精製される。
本発明はまた、本明細書に記載の方法により生産されたTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される結合アゴニストと薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の1つまたは組合せを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または前記対象に本明細書で定義される医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または前記対象に本明細書で定義される医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、前記対象に対するBDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、前記対象に対するBDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、療法において使用するための、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経障害の処置において使用するための、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、療法において使用するための、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤を提供する。
本発明はまた、神経障害の処置のための薬剤の生産における、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための薬剤の生産における、本明細書で定義されるTrkB結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害に処置のための薬剤の製造における、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための薬剤の生産における、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤の使用を提供する。
本発明はまた、処置が細胞生存、および/またはニューロン修復、および/またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、本明細書に記載の処置の方法、TrkB結合アゴニスト、または使用を提供する。
図1A:ラット皮質ニューロンにおける経時的な、BDNFおよび1G11により誘導されるTrkBリン酸化およびTrkB下流シグナル伝達およびTrkBの細胞表面レベルのウエスタンブロット。ラット培養皮質ニューロン(in vitroで7日)を37℃で、示されたように0.8nM BDNFまたは7.3nM 1G11で処理した。細胞溶解液(30μgタンパク質)を還元条件下のSDS−PAGEで分離し、示されたように抗体で免疫ブロットした。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を内部対照として使用した。TrkBの細胞表面レベルを測定するために、1G11処理後のラット皮質ニューロンをスルホ−NHS−ビオチンで氷上にて1時間処理し、次いで溶解およびストレプトアビジンアガロースビーズを用いたビオチン化タンパク質の単離を行った。単離されたタンパク質を分離し、抗TrkB抗体で免疫ブロットした。注:Ctrl、培地交換を行った非処理のゼロ時間対照。図1B:経時的全細胞TrkBの割合としてのBDNFおよび1G11により誘導されるTrkBの細胞表面レベル。ラット培養皮質ニューロン(in vitroで7日)を37℃で示されたように0.8nM BDNFまたは7.3nM 1G11で処理した。総TrkBと比較したTrkBの相対的表面レベルを濃度分析により決定した。総TrkBに対する表面TrkBの比を、ゼロ時点の非処理対照と比べた変化倍率として示す。 図2:異なる特性を有するTrkBアゴニスト抗体を示す代表的データ−増強剤および非競合物(3A3、1G11、8E5)、競合物(5D11)、非競合物(2A1、3A4、5C7)。100%活性は、BDNFの飽和濃度でのTrkB活性化、すなわち、10nM EC100を表す。 図3:公開されている構造に基づく、種々の二次構造(βシート、ループ、N末端「Nt」、およびC末端「Ct」)を示すBDNF/NT−4ホモダイマーと2つのTrkB D5ドメインの間の構造的相互作用。 図4:BDNF/NT−4ホモダイマーおよび2つのTrkB D5ドメインおよび1G11の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基を図4Aに示し、共結晶X線結晶学により同定された残基を図4Bに示す。 図5:BDNF/NT−4ホモダイマーおよび2つのTrkB D5ドメインおよび1G11のさらなる構造分析は、NT−4/BDNFのN末端がTrkBと1G11 Fabの重鎖の間の空間に突出している可能性があることを示す。 図6:BDNF/NT−4ホモダイマーおよび2つのTrkB D5ドメインおよび1G11の構造分析に分子表面を加えると、Vκ CDR L1とL3、およびCDRH3がTrkBと密接に相互作用し、TrkBとCDR H1およびH2の間に、BDNFのN末端に適合している可能性が想定され得る溝が存在することが示される。 図7:BDNF/NT−4ホモダイマーと2つのTrkB D5ドメインおよび3A3の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基が示され、これらは総てJM領域(D5ドメインのC末端および膜貫通領域のN末端)にある。JM残基は、β−ストランド形状を用いて延伸された。 図8:BDNF/NT−4ホモダイマーと2つのTrkB D5ドメインおよび5D11の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基を示し、これらはリガンド結合部位にある。 図9は、MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His単独または1G11との複合体に由来するTrkBペプチド間の重水素更新(deuterium update)における画分の違いを示す。 図10は、MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His単独または3A3との複合体に由来するTrkBペプチド間の重水素更新における画分の違いを示す。
発明の詳細な説明
「TrkB」は、本明細書で使用する場合、天然、内因性または組換え型のTrkBタンパク質を意味する。TrkBは、リガンドである脳由来神経栄養因子(BDNF)またはニューロトロフィン−4(NT−4/NT−4/5)の受容体である。BDNFおよびNT−4は両方ともTrkBと結合することができ、多くの一般的なシグナル伝達経路を活性化し得る。非共有結合性ホモダイマーリガンドであるBDNFまたはNT−4は、受容体チロシンキナーゼであるTrkBを活性化する。活性化されたTrkBは、(a)細胞生存、(b)ニューロン修復、および/または(c)ニューロン可塑性を調節することができる。
上記のように、TrkB−BDNFシグナル伝達は、中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)の細胞生存、修復、および可塑性を増進する上で重要な役割を果たす。ほとんどの神経障害の原因要素/機序が異なるとしても、変性を受け得る種々のタイプの細胞生存および機能は効率的なBDNF−TrkBシグナル伝達機構に依存している。従って、アゴニストを用いたTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復または増進は、細胞生存、ニューロン修復およびニューロン可塑性を増進して障害に対する差次的処置を与えると思われる。TrkBの活性化は中枢および末梢両方の作用機序を媒介し得る。
BDNFレベルは、多くの神経学的および病態生理学的疾患において低下しており、表現型/欠乏をこの低下に帰し得ることが報告されている。TrkB受容体レベルが不変のままであるBDNF欠乏の病態生理学的状態下では、投与された治療薬が、(i)TrkBを活性化する(促進する)、(ii)低下したBDNFレベルと競合しない、(iii)低下したBDNFの生理的レベルにより誘導される細胞内シグナル伝達を増強する、および/または(iv)そうでなければ治療薬に対する一時的脱感作をもたらし得るTrkBの細胞表面レベルを維持することが可能であれば、生理的な細胞/系の応答がなお惹起され得る。
本発明に関して、用語「TrkB結合アゴニスト」は、BDNFまたはNT−4の不在下でヒト全長TrkB(配列番号2に示される配列を有する)を促進または活性化する分子を意味する。TrkB結合アゴニストは、それが受容体と結合した際に天然リガンドBDNF/NT−4と同様の生物学的効果をもたらし得る。TrkBは受容体チロシンキナーゼであるので、複数の細胞内シグナル伝達経路を惹起する。促進作用は、増大したTrkBのリン酸化レベル(pTrkB)、増大したAktのリン酸化レベル(p−Akt)、増大したErkのリン酸化レベル(p−Erk)、および/または増大したCrebのリン酸化レベル(p−Creb)の測定を含む、TrkBの活性化により測定され得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、BDNFまたはNT−4の不在下でTrkB受容体を活性化して、BDNF最大応答(100%とする)に対して少なくとも10%、少なくとも20% 少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%または少なくとも60%のpTrkBレベルをもたらし得る。一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、BDNFまたはNT−4の不在下でTrkB受容体を活性化して、NT−4最大応答(100%とする)に対して少なくとも10%、少なくとも20% 少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%または少なくとも60%のpTrkBレベルをもたらし得る。
親和性は、ある分子、例えば、TrkB結合アゴニストの、別の分子、例えば、その標的抗原への、単一の結合部位における結合の強度である。TrkB結合アゴニストのTrkBに対する結合親和性は、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA))、または速度論(例えば、BIACORE(商標)分析)により決定され得る。例えば、実施例1.1(および表1のデータ)に記載されるBiacore(商標)法を、結合親和性を測定するために使用可能である。
本発明の特定のTrkB結合アゴニストは、100nM以下、50nM以下、25nM以下、または10nM以下の(KD)のヒトTrkBまたはヒトTrkB ECDに対する平衡解離定数を示す。KD数値が小さいほど、結合は強くなる。KDの逆数(すなわち、 1/KD)は、単位M−1を有する平衡会合定数(KA)である。当業者は、KA数値が大きいほど結合が強くなることを認識するであろう。解離速度定数(kd)または「koff」は、TrkB結合アゴニスト:TrkB複合体の安定性、すなわち、秒当たりに減衰する複合体の画分を表す。例えば、特定のTrkBアゴニストとヒトTrkBまたはヒトTrkB ECDの間の解離速度定数koffは、10×10−4/秒以下、9×10−4/秒以下、8×10−4/秒以下、7×10−4/秒以下、6×10−4/秒以下、5×10−4/秒以下、または4×10−4/秒以下である。会合速度定数(ka)または「kon」は、TrkB結合アゴニスト:TrkB複合体形成の割合を表す。例えば、特定のTrkBアゴニストとヒトTrkBまたはヒトTrkB ECDの間会合速度定数konは、3×10/Ms以上、4×10/Ms以上、5×10/Ms以上、6×10/Ms以上、または7×10/Ms以上である。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、全長ヒトTrkBと特異的に結合し、ヒトTrkAまたはヒトTrkCまたはヒトp75NTRとは結合しない。用語「特異的に結合する」とは、TrkB結合アゴニストが、他の(例えば、無関連の)タンパク質と全くまたは有意には結合することなく、TrkBと結合することを意味する。本明細書に記載のTrkB結合アゴニストは、それらがTrkA、TrkCおよび/またはp75NTRと結合する場合の少なくとも10、25、50、100、または1000倍の親和性でTrkBと結合し得る。このことは、これらのTrkB結合アゴニストを、TrkBおよびp75NTR(細胞死を助長する)の両方を活性化し得るBDNFから区別することが認識されるであろう。
本発明の特定のTrkBアゴニストは、BDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkB促進作用を増強する。「増強する」は、本明細書おいて、TrkBのBDNFにより誘導される促進作用および/またはNT−4により誘導される促進作用がTrkBアゴニストの存在下でより有効となることを意味して使用される。BDNFにより誘導される促進作用は、TrkBの活性化、例えば、細胞内シグナル伝達を評価することにより測定することができる。飽和濃度(すなわち、EC100)のBDNFまたはNT−4を、TrkB結合アゴニストの不在下での各リガンドに対するTrkBの100%活性化の基準として使用することができる。BDNFにより誘導される促進作用の増強は、TrkB結合アゴニストおよび飽和濃度(EC100)のBDNFの存在下での、100%を超えるBDNFにより誘導されるTrkBの活性化と定義することができる。使用可能な飽和濃度のBDNFは10nM(EC100)である。一例では、TrkBの100%の活性化は、BDNFを10nM EC100で用いる場合のTrkBの活性化に相当する。NT−4により誘導される促進作用の増強は、TrkB結合アゴニストおよび飽和濃度(EC100)のNT−4の存在下での100%を超えるNT−4により誘導されるTrkBの活性化として定義することができる。TrkBの活性化は、TrkBのリン酸化(pTrkB)のレベルを決定することにより測定することができる。飽和濃度のBDNFの存在下でのTrkBのリン酸化は、TrkB結合アゴニストの不在下での100%に比べて、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも110%であり得る。例えば、飽和濃度のBDNFの存在下でのTrkBのリン酸化は、TrkB結合アゴニストの不在下での100%に比べて、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、または少なくとも150%であり得る。pTrkBレベルは、TrkB結合アゴニストの存在下および飽和濃度のBDNFの存在下で130%前後であり得る。pTrkBレベルは、TrkB結合アゴニストの存在下および飽和濃度のBDNFの存在下で160%前後であり得る。pTrkBレベルは、TrkB結合アゴニストの存在下および飽和濃度のBDNFの存在下で120%前後であり得る。
増強効果はin vitroにて飽和濃度のBDNFの存在下でのみ測定できるが、この飽和濃度のBDNFは臨床現場では必要であるとは思われないことに留意されたい。TrkB結合アゴニストの増強効果は、BDNFのいずれの濃度でも存在するはずであると仮定される。TrkB受容体レベルが不変のままであるBDNF欠乏の病態生理学的状態下では、TrkB結合アゴニストが、低下したBDNFの生理的レベルにより誘導される細胞内シグナル伝達を増強することができれば、生理的反応が有益となる。
本発明の特定のTrkBアゴニストは、細胞表面のTrkBレベルを維持する。活性化されたチロシンキナーゼ受容体は一般にエンドサイトーシスを受けた後、分解されて細胞表面受容体のダウンレギュレーションをもたらし、それにより、リガンドに対して一時的に不応となって細胞内ホメオスタシスを維持し、TrkB上のBDNFの活性化効果の場合がそうである。TrkB結合アゴニストは、アゴニストの存在下で、時間が経ってもTrkBの細胞表面レベルを維持し得る。例えば、TrkBの細胞表面レベルは、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、または少なくとも10時間維持され得る。TrkB結合アゴニストは、アゴニストの存在下で、TrkBの細胞表面レベルを経時的に増大させ得る。例えば、TrkBの細胞表面レベルは、少なくとも5時間、少なくとも10時間、少なくとも15時間、少なくとも20時間、または少なくとも25時間増大され得る。TrkB結合アゴニストは、アゴニストにより活性化されるTrkBの利用可能な細胞表面レベルを増大させ、かつ/または(b)活性化されたTrkB受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害し得る。TrkB受容体レベルが不変のままであるBDNF欠乏の病態生理学的状態下では、治療的TrkB結合アゴニストが、そうでなければTrkBアゴニストに対する一時的脱感作をもたらし得るTrkBの細胞表面レベルを変更することなくTrkBを活性化することができれば、生理的反応が有益となる。
特定のTrkB結合アゴニストは、TrkBとの結合に関してBDNFおよび/またはNT−4と競合しない。TrkB結合アゴニストとBDNFまたはNT−4の間の競合は、TrkBの活性化を評価するための機能アッセイにより、例えば、BDNFまたはNT−4存在下と不在下の両方でTrkBリン酸化によるTrkBに対するTrkB結合アゴニストの活性化効果を測定することにより、決定され得る。一つの実施形態では、BDNFと競合しないTrkB結合アゴニストは、飽和BDNF濃度(例えば、10nM、EC100)の存在下、漸増濃度のアゴニストに対するTrkBリン酸化に変化を生じない。BDNFと競合しないTrkB結合アゴニストは、飽和BDNF濃度(例えば、10nM、EC100)の存在下、漸増濃度のアゴニストに対するTrkBリン酸化の低下を生じる。一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、アゴニストおよび飽和濃度(EC100)のBDNFの存在下でのリン酸化TrkBの総レベルが、飽和濃度のBDNF単独の存在下でのリン酸化TrkBレベルと同等である、すなわち、総pTrkB(EC100BDNF+アゴニスト)≒総pTrkB(EC100BDNF)の場合に、BDNFと競合しない。同様に、一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、アゴニストおよび飽和濃度(EC100)NT−4の存在下でのリン酸化TrkBの総レベルが、飽和濃度のNT−4単独の存在下でのリン酸化TrkBレベルと同等である、すなわち、総pTrkB(EC100NT−4+アゴニスト)≒総pTrkB(EC100NT−4)の場合に、NT−4と競合しない。リン酸化TrkBのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのBDNFまたはNT−4のいずれかの存在下で測定される平均総pTrkBが範囲内(BDNFまたはNTいずれかの飽和レベル−±3標準偏差の存在下で測定される平均総pTrkB)である場合に、同等であると見なされる。一つの実施形態では、アゴニストおよび飽和レベルのBDNFまたはNT−4のいずれかの存在下で測定される平均総pTrkBは、範囲内(BDNFまたはNT−4いずれかの飽和レベル±2標準偏差の存在下で測定される平均総pTrkB)である。別の実施形態では、アゴニストおよび飽和レベルのBDNFまたはNT−4のいずれかの存在下で測定される平均総pTrkBは、範囲内(BDNFまたはNT−4のいずれかの飽和レベル±1標準偏差の存在下で測定される平均総pTrkB)である。前記実施形態では、リン酸化pTrkBの平均総レベルは、少なくとも3回の読み取りに基づいて計算され、2つの標準偏差(すなわち、アゴニストの存在下で計算される標準偏差およびアゴニストの不在下で計算される標準偏差)のうち大きい方が用いられる。別の実施形態では、リン酸化TrkBのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのBDNFまたはNT−4のいずれかの存在下で測定される平均総pTrkBと飽和レベルのBDNFまたはNT−4の存在下で測定される平均総pTrkBが10%の違いである場合に、同等と見なされる。別の実施形態では、リン酸化TrkBのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのBDNFまたはNT−4のいずれかの存在下で測定される平均総pTrkBと飽和レベルのBDNFまたはNT−4の存在下で測定される平均総pTrkBが5%未満の違いである場合に、同等と見なされる。TrkBとの結合に関してBDNFまたはNT−4と競合しないTrkB結合アゴニストは、そのTrkBアゴニストはTrkBを活性化することができ、かつ、低下したBDNF(またはNT−4)のレベルと競合しないことから、臨床現場で有益である。よって、BDNFおよびNT−4は、TrkB結合アゴニストに加えて、生理的役割を果たし続けることができる。
あるいは、TrkB結合アゴニストとBDNFまたはNT−4の間の競合は、TrkB結合アゴニストおよびBDNFが同じまたは重複するエピトープと結合するかどうか、結合の立体阻害が存在するかどうか、または第1の分子の結合が第2の分子の結合を妨げるもしくは低下させるTrkBのコンフォメーション変化を誘導するかどうかを試験するように設計された競合ELISA、FMATまたはBIAcoreアッセイにより決定され得る。TrkBとの結合に関してTrkB結合アゴニストおよびBDNFまたはNT−4の間の競合は、全くないかまたは最小(すなわち、部分的)であり得る。一つの実施形態では、TrkB−ECDはチップ表面に固定化され、BDNFまたはNT−4のいずれかはフローセルに注入されてよい。次に、TrkB結合アゴニストを注入し、BDNFまたはNT−4の存在下でのTrkB−ECDに対するその結合能を評価した。競合は、TrkBアゴニストの結合が20%未満である「無し」;TrkBアゴニストの結合が20〜60%である「部分的」;およびTrkBアゴニストの結合が60%を超える「有り」として分類することができる。
本発明の特定のTrkB結合アゴニストは、ヒトTrkBと別種由来のTrkBの間で交差反応性を示し得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルTrkBと特異的に結合する。創薬は薬物がヒトで試験される前にマウス系でのリード薬物候補の試験を一般に必要とするので、ことのことは特に有用である。ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザル種に結合できる薬物の提供は、これらの系における結果を試験し、同じ薬物を用いてデータの対照比較を行うことを可能とする。これにより例えばマウスTrkBに対して機能する薬物とヒトTrkBに対して機能する別の薬物を見つけ出す必要の複雑さが無くなり、また、同一でない薬物を用いて結果を比較する必要が無くなる。特定のTrkB結合アゴニストは、ヒトおよびラットTrkBのリン酸化のEC50に5倍以下、または2倍以下の差を示す。特定のTrkB結合アゴニストは、ヒトおよびマウスTrkBのリン酸化のEC50に5倍以下、または2倍以下の差を示す。特定のTrkB結合アゴニストは、ヒトおよびカニクイザルのリン酸化のEC50に5倍以下、または2倍以下の差を示す。一つの実施形態では、EC50値は、少なくとも3回の実験の平均である。
TrkB結合アゴニストは、TrkBのBDNF結合部位に近接した、特に、当該リガンドのN末端と結合する特異性パッチに近接するTrkBエピトープと結合し得る。TrkB結合アゴニストは、TrkBと結合し、BDNFとTrkBのさらなる結合を増強または安定化させ得る(アゴニスト:リガンド:受容体の三元複合体)。TrkB結合アゴニストは、BDNFと非競合性のTrkB−BDNF増強剤であり得る。TrkB結合アゴニストは、TrkBのD5ドメインおよび/またはTrkBの膜近接(JM)領域内に含まれる特異的エピトープと結合し、かつ/またはTrkBとの結合に関して参照抗体と競合し得る。これらのエピトープとの結合はTrkBを活性なコンフォメーションで安定化することが可能である。TrkBアゴニストは、(a)TrkBの利用可能な細胞表面レベルを増大させ、かつ/または(b)活性化されたTrkB受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害し得る。
よって、BDNFの不在下でTrkBを活性化し、(ii)BDNFと競合せず、(iii)BDNFにより誘導されるまたはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強し、かつ/または(iv)TrkBの細胞表面レベルを維持するTrkB結合アゴニストが記載される。
TrkB一次アミノ酸配列は、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒト間で保存性が高く(全長配列の95%)、特に、細胞外ドメイン(TrkB−ECD)が保存されている。TrkB−ECDは、5つのドメイン(D1−D3:C32〜C194;D4:G195〜V283;D5:H284−G380)および短い膜近接JM領域(W381〜H430)を含む。TrkBのD5ドメインは、リガンド(BDNF/NT−4)の結合に関して全長TrkBに取って代わることができる。TrkBのリガンド結合ドメイン(LBD)内には、「保存パッチ」と「特異性パッチ」の2つの接触領域が存在する。保存パッチにおけるTrkB D5の接触残基は、AB、C’DおよびEF βシート間のループと、D5ドメインのC末端に由来する。このTrkBの保存パッチはリガンド(BDNF/NT−4)の軸に結合する。TrkB D5の特異性パッチの接触残基は、ABED βシートの外面に由来する。TrkBの特異性パッチは、非配位形態では配向をとらず、TrkBとの結合時に配向するようになるリガンド(BDNF/NT−4)のN末端と結合する。
用語「エピトープ」のほとんどの定義は、エピトープがTrkBアゴニストなど結合タンパク質の接触する抗原の部分であることを明示する(例えば、Essential Immunology, Sixth Edition, Blackwell Scientific Publishing, 1988, Ed. Roitt, Chapter 4参照)。他の定義は、結合タンパク質により結合される抗原の部分を意味する。用語「接触」および「結合」は、エピトープが適切には、静電気(水素結合、イオン性)、ファンデルワールス力、パイ効果および疎水結合などの非共有結合性の相互作用を介して抗体またはフラグメントと直接相互作用する残基だけからなるべきであることを暗に示し得る。このような厳密な解釈では、エピトープは、相互作用しないが他の点で抗原と結合タンパク質の間の相互作用に重要な残基を含まない。例えば、抗原注の特定の残基は、抗原および抗体(またはフラグメント)の他の残基間の直接的相互作用を助長するために必要な密接な相互作用を可能とするために極めて小さいことが(例えば、グリシン)必要とされる場合がある。同様に、特定の残基(例えば、プロリン)が、結合を可能とする正確なコンフォメーションを採るために抗原配列に必要とされる場合がある。
実際に、「エピトープ」情報を特定するために一般に実施される技術のほとんどは相互作用残基と他の点で重要な残基の間を区別しない(できない)。以下の技術が慣用される。
1.抗体またはそのフラグメントと抗原に由来するペプチドとの結合(有意な結合を示すペプチドは、「エピトープ」を含むと見なされる)。
2.水素重水素交換(非複合体形成抗原に比べて重水素組み込みに耐性のある複合体形成抗原に由来するペプチドは、「エピトープ」を含むと考えられる)。
3.突然変異誘発試験(例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発、結合タンパク質との結合を有意に変更する抗原の変異位置は「エピトープ」の一部を形成すると考えられる)。
当業者に明らかなように、原子レベル分解能を有する技術(例えば、X線結晶学、NMR、電子顕微鏡)のみが相互作用する残基と他の点で重要な残基とを区別することができる。しかしながら、これらが厳密な定義に従ってエピトープに関する情報を得ることのできる唯一の技術であるとしても、他の技術もなお標的との結合に重要な残基/配列に関する有用な情報を提供することが提示される。
実施例に記載されるTrkB結合アゴニスト、1G11は、以下のようにいくつかの望ましい特性を有する。
1.BDNFに誘導性される、およびNT−4により誘導される促進作用を増強する
2.TrkBの細胞表面レベルを維持する
3.カニクイザルTrkBとの交差反応性
1G11は、X線結晶学により、残基T288、F291、K372およびE293に密接に接近することが示された。T288およびT291はD5 βシートAに位置し;E293はD5 βシートAとA’の間に位置し;K372はD5 βシートGに存在する。例えば、TrkB結合アゴニストは、残基T288、F291、K372、E293、F285、T290およびD370を含んでなるエピトープと結合し得る。F285およびT290は、D5 βシートAに位置する。D370は、D5 βシートGに位置する。よって、「エピトープ」は、TrkBのD5ドメインのβシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域内に含まれると思われる。この同じ「エピトープ」に接触する他のTrkB結合アゴニストも同様の生物活性を有すると予想され得る。このような結合タンパク質は極めて望ましい。
よって、一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、
a)以下のヒトTrkB残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373およびGlu341のうち1以上と相互作用し得るか;
b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近し得るか;
c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
d)ヒトTrkBと結合し、かつ、
非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;あるいは
e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、以下のヒトTrkB残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373およびGlu341のうち1以上の、2以上、または3以上と相互作用し得る。一つの実施形態では、本発明は、Glu293と、および場合により、Thr290、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341からなる群から選択される1以上、または2以上のさらなる残基と相互作用するTrkB結合アゴニストを提供する。別の実施形態では、本発明は、Thr290およびGlu293、またはGlu293およびSer294、またはThr290、Glu293およびSer294と相互作用するTrkB結合アゴニストを提供する。
上記の実施形態では、相互作用は、直接的相互作用または水を介した間接的相互作用であり得る。一つの実施形態では、相互作用は直接的相互作用である。本発明に関して、直接的相互作用は、TrkB結合アゴニストと全長ヒトTrkBの示された残基との間の水素結合である。しかしながら、相互作用残基に関する情報は全長ヒトTrkBから導出される必要はないことに留意されたい。例えば、ヒトTrkB細胞外ドメインまたはヒトTrkBのD5−JMドメインが使用可能である。相互作用残基は、原子レベル分解能があるいずれの技術によって同定されてもよい。一つの実施形態では、相互作用残基はX線結晶学により同定される。
一つの実施形態では、本発明は、T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来の1以上の、2以上または3以上の残基の4.5Å以内に接近するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Glu293および場合により、T288、I289、T290、F291、L292、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択される1以上、または2以上のさらなる残基の4.5Å以内に接近するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Thr290およびGlu293、またはGlu293およびSer294、またはThr290、Glu293およびSer294の4.5Å以内に接近するTrkB結合アゴニストを提供する。上記の実施形態において、近接分析は、原子レベル分解能のある任意の技術、例えば、X線結晶学により同定された構造に対して実施され得る。TrkBの残基は、それらが全長ヒトTrkBにおいてなされる場合と同様にナンバリングされる。しかしながら、TrkB結合アゴニストとの近接に関する情報は全長ヒトTrkBから導出される必要はないことに留意されたい。例えば、ヒトTrkB細胞外ドメインまたはヒトTrkBのD5−JMドメインが使用可能である。
一つの実施形態では、本発明は、E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、E210、T288、F291、E293、D370およびK372の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、F291およびE293の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。結合は、任意の好適な方法、例えば、SPRまたはELISAにより評価することができる。TrkBは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け(例えば、ビオチン化)されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。用語「変更された親和性」は、TrkB結合アゴニストが、ヒト野生型TrkB細胞外ドメインと比べた場合に変異型に関して、実質的に低減されたまたは実質的に増強された親和性を示す状態を意味する。親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−1標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−2標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−3標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい3分の1である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい5分の1である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい10分の1である場合である。親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+1標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+2標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+3標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも3倍である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも5倍である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも10倍である場合である。一つの実施形態では、変更された親和性は、低下した親和性を意味する。
一つの実施形態では、本発明は、ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来の配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるTrkB結合タンパク質を提供する。一つの実施形態では、重水素組み込みに対する耐性は、重水素化バッファーに希釈した後15〜300秒の間の時点(例えば、15、60または300秒のうち一時点)で評価される。
アラニンスキャニング突然変異誘発およびX線結晶学からのデータは、1G11の不連続エピトープを指し示すが、ほとんどの相互作用はこの不連続エピトープの最もN末端の部分に存在すると思われることを述べておく。これは水素・重水素交換から最も強く保護される部分でもある。このため、1G11のエピトープのこのN末端領域にまさに結合する結合タンパク質は1G11に対して同等の特性有し得ると予想される。よって、一つの実施形態では、本発明は、配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチド(抗体1G11の不連続エピトープのN末端領域を含んでなるペプチド)と結合するTrkB結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「と結合する」には、ヒトTrkB細胞外ドメインに由来する等価の長さのいずれの非重複ペプチドで見られるものよりも実質的に大きい結合応答を必要とする。結合は、任意の好適な方法、例えば、ELISAによって評価することできる。ペプチドは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け(例えば、ビオチン化)されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。「オールオアナッシング」の結合応答が達成される(すなわち、配列番号71に示される配列を有するペプチドにより達成される結合のレベルが、他の非重複TrkBペプチドにより達成されるレベルよりも実質的に大きい)限り、指定された配列を有するペプチドと結合するための要件は、結合タンパク質がこの配列の外側の残基と相互作用してはならない、または例えば、それらを例えば、重水素取り込みから保護してはならないことを必ずしも意味しないことに留意されたい。本発明に関して、実質的により大きい結合応答とは、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−1標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である状況を意味する。一つの実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号71に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−2標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である。さらなる実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号71に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−3標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である。一つの実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号71に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい3分の1である。別の実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号71に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい5分の1である。別の実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号71に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい10分の1である。
類似のエピトープに結合する1G11およびTrkB結合アゴニストは、BDNF/NT4「保存パッチ」リガンド結合部位(AB、C’DおよびEF βシート間のループと、D5ドメインのC末端)に近接し、かつ、BDNF/NT4「特異性パッチ」リガンド結合部位(ABED βシートの外面)に近位のTrkB D5ドメインに位置するエピトープと結合し得る。BDNFのN末端は、TrkBとこれらのTrkB結合アゴニストの間の空間に突出している。このようなTrkB結合アゴニストは、TrkBとの結合に加えて、BDNFのN末端と相互作用でき、おそらくはその三元複合体を安定化させてBDNFの機能的応答の増強をもたらし得る。あるいは、このようなTrkB結合アゴニストは、リガンド結合ドメインにおいては結合しないがそれと近接することによりTrkBとBDNFの相互作用を安定化させ得る。
実施例に記載されているTrkB結合アゴニスト、3A3および8E5も、BDNFにより誘導される促進作用を増強することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発は、3A3結合に重要なTrkB内の特定の残基を同定する。3A3および8E5はある種の特性を共有し、TrkBとの結合に関して競合するので、それらは重複する「エピトープ」を有し得ると考えられる。3A3に関するデータに基づけば、「エピトープ」は、残基E398、Y397、D399、Y400、D394、およびI396を含んでなる。例えば、TrkB結合アゴニストは、残基E398、Y397、D399、およびY400を含んでなるエピトープと結合し得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、残基E398、Y397、D399、Y400、D394、I396、V395、N389、およびT402を含んでなるエピトープと結合し得る。これらの残基は膜近接(JM)領域(W381〜H430)にある。JM領域は、結晶構造が存在しなければ、長いフレキシブルリンカー領域であると仮定される。このJM領域もリガンドとの結合に重要であり得ると思われる。この同じ「エピトープ」と接触する他のTrkB結合アゴニストも、同様の生物活性を有すると予想され得る。このような結合タンパク質は極めて望ましい。
よって、一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、
a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか;
b)ヒトTrkBと結合し、かつ、重非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて水素の組み込みに対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じ得るか;または
c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
一つの実施形態では、本発明は、N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、D394、I396、Y397、E398、D399およびY400の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Y397、E398、D399およびY400の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するTrkB結合アゴニストを提供する。結合は、任意の好適な方法、例えば、SPRまたはELISAにより評価することができる。TrkBは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け(例えば、ビオチン化)されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。用語「変更された親和性」とは、TrkB結合アゴニストが、ヒト野生型TrkB細胞外ドメインと比べた場合に変異型に関して、実質的に低減されたまたは実質的に増強された親和性を示す状態を意味する。親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−1標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−2標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K−3標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい3分の1である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい5分の1である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kのせいぜい10分の1である場合である。親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+1標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+2標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均K+3標準偏差(野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである)以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも3倍である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも5倍である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型TrkB細胞外ドメインの平均Kの少なくとも10倍である場合である。一つの実施形態では、変更された親和性は、低下した親和性を意味する。
一つの実施形態では、本発明は、ヒトTrkBと結合し、かつ、非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるTrkB結合タンパク質を提供する。一つの実施形態では、重水素組み込みに対する耐性は、重水素化バッファーに希釈した後15〜60秒の間の時点(例えば、15、60秒のうち一時点)で評価される。
一つの実施形態では、本発明は、配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチド(アラニンスキャニング突然変異誘発により抗体3A3との結合に重要として同定された残基を総て含有する膜近接領域内のペプチド)と結合するTrkB結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「と結合する」には、ヒトTrkB細胞外ドメインに由来する等価の長さのいずれの非重複ペプチドで見られるものよりも実質的に大きい結合応答を必要とする。結合は、任意の好適な方法、例えば、ELISAによって評価することできる。ペプチドは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け(例えば、ビオチン化)されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。一つの実施形態では、このペプチドは、配列番号70(アラニンスキャニング突然変異誘発により抗体3A3との結合に重要として同定された残基をなお含有するより小さいペプチド)として示される配列を有し得る。「オールオアナッシング」の結合応答が達成される(すなわち、配列番号69(または70)に示される配列を有するペプチドにより達成される結合のレベルが、他の非重複TrkBペプチドにより達成されるレベルよりも実質的に大きい)限り、指定された配列を有するペプチドと結合するための要件は、結合タンパク質がこの配列の外側の残基と相互作用してはならない、または例えば、それらを例えば、重水素取り込みから保護してはならないことを必ずしも意味しないことに留意されたい。本発明に関して、実質的に大きい結合応答とは、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kが、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−1標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である状況を意味する。一つの実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−2標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である。さらなる実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均K−3標準偏差(いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される)以下である。一つの実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい3分の1である。別の実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい5分の1である。別の実施形態では、少なくとも3回の読み取りに基づく、配列番号69(または70)に示される配列を含有するペプチドの平均Kは、少なくとも3回の読み取りに基づいて測定される非重複TrkBペプチドの平均Kのせいぜい10分の1である。
TrkB JM領域エピトープはTrkB D5エピトープと明瞭に異なると見られるが、TrkB結合アゴニスト1G11、3A3および8E5は(少なくとも部分的に)TrkBとの結合に関して互いに競合可能であり、従って、これらのエピトープは重複する可能性があることに注目することが重要である。膜近接(JM)領域の長いフレキシブルリンカーが実際にD5 βシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域に近接している可能性がある。TrkB結合アゴニストがJM領域エピトープと結合する場合、それは(例えば、リガンドのN末端を介して)BDNFといくらかのさらなる相互作用を有し、かつ/または同様に受容体とリガンドとアゴニストの三元複合体を安定化させる可能性がある。興味深いことに、膜近接領域の残基D394、I396、およびY400は、これらの残基はラットTrkBでは異なるので(それぞれGlu、Leu、Trp)、ヒトTrkB受容体に特異性を付与する。同じ領域に結合するが異なる接触をなす他のTrkB結合アゴニストは交差反応性を示し得る可能性がある。
いくつかの実施形態では、TrkB上のTrkB結合アゴニストエピトープは、BDNFリガンド結合ドメイン(LBD)と重複しない。TrkB結合アゴニストは、TrkB上のエピトープと結合し、BDNFとTrkBの結合を可能とし、三元複合体(TrkBアゴニスト結合アゴニスト+TrkB+BDNF)を形成し得る。
TrkB上の特定のTrkB結合アゴニストエピトープは、参照抗体が結合するTrkB上のエピトープと重複する可能性がある。一つの実施形態では、本発明は、TrkBとの結合に関して参照抗体と競合するTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、TrkBとの結合に関して参照抗体と競合し、TrkBとの結合に関してBDNFと競合しない。参照抗体は、(a)配列番号27の重鎖配列と配列番号28の軽鎖配列;または(b)配列番号29の重鎖配列と配列番号30の軽鎖配列;または(c)配列番号31の重鎖配列と配列番号32の軽鎖配列を有し得る。
TrkB結合アゴニストは、TrkBの細胞内シグナル伝達を促進して、(a)細胞生存、(b)ニューロン修復、および/または(c)ニューロン可塑性を増進し得る。増進は、アゴニストの不在下に比べて、アゴニストの存在下で改善された生物学的機能または応答である。
「細胞生存」は、TrkBが発現される細胞の増殖の維持または増進を含む。TrkBは、中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)の両方で発現される。CNSでは、高レベルのTrkBが大脳皮質、海馬、視床、脈絡膜叢、ならびに小脳、脳幹、網膜および脊髄の顆粒層で発現される。PNSでは、TrkBは、脳神経節、前庭系、顎下腺および後根神経節で発現される。TrkB胎児脳で広く発現される。TrkBは、骨格筋、腎臓および膵臓などの他の組織でも発現される。TrkBは、マイスナー小体でも発現される。中枢神経系(CNS)および骨格筋の神経筋界面でのTrkBの活性化は、脳および脊髄運動ニューロンの生存および始原筋細胞の分化を調節し得る。一例では、細胞生存は、神経細胞生存を含む。
例えば、本発明のTrkB結合アゴニストは、ニューロンの生存、例えば、ヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株の生存を増進し得る。TrkB結合アゴニスト1G11、ヒト化1G11、8E5および3A3は、(ヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株の)細胞生存を濃度依存的に、平均EC500.006〜0.025nMで増進することができる。
TrkB結合アゴニストは、ラット脳および/もしくは脊髄由来ニューロン、マウス脳由来ニューロンで内因的に発現されるTrkB受容体、ならびに/またはCHO細胞で組換え発現されるカニクイザルTrkBを活性化し得る。
TrkBは、軸策の再生および成長、神経突起成長を含むニューロン修復、神経有随化、および筋再生の速度および程度を調節することができる。修復は、恒常性を維持するための生理的なもの(すなわち、生物学的インプットに応答したバランスの維持)であり得るか、または損傷および/または傷害の結果としてのものであり得る。例えば、TrkB結合アゴニストには、神経突起成長、例えば、ヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株における神経突起成長を含み得る。TrkB結合アゴニスト1G11、ヒト化1G11および8E5は、神経突起成長(ヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株において)を濃度依存的に、平均EC500.07〜1.58nMで誘導した。
TrkBは、シナプス可塑性と非シナプス可塑性の両方を包含するニューロン可塑性(神経可塑性)を調節し得る。ニューロン可塑性は、行動、環境、神経プロセス、思考、感情の変化による神経経路およびシナプスの変化、ならびに損傷および/または傷害から生じる変化を意味する。例えば、TrkBは、シナプス可塑性の機能を調節し得る。中枢神経系(CNS)および骨格筋の神経筋界面でのTrkBの活性化は、神経筋接合部(NMJ)を安定化させ、かつ、NMJにおけるアセチルコリン(ACh)伝達を調節し得る。
TrkB結合アゴニストは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、RNAアプタマー、または多糖であり得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、抗原結合タンパク質である。用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、TrkBとの結合が可能な抗体、および別の抗体形式を意味する。
用語「抗体」は、本明細書において、免疫グロブリン様ドメインを有する分子(例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE)を意味して最も広い意味で使用され、モノクローナル、組換え、合成、ポリクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、多重特異性抗体(二重特異性抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体を含む);単一可変ドメイン、抗原結合抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、TANDAB(商標)など)、ならびに前記いずれかの修飾形態を含む。一つの実施形態では、抗体は、IgG、またはIgA足場を有する。一つの実施形態では、抗体はIgG足場を有し、これは4鎖または2鎖抗体であり得る。IgG足場は、抗体のドメイン(すなわち、CH1、CH2、CH3、VH、VL)のいくつかまたは総てを含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG4PEから選択されるIgG足場を含んでなり得る。例えば、足場はIgG1であり得る。足場は、抗体のFc領域またはその一部からなり得る、または含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、無効化されたFc領域を含んでなってもよい。例えば、Fc領域は、突然変異L235AおよびG237A(EUナンバリング)で修飾されてよい。Fc領域のこの修飾はFcγ受容体およびC1qに対する抗体結合を減少させ、従って、抗体の、抗体依存性細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞傷害(CDC)によりTrkB陽性細胞の枯渇を誘導する能力を低下させる。これは、一般にFc無効化と言われる。Fcエフェクター機能はTrkB結合アゴニストの生物学的機能に重要でないことに留意されたい。
用語「ドメイン」は、タンパク質の残部とは独立にその三次構造を保持する折りたたみタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質のおよび/またはドメインの機能欠失なく、付加、除去または他のタンパク質に移動することができる。用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。よって、それは、VH、VHHおよびVLなどの完全な抗体可変ドメイン、および例えば、1以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換された修飾抗体可変ドメイン、または末端切断されたもしくはN末端またはC末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折りたたまれたフラグメントを含む。異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープと結合し得る単一可変ドメインは、「ドメイン抗体」または「dAb(商標)」と呼ばれることがある。単一可変ドメインはヒト単一可変ドメインであり得るが、齧歯類、テンジクザメおよびラクダ科動物VHH dAb(商標)などの他種由来の単一可変ドメインも含む。ラクダ科動物VHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。このようなVHHドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインも「単一可変ドメイン」と見なされる。本明細書で使用する場合、VHは、ラクダ科動物VHHドメインを含む。
もう1つの抗体形式として、TrkB結合アゴニストのCDRが好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格上に配置されたものがある。この非免疫グロブリン足場は、CTLA−4、リポカリン、タンパク質A由来分子、例えば、タンパク質AのZドメイン(アフィボディ、SpA)、Aドメイン(アビマー/マキシボディ);熱ショックタンパク質、例えば、GroElおよびGroES;トランスフェリン(トランスボディ);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(テトラネクチン);ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン(アフィリン);PDZドメイン;LDL受容体クラスAドメイン;EGFドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメイン;およびフィブロネクチン/アドネクチンからなる群に由来し得る。
1G11 TrkB結合アゴニストのHCおよびLCドメインは、それぞれ配列番号27および配列番号28に示される。ヒト化1G11 TrkB結合アゴニストのVHおよびVLドメインは、それぞれ配列番号40および配列番号41に示される。
「CDR」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には3つの重鎖CDRと3本の軽鎖CDR(またはCDR領域)がある。
配列番号27、配列番号28、配列番号40および配列番号41のCDR領域は、任意のナンバリング慣例、例えば、Kabat、Chothia、AbMおよびcontact慣例によって定義され得る。各方法により定義される配列番号27、配列番号28、配列番号40および配列番号41のCDR領域を表1に示す。contact法によって定義されるCDRH2を除いて、マウス1G11およびヒト化1G11のCDR配列は同一であることを述べておく。本明細書を通じ、アミノ酸残基は、Kabatナンバリング慣例に従ってナンバリングされる。
1G11 TrkB結合アゴニストパラトープおよびおそらくはヒト化1G11 TrkB結合アゴニストパラトープの主要結合残基は、CDR L1(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
L3(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
およびH3(太字の残基は、エピトープの4.5Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRH2内でエピトープの4.5Å以内に接近する残基は2つだけであり、直接的相互作用するものは1つだけである(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRH1内でエピトープに接近するまたは(間接的に)接触するのは唯一、一残基だけであり(太字の残基は、エピトープの4.5Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRL2でエピトープに接近するのは一残基である(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
よって、順位付けの観点から、CDR L1、L3およびH3は結合に最も重要であり、次いで、CDRH2、次いで、CDRL2およびCDRH1である。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、(a)配列番号28内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;(b)配列番号28内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および(c)配列番号27内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなる。
一つの実施形態では、CDRL1は、配列番号3もしくは配列番号66内に存在するか、または配列番号3もしくは配列番号66の変異体であり、その変異体は、1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、CDRL1は、配列番号3内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRL1内の修飾は残基R28、S30およびN32(配列番号28からナンバリング)にない。特定の実施形態では、R28、S30およびN32を修飾しないことに加え、CDRL1内の修飾は、残基I29および/または残基N31(配列番号28からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRL1は、配列番号3または配列番号66内に存在する。一つの実施形態では、CDRL1は、配列番号3内に存在する。
一つの実施形態では、CDRL3は、配列番号5もしくは配列番号68内に存在するか、または配列番号5もしくは配列番号68の変異体であり、その変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、CDRL3は、配列番号5内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRL3内の修飾は、残基N92およびS93(配列番号28からナンバリング)にない。特定の実施形態では、N92およびS93を修飾しないことに加え、CDRL3内の修飾は、残基S91およびW94(配列番号28からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRL3は、配列番号5または配列番号68内に存在する。一つの実施形態では、CDRL3は、配列番号5内に存在する。
一つの実施形態では、CDRH3は、配列番号8もしくは配列番号65内に存在するか、または配列番号8もしくは配列番号65の変異体であり、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。さらなる実施形態では、CDRH3は、配列番号8内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRH3内の修飾は、残基R97、Y99およびE100(配列番号27からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRH3は、配列番号8または配列番号65内に存在する。一つの実施形態では、CDRH3は、配列番号8内に存在する。
一つの実施形態では、上記で定義されるCDRL1、CDRL3およびCDRH3を含んでなることに加え、TrkB結合アゴニストは、配列番号27内に存在するCDRH2もしくはその変異体、または配列番号40もしくはその変異体を付加的に含んでなり、それらの変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、CDRH2は、配列番号7、配列番号59、配列番号61、配列番号63もしくは配列番号64内に存在するか、または配列番号7、配列番号59、配列番号61、配列番号63もしくは配列番号64の変異体であり、その変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、CDRH3は、配列番号7内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRH2内の修飾は、残基R50および/または残基Y57(配列番号27からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRH2は、配列番号7、配列番号59、配列番号61、配列番号63または配列番号64内に存在する。一つの実施形態では、CDRH2は、配列番号7内に存在する。
TrkB結合アゴニストは、CDRL1(配列番号3)、CDRL3(配列番号5)、およびCDRH3(配列番号8)を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、CDRL1(配列番号3)、CDRL3(配列番号5)、CDRH2(配列番号7)およびCDRH3(配列番号8)を含んでなり得る。
一つの実施形態では、上記で定義されるCDRL1、CDRL3、CDRH3およびCDRH2を含んでなることに加え、TrkB結合アゴニストは、配列番号28内に存在するCDRL2またはその変異体、および配列番号27内に存在するCDRH1またはその変異体を付加的に含んでなり、それらの変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。
一つの実施形態では、CDRL2は、配列番号4もしくは配列番号67内に存在するか、または配列番号4もしくは配列番号67の変異体であり、その変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、CDRL2は、配列番号4内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRL2内の修飾は、残基Y50(配列番号28からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRL2は、配列番号4または配列番号67内に存在する。一つの実施形態では、CDRL2は、配列番号4内に存在する。
一つの実施形態では、CDRH1は、配列番号6、配列番号58、配列番号60もしくは配列番号62内に存在するか、または配列番号6、配列番号58、配列番号60もしくは配列番号62の変異体であり、その変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、CDRH1は、配列番号6内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、CDRH1内の修飾は、残基Y33(配列番号27からナンバリング)にない。特定の実施形態では、Y33を修飾しないことに加え、CDRH1内の修飾は、残基S31(配列番号27からナンバリング)にない。一つの実施形態では、CDRH1は、配列番号6、配列番号58、配列番号60または配列番号62内に存在する。一つの実施形態では、CDRH1は、配列番号6内に存在する。
TrkB結合アゴニストは、配列番号6のCDRH1;配列番号7のCDRH2;配列番号8のCDRH3;配列番号3のCDRL1;配列番号4のCDRL2;および配列番号5のCDRL3を含んでなり得る。
前記実施形態では、特定のCDRは、3つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、1つの付加、1つの欠失および1つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体配列は1つのアミノ酸修飾を有する。別の実施形態では、各変異体配列は2つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表2に示されるような保存的置換である。
CDR L1、L2、L3、H1およびH2は、構造上、有限数の主鎖コンフォメーションのうちの1つを示す傾向がある。CDRの特定のカノニカル構造クラスは、CDRの長さと、CDRおよびフレームワーク領域の両方において重要な位置にある残基(構造決定残基またはSDR)により決定されるループパッキングとの両方によって定義される。CDRセットに対するカノニカルクラスを定義するためにクラスター分析が使用され、次に、埋もれた疎水基、水素結合残基、ならびに保存されているグリシンおよびプロリンを分析することによりカノニカル鋳型が同定される。抗体配列のCDRは、配列を重要な残基鋳型と比較し、同一性または類似性マトリックスを用いて各鋳型のスコアを求めることによってカノニカルクラスに割り付けることができる。
CDR当たり、可変領域当たり、重鎖または軽鎖当たりに複数の変異体CDRカノニカル位置が存在し得るので、そのCDRのカノニカル構造が、アゴニストがTrkBと結合できるように維持される限り、いずれの置換の組合せがTrkB結合アゴニストに存在してもよい。
TrkB結合アゴニストCDR変異体は、
(a)Y32のI、H、F、T、N、C、E、もしくはDによる置換;I34のV、MもしくはWによる置換;およびN35のH、E、Q、S、YもしくはTによる置換のうち1つまたは組合せを有するCDRH1の変異体;および/または
(b)I51のL、V、T、SもしくはNによる置換を有するCDRH2の変異体;および/または
(c)Y102のH、V、I、S、DもしくはGによる置換を有するCDRH3の変異体;および/または
(d)L33のM、V、IもしくはFによる置換;およびH34のA、G、N、S、VもしくはFによる置換のうち1つもしくは組合せを有するCDRL1の変異体;および/または
(e)V51のA、TもしくはGによる置換を有するCDRL2の変異体;および/または
(f)Q89のS、G、FもしくはLによる置換;Q90のHもしくはNによる置換;L96のP、Y、R、I、WもしくはFによる置換のうち1つもしくは組合せを有するCDRL3の変異体
を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、ヒト化VH領域、もしくはヒト化重鎖(HC)配列;および/またはヒト化VL領域、もしくはヒト化軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、配列番号40に示されるVH領域、もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および/または配列番号41に示されるVL領域、もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号40に示されるVH領域、または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および配列番号41に示されるVL領域、または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体VH領域は、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体VL領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。
TrkB結合アゴニストは、配列番号42に示されるHC、もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および/または配列番号43に示されるLC領域、もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなる。TrkB結合アゴニストは、配列番号42に示されるHC、または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および配列番号43に示されるLC領域、または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体HCは、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体LCは、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。
VH、VL、HCおよびLCに対する修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得、従って、いずれの特定の変異体配列も置換、付加および欠失を含有し得る。一般に、変異は、置換、特に、例えば表2に示されるような保存的置換である。
特定の実施形態では、VH、VL、HCおよびLCに対する修飾はCDRを除き、その結果、CDRは無傷であり、変異はVH、VL、HCまたはLC配列の残りの部分にある。変異体配列は実質的に、非修飾TrkB結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
TrkB結合アゴニストは、配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/または配列番号41の配列と少なくとも76%同一の配列を含んでなるVL領域を含んでなり得る。一つの実施形態では、VH領域は、配列番号40の配列と少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、VL領域は、配列番号41の配列と少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。
TrkB結合アゴニストは、47番がCysまたはSerであるVH領域を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、47番がCys、Ser、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnであるVH領域を含んでなり得る。
クエリー配列とサブジェクト配列の間の「同一性の割合」は、ペアワイズBLASTアラインメントが実施された後にサブジェクトアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列との100%のクエリー被覆率を有する場合にBLASTアルゴリズムにより計算される、割合として表される「同一性」値を用いて計算することができる。クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のこのようなペアワイズBLASTアラインメントは、米国国立バイオテクノロジー研究センター(National Center for Biotechnology Institute)のウェブサイトで利用可能なデフォルト設定のBLASTアルゴリズムを使用することにより、低複雑性領域のフィルターを解除して実行することができる。
クエリー配列は、サブジェクト配列と100%同一であり得るか、またはサブジェクト配列と比べた場合にある整数までのアミノ酸またはヌクレオチド変異を含み得るので、結果として同一性%は上記に示されるように100%未満となる。このような変異は、少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換(保存的置換および非保存的置換を含む)、または挿入を含み、前記変異は、クエリー配列のアミノ末端位もしくはカルボキシ末端位に存在してもよいし、あるいはそれらの末端位間のいずれかの場所に、クエリー配列中のアミノ酸もしくはヌクレオチド間に個々に、またはクエリー配列内の1以上の連続する群として散在して存在してもよい。
同一性%は、CDRを含むクエリー配列の全長にわたって計算することができる。あるいは、同一性%はCDRを除外してもよく、例えば、CDRはサブジェクト配列と100%同一であり、同一性%の変動はクエリー配列(すなわち、配列番号40または配列番号41)の残りの部分にあり、従って、CDR配列は固定される/無傷である。あるいは、CDR配列は、前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性%の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾TrkB結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
本発明はまた、(a)配列番号40のVH領域;および/または(b)配列番号41のVL領域を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、(a)配列番号40のVH領域;および(b)配列番号41のVL領域を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、(a)配列番号42と少なくとも90%同一の重鎖(HC)配列;および/または(b)配列番号43と少なくとも85%同一の軽鎖(LC)配列を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、HCは、配列番号42の配列と少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、LCは、配列番号42の配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。
TrkB結合アゴニストは、47番がCysまたはSerであるHC領域を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、47番がCys、Ser、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnであるHC領域を含んでなり得る。
「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性%は、CDRを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性%はCDRを除外してもよく、例えば、CDRはサブジェクト配列と100%同一であり、同一性%の変動はクエリー配列(すなわち、配列番号40または配列番号41)の残りの部分にあり、従って、CDR配列は固定される/無傷である。あるいは、CDR配列は、前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性%の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾TrkB結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
本発明はまた、(a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および/または(b)配列番号43の軽鎖(LC)配列を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、(a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および(b)配列番号43の軽鎖(LC)配列を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
3A3 TrkB結合アゴニストのHCおよびLCドメインは、それぞれ配列番号29および配列番号30に示される。ヒト化3A3 TrkB結合アゴニストのVHおよびVLドメインは、それぞれ配列番号46および配列番号47に示される。
TrkB結合アゴニストは、配列番号29由来のCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号30由来のCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択されるCDR;または各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有するCDR変異体のうちの1つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、配列番号29由来のCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号30由来のCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択される、1、2、3、4、5、もしくは6つのCDR;または各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有するCDR変異体を含んでなり得る。特定の実施形態では、特定のCDRは配列番号29または配列番号30内に存在し、一方、他のCDRは、配列番号29または配列番号30内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、以下のCDR:
(a)配列番号30内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号30内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号30内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号29内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号29内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号29内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち1以上を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、
(a)配列番号30内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号30内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号30内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号29内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号29内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号29内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも2つのCDR、少なくとも3つのCDR、少なくとも4つのCDRまたは少なくとも5つのCDRまたは6つ総てのCDRを含んでなる。
3A3に関する実施形態では、特定のCDRは、3つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、1つの付加、1つの欠失および1つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体CDRは1つのアミノ酸修飾を有し得る。別の実施形態では、各変異体配列は2つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表2に示される保存的置換である。
TrkB結合アゴニストは、以下のCDR:配列番号12のCDRH1;配列番号13のCDRH2;配列番号14のCDRH3;配列番号9のCDRL1;配列番号10のCDRL2;および/または配列番号11のCDRL3のうちいずれか1つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、配列番号12のCDRH1;配列番号13のCDRH2;配列番号14のCDRH3;配列番号9のCDRL1;配列番号10のCDRL2;および/または配列番号11のCDRL3から選択される1、2、3、4、5、または6つのCDRを含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号12のCDRH1;配列番号13のCDRH2;配列番号14のCDRH3;配列番号9のCDRL1;配列番号10のCDRL2;および配列番号11のCDRL3を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、ヒト化VH領域、もしくはヒト化重鎖(HC)配列;および/またはヒト化VL領域、もしくはヒト化軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、配列番号40に示されるVH領域もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体および/または配列番号41に示されるVL領域もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号40に示されるVH領域または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および配列番号41に示されるVL領域または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体VH領域は、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体VL領域は、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。
TrkB結合アゴニストは、配列番号42に示されるHCもしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および/または配列番号43に示されるLC領域もしくは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号42に示されるHCまたは10までのアミノ酸修飾を有するその変異体;および配列番号43に示されるLC領域または10までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体HCは、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体LCは、1、2 3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸修飾を有する。
VH、VL、HCおよびLCに対する修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得、従って、いずれの特定の変異体配列も置換、付加および欠失を含有し得る。一般に、変異は、置換、特に、例えば表2に示されるような保存的置換である。
TrkB結合アゴニストは、配列番号46の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/または配列番号47の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVL領域を含んでなり得る。一つの実施形態では、VH領域は、配列番号46の配列と少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、VL領域は、配列番号47の配列と少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。TrkB結合アゴニストは、配列番号46のVH領域;および/または配列番号47のVL領域を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号46のVH領域;および配列番号47のVL領域を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、配列番号48と少なくとも80%同一の重鎖(HC)配列;および/または配列番号49と少なくとも80%同一の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。一つの実施形態では、HCは、配列番号48の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、LCは、配列番号49の配列と少なくとも85%、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。TrkB結合アゴニストは、配列番号48の重鎖(HC)配列;および/または配列番号49の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号48の重鎖(HC)配列;およびの配列番号49の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。
3A3に関する実施形態では、「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性%は、CDRを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性%はCDRを除外してもよく、例えば、CDRはサブジェクト配列と100%同一であり、同一性%の変動はクエリー配列(すなわち、配列番号46、47、48または49)の残りの部分にあり、従って、CDR配列は固定される/無傷である。あるいは、CDR配列は、3A3に関する前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性%の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾TrkB結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
8E5 TrkB結合アゴニストのHCおよびLCドメインは、それぞれ配列番号31および配列番号32に示される。
TrkB結合アゴニストは、配列番号31由来のCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号32由来のCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択されるCDR;または各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有するCDR変異体のうちいずれか1つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、配列番号31由来のCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号32由来のCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択される1、2、3、4、5、または6つのCDR;または各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有するCDR変異体を含んでなり得る。特定の実施形態では、特定のCDRは配列番号31または配列番号32内に存在し、一方、他のCDRは配列番号31または配列番号32内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、以下のCDR:
(a)配列番号32内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号32内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号32内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号31内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号31内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号31内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち1以上を含んでなるTrkB結合アゴニストを提供する。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、
(a)配列番号32内に存在するCDRL1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(b)配列番号32内に存在するCDRL2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(c)配列番号32内に存在するCDRL3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(d)配列番号31内に存在するCDRH1または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
(e)配列番号31内に存在するCDRH2または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
(f)配列番号31内に存在するCDRH3または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも2つのCDR、少なくとも3つのCDR、少なくとも4つのCDRまたは少なくとも5つのCDRまたは6つ総てのCDRを含んでなる。
8E5に関する実施形態では、特定のCDRは3つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、1つの付加、1つの欠失および1つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体CDRは1つのアミノ酸修飾を有し得る。別の実施形態では、各変異体配列は2つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表2に示されるような保存的置換である。
TrkB結合アゴニストは、以下のCDR:配列番号18のCDRH1;配列番号19のCDRH2;配列番号20のCDRH3;配列番号15のCDRL1;配列番号16のCDRL2;および/または配列番号17のCDRL3のうちいずれか1つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、TrkB結合アゴニストは、配列番号18のCDRH1;配列番号19のCDRH2;配列番号20のCDRH3;配列番号15のCDRL1;配列番号16のCDRL2;および/または配列番号17のCDRL3から選択される1、2、3、4、5、または6つのCDRを含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号18のCDRH1;配列番号19のCDRH2;配列番号20のCDRH3;配列番号15のCDRL1;配列番号16のCDRL2;および配列番号17のCDRL3を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、ヒト化VH領域、またはヒト化重鎖(HC)配列;および/またはヒト化VL領域、またはヒト化軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストは、配列番号31と少なくとも80%同一の重鎖(HC)配列;および/または配列番号32と少なくとも80%同一の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。一つの実施形態では、HCは、配列番号48の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、LCは、配列番号49の配列と少なくとも85%、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の配列を含んでなる。TrkB結合アゴニストは、配列番号31の重鎖(HC)配列;および/または配列番号32の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。TrkB結合アゴニストは、配列番号31の重鎖(HC)配列;および配列番号32の軽鎖(LC)配列を含んでなり得る。
8E5に関する実施形態では、「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性%は、CDRを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性%はCDRを除外してもよく、例えば、CDRはサブジェクト配列と100%同一であり、同一性%の変動はクエリー配列(すなわち、配列番号31および32)の残りの部分にあり、従って、CDR配列は固定される/無傷である。あるいは、CDR配列は、8E5に関する前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性%の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾TrkB結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
TrkB結合アゴニストは、いくつかの従来の技術のいずれによって生産されてもよい。例えば、TrkB結合アゴニストは、それらを天然に発現する細胞から精製され得る(例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製することができる)か、または組換え発現系により生産され得る。一般に、宿主細胞は、所望のTrkB結合アゴニストをコードする組換え発現ベクターで形質転換させる。
TrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列もまた記載される。1G11に関する実施形態では、単一の核酸配列は、重鎖をコードする配列番号44;および/または軽鎖をコードする配列番号45、または配列番号44を含んでなり得る。あるいは、本発明は、重鎖をコードする配列番号44を含んでなる核酸;および/または軽鎖をコードする配列番号45を含んでなる別個の核酸を提供する。一つの実施形態では、単一の核酸配列は、重鎖をコードする配列番号50;および/または軽鎖をコードする配列番号51を含んでなり得る。もう1つの実施形態では、本発明は、重鎖をコードする配列番号50を含んでなる核酸;および/または軽鎖をコードする配列番号51を含んでなる別個の核酸を提供する。
TrkB結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターもまた記載される。該核酸配列、または該発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞も記載される。宿主細胞は単離された宿主細胞であり得る。宿主細胞は通常、多細胞生物(例えば、植物または動物)の一部ではない。宿主細胞は非ヒト宿主細胞であってもよい。原核生物(グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス(Bacilli)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種を含む)、酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris))、真菌(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)種)を含む真核生物、または昆虫細胞および哺乳類起源の細胞株(例えば、CHO、Perc6、HEK293、HeLa、NS0)を含む高等真核生物を含め、広範な宿主細胞が使用可能である。好適な宿主細胞としては、CHO(例えば、CHOK1およびCHO−DG44)などの哺乳類細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳類細胞宿主と併用するための適当なクローニングおよび発現ベクター、ならびにクローニング方法は当技術分野で公知である。
TrkB結合アゴニストの生産のための方法が記載され、その方法は、宿主細胞を核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる。一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは精製される(例えば、従来のタンパク質精製手順による)。本方法により生産されるTrkB結合アゴニストもまた記載される。よって、本発明は、夾雑物質を実質的に含まない、実質的に均質なTrkB結合アゴニスト集団を提供する。
TrkB結合アゴニストの発現および生産時に、翻訳後修飾が起こり得る。これは特定のリーダー配列の切断、種々の糖鎖部分の種々のグリコシル化パターンでの付加、脱アミド化(例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基における)、酸化(例えば、メチオニン、トリプトファンまたは遊離システイン残基における)、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化(例えば、アスパラギン酸残基における)、C末端リシンクリッピング(例えば、一方または両方の重鎖に由来する)、およびN末端グルタミン環化(例えば、重鎖および/または軽鎖における)を含み得る。TrkBアゴニストは、1以上の翻訳後修飾が施されているか、または受けていてもよい。この修飾はCDR、可変フレームワーク領域、または定常領域に生じ得る。修飾は、その分子の電荷の変化をもたらし得る。
脱アミド化は、主としてアスパラギン(N)をイソ−アスパラギン酸(イソ−アスパラギネート)およびアスパラギン酸(アスパラギネート)(D)におよそ3:1比で変換する酵素反応である。よって、この脱アミド化反応は、アスパラギネートからイソ−アスパラギン酸への異性化に関連する。アスパラギンの脱アミド化およびアスパラギネートの異性化は両方とも中間体スクシンイミドを含む。程度ははるかに低いが、脱アミド化は、グルタミン残基でも同様に起こり得る。脱アミド化は、CDR、Fab(非CDR領域)、またはFc領域で起こり得る。
酸化は生産および保存中に(すなわち、酸化条件の存在下で)起こり得、直接的には反応性酸素種により、または間接的には酸化ストレスの二次的副生成物との反応により誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらす。酸化は主としてメチオニン残基で起こるが、トリプトファンおよび遊離システイン残基でも起こり得る。酸化は、CDR、Fab(非CDR)領域、またはFc領域で起こり得る。
ジスルフィド結合のスクランブル化は、生産および基本的保存条件中に起こり得る。特定の状況下で、ジスルフィド結合は不適切に破壊または形成して不対合のシステイン残基(−SH)を生じる。これらの遊離(不対合の)スルフヒドリル(−SH)は、シャッフリングを増進し得る。
重鎖および/または軽鎖のN末端グルタミン(Q)およびグルタメート(グルタミン酸)(E)は、環化を介してピログルタメート(pGlu)を形成する可能性がある。ほとんどのpGlu形成は生産バイオリアクター内で起こるが、それは処理および保存条件のpHおよび温度に応じて非酵素的に形成され得る。N末端QまたはEの環化は、天然ヒト抗体に一般に見られる。
C末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、組換え型および天然ヒト抗体に一般に見られる。このプロセスの変形として、組換え宿主細胞由来の細胞内酵素による一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。ヒト対象/患者へのTrkB結合アゴニストの投与は、ヒト体内に残存するC末端リシンの除去をもたらす可能性がある。
本発明では、翻訳後修飾および上記の一次アミノ酸配列の変化は一般に、抗原結合親和性、生物活性、PK/PD、凝集、免疫原性、またはFc受容体との結合に有意な変化を生じない。
TrkB結合アゴニストは、ヒト疾患の処置において使用するために医薬組成物に組み込むことができる。一つの実施形態では、医薬組成物は、TrkB結合アゴニストを、場合により、1種類以上の薬学的に許容可能な担体および/または賦形剤および/または希釈剤と組み合わせて含んでなる。医薬組成物の例は、バッファー、塩、アミノ酸、ポリオール、糖、界面活性剤、洗剤、抗酸化剤、および/またはキレート剤のうちの1つまたは組合せを含んでなり得る。
医薬組成物は、ボーラスとしてまたは間欠的に(例えば、注射よりまたは徐放性処方物の使用により)または持続的注入により投与され得る。投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、くも膜下腔内、腹腔内、皮内、皮下、局所、中耳内、蝸牛内、眼内、硝子体内、筋肉内および門脈内が含まれる。医薬組成物は、局所投与(限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻腔内または眼内投与を含む)または経腸投与(限定されるものではないが、経口または直腸投与を含む)に好適であり得る。例えば、組成物は、静脈内またはくも膜下腔内投与に好適である。別の実施形態では、組成物は、硝子体内投与に好適である。
医薬組成物は、1mg〜10gの間のTrkB結合アゴニスト、例えば、5mg〜1gの間の抗原結合タンパク質を含んでなり得る。あるいは、組成物は、5mg〜500mgの間、例えば5mg〜50mgの間を含んでなり得る。
TrkB結合アゴニストの投与に関する有効用量および処置計画は、患者の年齢、体重および健康状態ならびに処置される疾患などの因子によって決まり得る。医薬処方物は、即放性処方物および徐放性処方物であり得る。徐放性処方物は特に、中耳内および蝸牛内送達に関して記載される。
医薬組成物は、TrkB結合アゴニストのパーツのキットを、他の薬剤と、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。便宜上、キットは、所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。一つの実施形態では、対象は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、カニクイザル、マーモセットまたはサルである。別の実施形態では、対象はヒトである。
TrkB結合アゴニストはまた、療法、例えば、治療または予防の方法で使用され得る。処置は、障害の少なくとも1つの様相または症状または生物学的兆候の緩和または軽減または治癒を包含する。
例えば、処置は、(1)その障害の生物学的兆候のうち1以上の改善、(2)(a)その障害に至るもしくは原因となる生体カスケードにおける1以上の点、または(b)その障害の生物学的兆候のうち1以上への干渉、(3)その障害に関連する症状もしくは作用のうち1以上の緩和、(4)その障害またはその障害の生物学的兆候のうち1以上の進行の緩徐化、および/または(5)障害またはその障害の生物学的兆候の重篤度の尤度の低減を含む。
予防は、例えば、障害に至るもしくは原因となる生体カスケードにおける1以上の点に干渉することにより、その障害またはその生物学的兆候の発生の誘導を低減する、または発生を遅延させるための薬物の予防的投与を含む。
TrkB結合アゴニストは、記載の方法に有効な量で使用される。治療上有効な量のTrkB結合アゴニストは、障害の1以上の症状を改善もしくは軽減するため、または障害を予防もしくは治癒するために有効な量である。
TrkBアゴニストは、中枢的にはCNSおよび末梢的にはPNSの両方で、細胞生存、および/またはニューロン修復、および/またはニューロン可塑性を増進するために使用することができる。
TrkBアゴニストは、神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を治療または予防するために使用することができる。BDNF−TrkB経路の作用機序とTrkBがCNSおよびPNSで広く発現されることを考慮すれば、TrkB結合アゴニストは、神経障害、神経変性疾患、発達障害および他の障害を有する対象に対して両方を提供することができる。これらはTrkB促進作用が有益であると予想される障害である。
例えば、TrkB結合アゴニストは、神経筋接合部(NMJ)におけるTrkB細胞内シグナル伝達を促進し、NMJの発達、安定性および維持を増進し得る。TrkB結合アゴニストは、骨格筋におけるTrkB細胞内シグナル伝達を促進し、骨格筋前駆細胞の増殖および分化を調節し得る。これは例えば筋肉損傷および変性の後に有益であり得る。TrkB結合アゴニストは、シュワン細胞においてTrkB細胞内シグナル伝達を促進し、軸策の再生および成長を増進し得る。これは例えば神経損傷および変性の後に有益であり得る。
障害には、疾患、病態、症候群、症状および徴候が含まれる。神経障害には、神経疾患、病態、症候群、症状および徴候が含まれる。神経障害は、脳、脊髄、脳神経、末梢神経、神経根、自律神経系、神経筋接合部、および/または筋肉を含む、中枢および末梢神経系の成分の構造または機能に混乱があるものを含み得る。神経障害は、表現型が不均一であり得、未知の病因を有する場合が多い。いくつかの機序および経路が、神経疾患などの神経障害に関連付けられている。これらの疾患では、特定の症状および構造/機能関係が基礎にある病因の理解に至っている。
障害はまた、TrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復または増進が有益であり得るものであり得る。例えば、TrkBを発現する細胞の変性または機能不全を含む障害の場合。
TrkB結合アゴニストは、本明細書に記載の障害の治療または予防の方法において使用可能である。より具体的には、TrkB結合アゴニストは、本明細書に記載の障害の処置方法において使用され得る。障害は、神経変性疾患、視神経症および網膜変性病態、難聴障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害およびその他のCNS障害を含んでなる。
神経変性疾患には、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、アルツハイマー病(AD)、運動ニューロン病(進行性筋萎縮を含む)、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)を含むプリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症(前頭側頭型認知症を含む)およびタウオパシー(tauopathies)が含まれる。より詳しい神経変性疾患としては、ALS、ハンチントン病および運動ニューロン病が含まれる。
一例では、ALSの処置は、運動ニューロンの生存および機能を増進することを含む。TrkB結合アゴニストは、神経保護および/または神経修復効果を有し得る。
一例では、認知症またはアルツハイマー病に関する処置は、認知機能低下の進行を緩徐化することを意味する。TrkB結合アゴニストは、細胞生存を促進し、神経突起成長を増進し、かつ/またはシナプス可塑性を調節し得る。TrkB結合アゴニストは、アルツハイマー病および他の認知症におけるニューロン機能不全を予防し得るまたは遅延させ得る。
一例では、ハンチントン病に関する処置は、限定されるものではないが、認知機能低下の進行の緩徐化を含む、疾患進行を緩徐化することを意味する。TrkB結合アゴニストは、細胞生存を促進し、神経突起成長を増進し、かつ/またはシナプス可塑性を調節し得る。TrkB結合アゴニストは、ハンチントン病におけるニューロン機能不全を予防し得るまたは遅延させ得る。
視神経神経症としては、例えば、網膜神経節細胞(RGC)および/または視神経を傷害する病態が含まれる。特定の視神経神経症としては、緑内障(例えば、開放隅角緑内障、広隅角緑内障、閉塞隅角緑内障(急性および慢性)、正常眼圧緑内障)、前部虚血性視神経症(AION)(例えば、非動脈性虚血性視神経症(non-arteritic ischeamic optic neuropathy)(NAION))、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症(例えば、乳頭浮腫)、浸潤性視神経症、外傷性視神経症、ミトコンドリア視神経症、中毒性視神経神経症、遺伝性視神経神経症(例えば、常染色体優性視神経萎縮(ADOA;Kjer型視神経萎縮)、レビー遺伝性視神経症、ローゼンバーグ・チュトリアン症候群、ウォルフラム症候群、視神経低形成)、視神経炎(例えば、視神経脊髄炎、乳頭炎)が含まれる。網膜変性障害には、遺伝性ジストロフィー(例えば、色素性網膜炎)、または加齢黄斑変性(ウェット型およびドライ型)を含む後天性病態が含まれるであろう。一つの実施形態では、視神経神経症としては、例えば、網膜神経節細胞(RGC)および/または視神経を傷害する病態が含まれる。特定の視神経神経症としては、緑内障(例えば、開放隅角緑内障、広隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障)、前部虚血性視神経症(AION)、非前部虚血性視神経症(non-anterior ischeamic optic neuropathy)(NAION)、外傷性視神経神経症およびレビー遺伝性視神経症が含まれる。網膜変性障害には、加齢黄斑変性(ウェット型およびドライ型)を含む遺伝性または後天性病態が含まれるであろう。
難聴障害としては、感音性難聴(SNHL)(両側性、一側性および不特定)および混合難聴(感音要素と伝音損失要素が存在する;両側性、一側性および不特定)が含まれる。感音性難聴としては、感覚性(蝸牛関連)または神経性(第8神経関連)難聴が含まれる。感音性難聴は、末端器官の病変から起こり得る。感音性難聴に関連する末端器官の病変は、音響性外傷(例えば85デシベル(db)を超えるノイズによる)、ウイルス性内リンパ内耳炎、メニエール病、第8神経の小脳橋角腫瘍、第8神経神経節の細菌またはウイルス感染(例えば、耳性帯状疱疹による)、急性中耳炎から生じる化膿性内耳炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、ウイルス起源のものを含む突発性難聴、例えば、流行性耳下腺炎、麻疹、インフルエンザ、水痘、単球増加症およびアデノウイルスを含むウイルスにより引き起こされるウイルス性内リンパ内耳炎)、および一過性虚血性難聴、中耳に延伸して鼓膜およびおそらく耳小骨連鎖を離断する側頭骨の骨折、蝸牛に影響を及ぼす骨折、ならびに第8神経の聴覚核または前庭核のいずれかから生じる、一般にシュワン細胞起源の腫瘍である聴神経腫瘍を含む。末端器官病変難聴は、風疹、出生時の無酸素症、分娩中の外傷による内耳中への出血、母親に投与される耳毒性薬、胎児赤芽球症、ならびにワーデンブルグ症候群およびハーラー症候群を含む遺伝性病態など、先天性であり得る。感音性難聴は、あるいは、加齢性のもの、例えば、加齢の正常な現象として起こる感音性難聴である老人性難聴(presbycusis)(老年性難聴(presbyacusia))であり得る。感音性難聴は、中毒性難聴(内耳の聴覚器官、特に、コルチ器官に影響を及ぼす耳毒性薬(例えば、ある種の抗生剤、ある種の化学療法薬、ある種のサリチル酸化合物、特に、アスピリン、ある種の利尿剤、一般ループ利尿薬、およびある種のキニーネ)から起こる難聴)であり得る。突発性感音性難聴、隠れた難聴(内耳におけるシナプスおよび聴覚線維損失から生じると思われる)および耳鳴(おそらくコルチ器官に対する傷害から生じる)も含まれる。
精神障害としては、不安、気分障害、鬱病(大鬱病性障害を含む)、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害および統合失調症が含まれる。
神経発達障害としては、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群 自閉性障害およびレット症候群が含まれる。
エネルギーバランスは、摂食行動を制御する2つの中枢回路の調節に依存する:中枢神経系(CNS)は、食欲、捕食行動、および体温調節を調和および統合しなければならず;満腹感(例えば、消化管からの)および全体的なエネルギーバランスを調節するシグナルが、末梢に伝達され、CNSにフィードバックされなければならない。よって、体重調節の障害には、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少(癌治療に関連するおよび/または癌治療により引き起こされる望ましくない体重減少)、サルコペニア、肥満およびオピオイド誘発性嘔吐が含まれる。
筋障害には、サルコペニアが含まれる。
他のCNS障害としては、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷(外傷性脳損傷(TBI)、脊髄損傷および末梢神経損傷を含む)、末梢神経症、神経筋疾患(重症筋無力症および筋無力症候群を含む)、睡眠障害および脳卒中が含まれる。一例では、末梢神経障害としては、化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)が含まれる。CIPNは、多くの抗癌薬の主要な用量制限副作用である。
TrkB結合アゴニストは、障害の進行を有意に緩徐化/停止/遅延する、日常生活機能を増進する、および対象の寿命を延長する神経障害および他の障害の処置として使用することができる。
一つの実施形態では、TrkB結合アゴニストは、以下の障害:筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、脳卒中、脊髄損傷、アルツハイマー病(AD)、運動ニューロン障害、外傷性脳損傷(TBI)、認知症、タウオパシー、末梢神経障害、神経損傷、末梢神経損傷、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)を含むプリオン病、精神障害、統合失調症、多発性硬化症、レット症候群、レビー小体病、多系統萎縮症、重症筋無力症、糖尿病性神経障害、網膜変性、緑内障、難聴、体重調節、拒食症、悪液質、神経筋疾患、気分および鬱病性障害、心的外傷後ストレス障害、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、不安、自閉性障害、疼痛、体重調節を含む障害、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、およびオピオイド誘発性嘔吐のうちいずれか1つの処置のために使用される。
上記の障害の治療または予防に使用される場合、TrkB結合アゴニストは、1以上の有効薬剤、例えば、特定の障害の治療または予防における使用のために承認された有効薬剤、より詳しくは、現行の標準治療をなすと考えられる薬剤とともに投与してよい。併用療法が想定される場合、有効薬剤は、1以上の医薬組成物で同時に、個別に、または逐次に投与してよい。
本発明のTrkB結合アゴニストがアルツハイマー病の処置のために使用される実施形態では、それはコリンエステラーゼ阻害剤および/またはメマンチンと併用可能である。
本発明のTrkB結合アゴニストがALSの処置のために使用される実施形態では、それはリルゾールと併用可能である。
本発明のTrkB結合アゴニストが緑内障の処置のために使用される実施形態では、それはプロスタグランジン類似体、β遮断薬、αアゴニストおよび炭酸脱水酵素阻害剤のうち1以上と併用され得る。本発明のTrkB結合アゴニストが緑内障の処置のために使用される別の実施形態では、それは選択的レーザー線維柱帯形成術(SLT)およびアルゴンレーザー線維柱帯形成術(ALT)と併用可能である。
一つの実施形態では、本発明のTrkB結合アゴニストは、感音性難聴を処置するための併用療法として蝸牛インプラント併用可能である。別の実施形態では、この本発明のTrkB結合アゴニストは、感音性難聴を処置するためにステロイドと併用可能である。別の実施形態では、この本発明のTrkB結合アゴニストは、感音性難聴を処置するために遺伝子療法、例えば、ATOH1遺伝子療法と併用可能である。
1つの特定の実施形態では、TrkB結合アゴニストは、耳毒性薬剤と併用投与される。当業者は、耳毒性薬剤から生じる難聴を予防し、患者に投与される耳毒性薬剤の高用量化をさらに可能とし得る。
本発明はまた、以下の実施形態を有する。
実施形態1.BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用を増強するTrkB結合アゴニスト。
実施形態2.TrkBとの結合に関してBDNFと競合しない、実施形態1のTrkB結合アゴニスト。
実施形態3.BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強効果が、TrkB結合アゴニストの不在下に比べたTrkB結合アゴニストの存在下、飽和濃度のBDNFの存在下でのTrkBの活性化の増大により測定される、実施形態1または2のTrkB結合アゴニスト。
実施形態4.TrkBの活性化の増大がTrkBのリン酸化のレベルの上昇により測定される、実施形態3のTrkB結合アゴニスト。
実施形態5.飽和濃度のBDNFの存在下でのTrkBのリン酸化が、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも110%に比べて、TrkB結合アゴニストの不在下で100%である、実施形態4のTrkB結合アゴニスト。
実施形態6.飽和濃度のBDNFの存在下でのTrkBのリン酸化が、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、または少なくとも150%に比べて、TrkB結合アゴニストの不在下で100%である、実施形態4または5に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態7.TrkBとの結合に関してBDNFと競合せず、かつ、TrkBのD5ドメインのβシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域内に含まれるエピトープと結合するTrkB結合アゴニスト。
実施形態8.エピトープが残基T288、F291、K372、およびE293を含んでなる、実施形態7に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態9.TrkBとの結合に関してBDNFと競合せず、かつ、TrkBの膜近接領域(W381〜H430)内に含まれるエピトープと結合するTrkB結合アゴニスト。
実施形態10.エピトープが残基E398、Y397、D399、およびY400を含んでなる、実施形態9に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態11.TrkBとの結合に関してBDNFと競合せず、かつ、TrkBとの結合に関して、(a)配列番号27の重鎖配列および配列番号28の軽鎖配列;または(b)配列番号29の重鎖配列および配列番号30の軽鎖配列;または(c)配列番号31の重鎖配列および配列番号32の軽鎖配列を有する参照抗体と競合するTrkB結合アゴニスト。
実施形態12.BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用を増強する、実施形態7〜11のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態13.BDNFの不在下でTrkBを活性化し、細胞表面のTrkBレベルを維持するTrkB結合アゴニスト。
実施形態14.TrkBのリガンド結合ドメインに結合しない、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態15.
(a)(i)配列番号27からのCDRH1、CDRH2、CDRH3、および/もしくは配列番号28からのCDRL1、CDRL2、CDRL3から選択されるCDRのいずれかのうちいずれか1つもしくは組合せ;または
(ii)各CDRに1、2、もしくは3つのアミノ酸修飾を有する(i)のCDR変異体;または
(b)配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/もしくは配列番号41の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVL領域
を含んでなるTrkB結合アゴニスト。
実施形態16.以下のCDR:
(a)配列番号6のCDRH1;
(b)配列番号7のCDRH2;
(c)配列番号8のCDRH3;
(d)配列番号3のCDRL1;
(e)配列番号4のCDRL2;および/または
(f)配列番号5のCDRL3
のうちいずれか1つまたは組合せを含んでなるTrkB結合アゴニスト。
実施形態17.CDRL1、CDRL3、およびCDRH3を含んでなる、実施形態15または16に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態18.加えてCDRH2を含んでなる、実施形態17に記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態19.
(a)ヒト化VH領域、またはヒト化重鎖(HC)配列;および/または
(b)ヒト化VL領域、またはヒト化軽鎖(LC)配列
を含んでなる、実施形態15〜18のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態20.VHの47番がCys、Ser、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnである、実施形態15〜19のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態21.
(a)配列番号40のVH領域;および/または
(b)配列番号41のVL領域
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
実施形態22.
(a)配列番号42と少なくとも80%同一の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43と少なくとも80%同一の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、実施形態15〜21のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態23.
(a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および/または
(b)配列番号43の軽鎖(LC)配列
を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
実施形態24.ヒトTrkB受容体を促進し、BDNFと競合せず、かつ、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用を増強する、実施形態15〜23のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態25.Fc領域が無効化されている、実施形態1〜24のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態26.合成配列、ヒト化配列、またはキメラ配列を含んでなる、実施形態1〜25のいずれか1つに記載のTrkB結合アゴニスト。
実施形態27.実施形態1〜26のいずれか1つで定義されるTrkB結合アゴニストをコードする核酸配列。
実施形態28.重鎖をコードする配列番号44;および/または軽鎖をコードする配列番号45を含んでなる、実施形態27に記載の核酸配列。
実施形態29.実施形態27または28に定義される核酸配列を含んでなる発現ベクター。
実施形態30.実施形態27もしくは28に定義される核酸配列、または実施形態29に定義される発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
実施形態31.実施形態1〜26のいずれか1つに定義されるTrkB結合アゴニストの生産のための方法であって、請求項30に定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養し、それにより、TrkB結合アゴニストが発現および精製されることを含んでなる、方法。
実施形態32.実施形態31の方法により生産されるTrkB結合アゴニスト。
実施形態33.実施形態1〜26または実施形態32のいずれか1つに定義されるTrkB結合アゴニスト、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤のうち1つまたは組合せを含んでなる、医薬組成物。
実施形態34.療法において使用するための、実施形態1〜26もしくは実施形態32のいずれか1つに定義されるTrkB結合アゴニスト、または実施形態33に定義される医薬組成物。
実施形態35.神経障害の処置において使用するための、実施形態1〜26もしくは実施形態32のいずれか1つに定義されるTrkB結合アゴニスト、または実施形態33に定義される医薬組成物。
実施形態36.神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、実施形態1〜26もしくは実施形態32のいずれか1つに定義されるTrkB結合アゴニスト、または実施形態33に定義される医薬組成物。
実施形態37.障害が神経変性疾患、視神経症、網膜変性病態、難聴を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および別のCNS障害である、実施形態35または36に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト。
実施形態38.障害が筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、アルツハイマー病(AD)、運動ニューロン病、パーキンソン病、プリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパシー、緑内障前部虚血性視神経症(AION)、非前部虚血性視神経症(non-anterior ischeamic optic neuropathy)(NAION)、外傷性視神経神経症、レビー遺伝性視神経症、加齢黄斑変性、神経性難聴、内耳性難聴、耳鳴、感音性難聴、混合性難聴、不安、気分障害、鬱病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、サルコペニア、肥満、オピオイド誘発性嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害および脳卒中である、実施形態37に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト。
実施形態39.処置が細胞生存、および/またはニューロン修復、および/またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、実施形態34、35、36、37または38のいずれか1つのTrkB結合アゴニスト。
実施形態40.療法において使用するための、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強剤。
1.TrkBアゴニスト
TrkB受容体に対するマウスモノクローナル抗体は、HEK293−6E細胞株発現および精製を用いて作製された組換えヒトTrkB細胞外ドメイン(以下、TrkB−ECDと呼称、配列番号1、D1−D2−D3−D4−D5−JM、C32−H430、399アミノ酸)によるBalb/cマウスの免疫誘導により作製した。免疫誘導に用いたTrkB−ECDは、GSAリンカーを介してFLAGタグを付加し、C末端にHisタグ(5His残基)を有した(FLAGタグ−GSA−C32−H430−His5)。ハイブリドーマ融合クローンのスクリーニング(約3000ウェル)は、(i)直接的抗原ELISA(すなわち、TrkB−ECDと結合する)と(ii)TrkB活性化依存性NFATプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイ(すなわち、TrkBのアゴニスト)の間に相関を示したクローンを選択することにより行った。この選択基準により、マウスアゴニスト抗体1G11、3A3(3B3と同じ抗体配列)、8E5、5D11(3E10と同じ)、5C7(5E6と同じ抗体配列)、3A4、および2A1を発現する複数のハイブリドーマクローンの同定に至った。
1.1 親和性
1G11は、ヒトTrkB−ECDと、表面プラズモン共鳴で決定した場合に約42nM(kon=5.66×10/Ms、koff=0.00239/秒)の親和性で結合することを示した。1G11の親和性を表3に、同定された他のアゴニスト抗体の親和性とともに示す。
1.2 受容体選択性
TrkAまたはTrkBまたはTrkCのいずれかを発現するCHO−K1細胞におけるTrk活性化依存性NFATプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイを用いたTrkファミリー受容体に対する1G11の選択性の評価から、1G11はTrkB受容体発現細胞でリポーター遺伝子発現を選択的に誘導したが、TrkAまたはTrkC受容体発現細胞では供試濃度(0.00006〜125nM)では誘導しなった。対照として、同族リガンド(TrkAに対してはNGF、TrkBに対してはBDNFおよびTrkCに対してはNT−3)は、対応するTrk受容体発現細胞において匹敵するレベルのリポーター遺伝子発現を誘導した。1G11はまた、汎ニューロトロフィン受容体p75NTRとの結合能に関しても試験した。細胞に基づく結合アッセイは、p75NTR受容体に対する1G11の検出可能な結合を示さなかった。TrkBアゴニストの受容体選択性を表3にまとめる。
1.3 交差種反応性
1G11は、齧歯類(マウス、ラット)、カニクイザル、およびヒトTrkB受容体と結合し、活性化する。2A1および5D11はまた、ラット、マウスおよびヒトTrkB受容体も活性化する。興味深いことに、3A3および8E5は、ヒトTrkB受容体のみを活性化し、齧歯類TrkB受容体を活性化しない。この種交差反応性は、異種細胞株または対応する種に由来する初代細胞またはヒトiPSC由来細胞において組換え発現されたTrkB受容体を用いて試験した。TrkBアゴニストの種選択性を表3にまとめる。
1.4 TrkBの活性化
CHO−K1を安定発現するヒト全長TrkB受容体(配列番号2)を1G11で処理すると、TrkBのリン酸化レベル(pTrkB、Y515)により測定した場合に3.1±2.1nM(平均±S.D.、n=8)の平均EC50でTrkBの活性化をもたらした。TrkBアゴニストのTrkB活性化効果を表3にまとめる。1G11はそれ自体、同族リガンドBDNF(ならびにNT−4)最大応答の約30〜40%のTrkB受容体を活性化する。
1G11は、ラット皮質ニューロンにおいてTrkBおよびその下流シグナル伝達経路の持続的活性化(最大24時間)を誘導したが、このことは、1G11はTrkBに曝された際に、その受容体をBDNFに比べて長時間活性化状態で維持できることを示す(図1A参照)。機構的に、1G11により誘導されるTrkB活性化はBDNFとは異なる。活性化されたチロシンキナーゼ受容体は一般に、エンドサイトーシスを受けた後、分解されて細胞表面受容体のダウンレギュレーションをもたらし、それにより、細胞内恒常性を維持するために一時的にリガンドに不応となる。興味深いことに、1G11は、ラット皮質ニューロンにおいてTrkBの表面レベルを最大4時間変化させなかったが、細胞表面ビオチン化により測定した場合のTrkB受容体の全細胞レベルの低下にもかかわらず、非処理対照に比べて24時間時点でレベルは上昇した(図1B参照)。
1.5 BDNF競合
TrkB受容体に対する1G11の活性化効果を、BDNFの存在下および不在下の両方でTrkBリン酸化により判定した。BDNFの存在下でのTrkBアゴニストの競合効果は、TrkBリン酸化の低下として定義された。全長TrkB受容体を過剰発現すCHO細胞における、飽和BDNF濃度(10nM、EC100)の存在下でのTrkBリン酸化に対する種々の濃度の1G11の効果の評価は、1G11がTrkBに関してBDNFと競合しないことを明らかにした。BDNFと競合することが同定された唯一TrkBアゴニストが5D11であり、これはBDNFにより誘導されるTrkBリン酸化を約50%低下させた。TrkBアゴニストのBDNF競合結果を表3にまとめる。
1.6 TrkBアゴニスト競合アッセイ
TrkBアゴニストmAbのエピトープ結合特性を分析するために、競合アッセイを、TrkBアゴニストが互いに競合し合うかを決定し、TrkB上の類似または重複するエピトープと結合するものを一緒に分類することを可能とするように設定した。TrkB−ECDをチップ表面に固定し、単一のTrkBアゴニストmAbをTrkBとの結合のためにフローセルに注入した。次に、第2のTrkBアゴニストmAbを注入し、第1のTrkBアゴニストmAbの存在下でのTrkB−ECDに対するその結合能を評価した。競合は、第2のTrkBアゴニストの結合が20%未満である「無し」;第2のTrkBアゴニストの結合が20〜60%である「部分的」;および第2のTrkBアゴニストの結合が60%を超える「有り」として分類した。従って、第2のTrkBアゴニストの結合「無し」は競合無しと結論付けられ、よって、非重複エピトープと結合するこれら2つのTrkBアゴニスト、あるいはまた第1のTrkBアゴニストの結合は、TrkB−ECDコンフォメーションを第2のTrkBアゴニストが結合できないような様式で変化させる。「部分的」および「有り」は、TrkB上の類似または重複するエピトープとの結合に関する2つのTrkBアゴニストの競合として結論付けられた。
TrkBアゴニストの競合結果を表3にまとめる(1G11、または3A3、または8E5との競合)。表2は、1G11、3A3、および8E5がTrkB上の類似または重複するエピトープとの結合に関して互いに競合するTrkBアゴニストを一緒に分類され得ることを示す。
1.7 BDNFの増強
BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用に対する1G11の増強効果を、BDNFの存在下でTrkBリン酸化レベル(pTrkB、Y515)を測定することにより評価した。全長TrkB受容体(配列番号2)を過剰発現するCHO細胞における、飽和BDNF濃度(10nM、EC100)の存在下でのTrkBに対する種々の濃度の1G11の効果の評価は、図2に示されるように最大応答で表した場合、処理30分後のTrkB活性の化定常レベルを増強するという結果を示した(BDNF−100%;BDNF+1G11−約100%〜145%)。
図2に示されるように、飽和BDNF濃度の存在下での他のTrkBアゴニストの評価は、3A3および8E5もまたTrkB受容体の活性化を「増強した」ことを明らかにした(それぞれ約100〜165%、および約100〜120%)。これらの結果を表3にまとめる。
興味深いことに、クローン5C7、5E6、3A4および2A1は競合せず、BDNFにより媒介されるTrkB受容体の活性化を増強もしなかったが、このことは(a)総てのアゴニスト抗体が増強特性を保持するわけではないこと、および(b)総てのリガンド非競合抗体が増強剤となるわけではないことを示す。
図2は、TrkB抗体−増強剤および非競合物(3A3、1G11、8E5)、競合物(5D11)、非競合物(2A1、3A4、5C7)に関する代表的で0他を示す。100%活性は、飽和濃度、すなわち、10nM EC100のBDNFにおけるTrkBの活性化を表す。
BDNFレベルは、ほとんどの神経学的および病態生理学的疾患において低下していることが報告されており、表現型/欠乏がこの低下に帰されてきた。TrkB受容体レベルが不変のままであるBDNF欠乏の病態生理学的状態下では、投与されるTrkBアゴニストが、(i)TrkB受容体を活性化すること(例えば、1G11、3A3、8E5、5D11、5C7、5E6、3A4および2A1)、(ii)低レベルのBDNFと競合しないこと(例えば、1G11、3A3、8E5、5C7、5E6、3A4および2A1)、(iii)BDNFの生理的レベルの低下により誘導される細胞内シグナル伝達を増強すること(例えば、1G11、3A3、8E5)、および(iv)そうでなければTrkBアゴニストに対する一時的脱感作をもたらし得るTrkBの細胞表面レベルを変更することがないこと(例えば、1G11)が可能であれば、生理的な細胞/系の応答がなお惹起され得る。このデータもまた表3にまとめる。
1.8 NT−4の増強
同様に、1G11は、NT−4と競合できず、かつ、飽和レベルのNT−4の存在下でNT−4により誘導されるTrkBの促進作用に対する「増強」効果を示し得なかった(NT−4−100%;NT−4+1G11−約130%;表3)。従って、3A3および8E5もまたNT−4により誘導されるTrkBの促進作用に対して増強効果を有すると予想される。
1.9 細胞生存および修復
1G11は、濃度依存的にヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞株において神経突起の生存を増進し、神経突起の成長を誘導した(それぞれ平均EC500.025±0.01nMおよび0.19±0.06nM)。1G11は、ラット脳および脊髄由来ニューロン、マウス脳由来ニューロンで内因的に発現されたTrkB受容体、およびCHO細胞において組換え発現されたカニクイザルTrkBを活性化した。
同様に、8E5および3A3も、それぞれEC50 0.09±0.06nM(平均±SD)および0.006±0.001nM(mean±SD)で細胞生存を増進した。
8E5は濃度依存的にEC50 1.58±0.34nM(平均±SD)で神経突起成長を誘導したが、3A3は、漸増抗体濃度で二相型の神経突起成長応答を一貫して示し、正確なEC50を導くことを困難にする。
2.1G11、3A3、および5D11の配列決定
従来技術によりTrkBアゴニストの配列決定を行った。CDRをKabatにより決定し、表4に1G11、3A3、8E5、および5D11に関して示す(注:異なるナンバリング慣行により決定された1G11に関するCDR領域は表1に示す)。1G11(配列番号27および28)、3A3(配列番号29および30)、8E5(配列番号31および32)、ならびに5D11(配列番号33および34)のそれぞれの全長マウス配列(重鎖および軽鎖)も表4に示す。
2.エピトープ
TrkB一次アミノ酸配列はマウス、ラット、カニクイザルおよびヒト間で保存性が高く(全長配列の95%)、特に、実施例1で同定された総てのTrkBアゴニストが結合する細胞外ドメインで保存されている。TrkB上の結合エピトープを決定するために、ドメイン欠失およびアラニンスキャニング突然変異誘発(表面プラズモン共鳴を使用)によるエピトープマッピング試験ならびにTrkB ECD(配列番号1)を用いたX線結晶試験を行った。TrkB ECDは、5つのドメイン(D1−D3:C32〜C194; D4:G195〜V283;D5:H284〜G380)と短い膜近接JM領域(W381〜H430)を含む。エピトープマッピング試験に用いたTrkB−ECDは、GSAリンカーを介してFLAGタグが付加され、C末端にHisタグ(5His残基)を有した(FLAGタグ−GSA−C32−H430−His5)。
欠失ドメイン変異体を作出した:D1−D3ドメイン変異体はC32〜L196(配列番号35)を含み;D4−D5−JMドメイン変異体はP197〜H430(配列番号36)を含み、D5−JMドメイン変異体はH284〜H430(配列番号37)を含む。
アラニンスキャニング突然変異誘発試験(2.2、2.3および2.5)のため、単一点突然変異体を挙げられたようにTrkB−ECD(配列番号1)に作出した:
2.1 TrkBとBDNFの間の結合
TrkBのD5ドメイン(残基286〜384)はリガンド(BDNF/NT−4)との結合に関して全長TrkBに取って代わり得ることが知られている。TrkBのリガンド結合部位内には、「保存パッチ」と「特異性パッチ」の2つの接触領域が存在する。保存パッチ内のTrkB D5の接触残基は、AB、C’DおよびEF βシートの間のループとD5ドメインのC末端に由来する。TrkBの保存パッチはリガンド(BDNF/NT−4)の軸に結合する。特異性パッチにおけるTrkB D5の接触残基は、ABED βシートの外面に由来する。TrkBの特異性パッチは、非配位形態では配向をとらず、TrkBとの結合時に配向するようになるリガンド(BDNF/NT−4)のN末端と結合する。BDNF/NT−4ホモダイマーと2つのTrkB D5ドメインの間の構造的相互作用を図3にまとめる。
2.2 1G11のエピトープ
種々のTrkBドメイン欠失変異体を用いた1G11の最初の表面プラズモン共鳴結合分析により、1G11はTrkB−ECD(C32〜H430)、D4−D5ドメイン変異体(P197〜H430)、およびD5ドメイン変異体(H284〜H430)と結合するが、D1−D3ドメイン変異体(C32〜L196)とは結合しないことが明らかになった。
TrkB−ECD内、ほとんどはD4−D5−JMドメイン内の約80の単一点アラニン突然変異体を用いた1G11の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として8つのアミノ酸が同定され、最も重要なものを最初に示すと、F291、E293>K372、E210、T288、D370>F285、T290となる。D4ドメインあるE210を除き、総ての残基がTrkBのD5ドメインに由来する。
TrkBのD5−JMドメイン(配列番号37)と複合体を形成した1G11キメラFab1[1G11由来可変領域とヒトIgG1の定常領域の融合物](配列番号38および39)の2.3Å分解能での共結晶構造により、IG11に密接に接近するTrkBのD5−JMドメイン上の14残基が明らかとなった(距離カットオフ4.5Åを使用)。これら同定された14残基は、アラニンスキャニング分析によっても同定されたもの(T288、F291、K372、E293)、ならびにX線結晶学によってのみ同定された近接する他のアミノ酸残基(I289、T290、L292、S294、K308、D358、E371、Q373、I374、S375)を含んだ。2.3Å分解能で距離カットオフ3.5Åを用い、7残基(290、293、294、372、373、374、375)が同定された。
このエピトープに関与する相互作用を、CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(Molecular Operating Enviroment)を用いて定義した。TrkBのD5−JMドメイン上の、1G11キメラFab1の7Å以内のタンパク質残基を選択し、次いで、「リガンド相互作用」ツールをデフォルトパラメーターともに使用して、これらの残基と相互作用すると思われる相互作用分子から水分子または残基を同定した。このツールがタンパク質残基よりもむしろ小分子リガンドの相互作用を定義するように設計されているために、選択された各残基の「リガンド相互作用」が個々に計算されたことに留意されたい。MOEにより定義された相互作用は、鎖内相互作用を削除するよう、また、2鎖間で架橋を形成したものとは別の、総ての水の相互作用を削除するようにエクセルで編集された。残った相互作用残基は次の通りである:
・1G11キメラFab1残基との直接的相互作用
Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375
・1G11キメラFab1残基との直接的相互作用、および水を介した間接的相互作用
Lys372、Gln373
・水を介した間接的相互作用のみ
Glu341
共結晶構造の分析とアラニンスキャン突然変異誘発は互いに補完および補強し合い、TrkBアゴニストと相互作用するかまたは構造的相互作用を介して間接的に結合に影響を及ぼす、TrkBのD5−JMドメイン内の残基を同定する。
アラニンスキャニングデータおよびX線データを用い、最低でもK372とE293は1G11が結合するTrkBエピトープの一部であると見られる。このデータを表5にまとめる。
E293は、D5 βシートAとA’の間に位置し;K372は、D5 βシートG内に位置する。残基T288およびT291(アラニンスキャニングおよび近接分析により同定)は、D5 βシートA内に位置する。
アラニンスキャニングによって同定された残基を図4Aに示し、共結晶X線結晶学的近接分析によって同定された残基を図4Bに示す。図4では、TrkB D5と結合した1G11 Fabの共結晶構造からのD5 TrkBドメインを、NT−4ホモダイマーと結合したヒトTrkBドメインD5の公開されている共結晶構造からの同じTrkBドメインと重ね合わせて、1G11 Fabに関して、リガンドに対するTrkBの結合を配向させた。次に、ヒトBDNF/NT−4ヘテロダイマー由来のBDNF鎖を重ね合わせて、BDNF上のTrkBの潜在的結合部位を示した。NT−4ホモダイマーと結合したヒトTrkBドメインD5の公開されている共結晶構造からのTrkB D5のC末端は、公開されている/利用可能な結晶構造データが無いため、この欠落領域の潜在的長さを示すために、膜近接(JM)領域をつないで膜貫通領域まで、β−ストランド形状を用いて延伸させた。この構造はリボン表示形式を用いて示し、潜在的TrkBエピトープとして示される残基については、これらの構造上に原子を示した。
図4Aおよび4Bから、1G11のエピトープは、TrkB D5ドメイン上に、BDNF/NT4「保存パッチ」リガンド結合部位(AB、C’DおよびEF βシート間のループとD5ドメインのC末端)に近接し、かつ、BDNF/NT4「特異性パッチ」リガンド結合部位(ABED βシートの外面)の近位に位置することが見て取れる。より詳しくは、TrkBドメイン5上の1G11エピトープは、D5 βシートA、D5 βシートAとA’の間の領域、およびD5 βシートGに沿って、特異性パッチのABED βシートの外面近位にあると見られる。TrkB上の1G11エピトープはBDNF/NT4リガンド結合部位と直接重複することはないという事実から、おそらくは、1G11がTrkBと結合し、かつ、TrkBがBDNF/NT−4と結合して、三元複合体「TrkBアゴニスト+TrkB+リガンド」を形成することが見込まれる。
1G11、TrkB、BDNF/NT−4成分の重ね合わせのさらなる分析は、NT−4/BDNFのN末端がTrkBと1G11 Fabの重鎖の間の空間に突出していることを示す(図5参照)。この重ね合わせに分子表面を加えると、Vκ CDR L1とL3、およびCDRH3がTrkBと密接に相互作用し、TrkBとCDR H1およびH2の間に、BDNFのN末端に適合している可能性が想定され得る溝が存在することが示される(図6参照)。よって、BDNFの存在下でのTrkBに対する1G11の結合はまた、BDNFのN末端への結合も含む可能性があり、この結合がおそらく三元複合体を安定化させてBDNFの機能的応答の増強に至る。従って、TrkBに加えて1G11も、リガンド(BDNF/NT−4)のN末端と相互作用し得る可能性がある。あるいは、1G11は、リガンド結合部位においてではなくそれと近接して結合することにより、TrkBとリガンドの間の相互作用を安定化させる可能性もある。
パラトープに関与する残基は、近接分析(距離カットオフ4.5Åを使用)による共結晶構造の分析により、また、CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(Molecular Operating Enviroment)を用いてエピトープと相互作用する残基を定義することにより同定した。パラトープ内の主要結合残基は、CDR L1(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
L3(太字の残基はエピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
およびH3(太字の残基はエピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRH2内でエピトープの4.5Å以内に接近する残基は2つだけであり、直接的相互作用するものは1つだけである(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRH1内でエピトープに接近するまたは(間接的に)接触するのは唯一、一残基だけであり(太字の残基は、エピトープの4.5Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
CDRL2でエピトープに接近するのは一残基である(太字の残基は、エピトープの4.5Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に(水を介して)エピトープと相互作用するものを表す:
よって、順位付けの観点から、CDR L1、L3およびH3は結合に最も重要であり、次いで、CDRH2、次いで、CDRL2およびCDRH1である。
2.3 3A3のエピトープ
TrkB−ECD内、ほとんどはD4−D5−JMドメイン内の約80の単一点アラニン突然変異体を用いた3A3の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として9つのアミノ酸が同定された(E398、Y397、D399、Y400>D394、I396>V395、N389、T402)。このデータを表5にまとめる。これらの残基は総て、TrkBのD5ドメインのC末端で、膜貫通領域のN末端であるJM領域にある(図7参照−JM残基はβ−ストランド形状を用いて延伸した)。この膜近接(JM)領域は、結晶構造が存在しなければ、長いフレキシブルリンカー領域であると仮定される。このJM領域もリガンドとの結合に重要であり得ると思われる。
3A3が結合するTrkBエピトープは1G11のエピトープとは異なると思われるが、3A3はTrkBとの結合に関して1G11(および8E5)と競合し、従って、これらのエピトープは何らかの形で重複し得る(上記の実施例1.6参照)か、またはJMもしくはD5ドメインとの結合が他の抗体の結合エピトープを変化させてコンフォメーション変化をもたらし得ることに着目することが重要である。膜近接(JM)領域の長いフレキシブルリンカーはD5 βシートA、BおよびGに実際に近接している可能性がある。
3A3はまた、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強を示す(上記実施例1.7参照)。従って、3A3がTrkBと結合すると、それもBDNF/NT−4と何らかの付加的相互作用を持ち(例えば、リガンドのN末端を介する)、かつ/または同様受容体とリガンドの複合体を安定化させる可能性がある。
興味深いことに、この試験により、膜近接領域内の残基D394、I396、およびY400は、これらの残基がラットTrkBと異なり(それぞれGlu、Leu、Trp)、かつ3A3はラットTrkBを活性化しないことから、ヒトTrkB受容体に特異性を付与することが明らかになった。
2.4 8E5のエピトープ
8E5の結合エピトープを決定する目的で、アラニンスキャン突然変異誘発研究も結晶学的研究も行われなかった。しかしながら、8E5はTrkBとの結合に関して1G11(および3A3)と競合し、従って、これらのエピトープは何らかの形で重複し(上記の実施例1.6参照)か、またはJMもしくはD5ドメインとの結合が他の抗体の結合エピトープを変化させてコンフォメーション変化をもたらし得ることに着目することが重要である。8E5はまた、BDNFにより誘導されるTrkBの促進作用の増強も示す(上記実施例1.7参照)。8E5は3A3と同様にヒトTrkB特異的であると事実は、このエピトープも3A3と同様に、おそらく、その配列が齧歯類とヒトの間で異なるJM領域内にあることを暗示している(表5参照)。
2.5 5D11のエピトープ
TrkB−ECD内、ほとんどはD4−D5−JMドメイン内の約80の単一点アラニン突然変異体を用いた5D11の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として6つのアミノ酸が同定された(N350>H299、D349>H300、K328、K333)。このデータを表5にまとめる。図8は、5D11のエピトープはリガンド結合部位(D5ドメインのAB、C’DおよびEF βシート間のループ;およびD βシート)にあることを示す。これは、TrkBリン酸化アッセイで測定した場合に5D11がBDNFと競合するという事実と完全に一致する。
2.6 増強抗体
実施例1および2からの結果に基づけば、(i)TrkBのBDNF結合部位に近接し、特に、リガンドのN末端と結合する特異性パッチの近位にあるTrkBエピトープと結合し、かつ、BDNF/NT−4の存在下で増強または安定化されるTrkBとの結合を可能とするTrkBアゴニスト:すなわち、TrkB−BDNF増強剤;(ii)リガンド結合部位内にまたはそれに近接して結合し、かつ、受容体とリガンドの間の相互作用を不安定にするTrkBアゴニスト:すなわち、BDNF競合物;および(iii)BDNF結合部位から離れたエピトープに結合するTrkBアゴニスト、すなわち、増強機能を持たない単純なアゴニストが存在する。
1G11、3A3および8E5は、BDNFと競合せず、2つのエピトープと結合すると思われる(8E5エピトープは未判定)増強剤の例である。これらのエピトープへの結合はBDNFの存在下でTrkB受容体を活性なコンフォメーションで安定化させ、また、(a)抗体により活性化されるTrkBの利用可能な細胞表面レベルを上昇させ;かつ/または(b)活性化されたTrkB受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害する可能性がある。
TrkBのECDの可溶性末端切断型(TrkB_H284−H430 ECD−6H)と3A3または1G11またはBNDFの二元複合体の形成を評価するためにSEC−MALSを行った。総ての場合で、二元複合体の存在が検出できた。また、TrkBのこの構築物とBDNFおよび3A3の間、および/またはTrkB、BDNFおよび1G11の間で三元複合体が形成されたかどうかを評価するためにもSEC−MALSを使用した。TrkB、BDNFおよび3A3試験は、三元複合体の存在の明らかな証拠を示さなかった。この試験では二元複合体も三元複合体も検出できず、複雑な溶液挙動およびSEC−MALSによっては可視化できないより高次の種の形成が示唆される。TrkB、BDNFおよび1G11試験からのデータもまた、単純な二元より高次の複合体の形成を示唆した。この場合、これらの、単純な二元より大きい種のいくつかが検出できた。しかしながら、これらの高分子量種の成分は正確に決定できなかった。従って、両抗体による増強は三元複合体の形成から生じ得るという可能性が残っている。
2.6 水素重水素交換
数種の他の潜在的タンパク質パートナーの存在下または不在下での、hisタグを有するD5−JM TrkBの交換比をモニタリングするためにHDX−MSを使用した。以下のタンパク質溶液は、個々の成分を、50mMリン酸Na、150mM NaCl pH7.0の非重水素化HOバッファーを希釈することにより調製した。
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);1G11 mAb(40μM;総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);3A3 mAb(40μM総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);BDNF(40μM;総てのTrkBが二元複合体で存在することを保証するため)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);1G11 mAb(20μM);BDNF(20μM)
・TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284−H430(D5−JM)−5His(20μM);3A3 mAb(20μM);BDNF(20μM)
HDX標識反応は、標準HDX法を用い、周囲温度にて、非重水素化バッファーから重水素化バッファー(DO中、50mMリン酸Na、100mM NaCl、pH6.6)へ20倍希釈で行った。交換サンプル(1〜3反復)を4時点:0秒(すなわち、非重水素化バッファーへの希釈時)、15秒;60秒および300秒に採取した。これらのサンプルを、予冷した低pHの変性急冷バッファー(400mMリン酸ナトリウム、8MグアニジンHCl、500mM(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン)、pH2.2)を用い、4℃で急冷した。
これらの変性急冷サンプルを固定化ペプシン消化カラム(Waters Enzymate BEH、2.1mm×30mm、Part no:186007233)に、240秒の消化時間、カラム流速100μl/分、および0.2%ギ酸水溶液の消化バッファーを用い、15℃で注入した。遊離したペプチドを0℃にて、1.0×100mm UPLC BEH C18カラム(Part no 186002346)を一般に15分の流動時間、移動相A:HO/ギ酸(99.8:0.2v/v)および移動相B:ACN/ギ酸(99.8:0.2v/v)とともに流速40μl/分で用いるAcquity UPLCシステムでのUPLC−MSにより分析した。
非重水素化タンパク質のタンパク質分解により生成されたペプチドを、対象とするタンパク質配列のみを含むデータベースに対して、ProteinLynxGlobal SERVER(http://www.waters.com/waters/en_GB/ProteinLynx-Global-SERVER %28PLGS%29/nav.htm?cid=513821&locale=en_GB)、またはMascot検索エンジンを用いて同定した。各時点および状態に対する重水素組み込みを、DynamX分析ソフトウエアv3.0(またはHD Examiner)を用い、PLGSからインポートした非重水素化ペプチドリストを重水素化サンプルに関して取得したデータと比較することにより計算した
各ペプチドの重水素化データを手作業により評価し、質の悪いデータを与える電荷状態またはペプチドを分析から除いた。
結果
1G11の存在下のTrkBは、TrkBペプチドに見られる重水素交換速度の特性に有意な変化を示した。画分の重水素化合物更新の違いのプロット(図9)は、TrkBペプチド領域284〜291に強い重水素化保護を示す。これは検討した総ての時点にわたって強い保護を維持し、この領域がTrkBと1G11との相互作用におそらく重要であることを示唆する。より微妙な交換保護がTrkBの中央領域およそ316〜380に見られ、ここにおける付加的残基がこの相互作用に役割を果たし得ることを示唆する。
3A3の存在下のTrkBは、TrkBペプチドに見られる重水素交換速度の特性に有意な変化を示したが、15秒と60秒の最も初期の交換時点のみであった。画分の重水素化更新の違いのプロット(図10)は、領域385〜398を含むTrkBペプチドに最も強い重水素化保護を示す。しかしながら、この保護は300秒の交換時点では失われる。TrkBに関するこの領域の極めて急速な重水素化と考え合わせると、このデータは、この領域が溶媒に曝されている可能性があり、急速に重水素化され、3A3との相互作用を介した重水素化からの保護は不完全であり、その速度は緩徐化されるものの、このより緩慢な速度であっても300秒以内に飽和重水素化に到達することを可能とすることを示唆する。
TrkB単独;TrkB−3A3 mAb;BDNFの存在下のTrkB−1G11 mAb。TrkB単独またはTrkB−mAb複合体のいずれかへのBDNFの添加は、TrkBの重水素化にロバストな変化を与えず、従って、TrkB−mAb−BDNF三元複合体の存在または不在のいずれも示すことができなかった。
3.ヒト化1G11、3A3、5D11
3.1 ヒト化
1G11、3A3および5D11をヒト化した。これらの配列は次の通りである。
ヒト化1G11重鎖可変(VH)領域−配列番号40;軽鎖可変(VL)領域−配列番号41;重鎖(HC)−配列番号42;軽鎖(LC)−配列番号43;HCをコードするDNA−配列番号44;LCをコードするDNA−配列番号45。
ヒト化3A3重鎖可変(VH)領域−配列番号46;軽鎖可変(VL)領域−配列番号47;重鎖(HC)−配列番号48;軽鎖(LC)−配列番号49;HCをコードするDNA−配列番号50;LCをコードするDNA−配列番号51。
ヒト化5D11重鎖可変(VH)領域−配列番号52;軽鎖可変(VL)領域−配列番号53;重鎖(HC)−配列番号54;軽鎖(LC)−配列番号55;HCをコードするDNA−配列番号56;LCをコードするDNA−配列番号57。
重鎖および軽鎖のマウスCDRを、当技術分野で標準的な手順:ヒトV遺伝子生殖細胞系データベースに対するCDRマスク可変(V)領域配列の検索、配列類似性に基づいて選択されたVおよびJ遺伝子鋳型配列を用い、好適なヒトフレームワーク配列にグラフトした。潜在的な復帰突然変異をヒトとマウス間の比較に基づいて同定した。
1G11の重鎖のマウスCDRをIGHV1_69重鎖フレームワークにグラフトし、3つのヒト化重鎖変異体を作出した:1つはCDRの線形グラフトであるもの(H0)、第2の変異体はkabat47番に復帰突然変異を組み込んだもの(W47C)(H4)、および第3の変異体は47番にセリン残基を組み込んだもの(W47S)(H7)。
1G11の軽鎖のマウスCDRをIGKV3_11ヒトフレームワークにグラフトし(Lo1)、また、Kabat49番のチロシンのリシンへの単一の復帰突然変異(Y49K)を有するIGKV3D−15ヒトフレームワークにグラフトした(Ln1)。
1G11のヒト化変異体を作出し、TrkB−ECDとの結合に関して、また種々の機能アッセイで試験した。Ln1変異体は、Lo1変異体に比べて結合に有意な違いを示さなかった。
しかしながら、CDRH2の直前である重鎖のKabat47番にヒトフレームワーク残基トリプトファン(W47)を有する変異体は、TrkBの結合の有意な低下を示した。重鎖のKabat47番のトリプトファンはヒト抗体で100%保存されており、重鎖−軽鎖境界にある。W47C/S復帰突然変異が導入されると、TrkBに対する結合が回復した。システインおよびセリンは類似の大きさのアミノ酸であり、両突然変異とも、マウス親1G11のものに類似するヒト化1G11の結合および機能的特性を保持していた。従って、重鎖の47番における類似の大きさの他のアミノ酸も結合および機能を保持すると予想される。例えば、他の可能性のある置換としては、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnが含まれる。また、重鎖の47番にトリプトファンが維持されていれば、重鎖−軽鎖境界構造を回復させる、従ってTrkBに対する結合を回復させる他のフレームワーク変化も存在し得ると予想される。
ヒト化1G11は、重鎖可変鎖のKabat47番にセリン突然変異が組み込まれた、ヒトフレームワークへの1G11 CDRの線形グラフト(H7、Lo1)である。
ヒト化1G11は、突然変異L235AおよびG237A(EUナンバリング)で修飾されたヒトIgG1 Fc領域を含む。IgG1 Fc領域のこの修飾はFcγ受容体およびC1qへのmAbの結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞傷害(CDC)によりTrkB陽性細胞の枯渇を誘導するmAbの能力を低下させる。これは一般にFc無効化と記載される。
ヒト化1G11を、C1qおよび種々のヒトおよびカニクイザルFc受容体(FcRn、FcγR I、FcγR IIaH、FcγR IIaR、FcγR IIb、FcγR IIIaVおよびFcγR IIIaF)とのその結合能に関して表面プラズモン共鳴により評価した。これらの結果は、予想されたように、重鎖におけるFcを無効化するL235AおよびG237A突然変異の導入はFcRnに対するヒト化1G11の結合には影響を及ぼさなかったが、C1q、FcγR I、FcγR IIaH、FcγR IIaR、FcγR IIb、FcγR IIIaVおよびFcγR IIIaFに対する結合を低下させたことを示した。
ヒト化1G11はFcが無効化されているが、マウス1G11はされていないことに留意されたい。Fcエフェクター機能は、このTrkBアゴニストの生物学的機能には重要ではない。
3.2 ヒト化抗体の特性
TrkBに対する抗体の結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴、ならびにTrkBリン酸化アッセイを含むいくつかのアッセイで、ヒト化1G11をマウス1G11と比較した。これらのアッセイにおいて、ヒト化1G11は1G11に匹敵し、ヒト化の成功が確認される。ヒト化1G11は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、1:1結合様式で、それぞれ約55nMおよび約60nMの親和性で組換えヒトおよびカニクイザルTrkB−ECDと結合した。ヒト化1G11は、ヒト全長TrkB受容体を安定に過剰発現するCHO−K1細胞において、リン酸化TrkBのレベルにより測定した場合、EC50 0.65±0.14nM(平均±SD、n=3)でヒトTrkB受容体を活性化した。ヒト化1G11はヒトTrkB受容体を選択的に活性化したが、ヒトTrkAまたはTrkC受容体を選択的に活性化することはなく、また、齧歯類(マウス、ラット)、カニクイザルおよびヒトTrkB受容体と交差反応し、これらを活性化する。
ヒト化1G11はBDNFと競合せず;かつ、それはCHO−K1細胞において、ヒトTrkBをEC50 0.65±0.14nM(平均±SD、n=3)で活性化し;飽和濃度のBDNFの存在下で、増強特性を保持し(BDNFに対して約120%)、すなわち、TrkB活性化のレベルを上昇させた。
in vitroにおいて、ヒト化1G11は、ヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞において、濃度依存的に、平均EC50 0.007±0.003nM(平均±S.D.;1G11=0.025±0.01nM)で、TrkBにより媒介される細胞生存を増進した。同じヒト全長TrkB受容体を安定発現するラットPC12神経芽腫細胞において、ヒト化1G11は、濃度依存的に、平均EC50 0.07±0.02nM(平均±S.D.;1G11=0.19±0.06nM)で、TrkBにより媒介される神経突起成長を増進した。
4.in vivo効果
ニューロン生存のSRAラットモデル
ニューロン生存に対する1G11のin vivo効果を、引き抜き(一側性)により誘発される脊髄運動ニューロン変性のラットモデルで評価した。簡単に述べれば、若年成体スプラーグ・ドーリー(sprague-dawley)ラットにおいて手術により第4腰髄節(L4)から前根を引き抜き、1週間回復させた後、静脈内に(単回ボーラスとして)またはくも膜下腔内(持続的)に1G11による介入を行った。持続的くも膜下腔内注入の場合、カテーテルをくも膜下腔に、L4−L5間の椎間孔を通して挿入し、他端を首の背部の比較に埋め込んだalzet 2002ミニ浸透圧ポンプに接続した。抗体介入まで、ビヒクル処方物をそのポンプにロードし、0.5μl/時の速度で送達した。
2種類の異なる用量の1G11(60μgまたは240μg/日)またはBDNF(陽性対照;12μg/日)の連続くも膜下腔内注入は、ラットSRAモデルにおいて2週間、ビヒクル処置群に比べて、明瞭な用量依存的応答なく、同程度にChAT発現ニューロン(抗ChAT抗体で染色)の生存を増進した(すなわち、反対側と比較)が、ビヒクル処方物(陰性対照)はそうではなかった。神経根引き抜き1週間後の1G11(0.03、0.1、0.3、1、3、30mg/kg)またはBDNF(陽性対照;12μg/日)の静脈内投与は、ChAT染色により可視化した場合に、脊髄ニューロン生存の暴露依存的増進を示したが、アイソタイプ対照(IgG1、3mg/kg)またはビヒクル処方物(陰性対照)はそうではなかった。1G11は、1、3、および30mg/kg(≦0.3mg/kgでは無視できる効果であった)で種々の程度までChATニューロンを救済することができた。
まとめると、1G11は、単回のボーラス静脈内尾静脈注射としてまたは連続的くも膜下腔内注入により投与した場合、一側性の(L4前根)引き抜きラットにおいて損傷7日後に脊髄ChATニューロンの生存を増進した。
歩行機能(hSOD1 G93A マウス)
ニューロン生存(上記の通り)に対する1G11の効果に加え、1G11の機能的効果をコンジェニックB6Cg−Tg(hSOD1G93A)1Gur/Jトランスジェニックマウスにおいて検討した。hSOD1 Tgマウスは、疾患が発症および進行すると、種々の歩行パラメーターに減損を示す。ビヒクル処方物(陰性対照)はそうではなかったが、1G11(0.3mg/kg)は、雌のコホート(約3.5か月齢)において、28日間2週間毎に(介入期間中2回)尾静脈ボーラス注射により投与した場合に、hSOD1−ビヒクル対照に比べてhSOD1マウスで種々の程度まで歩行特徴を有意に改善し、走行速度、歩調(歩/秒)、歩行周期時間、および立脚時間は野生型同腹子のものにほぼ匹敵し;歩調に対する効果は比較的大きくなく;揺動速度に対する効果はずっと低かった。これらの結果は、1G11は、静脈内に投与した場合、hSOD1G93Aトランスジェニックマウスにおける歩行欠陥を改善することができたことを示す。
歩行および神経学的スコアに対する1G11の効果をさらに評価するために、マウス(雄および雌、試験の開始時におよそ3.5か月齢、各群各性につき少なくとも16個体のマウス)に表6に従って投与を行った。この試験は無作為化、プラセボおよびアイソタイプ対照、二重盲検様式で行った。
8時点:97日目(ベースライン)、99日目(第1用量の1日後)、111日目(第1用量の13日後)、113日目(第2用量の1日後)、125日目(第2用量の13日後)、139日目(第3用量の13日後)、146日目(第4用量の7日後)および153日目(第4用量の13日後)に、齧歯類CatWalk Systemを用いて動物に歩行分析を行った。6種の歩行パラメーター(走行速度、歩長、立脚時間、歩行周期時間、歩調および揺動時間)を分析のために選択した。結果は、1G11が両性に対して、特に125日目および139日目に、IgG1アイソタイプ対照に比べてhSOD1−G93Aマウスにおいて歩行特徴を有意に改善したことを示した。平均して、低用量群に比べて高用量群で歩行特徴により良好な改善があった。
神経学的スコアは、全試験期間を通じて総てのhSOD1−G93A動物についてモニタリングした。ログランク検定は、1gG1アイソタイプ対照に比べて、1mg/kgおよび0.3mg/kg両方の1G11が雌マウスについては死亡までの中央時間を著しく引き延ばしたことを示した。雄マウスでは、0.3mg/kgのhSOD1−1G11群は死亡までの中央時間を著しく引き延ばしたが、1mg/kgのhSOD1−1G11群はIgG1アイソタイプ対照に比べて改善をあまり示さなかった。ウィルコクソン検定は、雌マウスに関して、1mg/kg 1G11はIgG1アイソタイプ対照に比べて振戦発生までの中央時間を著しく引き延ばしたが、0.3mg/kg 1G11はそうではなかったことを示した。雄マウスでは、1mg/kgおよび0.3mg/kgの両方の1G11が、IgG1アイソタイプ対照に比べて振戦発生までの中央時間をわずかに引き延ばした。
まとめると、これらの結果は、1G11は、静脈内投与した場合、両性のhSOD1−G93Aトランスジェニックマウスの歩行欠陥を改善でき、両性の振戦発生を遅延させ、hSOD1−G93Aトランスジェニックマウスの雌においてのみ、全「生存期間」を改善できたことを示す。
運動ニューロンの生存(hSOD1 G93A マウス)
脊髄ChAT陽性ニューロンに対する1G11の効果を評価するために、雄マウス(試験の開始時におよそ50日齢、各群12個体のマウス)に表7に従って投与を行った。試験は無作為化、プラセボ・アイソタイプ対照、二重盲検様式で行った。
投与期間の終了時に、マウスをイソフルランで深麻酔した。血液を排出するためにマウスに氷冷0.9%生理食塩水(120mL)、次いで、60mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を経心的に潅流した。脊髄を採取し、4℃にて4%PFA中で24時間後固定した。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)の免疫組織化学法(IHC)は、IHCオートステイナー(Ventana Discovery Ultra、Roche、USAにて行った。全スライド像をScanScope XT(Leica Biosystems、USA)により取り込んだ。
腰髄のL3−L5のChAT陽性細胞を定量し、分析した。ニューロンを正確に計数するために、ヘマトキシリンチャネルをDAB(ImageScope、バージョン11、Leica Biosystem)から分離し、次に、細胞定量のために腹側脊髄全体を包含するDAB単独像(10倍)を取得した。ChAT陽性MNニューロンは、盲検様式で独立した観察者により手作業で計数された。バイアスの消去および一貫性の確保のために、画像の定量化は、別の独立した検査者により無作為に質が確認された。
ChAT免疫染色による腰髄(L3−L5)分析は、ビヒクル処置野生型マウスに比べてビヒクル処置hSOD1−G93Aトランスジェニックマウスで、ChAT陽性運動ニューロンの有意性の高い減少を示した(35%減、p<0.0001)。これらのデータは、野生型マウスに比べてhSOD1−G93Aマウスの脊髄での、運動ニューロンの明らかな変性を示す。マウスIgG1(172.6±31.10)および1G11処置群は、ビヒクルに対して統計的有意性を示さなかった(0.3mg/kg:169.1±17.25;1mg/kg:160.1±28.12)。
配列表
配列番号1 TrkB-ECD
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号2 TrkB全長配列
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
配列番号3 1G11およびヒト化1G11 CDR L1 (Kabat, Chochia, AbM)
RASQRISNNLH
配列番号4 1G11およびヒト化1G11 CDR L2 (Kabat, Chochia, AbM)
YVSQSIS
配列番号5 1G11およびヒト化1G11 CDR L3 (Kabat, Chochia, AbM)
QQSNSWPLT
配列番号6 1G11およびヒト化1G11 CDR H1 (Kabat)
SYYIN
配列番号7 1G11およびヒト化1G11 CDR H2 (Kabat)
RIAPGNTYYNEIFKG
配列番号8 1G11およびヒト化1G11 CDR H3 (Kabat, Chochia, AbM)
RGYEGALDY
配列番号9 3A3 CDR L1 (Kabat)
KSSQSLLYSGNQKNYLA
配列番号10 3A3 CDR L2 (Kabat)
WASTRES
配列番号11 3A3 CDR L3 (Kabat)
QQYYSYPYT
配列番号12 3A3 CDR H1 (Kabat)
SYWMH
配列番号13 3A3 CDR H2 (Kabat)
YINPSTGYTDYNQKFKD
配列番号14 3A3 CDR H3 (Kabat)
SRAARY
配列番号15 8E5 CDR L1 (Kabat)
RASSSVSSSYLH
配列番号16 8E5 CDR L2 (Kabat)
STSNLAS
配列番号17 8E5 CDR L3 (Kabat)
QQYSGYPLT
配列番号18 8E5 CDR H1 (Kabat)
TYGMS
配列番号19 8E5 CDR H2 (Kabat)
TVSTGGTYTYYPDSVKG
配列番号20 8E5 CDR H3 (Kabat)
GGYSFAY
配列番号21 5D11 CDR L1 (Kabat)
RASQSVSTSFYSYMH
配列番号22 5D11 CDR L2 (Kabat)
YASNLQS
配列番号23 5D11 CDR L3 (Kabat)
QHSWEIPWT
配列番号24 5D11 CDR H1 (Kabat)
NYLIE
配列番号25 5D11 CDR H2 (Kabat)
VINPGSGGTNYNDKFKG
配列番号26 5D11 CDR H3 (Kabat)
GGNDYGDY
配列番号27 1G11 HC
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号28 1G11 LC
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号29 3A3 HC
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTDYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSRAARYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号30 3A3 LC
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号31 8E5 HC
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWVRQTPDKGLEWVATVSTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGGYSFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号32 8E5 LC
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGVSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号33 5D11 HC
QVHLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNDKFKGKAILTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGGNDYGDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号34 5D11 LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVFIKYASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEDDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号35 D1-D3ドメイン欠失変異体C32-L196
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGL
配列番号36 D4-D5-JMドメイン欠失変異体P197-H430
PSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号37 D5ドメイン欠失変異体H284-H430
HFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号38 1G11キメラFab1 [1G11由来可変領域(VH)とヒトIgG1由来定常領域(CH1)の融合物]
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
配列番号39 1G11 キメラFab1 [1G11由来可変領域(VL)とヒトIgG1由来定常領域(CL1)の融合物]
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40 ヒト化1G11 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSS
配列番号41 ヒト化1G11 VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIK
配列番号42 ヒト化1G11 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号43 ヒト化1G11 LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号44 ヒト化1G11 HCをコードするDNA
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTACTACATCAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGAGCATGGGCAGGATCGCCCCCGGCAACACCTACTACAACGAGATCTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACTGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGGGGCTACGAGGGCGCCCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号45 ヒト化1G11 LCをコードするDNA
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACTCTGAGCCTGAGCCCAGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCAGGGCCTCCCAGAGGATCAGCAACAACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCAAATACGTGAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTCTAACAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号46 ヒト化3A3 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSS
配列番号47 ヒト化3A3 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
配列番号48 ヒト化3A3 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号49 ヒト化3A3 LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号50 ヒト化3A3 HCをコードするDNA
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCTCCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCACCGGCTACACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCAGGGCTGCCAGGTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号51 ヒト化3A3 LCをコードするDNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGTACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACTGGGCTAGCACAAGGGAGAGCGGCGTGCCTGATAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACTACTCCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号52 ヒト化5D11 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGTNYNDKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGNDYGDYWGQGTLVTVSS
配列番号53 ヒト化5D11 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWEIPWTFGQGTKLEIK
配列番号54 ヒト化5D11 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGTNYNDKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGNDYGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号55 ヒト化5D11 LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWEIPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号56 ヒト化5D11 HCをコードするDNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACCTGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGTGATCAATCCCGGCAGCGGCGGCACCAACTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACTGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGGCGGGAACGATTACGGCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号57ヒト化5D11 LCをコードするDNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATTAACTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCACCAGCTTCTACTCCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCAAATACGCCAGCAACCTCCAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCAGGCTCCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAGATCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号58 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (Chochia)
GYTFTSY
配列番号59 1G11およびヒト化1G11 CDRH2 (Chochia)
APGN
配列番号60 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (AbM)
GYTFTSYYIN
配列番号61 1G11およびヒト化1G11 CDRH2 (AbM)
RIAPGNTY
配列番号62 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (Contact)
TSYYIN
配列番号63 1G11 CDRH2 (Contact)
CIGRIAPGNTY
配列番号64 ヒト化1G11 CDRH2 (Contact)
SMGRIAPGNTY
配列番号65 1G11およびヒト化1G11 CDRH3 (Contact)
ARRGYEGALD
配列番号66 1G11およびヒト化1G11 CDRL1 (Contact)
SNNLHWY
配列番号67 1G11およびヒト化1G11 CDRL2 (Contact)
LLIKYVSQSI
配列番号68 1G11およびヒト化1G11 CDRL3 (Contact)
QQSNSWPL
配列番号69
DGANPNYPDVIYEDYGTAAN
配列番号70
NPNYPDVIYEDYGT
配列番号71
HFAPTITFLESP
配列番号72 283-291からのTRKB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
GHFAPTITF
配列番号73 284-291からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
HFAPTITF
配列番号74 292-316からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
LESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQ
配列番号75 316-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
QWFYNGAIL
配列番号76 317-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
WFYNGAIL
配列番号77 318-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
FYNGAIL
配列番号78 347-361からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
QLDNPTHMNNGDYTL
配列番号79 TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド from 349-358
DNPTHMNNGD
配列番号80 351-368からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
PTHMNNGDYTLIAKNEYG
配列番号81 363-378からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
AKNEYGKDEKQISAHF
配列番号82 377-395からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
HFMGWPGIDDGANPNYPDV
配列番号83 379-385からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGID
配列番号84 379-395からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDV
配列番号85 379-396からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDVI
配列番号86 379-397からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチ
MGWPGIDDGANPNYPDVIY
配列番号87 379-398からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDVIYE
配列番号88 418-435からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
PSTDVTDKTGREHHHHHH

Claims (55)

  1. BDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強する、TrkB結合アゴニスト。
  2. 細胞表面のTrkBレベルを維持する、TrkB結合アゴニスト。
  3. TrkBのD5ドメインのβシートAとG、およびβシートAとA’の間の領域に含まれるエピトープと結合する、TrkB結合アゴニスト。
  4. a)ヒトTrkBの以下の残基:Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373およびGlu341のうち1以上と相互作用するか;
    b)T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、およびS375からなる群から選択されるヒトTrkB由来残基の4.5Å以内に接近するか;
    c)E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370およびK372(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか;
    d)ヒトTrkBと結合し、かつ非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基284〜291(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるか;または
    e)配列番号71に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
    TrkB結合アゴニスト。
  5. TrkBの膜近接領域(W381−H430)内に含まれるエピトープと結合する、TrkB結合アゴニスト。
  6. a)N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400およびT402の群から選択される残基が変異したヒトTrkB細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトTrkB細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか;
    b)ヒトTrkBと結合し、かつ非複合体形成ヒトTrkBに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基385〜398(全長ヒトTrkBに従ってナンバリング)由来配列の一部または全部を含有するヒトTrkBに由来するペプチドを生じるか;または
    c)配列番号69に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
    TrkB結合アゴニスト。
  7. TrkBとの結合に関して(a)配列番号27の重鎖配列と配列番号28の軽鎖配列;または(b)配列番号29の重鎖配列と配列番号30の軽鎖配列;または(c)配列番号31の重鎖配列と配列番号32の軽鎖配列を有する参照抗体と競合する、TrkB結合アゴニスト。
  8. (a)配列番号28内に存在するCDRL1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
    (b)配列番号28内に存在するCDRL3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
    (c)配列番号27内に存在するCDRH3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
    を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
  9. (a)配列番号3内に存在するCDRL1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;
    (b)配列番号5内に存在するCDRL3、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体;および
    (c)配列番号8内に存在するCDRH3、または1、2もしくは3つのアミノ酸を有するその変異体
    を含んでなる、請求項8に記載のTrkB結合アゴニスト。
  10. CDRL1内の修飾は残基R28、S30およびN32(配列番号28からナンバリング)になく、CDRL3内の修飾は残基N92およびS93(配列番号28からナンバリング)になく、かつCDRH3内の修飾は残基R97、Y99およびE100(配列番号27からナンバリング)にない、請求項8または請求項9に記載のTrkB結合アゴニスト。
  11. CDRL1内の修飾は残基I29にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
  12. CDRL1内の修飾は残基N31にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
  13. CDRL3内の修飾は残基S91およびW94にない、請求項10に記載のTrkB結合アゴニスト。
  14. (a)配列番号3内に存在するCDRL1;
    (b)配列番号5内に存在するCDRL3;および
    (c)配列番号8内に存在するCDRH3
    を含んでなる、請求項9に記載のTrkB結合アゴニスト。
  15. 配列番号27内に存在するCDRH2もしくはその変異体、または配列番号40内に存在するCDRH2もしくはその変異体をさらに含んでなり、前記変異体は1、2または3つのアミノ酸修飾を有する、請求項8〜14のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  16. CDRH2が配列番号7内に存在する、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、請求項15に記載のTrkB結合アゴニスト。
  17. CDRH2内の修飾は残基R50(配列番号27からナンバリング)にない、請求項15または請求項16に記載のTrkB結合アゴニスト。
  18. CDRH2内の修飾は残基Y57(配列番号27からナンバリング)にない、請求項17に記載のTrkB結合アゴニスト。
  19. CDRH2が配列番号7内に存在する、請求項16に記載のTrkB結合アゴニスト。
  20. (a)配列番号28内に存在するCDRL2、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体、および
    (b)配列番号27内に存在するCDRH1、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体
    をさらに含んでなる、請求項8〜19のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  21. (a)CDRL2が配列番号4内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体であり;かつ
    (b)CDRH1が配列番号6内に存在するか、または1、2もしくは3つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、
    請求項20に記載のTrkB結合アゴニスト。
  22. CDRL2内の修飾は残基Y50(配列番号28からナンバリング)になく、かつCDRH1内の修飾は残基Y33(配列番号27からナンバリング)にない、請求項20または請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。
  23. CDRH1内の修飾は残基S31(配列番号27からナンバリング)にない、請求項20または請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。
  24. (a)CDRL2が配列番号4内に存在し;かつ
    (b)CDRH1が配列番号6内に存在する、
    請求項21に記載のTrkB結合アゴニスト。
  25. 配列番号40の配列と少なくとも80%同一の配列を含んでなるVH領域および/または配列番号41の配列と少なくとも76%同一の配列を含んでなるVL領域を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
  26. (a)配列番号42と少なくとも90%同一の重鎖(HC)配列;および/または
    (b)配列番号43と少なくとも85%同一の軽鎖(LC)配列
    を含んでなる、TrkB結合アゴニスト。
  27. 配列番号40または配列番号42に対応する47番がCys、Ser、Gly、Ala、Val、ThrまたはAsnである、請求項25または請求項26に記載のTrkB結合アゴニスト。
  28. CDR配列が請求項8〜24のいずれか一項に定義される、請求項25〜27のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  29. CDR配列が請求項8〜24にいずれか一項に定義され、かつ同一性の割合がCDRを除く配列で計算される、請求項25〜27のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  30. (a)配列番号40のVH領域;および/または
    (b)配列番号41のVL領域
    を含んでなる、請求項25に記載のTrkB結合アゴニスト。
  31. (a)配列番号42の重鎖(HC)配列;および/または
    (b)配列番号43の軽鎖(LC)配列
    を含んでなる、請求項26に記載のTrkB結合アゴニスト。
  32. TrkBとの結合に関してBDNFおよび/またはNT−4と競合しない、請求項2〜31のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  33. アゴニストがBDNFにより誘導されるおよび/またはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用を増強する、請求項3〜31のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  34. BDNFにより誘導されるまたはNT−4により誘導されるTrkBの促進作用の増強効果が、TrkB結合アゴニストの不在下に比べたTrkB結合アゴニストの存在下での、飽和濃度のBDNFまたはNT−4の存在下でのTrkBの活性化の増大により測定される、請求項1または請求項33に記載のTrkB結合アゴニスト。
  35. TrkBの活性化の増大がTrkBのリン酸化のレベルの上昇により測定される、請求項34に記載のTrkB結合アゴニスト。
  36. 飽和濃度のBDNFまたはNT−4の存在下でのTrkBのリン酸化が、TrkB結合アゴニストの存在下での少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、または少なくとも150%に比べ、TrkB結合アゴニストの不在下では100%である、請求項35に記載のTrkB結合アゴニスト。
  37. 細胞表面のTrkBレベルを維持する、請求項1または請求項3〜36のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  38. ヒトおよびカニクイザルTrkBのリン酸化のEC50に5倍以内の差を示す、請求項1〜37のいずれか一項に記載のTrkB結合アゴニスト。
  39. 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列。
  40. 重鎖をコードする配列番号44;および/または軽鎖をコードする配列番号45を含んでなる、請求項39に記載のTrkB結合アゴニストをコードする1以上の核酸配列。
  41. 請求項39または40に定義される1以上の核酸配列を含んでなる、1以上の発現ベクター。
  42. 請求項39もしくは40に定義される1以上の核酸配列、または請求項41に定義される1以上の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
  43. 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの生産のための方法であって、請求項42に定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる、方法。
  44. 請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストと薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の1つまたは組合せとを含んでなる、医薬組成物。
  45. 療法において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
  46. 神経障害の処置において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
  47. 神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物。
  48. 必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
  49. 必要とする対象において神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニスト、または請求項44に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
  50. 神経障害の処置のための請求項44に定義される医薬組成物の製造における、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの使用。
  51. 神経障害、またはTrkBの活性化によるBDNF−TrkB経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための請求項44に定義される医薬組成物の製造における、請求項1〜38のいずれか一項に定義されるTrkB結合アゴニストの使用。
  52. 障害が神経変性疾患、視神経症、網膜変性病態、難聴を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および別のCNS障害である、請求項46もしくは47に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、請求項48もしくは49に記載の方法、または請求項50もしくは51に記載の使用。
  53. 障害が視神経症である、請求項52に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
  54. 障害が筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、アルツハイマー病(AD)、運動ニューロン病、パーキンソン病、プリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパシー、緑内障、前部虚血性視神経症(AION)、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア視神経症、中毒性視神経症 外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢黄斑変性、色素性網膜炎、神経性難聴、内耳性難聴、耳鳴、感音性難聴、混合性難聴、不安、気分障害、鬱病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、サルコペニア、肥満、オピオイド誘発性嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害および脳卒中である、請求項52に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
  55. 処置が細胞生存、および/またはニューロン修復、および/またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、請求項46〜54のいずれか一項に記載の使用のためのTrkB結合アゴニスト、方法、または使用。
JP2018525563A 2015-11-17 2016-11-15 神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト Active JP7039468B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2015/094779 2015-11-17
CN2015094779 2015-11-17
CNPCT/CN2016/095545 2016-08-16
CN2016095545 2016-08-16
GB1618814.6 2016-11-08
GB201618814 2016-11-08
PCT/EP2016/077644 WO2017085035A1 (en) 2015-11-17 2016-11-15 Binding agonists for treatment of neurological and other disorders

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018537090A true JP2018537090A (ja) 2018-12-20
JP2018537090A5 JP2018537090A5 (ja) 2019-12-26
JP7039468B2 JP7039468B2 (ja) 2022-03-22

Family

ID=57321320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018525563A Active JP7039468B2 (ja) 2015-11-17 2016-11-15 神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11078287B2 (ja)
EP (1) EP3377528A1 (ja)
JP (1) JP7039468B2 (ja)
KR (1) KR20180081522A (ja)
CN (1) CN108350079B (ja)
AU (1) AU2016356877A1 (ja)
CA (1) CA3005491A1 (ja)
TW (1) TW201730206A (ja)
WO (1) WO2017085035A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114940713B (zh) * 2017-03-15 2024-04-30 清华大学 抗trkb抗体
US10793634B2 (en) * 2017-06-09 2020-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-TrkB antibodies
SG11202002665UA (en) 2017-11-30 2020-04-29 Regeneron Pharma Anti-trkb monoclonal antibodies and methods of use
WO2019141092A1 (zh) * 2018-01-18 2019-07-25 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗lag-3抗体及其用途
SG11202108276RA (en) * 2019-01-30 2021-08-30 Jun Liu Inhibiting or alleviating agent for inflammation in the brain
WO2022115344A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Arginase 1 binders for inhibiting arginase 1 activity
WO2023125485A1 (en) * 2021-12-28 2023-07-06 4B Technologies (Beijing) Co., Limited TrkB ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF
CN115820678B (zh) * 2022-07-12 2023-08-29 吉林农业大学 激发机体抗prrsv gp3的基因、包含该基因的新功能型乳酸菌及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545781A (ja) * 2005-06-06 2008-12-18 ワイス 抗TrkBモノクローナル抗体およびその使用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070248611A1 (en) 2006-02-02 2007-10-25 Pfizer Inc Methods wanted for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist
EA200970469A1 (ru) * 2006-11-09 2010-04-30 АйАрЭм ЭлЭлСи Антитела-агонисты рецептора trkb и их применение
JP2010513461A (ja) 2006-12-20 2010-04-30 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 自己免疫障害を治療するためのTrkBアゴニスト
BRPI0817812A2 (pt) * 2007-10-23 2015-04-14 Novartis Ag Uso de anticorpos trkb para o tratamento de distúrbios respiratórios
KR101290503B1 (ko) 2008-01-17 2013-07-26 아이알엠 엘엘씨 개선된 항-trkb 항체
WO2010086828A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Rinat Neuroscience Corporation Agonist anti-trkb monoclonal antibodies
WO2011103667A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 6452728 Canada Inc. Agonistic antibodies to trkb receptors and uses thereof
WO2011103668A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 The Governors Of The University Of Alberta Cancer specific peptides and arrays for screening same
GB2491106A (en) 2011-05-18 2012-11-28 Univ Basel Antibodies against tropomyosin-related kinase B receptors
US9914781B1 (en) 2016-11-08 2018-03-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545781A (ja) * 2005-06-06 2008-12-18 ワイス 抗TrkBモノクローナル抗体およびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
JP7039468B2 (ja) 2022-03-22
CN108350079B (zh) 2021-11-02
US20200165345A1 (en) 2020-05-28
US20210347902A1 (en) 2021-11-11
KR20180081522A (ko) 2018-07-16
TW201730206A (zh) 2017-09-01
CN108350079A (zh) 2018-07-31
EP3377528A1 (en) 2018-09-26
CA3005491A1 (en) 2017-05-26
WO2017085035A1 (en) 2017-05-26
AU2016356877A1 (en) 2018-05-10
US11078287B2 (en) 2021-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210347902A1 (en) Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
US10640554B2 (en) Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
US11111290B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
AU2016292892B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US9914781B1 (en) Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
KR20190130133A (ko) 항-phf-타우 항체 및 이의 용도
US20190330320A1 (en) Antibodies specific for hyperphosphorlated tau for the treatment of ocular diseases
TW202104255A (zh) 用於治療及診斷之新穎分子
KR20230162790A (ko) 항-타우 항체 및 이의 용도
KR20200040903A (ko) 기분 장애의 치료 및 진단을 위한 항-서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 a5 항체의 용도
KR20230039734A (ko) 항-Aβ 항체
WO2023163187A1 (ja) 神経変性疾患の治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191114

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191114

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201023

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210107

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210323

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210706

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210907

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220121

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220208

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220309

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7039468

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150