JP2018537090A - 神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト - Google Patents

神経およびその他の障害の処置のための結合アゴニスト Download PDF

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Abstract

本発明は、ＴｒｋＢ結合アゴニスト、ならびに神経障害および他の障害の処置におけるそのようなアゴニストの使用に関する。本発明はまた、ＣＤＲ、可変領域、重鎖および軽鎖、ならびにそれらの変異体配列を含んでなる特定のＴｒｋＢ結合アゴニストに関する。

Description

本発明は、ＴｒｋＢ結合アゴニスト、ならびに神経障害および他の障害の処置におけるそのようなアゴニストの使用に関する。本発明はまた、ＣＤＲ、可変領域、重鎖および軽鎖、ならびにそれらの変異体配列を含んでなる特定のＴｒｋＢ結合アゴニストに関する。
神経障害は、世界中で罹患率および有病率が増えており、よって、療法が差し迫って必要である。しかしながら、神経障害は家族型および散発型の両方で表現型が不均質であり、未知の病因を持つ場合が多い。従って、単一の病態機序を標的とすることは、たとえその病態機序の性質がその疾患の重要な「駆動因子」であるとしても、有意な臨床利益を伴って疾患の改善をもたらす見込みが低い。
神経毒性物質の蓄積、炎症、脂質代謝、酸化ストレス、自己貪食、タンパク質分解およびミトコンドリア機能不全を含むいくつかの機構および経路が神経疾患などの神経障害に関連付けられている。しかしながら、それらがこの疾患の原因であるかまたは一次および／または二次傷害の結果であるかは依然として不明である。結果として、これらの個々の機序のいくつかに基づく療法は臨床上奏効しなかった。神経疾患の疾患修飾療法を開発するための多くの努力は、脳における不適切に折り畳まれた毒性タンパク質の蓄積がいくつかの神経変性疾患の重要な病原因子とみなされることを考えて毒素軽減アプローチに従うものであった。しかしながら、アルツハイマー病におけるＡβなどの毒性タンパク質を低下させることによる臨床奏効は限定されたものであったが、軽度疾患の患者における最近の治験は有望な結果を示す。
病因（その病態に至る生物学的機序）の標的化は、防止(prophylactic)または予防(preventative)的処置に好適なプローチであり得るが、病態生理学（その病態内で作動する内因性の生物学的機序）の標的化は、既存の神経障害における治療的介入のためのより良いアプローチとなり得る。
ニューロンの生存、機能、可塑性、および恒常性に役割を果たす内因性の神経栄養的および神経保護的経路を標的とすることによる、このもう１つの病態生理学的治療アプローチを使用することが可能である。内因性機構が神経障害において有意にダウンレギュレーションを受けている可能性があることを示す証拠がある。
ニューロトロフィンは、中枢および末梢神経系（それぞれＣＮＳおよびＰＮＳ）の発達、維持および機能を調節する内因性の成長因子である。神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーのリガンドは、主として高親和性Ｔｒｋ受容体［ＮＧＦに対するＴｒｋＡ、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）およびＮＴ−４（ニューロトロフィン４、ＮＴ−４／５）に対するＴｒｋＢ、ＮＴ−３（ニューロトロフィン３）に対するＴｒｋＣ］を介して、かつまた低親和性汎ニューロトロフィン受容体であるｐ７５ＮＴＲと結合することにより、シグナルを伝達する。Ｔｒｋ受容体を介するシグナル伝達は通常、細胞生存を増進するが、Ｔｒｋ受容体の不在下でのｐ７５ＮＴＲを介したニューロトロフィンのシグナル伝達は、一般に、アポトーシスを助長する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、ＣＮＳニューロンの生存および機能の増進におけるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の役割を裏づける前臨床的証拠がある。さらに、ＢＤＮＦを用いた４つの治験がＡＬＳにおいて実施されている。加えて、健常ボランティアにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体の皮下注射による第Ｉ相二重盲検プラセボ対照単一用量漸増試験（治験ＮＣＴ０１２６２６９０、スポンサー：ファイザー社）が、浮上した感覚症状の安全性への懸念のために終了した（試験結果は公開されていない）。
要約すると、ＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復または増進が有益であり得る神経障害および他の障害の処置の必要が依然としてある。
本発明は、ＢＤＮＦにより誘導されるおよび／またはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、ＴｒｋＢのＤ５ドメインのβシートＡとＧ、およびβシートＡとＡ’の間の領域内に含まれるエピトープと結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「エピトープ」は、ＴｒｋＢ結合タンパク質と接触する抗原（ＴｒｋＢ）の部分、例えば、ＴｒｋＢ結合タンパク質の４．５Å以内に接近するＴｒｋＢの部分を意味する。一つの実施形態では、このＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦと競合しない。ＴｒｋＢこの領域と結合するアゴニストは、
ａ）ヒトＴｒｋＢ以下の残基：Ｔｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５、Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３、Ｇｌｕ３４１のうち１以上と相互作用し得るか；
ｂ）Ｔ２８８、Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｌ２９２、Ｅ２９３、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｋ３７２、Ｑ３７３、Ｉ３７４、およびＳ３７５からなる群から選択されるヒトＴｒｋＢ由来残基の４．５Å以内に接近し得るか；
ｃ）Ｅ２１０、Ｆ２８５、Ｔ２８８、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｅ２９３、Ｄ３７０およびＫ３７２の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢに比べて変更された親和性で結合し得るか；
ｄ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基２８４〜２９１（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じ得るか；あるいは
ｅ）配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
本発明はまた、ＴｒｋＢの膜近接領域（Ｗ３８１−Ｈ４３０）内に含まれるエピトープと結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「エピトープ」は、ＴｒｋＢ結合タンパク質と接触する抗原（ＴｒｋＢ）の部分、例えば、ＴｒｋＢ結合タンパク質の４．５Å以内に接近するＴｒｋＢの部分を意味する。一つの実施形態では、このＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦと競合しない。この領域に結合するアゴニストは、
ａ）Ｎ３８９、Ｄ３９４、Ｖ３９５、Ｉ３９６、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９、Ｙ４００およびＴ４０２の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか；
ｂ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基３８５〜３９８（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じ得るか；あるいは
ｃ）配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
本発明はまた、ＴｒｋＢとの結合に関して、（ａ）配列番号２７の重鎖配列と配列番号２８の軽鎖配列；または（ｂ）配列番号２９の重鎖配列と配列番号３０の軽鎖配列；または（ｃ）配列番号３１の重鎖配列と配列番号３２の軽鎖配列を有する参照抗体と競合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、このＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦと競合しない。本発明はまた、細胞表面のＴｒｋＢのレベルを維持するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、このアゴニストは、ＢＤＮＦの不在下でＴｒｋＢを活性化する。
本発明はまた、（ｉ）配列番号２７由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号２８由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲのいずれか１つもしくは組合せ；または（ｉｉ）各ＣＤＲにおいて１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有する（ｉ）のＣＤＲ変異体を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。特定の実施形態では、特定のＣＤＲは、配列番号２７または配列番号２８内に存在するが、他のＣＤＲは、配列番号２７または配列番号２８内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｂ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
（ｃ）配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、以下のＣＤＲ：（ａ）配列番号６のＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号７のＣＤＲＨ２；（ｃ）配列番号８のＣＤＲＨ３；（ｄ）配列番号３のＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号４のＣＤＲＬ２；および／または（ｆ）配列番号５のＣＤＲＬ３のいずれか１つまたは組合せを含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、配列番号４０の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＨ領域および／または配列番号４１の配列と少なくとも７６％同一の配列を含んでなるＶＬ領域を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、（ａ）配列番号４２と少なくとも９０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または（ｂ）配列番号４３と少なくとも８５％同一の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする１以上の核酸配列を提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列を提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される１以上の核酸配列を含んでなる１以上の発現ベクターを提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される１以上の核酸配列、または本明細書で定義される１以上の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。一つの実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列、または本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストの生産のための方法であって、本明細書で定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる方法を提供する。この方法の一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストが発現され、精製される。
本発明はまた、本明細書に記載の方法により生産されたＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、本明細書で定義される結合アゴニストと薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の１つまたは組合せを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または前記対象に本明細書で定義される医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または前記対象に本明細書で定義される医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、前記対象に対するＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、必要とする対象において、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、前記対象に対するＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤を投与することを含んでなる方法を提供する。一つの実施形態では、対象はヒトである。
本発明はまた、療法において使用するための、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経障害の処置において使用するための、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
本発明はまた、療法において使用するための、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤を提供する。
本発明はまた、神経障害の処置のための薬剤の生産における、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための薬剤の生産における、本明細書で定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または本明細書で定義される医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害に処置のための薬剤の製造における、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤の使用を提供する。
本発明はまた、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための薬剤の生産における、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤の使用を提供する。
本発明はまた、処置が細胞生存、および／またはニューロン修復、および／またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、本明細書に記載の処置の方法、ＴｒｋＢ結合アゴニスト、または使用を提供する。
図１Ａ：ラット皮質ニューロンにおける経時的な、ＢＤＮＦおよび１Ｇ１１により誘導されるＴｒｋＢリン酸化およびＴｒｋＢ下流シグナル伝達およびＴｒｋＢの細胞表面レベルのウエスタンブロット。ラット培養皮質ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日）を３７℃で、示されたように０．８ｎＭ ＢＤＮＦまたは７．３ｎＭ １Ｇ１１で処理した。細胞溶解液（３０μｇタンパク質）を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、示されたように抗体で免疫ブロットした。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部対照として使用した。ＴｒｋＢの細胞表面レベルを測定するために、１Ｇ１１処理後のラット皮質ニューロンをスルホ−ＮＨＳ−ビオチンで氷上にて１時間処理し、次いで溶解およびストレプトアビジンアガロースビーズを用いたビオチン化タンパク質の単離を行った。単離されたタンパク質を分離し、抗ＴｒｋＢ抗体で免疫ブロットした。注：Ｃｔｒｌ、培地交換を行った非処理のゼロ時間対照。図１Ｂ：経時的全細胞ＴｒｋＢの割合としてのＢＤＮＦおよび１Ｇ１１により誘導されるＴｒｋＢの細胞表面レベル。ラット培養皮質ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日）を３７℃で示されたように０．８ｎＭ ＢＤＮＦまたは７．３ｎＭ １Ｇ１１で処理した。総ＴｒｋＢと比較したＴｒｋＢの相対的表面レベルを濃度分析により決定した。総ＴｒｋＢに対する表面ＴｒｋＢの比を、ゼロ時点の非処理対照と比べた変化倍率として示す。 図２：異なる特性を有するＴｒｋＢアゴニスト抗体を示す代表的データ−増強剤および非競合物（３Ａ３、１Ｇ１１、８Ｅ５）、競合物（５Ｄ１１）、非競合物（２Ａ１、３Ａ４、５Ｃ７）。１００％活性は、ＢＤＮＦの飽和濃度でのＴｒｋＢ活性化、すなわち、１０ｎＭ ＥＣ１００を表す。 図３：公開されている構造に基づく、種々の二次構造（βシート、ループ、Ｎ末端「Ｎｔ」、およびＣ末端「Ｃｔ」）を示すＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーと２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインの間の構造的相互作用。 図４：ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーおよび２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインおよび１Ｇ１１の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基を図４Ａに示し、共結晶Ｘ線結晶学により同定された残基を図４Ｂに示す。 図５：ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーおよび２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインおよび１Ｇ１１のさらなる構造分析は、ＮＴ−４／ＢＤＮＦのＮ末端がＴｒｋＢと１Ｇ１１ Ｆａｂの重鎖の間の空間に突出している可能性があることを示す。 図６：ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーおよび２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインおよび１Ｇ１１の構造分析に分子表面を加えると、Ｖκ ＣＤＲ Ｌ１とＬ３、およびＣＤＲＨ３がＴｒｋＢと密接に相互作用し、ＴｒｋＢとＣＤＲ Ｈ１およびＨ２の間に、ＢＤＮＦのＮ末端に適合している可能性が想定され得る溝が存在することが示される。 図７：ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーと２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインおよび３Ａ３の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基が示され、これらは総てＪＭ領域（Ｄ５ドメインのＣ末端および膜貫通領域のＮ末端）にある。ＪＭ残基は、β−ストランド形状を用いて延伸された。 図８：ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーと２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインおよび５Ｄ１１の間の構造的相互作用。アラニンスキャニングにより同定された残基を示し、これらはリガンド結合部位にある。 図９は、ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ単独または１Ｇ１１との複合体に由来するＴｒｋＢペプチド間の重水素更新(deuterium update)における画分の違いを示す。 図１０は、ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ単独または３Ａ３との複合体に由来するＴｒｋＢペプチド間の重水素更新における画分の違いを示す。
発明の詳細な説明
「ＴｒｋＢ」は、本明細書で使用する場合、天然、内因性または組換え型のＴｒｋＢタンパク質を意味する。ＴｒｋＢは、リガンドである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）またはニューロトロフィン−４（ＮＴ−４／ＮＴ−４／５）の受容体である。ＢＤＮＦおよびＮＴ−４は両方ともＴｒｋＢと結合することができ、多くの一般的なシグナル伝達経路を活性化し得る。非共有結合性ホモダイマーリガンドであるＢＤＮＦまたはＮＴ−４は、受容体チロシンキナーゼであるＴｒｋＢを活性化する。活性化されたＴｒｋＢは、（ａ）細胞生存、（ｂ）ニューロン修復、および／または（ｃ）ニューロン可塑性を調節することができる。
上記のように、ＴｒｋＢ−ＢＤＮＦシグナル伝達は、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の細胞生存、修復、および可塑性を増進する上で重要な役割を果たす。ほとんどの神経障害の原因要素／機序が異なるとしても、変性を受け得る種々のタイプの細胞生存および機能は効率的なＢＤＮＦ−ＴｒｋＢシグナル伝達機構に依存している。従って、アゴニストを用いたＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復または増進は、細胞生存、ニューロン修復およびニューロン可塑性を増進して障害に対する差次的処置を与えると思われる。ＴｒｋＢの活性化は中枢および末梢両方の作用機序を媒介し得る。
ＢＤＮＦレベルは、多くの神経学的および病態生理学的疾患において低下しており、表現型／欠乏をこの低下に帰し得ることが報告されている。ＴｒｋＢ受容体レベルが不変のままであるＢＤＮＦ欠乏の病態生理学的状態下では、投与された治療薬が、（ｉ）ＴｒｋＢを活性化する（促進する）、（ｉｉ）低下したＢＤＮＦレベルと競合しない、（ｉｉｉ）低下したＢＤＮＦの生理的レベルにより誘導される細胞内シグナル伝達を増強する、および／または（ｉｖ）そうでなければ治療薬に対する一時的脱感作をもたらし得るＴｒｋＢの細胞表面レベルを維持することが可能であれば、生理的な細胞／系の応答がなお惹起され得る。
本発明に関して、用語「ＴｒｋＢ結合アゴニスト」は、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の不在下でヒト全長ＴｒｋＢ（配列番号２に示される配列を有する）を促進または活性化する分子を意味する。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、それが受容体と結合した際に天然リガンドＢＤＮＦ／ＮＴ−４と同様の生物学的効果をもたらし得る。ＴｒｋＢは受容体チロシンキナーゼであるので、複数の細胞内シグナル伝達経路を惹起する。促進作用は、増大したＴｒｋＢのリン酸化レベル（ｐＴｒｋＢ）、増大したＡｋｔのリン酸化レベル（ｐ−Ａｋｔ）、増大したＥｒｋのリン酸化レベル（ｐ−Ｅｒｋ）、および／または増大したＣｒｅｂのリン酸化レベル（ｐ−Ｃｒｅｂ）の測定を含む、ＴｒｋＢの活性化により測定され得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の不在下でＴｒｋＢ受容体を活性化して、ＢＤＮＦ最大応答（１００％とする）に対して少なくとも１０％、少なくとも２０％ 少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％のｐＴｒｋＢレベルをもたらし得る。一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の不在下でＴｒｋＢ受容体を活性化して、ＮＴ−４最大応答（１００％とする）に対して少なくとも１０％、少なくとも２０％ 少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％のｐＴｒｋＢレベルをもたらし得る。
親和性は、ある分子、例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストの、別の分子、例えば、その標的抗原への、単一の結合部位における結合の強度である。ＴｒｋＢ結合アゴニストのＴｒｋＢに対する結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）により決定され得る。例えば、実施例１．１（および表１のデータ）に記載されるＢｉａｃｏｒｅ（商標）法を、結合親和性を測定するために使用可能である。
本発明の特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下の（ＫＤ）のヒトＴｒｋＢまたはヒトＴｒｋＢ ＥＣＤに対する平衡解離定数を示す。ＫＤ数値が小さいほど、結合は強くなる。ＫＤの逆数（すなわち、 １／ＫＤ）は、単位Ｍ−１を有する平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者は、ＫＡ数値が大きいほど結合が強くなることを認識するであろう。解離速度定数（ｋｄ）または「ｋｏｆｆ」は、ＴｒｋＢ結合アゴニスト：ＴｒｋＢ複合体の安定性、すなわち、秒当たりに減衰する複合体の画分を表す。例えば、特定のＴｒｋＢアゴニストとヒトＴｒｋＢまたはヒトＴｒｋＢ ＥＣＤの間の解離速度定数ｋｏｆｆは、１０×１０−４／秒以下、９×１０−４／秒以下、８×１０−４／秒以下、７×１０−４／秒以下、６×１０−４／秒以下、５×１０−４／秒以下、または４×１０−４／秒以下である。会合速度定数（ｋａ）または「ｋｏｎ」は、ＴｒｋＢ結合アゴニスト：ＴｒｋＢ複合体形成の割合を表す。例えば、特定のＴｒｋＢアゴニストとヒトＴｒｋＢまたはヒトＴｒｋＢ ＥＣＤの間会合速度定数ｋｏｎは、３×１０４／Ｍｓ以上、４×１０４／Ｍｓ以上、５×１０４／Ｍｓ以上、６×１０４／Ｍｓ以上、または７×１０４／Ｍｓ以上である。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、全長ヒトＴｒｋＢと特異的に結合し、ヒトＴｒｋＡまたはヒトＴｒｋＣまたはヒトｐ７５ＮＴＲとは結合しない。用語「特異的に結合する」とは、ＴｒｋＢ結合アゴニストが、他の（例えば、無関連の）タンパク質と全くまたは有意には結合することなく、ＴｒｋＢと結合することを意味する。本明細書に記載のＴｒｋＢ結合アゴニストは、それらがＴｒｋＡ、ＴｒｋＣおよび／またはｐ７５ＮＴＲと結合する場合の少なくとも１０、２５、５０、１００、または１０００倍の親和性でＴｒｋＢと結合し得る。このことは、これらのＴｒｋＢ結合アゴニストを、ＴｒｋＢおよびｐ７５ＮＴＲ（細胞死を助長する）の両方を活性化し得るＢＤＮＦから区別することが認識されるであろう。
本発明の特定のＴｒｋＢアゴニストは、ＢＤＮＦにより誘導されるおよび／またはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢ促進作用を増強する。「増強する」は、本明細書おいて、ＴｒｋＢのＢＤＮＦにより誘導される促進作用および／またはＮＴ−４により誘導される促進作用がＴｒｋＢアゴニストの存在下でより有効となることを意味して使用される。ＢＤＮＦにより誘導される促進作用は、ＴｒｋＢの活性化、例えば、細胞内シグナル伝達を評価することにより測定することができる。飽和濃度（すなわち、ＥＣ１００）のＢＤＮＦまたはＮＴ−４を、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下での各リガンドに対するＴｒｋＢの１００％活性化の基準として使用することができる。ＢＤＮＦにより誘導される促進作用の増強は、ＴｒｋＢ結合アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）のＢＤＮＦの存在下での、１００％を超えるＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの活性化と定義することができる。使用可能な飽和濃度のＢＤＮＦは１０ｎＭ（ＥＣ１００）である。一例では、ＴｒｋＢの１００％の活性化は、ＢＤＮＦを１０ｎＭ ＥＣ１００で用いる場合のＴｒｋＢの活性化に相当する。ＮＴ−４により誘導される促進作用の増強は、ＴｒｋＢ結合アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）のＮＴ−４の存在下での１００％を超えるＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの活性化として定義することができる。ＴｒｋＢの活性化は、ＴｒｋＢのリン酸化（ｐＴｒｋＢ）のレベルを決定することにより測定することができる。飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢのリン酸化は、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下での１００％に比べて、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での少なくとも１１０％であり得る。例えば、飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢのリン酸化は、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下での１００％に比べて、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、または少なくとも１５０％であり得る。ｐＴｒｋＢレベルは、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下および飽和濃度のＢＤＮＦの存在下で１３０％前後であり得る。ｐＴｒｋＢレベルは、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下および飽和濃度のＢＤＮＦの存在下で１６０％前後であり得る。ｐＴｒｋＢレベルは、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下および飽和濃度のＢＤＮＦの存在下で１２０％前後であり得る。
増強効果はｉｎ ｖｉｔｒｏにて飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのみ測定できるが、この飽和濃度のＢＤＮＦは臨床現場では必要であるとは思われないことに留意されたい。ＴｒｋＢ結合アゴニストの増強効果は、ＢＤＮＦのいずれの濃度でも存在するはずであると仮定される。ＴｒｋＢ受容体レベルが不変のままであるＢＤＮＦ欠乏の病態生理学的状態下では、ＴｒｋＢ結合アゴニストが、低下したＢＤＮＦの生理的レベルにより誘導される細胞内シグナル伝達を増強することができれば、生理的反応が有益となる。
本発明の特定のＴｒｋＢアゴニストは、細胞表面のＴｒｋＢレベルを維持する。活性化されたチロシンキナーゼ受容体は一般にエンドサイトーシスを受けた後、分解されて細胞表面受容体のダウンレギュレーションをもたらし、それにより、リガンドに対して一時的に不応となって細胞内ホメオスタシスを維持し、ＴｒｋＢ上のＢＤＮＦの活性化効果の場合がそうである。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アゴニストの存在下で、時間が経ってもＴｒｋＢの細胞表面レベルを維持し得る。例えば、ＴｒｋＢの細胞表面レベルは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、または少なくとも１０時間維持され得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アゴニストの存在下で、ＴｒｋＢの細胞表面レベルを経時的に増大させ得る。例えば、ＴｒｋＢの細胞表面レベルは、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、または少なくとも２５時間増大され得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アゴニストにより活性化されるＴｒｋＢの利用可能な細胞表面レベルを増大させ、かつ／または（ｂ）活性化されたＴｒｋＢ受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害し得る。ＴｒｋＢ受容体レベルが不変のままであるＢＤＮＦ欠乏の病態生理学的状態下では、治療的ＴｒｋＢ結合アゴニストが、そうでなければＴｒｋＢアゴニストに対する一時的脱感作をもたらし得るＴｒｋＢの細胞表面レベルを変更することなくＴｒｋＢを活性化することができれば、生理的反応が有益となる。
特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４と競合しない。ＴｒｋＢ結合アゴニストとＢＤＮＦまたはＮＴ−４の間の競合は、ＴｒｋＢの活性化を評価するための機能アッセイにより、例えば、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４存在下と不在下の両方でＴｒｋＢリン酸化によるＴｒｋＢに対するＴｒｋＢ結合アゴニストの活性化効果を測定することにより、決定され得る。一つの実施形態では、ＢＤＮＦと競合しないＴｒｋＢ結合アゴニストは、飽和ＢＤＮＦ濃度（例えば、１０ｎＭ、ＥＣ１００）の存在下、漸増濃度のアゴニストに対するＴｒｋＢリン酸化に変化を生じない。ＢＤＮＦと競合しないＴｒｋＢ結合アゴニストは、飽和ＢＤＮＦ濃度（例えば、１０ｎＭ、ＥＣ１００）の存在下、漸増濃度のアゴニストに対するＴｒｋＢリン酸化の低下を生じる。一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）のＢＤＮＦの存在下でのリン酸化ＴｒｋＢの総レベルが、飽和濃度のＢＤＮＦ単独の存在下でのリン酸化ＴｒｋＢレベルと同等である、すなわち、総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００ＢＤＮＦ＋アゴニスト）≒総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００ＢＤＮＦ）の場合に、ＢＤＮＦと競合しない。同様に、一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）ＮＴ−４の存在下でのリン酸化ＴｒｋＢの総レベルが、飽和濃度のＮＴ−４単独の存在下でのリン酸化ＴｒｋＢレベルと同等である、すなわち、総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００ＮＴ−４＋アゴニスト）≒総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００ＮＴ−４）の場合に、ＮＴ−４と競合しない。リン酸化ＴｒｋＢのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢが範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴいずれかの飽和レベル−±３標準偏差の存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢ）である場合に、同等であると見なされる。一つの実施形態では、アゴニストおよび飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢは、範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴ−４いずれかの飽和レベル±２標準偏差の存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢ）である。別の実施形態では、アゴニストおよび飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢは、範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベル±１標準偏差の存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢ）である。前記実施形態では、リン酸化ｐＴｒｋＢの平均総レベルは、少なくとも３回の読み取りに基づいて計算され、２つの標準偏差（すなわち、アゴニストの存在下で計算される標準偏差およびアゴニストの不在下で計算される標準偏差）のうち大きい方が用いられる。別の実施形態では、リン酸化ＴｒｋＢのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢと飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢが１０％の違いである場合に、同等と見なされる。別の実施形態では、リン酸化ＴｒｋＢのレベルは、アゴニストおよび飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢと飽和レベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下で測定される平均総ｐＴｒｋＢが５％未満の違いである場合に、同等と見なされる。ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦまたはＮＴ−４と競合しないＴｒｋＢ結合アゴニストは、そのＴｒｋＢアゴニストはＴｒｋＢを活性化することができ、かつ、低下したＢＤＮＦ（またはＮＴ−４）のレベルと競合しないことから、臨床現場で有益である。よって、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４は、ＴｒｋＢ結合アゴニストに加えて、生理的役割を果たし続けることができる。
あるいは、ＴｒｋＢ結合アゴニストとＢＤＮＦまたはＮＴ−４の間の競合は、ＴｒｋＢ結合アゴニストおよびＢＤＮＦが同じまたは重複するエピトープと結合するかどうか、結合の立体阻害が存在するかどうか、または第１の分子の結合が第２の分子の結合を妨げるもしくは低下させるＴｒｋＢのコンフォメーション変化を誘導するかどうかを試験するように設計された競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより決定され得る。ＴｒｋＢとの結合に関してＴｒｋＢ結合アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４の間の競合は、全くないかまたは最小（すなわち、部分的）であり得る。一つの実施形態では、ＴｒｋＢ−ＥＣＤはチップ表面に固定化され、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかはフローセルに注入されてよい。次に、ＴｒｋＢ結合アゴニストを注入し、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下でのＴｒｋＢ−ＥＣＤに対するその結合能を評価した。競合は、ＴｒｋＢアゴニストの結合が２０％未満である「無し」；ＴｒｋＢアゴニストの結合が２０〜６０％である「部分的」；およびＴｒｋＢアゴニストの結合が６０％を超える「有り」として分類することができる。
本発明の特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒトＴｒｋＢと別種由来のＴｒｋＢの間で交差反応性を示し得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＴｒｋＢと特異的に結合する。創薬は薬物がヒトで試験される前にマウス系でのリード薬物候補の試験を一般に必要とするので、ことのことは特に有用である。ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザル種に結合できる薬物の提供は、これらの系における結果を試験し、同じ薬物を用いてデータの対照比較を行うことを可能とする。これにより例えばマウスＴｒｋＢに対して機能する薬物とヒトＴｒｋＢに対して機能する別の薬物を見つけ出す必要の複雑さが無くなり、また、同一でない薬物を用いて結果を比較する必要が無くなる。特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒトおよびラットＴｒｋＢのリン酸化のＥＣ５０に５倍以下、または２倍以下の差を示す。特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒトおよびマウスＴｒｋＢのリン酸化のＥＣ５０に５倍以下、または２倍以下の差を示す。特定のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒトおよびカニクイザルのリン酸化のＥＣ５０に５倍以下、または２倍以下の差を示す。一つの実施形態では、ＥＣ５０値は、少なくとも３回の実験の平均である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢのＢＤＮＦ結合部位に近接した、特に、当該リガンドのＮ末端と結合する特異性パッチに近接するＴｒｋＢエピトープと結合し得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢと結合し、ＢＤＮＦとＴｒｋＢのさらなる結合を増強または安定化させ得る（アゴニスト：リガンド：受容体の三元複合体）。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦと非競合性のＴｒｋＢ−ＢＤＮＦ増強剤であり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢのＤ５ドメインおよび／またはＴｒｋＢの膜近接（ＪＭ）領域内に含まれる特異的エピトープと結合し、かつ／またはＴｒｋＢとの結合に関して参照抗体と競合し得る。これらのエピトープとの結合はＴｒｋＢを活性なコンフォメーションで安定化することが可能である。ＴｒｋＢアゴニストは、（ａ）ＴｒｋＢの利用可能な細胞表面レベルを増大させ、かつ／または（ｂ）活性化されたＴｒｋＢ受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害し得る。
よって、ＢＤＮＦの不在下でＴｒｋＢを活性化し、（ｉｉ）ＢＤＮＦと競合せず、（ｉｉｉ）ＢＤＮＦにより誘導されるまたはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強し、かつ／または（ｉｖ）ＴｒｋＢの細胞表面レベルを維持するＴｒｋＢ結合アゴニストが記載される。
ＴｒｋＢ一次アミノ酸配列は、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒト間で保存性が高く（全長配列の９５％）、特に、細胞外ドメイン（ＴｒｋＢ−ＥＣＤ）が保存されている。ＴｒｋＢ−ＥＣＤは、５つのドメイン（Ｄ１−Ｄ３：Ｃ３２〜Ｃ１９４；Ｄ４：Ｇ１９５〜Ｖ２８３；Ｄ５：Ｈ２８４−Ｇ３８０）および短い膜近接ＪＭ領域（Ｗ３８１〜Ｈ４３０）を含む。ＴｒｋＢのＤ５ドメインは、リガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）の結合に関して全長ＴｒｋＢに取って代わることができる。ＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内には、「保存パッチ」と「特異性パッチ」の２つの接触領域が存在する。保存パッチにおけるＴｒｋＢ Ｄ５の接触残基は、ＡＢ、Ｃ’ＤおよびＥＦ βシート間のループと、Ｄ５ドメインのＣ末端に由来する。このＴｒｋＢの保存パッチはリガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）の軸に結合する。ＴｒｋＢ Ｄ５の特異性パッチの接触残基は、ＡＢＥＤ βシートの外面に由来する。ＴｒｋＢの特異性パッチは、非配位形態では配向をとらず、ＴｒｋＢとの結合時に配向するようになるリガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）のＮ末端と結合する。
用語「エピトープ」のほとんどの定義は、エピトープがＴｒｋＢアゴニストなど結合タンパク質の接触する抗原の部分であることを明示する（例えば、Essential Immunology, Sixth Edition, Blackwell Scientific Publishing, 1988, Ed. Roitt, Chapter 4参照）。他の定義は、結合タンパク質により結合される抗原の部分を意味する。用語「接触」および「結合」は、エピトープが適切には、静電気（水素結合、イオン性）、ファンデルワールス力、パイ効果および疎水結合などの非共有結合性の相互作用を介して抗体またはフラグメントと直接相互作用する残基だけからなるべきであることを暗に示し得る。このような厳密な解釈では、エピトープは、相互作用しないが他の点で抗原と結合タンパク質の間の相互作用に重要な残基を含まない。例えば、抗原注の特定の残基は、抗原および抗体（またはフラグメント）の他の残基間の直接的相互作用を助長するために必要な密接な相互作用を可能とするために極めて小さいことが（例えば、グリシン）必要とされる場合がある。同様に、特定の残基（例えば、プロリン）が、結合を可能とする正確なコンフォメーションを採るために抗原配列に必要とされる場合がある。
実際に、「エピトープ」情報を特定するために一般に実施される技術のほとんどは相互作用残基と他の点で重要な残基の間を区別しない（できない）。以下の技術が慣用される。
１．抗体またはそのフラグメントと抗原に由来するペプチドとの結合（有意な結合を示すペプチドは、「エピトープ」を含むと見なされる）。
２．水素重水素交換（非複合体形成抗原に比べて重水素組み込みに耐性のある複合体形成抗原に由来するペプチドは、「エピトープ」を含むと考えられる）。
３．突然変異誘発試験（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発、結合タンパク質との結合を有意に変更する抗原の変異位置は「エピトープ」の一部を形成すると考えられる）。
当業者に明らかなように、原子レベル分解能を有する技術（例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、電子顕微鏡）のみが相互作用する残基と他の点で重要な残基とを区別することができる。しかしながら、これらが厳密な定義に従ってエピトープに関する情報を得ることのできる唯一の技術であるとしても、他の技術もなお標的との結合に重要な残基／配列に関する有用な情報を提供することが提示される。
実施例に記載されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、１Ｇ１１は、以下のようにいくつかの望ましい特性を有する。
１．ＢＤＮＦに誘導性される、およびＮＴ−４により誘導される促進作用を増強する
２．ＴｒｋＢの細胞表面レベルを維持する
３．カニクイザルＴｒｋＢとの交差反応性
１Ｇ１１は、Ｘ線結晶学により、残基Ｔ２８８、Ｆ２９１、Ｋ３７２およびＥ２９３に密接に接近することが示された。Ｔ２８８およびＴ２９１はＤ５ βシートＡに位置し；Ｅ２９３はＤ５ βシートＡとＡ’の間に位置し；Ｋ３７２はＤ５ βシートＧに存在する。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、残基Ｔ２８８、Ｆ２９１、Ｋ３７２、Ｅ２９３、Ｆ２８５、Ｔ２９０およびＤ３７０を含んでなるエピトープと結合し得る。Ｆ２８５およびＴ２９０は、Ｄ５ βシートＡに位置する。Ｄ３７０は、Ｄ５ βシートＧに位置する。よって、「エピトープ」は、ＴｒｋＢのＤ５ドメインのβシートＡとＧ、およびβシートＡとＡ’の間の領域内に含まれると思われる。この同じ「エピトープ」に接触する他のＴｒｋＢ結合アゴニストも同様の生物活性を有すると予想され得る。このような結合タンパク質は極めて望ましい。
よって、一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、
ａ）以下のヒトＴｒｋＢ残基：Ｔｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５、Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３およびＧｌｕ３４１のうち１以上と相互作用し得るか；
ｂ）Ｔ２８８、Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｌ２９２、Ｅ２９３、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｋ３７２、Ｑ３７３、Ｉ３７４、およびＳ３７５からなる群から選択されるヒトＴｒｋＢ由来残基の４．５Å以内に接近し得るか；
ｃ）Ｅ２１０、Ｆ２８５、Ｔ２８８、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｅ２９３、Ｄ３７０およびＫ３７２（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか；
ｄ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、
非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基２８４〜２９１（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じ得るか；あるいは
ｅ）配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、以下のヒトＴｒｋＢ残基：Ｔｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５、Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３およびＧｌｕ３４１のうち１以上の、２以上、または３以上と相互作用し得る。一つの実施形態では、本発明は、Ｇｌｕ２９３と、および場合により、Ｔｈｒ２９０、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５、Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３、Ｇｌｕ３４１からなる群から選択される１以上、または２以上のさらなる残基と相互作用するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｔｈｒ２９０およびＧｌｕ２９３、またはＧｌｕ２９３およびＳｅｒ２９４、またはＴｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３およびＳｅｒ２９４と相互作用するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
上記の実施形態では、相互作用は、直接的相互作用または水を介した間接的相互作用であり得る。一つの実施形態では、相互作用は直接的相互作用である。本発明に関して、直接的相互作用は、ＴｒｋＢ結合アゴニストと全長ヒトＴｒｋＢの示された残基との間の水素結合である。しかしながら、相互作用残基に関する情報は全長ヒトＴｒｋＢから導出される必要はないことに留意されたい。例えば、ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインまたはヒトＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメインが使用可能である。相互作用残基は、原子レベル分解能があるいずれの技術によって同定されてもよい。一つの実施形態では、相互作用残基はＸ線結晶学により同定される。
一つの実施形態では、本発明は、Ｔ２８８、Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｌ２９２、Ｅ２９３、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｋ３７２、Ｑ３７３、Ｉ３７４、およびＳ３７５からなる群から選択されるヒトＴｒｋＢ由来の１以上の、２以上または３以上の残基の４．５Å以内に接近するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｇｌｕ２９３および場合により、Ｔ２８８、Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｌ２９２、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｋ３７２、Ｑ３７３、Ｉ３７４、およびＳ３７５からなる群から選択される１以上、または２以上のさらなる残基の４．５Å以内に接近するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｔｈｒ２９０およびＧｌｕ２９３、またはＧｌｕ２９３およびＳｅｒ２９４、またはＴｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３およびＳｅｒ２９４の４．５Å以内に接近するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。上記の実施形態において、近接分析は、原子レベル分解能のある任意の技術、例えば、Ｘ線結晶学により同定された構造に対して実施され得る。ＴｒｋＢの残基は、それらが全長ヒトＴｒｋＢにおいてなされる場合と同様にナンバリングされる。しかしながら、ＴｒｋＢ結合アゴニストとの近接に関する情報は全長ヒトＴｒｋＢから導出される必要はないことに留意されたい。例えば、ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインまたはヒトＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメインが使用可能である。
一つの実施形態では、本発明は、Ｅ２１０、Ｆ２８５、Ｔ２８８、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｅ２９３、Ｄ３７０およびＫ３７２（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｅ２１０、Ｔ２８８、Ｆ２９１、Ｅ２９３、Ｄ３７０およびＫ３７２の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｆ２９１およびＥ２９３の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。結合は、任意の好適な方法、例えば、ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡにより評価することができる。ＴｒｋＢは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け（例えば、ビオチン化）されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。用語「変更された親和性」は、ＴｒｋＢ結合アゴニストが、ヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインと比べた場合に変異型に関して、実質的に低減されたまたは実質的に増強された親和性を示す状態を意味する。親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−１標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−２標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−３標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい３分の１である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい５分の１である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい１０分の１である場合である。親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋１標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋２標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋３標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均Ｋが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも３倍である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも５倍である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも１０倍である場合である。一つの実施形態では、変更された親和性は、低下した親和性を意味する。
一つの実施形態では、本発明は、ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基２８４〜２９１（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来の配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じるＴｒｋＢ結合タンパク質を提供する。一つの実施形態では、重水素組み込みに対する耐性は、重水素化バッファーに希釈した後１５〜３００秒の間の時点（例えば、１５、６０または３００秒のうち一時点）で評価される。
アラニンスキャニング突然変異誘発およびＸ線結晶学からのデータは、１Ｇ１１の不連続エピトープを指し示すが、ほとんどの相互作用はこの不連続エピトープの最もＮ末端の部分に存在すると思われることを述べておく。これは水素・重水素交換から最も強く保護される部分でもある。このため、１Ｇ１１のエピトープのこのＮ末端領域にまさに結合する結合タンパク質は１Ｇ１１に対して同等の特性有し得ると予想される。よって、一つの実施形態では、本発明は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（抗体１Ｇ１１の不連続エピトープのＮ末端領域を含んでなるペプチド）と結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「と結合する」には、ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに由来する等価の長さのいずれの非重複ペプチドで見られるものよりも実質的に大きい結合応答を必要とする。結合は、任意の好適な方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって評価することできる。ペプチドは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け（例えば、ビオチン化）されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。「オールオアナッシング」の結合応答が達成される（すなわち、配列番号７１に示される配列を有するペプチドにより達成される結合のレベルが、他の非重複ＴｒｋＢペプチドにより達成されるレベルよりも実質的に大きい）限り、指定された配列を有するペプチドと結合するための要件は、結合タンパク質がこの配列の外側の残基と相互作用してはならない、または例えば、それらを例えば、重水素取り込みから保護してはならないことを必ずしも意味しないことに留意されたい。本発明に関して、実質的により大きい結合応答とは、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−１標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である状況を意味する。一つの実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号７１に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−２標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である。さらなる実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号７１に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−３標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である。一つの実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号７１に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい３分の１である。別の実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号７１に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい５分の１である。別の実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号７１に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい１０分の１である。
類似のエピトープに結合する１Ｇ１１およびＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦ／ＮＴ４「保存パッチ」リガンド結合部位（ＡＢ、Ｃ’ＤおよびＥＦ βシート間のループと、Ｄ５ドメインのＣ末端）に近接し、かつ、ＢＤＮＦ／ＮＴ４「特異性パッチ」リガンド結合部位（ＡＢＥＤ βシートの外面）に近位のＴｒｋＢ Ｄ５ドメインに位置するエピトープと結合し得る。ＢＤＮＦのＮ末端は、ＴｒｋＢとこれらのＴｒｋＢ結合アゴニストの間の空間に突出している。このようなＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢとの結合に加えて、ＢＤＮＦのＮ末端と相互作用でき、おそらくはその三元複合体を安定化させてＢＤＮＦの機能的応答の増強をもたらし得る。あるいは、このようなＴｒｋＢ結合アゴニストは、リガンド結合ドメインにおいては結合しないがそれと近接することによりＴｒｋＢとＢＤＮＦの相互作用を安定化させ得る。
実施例に記載されているＴｒｋＢ結合アゴニスト、３Ａ３および８Ｅ５も、ＢＤＮＦにより誘導される促進作用を増強することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発は、３Ａ３結合に重要なＴｒｋＢ内の特定の残基を同定する。３Ａ３および８Ｅ５はある種の特性を共有し、ＴｒｋＢとの結合に関して競合するので、それらは重複する「エピトープ」を有し得ると考えられる。３Ａ３に関するデータに基づけば、「エピトープ」は、残基Ｅ３９８、Ｙ３９７、Ｄ３９９、Ｙ４００、Ｄ３９４、およびＩ３９６を含んでなる。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、残基Ｅ３９８、Ｙ３９７、Ｄ３９９、およびＹ４００を含んでなるエピトープと結合し得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、残基Ｅ３９８、Ｙ３９７、Ｄ３９９、Ｙ４００、Ｄ３９４、Ｉ３９６、Ｖ３９５、Ｎ３８９、およびＴ４０２を含んでなるエピトープと結合し得る。これらの残基は膜近接（ＪＭ）領域（Ｗ３８１〜Ｈ４３０）にある。ＪＭ領域は、結晶構造が存在しなければ、長いフレキシブルリンカー領域であると仮定される。このＪＭ領域もリガンドとの結合に重要であり得ると思われる。この同じ「エピトープ」と接触する他のＴｒｋＢ結合アゴニストも、同様の生物活性を有すると予想され得る。このような結合タンパク質は極めて望ましい。
よって、一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、
ａ）Ｎ３８９、Ｄ３９４、Ｖ３９５、Ｉ３９６、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９、Ｙ４００およびＴ４０２の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合し得るか；
ｂ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、重非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて水素の組み込みに対してより耐性のある、残基３８５〜３９８（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じ得るか；または
ｃ）配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合し得る。
一つの実施形態では、本発明は、Ｎ３８９、Ｄ３９４、Ｖ３９５、Ｉ３９６、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９、Ｙ４００およびＴ４０２（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｄ３９４、Ｉ３９６、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９およびＹ４００の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９およびＹ４００の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。結合は、任意の好適な方法、例えば、ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡにより評価することができる。ＴｒｋＢは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け（例えば、ビオチン化）されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。用語「変更された親和性」とは、ＴｒｋＢ結合アゴニストが、ヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインと比べた場合に変異型に関して、実質的に低減されたまたは実質的に増強された親和性を示す状態を意味する。親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−１標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−２標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ−３標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以下である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい３分の１である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい５分の１である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的増強は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤのせいぜい１０分の１である場合である。親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋１標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋２標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。さらなる実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤ＋３標準偏差（野生型または変異型の標準偏差のうち大きい方が使用されるべきである）以上である場合である。一つの実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも３倍である場合である。別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも５倍である場合である。さらに別の実施形態では、親和性の実質的低下は、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される変異型の平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定されるヒト野生型ＴｒｋＢ細胞外ドメインの平均ＫＤの少なくとも１０倍である場合である。一つの実施形態では、変更された親和性は、低下した親和性を意味する。
一つの実施形態では、本発明は、ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ、非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基３８５〜３９８（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じるＴｒｋＢ結合タンパク質を提供する。一つの実施形態では、重水素組み込みに対する耐性は、重水素化バッファーに希釈した後１５〜６０秒の間の時点（例えば、１５、６０秒のうち一時点）で評価される。
一つの実施形態では、本発明は、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（アラニンスキャニング突然変異誘発により抗体３Ａ３との結合に重要として同定された残基を総て含有する膜近接領域内のペプチド）と結合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。これに関して、用語「と結合する」には、ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに由来する等価の長さのいずれの非重複ペプチドで見られるものよりも実質的に大きい結合応答を必要とする。結合は、任意の好適な方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって評価することできる。ペプチドは、結合アッセイを容易にするためにタグ付け（例えば、ビオチン化）されてもよいが、その配列は付加的アミノ酸により延長されてはならない。一つの実施形態では、このペプチドは、配列番号７０（アラニンスキャニング突然変異誘発により抗体３Ａ３との結合に重要として同定された残基をなお含有するより小さいペプチド）として示される配列を有し得る。「オールオアナッシング」の結合応答が達成される（すなわち、配列番号６９（または７０）に示される配列を有するペプチドにより達成される結合のレベルが、他の非重複ＴｒｋＢペプチドにより達成されるレベルよりも実質的に大きい）限り、指定された配列を有するペプチドと結合するための要件は、結合タンパク質がこの配列の外側の残基と相互作用してはならない、または例えば、それらを例えば、重水素取り込みから保護してはならないことを必ずしも意味しないことに留意されたい。本発明に関して、実質的に大きい結合応答とは、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤが、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−１標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である状況を意味する。一つの実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−２標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である。さらなる実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤ−３標準偏差（いずれかのペプチドで見られる最大の標準偏差が使用される）以下である。一つの実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい３分の１である。別の実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい５分の１である。別の実施形態では、少なくとも３回の読み取りに基づく、配列番号６９（または７０）に示される配列を含有するペプチドの平均ＫＤは、少なくとも３回の読み取りに基づいて測定される非重複ＴｒｋＢペプチドの平均ＫＤのせいぜい１０分の１である。
ＴｒｋＢ ＪＭ領域エピトープはＴｒｋＢ Ｄ５エピトープと明瞭に異なると見られるが、ＴｒｋＢ結合アゴニスト１Ｇ１１、３Ａ３および８Ｅ５は（少なくとも部分的に）ＴｒｋＢとの結合に関して互いに競合可能であり、従って、これらのエピトープは重複する可能性があることに注目することが重要である。膜近接（ＪＭ）領域の長いフレキシブルリンカーが実際にＤ５ βシートＡとＧ、およびβシートＡとＡ’の間の領域に近接している可能性がある。ＴｒｋＢ結合アゴニストがＪＭ領域エピトープと結合する場合、それは（例えば、リガンドのＮ末端を介して）ＢＤＮＦといくらかのさらなる相互作用を有し、かつ／または同様に受容体とリガンドとアゴニストの三元複合体を安定化させる可能性がある。興味深いことに、膜近接領域の残基Ｄ３９４、Ｉ３９６、およびＹ４００は、これらの残基はラットＴｒｋＢでは異なるので（それぞれＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ）、ヒトＴｒｋＢ受容体に特異性を付与する。同じ領域に結合するが異なる接触をなす他のＴｒｋＢ結合アゴニストは交差反応性を示し得る可能性がある。
いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢ上のＴｒｋＢ結合アゴニストエピトープは、ＢＤＮＦリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と重複しない。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢ上のエピトープと結合し、ＢＤＮＦとＴｒｋＢの結合を可能とし、三元複合体（ＴｒｋＢアゴニスト結合アゴニスト＋ＴｒｋＢ＋ＢＤＮＦ）を形成し得る。
ＴｒｋＢ上の特定のＴｒｋＢ結合アゴニストエピトープは、参照抗体が結合するＴｒｋＢ上のエピトープと重複する可能性がある。一つの実施形態では、本発明は、ＴｒｋＢとの結合に関して参照抗体と競合するＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢとの結合に関して参照抗体と競合し、ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦと競合しない。参照抗体は、（ａ）配列番号２７の重鎖配列と配列番号２８の軽鎖配列；または（ｂ）配列番号２９の重鎖配列と配列番号３０の軽鎖配列；または（ｃ）配列番号３１の重鎖配列と配列番号３２の軽鎖配列を有し得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢの細胞内シグナル伝達を促進して、（ａ）細胞生存、（ｂ）ニューロン修復、および／または（ｃ）ニューロン可塑性を増進し得る。増進は、アゴニストの不在下に比べて、アゴニストの存在下で改善された生物学的機能または応答である。
「細胞生存」は、ＴｒｋＢが発現される細胞の増殖の維持または増進を含む。ＴｒｋＢは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の両方で発現される。ＣＮＳでは、高レベルのＴｒｋＢが大脳皮質、海馬、視床、脈絡膜叢、ならびに小脳、脳幹、網膜および脊髄の顆粒層で発現される。ＰＮＳでは、ＴｒｋＢは、脳神経節、前庭系、顎下腺および後根神経節で発現される。ＴｒｋＢ胎児脳で広く発現される。ＴｒｋＢは、骨格筋、腎臓および膵臓などの他の組織でも発現される。ＴｒｋＢは、マイスナー小体でも発現される。中枢神経系（ＣＮＳ）および骨格筋の神経筋界面でのＴｒｋＢの活性化は、脳および脊髄運動ニューロンの生存および始原筋細胞の分化を調節し得る。一例では、細胞生存は、神経細胞生存を含む。
例えば、本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストは、ニューロンの生存、例えば、ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞株の生存を増進し得る。ＴｒｋＢ結合アゴニスト１Ｇ１１、ヒト化１Ｇ１１、８Ｅ５および３Ａ３は、（ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞株の）細胞生存を濃度依存的に、平均ＥＣ５００．００６〜０．０２５ｎＭで増進することができる。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ラット脳および／もしくは脊髄由来ニューロン、マウス脳由来ニューロンで内因的に発現されるＴｒｋＢ受容体、ならびに／またはＣＨＯ細胞で組換え発現されるカニクイザルＴｒｋＢを活性化し得る。
ＴｒｋＢは、軸策の再生および成長、神経突起成長を含むニューロン修復、神経有随化、および筋再生の速度および程度を調節することができる。修復は、恒常性を維持するための生理的なもの（すなわち、生物学的インプットに応答したバランスの維持）であり得るか、または損傷および／または傷害の結果としてのものであり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストには、神経突起成長、例えば、ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞株における神経突起成長を含み得る。ＴｒｋＢ結合アゴニスト１Ｇ１１、ヒト化１Ｇ１１および８Ｅ５は、神経突起成長（ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞株において）を濃度依存的に、平均ＥＣ５００．０７〜１．５８ｎＭで誘導した。
ＴｒｋＢは、シナプス可塑性と非シナプス可塑性の両方を包含するニューロン可塑性（神経可塑性）を調節し得る。ニューロン可塑性は、行動、環境、神経プロセス、思考、感情の変化による神経経路およびシナプスの変化、ならびに損傷および／または傷害から生じる変化を意味する。例えば、ＴｒｋＢは、シナプス可塑性の機能を調節し得る。中枢神経系（ＣＮＳ）および骨格筋の神経筋界面でのＴｒｋＢの活性化は、神経筋接合部（ＮＭＪ）を安定化させ、かつ、ＮＭＪにおけるアセチルコリン（ＡＣｈ）伝達を調節し得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡアプタマー、または多糖であり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、抗原結合タンパク質である。用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、ＴｒｋＢとの結合が可能な抗体、および別の抗体形式を意味する。
用語「抗体」は、本明細書において、免疫グロブリン様ドメインを有する分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を意味して最も広い意味で使用され、モノクローナル、組換え、合成、ポリクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、多重特異性抗体（二重特異性抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体を含む）；単一可変ドメイン、抗原結合抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢ（商標）など）、ならびに前記いずれかの修飾形態を含む。一つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、またはＩｇＡ足場を有する。一つの実施形態では、抗体はＩｇＧ足場を有し、これは４鎖または２鎖抗体であり得る。ＩｇＧ足場は、抗体のドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ）のいくつかまたは総てを含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧ足場を含んでなり得る。例えば、足場はＩｇＧ１であり得る。足場は、抗体のＦｃ領域またはその一部からなり得る、または含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、無効化されたＦｃ領域を含んでなってもよい。例えば、Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリング）で修飾されてよい。Ｆｃ領域のこの修飾はＦｃγ受容体およびＣ１ｑに対する抗体結合を減少させ、従って、抗体の、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によりＴｒｋＢ陽性細胞の枯渇を誘導する能力を低下させる。これは、一般にＦｃ無効化と言われる。Ｆｃエフェクター機能はＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的機能に重要でないことに留意されたい。
用語「ドメイン」は、タンパク質の残部とは独立にその三次構造を保持する折りたたみタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質のおよび／またはドメインの機能欠失なく、付加、除去または他のタンパク質に移動することができる。用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。よって、それは、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬなどの完全な抗体可変ドメイン、および例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換された修飾抗体可変ドメイン、または末端切断されたもしくはＮ末端またはＣ末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折りたたまれたフラグメントを含む。異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープと結合し得る単一可変ドメインは、「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ（商標）」と呼ばれることがある。単一可変ドメインはヒト単一可変ドメインであり得るが、齧歯類、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ ｄＡｂ（商標）などの他種由来の単一可変ドメインも含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインも「単一可変ドメイン」と見なされる。本明細書で使用する場合、ＶＨは、ラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
もう１つの抗体形式として、ＴｒｋＢ結合アゴニストのＣＤＲが好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格上に配置されたものがある。この非免疫グロブリン足場は、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、タンパク質Ａ由来分子、例えば、タンパク質ＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えば、ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン；ＥＧＦドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメイン；およびフィブロネクチン／アドネクチンからなる群に由来し得る。
１Ｇ１１ ＴｒｋＢ結合アゴニストのＨＣおよびＬＣドメインは、それぞれ配列番号２７および配列番号２８に示される。ヒト化１Ｇ１１ ＴｒｋＢ結合アゴニストのＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号４０および配列番号４１に示される。
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３本の軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。
配列番号２７、配列番号２８、配列番号４０および配列番号４１のＣＤＲ領域は、任意のナンバリング慣例、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ慣例によって定義され得る。各方法により定義される配列番号２７、配列番号２８、配列番号４０および配列番号４１のＣＤＲ領域を表１に示す。ｃｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲＨ２を除いて、マウス１Ｇ１１およびヒト化１Ｇ１１のＣＤＲ配列は同一であることを述べておく。本明細書を通じ、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング慣例に従ってナンバリングされる。
１Ｇ１１ ＴｒｋＢ結合アゴニストパラトープおよびおそらくはヒト化１Ｇ１１ ＴｒｋＢ結合アゴニストパラトープの主要結合残基は、ＣＤＲ Ｌ１（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
Ｌ３（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
およびＨ３（太字の残基は、エピトープの４．５Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＨ２内でエピトープの４．５Å以内に接近する残基は２つだけであり、直接的相互作用するものは１つだけである（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＨ１内でエピトープに接近するまたは（間接的に）接触するのは唯一、一残基だけであり（太字の残基は、エピトープの４．５Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＬ２でエピトープに接近するのは一残基である（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
よって、順位付けの観点から、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ３およびＨ３は結合に最も重要であり、次いで、ＣＤＲＨ２、次いで、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＨ１である。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、（ａ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；（ｂ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および（ｃ）配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなる。
一つの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号３もしくは配列番号６６内に存在するか、または配列番号３もしくは配列番号６６の変異体であり、その変異体は、１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号３内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ１内の修飾は残基Ｒ２８、Ｓ３０およびＮ３２（配列番号２８からナンバリング）にない。特定の実施形態では、Ｒ２８、Ｓ３０およびＮ３２を修飾しないことに加え、ＣＤＲＬ１内の修飾は、残基Ｉ２９および／または残基Ｎ３１（配列番号２８からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号３または配列番号６６内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号３内に存在する。
一つの実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号５もしくは配列番号６８内に存在するか、または配列番号５もしくは配列番号６８の変異体であり、その変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号５内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ３内の修飾は、残基Ｎ９２およびＳ９３（配列番号２８からナンバリング）にない。特定の実施形態では、Ｎ９２およびＳ９３を修飾しないことに加え、ＣＤＲＬ３内の修飾は、残基Ｓ９１およびＷ９４（配列番号２８からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号５または配列番号６８内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号５内に存在する。
一つの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号８もしくは配列番号６５内に存在するか、または配列番号８もしくは配列番号６５の変異体であり、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号８内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ３内の修飾は、残基Ｒ９７、Ｙ９９およびＥ１００（配列番号２７からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号８または配列番号６５内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号８内に存在する。
一つの実施形態では、上記で定義されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３を含んでなることに加え、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ２もしくはその変異体、または配列番号４０もしくはその変異体を付加的に含んでなり、それらの変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ２は、配列番号７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３もしくは配列番号６４内に存在するか、または配列番号７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３もしくは配列番号６４の変異体であり、その変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号７内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ２内の修飾は、残基Ｒ５０および／または残基Ｙ５７（配列番号２７からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ２は、配列番号７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３または配列番号６４内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ２は、配列番号７内に存在する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＣＤＲＬ１（配列番号３）、ＣＤＲＬ３（配列番号５）、およびＣＤＲＨ３（配列番号８）を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＣＤＲＬ１（配列番号３）、ＣＤＲＬ３（配列番号５）、ＣＤＲＨ２（配列番号７）およびＣＤＲＨ３（配列番号８）を含んでなり得る。
一つの実施形態では、上記で定義されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＨ２を含んでなることに加え、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ２またはその変異体、および配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ１またはその変異体を付加的に含んでなり、それらの変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。
一つの実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号４もしくは配列番号６７内に存在するか、または配列番号４もしくは配列番号６７の変異体であり、その変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号４内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ２内の修飾は、残基Ｙ５０（配列番号２８からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号４または配列番号６７内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号４内に存在する。
一つの実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号６、配列番号５８、配列番号６０もしくは配列番号６２内に存在するか、または配列番号６、配列番号５８、配列番号６０もしくは配列番号６２の変異体であり、その変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号６内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ１内の修飾は、残基Ｙ３３（配列番号２７からナンバリング）にない。特定の実施形態では、Ｙ３３を修飾しないことに加え、ＣＤＲＨ１内の修飾は、残基Ｓ３１（配列番号２７からナンバリング）にない。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号６、配列番号５８、配列番号６０または配列番号６２内に存在する。一つの実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号６内に存在する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号６のＣＤＲＨ１；配列番号７のＣＤＲＨ２；配列番号８のＣＤＲＨ３；配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号４のＣＤＲＬ２；および配列番号５のＣＤＲＬ３を含んでなり得る。
前記実施形態では、特定のＣＤＲは、３つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、１つの付加、１つの欠失および１つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体配列は１つのアミノ酸修飾を有する。別の実施形態では、各変異体配列は２つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表２に示されるような保存的置換である。
ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、構造上、有限数の主鎖コンフォメーションのうちの１つを示す傾向がある。ＣＤＲの特定のカノニカル構造クラスは、ＣＤＲの長さと、ＣＤＲおよびフレームワーク領域の両方において重要な位置にある残基（構造決定残基またはＳＤＲ）により決定されるループパッキングとの両方によって定義される。ＣＤＲセットに対するカノニカルクラスを定義するためにクラスター分析が使用され、次に、埋もれた疎水基、水素結合残基、ならびに保存されているグリシンおよびプロリンを分析することによりカノニカル鋳型が同定される。抗体配列のＣＤＲは、配列を重要な残基鋳型と比較し、同一性または類似性マトリックスを用いて各鋳型のスコアを求めることによってカノニカルクラスに割り付けることができる。
ＣＤＲ当たり、可変領域当たり、重鎖または軽鎖当たりに複数の変異体ＣＤＲカノニカル位置が存在し得るので、そのＣＤＲのカノニカル構造が、アゴニストがＴｒｋＢと結合できるように維持される限り、いずれの置換の組合せがＴｒｋＢ結合アゴニストに存在してもよい。
ＴｒｋＢ結合アゴニストＣＤＲ変異体は、
（ａ）Ｙ３２のＩ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、もしくはＤによる置換；Ｉ３４のＶ、ＭもしくはＷによる置換；およびＮ３５のＨ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、ＹもしくはＴによる置換のうち１つまたは組合せを有するＣＤＲＨ１の変異体；および／または
（ｂ）Ｉ５１のＬ、Ｖ、Ｔ、ＳもしくはＮによる置換を有するＣＤＲＨ２の変異体；および／または
（ｃ）Ｙ１０２のＨ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、ＤもしくはＧによる置換を有するＣＤＲＨ３の変異体；および／または
（ｄ）Ｌ３３のＭ、Ｖ、ＩもしくはＦによる置換；およびＨ３４のＡ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、ＶもしくはＦによる置換のうち１つもしくは組合せを有するＣＤＲＬ１の変異体；および／または
（ｅ）Ｖ５１のＡ、ＴもしくはＧによる置換を有するＣＤＲＬ２の変異体；および／または
（ｆ）Ｑ８９のＳ、Ｇ、ＦもしくはＬによる置換；Ｑ９０のＨもしくはＮによる置換；Ｌ９６のＰ、Ｙ、Ｒ、Ｉ、ＷもしくはＦによる置換のうち１つもしくは組合せを有するＣＤＲＬ３の変異体
を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒト化ＶＨ領域、もしくはヒト化重鎖（ＨＣ）配列；および／またはヒト化ＶＬ領域、もしくはヒト化軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４０に示されるＶＨ領域、もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および／または配列番号４１に示されるＶＬ領域、もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４０に示されるＶＨ領域、または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および配列番号４１に示されるＶＬ領域、または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体ＶＨ領域は、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体ＶＬ領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４２に示されるＨＣ、もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および／または配列番号４３に示されるＬＣ領域、もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなる。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４２に示されるＨＣ、または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および配列番号４３に示されるＬＣ領域、または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体ＨＣは、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体ＬＣは、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。
ＶＨ、ＶＬ、ＨＣおよびＬＣに対する修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得、従って、いずれの特定の変異体配列も置換、付加および欠失を含有し得る。一般に、変異は、置換、特に、例えば表２に示されるような保存的置換である。
特定の実施形態では、ＶＨ、ＶＬ、ＨＣおよびＬＣに対する修飾はＣＤＲを除き、その結果、ＣＤＲは無傷であり、変異はＶＨ、ＶＬ、ＨＣまたはＬＣ配列の残りの部分にある。変異体配列は実質的に、非修飾ＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４０の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＨ領域および／または配列番号４１の配列と少なくとも７６％同一の配列を含んでなるＶＬ領域を含んでなり得る。一つの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４０の配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号４１の配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、４７番がＣｙｓまたはＳｅｒであるＶＨ領域を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、４７番がＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎであるＶＨ領域を含んでなり得る。
クエリー配列とサブジェクト配列の間の「同一性の割合」は、ペアワイズＢＬＡＳＴアラインメントが実施された後にサブジェクトアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列との１００％のクエリー被覆率を有する場合にＢＬＡＳＴアルゴリズムにより計算される、割合として表される「同一性」値を用いて計算することができる。クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のこのようなペアワイズＢＬＡＳＴアラインメントは、米国国立バイオテクノロジー研究センター(National Center for Biotechnology Institute）のウェブサイトで利用可能なデフォルト設定のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することにより、低複雑性領域のフィルターを解除して実行することができる。
クエリー配列は、サブジェクト配列と１００％同一であり得るか、またはサブジェクト配列と比べた場合にある整数までのアミノ酸またはヌクレオチド変異を含み得るので、結果として同一性％は上記に示されるように１００％未満となる。このような変異は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入を含み、前記変異は、クエリー配列のアミノ末端位もしくはカルボキシ末端位に存在してもよいし、あるいはそれらの末端位間のいずれかの場所に、クエリー配列中のアミノ酸もしくはヌクレオチド間に個々に、またはクエリー配列内の１以上の連続する群として散在して存在してもよい。
同一性％は、ＣＤＲを含むクエリー配列の全長にわたって計算することができる。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリー配列（すなわち、配列番号４０または配列番号４１）の残りの部分にあり、従って、ＣＤＲ配列は固定される／無傷である。あるいは、ＣＤＲ配列は、前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性％の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾ＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
本発明はまた、（ａ）配列番号４０のＶＨ領域；および／または（ｂ）配列番号４１のＶＬ領域を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号４０のＶＨ領域；および（ｂ）配列番号４１のＶＬ領域を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
本発明はまた、（ａ）配列番号４２と少なくとも９０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または（ｂ）配列番号４３と少なくとも８５％同一の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、ＨＣは、配列番号４２の配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、ＬＣは、配列番号４２の配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、４７番がＣｙｓまたはＳｅｒであるＨＣ領域を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、４７番がＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎであるＨＣ領域を含んでなり得る。
「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性％は、ＣＤＲを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリー配列（すなわち、配列番号４０または配列番号４１）の残りの部分にあり、従って、ＣＤＲ配列は固定される／無傷である。あるいは、ＣＤＲ配列は、前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性％の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾ＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
本発明はまた、（ａ）配列番号４２の重鎖（ＨＣ）配列；および／または（ｂ）配列番号４３の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。一つの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号４２の重鎖（ＨＣ）配列；および（ｂ）配列番号４３の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
３Ａ３ ＴｒｋＢ結合アゴニストのＨＣおよびＬＣドメインは、それぞれ配列番号２９および配列番号３０に示される。ヒト化３Ａ３ ＴｒｋＢ結合アゴニストのＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号４６および配列番号４７に示される。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号２９由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号３０由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲ；または各ＣＤＲに１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有するＣＤＲ変異体のうちの１つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号２９由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号３０由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択される、１、２、３、４、５、もしくは６つのＣＤＲ；または各ＣＤＲに１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有するＣＤＲ変異体を含んでなり得る。特定の実施形態では、特定のＣＤＲは配列番号２９または配列番号３０内に存在し、一方、他のＣＤＲは、配列番号２９または配列番号３０内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、以下のＣＤＲ：
（ａ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｂ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｃ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｄ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｅ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
（ｆ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち１以上を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、
（ａ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｂ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｃ）配列番号３０内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｄ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｅ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
（ｆ）配列番号２９内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲ、少なくとも３つのＣＤＲ、少なくとも４つのＣＤＲまたは少なくとも５つのＣＤＲまたは６つ総てのＣＤＲを含んでなる。
３Ａ３に関する実施形態では、特定のＣＤＲは、３つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、１つの付加、１つの欠失および１つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体ＣＤＲは１つのアミノ酸修飾を有し得る。別の実施形態では、各変異体配列は２つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表２に示される保存的置換である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、以下のＣＤＲ：配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１３のＣＤＲＨ２；配列番号１４のＣＤＲＨ３；配列番号９のＣＤＲＬ１；配列番号１０のＣＤＲＬ２；および／または配列番号１１のＣＤＲＬ３のうちいずれか１つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１３のＣＤＲＨ２；配列番号１４のＣＤＲＨ３；配列番号９のＣＤＲＬ１；配列番号１０のＣＤＲＬ２；および／または配列番号１１のＣＤＲＬ３から選択される１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１３のＣＤＲＨ２；配列番号１４のＣＤＲＨ３；配列番号９のＣＤＲＬ１；配列番号１０のＣＤＲＬ２；および配列番号１１のＣＤＲＬ３を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒト化ＶＨ領域、もしくはヒト化重鎖（ＨＣ）配列；および／またはヒト化ＶＬ領域、もしくはヒト化軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４０に示されるＶＨ領域もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体および／または配列番号４１に示されるＶＬ領域もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４０に示されるＶＨ領域または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および配列番号４１に示されるＶＬ領域または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体ＶＨ領域は、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体ＶＬ領域は、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４２に示されるＨＣもしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および／または配列番号４３に示されるＬＣ領域もしくは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４２に示されるＨＣまたは１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体；および配列番号４３に示されるＬＣ領域または１０までのアミノ酸修飾を有するその変異体を含んでなり得る。一つの実施形態では、変異体ＨＣは、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、変異体ＬＣは、１、２ ３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する。
ＶＨ、ＶＬ、ＨＣおよびＬＣに対する修飾は、独立に置換、付加または欠失であり得、従って、いずれの特定の変異体配列も置換、付加および欠失を含有し得る。一般に、変異は、置換、特に、例えば表２に示されるような保存的置換である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４６の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＨ領域および／または配列番号４７の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＬ領域を含んでなり得る。一つの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４６の配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号４７の配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４６のＶＨ領域；および／または配列番号４７のＶＬ領域を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４６のＶＨ領域；および配列番号４７のＶＬ領域を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４８と少なくとも８０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または配列番号４９と少なくとも８０％同一の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。一つの実施形態では、ＨＣは、配列番号４８の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、ＬＣは、配列番号４９の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４８の重鎖（ＨＣ）配列；および／または配列番号４９の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号４８の重鎖（ＨＣ）配列；およびの配列番号４９の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。
３Ａ３に関する実施形態では、「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性％は、ＣＤＲを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリー配列（すなわち、配列番号４６、４７、４８または４９）の残りの部分にあり、従って、ＣＤＲ配列は固定される／無傷である。あるいは、ＣＤＲ配列は、３Ａ３に関する前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性％の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾ＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
８Ｅ５ ＴｒｋＢ結合アゴニストのＨＣおよびＬＣドメインは、それぞれ配列番号３１および配列番号３２に示される。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号３１由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号３２由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲ；または各ＣＤＲに１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有するＣＤＲ変異体のうちいずれか１つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号３１由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号３２由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択される１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ；または各ＣＤＲに１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有するＣＤＲ変異体を含んでなり得る。特定の実施形態では、特定のＣＤＲは配列番号３１または配列番号３２内に存在し、一方、他のＣＤＲは配列番号３１または配列番号３２内に存在するものの変異体である。一つの実施形態では、本発明は、以下のＣＤＲ：
（ａ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｂ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｃ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｄ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｅ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
（ｆ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
のうち１以上を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニストを提供する。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、
（ａ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｂ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｃ）配列番号３２内に存在するＣＤＲＬ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｄ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ１または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
（ｅ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ２または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
（ｆ）配列番号３１内に存在するＣＤＲＨ３または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
の群から選択される少なくとも２つのＣＤＲ、少なくとも３つのＣＤＲ、少なくとも４つのＣＤＲまたは少なくとも５つのＣＤＲまたは６つ総てのＣＤＲを含んでなる。
８Ｅ５に関する実施形態では、特定のＣＤＲは３つまでのアミノ酸修飾を有する変異体配列であり得る。各修飾は独立に置換、付加または欠失であり得る。例えば、変異体配列は、１つの付加、１つの欠失および１つの置換を有し得る。一つの実施形態では、各変異体ＣＤＲは１つのアミノ酸修飾を有し得る。別の実施形態では、各変異体配列は２つまでのアミノ酸修飾を有する。一つの実施形態では、修飾は置換、特に、例えば表２に示されるような保存的置換である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、以下のＣＤＲ：配列番号１８のＣＤＲＨ１；配列番号１９のＣＤＲＨ２；配列番号２０のＣＤＲＨ３；配列番号１５のＣＤＲＬ１；配列番号１６のＣＤＲＬ２；および／または配列番号１７のＣＤＲＬ３のうちいずれか１つまたは組合せを含んでなり得る。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号１８のＣＤＲＨ１；配列番号１９のＣＤＲＨ２；配列番号２０のＣＤＲＨ３；配列番号１５のＣＤＲＬ１；配列番号１６のＣＤＲＬ２；および／または配列番号１７のＣＤＲＬ３から選択される１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号１８のＣＤＲＨ１；配列番号１９のＣＤＲＨ２；配列番号２０のＣＤＲＨ３；配列番号１５のＣＤＲＬ１；配列番号１６のＣＤＲＬ２；および配列番号１７のＣＤＲＬ３を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒト化ＶＨ領域、またはヒト化重鎖（ＨＣ）配列；および／またはヒト化ＶＬ領域、またはヒト化軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号３１と少なくとも８０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または配列番号３２と少なくとも８０％同一の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。一つの実施形態では、ＨＣは、配列番号４８の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。一つの実施形態では、ＬＣは、配列番号４９の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の配列を含んでなる。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号３１の重鎖（ＨＣ）配列；および／または配列番号３２の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、配列番号３１の重鎖（ＨＣ）配列；および配列番号３２の軽鎖（ＬＣ）配列を含んでなり得る。
８Ｅ５に関する実施形態では、「同一性の割合」は、上記に示されるように計算される。この場合にも、同一性％は、ＣＤＲを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリー配列（すなわち、配列番号３１および３２）の残りの部分にあり、従って、ＣＤＲ配列は固定される／無傷である。あるいは、ＣＤＲ配列は、８Ｅ５に関する前記実施形態のいずれかに示される通りであり、同一性％の変動はクエリー配列の残りの部分について計算される。変異体配列は実質的に、非修飾ＴｒｋＢ結合アゴニストの生物学的特徴を保持する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、いくつかの従来の技術のいずれによって生産されてもよい。例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、それらを天然に発現する細胞から精製され得る（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製することができる）か、または組換え発現系により生産され得る。一般に、宿主細胞は、所望のＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする組換え発現ベクターで形質転換させる。
ＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする１以上の核酸配列もまた記載される。１Ｇ１１に関する実施形態では、単一の核酸配列は、重鎖をコードする配列番号４４；および／または軽鎖をコードする配列番号４５、または配列番号４４を含んでなり得る。あるいは、本発明は、重鎖をコードする配列番号４４を含んでなる核酸；および／または軽鎖をコードする配列番号４５を含んでなる別個の核酸を提供する。一つの実施形態では、単一の核酸配列は、重鎖をコードする配列番号５０；および／または軽鎖をコードする配列番号５１を含んでなり得る。もう１つの実施形態では、本発明は、重鎖をコードする配列番号５０を含んでなる核酸；および／または軽鎖をコードする配列番号５１を含んでなる別個の核酸を提供する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターもまた記載される。該核酸配列、または該発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞も記載される。宿主細胞は単離された宿主細胞であり得る。宿主細胞は通常、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。宿主細胞は非ヒト宿主細胞であってもよい。原核生物（グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス(Bacilli)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種を含む）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)種）を含む真核生物、または昆虫細胞および哺乳類起源の細胞株（例えば、ＣＨＯ、Ｐｅｒｃ６、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＳ０）を含む高等真核生物を含め、広範な宿主細胞が使用可能である。好適な宿主細胞としては、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫ１およびＣＨＯ−ＤＧ４４）などの哺乳類細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳類細胞宿主と併用するための適当なクローニングおよび発現ベクター、ならびにクローニング方法は当技術分野で公知である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストの生産のための方法が記載され、その方法は、宿主細胞を核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる。一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは精製される（例えば、従来のタンパク質精製手順による）。本方法により生産されるＴｒｋＢ結合アゴニストもまた記載される。よって、本発明は、夾雑物質を実質的に含まない、実質的に均質なＴｒｋＢ結合アゴニスト集団を提供する。
ＴｒｋＢ結合アゴニストの発現および生産時に、翻訳後修飾が起こり得る。これは特定のリーダー配列の切断、種々の糖鎖部分の種々のグリコシル化パターンでの付加、脱アミド化（例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基における）、酸化（例えば、メチオニン、トリプトファンまたは遊離システイン残基における）、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化（例えば、アスパラギン酸残基における）、Ｃ末端リシンクリッピング（例えば、一方または両方の重鎖に由来する）、およびＮ末端グルタミン環化（例えば、重鎖および／または軽鎖における）を含み得る。ＴｒｋＢアゴニストは、１以上の翻訳後修飾が施されているか、または受けていてもよい。この修飾はＣＤＲ、可変フレームワーク領域、または定常領域に生じ得る。修飾は、その分子の電荷の変化をもたらし得る。
脱アミド化は、主としてアスパラギン（Ｎ）をイソ−アスパラギン酸（イソ−アスパラギネート）およびアスパラギン酸（アスパラギネート）（Ｄ）におよそ３：１比で変換する酵素反応である。よって、この脱アミド化反応は、アスパラギネートからイソ−アスパラギン酸への異性化に関連する。アスパラギンの脱アミド化およびアスパラギネートの異性化は両方とも中間体スクシンイミドを含む。程度ははるかに低いが、脱アミド化は、グルタミン残基でも同様に起こり得る。脱アミド化は、ＣＤＲ、Ｆａｂ（非ＣＤＲ領域）、またはＦｃ領域で起こり得る。
酸化は生産および保存中に（すなわち、酸化条件の存在下で）起こり得、直接的には反応性酸素種により、または間接的には酸化ストレスの二次的副生成物との反応により誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらす。酸化は主としてメチオニン残基で起こるが、トリプトファンおよび遊離システイン残基でも起こり得る。酸化は、ＣＤＲ、Ｆａｂ（非ＣＤＲ）領域、またはＦｃ領域で起こり得る。
ジスルフィド結合のスクランブル化は、生産および基本的保存条件中に起こり得る。特定の状況下で、ジスルフィド結合は不適切に破壊または形成して不対合のシステイン残基（−ＳＨ）を生じる。これらの遊離（不対合の）スルフヒドリル（−ＳＨ）は、シャッフリングを増進し得る。
重鎖および／または軽鎖のＮ末端グルタミン（Ｑ）およびグルタメート（グルタミン酸）（Ｅ）は、環化を介してピログルタメート（ｐＧｌｕ）を形成する可能性がある。ほとんどのｐＧｌｕ形成は生産バイオリアクター内で起こるが、それは処理および保存条件のｐＨおよび温度に応じて非酵素的に形成され得る。Ｎ末端ＱまたはＥの環化は、天然ヒト抗体に一般に見られる。
Ｃ末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、組換え型および天然ヒト抗体に一般に見られる。このプロセスの変形として、組換え宿主細胞由来の細胞内酵素による一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。ヒト対象／患者へのＴｒｋＢ結合アゴニストの投与は、ヒト体内に残存するＣ末端リシンの除去をもたらす可能性がある。
本発明では、翻訳後修飾および上記の一次アミノ酸配列の変化は一般に、抗原結合親和性、生物活性、ＰＫ／ＰＤ、凝集、免疫原性、またはＦｃ受容体との結合に有意な変化を生じない。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ヒト疾患の処置において使用するために医薬組成物に組み込むことができる。一つの実施形態では、医薬組成物は、ＴｒｋＢ結合アゴニストを、場合により、１種類以上の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる。医薬組成物の例は、バッファー、塩、アミノ酸、ポリオール、糖、界面活性剤、洗剤、抗酸化剤、および／またはキレート剤のうちの１つまたは組合せを含んでなり得る。
医薬組成物は、ボーラスとしてまたは間欠的に（例えば、注射よりまたは徐放性処方物の使用により）または持続的注入により投与され得る。投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、くも膜下腔内、腹腔内、皮内、皮下、局所、中耳内、蝸牛内、眼内、硝子体内、筋肉内および門脈内が含まれる。医薬組成物は、局所投与（限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻腔内または眼内投与を含む）または経腸投与（限定されるものではないが、経口または直腸投与を含む）に好適であり得る。例えば、組成物は、静脈内またはくも膜下腔内投与に好適である。別の実施形態では、組成物は、硝子体内投与に好適である。
医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの間のＴｒｋＢ結合アゴニスト、例えば、５ｍｇ〜１ｇの間の抗原結合タンパク質を含んでなり得る。あるいは、組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇの間、例えば５ｍｇ〜５０ｍｇの間を含んでなり得る。
ＴｒｋＢ結合アゴニストの投与に関する有効用量および処置計画は、患者の年齢、体重および健康状態ならびに処置される疾患などの因子によって決まり得る。医薬処方物は、即放性処方物および徐放性処方物であり得る。徐放性処方物は特に、中耳内および蝸牛内送達に関して記載される。
医薬組成物は、ＴｒｋＢ結合アゴニストのパーツのキットを、他の薬剤と、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。便宜上、キットは、所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。一つの実施形態では、対象は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、カニクイザル、マーモセットまたはサルである。別の実施形態では、対象はヒトである。
ＴｒｋＢ結合アゴニストはまた、療法、例えば、治療または予防の方法で使用され得る。処置は、障害の少なくとも１つの様相または症状または生物学的兆候の緩和または軽減または治癒を包含する。
例えば、処置は、（１）その障害の生物学的兆候のうち１以上の改善、（２）（ａ）その障害に至るもしくは原因となる生体カスケードにおける１以上の点、または（ｂ）その障害の生物学的兆候のうち１以上への干渉、（３）その障害に関連する症状もしくは作用のうち１以上の緩和、（４）その障害またはその障害の生物学的兆候のうち１以上の進行の緩徐化、および／または（５）障害またはその障害の生物学的兆候の重篤度の尤度の低減を含む。
予防は、例えば、障害に至るもしくは原因となる生体カスケードにおける１以上の点に干渉することにより、その障害またはその生物学的兆候の発生の誘導を低減する、または発生を遅延させるための薬物の予防的投与を含む。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、記載の方法に有効な量で使用される。治療上有効な量のＴｒｋＢ結合アゴニストは、障害の１以上の症状を改善もしくは軽減するため、または障害を予防もしくは治癒するために有効な量である。
ＴｒｋＢアゴニストは、中枢的にはＣＮＳおよび末梢的にはＰＮＳの両方で、細胞生存、および／またはニューロン修復、および／またはニューロン可塑性を増進するために使用することができる。
ＴｒｋＢアゴニストは、神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を治療または予防するために使用することができる。ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の作用機序とＴｒｋＢがＣＮＳおよびＰＮＳで広く発現されることを考慮すれば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、神経障害、神経変性疾患、発達障害および他の障害を有する対象に対して両方を提供することができる。これらはＴｒｋＢ促進作用が有益であると予想される障害である。
例えば、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、神経筋接合部（ＮＭＪ）におけるＴｒｋＢ細胞内シグナル伝達を促進し、ＮＭＪの発達、安定性および維持を増進し得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、骨格筋におけるＴｒｋＢ細胞内シグナル伝達を促進し、骨格筋前駆細胞の増殖および分化を調節し得る。これは例えば筋肉損傷および変性の後に有益であり得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、シュワン細胞においてＴｒｋＢ細胞内シグナル伝達を促進し、軸策の再生および成長を増進し得る。これは例えば神経損傷および変性の後に有益であり得る。
障害には、疾患、病態、症候群、症状および徴候が含まれる。神経障害には、神経疾患、病態、症候群、症状および徴候が含まれる。神経障害は、脳、脊髄、脳神経、末梢神経、神経根、自律神経系、神経筋接合部、および／または筋肉を含む、中枢および末梢神経系の成分の構造または機能に混乱があるものを含み得る。神経障害は、表現型が不均一であり得、未知の病因を有する場合が多い。いくつかの機序および経路が、神経疾患などの神経障害に関連付けられている。これらの疾患では、特定の症状および構造／機能関係が基礎にある病因の理解に至っている。
障害はまた、ＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復または増進が有益であり得るものであり得る。例えば、ＴｒｋＢを発現する細胞の変性または機能不全を含む障害の場合。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、本明細書に記載の障害の治療または予防の方法において使用可能である。より具体的には、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、本明細書に記載の障害の処置方法において使用され得る。障害は、神経変性疾患、視神経症および網膜変性病態、難聴障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害およびその他のＣＮＳ障害を含んでなる。
神経変性疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン病（進行性筋萎縮を含む）、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を含むプリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症（前頭側頭型認知症を含む）およびタウオパシー(tauopathies)が含まれる。より詳しい神経変性疾患としては、ＡＬＳ、ハンチントン病および運動ニューロン病が含まれる。
一例では、ＡＬＳの処置は、運動ニューロンの生存および機能を増進することを含む。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、神経保護および／または神経修復効果を有し得る。
一例では、認知症またはアルツハイマー病に関する処置は、認知機能低下の進行を緩徐化することを意味する。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、細胞生存を促進し、神経突起成長を増進し、かつ／またはシナプス可塑性を調節し得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、アルツハイマー病および他の認知症におけるニューロン機能不全を予防し得るまたは遅延させ得る。
一例では、ハンチントン病に関する処置は、限定されるものではないが、認知機能低下の進行の緩徐化を含む、疾患進行を緩徐化することを意味する。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、細胞生存を促進し、神経突起成長を増進し、かつ／またはシナプス可塑性を調節し得る。ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ハンチントン病におけるニューロン機能不全を予防し得るまたは遅延させ得る。
視神経神経症としては、例えば、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および／または視神経を傷害する病態が含まれる。特定の視神経神経症としては、緑内障（例えば、開放隅角緑内障、広隅角緑内障、閉塞隅角緑内障（急性および慢性）、正常眼圧緑内障）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）（例えば、非動脈性虚血性視神経症(non-arteritic ischeamic optic neuropathy)（ＮＡＩＯＮ））、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症（例えば、乳頭浮腫）、浸潤性視神経症、外傷性視神経症、ミトコンドリア視神経症、中毒性視神経神経症、遺伝性視神経神経症（例えば、常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ；Ｋｊｅｒ型視神経萎縮）、レビー遺伝性視神経症、ローゼンバーグ・チュトリアン症候群、ウォルフラム症候群、視神経低形成）、視神経炎（例えば、視神経脊髄炎、乳頭炎）が含まれる。網膜変性障害には、遺伝性ジストロフィー（例えば、色素性網膜炎）、または加齢黄斑変性（ウェット型およびドライ型）を含む後天性病態が含まれるであろう。一つの実施形態では、視神経神経症としては、例えば、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および／または視神経を傷害する病態が含まれる。特定の視神経神経症としては、緑内障（例えば、開放隅角緑内障、広隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、非前部虚血性視神経症(non-anterior ischeamic optic neuropathy)（ＮＡＩＯＮ）、外傷性視神経神経症およびレビー遺伝性視神経症が含まれる。網膜変性障害には、加齢黄斑変性（ウェット型およびドライ型）を含む遺伝性または後天性病態が含まれるであろう。
難聴障害としては、感音性難聴（ＳＮＨＬ）（両側性、一側性および不特定）および混合難聴（感音要素と伝音損失要素が存在する；両側性、一側性および不特定）が含まれる。感音性難聴としては、感覚性（蝸牛関連）または神経性（第８神経関連）難聴が含まれる。感音性難聴は、末端器官の病変から起こり得る。感音性難聴に関連する末端器官の病変は、音響性外傷（例えば８５デシベル（ｄｂ）を超えるノイズによる）、ウイルス性内リンパ内耳炎、メニエール病、第８神経の小脳橋角腫瘍、第８神経神経節の細菌またはウイルス感染（例えば、耳性帯状疱疹による）、急性中耳炎から生じる化膿性内耳炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、ウイルス起源のものを含む突発性難聴、例えば、流行性耳下腺炎、麻疹、インフルエンザ、水痘、単球増加症およびアデノウイルスを含むウイルスにより引き起こされるウイルス性内リンパ内耳炎）、および一過性虚血性難聴、中耳に延伸して鼓膜およびおそらく耳小骨連鎖を離断する側頭骨の骨折、蝸牛に影響を及ぼす骨折、ならびに第８神経の聴覚核または前庭核のいずれかから生じる、一般にシュワン細胞起源の腫瘍である聴神経腫瘍を含む。末端器官病変難聴は、風疹、出生時の無酸素症、分娩中の外傷による内耳中への出血、母親に投与される耳毒性薬、胎児赤芽球症、ならびにワーデンブルグ症候群およびハーラー症候群を含む遺伝性病態など、先天性であり得る。感音性難聴は、あるいは、加齢性のもの、例えば、加齢の正常な現象として起こる感音性難聴である老人性難聴(presbycusis)（老年性難聴(presbyacusia)）であり得る。感音性難聴は、中毒性難聴（内耳の聴覚器官、特に、コルチ器官に影響を及ぼす耳毒性薬（例えば、ある種の抗生剤、ある種の化学療法薬、ある種のサリチル酸化合物、特に、アスピリン、ある種の利尿剤、一般ループ利尿薬、およびある種のキニーネ）から起こる難聴）であり得る。突発性感音性難聴、隠れた難聴（内耳におけるシナプスおよび聴覚線維損失から生じると思われる）および耳鳴（おそらくコルチ器官に対する傷害から生じる）も含まれる。
精神障害としては、不安、気分障害、鬱病（大鬱病性障害を含む）、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害および統合失調症が含まれる。
神経発達障害としては、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群 自閉性障害およびレット症候群が含まれる。
エネルギーバランスは、摂食行動を制御する２つの中枢回路の調節に依存する：中枢神経系（ＣＮＳ）は、食欲、捕食行動、および体温調節を調和および統合しなければならず；満腹感（例えば、消化管からの）および全体的なエネルギーバランスを調節するシグナルが、末梢に伝達され、ＣＮＳにフィードバックされなければならない。よって、体重調節の障害には、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少（癌治療に関連するおよび／または癌治療により引き起こされる望ましくない体重減少）、サルコペニア、肥満およびオピオイド誘発性嘔吐が含まれる。
筋障害には、サルコペニアが含まれる。
他のＣＮＳ障害としては、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷（外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊髄損傷および末梢神経損傷を含む）、末梢神経症、神経筋疾患（重症筋無力症および筋無力症候群を含む）、睡眠障害および脳卒中が含まれる。一例では、末梢神経障害としては、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）が含まれる。ＣＩＰＮは、多くの抗癌薬の主要な用量制限副作用である。
ＴｒｋＢ結合アゴニストは、障害の進行を有意に緩徐化／停止／遅延する、日常生活機能を増進する、および対象の寿命を延長する神経障害および他の障害の処置として使用することができる。
一つの実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、以下の障害：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脳卒中、脊髄損傷、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン障害、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、認知症、タウオパシー、末梢神経障害、神経損傷、末梢神経損傷、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を含むプリオン病、精神障害、統合失調症、多発性硬化症、レット症候群、レビー小体病、多系統萎縮症、重症筋無力症、糖尿病性神経障害、網膜変性、緑内障、難聴、体重調節、拒食症、悪液質、神経筋疾患、気分および鬱病性障害、心的外傷後ストレス障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、不安、自閉性障害、疼痛、体重調節を含む障害、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、およびオピオイド誘発性嘔吐のうちいずれか１つの処置のために使用される。
上記の障害の治療または予防に使用される場合、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、１以上の有効薬剤、例えば、特定の障害の治療または予防における使用のために承認された有効薬剤、より詳しくは、現行の標準治療をなすと考えられる薬剤とともに投与してよい。併用療法が想定される場合、有効薬剤は、１以上の医薬組成物で同時に、個別に、または逐次に投与してよい。
本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストがアルツハイマー病の処置のために使用される実施形態では、それはコリンエステラーゼ阻害剤および／またはメマンチンと併用可能である。
本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストがＡＬＳの処置のために使用される実施形態では、それはリルゾールと併用可能である。
本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストが緑内障の処置のために使用される実施形態では、それはプロスタグランジン類似体、β遮断薬、αアゴニストおよび炭酸脱水酵素阻害剤のうち１以上と併用され得る。本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストが緑内障の処置のために使用される別の実施形態では、それは選択的レーザー線維柱帯形成術（ＳＬＴ）およびアルゴンレーザー線維柱帯形成術（ＡＬＴ）と併用可能である。
一つの実施形態では、本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストは、感音性難聴を処置するための併用療法として蝸牛インプラント併用可能である。別の実施形態では、この本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストは、感音性難聴を処置するためにステロイドと併用可能である。別の実施形態では、この本発明のＴｒｋＢ結合アゴニストは、感音性難聴を処置するために遺伝子療法、例えば、ＡＴＯＨ１遺伝子療法と併用可能である。
１つの特定の実施形態では、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、耳毒性薬剤と併用投与される。当業者は、耳毒性薬剤から生じる難聴を予防し、患者に投与される耳毒性薬剤の高用量化をさらに可能とし得る。
本発明はまた、以下の実施形態を有する。
実施形態１．ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強するＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２．ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦと競合しない、実施形態１のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態３．ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強効果が、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下に比べたＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下、飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢの活性化の増大により測定される、実施形態１または２のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態４．ＴｒｋＢの活性化の増大がＴｒｋＢのリン酸化のレベルの上昇により測定される、実施形態３のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態５．飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢのリン酸化が、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での少なくとも１１０％に比べて、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下で１００％である、実施形態４のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態６．飽和濃度のＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢのリン酸化が、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、または少なくとも１５０％に比べて、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下で１００％である、実施形態４または５に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態７．ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦと競合せず、かつ、ＴｒｋＢのＤ５ドメインのβシートＡとＧ、およびβシートＡとＡ’の間の領域内に含まれるエピトープと結合するＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態８．エピトープが残基Ｔ２８８、Ｆ２９１、Ｋ３７２、およびＥ２９３を含んでなる、実施形態７に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態９．ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦと競合せず、かつ、ＴｒｋＢの膜近接領域（Ｗ３８１〜Ｈ４３０）内に含まれるエピトープと結合するＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１０．エピトープが残基Ｅ３９８、Ｙ３９７、Ｄ３９９、およびＹ４００を含んでなる、実施形態９に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１１．ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦと競合せず、かつ、ＴｒｋＢとの結合に関して、（ａ）配列番号２７の重鎖配列および配列番号２８の軽鎖配列；または（ｂ）配列番号２９の重鎖配列および配列番号３０の軽鎖配列；または（ｃ）配列番号３１の重鎖配列および配列番号３２の軽鎖配列を有する参照抗体と競合するＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１２．ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強する、実施形態７〜１１のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１３．ＢＤＮＦの不在下でＴｒｋＢを活性化し、細胞表面のＴｒｋＢレベルを維持するＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１４．ＴｒｋＢのリガンド結合ドメインに結合しない、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１５．
（ａ）（ｉ）配列番号２７からのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および／もしくは配列番号２８からのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲのいずれかのうちいずれか１つもしくは組合せ；または
（ｉｉ）各ＣＤＲに１、２、もしくは３つのアミノ酸修飾を有する（ｉ）のＣＤＲ変異体；または
（ｂ）配列番号４０の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＨ領域および／もしくは配列番号４１の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＬ領域
を含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１６．以下のＣＤＲ：
（ａ）配列番号６のＣＤＲＨ１；
（ｂ）配列番号７のＣＤＲＨ２；
（ｃ）配列番号８のＣＤＲＨ３；
（ｄ）配列番号３のＣＤＲＬ１；
（ｅ）配列番号４のＣＤＲＬ２；および／または
（ｆ）配列番号５のＣＤＲＬ３
のうちいずれか１つまたは組合せを含んでなるＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１７．ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ３、およびＣＤＲＨ３を含んでなる、実施形態１５または１６に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１８．加えてＣＤＲＨ２を含んでなる、実施形態１７に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態１９．
（ａ）ヒト化ＶＨ領域、またはヒト化重鎖（ＨＣ）配列；および／または
（ｂ）ヒト化ＶＬ領域、またはヒト化軽鎖（ＬＣ）配列
を含んでなる、実施形態１５〜１８のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２０．ＶＨの４７番がＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎである、実施形態１５〜１９のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２１．
（ａ）配列番号４０のＶＨ領域；および／または
（ｂ）配列番号４１のＶＬ領域
を含んでなる、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２２．
（ａ）配列番号４２と少なくとも８０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または
（ｂ）配列番号４３と少なくとも８０％同一の軽鎖（ＬＣ）配列
を含んでなる、実施形態１５〜２１のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２３．
（ａ）配列番号４２の重鎖（ＨＣ）配列；および／または
（ｂ）配列番号４３の軽鎖（ＬＣ）配列
を含んでなる、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２４．ヒトＴｒｋＢ受容体を促進し、ＢＤＮＦと競合せず、かつ、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強する、実施形態１５〜２３のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２５．Ｆｃ領域が無効化されている、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２６．合成配列、ヒト化配列、またはキメラ配列を含んでなる、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態２７．実施形態１〜２６のいずれか１つで定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする核酸配列。
実施形態２８．重鎖をコードする配列番号４４；および／または軽鎖をコードする配列番号４５を含んでなる、実施形態２７に記載の核酸配列。
実施形態２９．実施形態２７または２８に定義される核酸配列を含んでなる発現ベクター。
実施形態３０．実施形態２７もしくは２８に定義される核酸配列、または実施形態２９に定義される発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
実施形態３１．実施形態１〜２６のいずれか１つに定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストの生産のための方法であって、請求項３０に定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養し、それにより、ＴｒｋＢ結合アゴニストが発現および精製されることを含んでなる、方法。
実施形態３２．実施形態３１の方法により生産されるＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態３３．実施形態１〜２６または実施形態３２のいずれか１つに定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤のうち１つまたは組合せを含んでなる、医薬組成物。
実施形態３４．療法において使用するための、実施形態１〜２６もしくは実施形態３２のいずれか１つに定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または実施形態３３に定義される医薬組成物。
実施形態３５．神経障害の処置において使用するための、実施形態１〜２６もしくは実施形態３２のいずれか１つに定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または実施形態３３に定義される医薬組成物。
実施形態３６．神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、実施形態１〜２６もしくは実施形態３２のいずれか１つに定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または実施形態３３に定義される医薬組成物。
実施形態３７．障害が神経変性疾患、視神経症、網膜変性病態、難聴を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および別のＣＮＳ障害である、実施形態３５または３６に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態３８．障害が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン病、パーキンソン病、プリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパシー、緑内障前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、非前部虚血性視神経症(non-anterior ischeamic optic neuropathy)（ＮＡＩＯＮ）、外傷性視神経神経症、レビー遺伝性視神経症、加齢黄斑変性、神経性難聴、内耳性難聴、耳鳴、感音性難聴、混合性難聴、不安、気分障害、鬱病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、サルコペニア、肥満、オピオイド誘発性嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害および脳卒中である、実施形態３７に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態３９．処置が細胞生存、および／またはニューロン修復、および／またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、実施形態３４、３５、３６、３７または３８のいずれか１つのＴｒｋＢ結合アゴニスト。
実施形態４０．療法において使用するための、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強剤。
１．ＴｒｋＢアゴニスト
ＴｒｋＢ受容体に対するマウスモノクローナル抗体は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞株発現および精製を用いて作製された組換えヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（以下、ＴｒｋＢ−ＥＣＤと呼称、配列番号１、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５−ＪＭ、Ｃ３２−Ｈ４３０、３９９アミノ酸）によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫誘導により作製した。免疫誘導に用いたＴｒｋＢ−ＥＣＤは、ＧＳＡリンカーを介してＦＬＡＧタグを付加し、Ｃ末端にＨｉｓタグ（５Ｈｉｓ残基）を有した（ＦＬＡＧタグ−ＧＳＡ−Ｃ３２−Ｈ４３０−Ｈｉｓ５）。ハイブリドーマ融合クローンのスクリーニング（約３０００ウェル）は、（ｉ）直接的抗原ＥＬＩＳＡ（すなわち、ＴｒｋＢ−ＥＣＤと結合する）と（ｉｉ）ＴｒｋＢ活性化依存性ＮＦＡＴプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイ（すなわち、ＴｒｋＢのアゴニスト）の間に相関を示したクローンを選択することにより行った。この選択基準により、マウスアゴニスト抗体１Ｇ１１、３Ａ３（３Ｂ３と同じ抗体配列）、８Ｅ５、５Ｄ１１（３Ｅ１０と同じ）、５Ｃ７（５Ｅ６と同じ抗体配列）、３Ａ４、および２Ａ１を発現する複数のハイブリドーマクローンの同定に至った。
１．１ 親和性
１Ｇ１１は、ヒトＴｒｋＢ−ＥＣＤと、表面プラズモン共鳴で決定した場合に約４２ｎＭ（ｋｏｎ＝５．６６×１０４／Ｍｓ、ｋｏｆｆ＝０．００２３９／秒）の親和性で結合することを示した。１Ｇ１１の親和性を表３に、同定された他のアゴニスト抗体の親和性とともに示す。
１．２ 受容体選択性
ＴｒｋＡまたはＴｒｋＢまたはＴｒｋＣのいずれかを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＴｒｋ活性化依存性ＮＦＡＴプロモーターにより駆動されるリポーターアッセイを用いたＴｒｋファミリー受容体に対する１Ｇ１１の選択性の評価から、１Ｇ１１はＴｒｋＢ受容体発現細胞でリポーター遺伝子発現を選択的に誘導したが、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣ受容体発現細胞では供試濃度（０．００００６〜１２５ｎＭ）では誘導しなった。対照として、同族リガンド（ＴｒｋＡに対してはＮＧＦ、ＴｒｋＢに対してはＢＤＮＦおよびＴｒｋＣに対してはＮＴ−３）は、対応するＴｒｋ受容体発現細胞において匹敵するレベルのリポーター遺伝子発現を誘導した。１Ｇ１１はまた、汎ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲとの結合能に関しても試験した。細胞に基づく結合アッセイは、ｐ７５ＮＴＲ受容体に対する１Ｇ１１の検出可能な結合を示さなかった。ＴｒｋＢアゴニストの受容体選択性を表３にまとめる。
１．３ 交差種反応性
１Ｇ１１は、齧歯類（マウス、ラット）、カニクイザル、およびヒトＴｒｋＢ受容体と結合し、活性化する。２Ａ１および５Ｄ１１はまた、ラット、マウスおよびヒトＴｒｋＢ受容体も活性化する。興味深いことに、３Ａ３および８Ｅ５は、ヒトＴｒｋＢ受容体のみを活性化し、齧歯類ＴｒｋＢ受容体を活性化しない。この種交差反応性は、異種細胞株または対応する種に由来する初代細胞またはヒトｉＰＳＣ由来細胞において組換え発現されたＴｒｋＢ受容体を用いて試験した。ＴｒｋＢアゴニストの種選択性を表３にまとめる。
１．４ ＴｒｋＢの活性化
ＣＨＯ−Ｋ１を安定発現するヒト全長ＴｒｋＢ受容体（配列番号２）を１Ｇ１１で処理すると、ＴｒｋＢのリン酸化レベル（ｐＴｒｋＢ、Ｙ５１５）により測定した場合に３．１±２．１ｎＭ（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝８）の平均ＥＣ５０でＴｒｋＢの活性化をもたらした。ＴｒｋＢアゴニストのＴｒｋＢ活性化効果を表３にまとめる。１Ｇ１１はそれ自体、同族リガンドＢＤＮＦ（ならびにＮＴ−４）最大応答の約３０〜４０％のＴｒｋＢ受容体を活性化する。
１Ｇ１１は、ラット皮質ニューロンにおいてＴｒｋＢおよびその下流シグナル伝達経路の持続的活性化（最大２４時間）を誘導したが、このことは、１Ｇ１１はＴｒｋＢに曝された際に、その受容体をＢＤＮＦに比べて長時間活性化状態で維持できることを示す（図１Ａ参照）。機構的に、１Ｇ１１により誘導されるＴｒｋＢ活性化はＢＤＮＦとは異なる。活性化されたチロシンキナーゼ受容体は一般に、エンドサイトーシスを受けた後、分解されて細胞表面受容体のダウンレギュレーションをもたらし、それにより、細胞内恒常性を維持するために一時的にリガンドに不応となる。興味深いことに、１Ｇ１１は、ラット皮質ニューロンにおいてＴｒｋＢの表面レベルを最大４時間変化させなかったが、細胞表面ビオチン化により測定した場合のＴｒｋＢ受容体の全細胞レベルの低下にもかかわらず、非処理対照に比べて２４時間時点でレベルは上昇した（図１Ｂ参照）。
１．５ ＢＤＮＦ競合
ＴｒｋＢ受容体に対する１Ｇ１１の活性化効果を、ＢＤＮＦの存在下および不在下の両方でＴｒｋＢリン酸化により判定した。ＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢアゴニストの競合効果は、ＴｒｋＢリン酸化の低下として定義された。全長ＴｒｋＢ受容体を過剰発現すＣＨＯ細胞における、飽和ＢＤＮＦ濃度（１０ｎＭ、ＥＣ１００）の存在下でのＴｒｋＢリン酸化に対する種々の濃度の１Ｇ１１の効果の評価は、１Ｇ１１がＴｒｋＢに関してＢＤＮＦと競合しないことを明らかにした。ＢＤＮＦと競合することが同定された唯一ＴｒｋＢアゴニストが５Ｄ１１であり、これはＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢリン酸化を約５０％低下させた。ＴｒｋＢアゴニストのＢＤＮＦ競合結果を表３にまとめる。
１．６ ＴｒｋＢアゴニスト競合アッセイ
ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂのエピトープ結合特性を分析するために、競合アッセイを、ＴｒｋＢアゴニストが互いに競合し合うかを決定し、ＴｒｋＢ上の類似または重複するエピトープと結合するものを一緒に分類することを可能とするように設定した。ＴｒｋＢ−ＥＣＤをチップ表面に固定し、単一のＴｒｋＢアゴニストｍＡｂをＴｒｋＢとの結合のためにフローセルに注入した。次に、第２のＴｒｋＢアゴニストｍＡｂを注入し、第１のＴｒｋＢアゴニストｍＡｂの存在下でのＴｒｋＢ−ＥＣＤに対するその結合能を評価した。競合は、第２のＴｒｋＢアゴニストの結合が２０％未満である「無し」；第２のＴｒｋＢアゴニストの結合が２０〜６０％である「部分的」；および第２のＴｒｋＢアゴニストの結合が６０％を超える「有り」として分類した。従って、第２のＴｒｋＢアゴニストの結合「無し」は競合無しと結論付けられ、よって、非重複エピトープと結合するこれら２つのＴｒｋＢアゴニスト、あるいはまた第１のＴｒｋＢアゴニストの結合は、ＴｒｋＢ−ＥＣＤコンフォメーションを第２のＴｒｋＢアゴニストが結合できないような様式で変化させる。「部分的」および「有り」は、ＴｒｋＢ上の類似または重複するエピトープとの結合に関する２つのＴｒｋＢアゴニストの競合として結論付けられた。
ＴｒｋＢアゴニストの競合結果を表３にまとめる（１Ｇ１１、または３Ａ３、または８Ｅ５との競合）。表２は、１Ｇ１１、３Ａ３、および８Ｅ５がＴｒｋＢ上の類似または重複するエピトープとの結合に関して互いに競合するＴｒｋＢアゴニストを一緒に分類され得ることを示す。
１．７ ＢＤＮＦの増強
ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用に対する１Ｇ１１の増強効果を、ＢＤＮＦの存在下でＴｒｋＢリン酸化レベル（ｐＴｒｋＢ、Ｙ５１５）を測定することにより評価した。全長ＴｒｋＢ受容体（配列番号２）を過剰発現するＣＨＯ細胞における、飽和ＢＤＮＦ濃度（１０ｎＭ、ＥＣ１００）の存在下でのＴｒｋＢに対する種々の濃度の１Ｇ１１の効果の評価は、図２に示されるように最大応答で表した場合、処理３０分後のＴｒｋＢ活性の化定常レベルを増強するという結果を示した（ＢＤＮＦ−１００％；ＢＤＮＦ＋１Ｇ１１−約１００％〜１４５％）。
図２に示されるように、飽和ＢＤＮＦ濃度の存在下での他のＴｒｋＢアゴニストの評価は、３Ａ３および８Ｅ５もまたＴｒｋＢ受容体の活性化を「増強した」ことを明らかにした（それぞれ約１００〜１６５％、および約１００〜１２０％）。これらの結果を表３にまとめる。
興味深いことに、クローン５Ｃ７、５Ｅ６、３Ａ４および２Ａ１は競合せず、ＢＤＮＦにより媒介されるＴｒｋＢ受容体の活性化を増強もしなかったが、このことは（ａ）総てのアゴニスト抗体が増強特性を保持するわけではないこと、および（ｂ）総てのリガンド非競合抗体が増強剤となるわけではないことを示す。
図２は、ＴｒｋＢ抗体−増強剤および非競合物（３Ａ３、１Ｇ１１、８Ｅ５）、競合物（５Ｄ１１）、非競合物（２Ａ１、３Ａ４、５Ｃ７）に関する代表的で０他を示す。１００％活性は、飽和濃度、すなわち、１０ｎＭ ＥＣ１００のＢＤＮＦにおけるＴｒｋＢの活性化を表す。
ＢＤＮＦレベルは、ほとんどの神経学的および病態生理学的疾患において低下していることが報告されており、表現型／欠乏がこの低下に帰されてきた。ＴｒｋＢ受容体レベルが不変のままであるＢＤＮＦ欠乏の病態生理学的状態下では、投与されるＴｒｋＢアゴニストが、（ｉ）ＴｒｋＢ受容体を活性化すること（例えば、１Ｇ１１、３Ａ３、８Ｅ５、５Ｄ１１、５Ｃ７、５Ｅ６、３Ａ４および２Ａ１）、（ｉｉ）低レベルのＢＤＮＦと競合しないこと（例えば、１Ｇ１１、３Ａ３、８Ｅ５、５Ｃ７、５Ｅ６、３Ａ４および２Ａ１）、（ｉｉｉ）ＢＤＮＦの生理的レベルの低下により誘導される細胞内シグナル伝達を増強すること（例えば、１Ｇ１１、３Ａ３、８Ｅ５）、および（ｉｖ）そうでなければＴｒｋＢアゴニストに対する一時的脱感作をもたらし得るＴｒｋＢの細胞表面レベルを変更することがないこと（例えば、１Ｇ１１）が可能であれば、生理的な細胞／系の応答がなお惹起され得る。このデータもまた表３にまとめる。
１．８ ＮＴ−４の増強
同様に、１Ｇ１１は、ＮＴ−４と競合できず、かつ、飽和レベルのＮＴ−４の存在下でＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用に対する「増強」効果を示し得なかった（ＮＴ−４−１００％；ＮＴ−４＋１Ｇ１１−約１３０％；表３）。従って、３Ａ３および８Ｅ５もまたＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用に対して増強効果を有すると予想される。
１．９ 細胞生存および修復
１Ｇ１１は、濃度依存的にヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞株において神経突起の生存を増進し、神経突起の成長を誘導した（それぞれ平均ＥＣ５００．０２５±０．０１ｎＭおよび０．１９±０．０６ｎＭ）。１Ｇ１１は、ラット脳および脊髄由来ニューロン、マウス脳由来ニューロンで内因的に発現されたＴｒｋＢ受容体、およびＣＨＯ細胞において組換え発現されたカニクイザルＴｒｋＢを活性化した。
同様に、８Ｅ５および３Ａ３も、それぞれＥＣ５０ ０．０９±０．０６ｎＭ（平均±ＳＤ）および０．００６±０．００１ｎＭ（ｍｅａｎ±ＳＤ）で細胞生存を増進した。
８Ｅ５は濃度依存的にＥＣ５０ １．５８±０．３４ｎＭ（平均±ＳＤ）で神経突起成長を誘導したが、３Ａ３は、漸増抗体濃度で二相型の神経突起成長応答を一貫して示し、正確なＥＣ５０を導くことを困難にする。
２．１Ｇ１１、３Ａ３、および５Ｄ１１の配列決定
従来技術によりＴｒｋＢアゴニストの配列決定を行った。ＣＤＲをＫａｂａｔにより決定し、表４に１Ｇ１１、３Ａ３、８Ｅ５、および５Ｄ１１に関して示す（注：異なるナンバリング慣行により決定された１Ｇ１１に関するＣＤＲ領域は表１に示す）。１Ｇ１１（配列番号２７および２８）、３Ａ３（配列番号２９および３０）、８Ｅ５（配列番号３１および３２）、ならびに５Ｄ１１（配列番号３３および３４）のそれぞれの全長マウス配列（重鎖および軽鎖）も表４に示す。
２．エピトープ
ＴｒｋＢ一次アミノ酸配列はマウス、ラット、カニクイザルおよびヒト間で保存性が高く（全長配列の９５％）、特に、実施例１で同定された総てのＴｒｋＢアゴニストが結合する細胞外ドメインで保存されている。ＴｒｋＢ上の結合エピトープを決定するために、ドメイン欠失およびアラニンスキャニング突然変異誘発（表面プラズモン共鳴を使用）によるエピトープマッピング試験ならびにＴｒｋＢ ＥＣＤ（配列番号１）を用いたＸ線結晶試験を行った。ＴｒｋＢ ＥＣＤは、５つのドメイン（Ｄ１−Ｄ３：Ｃ３２〜Ｃ１９４； Ｄ４：Ｇ１９５〜Ｖ２８３；Ｄ５：Ｈ２８４〜Ｇ３８０）と短い膜近接ＪＭ領域（Ｗ３８１〜Ｈ４３０）を含む。エピトープマッピング試験に用いたＴｒｋＢ−ＥＣＤは、ＧＳＡリンカーを介してＦＬＡＧタグが付加され、Ｃ末端にＨｉｓタグ（５Ｈｉｓ残基）を有した（ＦＬＡＧタグ−ＧＳＡ−Ｃ３２−Ｈ４３０−Ｈｉｓ５）。
欠失ドメイン変異体を作出した：Ｄ１−Ｄ３ドメイン変異体はＣ３２〜Ｌ１９６（配列番号３５）を含み；Ｄ４−Ｄ５−ＪＭドメイン変異体はＰ１９７〜Ｈ４３０（配列番号３６）を含み、Ｄ５−ＪＭドメイン変異体はＨ２８４〜Ｈ４３０（配列番号３７）を含む。
アラニンスキャニング突然変異誘発試験（２．２、２．３および２．５）のため、単一点突然変異体を挙げられたようにＴｒｋＢ−ＥＣＤ（配列番号１）に作出した：
２．１ ＴｒｋＢとＢＤＮＦの間の結合
ＴｒｋＢのＤ５ドメイン（残基２８６〜３８４）はリガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）との結合に関して全長ＴｒｋＢに取って代わり得ることが知られている。ＴｒｋＢのリガンド結合部位内には、「保存パッチ」と「特異性パッチ」の２つの接触領域が存在する。保存パッチ内のＴｒｋＢ Ｄ５の接触残基は、ＡＢ、Ｃ’ＤおよびＥＦ βシートの間のループとＤ５ドメインのＣ末端に由来する。ＴｒｋＢの保存パッチはリガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）の軸に結合する。特異性パッチにおけるＴｒｋＢ Ｄ５の接触残基は、ＡＢＥＤ βシートの外面に由来する。ＴｒｋＢの特異性パッチは、非配位形態では配向をとらず、ＴｒｋＢとの結合時に配向するようになるリガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）のＮ末端と結合する。ＢＤＮＦ／ＮＴ−４ホモダイマーと２つのＴｒｋＢ Ｄ５ドメインの間の構造的相互作用を図３にまとめる。
２．２ １Ｇ１１のエピトープ
種々のＴｒｋＢドメイン欠失変異体を用いた１Ｇ１１の最初の表面プラズモン共鳴結合分析により、１Ｇ１１はＴｒｋＢ−ＥＣＤ（Ｃ３２〜Ｈ４３０）、Ｄ４−Ｄ５ドメイン変異体（Ｐ１９７〜Ｈ４３０）、およびＤ５ドメイン変異体（Ｈ２８４〜Ｈ４３０）と結合するが、Ｄ１−Ｄ３ドメイン変異体（Ｃ３２〜Ｌ１９６）とは結合しないことが明らかになった。
ＴｒｋＢ−ＥＣＤ内、ほとんどはＤ４−Ｄ５−ＪＭドメイン内の約８０の単一点アラニン突然変異体を用いた１Ｇ１１の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として８つのアミノ酸が同定され、最も重要なものを最初に示すと、Ｆ２９１、Ｅ２９３＞Ｋ３７２、Ｅ２１０、Ｔ２８８、Ｄ３７０＞Ｆ２８５、Ｔ２９０となる。Ｄ４ドメインあるＥ２１０を除き、総ての残基がＴｒｋＢのＤ５ドメインに由来する。
ＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメイン（配列番号３７）と複合体を形成した１Ｇ１１キメラＦａｂ１［１Ｇ１１由来可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域の融合物］（配列番号３８および３９）の２．３Å分解能での共結晶構造により、ＩＧ１１に密接に接近するＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメイン上の１４残基が明らかとなった（距離カットオフ４．５Åを使用）。これら同定された１４残基は、アラニンスキャニング分析によっても同定されたもの（Ｔ２８８、Ｆ２９１、Ｋ３７２、Ｅ２９３）、ならびにＸ線結晶学によってのみ同定された近接する他のアミノ酸残基（Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｌ２９２、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｑ３７３、Ｉ３７４、Ｓ３７５）を含んだ。２．３Å分解能で距離カットオフ３．５Åを用い、７残基（２９０、２９３、２９４、３７２、３７３、３７４、３７５）が同定された。
このエピトープに関与する相互作用を、ＣＣＧ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）ＭＯＥ ｖ２０１５．１００１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ）を用いて定義した。ＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメイン上の、１Ｇ１１キメラＦａｂ１の７Å以内のタンパク質残基を選択し、次いで、「リガンド相互作用」ツールをデフォルトパラメーターともに使用して、これらの残基と相互作用すると思われる相互作用分子から水分子または残基を同定した。このツールがタンパク質残基よりもむしろ小分子リガンドの相互作用を定義するように設計されているために、選択された各残基の「リガンド相互作用」が個々に計算されたことに留意されたい。ＭＯＥにより定義された相互作用は、鎖内相互作用を削除するよう、また、２鎖間で架橋を形成したものとは別の、総ての水の相互作用を削除するようにエクセルで編集された。残った相互作用残基は次の通りである：
・１Ｇ１１キメラＦａｂ１残基との直接的相互作用
Ｔｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５
・１Ｇ１１キメラＦａｂ１残基との直接的相互作用、および水を介した間接的相互作用
Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３
・水を介した間接的相互作用のみ
Ｇｌｕ３４１
共結晶構造の分析とアラニンスキャン突然変異誘発は互いに補完および補強し合い、ＴｒｋＢアゴニストと相互作用するかまたは構造的相互作用を介して間接的に結合に影響を及ぼす、ＴｒｋＢのＤ５−ＪＭドメイン内の残基を同定する。
アラニンスキャニングデータおよびＸ線データを用い、最低でもＫ３７２とＥ２９３は１Ｇ１１が結合するＴｒｋＢエピトープの一部であると見られる。このデータを表５にまとめる。
Ｅ２９３は、Ｄ５ βシートＡとＡ’の間に位置し；Ｋ３７２は、Ｄ５ βシートＧ内に位置する。残基Ｔ２８８およびＴ２９１（アラニンスキャニングおよび近接分析により同定）は、Ｄ５ βシートＡ内に位置する。
アラニンスキャニングによって同定された残基を図４Ａに示し、共結晶Ｘ線結晶学的近接分析によって同定された残基を図４Ｂに示す。図４では、ＴｒｋＢ Ｄ５と結合した１Ｇ１１ Ｆａｂの共結晶構造からのＤ５ ＴｒｋＢドメインを、ＮＴ−４ホモダイマーと結合したヒトＴｒｋＢドメインＤ５の公開されている共結晶構造からの同じＴｒｋＢドメインと重ね合わせて、１Ｇ１１ Ｆａｂに関して、リガンドに対するＴｒｋＢの結合を配向させた。次に、ヒトＢＤＮＦ／ＮＴ−４ヘテロダイマー由来のＢＤＮＦ鎖を重ね合わせて、ＢＤＮＦ上のＴｒｋＢの潜在的結合部位を示した。ＮＴ−４ホモダイマーと結合したヒトＴｒｋＢドメインＤ５の公開されている共結晶構造からのＴｒｋＢ Ｄ５のＣ末端は、公開されている／利用可能な結晶構造データが無いため、この欠落領域の潜在的長さを示すために、膜近接（ＪＭ）領域をつないで膜貫通領域まで、β−ストランド形状を用いて延伸させた。この構造はリボン表示形式を用いて示し、潜在的ＴｒｋＢエピトープとして示される残基については、これらの構造上に原子を示した。
図４Ａおよび４Ｂから、１Ｇ１１のエピトープは、ＴｒｋＢ Ｄ５ドメイン上に、ＢＤＮＦ／ＮＴ４「保存パッチ」リガンド結合部位（ＡＢ、Ｃ’ＤおよびＥＦ βシート間のループとＤ５ドメインのＣ末端）に近接し、かつ、ＢＤＮＦ／ＮＴ４「特異性パッチ」リガンド結合部位（ＡＢＥＤ βシートの外面）の近位に位置することが見て取れる。より詳しくは、ＴｒｋＢドメイン５上の１Ｇ１１エピトープは、Ｄ５ βシートＡ、Ｄ５ βシートＡとＡ’の間の領域、およびＤ５ βシートＧに沿って、特異性パッチのＡＢＥＤ βシートの外面近位にあると見られる。ＴｒｋＢ上の１Ｇ１１エピトープはＢＤＮＦ／ＮＴ４リガンド結合部位と直接重複することはないという事実から、おそらくは、１Ｇ１１がＴｒｋＢと結合し、かつ、ＴｒｋＢがＢＤＮＦ／ＮＴ−４と結合して、三元複合体「ＴｒｋＢアゴニスト＋ＴｒｋＢ＋リガンド」を形成することが見込まれる。
１Ｇ１１、ＴｒｋＢ、ＢＤＮＦ／ＮＴ−４成分の重ね合わせのさらなる分析は、ＮＴ−４／ＢＤＮＦのＮ末端がＴｒｋＢと１Ｇ１１ Ｆａｂの重鎖の間の空間に突出していることを示す（図５参照）。この重ね合わせに分子表面を加えると、Ｖκ ＣＤＲ Ｌ１とＬ３、およびＣＤＲＨ３がＴｒｋＢと密接に相互作用し、ＴｒｋＢとＣＤＲ Ｈ１およびＨ２の間に、ＢＤＮＦのＮ末端に適合している可能性が想定され得る溝が存在することが示される（図６参照）。よって、ＢＤＮＦの存在下でのＴｒｋＢに対する１Ｇ１１の結合はまた、ＢＤＮＦのＮ末端への結合も含む可能性があり、この結合がおそらく三元複合体を安定化させてＢＤＮＦの機能的応答の増強に至る。従って、ＴｒｋＢに加えて１Ｇ１１も、リガンド（ＢＤＮＦ／ＮＴ−４）のＮ末端と相互作用し得る可能性がある。あるいは、１Ｇ１１は、リガンド結合部位においてではなくそれと近接して結合することにより、ＴｒｋＢとリガンドの間の相互作用を安定化させる可能性もある。
パラトープに関与する残基は、近接分析（距離カットオフ４．５Åを使用）による共結晶構造の分析により、また、ＣＣＧ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）ＭＯＥ ｖ２０１５．１００１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ）を用いてエピトープと相互作用する残基を定義することにより同定した。パラトープ内の主要結合残基は、ＣＤＲ Ｌ１（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
Ｌ３（太字の残基はエピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
およびＨ３（太字の残基はエピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＨ２内でエピトープの４．５Å以内に接近する残基は２つだけであり、直接的相互作用するものは１つだけである（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＨ１内でエピトープに接近するまたは（間接的に）接触するのは唯一、一残基だけであり（太字の残基は、エピトープの４．５Åに接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
ＣＤＲＬ２でエピトープに接近するのは一残基である（太字の残基は、エピトープの４．５Å以内に接近するものを表し、下線の残基は、直接または間接的に（水を介して）エピトープと相互作用するものを表す：
よって、順位付けの観点から、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ３およびＨ３は結合に最も重要であり、次いで、ＣＤＲＨ２、次いで、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＨ１である。
２．３ ３Ａ３のエピトープ
ＴｒｋＢ−ＥＣＤ内、ほとんどはＤ４−Ｄ５−ＪＭドメイン内の約８０の単一点アラニン突然変異体を用いた３Ａ３の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として９つのアミノ酸が同定された（Ｅ３９８、Ｙ３９７、Ｄ３９９、Ｙ４００＞Ｄ３９４、Ｉ３９６＞Ｖ３９５、Ｎ３８９、Ｔ４０２）。このデータを表５にまとめる。これらの残基は総て、ＴｒｋＢのＤ５ドメインのＣ末端で、膜貫通領域のＮ末端であるＪＭ領域にある（図７参照−ＪＭ残基はβ−ストランド形状を用いて延伸した）。この膜近接（ＪＭ）領域は、結晶構造が存在しなければ、長いフレキシブルリンカー領域であると仮定される。このＪＭ領域もリガンドとの結合に重要であり得ると思われる。
３Ａ３が結合するＴｒｋＢエピトープは１Ｇ１１のエピトープとは異なると思われるが、３Ａ３はＴｒｋＢとの結合に関して１Ｇ１１（および８Ｅ５）と競合し、従って、これらのエピトープは何らかの形で重複し得る（上記の実施例１．６参照）か、またはＪＭもしくはＤ５ドメインとの結合が他の抗体の結合エピトープを変化させてコンフォメーション変化をもたらし得ることに着目することが重要である。膜近接（ＪＭ）領域の長いフレキシブルリンカーはＤ５ βシートＡ、ＢおよびＧに実際に近接している可能性がある。
３Ａ３はまた、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強を示す（上記実施例１．７参照）。従って、３Ａ３がＴｒｋＢと結合すると、それもＢＤＮＦ／ＮＴ−４と何らかの付加的相互作用を持ち（例えば、リガンドのＮ末端を介する）、かつ／または同様受容体とリガンドの複合体を安定化させる可能性がある。
興味深いことに、この試験により、膜近接領域内の残基Ｄ３９４、Ｉ３９６、およびＹ４００は、これらの残基がラットＴｒｋＢと異なり（それぞれＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ）、かつ３Ａ３はラットＴｒｋＢを活性化しないことから、ヒトＴｒｋＢ受容体に特異性を付与することが明らかになった。
２．４ ８Ｅ５のエピトープ
８Ｅ５の結合エピトープを決定する目的で、アラニンスキャン突然変異誘発研究も結晶学的研究も行われなかった。しかしながら、８Ｅ５はＴｒｋＢとの結合に関して１Ｇ１１（および３Ａ３）と競合し、従って、これらのエピトープは何らかの形で重複し（上記の実施例１．６参照）か、またはＪＭもしくはＤ５ドメインとの結合が他の抗体の結合エピトープを変化させてコンフォメーション変化をもたらし得ることに着目することが重要である。８Ｅ５はまた、ＢＤＮＦにより誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強も示す（上記実施例１．７参照）。８Ｅ５は３Ａ３と同様にヒトＴｒｋＢ特異的であると事実は、このエピトープも３Ａ３と同様に、おそらく、その配列が齧歯類とヒトの間で異なるＪＭ領域内にあることを暗示している（表５参照）。
２．５ ５Ｄ１１のエピトープ
ＴｒｋＢ−ＥＣＤ内、ほとんどはＤ４−Ｄ５−ＪＭドメイン内の約８０の単一点アラニン突然変異体を用いた５Ｄ１１の表面プラズモン共鳴結合分析では、程度は様々であるが、結合に重要な残基として６つのアミノ酸が同定された（Ｎ３５０＞Ｈ２９９、Ｄ３４９＞Ｈ３００、Ｋ３２８、Ｋ３３３）。このデータを表５にまとめる。図８は、５Ｄ１１のエピトープはリガンド結合部位（Ｄ５ドメインのＡＢ、Ｃ’ＤおよびＥＦ βシート間のループ；およびＤ βシート）にあることを示す。これは、ＴｒｋＢリン酸化アッセイで測定した場合に５Ｄ１１がＢＤＮＦと競合するという事実と完全に一致する。
２．６ 増強抗体
実施例１および２からの結果に基づけば、（ｉ）ＴｒｋＢのＢＤＮＦ結合部位に近接し、特に、リガンドのＮ末端と結合する特異性パッチの近位にあるＴｒｋＢエピトープと結合し、かつ、ＢＤＮＦ／ＮＴ−４の存在下で増強または安定化されるＴｒｋＢとの結合を可能とするＴｒｋＢアゴニスト：すなわち、ＴｒｋＢ−ＢＤＮＦ増強剤；（ｉｉ）リガンド結合部位内にまたはそれに近接して結合し、かつ、受容体とリガンドの間の相互作用を不安定にするＴｒｋＢアゴニスト：すなわち、ＢＤＮＦ競合物；および（ｉｉｉ）ＢＤＮＦ結合部位から離れたエピトープに結合するＴｒｋＢアゴニスト、すなわち、増強機能を持たない単純なアゴニストが存在する。
１Ｇ１１、３Ａ３および８Ｅ５は、ＢＤＮＦと競合せず、２つのエピトープと結合すると思われる（８Ｅ５エピトープは未判定）増強剤の例である。これらのエピトープへの結合はＢＤＮＦの存在下でＴｒｋＢ受容体を活性なコンフォメーションで安定化させ、また、（ａ）抗体により活性化されるＴｒｋＢの利用可能な細胞表面レベルを上昇させ；かつ／または（ｂ）活性化されたＴｒｋＢ受容体のエンドサイトーシスおよび分解を阻害する可能性がある。
ＴｒｋＢのＥＣＤの可溶性末端切断型（ＴｒｋＢ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０ ＥＣＤ−６Ｈ）と３Ａ３または１Ｇ１１またはＢＮＤＦの二元複合体の形成を評価するためにＳＥＣ−ＭＡＬＳを行った。総ての場合で、二元複合体の存在が検出できた。また、ＴｒｋＢのこの構築物とＢＤＮＦおよび３Ａ３の間、および／またはＴｒｋＢ、ＢＤＮＦおよび１Ｇ１１の間で三元複合体が形成されたかどうかを評価するためにもＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用した。ＴｒｋＢ、ＢＤＮＦおよび３Ａ３試験は、三元複合体の存在の明らかな証拠を示さなかった。この試験では二元複合体も三元複合体も検出できず、複雑な溶液挙動およびＳＥＣ−ＭＡＬＳによっては可視化できないより高次の種の形成が示唆される。ＴｒｋＢ、ＢＤＮＦおよび１Ｇ１１試験からのデータもまた、単純な二元より高次の複合体の形成を示唆した。この場合、これらの、単純な二元より大きい種のいくつかが検出できた。しかしながら、これらの高分子量種の成分は正確に決定できなかった。従って、両抗体による増強は三元複合体の形成から生じ得るという可能性が残っている。
２．６ 水素重水素交換
数種の他の潜在的タンパク質パートナーの存在下または不在下での、ｈｉｓタグを有するＤ５−ＪＭ ＴｒｋＢの交換比をモニタリングするためにＨＤＸ−ＭＳを使用した。以下のタンパク質溶液は、個々の成分を、５０ｍＭリン酸Ｎａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０の非重水素化Ｈ２Ｏバッファーを希釈することにより調製した。
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）；１Ｇ１１ ｍＡｂ（４０μＭ；総てのＴｒｋＢが二元複合体で存在することを保証するため）
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）；３Ａ３ ｍＡｂ（４０μＭ総てのＴｒｋＢが二元複合体で存在することを保証するため）
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）；ＢＤＮＦ（４０μＭ；総てのＴｒｋＢが二元複合体で存在することを保証するため）
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）；１Ｇ１１ ｍＡｂ（２０μＭ）；ＢＤＮＦ（２０μＭ）
・ＴｒｋＢ＿ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧ＿Ｈ２８４−Ｈ４３０（Ｄ５−ＪＭ）−５Ｈｉｓ（２０μＭ）；３Ａ３ ｍＡｂ（２０μＭ）；ＢＤＮＦ（２０μＭ）
ＨＤＸ標識反応は、標準ＨＤＸ法を用い、周囲温度にて、非重水素化バッファーから重水素化バッファー（Ｄ２Ｏ中、５０ｍＭリン酸Ｎａ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）へ２０倍希釈で行った。交換サンプル（１〜３反復）を４時点：０秒（すなわち、非重水素化バッファーへの希釈時）、１５秒；６０秒および３００秒に採取した。これらのサンプルを、予冷した低ｐＨの変性急冷バッファー（４００ｍＭリン酸ナトリウム、８ＭグアニジンＨＣｌ、５００ｍＭ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、ｐＨ２．２）を用い、４℃で急冷した。
これらの変性急冷サンプルを固定化ペプシン消化カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｅｎｚｙｍａｔｅ ＢＥＨ、２．１ｍｍ×３０ｍｍ、Ｐａｒｔ ｎｏ：１８６００７２３３）に、２４０秒の消化時間、カラム流速１００μｌ／分、および０．２％ギ酸水溶液の消化バッファーを用い、１５℃で注入した。遊離したペプチドを０℃にて、１．０×１００ｍｍ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｐａｒｔ ｎｏ １８６００２３４６）を一般に１５分の流動時間、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／ギ酸（９９．８：０．２ｖ／ｖ）および移動相Ｂ：ＡＣＮ／ギ酸（９９．８：０．２ｖ／ｖ）とともに流速４０μｌ／分で用いるＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムでのＵＰＬＣ−ＭＳにより分析した。
非重水素化タンパク質のタンパク質分解により生成されたペプチドを、対象とするタンパク質配列のみを含むデータベースに対して、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘＧｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ(http://www.waters.com/waters/en_GB/ProteinLynx-Global-SERVER %28PLGS%29/nav.htm?cid=513821&locale=en_GB)、またはＭａｓｃｏｔ検索エンジンを用いて同定した。各時点および状態に対する重水素組み込みを、ＤｙｎａｍＸ分析ソフトウエアｖ３．０（またはＨＤ Ｅｘａｍｉｎｅｒ）を用い、ＰＬＧＳからインポートした非重水素化ペプチドリストを重水素化サンプルに関して取得したデータと比較することにより計算した１。
各ペプチドの重水素化データを手作業により評価し、質の悪いデータを与える電荷状態またはペプチドを分析から除いた。
結果
１Ｇ１１の存在下のＴｒｋＢは、ＴｒｋＢペプチドに見られる重水素交換速度の特性に有意な変化を示した。画分の重水素化合物更新の違いのプロット（図９）は、ＴｒｋＢペプチド領域２８４〜２９１に強い重水素化保護を示す。これは検討した総ての時点にわたって強い保護を維持し、この領域がＴｒｋＢと１Ｇ１１との相互作用におそらく重要であることを示唆する。より微妙な交換保護がＴｒｋＢの中央領域およそ３１６〜３８０に見られ、ここにおける付加的残基がこの相互作用に役割を果たし得ることを示唆する。
３Ａ３の存在下のＴｒｋＢは、ＴｒｋＢペプチドに見られる重水素交換速度の特性に有意な変化を示したが、１５秒と６０秒の最も初期の交換時点のみであった。画分の重水素化更新の違いのプロット（図１０）は、領域３８５〜３９８を含むＴｒｋＢペプチドに最も強い重水素化保護を示す。しかしながら、この保護は３００秒の交換時点では失われる。ＴｒｋＢに関するこの領域の極めて急速な重水素化と考え合わせると、このデータは、この領域が溶媒に曝されている可能性があり、急速に重水素化され、３Ａ３との相互作用を介した重水素化からの保護は不完全であり、その速度は緩徐化されるものの、このより緩慢な速度であっても３００秒以内に飽和重水素化に到達することを可能とすることを示唆する。
ＴｒｋＢ単独；ＴｒｋＢ−３Ａ３ ｍＡｂ；ＢＤＮＦの存在下のＴｒｋＢ−１Ｇ１１ ｍＡｂ。ＴｒｋＢ単独またはＴｒｋＢ−ｍＡｂ複合体のいずれかへのＢＤＮＦの添加は、ＴｒｋＢの重水素化にロバストな変化を与えず、従って、ＴｒｋＢ−ｍＡｂ−ＢＤＮＦ三元複合体の存在または不在のいずれも示すことができなかった。
３．ヒト化１Ｇ１１、３Ａ３、５Ｄ１１
３．１ ヒト化
１Ｇ１１、３Ａ３および５Ｄ１１をヒト化した。これらの配列は次の通りである。
ヒト化１Ｇ１１重鎖可変（ＶＨ）領域−配列番号４０；軽鎖可変（ＶＬ）領域−配列番号４１；重鎖（ＨＣ）−配列番号４２；軽鎖（ＬＣ）−配列番号４３；ＨＣをコードするＤＮＡ−配列番号４４；ＬＣをコードするＤＮＡ−配列番号４５。
ヒト化３Ａ３重鎖可変（ＶＨ）領域−配列番号４６；軽鎖可変（ＶＬ）領域−配列番号４７；重鎖（ＨＣ）−配列番号４８；軽鎖（ＬＣ）−配列番号４９；ＨＣをコードするＤＮＡ−配列番号５０；ＬＣをコードするＤＮＡ−配列番号５１。
ヒト化５Ｄ１１重鎖可変（ＶＨ）領域−配列番号５２；軽鎖可変（ＶＬ）領域−配列番号５３；重鎖（ＨＣ）−配列番号５４；軽鎖（ＬＣ）−配列番号５５；ＨＣをコードするＤＮＡ−配列番号５６；ＬＣをコードするＤＮＡ−配列番号５７。
重鎖および軽鎖のマウスＣＤＲを、当技術分野で標準的な手順：ヒトＶ遺伝子生殖細胞系データベースに対するＣＤＲマスク可変（Ｖ）領域配列の検索、配列類似性に基づいて選択されたＶおよびＪ遺伝子鋳型配列を用い、好適なヒトフレームワーク配列にグラフトした。潜在的な復帰突然変異をヒトとマウス間の比較に基づいて同定した。
１Ｇ１１の重鎖のマウスＣＤＲをＩＧＨＶ１＿６９重鎖フレームワークにグラフトし、３つのヒト化重鎖変異体を作出した：１つはＣＤＲの線形グラフトであるもの（Ｈ０）、第２の変異体はｋａｂａｔ４７番に復帰突然変異を組み込んだもの（Ｗ４７Ｃ）（Ｈ４）、および第３の変異体は４７番にセリン残基を組み込んだもの（Ｗ４７Ｓ）（Ｈ７）。
１Ｇ１１の軽鎖のマウスＣＤＲをＩＧＫＶ３＿１１ヒトフレームワークにグラフトし（Ｌｏ１）、また、Ｋａｂａｔ４９番のチロシンのリシンへの単一の復帰突然変異（Ｙ４９Ｋ）を有するＩＧＫＶ３Ｄ−１５ヒトフレームワークにグラフトした（Ｌｎ１）。
１Ｇ１１のヒト化変異体を作出し、ＴｒｋＢ−ＥＣＤとの結合に関して、また種々の機能アッセイで試験した。Ｌｎ１変異体は、Ｌｏ１変異体に比べて結合に有意な違いを示さなかった。
しかしながら、ＣＤＲＨ２の直前である重鎖のＫａｂａｔ４７番にヒトフレームワーク残基トリプトファン（Ｗ４７）を有する変異体は、ＴｒｋＢの結合の有意な低下を示した。重鎖のＫａｂａｔ４７番のトリプトファンはヒト抗体で１００％保存されており、重鎖−軽鎖境界にある。Ｗ４７Ｃ／Ｓ復帰突然変異が導入されると、ＴｒｋＢに対する結合が回復した。システインおよびセリンは類似の大きさのアミノ酸であり、両突然変異とも、マウス親１Ｇ１１のものに類似するヒト化１Ｇ１１の結合および機能的特性を保持していた。従って、重鎖の４７番における類似の大きさの他のアミノ酸も結合および機能を保持すると予想される。例えば、他の可能性のある置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎが含まれる。また、重鎖の４７番にトリプトファンが維持されていれば、重鎖−軽鎖境界構造を回復させる、従ってＴｒｋＢに対する結合を回復させる他のフレームワーク変化も存在し得ると予想される。
ヒト化１Ｇ１１は、重鎖可変鎖のＫａｂａｔ４７番にセリン突然変異が組み込まれた、ヒトフレームワークへの１Ｇ１１ ＣＤＲの線形グラフト（Ｈ７、Ｌｏ１）である。
ヒト化１Ｇ１１は、突然変異Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリング）で修飾されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のこの修飾はＦｃγ受容体およびＣ１ｑへのｍＡｂの結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によりＴｒｋＢ陽性細胞の枯渇を誘導するｍＡｂの能力を低下させる。これは一般にＦｃ無効化と記載される。
ヒト化１Ｇ１１を、Ｃ１ｑおよび種々のヒトおよびカニクイザルＦｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＦｃγＲ Ｉ、ＦｃγＲ ＩＩａＨ、ＦｃγＲ ＩＩａＲ、ＦｃγＲ ＩＩｂ、ＦｃγＲ ＩＩＩａＶおよびＦｃγＲ ＩＩＩａＦ）とのその結合能に関して表面プラズモン共鳴により評価した。これらの結果は、予想されたように、重鎖におけるＦｃを無効化するＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異の導入はＦｃＲｎに対するヒト化１Ｇ１１の結合には影響を及ぼさなかったが、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲ Ｉ、ＦｃγＲ ＩＩａＨ、ＦｃγＲ ＩＩａＲ、ＦｃγＲ ＩＩｂ、ＦｃγＲ ＩＩＩａＶおよびＦｃγＲ ＩＩＩａＦに対する結合を低下させたことを示した。
ヒト化１Ｇ１１はＦｃが無効化されているが、マウス１Ｇ１１はされていないことに留意されたい。Ｆｃエフェクター機能は、このＴｒｋＢアゴニストの生物学的機能には重要ではない。
３．２ ヒト化抗体の特性
ＴｒｋＢに対する抗体の結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴、ならびにＴｒｋＢリン酸化アッセイを含むいくつかのアッセイで、ヒト化１Ｇ１１をマウス１Ｇ１１と比較した。これらのアッセイにおいて、ヒト化１Ｇ１１は１Ｇ１１に匹敵し、ヒト化の成功が確認される。ヒト化１Ｇ１１は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、１：１結合様式で、それぞれ約５５ｎＭおよび約６０ｎＭの親和性で組換えヒトおよびカニクイザルＴｒｋＢ−ＥＣＤと結合した。ヒト化１Ｇ１１は、ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定に過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、リン酸化ＴｒｋＢのレベルにより測定した場合、ＥＣ５０ ０．６５±０．１４ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）でヒトＴｒｋＢ受容体を活性化した。ヒト化１Ｇ１１はヒトＴｒｋＢ受容体を選択的に活性化したが、ヒトＴｒｋＡまたはＴｒｋＣ受容体を選択的に活性化することはなく、また、齧歯類（マウス、ラット）、カニクイザルおよびヒトＴｒｋＢ受容体と交差反応し、これらを活性化する。
ヒト化１Ｇ１１はＢＤＮＦと競合せず；かつ、それはＣＨＯ−Ｋ１細胞において、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０ ０．６５±０．１４ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）で活性化し；飽和濃度のＢＤＮＦの存在下で、増強特性を保持し（ＢＤＮＦに対して約１２０％）、すなわち、ＴｒｋＢ活性化のレベルを上昇させた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト化１Ｇ１１は、ヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞において、濃度依存的に、平均ＥＣ５０ ０．００７±０．００３ｎＭ（平均±Ｓ．Ｄ．；１Ｇ１１＝０．０２５±０．０１ｎＭ）で、ＴｒｋＢにより媒介される細胞生存を増進した。同じヒト全長ＴｒｋＢ受容体を安定発現するラットＰＣ１２神経芽腫細胞において、ヒト化１Ｇ１１は、濃度依存的に、平均ＥＣ５０ ０．０７±０．０２ｎＭ（平均±Ｓ．Ｄ．；１Ｇ１１＝０．１９±０．０６ｎＭ）で、ＴｒｋＢにより媒介される神経突起成長を増進した。
４．ｉｎ ｖｉｖｏ効果
ニューロン生存のＳＲＡラットモデル
ニューロン生存に対する１Ｇ１１のｉｎ ｖｉｖｏ効果を、引き抜き（一側性）により誘発される脊髄運動ニューロン変性のラットモデルで評価した。簡単に述べれば、若年成体スプラーグ・ドーリー(sprague-dawley)ラットにおいて手術により第４腰髄節（Ｌ４）から前根を引き抜き、１週間回復させた後、静脈内に（単回ボーラスとして）またはくも膜下腔内（持続的）に１Ｇ１１による介入を行った。持続的くも膜下腔内注入の場合、カテーテルをくも膜下腔に、Ｌ４−Ｌ５間の椎間孔を通して挿入し、他端を首の背部の比較に埋め込んだａｌｚｅｔ ２００２ミニ浸透圧ポンプに接続した。抗体介入まで、ビヒクル処方物をそのポンプにロードし、０．５μｌ／時の速度で送達した。
２種類の異なる用量の１Ｇ１１（６０μｇまたは２４０μｇ／日）またはＢＤＮＦ（陽性対照；１２μｇ／日）の連続くも膜下腔内注入は、ラットＳＲＡモデルにおいて２週間、ビヒクル処置群に比べて、明瞭な用量依存的応答なく、同程度にＣｈＡＴ発現ニューロン（抗ＣｈＡＴ抗体で染色）の生存を増進した（すなわち、反対側と比較）が、ビヒクル処方物（陰性対照）はそうではなかった。神経根引き抜き１週間後の１Ｇ１１（０．０３、０．１、０．３、１、３、３０ｍｇ／ｋｇ）またはＢＤＮＦ（陽性対照；１２μｇ／日）の静脈内投与は、ＣｈＡＴ染色により可視化した場合に、脊髄ニューロン生存の暴露依存的増進を示したが、アイソタイプ対照（ＩｇＧ１、３ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル処方物（陰性対照）はそうではなかった。１Ｇ１１は、１、３、および３０ｍｇ／ｋｇ（≦０．３ｍｇ／ｋｇでは無視できる効果であった）で種々の程度までＣｈＡＴ＋ニューロンを救済することができた。
まとめると、１Ｇ１１は、単回のボーラス静脈内尾静脈注射としてまたは連続的くも膜下腔内注入により投与した場合、一側性の（Ｌ４前根）引き抜きラットにおいて損傷７日後に脊髄ＣｈＡＴ＋ニューロンの生存を増進した。
歩行機能（ｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ マウス）
ニューロン生存（上記の通り）に対する１Ｇ１１の効果に加え、１Ｇ１１の機能的効果をコンジェニックＢ６Ｃｇ−Ｔｇ（ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスにおいて検討した。ｈＳＯＤ１ Ｔｇマウスは、疾患が発症および進行すると、種々の歩行パラメーターに減損を示す。ビヒクル処方物（陰性対照）はそうではなかったが、１Ｇ１１（０．３ｍｇ／ｋｇ）は、雌のコホート（約３．５か月齢）において、２８日間２週間毎に（介入期間中２回）尾静脈ボーラス注射により投与した場合に、ｈＳＯＤ１−ビヒクル対照に比べてｈＳＯＤ１マウスで種々の程度まで歩行特徴を有意に改善し、走行速度、歩調（歩／秒）、歩行周期時間、および立脚時間は野生型同腹子のものにほぼ匹敵し；歩調に対する効果は比較的大きくなく；揺動速度に対する効果はずっと低かった。これらの結果は、１Ｇ１１は、静脈内に投与した場合、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおける歩行欠陥を改善することができたことを示す。
歩行および神経学的スコアに対する１Ｇ１１の効果をさらに評価するために、マウス（雄および雌、試験の開始時におよそ３．５か月齢、各群各性につき少なくとも１６個体のマウス）に表６に従って投与を行った。この試験は無作為化、プラセボおよびアイソタイプ対照、二重盲検様式で行った。
８時点：９７日目（ベースライン）、９９日目（第１用量の１日後）、１１１日目（第１用量の１３日後）、１１３日目（第２用量の１日後）、１２５日目（第２用量の１３日後）、１３９日目（第３用量の１３日後）、１４６日目（第４用量の７日後）および１５３日目（第４用量の１３日後）に、齧歯類ＣａｔＷａｌｋ Ｓｙｓｔｅｍを用いて動物に歩行分析を行った。６種の歩行パラメーター（走行速度、歩長、立脚時間、歩行周期時間、歩調および揺動時間）を分析のために選択した。結果は、１Ｇ１１が両性に対して、特に１２５日目および１３９日目に、ＩｇＧ１アイソタイプ対照に比べてｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおいて歩行特徴を有意に改善したことを示した。平均して、低用量群に比べて高用量群で歩行特徴により良好な改善があった。
神経学的スコアは、全試験期間を通じて総てのｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ動物についてモニタリングした。ログランク検定は、１ｇＧ１アイソタイプ対照に比べて、１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇ両方の１Ｇ１１が雌マウスについては死亡までの中央時間を著しく引き延ばしたことを示した。雄マウスでは、０．３ｍｇ／ｋｇのｈＳＯＤ１−１Ｇ１１群は死亡までの中央時間を著しく引き延ばしたが、１ｍｇ／ｋｇのｈＳＯＤ１−１Ｇ１１群はＩｇＧ１アイソタイプ対照に比べて改善をあまり示さなかった。ウィルコクソン検定は、雌マウスに関して、１ｍｇ／ｋｇ １Ｇ１１はＩｇＧ１アイソタイプ対照に比べて振戦発生までの中央時間を著しく引き延ばしたが、０．３ｍｇ／ｋｇ １Ｇ１１はそうではなかったことを示した。雄マウスでは、１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇの両方の１Ｇ１１が、ＩｇＧ１アイソタイプ対照に比べて振戦発生までの中央時間をわずかに引き延ばした。
まとめると、これらの結果は、１Ｇ１１は、静脈内投与した場合、両性のｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの歩行欠陥を改善でき、両性の振戦発生を遅延させ、ｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの雌においてのみ、全「生存期間」を改善できたことを示す。
運動ニューロンの生存（ｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ マウス）
脊髄ＣｈＡＴ陽性ニューロンに対する１Ｇ１１の効果を評価するために、雄マウス（試験の開始時におよそ５０日齢、各群１２個体のマウス）に表７に従って投与を行った。試験は無作為化、プラセボ・アイソタイプ対照、二重盲検様式で行った。
投与期間の終了時に、マウスをイソフルランで深麻酔した。血液を排出するためにマウスに氷冷０．９％生理食塩水（１２０ｍＬ）、次いで、６０ｍＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に潅流した。脊髄を採取し、４℃にて４％ＰＦＡ中で２４時間後固定した。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の免疫組織化学法（ＩＨＣ）は、ＩＨＣオートステイナー（Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡにて行った。全スライド像をＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＸＴ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）により取り込んだ。
腰髄のＬ３−Ｌ５のＣｈＡＴ陽性細胞を定量し、分析した。ニューロンを正確に計数するために、ヘマトキシリンチャネルをＤＡＢ（ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ、バージョン１１、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）から分離し、次に、細胞定量のために腹側脊髄全体を包含するＤＡＢ単独像（１０倍）を取得した。ＣｈＡＴ陽性ＭＮニューロンは、盲検様式で独立した観察者により手作業で計数された。バイアスの消去および一貫性の確保のために、画像の定量化は、別の独立した検査者により無作為に質が確認された。
ＣｈＡＴ免疫染色による腰髄（Ｌ３−Ｌ５）分析は、ビヒクル処置野生型マウスに比べてビヒクル処置ｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスで、ＣｈＡＴ陽性運動ニューロンの有意性の高い減少を示した（３５％減、ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、野生型マウスに比べてｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの脊髄での、運動ニューロンの明らかな変性を示す。マウスＩｇＧ１（１７２．６±３１．１０）および１Ｇ１１処置群は、ビヒクルに対して統計的有意性を示さなかった（０．３ｍｇ／ｋｇ：１６９．１±１７．２５；１ｍｇ／ｋｇ：１６０．１±２８．１２）。
配列表
配列番号1 TrkB-ECD
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号2 TrkB全長配列
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
配列番号3 1G11およびヒト化1G11 CDR L1 (Kabat, Chochia, AbM)
RASQRISNNLH
配列番号4 1G11およびヒト化1G11 CDR L2 (Kabat, Chochia, AbM)
YVSQSIS
配列番号5 1G11およびヒト化1G11 CDR L3 (Kabat, Chochia, AbM)
QQSNSWPLT
配列番号6 1G11およびヒト化1G11 CDR H1 (Kabat)
SYYIN
配列番号7 1G11およびヒト化1G11 CDR H2 (Kabat)
RIAPGNTYYNEIFKG
配列番号8 1G11およびヒト化1G11 CDR H3 (Kabat, Chochia, AbM)
RGYEGALDY
配列番号9 3A3 CDR L1 (Kabat)
KSSQSLLYSGNQKNYLA
配列番号10 3A3 CDR L2 (Kabat)
WASTRES
配列番号11 3A3 CDR L3 (Kabat)
QQYYSYPYT
配列番号12 3A3 CDR H1 (Kabat)
SYWMH
配列番号13 3A3 CDR H2 (Kabat)
YINPSTGYTDYNQKFKD
配列番号14 3A3 CDR H3 (Kabat)
SRAARY
配列番号15 8E5 CDR L1 (Kabat)
RASSSVSSSYLH
配列番号16 8E5 CDR L2 (Kabat)
STSNLAS
配列番号17 8E5 CDR L3 (Kabat)
QQYSGYPLT
配列番号18 8E5 CDR H1 (Kabat)
TYGMS
配列番号19 8E5 CDR H2 (Kabat)
TVSTGGTYTYYPDSVKG
配列番号20 8E5 CDR H3 (Kabat)
GGYSFAY
配列番号21 5D11 CDR L1 (Kabat)
RASQSVSTSFYSYMH
配列番号22 5D11 CDR L2 (Kabat)
YASNLQS
配列番号23 5D11 CDR L3 (Kabat)
QHSWEIPWT
配列番号24 5D11 CDR H1 (Kabat)
NYLIE
配列番号25 5D11 CDR H2 (Kabat)
VINPGSGGTNYNDKFKG
配列番号26 5D11 CDR H3 (Kabat)
GGNDYGDY
配列番号27 1G11 HC
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号28 1G11 LC
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号29 3A3 HC
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTDYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSRAARYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号30 3A3 LC
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号31 8E5 HC
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWVRQTPDKGLEWVATVSTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGGYSFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号32 8E5 LC
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGVSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号33 5D11 HC
QVHLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNDKFKGKAILTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGGNDYGDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号34 5D11 LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVFIKYASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEDDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号35 D1-D3ドメイン欠失変異体C32-L196
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGL
配列番号36 D4-D5-JMドメイン欠失変異体P197-H430
PSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号37 D5ドメイン欠失変異体H284-H430
HFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
配列番号38 1G11キメラFab1 [1G11由来可変領域(VH)とヒトIgG1由来定常領域(CH1)の融合物]
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
配列番号39 1G11 キメラFab1 [1G11由来可変領域(VL)とヒトIgG1由来定常領域(CL1)の融合物]
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40 ヒト化1G11 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSS
配列番号41 ヒト化1G11 VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIK
配列番号42 ヒト化1G11 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号43 ヒト化1G11 LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号44 ヒト化1G11 HCをコードするDNA
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTACTACATCAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGAGCATGGGCAGGATCGCCCCCGGCAACACCTACTACAACGAGATCTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACTGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGGGGCTACGAGGGCGCCCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号45 ヒト化1G11 LCをコードするDNA
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACTCTGAGCCTGAGCCCAGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCAGGGCCTCCCAGAGGATCAGCAACAACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCAAATACGTGAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTCTAACAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号46 ヒト化3A3 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSS
配列番号47 ヒト化3A3 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
配列番号48 ヒト化3A3 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号49 ヒト化3A3 LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号50 ヒト化3A3 HCをコードするDNA
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCTCCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCACCGGCTACACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCAGGGCTGCCAGGTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号51 ヒト化3A3 LCをコードするDNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGTACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACTGGGCTAGCACAAGGGAGAGCGGCGTGCCTGATAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACTACTCCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号52 ヒト化5D11 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGTNYNDKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGNDYGDYWGQGTLVTVSS
配列番号53 ヒト化5D11 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWEIPWTFGQGTKLEIK
配列番号54 ヒト化5D11 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGTNYNDKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGNDYGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号55 ヒト化5D11 LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWEIPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号56 ヒト化5D11 HCをコードするDNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACCTGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGTGATCAATCCCGGCAGCGGCGGCACCAACTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACTGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGGCGGGAACGATTACGGCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号57ヒト化5D11 LCをコードするDNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATTAACTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCACCAGCTTCTACTCCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCAAATACGCCAGCAACCTCCAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCAGGCTCCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAGATCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号58 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (Chochia)
GYTFTSY
配列番号59 1G11およびヒト化1G11 CDRH2 (Chochia)
APGN
配列番号60 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (AbM)
GYTFTSYYIN
配列番号61 1G11およびヒト化1G11 CDRH2 (AbM)
RIAPGNTY
配列番号62 1G11およびヒト化1G11 CDRH1 (Contact)
TSYYIN
配列番号63 1G11 CDRH2 (Contact)
CIGRIAPGNTY
配列番号64 ヒト化1G11 CDRH2 (Contact)
SMGRIAPGNTY
配列番号65 1G11およびヒト化1G11 CDRH3 (Contact)
ARRGYEGALD
配列番号66 1G11およびヒト化1G11 CDRL1 (Contact)
SNNLHWY
配列番号67 1G11およびヒト化1G11 CDRL2 (Contact)
LLIKYVSQSI
配列番号68 1G11およびヒト化1G11 CDRL3 (Contact)
QQSNSWPL
配列番号69
DGANPNYPDVIYEDYGTAAN
配列番号70
NPNYPDVIYEDYGT
配列番号71
HFAPTITFLESP
配列番号72 283-291からのTRKB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
GHFAPTITF
配列番号73 284-291からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
HFAPTITF
配列番号74 292-316からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
LESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQ
配列番号75 316-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
QWFYNGAIL
配列番号76 317-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
WFYNGAIL
配列番号77 318-324からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
FYNGAIL
配列番号78 347-361からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
QLDNPTHMNNGDYTL
配列番号79 TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド from 349-358
DNPTHMNNGD
配列番号80 351-368からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
PTHMNNGDYTLIAKNEYG
配列番号81 363-378からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
AKNEYGKDEKQISAHF
配列番号82 377-395からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
HFMGWPGIDDGANPNYPDV
配列番号83 379-385からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGID
配列番号84 379-395からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDV
配列番号85 379-396からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDVI
配列番号86 379-397からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチ
MGWPGIDDGANPNYPDVIY
配列番号87 379-398からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
MGWPGIDDGANPNYPDVIYE
配列番号88 418-435からのTrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5Hisペプチド
PSTDVTDKTGREHHHHHH

Claims (55)

  1. ＢＤＮＦにより誘導されるおよび／またはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強する、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  2. 細胞表面のＴｒｋＢレベルを維持する、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  3. ＴｒｋＢのＤ５ドメインのβシートＡとＧ、およびβシートＡとＡ’の間の領域に含まれるエピトープと結合する、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  4. ａ）ヒトＴｒｋＢの以下の残基：Ｔｈｒ２９０、Ｇｌｕ２９３、Ｓｅｒ２９４、Ａｓｐ３５８、Ｓｅｒ３７５、Ｌｙｓ３７２、Ｇｌｎ３７３およびＧｌｕ３４１のうち１以上と相互作用するか；
    ｂ）Ｔ２８８、Ｉ２８９、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｌ２９２、Ｅ２９３、Ｓ２９４、Ｋ３０８、Ｄ３５８、Ｅ３７１、Ｋ３７２、Ｑ３７３、Ｉ３７４、およびＳ３７５からなる群から選択されるヒトＴｒｋＢ由来残基の４．５Å以内に接近するか；
    ｃ）Ｅ２１０、Ｆ２８５、Ｔ２８８、Ｔ２９０、Ｆ２９１、Ｅ２９３、Ｄ３７０およびＫ３７２（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか；
    ｄ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基２８４〜２９１（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じるか；または
    ｅ）配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
    ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  5. ＴｒｋＢの膜近接領域（Ｗ３８１−Ｈ４３０）内に含まれるエピトープと結合する、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  6. ａ）Ｎ３８９、Ｄ３９４、Ｖ３９５、Ｉ３９６、Ｙ３９７、Ｅ３９８、Ｄ３９９、Ｙ４００およびＴ４０２の群から選択される残基が変異したヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインと、突然変異を持たないヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに比べて変更された親和性で結合するか；
    ｂ）ヒトＴｒｋＢと結合し、かつ非複合体形成ヒトＴｒｋＢに由来する対応するペプチドに比べて重水素結合に対してより耐性のある、残基３８５〜３９８（全長ヒトＴｒｋＢに従ってナンバリング）由来配列の一部または全部を含有するヒトＴｒｋＢに由来するペプチドを生じるか；または
    ｃ）配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する、
    ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  7. ＴｒｋＢとの結合に関して（ａ）配列番号２７の重鎖配列と配列番号２８の軽鎖配列；または（ｂ）配列番号２９の重鎖配列と配列番号３０の軽鎖配列；または（ｃ）配列番号３１の重鎖配列と配列番号３２の軽鎖配列を有する参照抗体と競合する、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  8. （ａ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ１、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
    （ｂ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ３、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
    （ｃ）配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ３、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
    を含んでなる、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  9. （ａ）配列番号３内に存在するＣＤＲＬ１、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；
    （ｂ）配列番号５内に存在するＣＤＲＬ３、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体；および
    （ｃ）配列番号８内に存在するＣＤＲＨ３、または１、２もしくは３つのアミノ酸を有するその変異体
    を含んでなる、請求項８に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  10. ＣＤＲＬ１内の修飾は残基Ｒ２８、Ｓ３０およびＮ３２（配列番号２８からナンバリング）になく、ＣＤＲＬ３内の修飾は残基Ｎ９２およびＳ９３（配列番号２８からナンバリング）になく、かつＣＤＲＨ３内の修飾は残基Ｒ９７、Ｙ９９およびＥ１００（配列番号２７からナンバリング）にない、請求項８または請求項９に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  11. ＣＤＲＬ１内の修飾は残基Ｉ２９にない、請求項１０に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  12. ＣＤＲＬ１内の修飾は残基Ｎ３１にない、請求項１０に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  13. ＣＤＲＬ３内の修飾は残基Ｓ９１およびＷ９４にない、請求項１０に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  14. （ａ）配列番号３内に存在するＣＤＲＬ１；
    （ｂ）配列番号５内に存在するＣＤＲＬ３；および
    （ｃ）配列番号８内に存在するＣＤＲＨ３
    を含んでなる、請求項９に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  15. 配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ２もしくはその変異体、または配列番号４０内に存在するＣＤＲＨ２もしくはその変異体をさらに含んでなり、前記変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  16. ＣＤＲＨ２が配列番号７内に存在する、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、請求項１５に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  17. ＣＤＲＨ２内の修飾は残基Ｒ５０（配列番号２７からナンバリング）にない、請求項１５または請求項１６に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  18. ＣＤＲＨ２内の修飾は残基Ｙ５７（配列番号２７からナンバリング）にない、請求項１７に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  19. ＣＤＲＨ２が配列番号７内に存在する、請求項１６に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  20. （ａ）配列番号２８内に存在するＣＤＲＬ２、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体、および
    （ｂ）配列番号２７内に存在するＣＤＲＨ１、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体
    をさらに含んでなる、請求項８〜１９のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  21. （ａ）ＣＤＲＬ２が配列番号４内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体であり；かつ
    （ｂ）ＣＤＲＨ１が配列番号６内に存在するか、または１、２もしくは３つのアミノ酸修飾を有するその変異体である、
    請求項２０に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  22. ＣＤＲＬ２内の修飾は残基Ｙ５０（配列番号２８からナンバリング）になく、かつＣＤＲＨ１内の修飾は残基Ｙ３３（配列番号２７からナンバリング）にない、請求項２０または請求項２１に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  23. ＣＤＲＨ１内の修飾は残基Ｓ３１（配列番号２７からナンバリング）にない、請求項２０または請求項２１に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  24. （ａ）ＣＤＲＬ２が配列番号４内に存在し；かつ
    （ｂ）ＣＤＲＨ１が配列番号６内に存在する、
    請求項２１に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  25. 配列番号４０の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでなるＶＨ領域および／または配列番号４１の配列と少なくとも７６％同一の配列を含んでなるＶＬ領域を含んでなる、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  26. （ａ）配列番号４２と少なくとも９０％同一の重鎖（ＨＣ）配列；および／または
    （ｂ）配列番号４３と少なくとも８５％同一の軽鎖（ＬＣ）配列
    を含んでなる、ＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  27. 配列番号４０または配列番号４２に対応する４７番がＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎである、請求項２５または請求項２６に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  28. ＣＤＲ配列が請求項８〜２４のいずれか一項に定義される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  29. ＣＤＲ配列が請求項８〜２４にいずれか一項に定義され、かつ同一性の割合がＣＤＲを除く配列で計算される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  30. （ａ）配列番号４０のＶＨ領域；および／または
    （ｂ）配列番号４１のＶＬ領域
    を含んでなる、請求項２５に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  31. （ａ）配列番号４２の重鎖（ＨＣ）配列；および／または
    （ｂ）配列番号４３の軽鎖（ＬＣ）配列
    を含んでなる、請求項２６に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  32. ＴｒｋＢとの結合に関してＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４と競合しない、請求項２〜３１のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  33. アゴニストがＢＤＮＦにより誘導されるおよび／またはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用を増強する、請求項３〜３１のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  34. ＢＤＮＦにより誘導されるまたはＮＴ−４により誘導されるＴｒｋＢの促進作用の増強効果が、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下に比べたＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での、飽和濃度のＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下でのＴｒｋＢの活性化の増大により測定される、請求項１または請求項３３に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  35. ＴｒｋＢの活性化の増大がＴｒｋＢのリン酸化のレベルの上昇により測定される、請求項３４に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  36. 飽和濃度のＢＤＮＦまたはＮＴ−４の存在下でのＴｒｋＢのリン酸化が、ＴｒｋＢ結合アゴニストの存在下での少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、または少なくとも１５０％に比べ、ＴｒｋＢ結合アゴニストの不在下では１００％である、請求項３５に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  37. 細胞表面のＴｒｋＢレベルを維持する、請求項１または請求項３〜３６のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  38. ヒトおよびカニクイザルＴｒｋＢのリン酸化のＥＣ５０に５倍以内の差を示す、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のＴｒｋＢ結合アゴニスト。
  39. 請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする１以上の核酸配列。
  40. 重鎖をコードする配列番号４４；および／または軽鎖をコードする配列番号４５を含んでなる、請求項３９に記載のＴｒｋＢ結合アゴニストをコードする１以上の核酸配列。
  41. 請求項３９または４０に定義される１以上の核酸配列を含んでなる、１以上の発現ベクター。
  42. 請求項３９もしくは４０に定義される１以上の核酸配列、または請求項４１に定義される１以上の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
  43. 請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストの生産のための方法であって、請求項４２に定義される宿主細胞を前記核酸配列またはベクターの発現に好適な条件下で培養することを含んでなる、方法。
  44. 請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストと薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤の１つまたは組合せとを含んでなる、医薬組成物。
  45. 療法において使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または請求項４４に定義される医薬組成物。
  46. 神経障害の処置において使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または請求項４４に定義される医薬組成物。
  47. 神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置において使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または請求項４４に定義される医薬組成物。
  48. 必要とする対象において神経障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または請求項４４に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
  49. 必要とする対象において神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害を処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニスト、または請求項４４に定義される医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
  50. 神経障害の処置のための請求項４４に定義される医薬組成物の製造における、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストの使用。
  51. 神経障害、またはＴｒｋＢの活性化によるＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の回復もしくは増進が有益であり得る他の障害の処置のための請求項４４に定義される医薬組成物の製造における、請求項１〜３８のいずれか一項に定義されるＴｒｋＢ結合アゴニストの使用。
  52. 障害が神経変性疾患、視神経症、網膜変性病態、難聴を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および別のＣＮＳ障害である、請求項４６もしくは４７に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト、請求項４８もしくは４９に記載の方法、または請求項５０もしくは５１に記載の使用。
  53. 障害が視神経症である、請求項５２に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト、方法、または使用。
  54. 障害が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン病、パーキンソン病、プリオン病、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパシー、緑内障、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア視神経症、中毒性視神経症 外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢黄斑変性、色素性網膜炎、神経性難聴、内耳性難聴、耳鳴、感音性難聴、混合性難聴、不安、気分障害、鬱病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、拒食症、悪液質、望ましくない体重減少、サルコペニア、肥満、オピオイド誘発性嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、癲癇、多発性硬化症、片頭痛、神経損傷、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害および脳卒中である、請求項５２に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト、方法、または使用。
  55. 処置が細胞生存、および／またはニューロン修復、および／またはニューロン可塑性の増進を含んでなる、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｋＢ結合アゴニスト、方法、または使用。
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