KR20230039734A

KR20230039734A - 항-Aβ 항체

Info

Publication number: KR20230039734A
Application number: KR1020237005881A
Authority: KR
Inventors: 미카엘 스코브; 탈로찬 에스. 니자르; 스리다르 고빈다라잔; 톰 퍼셀; 마크 웰치; 프레데리크 바드; 로빈 바르부르; 와그너 자고
Original assignee: 오타이르 프로테나 리미티드
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2023-03-21
Also published as: US11434284B2; WO2022020680A1; AU2021310926A1; US20220041700A1; IL300059A; EP4185612A1; UY39337A; US20230331828A1; US20220049009A1; US20220089762A1; US20220041701A1; CL2023000216A1; US11434283B2; CN116348487A; JP2023535024A; US20220242940A1; CA3186614A1; US11434285B2; US11440953B2; MX2023000949A

Abstract

인간 베타-아밀로이드 펩타이드에 결합하는 항체, 항체를 이용한 아밀로이드 생성 장애의 검출, 측정 및 치료 방법, 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 제조 방법이 제공된다.

Description

항-Aβ 항체

관련 출원

본 출원은 2020년 7월 23일자 미국 가출원 번호 63/055,813, 2020년 10월 1일자 미국 가출원 번호 63/086,589, 2021년 5월 11일자 미국 가출원 번호 63/187,379 및 2021년 7월 8일자 미국 가출원 번호 63/219,611에 대해 우선권의 혜택을 주장하며, 이들 출원 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

서열 목록에 대한 진술

서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형태가 전자 제출에 의해 본 출원과 함께 제출되며, 그 전체가 원용에 의해 본 출원에 포함된다. 서열목록은 2021년 7월 22일자에 생성된 155 kb 크기의 파일명 "20-1030-WO_Sequence-Listing_ST25.txt"에 수록된다.

기술 분야

본 발명은 항-아밀로이드 베타 (Aβ) 항체 및 이의 조성물 및 이용 방법에 관한 것이다.

알츠하이머 질환 (AD)은 노인성 치매를 유발하는 진행성 질환이다. 이 질환은 일반적으로 노년기 (65세 이상)에 발생하는 후기 발병과 노년기 훨씬 이전, 즉 35-60세에 발생하는 조기 발병으로 나뉜다. 이러한 질환의 2가지 유형은 질환 병인이 동일한 것으로 보이지만, 어린 나이에 발병된 경우에는 이상 현상들이 더 심각하고 널리 퍼지는 경향을 보인다. 이 질환은 2종 이상의 뇌 병변 유형, 즉 신경섬유 덩어리와 노인반을 특징으로 한다. 신경섬유 덩어리는 쌍으로 서로 꼬인 2개의 필라멘트로 이루어진 타우 단백질이 미세소관과 얽혀 세포내 침착된 것이다. 노인반 (즉, 아밀로이드 플라크)은 중심에 세포외 아밀로이드 침착물이 존재하는 최대 150 ㎛ 직경의 무질서한 신경망 구역으로서, 뇌 조직 단편에 대한 현미경 분석을 통해 관찰할 수 있다. 뇌에 아밀로이드 플라크의 축적은 또한 다운 증후군 및 기타 인지 장애와도 연관되어 있다.

플라크의 주 성분은 Aβ (Abeta) 또는 β-아밀로이드 펩타이드로 지칭되는 펩타이드이다. Aβ 펩타이드는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로 지칭되는 거대 막관통 당단백질의 내부 단편으로서, 아미노산 39-43개로 이루어진 4-kDa 단편이다. Aβ는 APP가 여러가지 세크레타제 효소에 의해 단백질 분해를 거친 결과로서, 주로 아미노산 40개 길이의 짧은 형태와 아미노산 42-43개 길이의 긴 형태 2가지로 발견된다. APP의 소수성 막관통 도메인 부분은 Aβ의 카르복시 말단에서 발견되는데, 이는 특히 긴 형태의 Aβ가 플라크로 응집되는 경향성을 설명해줄 수 있다. 뇌에 아밀로이드 플라크의 축적은 궁극적으로 뉴런 세포 사멸을 유발한다. 신경 퇴화 유형과 관련한 신체적 증상이 알츠하이머 질환의 특징이다.

본 발명은 Aβ에 특이적으로 결합하는 항체 (및 항체 단편), 이러한 항체 및 항체 단편과 관련 핵산의 제조 방법, Aβ-관련 신경계 장애를 가진 환자의 치료 방법, 아밀로이드 생성 질환을 치료하거나, 발병 위험을 낮추거나 또는 개시를 지연하거나, 아밀로이드 생성 질환의 마커, 예방학적 및/또는 치료학적 용도를 위한, 예를 들어, Aβ 플라크의 방지, 감소 또는 저해 및 인지 개선을 달성하기 위한 예방학적 및/또는 치료학적 용도로서, Aβ에 대해 높은 친화성 결합을 나타내는 항체의 약학적 제형 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드 플라크를 검출하는 방법 및 아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 환자에서 치료 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로 Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하고; 아밀로이드 생성 장애와 관련한 용해성 Aβ 종을 중화하고 플라크 부담을 낮추는데 효과적인, 단일클론 항체의 식별 및 특정화를 기반으로 한다.

다양한 측면들에서, 본 발명은 Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 항체 및 단편은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기한 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3와 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 표 1의 항체들 중 어느 하나에 대해 나타낸 바와 같다. 아울러, 본 발명의 항체 또는 단편 또는 단편들은 표 1의 항체들 중 어느 하나에 대해 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 가질 수 있으며, 표 1의 항체들 중 어느 하나에 대해 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예들에서, 항체 및 이의 단편은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서

중쇄 CDR1은 서열번호 16, 19 또는 20 중 하나를 포함하고,

중쇄 CDR2는 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 하나를 포함하고,

중쇄 CDR3는 서열번호 18, 24 또는 25 중 하나를 포함하고,

경쇄 CDR1은 서열번호 26, 29, 31 또는 32 중 하나를 포함하고,

경쇄 CDR2는 서열번호 33, 34, 35 또는 36 중 하나를 포함하고,

경쇄 CDR3는 서열번호 28, 38 또는 39 중 하나를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 단편은, CDR을 제외하고는, 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일한 중쇄 가변 영역; 및 CDR을 제외하고는, 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 아울러, 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택될 수 있으며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택될 수 있다.

추가적인 구현예들에서, 본 발명은 다음과 같은 아미노산 서열을 가진, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하는, Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다:

중쇄 CDR1은 X₁이 Y 또는 F인 아미노산 서열 GFTFSNX₁GMS (서열번호 88)을 포함하고;

중쇄 CDR2는 X₁이 I 또는 V인 아미노산 서열 SX₁RSGSGRTYYSDNVKG (서열번호 89)을 포함하고;

중쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T인 아미노산 서열 YDHYX₁GX₂SDY (서열번호 90)을 포함하고;

경쇄 CDR1은 아미노산 서열 KSSQSLLDYDGKTYLN (서열번호 91)을 포함하고;

경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRDX₃ (서열번호 92)을 포함하고;

경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T인 아미노산 서열 WQGTHFPRX₁ (서열번호 93)을 포함한다.

아울러, 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 F 또는 Y인 WQGTHFPRX₁FX₂ (서열번호 94)일 수 있다.

또한, 본 발명의 구현예는 하기 아미노산 서열을 가진, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역를 포함하는, Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 것이다:

중쇄 CDR1은 X₁이 S 또는 A이고 X₂가 Y 또는 F인 아미노산 서열 GFTFX₁NX₂GMS (서열번호 95)을 포함하고;

중쇄 CDR2는 X₁이 I 또는 V이고, X₂가 S 또는 G이고 X₃가 S 또는 G인 아미노산 서열 SX₁RSGX₂X₃RTYYSDNVKG (서열번호 96)을 포함하고;

경쇄 CDR1은 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 V, M 또는 L이고 X₃가 Y, T 또는 S인 아미노산 서열 X₁SSQSLX₂DX₃DGKTYLN (서열번호 97)을 포함하고;

경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 E 또는 D이고 X₄가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRX₃X₄ (서열번호 98)을 포함하고;

경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T인 아미노산 서열 WQGX₁HFPRX₂ (서열번호 99)을 포함한다.

또한, 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 F 또는 Y인 WQGTHFPRX₁FX₂X₃ (서열번호 100)를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적인 측면에서, 항체 또는 이의 단편은 인간화 항체, 인간 IgG1 항체이거나 또는 전장 항체 (full antibody), 키메라 항체, CDR-이식된 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc 또는 Fv를 포함할 수 있다.

또한, 추가적으로, 본 발명의 항체 또는 단편은 서열번호 40에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 41에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 단편은 Aβ의 아미노산 1-7로부터 유래한 아미노산 위치 3개 이상을 함유한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산에 대한 것이다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 제조 방법에 대한 것이다. 이러한 방법은 (a) 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 세포를, 세포가 항체 또는 이의 단편을 분비하도록 배양하는 단계; 및 (b) 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 단편을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포주의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 (a) 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄와 선별가능한 마커를 암호화하는 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 벡터를 증가된 카피 수로 포함하는 세포를 선별하기 위한 조건에서 세포를 증식시키는 단계; (c) 선별한 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 항체 또는 이의 단편의 수율에 기반하여 선별한 단일 세포로부터 클로닝한 세포를 보관 (banking)하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 방법은 세포를 선별 조건에서 증식시키는 단계; 및 천연적으로 발현하고 적어도 100 mg/L/10⁶ 세포/24 h으로 분비하는 세포주를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.

추가적인 측면은 환자에서 아밀로이드 생성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 단편을 유효 투여량 (effective dosage)으로 환자에 투여하는 것을 포함한다. 아밀로이드 생성 질환은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애일 수 있다.

아밀로이드 생성 질환의 경우, 본 발명의 방법은 질환을 가진 환자에게 항체 또는 이의 단편을 질환 치료에 유효한 용법 (regime)으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명의 방법은 질환 위험이 유전자 또는 생화학적 마커로부터 결정된 환자에서 알츠하이머 질환의 개시를 늦추거나 또는 위험을 낮추는 것을 포함한다. 본 방법은 질환을 가진 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 질환의 위험을 낮추거나 또는 질환 개시를 늦추는데 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함한다.

또한 추가적으로, 본 발명은 아밀로이드 생성 질환과 관련한 병태 또는 질환을 가진 개체에서 인지 개선을 달성하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 아밀로이드 생성 질환은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애일 수 있다.

또한 추가적으로, 본 발명은 인간 개체에서 다운 증후군 또는 임상 또는 전임상 알츠하이머 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 인간 개체에서 아밀로이드 플라크의 생성을 저해하거나, 인간 개체의 뇌에서 아밀로이드 플라크를 감소시키거나, 아밀로이드 생성 질환을 가지고 있거나 또는 발병 위험이 있는 개체에서 아밀로이드 플라크를 저해 또는 감소시키는 방법들 중 하나 이상을 포함한다. 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법들 각각에서, 아밀로이드 플라크는 Aβ₁ _-42, Aβ의 피로글루타메이트 종 (예, Aβ_pE3 _-42) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 아밀로이드 생성 질환을 가지고 있거나 아밀로이드 생성 질환의 발병 위험이 있는 개체에서 아밀로이드 플라크를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 단편을 투여하는 단계; 및 개체에서 Aβ에 결합한 항체 또는 이의 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 아밀로이드 생성 질환은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애이다. 이러한 검출 방법에서, 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어, 형광 표지 물질, 상자성 표지물질 또는 방사성 표지 물질로 표지할 수 있다. 방사성 표지 물질은 양전자 방출 단층촬영술 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 이용해 검출할 수 있다.

아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법은

(a) 청구항 1-18 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하여 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편의 1차 함량을 검출함으로써, 치료하기 전 개체에서 아밀로이드 플라크의 1차 수준을 측정하는 단계,

(b) 개체에 치료제를 투여하는 단계,

(c) 개체에 항체 또는 이의 단편을 투여하여 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출함으로써, 치료 후 개체에서 아밀로이드 플라크의 2차 수준을 측정하는 단계를 포함하며,

아밀로이드 플라크의 수준 감소는 긍정적인 치료 반응을 의미한다.

또한 추가적으로, 본 발명의 다른 측면은 아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은, (a) 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 투여하여 개체에서 Aβ에 결합한 항체 또는 이의 단편의 1차 함량을 검출함으로써, 치료하기 전 개체에서 아밀로이드 플라크의 1차 수준을 측정하는 단계, (b) 개체에 치료제를 투여하는 단계, (c) 개체에 항체 또는 이의 단편을 투여하여 개체에서 Aβ에 결합한 항체 또는 이의 단편을 검출함으로써, 치료 후 개체에서 아밀로이드 플라크의 2차 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 아밀로이드 플라크의 수준 변화가 없거나 또는 아밀로이드 플라크의 소폭 증가는 긍정적인 치료 반응을 의미한다.

본 발명의 방법은 또한 인간 개체에서 Aβ의 감소, 소거 (clearing) 또는 소거 촉진, 또는 Aβ 축적 또는 응집의 감소 또는 저해를 포함한다. 이러한 방법은 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 아밀로이드 생성 질환을 가진 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ를 감소시키거나, 소거를 촉진하거나 또는 소거하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 아밀로이드 생성 질환을 가진 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해 또는 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 개체에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함한다.

아밀로이드 생성 질환을 가진 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해하는 방법은 청구항 1-18 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효한 용법으로 개체에 투여하여, 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해하는 것을 포함한다. 아밀로이드 생성 질환은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애일 수 있다. Aβ는 Aβ₁ _-42, Aβ의 피로글루타메이트 종 (예, Aβ_pE3 _-42) 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 전술한 방법들 각각에서 항체는 말초 투여에 의해 투여되며, 이는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.

도 1은 인간 생식계열 프래임워크 잔기를 바피뉴주맙 (bapineuzumab)(hBP) VL 서열과 조합하여 설계한 VL 버전 3종을 정렬한 것이다. 정규 (canonical) 잔기 또는 계면 잔기는 비-변형된다.
도 2는 바피뉴주맙 (hBP) 대비 IC₅₀ 비율 (IC₅₀ ratio)을 결정하기 위한 4918, 4917, 4921, 3818, 49human3, 2931 및 바피뉴주맙 대조군의 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 바피뉴주맙 (hBP) 대비 IC₅₀ 비율을 결정하기 위한 2926, 2831, 2927, 2726, 2731, 2826 및 바피뉴주맙 대조군의 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 도시한 것이다.
도 4는 바피뉴주맙 (hBP) 대비 IC₅₀ 비율을 결정하기 위한 2727, 2931 및 바피뉴주맙 대조군의 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 도시한 것이다.
도 5A 및 도 5B는 2931, 2731 및 바피뉴주맙 (도 5A), 및 2726, 2831 및 바피뉴주맙 (도 5B)의 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 도시한 것이다.
도 6A 내지 6D는 분석물 농도 100 nM-0.39 nM (2배 연속 희석)에서 h2726 (도 6A), h2731 (도 6B), h2831 (도 6C) 및 2931 (도 6D)의 Aβ₁ _-28 결합성에 대한 BIAcore 센소그램을 도시한 것이다.
도 7은 재조합 Abeta 1-42 (Aβ₁ _-42) 피브릴에 대한 인간화 항체 (PB-0569 (아두카누맙), PB-0573 (h2726), PB-0574 (h2731), PB-0575 (h2831), PB-0576 (h2931))의 결합 특성을 비교한 BIAcore 센소그램을 도시한 것이다.
도 8은 h2931이 상대적으로 높은 친화성으로 용해성 Aβ 올리고머에 결합함을 나타낸 것이다.
도 9는 아두카누맙 대조군 대비 2726, 2731, 2831, 2931의 Aβ 피브릴 결합 활성을 평가한 그래프를 도시한 것이다. 일정한 농도의 Aβ 피브릴에 대해 항체를 타이트레이션하거나 (좌측 패널), 또는 일정한 농도의 항체에 대해 Aβ 피브릴을 타이트레이션하였으며 (우측 패널), 2726, 2731, 2831 및 2931이 아두카누맙보다 실질적으로 양호하게 결합하는 것으로 확인된다.
도 10은 AD 뇌에서 Aβ 결합성을 나타낸 것이다. 조직 Aβ 병변에 대한 결합성은 h2726, h2731, h2831 및 h2931 항체들에서 비슷하게 관찰된다. 항체 4종, 즉 h2726, h2731, h2831, h2931 0.3 ㎍/ml로 염색한 예시적인 사진들은 다양한 수준의 Aβ 병태 (AD 11-97 및 AD 13-75)를 가진 AD 뇌 2종에서 이들의 염색 패턴을 보여준다. 각 뇌에서, 사진은 동일 단면적으로부터 획득하였으며, 항체 4종 모두에 대해 비교적 비슷한 강도와 병변 분포를 나타낸다. 아두카누맙 염색이 항상 가장 약하다 (기준자 500 ㎛).
도 11은 대조군 AD 뇌에서 Aβ 결합성을 나타낸 것이다. 인간 IgG 이소형 대조군 항체는 AD 뇌에서 염색되지 않는다. 이들 예에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG 이소형과 1 ㎍/ml로 인큐베이션한 AD 조직 단편은 전혀 염색되지 않는다 (기준자 500 ㎛).
도 12는 AD 뇌에서 Aβ 결합성을 정량한 것이다. AD 조직에서 Aβ 병태에 대한 염색을 정량한 결과, h2726, h2731, h2831 및 h2931 항체들 간에 유사한 결합성이 확인된다. AD 뇌 4종으로부터 수득한 조직 단편을 항체 h2726, h2731, h2831, h2931 및 아두카누맙과 다음과 같은 농도 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 9 ㎍/ml로 인큐베이션하였다. 조직 단편의 사진을 획득한 후, 조직의 염색된 면적 %를 Halo^® 이미징 분석 소프트웨어를 이용해 형태계측학적으로 결정하였다. 각 그래프는 AD 뇌에서 항체 5종에 의해 수득한 측정 결과를 비교한다. 그래프 4종은 h2726, h2731, h2831, h2931 항체의 결합 프로파일이 비슷하다는 것을 일관적으로 보여준다. 아두카누맙으로 수득한 측정 결과는 유의하게 더 낮다.
도 13은 AD 뇌에서의 Aβ 결합성을 나타낸 것이다. hBP는 조직 Aβ 병태에 강하게, 용량-의존적인 방식으로 결합한다. 병태 분포가 비슷한 상대적으로 동일 면적의 조직 단편 (뇌 AD 13-75) 사진. hBP는 농도에 따른 염색 수준 증가를 나타내고, Aβ 병태에 대한 결합성이 각 농도에서 BAN2401 또는 아두카누맙보다 더 강하다 (스케일 바: 500 ㎛).
도 14A 및 14B는 일차 뮤라인 미세아교세포가 포함된 APP.PS1 Tg 마우스 조직에서 h2931 및 아두카누맙에 대한 생체외 식세포 실험의 개개 결과 (도 14A)와 종합 결과 (도 14B)를 나타낸 것이다. h2931 및 아두카누맙은 둘다 이소형 대조군과 비교해 Aβ₁ _-42를 상당히 유의한 수준으로 감소시키는 것으로 입증된다. 도 14B
도 15A 및 15B는 이소형 대조군과 비교하고 +/- Aβ 첨가에 대해 표준화한, h2726, h2731, h2831 및 h2931의 농도 증가에 따른 랫 해마 뉴런의 신경돌기에 대한 용해성 올리고머에의 결합성 감소를 보여주는 그래프를 도시한 것이다. 도 15A는 뉴런 당 스팟 개수를 나타내고, 도 15B는 총 스팟 개수 (40필드/웰)를 나타낸다.
도 16은 +/- Aβ 첨가에 대해 표준화한, 2726, 2731, 2831 및 2931 농도 증가에 따른 뉴런 당 Aβ 스팟의 %를 나타낸 그래프이다.
도 17은 바피뉴주맙 가변성 중쇄 서열과 본 발명 2726, 2731, 2831 및 2931의 서열 4종을 정렬한 것이다. CDR은 진하게 표시된다.
도 18은 바피뉴주맙 가변성 경쇄 서열과 본 발명 2726, 2731, 2831 및 2931의 서열 4종 (가변성 경쇄)을 정렬한 것이다. CDR은 진하게 표시된다.
도 19A 및 19B는 본 발명의 항체들에 대한 가변성 중쇄 및 경쇄 CDR 서열들을 열거한 CDR 표를 도시한 것이다. 도 19A는 중쇄 CDR을 나타내고, 도 19B는 경쇄 CDR을 나타낸다.
도 20A 및 20B는 혼성 응집된 Aβ42 종들에 결합하는 항체 효력을 경쟁적인 ELISA에 의해 측정한 그래프이다. 도 20A는 h2931, h2731 및 바피뉴주맙 대조군을 도시한 것이고, 도 20BA는 h2831, h2726 및 바피뉴주맙 대조군을 도시한 것이다.
도 21은 피브릴성 Aβ42에 대한 항체의 직접 결합 및 상대적인 친화성을 ELISA에 의해 측정한 그래프이다.
도 22는 AD 뇌에서 Aβ 플라크 영역에 대한 항체 용량 반응을 면역조직화학적 염색에 의한 양성 조직 %로서 측정한 그래프이다.
도 23은 항체 존재시 랫 해마 뉴런에 대한 용해성 Aβ의 결합성을 정량한 것이다.
도 24는 일차 뮤라인 미세아교세포가 함유된 AD 조직에서 h2731에 대한 생체외 식세포 실험 결과를 나타내 것이다. h2731은 Aβ₁ _-42의 상당한 유의한 감소를 나타내며, 이는 이 항체가 식세포작용 및 이들 종의 제거를 강하게 촉진함을 의미한다.
도 25A 및 25B는 생체외 식세포작용 분석에서 사용된 AD 조직에서 피로글루타메이트-3 Aβ (Aβ_pE3 _- ₄₂)의 존재를 검증하고 (도 23A), 피로글루타메이트-3 Aβ 및 h2931에서의 유사한 결합 패턴을 입증한 것이다 (도 23A 및 B).
도 26A 및 26B는 일차 뮤라인 미세아교세포가 함유된 AD 조직에서 h2931 및 h2731에 대한 생체외 식세포 실험의 결과를 나타낸 것이다. h2931 및 h2731 둘다 피로글루타메이트-3 Aβ (Aβ_pE3 _- ₄₂)를 상당히 유의하게 감소시키며, 이는 이들 항체 2종이 식세포작용 및 이들 종의 제거를 강하게 촉진함을 의미한다.
도 27은 h2731이 Aβ_pE3 _-42가 아닌 Aβ₁ _-42의 N-말단에 결합함을 나타낸 것이다.
도 28A 및 28B는 본 발명의 항체가 THP-1 인간 단핵구에서 Aβ₁ _-42 프로토피브릴의 식세포작용을 시험관내에서 유도함을 나타낸 것이다.
도 29A 및 도 29B는 인간 AD 뇌 조직에서 N-말단 항-Ab 항체에 의해 측정한 Aβ_1-XX의 분포 패턴을 Aβ_pE3 _-42과 비교하여 나타낸 것이다. 도 29C는 인간 AD 뇌 조직에서 Aβ_pE3 _-42 대비 Aβ₁ _- _XX에 의해 커버링되는 면적 %를 정량하여 나타낸 것이다.
도 30은 Aβ 플라크에의 h2731 국지화, Aβ 플라크에서의 항-Aβ_pE3 _-42 항체 신호의 국지화 및 Aβ 플라크에서의 h2731 및 항-Aβ_pE3 _-42 항체 신호의 공동-국지화를 나타낸 것이다.
도 31A 및 도 31B는 항-Aβ 항체 h2731이 AD 뇌 조직으로부터 Aβ_pE3 _-42 소거를 용량-의존적인 방식으로 아두카누맙과 비교해 더 높은 효력으로 촉진함을 보여주는 것이다.
도 32A는 AD 뇌 조직에서의 h2731 및 아두카누맙 농도 의존적인 Aβ_pE3 _-42의 소거를 나타낸 것이고, 도 32B는 h2731의 효과가 미세아교세포-의존적임을 보여주는 것이다.
도 33은 반복 투여시 예측되는 h2731 및 아두카누맙의 CNS 노출을 비교한 것이다.
도 34는 AD 뇌 조직에서 항-Aβ 항체 h2731이 Aβ_pE3 _-42 함유 플라크의 소거를 생체외에서 촉진함을 보여주는 것이다.

아밀로이드 베타 (Aβ)의 N-말단을 표적으로 하는 단일클론 항체 (mAb)는 아밀로이드 플라크 부담을 낮추는 것으로 임상적으로 입증된 바 있으며, 이러한 항체 중 하나인 아두카누맙은 알츠하이머 질환 (AD)에서 인지력 감퇴 서행과 관련있는 것으로 입증되어 있다. 또한, 전임상 실험에서, Aβ의 N-말단 에피토프를 표적으로 하는 단일클론 항체 (mAb)가 시험관내 및 생체내에서 항체-의존적인 미세아교세포-매개 Aβ-플라크 소거를 유발하고, 용해성의 독성 Aβ 올리고머를 중화하는 것으로, 입증된 바 있다. 이에 Aβ N-말단을 표적으로 하는 mAb의 투여가 AD 환자에서 Aβ 플라크를 소거하고 용해성 Aβ 응집을 중화함으로써 질환의 진행을 늦출 것으로 예측하였다.

Aβ 항체 바피뉴주맙 (hBP)은 뮤라인 모 항체 3D6으로부터 개발된 인간화 항체이다. 본 발명의 다양한 측면에서, hBP보다 우수한 항체를 구축하기 위해 다각적인 방식을 적용하였다. hBP의 인간화 (humanness)를 분석하였으며, 경쇄 인간화를 최적화할 수 있는 것으로 확인되었다.

hBP의 대략적인 구조 모델을 제공할 구조를 탐색하기 위해 PDB 데이터베이스 [Deshpande et al, 2005]에서 단백질 서열을 검색하였다. hBP fab PDB code 4HIX의 결정 구조 [Miles, et al., 2013]는 허용가능한 해상도 (2.2 Å)이고 hBP Vh 및 Vk에 대해 정확한 서열 매칭을 나타내어, Vh 및 Vk 구조에 대해 이를 활용하였으며, 루프들에 대해 동일한 정규 구조 (canonical structure)를 유지하였다 [Miles, et al., 2013].

입력 서열로서 hBP VL에 대해 IMGT/DomainGapAlignment를 수행하여, hBP VL에 대해 매칭성이 가장 높은 인간 생식계열 VK 유전자 서열 IGHV2-30*02를 동정하였다. hBP VL의 프래임워크는 IGHV2-30*02의 대응되는 프래임워크 영역과 높은 수준의 서열 유사성을 공유한다. 이에, IGHV2-30*02 VL의 프래임워크 영역은 hBP 프래임워크 영역을 추가로 최적화하기 위한 안내 서열로서 선정하였다. hBP 3D 구조에서 항원과 어떠한 직접적인 접촉을 형성하지 않는 CDR-L2 내 부가적인 잔기들은 생식계열 서열로 바꾸었으며, 다음과 같은 변형하였다.

VL 버전 3종은 인간 생식계열 프래임워크 잔기를 hBP VL 서열과 조합하여 설계하였다. 정규 잔기 또는 계면 잔기는 변형하지 않는다. 또한, P15가 턴 위치에 위치하고 생식계열 유전자의 경우 이 위치에 Leu이 존재한다는 구조 관찰 결과에 기초하여, P15L을 가변성 경쇄 버전 1종에서 조사하였다.

3D 구조 관찰 결과를 토대로, 경쇄와 중쇄의 CDR 및 프래임워크 내 여러 잔기들에 대해 치환을 설계하였다. VL 및 VH 돌연변이 버전을 구축하고, 합리적 설계 (rational design) 제1 라운드로 결합을 조사하였다. 결합을 개선하는 돌연변이들은 제2 라운드 합리적 설계에서 조합하였다. 또한, 추가적인 구조 분석을 통해 도출된 새로운 돌연변이 역시 설계에 조합하였다.

이에, 본 발명은 항체 (및 항체 단편), 이러한 항체 및 항체 단편을 암호화하는 핵산, 이러한 항체 및 항체 단편을 생산하는 방법, 약학적 조성물, 및 아밀로이드 생성 질환을 예방 또는 치료하거나, 아밀로이드 생성 질환의 위험을 낮추거나 또는 발병을 지연하거나, 아밀로이드 생성 질환과 관련한 병태를 가진 개체에서 인지력을 개선하거나, 개체에서 Aβ 플라크 형성을 저해하거나, 개체의 뇌에서 Aβ 플라크를 감소시키거나, 아밀로이드 생성 질환의 발병 위험이 있는 개체에서 아밀로이드 플라크를 저해 또는 감소시키거나, 아밀로이드 플라크를 검출하거나, 아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 아밀로이드 생성 질환은 알츠하이머 및 본원에 기술된 기타 질환들을 포괄한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 베타 아밀로이드 단백질 (Aβ)(예, 용해성 Aβ 및/또는 응집된 Aβ)에 결합하거나, (예, 응집된 Aβ의) 식세포작용을 매개하거나, 플라크 부담을 낮추거나, 및/또는 (예, 환자에서) 신경돌기 이상증 (neuritic dystrophy)을 줄이거나, 용해성의 독성 Aβ 종을 중화하는데 효과적인 단일클론 항체 일군의 특정화를 기반으로 한다. 본 발명의 항체 및 단편은 현재 발표된 실험 요법과 비교해 병리학적 피브릴 Aβ에 대해 더 높은 결합 강도 (친화성 및/또는 항원항체결합)와, 용해성의 독성 Aβ 형태에 대해 높은 친화성을 나타낸다. 이들 항체는 편리한 투여 전략 및 향상된 환자 접근성을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 측면들을 보다 상세히 기술하기에 앞서, 여러가지 용어들을 정의한다.

정의

용어 "항체"는 온전한 항체 (intact　antibody) 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은 표적에 대한 특이적인 결합에 대해 이것이 기원한 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 분리된 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab)c, Fv 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 (가변성) 도메인 항체는 통상적인 항체에서 이의 VL 파트너로부터 분리된 VH 영역 (또는 그 반대)　(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546) 뿐 아니라 낙타과 또는 연골 어류 (예, 수염 상어)와 같은 종으로부터 유래한 VH 영역 (때때로 VHH로 알려져 있음)을 포함하며, VH 영역이 VL 영역과 결합되어 있지 않은 것이다 (예를 들어, WO 9404678 참조). 하나의 쇄가 이의 본래의 파트너로부터 분리된 단일 도메인 항체는 때때로 Dab라고도 하며, 낙타과 또는 연골 어류로부터 유래한 단일 도메인은 때때로 나노바디로 알려져 있다. 단일 도메인 항체에 불변 영역 또는 불변 영역의 일부가 존재하거나 또는 존재하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 낙타과로부터 유래한 천연적인 단일 가변 영역 항체는 VHH 가변 영역, 및 CH2와 CH3 불변 영역을 포함한다. 단일 도메인 항체는 통상적인 항체와 비슷한 방식으로 인간화하기 위한 대상일 수 있다. 항체의 Dab 유형은 통상적으로 인간 기원의 항체로부터 유래한다. 항체의 나노바디 유형은 낙타과 또는 상어 기원이며, 인간화가 이행될 수 있다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 온전한 면역글로불린에 대한 효소적 또는 화학적 분리를 통해 제조할 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중 특이성 항체를 포함한다. 이중 특이성 항체 또는 2관능성 항체는 2종의 서로 다른 중쇄/경쇄 쌍들 및 2종의 서로 다른 결합 부위를 갖는 인공적인 혼성 항체이다 (예, Songsivilai and Lachmann, Clin . Exp . Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992) 참조).

면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 (본원에서 때로 "경쇄 가변성 도메인" ("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변성 도메인" ("VH 도메인")으로도 각각 지칭됨)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 3개가 사이에 존재하는 "프래임워크" 영역으로 구성된다. 프래임워크 영역은 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하도록 CDR을 정렬하는 역할을 담당한다. CDR은 주로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. VL 및 VH 도메인 둘다 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로, 다음과 같이 프래임워크 (FR)와 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3는 때로는 본원에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 지칭되고; VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3는 때로는 본원에서 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 지칭된다. 본 출원이 C-말단 잔기로서 R을 가진 VL 서열을 언급하는 경우, R은 대안적으로 경쇄 불변 영역의 N-말단 잔기인 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 본 출원은 C-말단 R이 없는 VL 서열을 언급하는 것으로 이해하여야 한다.

아미노산을 각 VL 및 VH 도메인으로 지정하는 것은 임의의 통례적인 CDR 정의에 따라 이루어진다. 통례적인 정의는 Kabat 정의 (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 및 1991), Chothia 정의 (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); CDR-H1이 Chothia CDR과 Kabat CDR을 종합한 Chothia Kabat CDR composite; Oxford Molecular의 항체 모델링 소프트웨어에서 적용되는 AbM 정의; 및 Martin 등의 접촉 정의 (bioinfo.org.uk/abs)(표 A 참조)를 포함한다. Kabat는 여러가지 중쇄들 간에 또는 여러가지 경쇄들 간에 대응되는 잔기에 동일한 번호를 지정하는, 널리 사용되는 번호 지정 규약 (Kabat 넘버링)을 제공한다. 항체가 특정한 CDR 정의 (예를 들어, Kabat)에 따라 CDR을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 그 정의는 항체에 존재하는 최소한의 CDR 잔기 (즉, Kabat CDR)를 규정한다. 이는 또한, 다른 통례적인 CDR 정의에서는 포함되지만 명시된 정의에서는 포함되지 않는 기타 잔기 역시 존재하는 경우를, 배제하는 것은 아니다. 예를 들어, Kabat에 따라 정의되는 CDR을 포함하는 항체는, 다른 가능성들 중에서도, CDR이 Kabat CDR 잔기를 포함하고 그외 CDR 잔기는 포함하지 않는 항체, 그리고 CDR H1이 Chothia-Kabat composite CDR H1이고 그외 CDR은 Kabat CDR 잔기를 포함하되 다른 정의에 따른 추가적인 CDR 잔기는 포함하지 않는 항체를 포함한다.

표 A

Kabat 넘버링을 이용한 통례적인 CDR 정의

Loop	Kabat	Chothia	Chothia & Kabat Composite	AbM	Contact
L1	L24--L34	L24--L34	L24--L34	L24--L34	L30--L36
L2	L50--L56	L50--L56	L50--L56	L50--L56	L46--L55
L3	L89--L97	L89--L97	L89--L97	L89--L97	L89--L96
H1	H31--H35B	H26--H32..H34*	H26--H35B*	H26--H35B	H30--H35B
H2	H50--H65	H52--H56	H50--H65	H50--H58	H47--H58
H3	H95--H102	H95--H102	H95--H102	H95--H102	H93--H10
*Chothia에 따른 CDR-H1은 (루프의 길이에 따라) H32, H33 또는 H34에서 끝날 수 있다. 이는 Kabat 넘버링 체계에 따르면 35A 및 35B에 추가의 잔기 삽입이 존재하는 반면 Chothia 넘버링에 따르면 31A 및 31B에 존재하기 때문이다. H35A도 H35B (Kabat 넘버링)도 존재하지 않는다면, Chothia CDR-H1 루프는 H32에서 끝난다. 만일 H35A만 존재한다면 H33에서 끝난다. H35A와 H35B 둘다 존재한다면, H34에서 끝난다

일부 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체의 CDR은 Kabat, Chothia, Kabat/Chothia Composite, AbM 및 Contact으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정의에 따른 것이다.

경쇄 및/또는 중쇄는 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 아미노산 하나 또는 수개, 예를 들어, 중쇄의 C-말단 라이신은 전체 분자 또는 일정 비율의 분자들에서 생략되거나, 또는 유도체화될 수 있다. 보체-매개 세포독성 또는 ADCC와 같은 작동자 기능을 높이거나 또는 낮추기 위해 (예를 들어, Winter et al., 미국 특허 5,624,821; Tso et al., 미국 특허 5,834,597; 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장하기 위해 (예를 들어, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004 참조), 불변 영역에 치환이 이루어질 수 있다. 치환의 예로는 항체 반감기 연장의 경우 250번 위치에 Gln 및/또는 428번 위치에 Leu를 포함한다 (이 불변 영역에 대한 단락에서는 EU 넘버링이 적용됨). 234, 235, 236 및/또는 237번 위치들 중 임의 위치 또는 모든 위치들에서 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화성을 감소시킨다 (예를 들어, US 6,624,821). 작동자 기능을 낮추기 위해 인간 IgG1의 234, 235 및 237번 위치에서 알라닌 치환을 적용할 수 있다. 일부 항체는 작동자 기능을 낮추기 위해 인간 IgG1의 234, 235 및 237번 위치에 알라닌 치환을 가진다. 선택적으로, 인간 IgG2의 234, 236 및/또는 237번 위치는 알라닌으로, 235번 위치는 글루타민으로 치환된다 (예를 들어, US 5,624,821 참조). 일부 항체의 경우, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따라 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 및 331번 위치들 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된다. 일부 항체의 경우, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따라 318, 320 및 322번 위치들 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된다. 일부 항체의 경우, 234 및/또는 235번 위치는 알라닌으로 치환되거나 및/또는 329번 위치는 글리신으로 치환된다. 일부 항체의 경우, 234 및 235번 위치는 알라닌으로 치환된다. 일부 항체의 경우, 이소형은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.

용어 "인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"는 하나 이상의 인간화된 면역글로불린 또는 항체 쇄 (즉, 하나 이상의 인간화된 경쇄 또는 중쇄)를 가진 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. 용어 "인간화된 면역글로불린 쇄" 또는 "인간화 항체 쇄" (즉, "인간화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화된 면역글로불린 중쇄")는 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 가변적인 프래임워크 영역과 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 상보성 결정 영역 (CDR)(예, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 CDR 2종, 더 바람직하게는 CDR 3종)을 함유한 가변 영역을 가진 면역글로불린 또는 항체 쇄 (즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 지칭하며, 추가적으로 불변 영역 (예, 경쇄의 경우 하나 이상의 불변 영역, 또는 중쇄의 경우 바람직하게는 불변 영역 3종)을 포함한다. 용어 "인간화된 가변 영역" (예, "인간화된 경쇄 가변 영역" 또는 "인간화된 중쇄 가변 영역")은 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 가변적인 프래임워크 영역과 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한 가변 영역을 지칭한다.

이에, 인간화 면역글로불린 또는 항체의 영역 또는 잔기, 또는 인간화 면역글로불린 또는 항체 쇄의 영역 또는 잔기는, 가능하게는 CDR을 제외하고는, 하나 이상의 본래의 인간 면역글로불린 서열에서 대응되는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "대응되는 영역" 또는 "대응되는 잔기"는, 제1 서열과 제2 서열을 비교하기 위해 최적으로 정렬하였을 경우, 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 영역 또는 잔기와 동일한 (균등한) 위치에 존재하는 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 영역 또는 잔기를 지칭한다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기 (antigenic determinant)"는 항체가 결합하는 항원의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산으로부터 또는 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의해 병치되는 비-인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매 처리시 해체된다. 에피토프는 전형적으로 아미노산 적어도 3개, 보다 통상적으로 적어도 5개 또는 8-10개를 독특한 공간적인 입체구조로 포함한다. 에피토프가 단백질 내 소정의 아미노산 잔기 범위 (예를 들어, Aβ의 잔기 1-6개)인 것으로 언급되는 경우, 그 범위는 양쪽 경계를 정의하는 잔기를 포함한다. 그 범위 내 특정 잔기는 에피토프에 기여하지만, 다른 잔기는 그렇지 않을 수 있다. 에피토프를 형성하는 잔기들은 서로 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 마찬가지로, 항체가 특정 아미노산 범위에서 발견되는 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 그 범위에 존재하는 아미노산 잔기들과 모두 접촉하는 것은 아니며, 항체와 접촉하는 에피토프 잔기들은 서로 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 에피토프의 공간적인 입체구조를 확인하는 방법으로는, 예를 들어, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)를 참조한다.

동일한 에피토프를 인지하는 항체는 항체가 표적 항원에 결합하는 것에 대해 다른 항체와 경쟁하거나 또는 차단하는 능력을 확인하는 간단한 면역분석, 즉 경쟁적인 결합 분석으로 동정할 수 있다. 경쟁적인 결합은, 검사 면역글로불린이 Aβ와 같은 공통 항원에 대해 참조 항원의 특이적인 결합을 저해하는 분석으로, 확인한다. 여러가지 유형의 경쟁적인 결합 분석, 예를 들어 고상 직접 또는 간접 방사성면역분석 (RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); 고상 직접 표지 분석, 고상 직접 표지 샌드위치 분석 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); I-125 표지 물질을 이용한 고상 직접 표지 RIA (Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))가 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 비-표지된 검사 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린 중 어느 하나를 보유한 세포 또는 고상 표면에 결합된 정제 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적인 저해는 검사 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지 물질의 양을 결정함으로써 측정한다. 통상적으로, 검사 면역글로불린은 과량으로 제공된다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량 존재할 경우, 경쟁 항체는 참조 항체의 공통 항원에 대한 특이적인 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 그 이상으로 저해할 것이다.

항체들 간의 경쟁은, 검사 항체가 공통 항원에 대한 참조 항체 (예, 3D6, 아두카누맙, 바피뉴주맙)의 특이적인 결합을 저해하는 분석으로, 결정된다 (예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). 경쟁적인 결합 분석으로 측정하였을 경우 과량 (예, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)의 검사 항체가 참조 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 99% 저해한다면, 그 검사 항체는 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 경쟁 분석에 의해 동정된 항체 (경쟁 항체)로는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 그리고 입체 방해가 발생할 정도로 참조 항체가 결합하는 에피토프와 충분히 인접한 근접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 식별하기 위해 자체 항원과 결합한 항체에 대한 X선 결정학을 통해 규정할 수 있다. 대안적으로, 한가지 항체의 결합성을 낮추거나 또는 소거하는 항원내 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합성을 낮추거나 또는 소거한다면, 이들 항체 2종은 동일한 에피토프를 가지는 것이다. 만일 한가지 항체의 결합성을 낮추거나 또는 소거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 낮추거나 또는 소거한다면, 이들 항체 2종은 중첩되는 에피토프를 가지는 것이다.

에피토프는 또한 면역 세포, 예를 들어 B 세포 및/또는 T 세포에 의해 인지된다. 에피토프의 세포 인지는 ³H-티미딘 병합, 사이토카인 분비, 항체 분비 또는 항원-의존적인 사멸 (세포독성 T 림프구 분석)에 의해 측정되는 바와 같이 항원-의존적인 증식을 측정하는 시험관내 분석을 통해 확인할 수 있다.

예시적인 에피토프 또는 항원 결정기는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에서 발견될 수 있지만, 바람직하게는 APP의 Aβ 펩타이드에서 발견된다. APP는 여러가지 이소형, 예를 들어 APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ 및 APP⁷⁷⁰이 존재한다. APP 내 아미노산들은 APP⁷⁷⁰ 이소형의 서열에 따라 번호가 지정된다 (예, GenBank 등재번호 P05067, 또한 서열번호 85).

Aβ (본원에서 베타 아밀로이드 펩타이드 및 A-beta로도 지칭됨) 펩타이드는 APP의 아미노산 39-43개로 이루어진 약 4-kDa의 내부 단편 (Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43)이다. Aβ40은, 예를 들어, APP의 잔기 672-711로 이루어지고, Aβ42는 APP의 잔기 673-713으로 이루어진다. 여러가지 세크레타제 효소에 의한 생체내 또는 인 시추 단백질 분해 공정으로, Aβ는 아미노산 40개 길이의 "짧은 형태"와 아미노산 42-43개 길이의 "긴 형태" 2가지로 발견된다. 본원에 기술된 바와 같이, 바람직한 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ 펩타이드의 N-말단에 위치하고, Aβ의 아미노산 1-10 내 잔기를 포함하며, 바람직하게는 Aβ 42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 또는 3-7로부터 유래한 잔기를 포함한다. 추가적으로 참조되는 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ의 잔기 2-4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 Aβ의 잔기 3-5, 6, 7, 8 또는 9, 또는 Aβ42의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10을 포함하다.

"용해성" 또는 "분리된 (dissociated)" Aβ는, 100,000 xg에서 원심분리시 용액 (상층액)에 잔류하는, 다른 단백질 및 지질과 조합되거나 조합되어 있지 않은, 단량체, 응집체, 올리고머 형태의 Aβ 종을 지칭한다. "불용성" Aβ는 100,000 xg에서 원심분리시 용액에 잔류하지 않는, 아밀로이드 (베타-시트)이거나 아닌, 응집된 Aβ 종을 지칭하며, 예를 들어, Aβ는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. Aβ (예, Aβ42)는, 적어도 부분적으로, 펩타이드의 C-말단에 위치한 소수성 잔기 (APP의 막관통 도메인의 일부분)로 인해 응집되는 것으로 보인다. 용해성 Aβ를 준비하는 한가지 방법은 친수성화된 펩타이드를 neat DMSO에 초음파 처리하여 용해하는 것이다. 이렇게 수득한 용액은 원심분리하여 임의의 불용성 미립자를 제거한다.

항체의 "특이적인 결합"은 항체가 항원 또는 바람직한 에피토프에 대해 상당한 친화성을 나타내며, 바람직하게는 유의한 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 의미한다. "상당한" 또는 바람직한 결합은 적어도 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ M^-1 또는 10¹⁰M^-1의 친화성으로 결합하는 것을 포함한다. 10⁷ M^-1보다 높은, 바람직하게는 10⁸ M^-1보다 높은 친화성이 더 바람직하다. 본원에 기재된 값의 중간 값 역시 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도되며, 바람직한 결합 친화성은 친화성, 범위 예를 들어, 10⁶ 내지 10¹⁰M^-1, 바람직하게는 10⁷ 내지 10¹⁰M^-1, 더 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹⁰ M^-1로서 언급될 수도 있다. "유의한 교차 반응성을 나타내지 않는" 항체는 부적절한 실체 (예, 부적절한 단백질 실체)에 상당히 결합하지 않는 것이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ에 상당히 결합할 것이지만, non-Aβ 단백질 또는 펩타이드 (예, 플라크에 함유된 non-Aβ 단백질 또는 펩타이드)와는 유의한 수준으로 반응하지 않을 것이다. 바람직한 에피토프에 대해 특이적인 항체는, 예를 들어, 동일한 단백질 또는 펩타이드 상의 원위 에피토프와 유의하게 교차-반응하지 않을 것이다. 특이적인 결합은 이러한 결합을 확인하기 위한 임의의 당해 기술 분야에서 인정된 수단에 따라 확인할 수 있다. 바람직하게는, 특이적인 결합은 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적인 결합 분석에 따라 검증한다.

결합성 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 온전한 면역글로불린에 대한 효소적 또는 화학적 절단을 통해 제조된다. 결합성 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv, 단쇄 및 단쇄 항체를 포함한다.

용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 기타 포유류 개체를 포함한다.

용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 일부 달성하기에 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료학적인 유효량"은 질환을 이미 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 용도에 대해 유효한 양은 환자 자신의 면역계의 전체 상태 및 감염 중증도에 따라 결정될 것이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는, 질환, 질환의 증상 또는 질환의 소인을 완치하거나, 치유하거나, 완화하거나, 경감하거나, 변형하거나, 처치하거나, 개선하거나, 향상하거나 또는 영향을 미치기 위한 목적으로, 질환, 질환 증상 또는 질환 소인을 가진 환자에 대한 치료학적 물질의 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 유래한 단리한 조직 또는 세포주에 대한 치료학적 물질의 적용 또는 투여로서 정의된다.

용어 "아밀로이드 생성 질환"은 불용성 아밀로이드 피브릴 또는 아밀로이드 플라크의 형성 또는 침착과 관련한 (또는 이에 의해 유발되는) 임의의 질환을 포괄한다. 아밀로이드 생성 질환에 대한 예로는, 비-제한적으로, 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군, 경미한 인지 장애, 프리온-관련 전염성 해면상 뇌증 (인간의 경우, 쿠루 (kuru) 및 크로이츠펠트-야콥병, 양 및 소의 경우 스크래피 (scrapie) 및 BSE) 등을 포함한다. 여러가지 아밀로이드 생성 질환은 침착된 피브릴의 폴리펩타이드 성분의 특성에 따라 정의되거나 또는 특정된다. 예를 들어, 알츠하이머 질환을 가진 개체 또는 환자의 경우에는, β-아밀로이드 단백질 (예, 야생형, 변이체 또는 말단 절단된 β-아밀로이드 단백질)이 아밀로이드 침착물의 특징적인 폴리펩타이드 성분이다. 즉, 알츠하이머 질환은 예를 들어 개체 또는 환자의 뇌에 "Aβ의 침착을 특징으로 하는 질환" 또는 "Aβ의 침착과 관련한 질환"의 일 예이다. 용어 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩타이드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩타이드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.

만일 개체가 하나 이상의 공지된 위험 인자 (예, 유전적, 생화학적, 가족력, 상황적 노출)를 가지고 있어 해당 위험 인자를 가진 개체가 위험 인자가 없는 개체에 비해 질환이 발병할 위험이 통계학적으로 유의하게 높은 위험 상태라면, 그 개체는 질환 위험이 증가된 상태이다.

용어 "증상"은 환자가 인지하는 보행 변형과 같은 질환의 주관적인 증거를 의미한다. "징후"는 의사에 의해 관찰되는 질환의 객관적인 증거를 의미한다.

통계학적 유의성은 p<0.05를 의미한다.

항-Aβ 항체

이제, 본 발명의 다양한 측면들로 돌아가, 본 발명의 제1 측면은 Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 항체 또는 단편은 본원에서 h2726, h2731, h2831, h2931, h2926, h4921, h2828, h2929, h3818G, h2927, h49k3G, h4917G, h2727 및 h4918G로서 식별되는 구조체들 중 어느 하나로부터 유래한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 본 발명의 특정한 단일클론 항체는 Aβ의 (1로 지칭되는 천연 Aβ의 첫번째 N 말단 잔기를 가진) 잔기 1-6 내 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 단일클론 항체는 아미노산 1-6 내 에피토프에 결합하고, 일부는 아미노산 1-5 내 에피토프에 결합하고, 일부는 아미노산 1-4 내 에피토프에 결합한다. 일부 항체는 아미노산 1-3, 2-5, 3-5, 2-4, 2-5, 2-6, 3-5 또는 3-6 내 에피토프에 결합한다. 항체가 예를 들어 Aβ 1-6과 같이 명시된 잔기들 내 에피토프에 결합하는 것으로 언급되는 경우, 이는 항체가 명시된 잔기 (즉, 일 예로, Aβ 1-6)를 함유한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것을 의미하며; 이러한 항체가 Aβ 1-6 내 모든 잔기들과 반드시 접촉하는 것은 아니다.

다른 측면에서, 항체 또는 단편은 표 1A에 나타낸 구조체로부터 유래한 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다.

표 1A

다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 표 1A의 구조체들 중 어느 하나에 대해 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 또한, 항체 또는 단편은 표 1A의 구조체들 중 하나에 대해 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있다.

표 1A에서 식별되는 중쇄 및 경쇄 서열 각각의 CDR과 바피뉴주맙 ("Bapi", "hBP")의 CDR을 정렬하여, 도 19A 및 도 19B에 도시한다. 일 측면에서, 본 발명은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 함유하되, CDR1이 서열번호 16, 19 및 20 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며; CDR2가 서열번호 17, 20, 21 22 및 23 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며; CDR3가 서열번호 18, 24, 25 중 어느 하나로부터 선택될 수 있는, 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 아울러, 항체 또는 이의 단편은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호 26, 29, 31 및 32 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며, CDR2는 서열번호 27, 33, 34 및 35 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며, CDR3는 서열번호 28, 38 및 39 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 이들 구현예들 각각에서, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR은 서로 조합되며, 동시에 서열번호 16, 17, 18, 26, 27 및 28인 것은 아니다.

전술한 항체에 대한 단백질 모델링 정보 분석을 통해, 특히 본 발명의 항체의 항원항체 결합성/친화성 특징을 증가시키는데 기여하는, 변형 2가지를 CDR에서 식별하였다:

CDR-L1: S32Y (32번 위치에서 Ser -> Tyr), 및

CDR-H2: G55S (55번 위치에서 Gly -> Ser).

본 발명에 열거된 항체가 결합하는 동일한 에피토프에 결합되는, CDR-L1의 32번 위치에 Tyr을, CDR-H2의 55번 위치에 Ser을 가진, 항-Aβ 항체는 식별된 열거한 항체와 동일한 특성을 가진 것으로 예상된다 (표 1A, 도 19A 및 도 19B 참조). CDR-L1의 32번 위치에 Tyr, CDR-H2의 55번 위치에 Ser을 갖지 않은 개시된 항체는, CDR-L1의 32번 위치에 Tyr, CDR-H2의 55번 위치에 Ser을 가지도록 변형될 수 있으며, 이는 본원에 식별된 이러한 항체에 유사한 결합 특성을 부여할 것으로 예상할 수 있다.

32번 위치에 Tyr을 가진 CDR-L1의 예는 서열번호 29 및 31을 포함한다. 54번 위치에 Ser을 가진 CDR-H2의 예는 서열번호 20 및 21을 포함한다.

예로서, 32번 위치에 Tyr을 가진 CDR-L1 및 55번 위치에 Ser을 가진 CDR-H2를 포함하는 항체는 h2726, h2731, h2727, h2826, h2831, h2926, h2927, h2931, h2929의 CDR을 가진 항체를 포함한다 (표 1A 참조). 부가적인 이러한 항체로는 아래 표 1B에 기재된 바와 같이 LC CDR 1, 2, 3 및 HC CDR 1, 2, 3를 포함하는 항체 등이 있다.

표 1B

본원에서 동정된 항체들에서 확인되는 결합 특성에 비추어, 비슷한 결합 특성을 제공할 것으로 예상되는 컨센서스 서열을 동정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에서, Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편은 다음과 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:

경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고, X₂가 S 또는 T이고 X₃가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRDX₃ (서열번호 92)를 포함하고;

일부 구현예에서, 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 F 또는 Y인 아미노산 서열 WQGTHFPRX₁FX₂ (서열번호 94)을 포함한다.

본원에 기술된 항체와 유사한 결합 특성을 제공할 것으로 예상할 수 있는 비슷한 컨센서스 서열은 다음과 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다:

중쇄 CDR2는 X₁이 I 또는 V, X₂가 S 또는 G이고 X₃가 S 또는 G인 아미노산 서열 SX₁RSGX₂X₃RTYYSDNVKG (서열번호 96)을 포함하고;

경쇄 CDR1은 X₁이 K 또는 R이고, X₂가 V, M 또는 L이고 X₃가 Y, T 또는 S인 아미노산 서열 X₁SSQSLX₂DX₃DGKTYLN (서열번호 97)을 포함하고;

경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고, X₂가 S 또는 T이고 X₃가 E 또는 D이고 X₄가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRX₃X₄ (서열번호 98)을 포함하고;

일부 구현예에서, 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 F 또는 Y인 WQGTHFPRX₁FX₂X₃ (서열번호 100)를 포함한다.

아울러, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표 1A에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 75% 동일할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 표 1A에서 식별되는 VH 및/또는 VL 서열에 대해 75% 동일하거나, 80% 동일하거나, 85% 동일하거나, 90% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일할 수 있다. 다양한 측면에서, VH 및 VL에서의 임의의 서열 변형은, 본 발명의 VH 및 VH 서열이 표 1A에서 식별된 CDR을 포함하지만, CDR 외부의 VH 및 VL 서열 영역이 표 1A에서의 VH 및 VL 서열의 CDR 외부의 영역에 대해 적어도 75% 동일할 수 있도록, CDR의 외부에 존재할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 항체 또는 단편은, CDR을 제외하고는 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7 중 하나와 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 영역과, CDR을 제외하고는 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 하나와 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 및 단편은 또한 서열번호 40에 대해 적어도 75% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 서열번호 40에 대해 75% 동일하거나, 80% 동일하거나, 85% 동일하거나, 90% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일할 수 있다.

본 발명의 항체 및 단편은 또한 서열번호 41에 대해 적어도 75% 동일한 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 불변 영역은 서열번호 41에 대해 75% 동일하거나, 80% 동일하거나, 85% 동일하거나, 90% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일할 수 있다.

표 1A에 기재된 서열 (+ 임의의 불변 영역)에 대해 100% 미만으로 동일한 변이체 항체 또는 단편은 표 1A의 항-Aβ 항체와 단지 아미노산 잔기 1-15개, 1-10개, 예를 들어 6-10개, 겨우 5개, 4개, 3개, 2개 또는 심지어 1개가 다를 수 있다. "보존적인 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 전하가 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 전하가 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 계열들은 당해 기술 분야에서 정의되어 있다. 이러한 계열로는 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 잔기를 가진 아미노산 (예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안적으로, 포화 돌연변이 유발에 의해서와 같이 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있으며, 제조된 돌연변이체는 활성을 보유한 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 선별할 수 있다 (예, Aβ 폴리펩타이드 결합력).

예를 들어, 항체 분자의 프래임워크 영역에만 돌연변이를 도입하는 것도 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중립 과오 돌연변이 (neutral missense mutation)일 수 있으며, 즉 항체의 항원 결합력에는 영향이 없거나 또는 거의 영향을 미치지 않는다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 용법 (codon usage)을 최적화하거나 또는 하이브리도마의 항체 생산을 개선하는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 비-중립 과오 돌연변이는 항체의 항원 결합력을 바꿀 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 항원 결합 활성의 비-변동 또는 결합 활성의 변동 (예, 항원 결합 활성 개선 또는 항체 특이성 변경) 등의 원하는 특성을 가진 돌연변이 분자를 설계 및 검사할 수 있을 것이다. 돌연변이 유발 후, 암호화된 단백질을 일상적으로 발현시키고, 암호화된 단백질 기능적 및/또는 생물학적 활성 (예, Aβ 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프에 면역 특이적으로 결합하는 능력)을 당해 기술 분야에 공지된 기법을 일상적으로 수정하거나 또는 본원에 기술된 기법을 이용해 결정할 수 있다.

전술한 구현예들 각각에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 본원에 기술된 바와 같이 인간화 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간 IgG1 항체일 수 있다. 아울러, 항체는 전장 항체 (full antibody), 키메라 항체, CDR-이식된 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 항체의 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc 또는 Fv일 수 있다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 온전한 면역글로불린에 대한 효소적 또는 화학적 분해를 통해 만들어진다.

본원에 개시된 항체 또는 결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 해리 속도 (k(off)) 5x10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5x10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하로, Aβ 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는, 해리 속도 (k(off)) 5x10⁴ sec^-1, 10^-4 sec^-1, 5x10^-5 sec^-1, 10^-5 sec^-1, 5x10^-6 sec^-1, 10^-6 sec^-1, 5x10^-7 sec^-1 또는 10^-7 sec^-1 이하로, Aβ 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.

본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드 (예, Aβ) 또는 이의 단편 또는 변이체에, 결합 속도 (k(on)) 10³ M-1 sec-1, 5x10³ M-1 sec-1, 10⁴ M-1 sec-1 또는 5x10⁴ M-1 sec-1으로, 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드 (예, Aβ) 또는 또는 이의 단편 또는 변이체에, 결합 속도 (k(on)) 10⁵ M-1 sec-1, 5x10⁵ M-1 sec-1, 10⁶ M-1 sec-1, 5x10⁶ M-1 sec-1 또는 10⁷ M-1 sec-1으로, 결합하는 것으로 언급될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 Aβ 결합 친화성 측면에서 언급되거나 또는 명시될 수 있다. 결합 친화성은 해리 상수 또는 Kd가 5x10^-2M, 10^-2M, 5x10^-3M, 10^-3M, 5x10^-4M, 10^-4M, 5x10^-5M, 10^-5M, 5x10^-6M, 10^-6M, 5x10^-7M, 10^-7M, 5x10^-8M, 10^-8M, 5x10^-9M, 10^-9M, 5x10^-10M, 10^-10M, 5x10^-11M, 10^-11M, 5x10^-12M, 10^-12M, 5x10^-13M, 10^-13M, 5x10^-14M, 10^-14M, 5x10^-15M 또는 10^-15M 미만인 것을 포함할 수 있다.

재조합 항체의 발현

본 발명은, 발현시 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는, 항체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 발현시 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 예는 본원에 제공되며 (예, 서열번호 42 내지 서열번호 69), 이는 서열번호 1 내지 서열번호 39에 따른 가변성 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드 및 이의 CDR을 암호화한다. 코돈 축중 (codon degeneracy)으로 인해, 다른 폴리뉴클레오티드도 이러한 서열을 쉽게 대체할 수 있다.

인간화 항체 및 인간 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 제조된다. 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 불변 영역과 연결될 수 있으며, 이는 발현 벡터에 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일한 또는 서로 다른 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호화하는 DNA 분절은 면역글로불린 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)에 조절 서열과 작동가능하게 연결된다. 발현 조절 서열로는, 비-제한적으로, 프로모터 (예, 천연적으로-부속된 프로모터 또는 이종적인 프로모터), 신호 서열, 인핸서 인자 및 전사 종결 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내 진핵생물 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주에 일단 도입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열을 고 수준으로 발현하고 교차-반응성 항체를 수집 및 정제하는데 적합한 조건 하에 유지된다.

이들 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA 내 일부로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 통상, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출할 수 있도록 선별 마커 (예, 암피실린-내성, 히그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 유용한 원핵생물 숙주 1종은 E. coli이다. 이용하기에 적합한 다른 미생물 숙주로는 바실러스 섭틸리스와 같은 바실러스 및 살모넬라와 같은 기타 장내세균과 및 다양한 슈도모나스 종 등이 있다. 이들 원핵생물 숙주의 경우, 이는 전형적으로 숙주 세포와 혼용가능한 발현 조절 서열 (예, 복제 오리진)을 함유할 발현 벡터를 만들 수 있다. 아울러, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터 유래한 프로모터 시스템과 같은 다양한 임의 개수의 잘 알려진 프로모터들 존재할 것이다. 프로모터는 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 조절할 것이며, 이는 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위해 리보솜 결합부 서열 등을 가질 것이다.

효모와 같은 기타 미생물 역시 발현에 이용가능하다. 사카로마이세스는 필요에 따라 발현 조절 서열 (예, 프로모터), 복제 오리진, 종결 서열 등을 가진 적절한 벡터를 구비한, 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 당분해 효소를 함유한다. 유도성 효모 프로모터로는 특히 알코올 데하이드로게나제, 이소시토크롬 C 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터 유래한 프로모터 등이 있다. 아울러, 발현에 식물 (예, 벼, 토바코) 역시 이용가능하다.

포유류 조직 세포 배양 역시 이용하여, 본 발명의 폴리펩타이드 (면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 발현 및 생산할 수 있다. 진핵생물 세포는, 이종의 단백질 (예, 온전한 면역글로불린)을 생산할 수 있는 여러가지 적절한 숙주 세포주가 당해 기술 분야에서 개발되어 있어, 특히 유용할 수 있으며, 이러한 것으로는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는, 골수종 세포주 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마 등이 있다. 바람직하게는, 세포는 비-인간 세포이다. 이들 세포용 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어 복제 오리진, 프로모터 및 인핸서와 필수 처리 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합부, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열을 함유할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 보바인 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래한 프로모터이다.

항체-암호화 서열은 형질전환 동물의 게놈에 도입된 다음 형질전환 동물의 모유에서 발현시키기 위해 전이유전자에 병합될 수 있다. 적절한 전이유전자는 카세인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이 유전자로부터 유래한 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된, 경쇄 및/또는 중쇄 암호화 서열을 포함한다.

대상 폴리뉴클레오티드 서열 (예, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열과 발현 조절 서열)을 함유한 벡터는, 세포 숙주의 유형에 따라 결정되는, 잘 알려진 방법에 의해 숙주 세포에 전달할 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 세포의 경우 염화나트륨 형질감염이 흔히 이용되며, 다른 세포 숙주에 대해서는 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이올리스틱스 또는 바이러스-기반의 형질감염이 이용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하기 위해 이용되는 기타 방법으로는 폴리브렌을 이용하는 방법, 원형질 융합, 리포좀, 전기천공 및 미세주입법 등이 있다 (일반적으로, 상기 Sambrook et al. 참조). 형질전환 동물을 제조하기 위해, 전이유전자를 수정된 난모세포에 미세주입할 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈에 병합할 수 있으며, 이들 세포의 핵을 탈핵된 난모세포에 전달할 수 있다.

중쇄 및 경쇄를 별개의 발현 벡터에서 클로닝하는 경우, 이들 벡터를 공동-형질감염시켜 온전한 면역글로불린의 발현 및 조립을 달성한다. 발현되면, 본 발명의 온전한 항체, 이의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄 또는 기타 면역글로불린 형태는, 황산암모늄 침강, 친화성 컬럼 (예, 단백질 A), 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 비롯하여 당해 기술 분야의 표준적인 공정에 따라 정제할 수 있다. 약제학적 용도의 경우 동질성이 적어도 90-95%인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98-99% 이상의 동질성이 가장 바람직하다.

대상 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 발현 벡터의 카피수 증가는 항체 또는 항체 단편의 생산을 증가시키기 위한 수단으로서 바람직하다. 이러한 목적으로 세포를 유전자 조작한 다음 숙주 세포를 선별하는 여러가지 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 종종 원하는 단백질에서 달성되는 수율을 개선하기 위해 도입되는 발현 벡터의 카피수를 높이기 위한 "증폭 단계"를 포함한다. 증폭 방법은 예를 들어 Bebbington and Hentschel (DNA Cloning Volume III (IRL press, 1987))에서 기존에 발표된 바 있다. 임의의 여러가지 선별가능한 마커들이,종종 숙주 세포 대사에 참여하며 특정 배지 조건에서 생존하는데 필수적인 효소를 암호화하는 핵산 서열 형태로, 선별가능한 마커를 이용한 선별시 원하는 단백질의 발현이 촉진될 수 있도록 발현 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 고 키피수를 위해 선별한 세포는, 단백질 역가가 허용가능하게 상승하지 않을 경우 추가적인 증폭 방법을 실시할 수도 있다. 이러한 방법은 선별가능한 마커를 저해하는 특정 독성 약물 (예, 메토트렉세이트 및 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 메티오닌 설폭이민 및 글루타민 신타제, 다약제 내성/아드리아마이신)에 세포를 노출시키는 것을 수반할 수 있다. 이러한 저해를 통해 마커 발현 수준이 증가된 세포 집단을 선별할 수 있다. 이는 종종 마찬가지로 기능적으로 연결된 발현 카세트의 발현 수준의 증가로 이어진다. 개개 세포의 벡터 카피수는 단백질 발현의 정체기 (plateau), 바람직하게는 적어도 약 100 mg/ml/10⁶ 세포/24시간에 도달할 때까지 분석한다. 이러한 선별 및 증폭을 통해 키운 클론은 이후 최상의 클론을 선별하기 위해 역가/수율에 대해 스크리닝한 다음 추가로 평가한다. 이러한 타이트레이션 및 스크리닝을 통해, 하나 이상의 원하는 단백질을 추후 생산하기 위한 클론 하나 또는 수개를 동정하고, 이를 추후 단독으로 사용하는 것이 일반적이다.

약학적 조성물

항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 준비하여 필요한 개체에 투여하는 방법 여러가지가 공지되어 있다. 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 경로는 예를 들어, 말초, 경구, 중추 (예, 척수강내, 두개강내), 비경구, 흡입에 의한 또는 국소일 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 투여를 용이하게 하기 위해, 그리고 활성 물질의 안정성을 강화하기 위해, 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 생리식염수, 무독성 완충제, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용가능한, 무독성의 무균 담체를 포함한다. 본 출원의 목적으로, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 약제학적 유효량은, 효과적인 표적 결합을 달성하고 이점을 획득하기에, 예를 들어 혈관 아밀로이드에는 영향을 미치지 않으면서 뇌 아밀로이드 플라크를 감소시키거나 또는 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 장기 투여시 미세출혈 발생을 최소화하기에, 충분한 양을 의미하기 위한 것일 것이다. 일부 구현예에서, 항-Aβ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 뇌 아밀로이드 플라크를 낮추는데 유효한 양으로 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 약학적 조성물은, 예를 들어, 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르빈산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인간수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아밀로이드 플라크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등의, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 또는 염이 조성물에 함유될 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 함유시킴으로써, 달성할 수 있다.

비경구 제형은 유지 용량 (maintenance dose)이 후속되는 단일 볼루스 용량 (single bolus dose), 주입 또는 로딩 볼루스 용량 (loading bolus dose)일 수 있다. 이러한 조성물은 특정한 고정된 또는 가변적인 간격으로, 예를 들어, 매일 1회 또는 "필요시에" 투여할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제 (preparation)는 무균 수성 또는 비-수성 용액제, 현탁제 및 유제를 포함한다. 비-수성 용매에 대한 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체로는 물, 알코올성/수성 용액제, 유제 또는 현탁제, 예를 들어 식염수 및 완충화된 매질 등이 있다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거액 또는 고정 오일 등이 있다 정맥내 비히클로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예, 링거 덱스트로스에 기반한 물질) 등이 있다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다. 아울러, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도한 용도에 따라 도파민 또는 정신약리학적 약물과 같은 물질을 추가로 포함할 수 있다.

단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합되는 항-Aβ 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 양은 치료 숙주와 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 1회 투여로, 다회 투여로 또는 확립된 기간 동안에 걸친 주입으로 투여할 수 있다. 투여량 용법 (dosage regimen) 역시 최적의 원하는 반응 (예, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이 용어 "말초 투여"는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내, 안구내/유리체내, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 이러한 투여 형태들 모두 본 발명의 범위 내인 것으로 명백하게 간주되지만, 투여 형태에 대한 일 예는 주사용, 특히 피하, 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적용 용액일 것이다. 주사용으로 적합한 약학적 조성물은 완충제, 계면활성제, 선택적으로 안정제 등을 포함할 수 있다. 말초 투여용 제제는 무균 수성 또는 비-수성 용액제, 현탁제 및 유제를 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 전형적으로 부적절한 오염물질로부터 실질적으로 순수하다. 이는, 물질이 전형적으로 제조 또는 정제시 기인한 간섭 단백질 및 기타 오염물질의 적어도 50% w/w 순도임을 의미하지만, 물질이 이의 이용을 용이하게 하기 위해 의도된 약학적으로 허용가능한 담체(들) 또는 기타 비히클 과량과 조합될 가능성을 배제하는 것은 아니다. 때로는, 단일클론 항체 (또는 다른 치료학적 물질)는 제조 또는 정제로부터 기인한 간섭 단백질 및 오염물질의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순도이다.

치료가능한 환자

또한, 본 발명은, 예를 들어 아밀로이드 생성 질환을 방지 또는 치료하기 위해, 환자에서 유익한 치료학적 반응 (예, Aβ의 식세포작용 유도, 플라크 부담 감소, 플라크 형성 저해, 신경돌기 이상증의 완화, 용해성 독성 Aβ 종의 중화, 인지 기능 개선 및/또는 인지 감퇴 반전, 치료 또는 예방)을 달성하는, 본 발명의 항체, 단편 및 약학적 조성물을 투여함으로써 알츠하이머 및 기타 아밀로이드 생성 질환을 치료하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아밀로이드 생성 질환을 치료 또는 방지하기 위한 약제의 제조에 있어 개시된 항체 및 단편의 용도에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 환자에서 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련한 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 아밀로이드 침착은 뇌 또는 기타 CNS 영역에 존재한다. 이러한 질환으로는 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 노화-관련 황반 변성 (AMD) 및 인지장애 등이 있다. 후자는 아밀로이드 생성 질환의 다른 특징을 동반하여 또는 비-동반하여 발생할 수 있다. 본 발명의 일부 방법은 환자에게 아밀로이드 침착물의 구성성분에 특이적으로 결합하는 항체를 유효량으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 방법에서 인간 환자에서 알츠하이머 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하다.

본 방법은 무증상 환자와 현재 질환 증상이 나타난 환자 모두에 이용할 수 있다. 이러한 방법에서 이용되는 항체는, 본원에 기술된 바와 같이, 인간화 항체, 인간 항체 또는 이의 단편 (예, 항원 결합 단편)일 수 있으며, 단일클론 또는 다클론 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩타이드로 면역화된 인간으로부터 제조된 항체의 투여를 특징으로 하며, 인간은 항체로 치료할 환자일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 항체를 약학적 담체와 함께 약학적 조성물로서 투여하는 것을 특징으로 한다. 대안적으로, 항체는 하나 이상의 항체 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 환자에 투여할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 환자에서 항체 쇄를 형성한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다. 예시적인 구현예에서, 환자에게 투여된 항체의 혈중 수준에 대해 환자를 모니터링한다.

치료가능한 환자는 질환 위험이 있지만 증상이 나타나지 않은 개체뿐 아니라 현재 증상이 나타난 환자를 포괄한다. 알츠하이머 질환의 경우, 잠재적으로, 충분히 장수한 사람은 알츠하이머 질환 위험을 가지고 있다. 따라서, 본 방법은 대상 환자의 위험을 평가할 필요없이 일반 대중에게 예방학적으로 투여하는 것을 포함한다. 본 방법은 알츠하이머 질환의 알려진 유전학적 위험을 가진 개체에 특히 유용하다. 이러한 개체로는 이러한 질환을 경험한 친적이 있는 개체, 그리고 유전학적 또는 생화학적 마커 분석에 의해 결정되는 위험을 가진 개체를 포함한다. 알츠하이머 질환에 대한 유전학적 위험 마커는 APP 유전자에서의 돌연변이, 특히 Hardy 및 Swedish 돌연변이로 각각 언급되는 717번 위치와 670 및 671번 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 다른 위험 마커로는 presenilin 유전자에서의 돌연변이, PS1 및 PS2, 및 ApoE4, AD 가족력, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증이 있다. 현재 알츠하이머 질환을 앓고 있는 개체는 특징적인 치매뿐 아니라 전술한 위험 인자의 존재에 의해 인지할 수 있다. 아울러, 여러가지 진단 검사들 역시 AD 개체를 식별하는데 이용가능하다. 이는 CSF tau 및 Aβ42 수준 측정을 포함한다. tau 수준 상승 및 Aβ42 수준 감소는 AD의 존재를 의미한다. 알츠하이머 질환을 앓고 있는 개체는 실시예에 기술된 바와 같이 ADRDA 기준에 의해 진단할 수도 있다.

무증상 환자에 대한 치료는 임의 연령 (예, 10세, 20세, 30세)에 개시할 수 있다. 그러나, 통상적으로, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세에 이를 때까지 치료 개시는 필요하지 않다. 치료는 전형적으로 일정 기간 동안에 걸친 수회 투여를 수반한다. 치료는 항체 수준을 경시적으로 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 만일 반응이 감소하면, 부스터 투여가 지시된다. 잠재적인 다운증후군 환자의 경우, 치료학적 물질을 모체에 투여함으로써 출산 전 치료를 개시할 수 있거나 또는 출생 직후에 개시할 수 있다.

생체내 검출

다른 측면에서, 본 발명은 아밀로이드 생성 질환을 앓고 있거나 또는 발병 위험이 있는 환자에서 아밀로이드 플라크 및 침착을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 아밀로이드 생성 질환 또는 이의 감수성을 진단 또는 확증하는데 유용하다. 예를 들어, 이러한 방법은 치매 증상이 있는 환자에 적용할 수 있으며, 비정상적인 아밀로이드 침착이 관찰된 결과는 알츠하이머 질환 가능성을 의미한다. 또한, 이러한 방법은 무증상 환자에도 적용할 수 있다. 비정상적인 아밀로이드 침작물 존재는 향후 증상성 질환에 대한 감수성을 의미한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 개체/환자에 투여하는 단계, 및 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출하는 단계를 포함한다.

항체 및/또는 이의 항체 단편은 가시화할 조직으로의 전달을 달성하는 임의의 적절한 수단에 의해 투여할 수 있으며, 예를 들어 환자 신체에 정맥내 주사에 의해 또는 두개강내 주사에 의해 뇌로 직접 투여될 수 있다. 항체 및/또는 이의 단편의 투여량은 치료학적 용량, 치료학적 용량보다 낮은 용량 (subtherapeutic dose) 또는 치료학적 용량을 초과하는 용량 (supratherapeutic dose)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 표지되며, 형광 표지 물질, 상자성 표지 물질 또는 방사성 표지 물질을 포함한다. 표지 물질의 선정은 검출 수단에 따라 결정된다. 예를 들어, 형광 표지 물질은 가시적 검출에 적합하다. 상자성 표지 물질은 외과적 개입 없이 단층 촬영 검출을 수행하는데 적합하다. 일부 구현예에서, 방사성 표지 물질은 양전자 방출 단층촬영술 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 이용해 검출한다.

다른 측면에서, 본 발명은 아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 투여하고 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편의 1차 함량을 검출함으로써, 치료하기 전 개체에서 아밀로이드 플라크의 1차 수준을 측정한다. 그런 후, 개체에 치료를 실시한 다음 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출하여, 개체에서 아밀로이드 플라크의 2차 수준을 측정한다. 일부 구현예에서, 아밀로이드 플라크의 수준 감소는 치료에 대한 긍정적인 반응을 의미하고, 일부 구현예에서, 아밀로이드 플라크 수준에 변화가 없거나 또는 아밀로이드 플라크의 소폭 증가는 치료에 대한 긍정적인 반응을 의미한다. 일부 구현예에서, 아밀로이드 플라크의 수준은 본원에 기술된 아밀로이드 플라크 검출 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

일부 구현예에서, 아밀로이드 생성 질환의 진단은, 예를 들어, 측정한 1차 수준 (즉, 베이스라인)을 개체에서 아밀로이드 플라크에 대한 후속적인 2차 수준과 표지된 위치들의 개수, 크기 및/또는 강도 측면에서 비교함으로써, 수행할 수 있다. 경시적인 증가는 질환 진행을 의미하고, 비-변화는 의미하고, 경시적인 아밀로이드 플라크의 개수 또는 강도가 매우 낮은 것은 관해를 의미한다.

치료 용법

예방학적 용도: 약학적 조성물 또는 의약제는 알츠하이머 질환 또는 기타 아밀로이드 생성 질환에 걸리기 쉽거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 질환, 이의 합병증 및 질환 진행 중에 나타나는 중간 병리학적 표현형 (intermediate pathological phenotype)의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동 증상을 비롯한 질환 위험을 소거 또는 낮추거나, 중증성을 약화시키거나 또는 개시를 지연하기에 충분한 양으로 투여된다. 아밀로이드 생성 질환에 대한 환자 감수성 또는 위험은, 예를 들어, 유전자 마커, 생화학적 마커, 불특정 유전학적 위험 또는 기타 수단으로부터 결정할 수 있다. 치료학적 용도의 경우, 조성물 또는 의약제는 합병증 및 질환 진행시의 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 (생화학적, 조직학적 및/또는 거동) 증상을 치유하거나 또는 적어도 일부 중단하기에 충분한 양으로 이러한 질환을 앓고 있는 것으로 의심되거나 또는 이미 앓고 있는 환자에게 투여된다.

일부 구현예에서, 물질의 투여는 특징적인 알츠하이머 또는 기타 아밀로이드 생성 질환 인지 병태가 아직 발병하지 않은 환자에서 인지 장애를 완화하거나 또는 제거한다. 치료학적 또는 예방학적 치료를 달성하기에 충분한 양은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로서 정의된다. 예방학적 용법 및 치료학적 용법 둘다에서, 물질은 일반적으로 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 투여량을 수회로 투여하며, 여기서 "면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 수용 개체에서 항원에 대한 체액성 (항체 매개) 및/또는 세포성 (항원-특이적인 T 세포 또는 이들의 분비 산물에 의해 매개됨) 반응의 전개를 포함한다. 이러한 반응은 능동 반응, 즉 면역원의 투여에 의해 유발되는 반응이거나, 또는 수동 반응, 즉 면역글로불린 또는 항체 또는 감작된 T 세포의 투여에 의해 유발되는 반응일 수 있다.

일부 구현예에서, 항체는 수회로 투여된다. 단일 투여량의 투여 간격은 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 Aβ에 대한 혈중 항체 수준을 측정함으로써 확인되는 바에 따라 비정기적일 수 있다. 일부 방법의 경우, 투여량은 혈장 항체 농도 1-1000 ㎍/ml이 달성되도록, 다른 방법의 경우 25-300 ㎍/ml이 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 (sustained release) 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 투여 횟수가 더 적어진다. 투여량 및 횟수는 환자에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 반감기가 가장 길고, 그 다음이 인간화 항체, 키메라 항체 및 비-인간 항체이다.

투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방학적인지 또는 치료학적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방학적 용도의 경우, 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 함유한 조성물은 환자의 내성을 강화하기 위해 질환 상태가 아닌 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 재차 환자의 건강 상태 및 전반적인 면역에 따라 결정되지만, 일반적으로 투여 당 0.1 내지 25 mg/kg, 특히 투여 당 0.5 내지 2.5 mg/kg 범위이다. 상대적으로 낮은 투여량은 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 여생 동안 치료제를 계속 투여받는다.

치료학적 용도의 경우, 때로는 질환의 진행이 완화되거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상에 대해 일부 또는 완전 개선을 나타낼 때까지, 상대적으로 높은 투여량 (예, 투여 당 약 0.5 내지 300 mg/kg, 투여량 5 내지 25 mg/kg이 보다 일반적으로 사용됨)이 비교적 짧은 간격 동안 필요할 수도 있다. 이후에는 환자에게 예방학적 용법을 실시할 수 있다.

투여: 치료학적 물질은 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개강내, 복막내, 비강내, 안내 또는 근육내 수단에 의해 투여할 수 있다. 근육내 주사는 가장 전형적으로 팔 또는 다리 근육에서 수행된다. 일부 방법의 경우, 물질은 침착물이 축적된 특정 조직에, 예를 들어 두개강내 주사에 의해 직접 주사한다. 항체 투여시 근육내 주사 또는 정맥내 주입이 바람직하다. 일부 방법의 경우, 특정 치료 항체는 두개골에 직접 주사한다. 일부 방법의 경우, 항체는 지속 방출 조성물로서 또는 기구를 통해 투여한다.

본 발명의 물질은 선택적으로 아밀로이드 생성 질환을 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 물질과 조합하여 투여할 수도 있다. 뇌에 아밀로이드가 침착되는 알츠하이머 및 다운 증후군의 경우, 본 발명의 물질은 또한 혈액-뇌 장벽을 통해 본 발명의 물질의 통과를 증가시키는 다른 물질과 조합하여 투여할 수도 있다.

본 발명은 아래 비-제한적인 실시예를 들어 보다 충분히 설명될 것이다.

서열번호 40: huIgG1 불변 영역

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 41: huKappa 불변 영역

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 42: h2726_VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

GAAGTGCAGCTTCTGGAGAGCGGGGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGTGCCGCGTCCGGTTTTACCTTCTCCAACTACGGAATGTCATGGGTCCGCCAAGCACCCGGAAAGGGATTGGAATGGGTGGCTTCGATCCGGTCCGGCTCGGGACGGACCTACTACTCCGATAACGTCAAGGGCAGATTCACTATTAGCCGGGACAACAGCAAGAATACCCTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGTGCGCTACGACCACTACTCGGGTTCCTCTGATTACTGGGGACAGGGGACCCTCGTGACTGTGTCAAGC

서열번호 43: h2726_VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACCCAGTCACCACTGTCCCTTCCTGTGACTCCCGGAGAACCGGCGTCCATTTCGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGCTCGATTATGACGGAAAGACCTACCTGAACTGGTTGCTCCAAAAGCCTGGGCAGAGCCCCCAGAGACTGATCTACAAAGTGTCCAACAGGGACTCGGGCGTGCCGGACCGCTTCTCGGGGTCCGGTTCCGGTACCGACTTTACGCTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGCACTCACTTCCCGCGGACCTTCGGACAAGGCACCAAGGTCGAGATCAAG

서열번호 44: h2931_VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

GAAGTGCAGCTCCTGGAGTCCGGGGGTGGACTGGTGCAGCCCGGGGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCGTCAGGATTCACCTTCTCCAACTTCGGAATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCGGGAAAGGGCCTTGAATGGGTGGCTAGCGTGCGCTCCGGTTCCGGACGGACCTACTACTCGGACAACGTGAAGGGCCGGTTTACTATCTCCCGGGACAATTCGAAGAACACCCTGTACCTCCAAATGAACTCCTTGCGCGCCGAGGATACCGCAGTGTATTACTGCGTGCGCTACGACCACTACTCTGGCACTAGCGATTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTCACCGTGTCGTCA

서열번호 45: h2931_VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCACCTCTGTCCCTGCCTGTGACCCTTGGGGAACCCGCCTCGATCTCGTGCAAGAGCTCCCAGAGCCTGCTCGACTATGATGGAAAGACCTACCTGAACTGGTTGCTCCAAAAGCCGGGCCAGAGCCCCCAGAGGCTGATCTACCGCGTGACCAACCGCGACACCGGGGTGCCGGACCGGTTCTCCGGATCCGGCAGCGGCACTGACTTCACCCTGAAAATTTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGTACTCACTTTCCACGGTCCTTCGGTCAAGGAACCAAGGTCGAGATCAAG

서열번호 46: h2731_VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 47: h2731_VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 48: h2831_VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

GAAGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGGGGATCCCTGCGGCTTTCCTGCGCCGCATCCGGCTTCACCTTTTCAAACTTCGGAATGTCGTGGGTCAGACAGGCCCCGGGAAAGGGTCTGGAATGGGTGGCCTCAGTGCGGTCCGGATCGGGTAGAACCTACTACAGCGATAACGTGAAGGGCCGGTTCACGATCTCCCGCGACAACTCCAAGAACACCCTGTACTTGCAAATGAATAGCCTCAGGGCTGAGGATACCGCGGTCTACTACTGTGTGCGCTATGACCACTACACTGGAACTAGCGACTACTGGGGCCAGGGGACCCTCGTGACTGTGTCGTCC

서열번호 49: h2831_VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 50: h2926_VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 51: h2926_VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 52: h4921G VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCGGGGGGGGGACTCGTGCAGCCCGGGGGCTCCCTGAGACTCTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACTTTTTCAAACTTCGGAATGTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGAAAGGGTCTGGAATGGGTCGCCAGCGTGCGGTCCGGCGGCGGACGGACTTACTACTCCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCAAGGGATAACTCCAAGAATACTCTGTACTTGCAAATGAACTCGCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTACTATTGCGTGCGCTACGACCACTACTCCGGTACCAGCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTTGTGACCGTGTCGAGC

서열번호 53: h4921G VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCGCCCCTCTCCCTGCCTGTGACTCTGGGGGAACCCGCGTCCATTTCGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGTTGGACTCAGACGGAAAGACCTACCTTAACTGGCTGCTGCAAAAGCCAGGACAGAGCCCGCAGAGGCTGATCTACCGCGTGACCAACCGGGATACGGGAGTGCCGGACAGATTCAGCGGCTCGGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTCAAAATCTCCCGCGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTATTACTGTTGGCAGGGAACCCACTTTCCTCGGACCTTCGGTCAAGGGACTAAGGTCGAAATCAAG

서열번호 54: h2826 VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 55: h2826 VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 56: h2929 VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 57: h2929 VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACCCAAAGCCCCCTGTCCCTCCCTGTGACTCCTGGAGAGCCGGCGTCCATTTCCTGCCGGTCAAGCCAGTCCTTGGTGGACTACGACGGAAAGACCTACCTCAACTGGCTGCTGCAGCGCCCCGGGCAGTCGCCGCAGCGGCTTATCTACAAAGTGTCCAACCGCGACTCGGGCGTGCCGGATAGGTTTTCGGGTTCCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAAATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGTTCTCACTTCCCACGGTCATATGGCCAAGGGACTAAGGTCGAAATCAAG

서열번호 58: h3818G VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

GAAGTGCAGCTCCTGGAGTCCGGCGGTGGACTGGTGCAGCCGGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCGTCGGGCTTTACTTTCGCAAATTACGGCATGAGCTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGAAGGGTCTGGAATGGGTGGCCAGCGTCCGGAGCGGGGGATCCCGGACCTATTACTCCGACAACGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCAAGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACTTGCAAATGAACAGCCTTCGGGCTGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGTGCGCTACGACCACTACTCCGGATCCTCGGATTACTGGGGACAGGGAACCCTCGTGACCGTGTCATCG

서열번호 59: h3818G VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCGCCCCTCTCCCTGCCTGTGACTCTGGGGGAACCCGCGTCCATTTCGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGATGGACACCGACGGAAAGACCTACCTTAACTGGCTGCTGCAAAAGCCAGGACAGAGCCCGCAGAGGCTGATCTACAAAGTGTCAAACCGGGAGTCCGGAGTGCCGGACAGATTCAGCGGCTCGGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTCAAAATCTCCCGCGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTATTACTGTTGGCAGGGAACCCACTTTCCTCGGACCTTCGGTCAAGGGACTAAGGTCGAAATCAAG

서열번호 60: h2927 VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 61: h2927 VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCACCGCTCTCCCTCCCTGTGACCCCGGGCGAACCAGCGTCGATCTCCTGCAAGAGCAGCCAATCATTGCTGGACTACGACGGAAAGACCTATCTTAACTGGCTGCTGCAGAAGCCCGGGCAGAGCCCGCAGCGCCTGATCTACAAAGTGTCCAACAGAGACTCCGGAGTGCCTGATAGGTTCTCGGGTTCCGGCTCCGGTACCGACTTCACTCTGAAAATTTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGCACCCACTTCCCCCGGTCGTTTGGACAAGGGACCAAGGTCGAGATCAAG

서열번호 62: h49K3G VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 63: h49K3G VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCGCCCCTCTCCCTGCCTGTGACTCTGGGGGAACCCGCGTCCATTTCGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGTTGGACTCAGACGGAAAGACCTACCTTAACTGGCTGCTGCAAAAGCCAGGACAGAGCCCGCAGAGGCTGATCTACAAAGTGTCAAACCGGGATTCCGGAGTGCCGGACAGATTCAGCGGCTCGGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTCAAAATCTCCCGCGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTATTACTGTTGGCAGGGAACCCACTTTCCTCGGACCTTCGGTCAAGGGACTAAGGTCGAAATCAAG

서열번호 64: h4917G VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 65: h4917G VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

GATGTCGTGATGACTCAGTCGCCCCTCTCCCTGCCTGTGACTCTGGGGGAACCCGCGTCCATTTCGTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTGTTGGACTCAGACGGAAAGACCTACCTTAACTGGCTGCTGCAAAAGCCAGGACAGAGCCCGCAGAGGCTGATCTACAAAGTGACCAACCGGGAGTCCGGAGTGCCGGACAGATTCAGCGGCTCGGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTCAAAATCTCCCGCGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTATTACTGTTGGCAGGGAACCCACTTTCCTCGGTCATTCGGTCAAGGGACTAAGGTCGAAATCAAG

서열번호 66: h2727 VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 67: h2727 VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 68: h4918G VH (가변적인 중쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 69: h4918G VL (가변적인 경쇄) 뉴클레오티드 서열

서열번호 70: 아두카누맙 중쇄:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 71: 아두카누맙 경쇄:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 72: 바피뉴주맙 HC (중쇄)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 73: 바피뉴주맙 VH (가변적인 중쇄)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSS

서열번호 16: VH CDR1 GFTFSNYGMS

서열번호 17: VH CDR2 SIRSGGGRTYYSNDYNVKG

서열번호 18: VH CDR3 YDHYSGSSDY

서열번호 77: 바피뉴주맙 LC (경쇄)

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 78: 바피뉴주맙 VL (가변적인 경쇄)

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIK

서열번호 26: VL CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLN

서열번호 27: VL CDR2 LVSSKLDS

서열번호 28: VL CDR3 WQGTHFPRT

서열번호 82: 간테네루맙 HC 아미노산 서열:

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 83: 간테네루맙 LC 아미노산 서열:

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 84: 아밀로이드 베타 (Aβ) 1-42:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

서열번호 85: 아밀로이드 베타 (Aβ) 전구체 단백질:

MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADT이분자GSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN

서열번호 86: huIgG1 불변 영역 뉴클레오티드 서열

GCCAGCACTAAGGGGCCTAGCGTCTTTCCGCTGGCCCCGTCCTCCAAGTCCACTTCGGGTGGAACCGCGGCACTGGGGTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCGGTCACCGTGTCCTGGAACTCGGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCTGCGGTGCTGCAGTCCTCCGGGCTCTACTCGCTGTCAAGCGTGGTCACCGTCCCGAGCTCATCCCTGGGTACTCAGACCTACATTTGCAACGTGAACCACAAACCTTCCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCGTGTCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTCTTCCCGCCTAAGCCGAAGGACACTCTGATGATCTCGAGAACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCGGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTGGAAGTCCATAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACTCAACTTACCGGGTGGTGTCAGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCGCTGCCGGCCCCCATTGAAAAGACCATCAGCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTCTACACCTTGCCCCCTTCCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAAGTGTCGCTGACGTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCATCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTACAAGACTACCCCGCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCGTTCTTCCTGTATTCCAAGCTCACCGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCCCTTTCCCCCGGAAAGTAA

서열번호 87: huKappa 불변 영역 뉴클레오티드 서열

CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA

실시예

아래 실시예들은 본원에 기술된 방법을 예시하기 위해 기술된다. 아래 실시예들에 대한 특정 측면은 본원에 기술된 실무에서 잘 작동하기 위해 본 발명의 공동 발명자가 인지하거나 또는 발견한 기법 및 공정 관점에서 기술된다. 본 발명 및 당해 기술 분야의 일반적인 기술 수준에 비추어, 당업자라면 아래 실시예들이 단순 예로서 의도된 것일뿐, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 여러가지 변화, 수정 및 변형을 채택할 수 있음을, 알 것이다.

이들 실험에서 사용되는 바와 같이, "아두카누맙" 또는 "Adu"는 서열번호 70의 중쇄 및 서열번호 71의 경쇄를 가지며, 미국 특허 공개번호 US 2015/0315267 및 PCT 공개 번호 WO 2014/089500에 기술된 것과 같은 항체를 지칭한다.

이들 실험에서 사용되는 바와 같이, "BAN-2401" 및 "간테네루맙 (gantenerumab)"은 예를 들어 유럽 특허번호 EP 1960428B1에 기술된 바와 같이, 서열번호 79의 중쇄 및 서열번호 80의 경쇄를 가진 항체를 지칭한다.

하기 방법들에서, 응집된 또는 피브릴 Aβ에 대한 항체 결합 프로파일은 ELISA, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및 면역조직화학 (IHC)에 의해 규명한다. 식세포작용에 의해 플라크 소거를 매개하는 능력은 APP/PS1 형질전환 마우스 뇌 및 일차 뮤라인 미세아교세포를 함유한 AD 뇌에서 면역형광, ELISA 및 MSD 정량화에 의해 생체외에서 평가하고, Aβ 올리고머 뉴런 결합에 대한 중화는 랫 일차 해마 배양물에 조사한다.

본원에 제시된 결과: 다른 N-말단 Aβ 항체 요법 (바피뉴주맙, 아두카누맙)에 비해, 본 발명의 mAb는 경쟁적인 또는 표준 결합 ELISA에서 응집된 Aβ 및 피브릴 Aβ에 대해 우수한 겉보기 친화성 (apparent affinity)을 나타내었다. 본 발명에 따른 mAb의 피브릴 Aβ에 대한 강화된 항원항체 결합성은 SPR 평형 결합 동역학에 의해 검증되었으며, 더 느린 해리-속도 동역학으로 인해 아두카누맙보다 항원항체 결합성이 5-11배 더 높았다. 인간 AD 뇌 냉동 조직 단편에 대해 IHC 용량 반응을 평가한 결과, 검사한 개별 AD 기증 조직과 상관없이, 아두카누맙보다 겉보기 친화성 및 플라크 영역 결합성이 더 우수하였다. 생체외 활성 분석에서, 본 발명의 mAb는 APP/PS1 마우스 조직에서 미세아교세포의 식세포작용에 의한 Aβ 플라크 감소를 유의하게 촉진하고, 농도-의존적인 방식으로 랫 일차 뉴런에 용해성 Aβ 올리고머가 결합하는 것을 차단하는 것으로 입증되었다. 인간 AD 뇌를 이용한 생체외 기능성 분석에서, 본 발명의 mAb는 노인반의 번역 후 변형된 성분인 피로글로타밀화된 Aβ의 소거를 유의하게 촉진하는 것으로 입증되었다.

실시예 1. Aβ 항체 설계

Aβ 항체 바피뉴주맙 (hBP)은 모 뮤라인 항체 3D6으로부터 개발된 인간화 항체이다. 본원에서, 우수한 hBP 항체를 구축하기 위해 다각적인 방식을 활용하였다. hBP의 인간화를 분석하였으며, 경쇄 인간화를 최적화할 수 있는 것으로 확정되었다.

hBP의 대략적인 구조 모델을 제공하기 위한 구조를 찾기 위해 PDB 데이터베이스 [Deshpande et al, 2005]에서 단백질 서열을 검색하였다. hBP fab PDB code 4HIX의 결정 구조 [Miles, et al., 2013]가 허용가능한 해상도 (2.2 Å)를 가지고 hBP Vh 및 Vk와 서열이 정확하게 일치하여 루프에 대해 동일한 정규 구조를 유지하고 있어, Vh 및 Vk 구조에 대해 이를 활용하였다.

입력 서열로서 hBP VL에 대해 IMGT/DomainGapAlignment를 수행하였다. 인간 생식계열 VK 서열 IGHV2-30*02가 hBP VL에 대한 매칭성이 가장 높았다. hBP VL의 프래임워크는 IGHV2-30*02의 대응되는 프래임워크 영역과 높은 수준의 서열 유사성을 공유하였다. 이에, hBP 프래임워크 영역을 추가로 최적화하기 위한 안내 서열로서 IGHV2-30*02 VL의 프래임워크 영역을 선정하였다. 아울러, hBP 3D 구조에서 항원과 어떠한 직접적인 접촉을 형성하지 않는 CDR-L2 내 잔기 3종 역시 생식계열 서열로 바꾸었으며, 다음과 같은 변형, L50K, K53N 및 L54R (Kabat)을 수행하였다.

인간 생식계열 프래임워크 잔기를 hBP VL 서열과 조합하여 VL 버전 3종을 설계하였다. 정규 잔기나 계면 잔기는 바꾸지 않았다. 설계한 VK 버전들을 정렬하여 도 1에 나타낸다.

P15가 턴 위치에 위치하고, 생식계열 유전자의 경우 이 위치에 Leu이 존재한다는 구조 관찰 결과에 기반하여, 가변성 경쇄의 한가지 버전에서 P15L을 검사하였다.

3D 구조 관찰 결과를 토대로, 경쇄 및 중쇄 CDR 및 프래임워크 내 다수 잔기에서 치환을 설계하였다. 총 경쇄 30종 및 중쇄 32종으로, VL 및 VH 돌연변이 버전들을 구축하였으며, 합리적 설계 제1 라운드에서 결합성을 조사하였다. 결합 개선을 나타낸 돌연변이들은 제2 라운드 합리적 설계에서 조합하였다. 또한, 추가적인 구조 분석에 의해 도출된 새로운 돌연변이 역시 설계에 조합하였다.

CDR-H1 내 다음과 같은 위치, 즉 T28, S30, N31, Y32 및 G33 (Kabat)에 대해 돌연변이 유발에 기반한 합리적인 설계를 수행하였다. CDR-H2 위치 I51, G53, G54, T57, S60, D61 및 N62 역시 돌연변이를 유발하였다 (Kabat). CDR-H3 위치 D96, H97, S99, S100a 및 Y102에 대해 합리적 돌연변이 유발을 수행하였다 (Kabat).

가변성 경쇄의 경우, CDR-L1 위치 K24, L27c, D27d 및 S27e (Kabat)에서 다중 치환을 시도하였다. 경쇄 CDR-L2 위치 K53 및 L54에는 지향성 및 제한적인 돌연변이 유발을 수행하였다 (Kabat). CDR-L3 위치는 치환하지 않았다.

프래임워크 영역 내 몇몇 선택 위치에서도 중쇄 및 경쇄에 대한 합리적인 돌연변이 유발을 수행하였다.

추가적인 중쇄 변이체 57종 및 경쇄 변이체 33종을 설계하였으며, 인간 가변성 중쇄 및 경쇄의 데이터베이스 분석에 의한 컴퓨터 학습에 기반하여 질의 서열-특이적인 변화를 제시하는 Atum GPSpro 소프트웨어를 이용해 분석하였다.

가변적인 중쇄 도메인의 경우, A24, S25, G26, F27, T28, F29, S30, N31, Y32, G33 및 M34 위치에서 여러가지 치환을 설계하여 분석하였다 (Kabat). 이들 위치 대부분이 CDR-H1에 위치하였다. 마찬가지로, 위치 A49, S50, I51, R52, S52a, G53, G54, G55, R56, T57, Y58, Y59, S60, D61, N62, V63 및 K64 (Kabat)와 같은 CDR-H2 잔기 여러 곳에서도 돌연변이를 유발하였다. 아울러, CDR-H3 내 아미노산, 예를 들어, 위치 V93, R94, Y95, D96, H97, Y98, S99, G100, S100a, S100b, D101 및 Y102 (Kabat)에서 다중 치환을 수행하였다.

경쇄 CDR-L1 위치 K24, S25, S26, Q27, S27a, L27b, L27c, D27d, S27e, D28, G29, K30, T31, Y32, L33 및 N34 (Kabat)에서도 다중 치환을 설계하였다. CDR-L2의 경우, L50, V51, S52, K53, L54, D55 및 S56 (Kabat) 위치에 돌연변이를 유발하였다. Q90, G91, T92, H93, F94, P95, R96 및 T97 등의 CDR-L3 위치 대부분을 복수의 아미노산으로 합리적으로 치환하였다 (Kabat).

합리적 및 GPSpro 설계로부터 생성된 변이체 항체들 모두 발현, 융점 (Tm), 친화성 및 항원항체 결합성에 대해 분석하였다. 전술한 분석에 기반하여 추가로 분석하기 위해, 합리적 설계로부터 항체 8종을, 컴퓨터 학습 캠페인으로부터 항체 6종을 선정하였다.

실시예 2. 경쟁적인 ELISA 분석에 의한 IC ₅₀ 비율 결정.

항원-코팅된 플레이트에서의 표지된 항체의 결합 경쟁 (저해)에 기반한 분석을 이용해, 본 발명의 항체에 대해 IC₅₀을 결정하였다.

피브릴을 구축하기 위해, HFIP (헥사플루오로이소프로판올)로 사전 처리한 다음 건조한 Aβ 1-42 폴리펩타이드를 DMSO에 5 mM로 재현탁한 후, 10 mM HCl을 이용해 100 μM로 추가로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하여 용해성 및 피브릴 종들을 분리하였다. 펠릿을 1x D-PBS에 본래의 부피로 재현탁하고, 사용전 초음파 처리하였다.

플레이트를 0.5 mg/ml 피브릴 Aβ 42로 코팅하고, 예를 들어 1% BSA/ PBS를 이용해 차단 처리하였다. 0.1% BSA/PBS 중에 준비한, 150 ㎍/ml (75 ㎍/ml 최종 농도)로부터 시작되는 hBP 3배 연속 희석물 7종을, 20 ㎍/ml (10 ㎍/ml 최종 농도)로부터 시작되는 검사 항체 3배 연속 희석물 4종을 웰에 3 세트로, 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 0.1% BSA/PBS 중에 준비한 0.75 ㎍/ml (0.35 ㎍/ml 최종 농도) hBP-바이오틴 50 ㎕를 모든 웰에 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 플레이트를 인큐베이션한 후, TTBS로 3회 헹구었다. 1/10,000으로 희석한 GE 스트렙타비딘 HRP 100 ㎕를 첨가하여 30분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 플레이트를 TTBS로 6회 헹구었다. Thermo Fisher o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (OPD) 기질을 제조사 지침에 따라 신선하게 준비하여, 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 반응물을 15분간 인큐베이션하고, 2N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. Spectromax 490 nm에서 샘플을 판독하였다. 도 2, 도 3 및 도 4는 4918, 4917, 4921, 3818, 49human3, 2931 및 바피뉴주맙 대조군 (도 2), 2926, 2831, 2927, 2726, 2731, 2826 및 바피뉴주맙 대조군 (도 3) 및 2727, 2929 및 바피뉴주맙 대조군 (도 4)에 대한 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 예시한다. 각 검사 항체들의 IC₅₀은 hBP의 IC₅₀으로 나누어, 최대 저해 농도의 1/2 농도 (IC₅₀) 비율을 수득하였다. 비율 1<은 hBP보다 성능이 우수함을 의미한다. 표 2를 참조한다.

항체	피브릴 Aβ42 IC₅₀ 비율에 대한 경쟁적인 ELISA (검사체:hBP)
h2931	0.59
h2731	0.61
h2726	0.68
h2831	0.77
h2926	0.99
h4921	1.01
h2826	1.10
h2929	1.16
h3818	1.18
h2927	1.60
h49_hum3	2.16
h49_VK17	2.69
h2727	3.06
h4918	ND
hBP	1

실시예 3. 경쟁적인 ELISA에 의한 단일클론 항체의 효력 결정

응집된 Aβ42에 결합하는 바이오틴화된-바피뉴주맙과 경쟁하는 능력을 경쟁적인 ELISA에 의해 분석함으로써, 본 발명의 일부 단일클론 항체의 결합 효력을 측정하였다. Aβ 42 1 mg을 diH₂O 1 ml에 첨가하여 왕성하게 볼텍싱한 다음 교반기 위에서 실온에서 48시간 동안 두었다. 플레이트를 0.5 mg/ml 이종적인 Aβ 42 응집 혼합물로 코팅하고, 예를 들어 1% BSA/PBS로 차단 처리하였다. 150 ㎍/ml (hBP-바이오틴으로 희석한 후 75 ㎍/ml)로부터 시작되는 hBP 3배 연속 희석물 7종을, 20 ㎍/ml (hBP-바이오틴으로 희석 후 10 ㎍/ml)로부터 시작되는 검사 항체 3배 연속 희석물 4종을 웰에 3 세트로, 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 0.75 ㎍/ml (희석 후 0.35 ㎍/ml) hBP-바이오틴 50 ㎕를 모든 웰에 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 플레이트를 인큐베이션한 후 TTBS로 3회 헹구었다. 1/10,000으로 희석한 GE 스트렙타비딘 HRP 100 ㎕를 첨가하여 30분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 플레이트를 TTBS로 6회 헹구었다. Thermo Fisher o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (OPD) 기질을 제조사 지침에 따라 신선하게 준비하여, 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 반응물을 15분간 인큐베이션하고, 2N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. Spectromax 490 nm에서 샘플을 판독하였다. 도 5A는 2931, 2731 및 바피뉴주맙 대조군에 대한 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를; 도 5B는 2726, 2831 및 바피뉴주맙 대조군에 대한 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 도시한다. 도 20A는 2931, 2731 및 바피뉴주맙 대조군에 대한 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 (표 3, 제1-2열에 나타낸 데이터); 도 20B는 2831, 2726 및 바피뉴주맙 대조군에 대한 경쟁적인 ELISA 분석 그래프를 (표 3, 제4-5열에 나타낸 데이터) 도시한다. 도 20A 및 도 20B에서, 곡선 및 수득한 IC50 추정치는 데이터의 비-선형 3-매개변수 최소 자승 피트를 나타낸다. 각각의 점은 샘플 3 세트의 평균이다 (변동 계수 <20%).

mAb	Bapi	h2931	h2731
IC₅₀ (㎍/mL mAb)	15.04	6.901	5.024

mAb	Bapi	h2726	h2831
IC₅₀ (㎍/mL mAb)	21.83	9.049	9.907

그 결과, 항체 2931, 2731, 2726 및 2831은 hBP보다 효력이 우수하였으며; IC₅₀ 값이 hBP에 비해 ~2-4배 더 낮았다.

실시예 4. BIAcore에 의한 인간화 mAb 또는 Fab의 특징 규명

재조합 Aβ₁ _-42 피브릴에 대한 인간화 항체 또는 인간화된 항원 결합 단편 (Fab)의 결합 특성을 비교하기 위해, BIAcore T200 (GE Life Sciences)을 이용해 분석하였다.

피브릴을 구축하기 위해, HFIP (헥사플루오로이소프로판올)로 사전 처리한 다음 건조한 Aβ₁ _-42 폴리펩타이드를 DMSO에 5 mM로 재현탁한 후, 10 mM HCl을 이용해 100 μM로 추가로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하여 용해성 및 피브릴 종들을 분리하였다. 펠릿을 D-PBS에 본래의 부피로 재현탁하고, 사용전 초음파 처리하였다.

피브릴을 센서 칩 M5 (GE Healthcare Life Sciences)에 아민 커플링을 통해 분석물 최대 결합 단위 대략 100 RU이 확보되는 수준으로 고정하였다. 항체 또는 Fab를 다양한 농도 (범위 1 nM 내지 100 nM)로 커플링된 리간드를 통해 전개 완충제 (HBS + 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) 중에 30 ㎕/min 속도로 결합 시간 300s 및 해리 시간 1200s로 통과시켰다. 칩 표면은 10 mM 글리신-HCl (pH 1.7)을 2회 주입하여 재생시켰다. 리간드 비-함유 센서 및 0 nM 농도의 분석물 둘다에 대해 데이터를 블랭크-공제하였다. BIAcore Insight 평가 소프트웨어 (v2.0)에서 0 RU로 설정된 벌크 굴절률로 이용해 글로벌 1:1 피트로 분석하였다. 해리-속도 데이터 (k_diss; kd)를 표 4 (Fab) 및 표 6 (항체)에 나타낸다.

마찬가지로, h2726, h2731, h2831 및 h2931 Fab 및 항체에서는, 유의하게 높은 해리 상수가 입증된 아두카누맙과 비교해 낮은 해리 상수가 관찰되었다.

주입 변수 분석물 1 용액	1:1 결합 ka (1/Ms)	kd (1/s)	겉보기 KD (M)	Rmax ( RU )
h2726	1.29e+5	2.59e-4	2.01e-9	133.5
h2731	1.29e+5	2.89e-4	2.24e-9	134.0
h2831	1.08e+5	2.48e-4	2.31e-9	127.1
h2931	1.23e+5	1.99e-4	1.62e-9	132.0
hBP	1.12e+5	6.00e-4	5.34e-9	116.1

실시예 5. BIAcore에 의한 인간화 mAb 겉보기 친화성 규명

Aβ₁ _-28 (Bachem, Torrance, CA)에 대한 후보 항-Aβ의 결합 친화성을 Biacore T200을 이용해 결정하였다. 항-인간 Fc 항체를 아민 커플링을 통해 CM3 센서 칩 (GE Healthcare Life Sciences)에 고정하고, 이를 이용해 Aβ 항체를 포획하였다.

다양한 농도의 Aβ₁ _-28 (분석물, 농도 범위: 100 nM - 0.39 nM, 각 희석 단계별 2배 연속 희석)를 포획된 리간드를 통해 전개 완충제 (HBS + 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) 중에 50 ㎕/min 속도로 결합 시간 240s 및 해리 시간 900s로 통과시켰다. 리간드를 함유하지 않은 비관련 센서 및 0 nM 농도의 분석물 함유 완충제 전개 둘다에 대해 데이터를 블랭크-공제하였다. BIAcore 평가 소프트웨어 (v3.0)를 이용해 글로벌 1:1 피트로 분석하였다.

겉보기 해리 상수 (KD)를 표 5에 나타낸 바, 본 발명의 mAb는 Aβ₁ _-28 단량체에 대해 4-7 nM의 결합 친화성을 나타내었다. 0.39 nM - 100nM 농도 범위에서 결합 센소그램을 도 6A (h2726), 도 6B (h2731), 도 6C (h2831) 및 도 6D (h2931)에 나타낸다.

주입 변수 포획 용액	분석물 1 용액	1:1 결합 ka (1/Ms)	kd (1/s)	겉보기 KD (M)	Rmax ( RU )
h2726	Aβ₁ _-28	9.23e+4	5.55e-4	6.01e-9	87.0
h2731	Aβ₁ _-28	1.19e+5	5.95e-4	5.01e-9	78.3
h2831	Aβ₁ _-28	7.31e+4	5.08e-4	6.95e-9	88.0
h2931	Aβ₁ _-28	9.47e+4	4.12e-4	4.35e-9	76.1

실시예 6. BIAcore에 의한 인간화 mAb의 겉보기 친화성 규명

재조합 Aβ₁ _-42 피브릴에 대한 인간화 항체의 결합 특성을 비교하기 위해, BIAcore T200을 이용해 분석하였다.

피브릴을 구축하기 위해, HFIP (헥사플루오로이소프로판올)로 사전 처리한 다음 건조한 Aβ₁ _-42 폴리펩타이드를 DMSO에 5 mM로 재현탁한 후, 10 mM HCl을 이용해 100 μM로 추가로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하여 용해성 및 피브릴 종들을 분리하였다. 펠릿을 1x D-PBS에 본래의 부피로 재현탁하고, 사용전 초음파 처리하였다.

피브릴을 센서 칩 M5 (GE Healthcare Life Sciences)에 아민 커플링을 통해 분석물 최대 결합 단위 대략 50 RU이 확보되는 수준으로 고정하였다. 항체를 다양한 농도 (범위 0.411 nM 내지 100 nM)로 커플링된 리간드를 통해 전개 완충제 (HBS + 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) 중에 30 ㎕/min 속도로 결합 시간 300s 및 해리 시간 1200s로 통과시켰다. 칩 표면은 10mM 글리신-HCl (pH 1.7)을 2회 주입하여 재생시켰다. 리간드 비-함유 센서 및 0 nM 농도의 분석물 둘다에 대해 데이터를 블랭크-공제하였다. BIAcore Insight 평가 소프트웨어 (v2.0)에서 0 RU로 설정된 벌크 굴절률로 이용해 글로벌 1:1 피트로 분석하였다. 겉보기 해리 상수 (KD)는 표 6에 나타내고, 100 nM에서 결합 비교 센소그램은 도 7에 나타낸다.

고정된 리간드	주입 변수 분석물 1 용액	1:1 결합 ka (1/Ms)	kd (1/s)	겉보기 KD (M)	Rmax (RU)
피브릴 Aβ 7.5㎍/mL Ace4.5	Adu	2.96e+7	1.70e-2	5.74e-10	45.2
피브릴 Aβ 7.5㎍/mL Ace4.5	h2726	3.93e+5	2.12e-5	5.40e-11	51.0
피브릴 Aβ 7.5㎍/mL Ace4.5	h2731	3.72e+5	2.62e-5	7.04e-11	50.7
피브릴 Aβ 7.5㎍/mL Ace4.5	h2831	2.65e+5	2.94e-5	1.11e-10	50.2
피브릴 Aβ 7.5㎍/mL Ace4.5	h2931	3.35e+5	2.05e-5	6.12e-11	50.0
Abeta, 아밀로이드 베타, Aβ; ka,　결합 속도 상수; kd,　해리 속도 상수; KD,　겉보기 평형 해리 상수; mAb, 단일클론 항체; R_max, 최대 반응; SPR, 표면 플라스몬 공명.

ELISA에 의해 관찰된 피브릴 Aβ에 대한 본 발명의 단일클론 항체의 상대적인 항원항체 결합성 강화는 SPR 평형 결합 동역학에서 검증되었으며 (표 6), 아두카누맙과 비교해 항원항체 결합성 (겉보기 KD)이 5-11배 높았다.

이는 SPR 센소그램에서 관찰된 여러가지 결합 프로파일들에서 설명된다 (도 7). 아두카누맙은 Aβ 피브릴에 더 빠른 결합 속도 (ka)로 결합하지만, 본 발명의 단일클론 항체의 훨씬 느린 해리 속도 (kd)로 인해 항원항체 결합성이 아두카누맙과 비교해 훨씬 높게 측정되었다 (즉, 보다 낮은 KD*).

실시예 7. ELISA에 의한 Aβ 피브릴 결합

Aβ₁ _-42 및 Aβ_pE3 _-42피브릴에 대한 본 발명의 특정 단일클론 항체 및 아두카누맙의 직접 결합성을 ELISA에 의해 평가하였다. 피브릴을 구축하기 위해, HFIP (헥사플루오로이소프로판올)로 사전 처리한 다음 건조한 Aβ₁ _-42 또는 Aβ_pE3 _-42 폴리펩타이드를 DMSO에 5 mM로 재현탁한 후 10 mM HCl을 이용해 100 μM로 추가로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하여 용해성 및 피브릴 종들을 분리하였다. 펠릿을 1x D-PBS에 본래의 부피로 재현탁하고, 사용전 초음파 처리하였다.

PBS 중의 Aβ 피브릴 1.0 ㎍/ml 또는 2.5 ㎍/ml로 밤새 실온에서 코팅하였다. 플레이트를 1% BSA/ PBS로 1시간 동안 차단 처리하였다. 항체는 0.1% BSA-PBS 및 0.1% Tween 20에서 10 ㎍/ml에서 4.8 ng/ml까지 연속 희석하고, 각 희석물 100 ㎕를 각 항체에 2 세트로 첨가하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS/Tween 20으로 4회 헹군 후, 1/5000으로 희석한 염소 항-인간 IgG HRP (Jackson ImmunnoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 또는 Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS/Tween 20으로 6회 헹구고, Thermo Fisher o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (OPD) 정제 및 ThermoFisher 기질 완충제를 제조사의 지침에 따라 준비하였다. 기질 100 ㎕를 첨가하여 15분간 인큐베이션하였다. H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 분자 장치 spectromax에서 490 nm에서 판독하였다. 도 9A 및 도 21. 도 21에서, 곡선 및 수득한 EC₅₀ 추정치는 데이터의 비-선형 3-매개변수 최소 자승 피트를 나타낸다 (표 7에 나타낸 데이터).

mAb	h2726	h2731	h2831	h2931	Adu
EC₅₀(㎍/mL mAb)	0.0359	0.03671	0.04894	0.04495	0.7241

플레이트를 PBS 중의 Aβ 피브릴 희석물 10 ㎍/ml - 4.8 ng/ml로 밤새 실온에서 코팅하였다. 플레이트를 1% BSA/PBS로 1시간 동안 차단 처리하였다. 0.1% BSA/PBS 0.1% Tween 20 중의 2 ㎍/ml 항체를 적절한 웰에 2 세트로 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS/Tween 20으로 4회 헹군 후, Jackson 염소 항-인간 IgG HRP 1/5000 희석물 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS/Tween 20으로 6회 헹구고, Thermo Fisher o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (OPD) 정제 및 ThermoFisher 기질 완충제를 제조사의 지침에 따라 준비하였다. 기질 100 ㎕를 첨가하여 15분간 인큐베이션하였다. H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 분자 장치 spectromax에서 490 nm에서 판독하였다. 도 9B, 우측 패널.

항체 h2726, h2731, h2831 및 h2931은 모두 강력한 피브릴 친화성을 나타내었으며, 최상 물질과 최저 물질 간의 차이는 25%였다. 아울러, 항체 4종 모두 아두카누맙보다 현저하게 높은 항원항체 결합성을 나타내었다. 도 21에서, 분석 신호 (OD490) 3배 증가 및 15-20배 낮은 EC₅₀ 추정치는, 아두카누맙 대비 h2726, h2731, h2831 및 h2931 mAb의 피브릴 Aβ에 대한 전체 결합성 및 상대적인 항원항체 결합성의 증가를 의미한다.

실시예 8. ELISA에 의한 Aβ 올리고머의 h2931 결합성

Aβ 올리고머에 대한 h2931의 직접 결합을 ELISA에 의해 평가하였다. 올리고머를 구축하기 위해, 1차 동결건조한 바이오틴화된 및 비-표지된 Aβ (Bachem)를 각각 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올 (HFIP, Sigma) 중에 1 mg/mL로 용해하였다. HFIP는 흄 후드에서 밤새 실온에 두어 샘플에서 증발시켰다. 그런 후, 분액을 speedvac에서 실온 하에 원심분리함으로써 모든 액체를 제거하여 HFIP 필름 분액 250 ㎍을 입수하였으며, 이를 향후 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.

바이오틴화된 및 비-표지된 Aβ HFIP 펠렛 250 ㎍을 드라이 DMSO (Sigma)에 최종 농도 5 mM로 용해하여, 올리고머를 준비하였다. 비표지:바이오틴화된 혼합물의 경우에는 샘플을 멸균 1.5 mL 저-결합 미세원심분리관 (Axygen)에서 9:1 비율 (비표지:바이오틴화)로 조합하였다. DMSO에 용해한 샘플을 차가운 페놀-프리 neurobasal 배지 (Invitrogen)로 100 μM로 희석한 다음 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 이를 14,000 g에서 15분간 원심분리하여 거대 불용성 물질로부터 올리고머를 분리하였다. 상층액 위층 90%를 조심스럽게 취하여 새로운 무균 저-결합 미세원심분리관으로 옮기고, 사용시까지 얼음 위에서 보관하였다.

PBS 중의 각 조제물 2.5 ㎍/mL를 Costar ELISA 고 결합 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 밤새 실온에서 코팅하였다. 플레이트에서 흡인 제거한 다음 PBS 중의 1% BSA를 200 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. h2931 mAb를 0.1% BSA/PBS 0.1% tween 20 완충제 중에 출발 농도 10 ㎍/ml로 준비한 다음 이를 사용해 7회 연속 희석하였다 (각각 1:2). 샘플을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS.0.1% tween 20으로 4번 헹구었다. 염소 항-인간 (H+L) HRP (Jackson Immunoresearch, PA)를 0.1% BSA/PBS 0.1% tween 20 중에 1/5000으로 희석하여 100 ㎕/웰로 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 4번 헹구고, o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드 정제 (ThermoFisher)를 제조사의 지침에 따라 준비하였다. 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 샘플을 분자 장치 SpectroMax에서 490 nm에서 판독하였다. 곡선 및 수득된 EC₅₀ 추정치는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 비-선형 3-매개변수 최소 자승 피트를 나타낸다.

mAb h2931은 용해성 올리고머에 상대적으로 높은 친화성으로 결합하는 것으로 확인되었으며, EC₅₀ 추정치는 23 ng/mL 또는 0.15 nM이었다. 도 8.

실시예 9. AD 뇌에서 항- Aβ 항체 결합

조직 샘플. 인간 AD 뇌 냉동 샘플을 Banner Sun Health Research Institute (Sun City, AZ)에서 입수하였다. 조직은 높은 수준의 Aβ 병태가 확증되고 제공 기관에서 Braak 시스템에 따라 병기 분류된 기증자로부터 수득한 것이다 (표 8). 아울러, 이의 병태 수준 및 분포를 확인하기 위해 모든 조직 블럭에 대해 사내 품질 관리를 수행하였다.

표 8. AD 기증자 정보

사례 ID	성별	사망 연령	PMI	Braak 점수
AD 13-75	M	77	3.62	VI
AD 14-11	M	82	3.98	V
AD 15-19	F	83	3.62	V
AD 11-97	F	86	2.52	V

조직 단편 준비 및 고정. 고정하지 않은 냉동 뇌 조직 샘플을 2-메틸부탄 및 드라이아이스 슬러리 (-60℃) 혼합물에 침지한 크리오몰드 (cryomold)에서 Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek) 중에 포매한 다음, 조직 단편 제조시까지 -80℃에서 보관하였다. Leica 3050S cryostat를 사용해 연속 냉동 조직 단편을 10 ㎛ 두께로 준비하였다. 단편을 양으로 하전된 유리 슬라이드 위에서 바로 해동-탑재하고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 면역조직화학 IHC 공정 전에, 슬라이드를 10% 중성의 완충화된 포르말린 용액에 10분간 4℃에서 침지하고, PBS에서 헹군 후 글루코스 옥시다제 용액 (20 mM 베타 D(+) 글루코스, 2 mM 소듐 아지드 및 2 unit/mL 글루코스 옥시다제 / 1X PBS)에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS에서 5분간 3번 헹군 다음 자동 염색기에서 가공 처리하기 위해 염색 랙으로 옮겼다.

항체 바이오틴화. 인간화된 IgG 항체를 비-공유 방법을 이용해, 바이오틴-접합된 염소 항-인간 1가 fab 단편 (Jackson ImmunoResearch)과 1:4 비율로 사용해 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하는 방식에 의해, 바이오틴화하였다. 결합되지 않은 과량의 Fab를 사용하기 전 추가의 시간 동안 인간 혈청과 사전-인큐베이션함으로써 흡착시켰다. 신선하게 준비한 항체를 이후 조직 단편에 즉시 사용하기 위해 염색장치 (stainer)에 로딩하였다.

면역염색. 자동 Leica Bond Rx Stainer (Leica Biosystems)에서 Bond Research Kit (DS980, Leica Biosystems) 및 아비딘-바이오틴 증폭된 면역-퍼옥시다제 검출 시스템을 이용해 염색을 수행하였다. 각각의 바이오틴화된 항-Aβ 항체 또는 인간 IgG 대조군을 단편에 지정된 농도로 1시간 동안 적용하였으며, 아비딘-바이오틴 증폭 시스템 (ABC Elite Standard, PK-6100; Vector Laboratories)을 사용해 가시화하였다. 이후, 조직 단편에 헤마톡실린 대조 염색을 적용한 다음 일련의 알코올 농도 증가 방식으로 탈수시킨 후, 크실렌 제거, 커버-슬립핑 및 공기-건조를 수행하였다.

조직 영상화. 염색한 슬라이드는 Hamamatsu NanoZoomer 2.0HT 슬라이드 스캐너 (Hamamatsu Corporation)를 사용해 디지털 촬영하고, 이미지는 NanoZoomer Digital Pathology software (NDP.scan, Version 2.7.25)를 사용해 .ndpi 파일 형식으로 획득하였다. 본 보고서에 수록된 이미지는 NDP.view에서 직접 획득하였으며, 어떠한 증강 처리 없이 전송하였다. 형태 계측을 위해 디지털 촬영한 슬라이드를 Halo software (V2.1.1537)로 분석하여 염색된 조직의 %를 측정하고, 그 결과를 GraphPad Prism 8을 이용해 도표로 작성하였다.

h2726, h2731, h2831, h2931 및 아두카누맙을 이용한 결과. 본 발명의 인간화 항-Aβ 항체 4종, 즉 h2726, h2731, h2831 및 h2931과 아두카누맙을 농도를 증가시키면서, 즉 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 9 ㎍/ml 농도로 AD 뇌 4종 모두에 적용하였다. 도 10 (0.3 ㎍/mL)에 나타낸 바와 같이, 이들 항체와 인큐베이션한 AD 뇌 조직 단편은 AD에서 Aβ 병태의 전형인 면역양성 구조를 나타내었다. 뇌 AD 13-75 및 AD 14-11은 Aβ 플라크의 밀도가 높은 반면, 뇌 AD 11-97 및 AD 15-19는 병태가 비교적 드물었다. 각각의 뇌에서, 항체 4종, 즉 h2726, h2731, h2831 및 h2931에 의해 특정 농도에서 수득된 염색 결과들은 강도 및 분포 측면에서 비슷하였다. 아두카누맙을 이용한 염색 결과가 샘플들 및 농도들 중에서 가장 약하였다. 도 11에 예시한 바와 같이, 대조군 인간 IgG 이소형 1 또는 9 ㎍/ml과 인큐베이션한 뇌 4종 모두에서 수득한 조직 단편들은 병변 염색이 관찰되지 않았다.

도 12 및 도 22에서 그래프는 AD 뇌 4종 모두에서 항체 5종에 의한 염색 결과를 정량한 도표이다. 조직 표면적에서 염색된 병변이 차지하는 %를 측정한 결과, 각 AD 뇌에서, 항체 4종 h2726, h2731, h2831, h2931은 검사한 농도 전체에서 비슷한 결합 수준을 나타내었다. 이에 상응하게, 표 9의 데이터는, 각각의 뇌에서, 곡선하 면적 및 EC50 값이 항체 4종들에서 유사하게 유지됨을 보여준다. 아두카누맙을 이용해 수득한 값은 검사한 농도 범위 전체에서 AD 뇌들에서 일관적으로 더 낮았다.

도 22는, 특히 뇌척수액 내 10 mg/kg 아두카누맙을 이용한 임상적으로 관련한 노출로 추정되는 항체 농도에서, 아두카누맙에 대비 (염색된 양성 조직의 %로서) 더 높은 플라크 영역 결합성을 보여준다. 검사한 최고 농도에서 비슷한 수준의 플라크 영역 염색이 관찰되었으며, 이는 이 농도에서 결합 포화를 의미한다.

표 9. 곡선하 면적 및 최고 유효 농도의 1/2 (EC₅₀)

곡선하 면적	h2726	h2731	h2831	h2931
AD 11-97	50.18	50.58	49.21	47.70
AD 15-19	52.08	52.71	49.73	44.81
AD 13-75	149.3	150.4	138.7	139.1
AD 14-11	149.1	149.2	148.9	134.5

EC50	h2726	h2731	h2831	h2931
AD 11-97	0.09163	0.1346	0.1019	0.08893
AD 15-19	0.1356	0.1274	0.1328	0.1330
AD 13-75	0.1615	0.1415	0.2144	0.2273
AD 14-11	0.1325	0.1102	0.1625	0.1691

바피뉴주맙 (hBP)을 이용한 결과

뇌 AD 13-75의 조직 단편을 인간화 항체 hBP뿐 아니라 아두카누맙 및 BAN2401과 농도를 증가시키면서, 즉 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 9 ㎍/ml 농도에서 인큐베이션하였다. 항체 h2726, h2731, h2831 및 h2931을 이용해 관찰한 바와 같이, hBP를 이용한 염색 수준은 용량 의존적인 방식으로 증가하였다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, hBP 염색은 검사한 모든 농도들에서 아두카누맙 및 BAN2401보다 더 강하였다.

실시예 10. ( Aβ ₁ _-42 및 Aβ _pE3 _-42 ) 플라크 소거를 확인하기 위한 생체외 식세포작용 분석

AD 초기 단계에서는 미세아교세포 기능이 신경보호성으로, 세포자살 세포 및 병리학적 단백질 응집물을 제거하는 작용을 할 뿐 아니라 시냅스 독성 Aβ 올리고머의 성장 및 확산을 제한하기 위한 플라크 주위 장벽을 형성한다. 생체외 식세포작용 분석으로 항체-매개 미세아교세포의 소거 반응을 정량하였다.

일차 미세아교세포 배양물 구축: 신생아 마우스 뇌 조직을 해부하기 위해, P1 새끼 동물을 멸균한 가위로 신속하게 목을 절단한다. 뇌척수막을 제거하고, 원하는 양의 동물 뇌를 해부할 때까지 얼음 위에서 전뇌를 즉시 해부 매질 (예, 고 글루코스 DMEM + 20% PBS, P/S)에 침지하였다. 바람직하게는, 전체 공정 시간은 세포 손상을 최소화하기 위해 10분 이내로 제한한다.

조직을 새로운 멸균 파이펫으로 22G 바늘과 이후 25G 바늘을 사용해 조심스럽게 연속 2회 흡인하였다. 샘플을 2,500xg에서 5분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층물을 조심스럽게 흡인하고, 세포 펠릿에 신선한 배양 배지 (고-글루코스 DMEM, 10% FBS, P/S 및 25 ng/ml 재조합 마우스 GM-CSF) 5 ml을 첨가하였다. 세포 펠릿을 멸균한 10 ml 파이펫을 사용해 약 10회 상하 파이펫팅하여, 펠릿을 용해하였다.

세포 체류기 (기공 크기 100 ㎛)를 새로운 50 ml 코니컬 튜브 위에 배치하고, 세포 체류기를 통해 코니컬 튜브로 물질을 분배하였다. 세포 체류기를 신선한 배지 4-5 ml로 헹군 다음 200xg에서 5분간 4℃에서 원심분리하였다.

세포를 T-75 플라스틱 배양 플라스크에 마우스 뇌 2개 밀도로 배치하였다. 조심스럽게 상층액을 흡인하고, 신선한 배양 배지 (고-글루코스 DMEM, 10% FBS, P/S, 및 25 ng/ml 재조합 마우스 GM-CSF) 3 ml을 각 세포 펠릿에 10 ml 멸균 파이펫을 사용해 첨가하였다. 10 ml 파이펫으로 10회 상하 파이펫팅하여 재현탁하였다. 각 플라스크에 배양 배지 (고-글루코스 DMEM, 10% FBS, P/S 및 25 ng/ml 재조합 마우스 과립구-단핵구 콜로니-자극 인자) 6 ml을 첨가한 다음 재현탁한 세포 펠릿 6 ml을 첨가하여 최종 12 ml을 5% CO₂ 37℃ 인큐베이터에서 수득함으로써, 1 멸균 T-75 플라스크를 준비하였다.

5일째에 각 플라스크의 배양 배지를 신선한 배양 배지 (고-글루코스 DMEM, 10% FBS, P/S 및 25 ng/ml 재조합 마우스 GM-CSF) 12 ml로 교체하였다. 접종한 세포 혼합물 대략 10%가 플라스틱 표면에 부착되어 증식하게 될 것이다. 배지를 주당 2회 (3-4일 간격) 교체하였으며, 컨플루언스에 도달하였다. 이러한 교체는 세포가 부착된 플라스크 바닥을 건드리지 않고 매우 조심스럽게 수행하였다.

7-11일 후, 플라스크를 19-mm 궤적의 Lab-Line 오르비탈 셰이커를 사용해 2시간 동안 37℃에서 200 rpm으로 회전시켰다. 세포 현탁물을 200xg에서 원심분리하고, 분석 매질 (하이브리도마-무혈청 배지 H-SFM [Life Technologies] + 1% FBS, 글루타민, P/S 및 5 ng/ml 재조합 마우스 GM-CSF)에 재현탁하였다.

생체외 분석. APP/PS1 마우스 또는 인간 AD 뇌 (사후 간격, 3시간 미만)의 냉동 조직 단편 (10 ㎛ 두께; 넓은 날 사용)을 폴리라이신으로 코팅한 둥근형 유리 커버슬립 위에서 해동 탑재하여, 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 배치하였다 (CT -30C OT -20C). 조직 샘플을 단편 사이에 손가락을 대거나 또는 OT를 -12C로 낮추어 가온하였다. 커버슬립을 분석 매질로 2번 헹구었다. 항체 (대조군 또는 Aβ 항체)를 분석 매질 (최종 20 ㎍/ml) 250 ㎕에 2X 농도로 첨가하여 조직 배양 인큐베이터에 두었다.

그 후, 미세아교세포를 분석 매질 250 ㎕에 최종 밀도 800,000 세포/ml (원액 1,600,000 세포/ml)로 접종하였다. 배양물은 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 분위기 하에 72시간 동안 유지시켰다.

총 Aβ (Aβ₁ _-42) 정량. 배지를 조심스럽게 취한 다음 빙랭한 PBS로 헹구었다. 8M 우레아 100 ㎕를 첨가하여 파이펫팅으로 조직을 재현탁한 다음 파이펫 팁으로 긁어냈다. 그런 후, 상층물을 분석 준비시까지 -20℃에서 냉동시켰다. 현탁물은 얼음 위에서 해동시켜 16,000xg에서 20분간 4℃에서 원심분리한 다음 희석하고, V-PLEX Total Aβ42 펩타이드 (4G8) 키트 (Meso Scale Discovery)를 이용해 분석하였다. 결과들은 도 14A, 도 14B 및 도 24에 나타낸다. 도 14A 및 도 24는 뇌 조직 단편별 Aβ 수준을 보여주며, 도 14B는 동일 데이터를 처리별 산점도로 나타낸 것이다 (도 14B 데이터는 표 10에 나타낸 것이고; 도 24의 데이터는 표 11에 나타냄). h2731, h2931 및 아두카누맙은 Aβ 플라크 종을 이소형 대조군에 비해 상당히 유의하게 감소시켰다.

mAb (Avg. pg/mL Aβ₁ _-42)	이소형 대조군	h2931	아두카누맙
평균	92619	53113	49501
SD	14801	18239	7961

조건	Aβ1-42 (pg/ml)	SD
건강한 대조군	5797.25	2022.51
AD 뇌 + hIgG1 이소형	185138.90	35888.64
AD 뇌 + h2731	101172.05	40194.48

피로글루타메이트-3 Aβ (Aβ_pE3 _-42) 정량. N-말단 절단된 및 피로글루타메이트-변형된 Aβ (예, Aβ_pE3 _- ₄₂)는 AD 뇌에서 성숙한 노인반의 구성성분으로 알려져 있다 (Saido et al., Neuron 14, 1995). N-말단 Aβ의 피로글루타메이트-변형이 본원에 언급된 h2731 등과 같은 N-말단 항체의 결합에 영향을 미치는지는 알려져 있지 않았다. 마찬가지로, 이들 항체가 식세포-매개 Aβ_pE3 _-42 소거를 촉진하는 능력을 가진 것도 알려져 있지 않다.

생체외 실험에서 이용한 AD 뇌에서, 피로글루타메이트-3 Aβ의 존재 및 h2931 대비 이의 비슷한 염색 패턴을 면역조직화학법으로 검증하였다 (도 25A 및 25B). 피로글루타메이트-3 Aβ의 제거를 입증하기 위해, 상업적인 ELISA 방법을 이용해 생체외 식세포작용에 의한 이의 제거를 측정하였다. 전술한 방법에 따라 수집한 현탁물을 얼음 위에서 해동하고, 16,000xg 및 4℃에서 20분간 원심분리한 후, 희석해 시판 ELISA 키트 (아밀로이드 베타 N3pE Aβ, IBL America)를 이용해 분석하였다. Aβ_pE3 _-42 ELISA 분석은 비-변형 Aβ₁ _-42와 비교할 경우 Aβ_pE3 _-42에 고 특이성이다 (데이터 도시 안함).

결과는 도 26A 및 도 26B (각각 표 12 및 표 13에 나타낸 데이터)에 나타낸 바, 이는 지정된 항체 처리 후, 즉 도 26A의 경우 h2931, 및 도 26B의 경우 h2731 처리 후, 뇌 조직 단편의 피로글루타메이트-3 Aβ 수준을 건강한 대조군 및 IgG1 이소형 대조군 처리 AD 뇌와 각각 비교하여 보여준다. 여러 AD 뇌들로부터 유래한 조직 단편들을 각 처리에 사용하였다. h2731 및 h2931은 둘다 이소형 대조군에 비해 피로글루타메이트-3 Aβ를 매우 유의하게 감소시켰다.

도 24 및 도 26B는, 종합적으로, AD 환자 뇌 조직에서 일차 마우스 미세아교세포와 인큐베이션할 경우 본 발명의 항-Aβ 항체 (예, h2731)가 Aβ₁ _-42 및 Aβ_pE3 _-42 단백질의 소거를 촉진함을 보여준다. 이러한 결과는 이들 항체가 인간 병태 상황에서 Aβ₁ _-42 및 Aβ_pE3 _-42 둘다 소거한다는 사실을 검증해준다.

N-말단을 표적으로 하는 항-Aβ 항체는 AD 환자의 뇌 조직에서 피로글루타메이트-변형된 Aβ를 비롯한 Aβ 플라크 종에 대한 미세아교세포-매개 제거를 상당히 촉진하였다. 이들 데이터는 알츠하이머 질환에 대해 피하 투여되는 항체 면역요법으로서 본 발명의 항체의 추가적인 개발을 뒷받침해준다.

조건	AbpE3-42 (pg/ml)	Stdev
건강한 대조군	44.20	6.39
AD 뇌 + hIgG1 이소형	259.42	27.39
AD 뇌 + h2931	62.59	16.16

조건	AbpE3-42 (pg/ml)	Stdev
건강한 대조군	26.75	34.83
AD 뇌 + hIgG1 이소형	478.91	117.80
AD 뇌 + h2731	153.76	67.59

실시예 11. 해마 결합 분석에서 올리고머 차단

랫 해마 뉴런에서의 Aβ 결합 분석

E18 일차 랫 해마 뉴런을 Zago et al. (J. Neurosci 22 February 2012, 32 (8) 2696-2702)에 언급된 바와 같이 배양하였다. 일차 뉴런에 신경돌기 결합을 차단하기 위해 배양물 DIV14-21에서 항체와 함께 또는 항체 첨가 없이 용해성 Aβ와 사전 인큐베이션하였다.

신선한 비-표지된, 바이오틴화된 또는 (9:1) 비-표지:바이오틴화된 용해성 Aβ를 하루 전 준비하여 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 사용하기 전 Aβ를 14,000 RPM에서 15분간 스핀 다운하였다.

NB-NPR (NeuroBasal-no phenol red) 또는 NbActiv4-NPR 매질을 이용해 최종 처리 부피의 1/2로 최종 처리 농도의 (2x) 항체 및 Aβ 용액의 각 희석물을 준비하였다. 이를 합친 후 혼합물을 3-4회 혼합한 다음 37℃에서 30분간 사전 인큐베이션하였다.

결합 분석 직전에 뉴런을 미리 데운 NB-NPR 150 ㎕/웰로 헹구었다. 완충제를 흡인하고, 항체/ Aβ 처리물을 세포에 60 ㎕/웰로 첨가한 다음 일반 인큐베이터 조건 (5% CO₂; 9% O₂) 하에 37℃에서 30-40분간 인큐베이션하였다.

뉴런을 150 ㎕/웰 NB-NPR에서 2번 헹군 다음 1x DPBS 중의 4% 파라포름알데하이드에서 20분간 실온에서 고정하였다.

세포를 1x DPBS 중의 0.1% Triton X-100으로 5분간 투과 처리한 다음 10% 정상 염소 혈청 (NGS)에서 1시간 동안 실온 (RT)에서 차단 처리하였다.

1% BSA + 1% NGS를 함유한 1x DPBS 100 ㎕/웰에서 샘플을 미세소관-부속 단백질 2 (MAP2) 및 뉴런 핵 단백질 (NeuN)-일차 항체와 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 샘플을 1x DPBS 150 ㎕/웰에서 5분 간격으로 2번 헹구었다. 2차 항체를 100 ㎕/웰 1x DPBS + 1% BSA + 1% NGS에 첨가하여 1시간 동안 실온에 두었다.

Operetta HCI CLS 장치 (Perkin Elmer; 수정된 신경돌기 성장 알고리즘: 40x H₂O 대물렌즈; 마이크로플레이트 형태에서 웰 당 필드 25-40개; (n=3)/조건)를 사용해 용해성 Aβ 신경돌기 결합 스팟을 정량하기 위해 HCI (high-content imaging) 분석을 수행하였다. MAP2 및 NeuN 뉴런 마커를 이용해 각각의 신경돌기 트리를 추적하고 광학 필드 당 세포체 개수를 계수하였다 (예, 미세소관-부속 단백질 2 (Abcam; Cambridge, UK), 및 NeuN (EMD Millipore) 1차 항체 처리 후, AlexaFluor (Thermo Fisher Scientific) 2차 검출 항체 사용). 신경돌기 Aβ 스팟을, 다양한 단일클론 및 다클론 Aβ 항체 (예, 마우스 단일클론 항-Aβ 항체 MabN254 (EMD Millipore))와 후속적인 AlexaFluor (Thermo Fisher Scientific) 2차 검출 항체 또는 바이오틴화된 Aβ 물질에 대한 스트렙타비딘-AF488를 이용해 검출하였다. 도 15A 및 도 15B는 항-Aβ 항체의 농도 증가에 따라 뉴런 당 스팟 개수가 감소함을 보여주며, 이는 Aβ에 대한 활성을 의미한다. 도 23은 h2731이 랫 해마 시냅스에의 용해성 Aβ 응집물의 결합을 (뉴런 당 Aβ42 스팟) 농도-의존적인 방식으로 효과적으로 차단함을 보여준다. h2731의 효과는 최소 1:500 (p　< 0.05) mAb:Aβ42 몰 비율에서 검출되었으며, Aβ42 단독 (mAb와 사전 인큐베이션하지 않은 경우)과 비교해 1:50 몰 비율에서 >90% 차단하였다 (p < 0.001). 데이터는 표 14에 나타낸다.

	용해성 Aβ	이소형 대조군	h2731	h2731	h2731	h2731
	1 μM	1:50	1:1000	1:500	1:100	1:50
평균 (Aβ 스팟/뉴런)	76.3	58.7	51.0	39.7	11.3	6.3
SD	28.2	12.9	14.9	12.1	4.9	1.5

실시예 12. 천연 Aβ 종 및 변형된 Aβ 종에 결합하는 항- Aβ 항체

인간 AD 뇌의 냉동 조직 단편을 폴리-D-라이신으로 코팅된 커버슬립 위에서 해동 탑재하여, 24웰 조직 배양 플레이트에 배치한 다음 검사 항체와 1시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 일차 마우스 미세아교세포를 800,000 세포/ml로 접종하고, 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 유지시켰다. 배지를 조심스럽게 취한 다음 PBS로 조직 단편을 헹구었다. Aβ_pE3 _-42에 대한 ELISA (Immuno-Biological Laboratories, Minneapolis, MN) 또는 Aβ₁ _-42에 대한 MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockland, MD)에 의해 정량하기 위해 조직 단편을 8M 우레아에 재현탁하였다. Immuno-Biological Laboratories Aβ_pE3 _-42 ELISA 키트는 pE3-42 종을 특이적으로 검출하며, 전장 Aβ에 대해서는 검출가능한 신호는 검출되지 않았다.

도 27은 h2731이 전장 Aβ의 N-말단에 높은 겉보기 친화성으로 결합하지만, 피로글루타메이트-변형된 Aβ (Aβ_pE3 _- ₄₂)에는 직접 결합하지 않음을 보여준다. h2731은 최대 유효 농도의 1/2 (EC₅₀) 수치 8.1 ng/mL (54 pM)로서, 비변형된 N-말단을 가진 피브릴 Aβ 종 (Aβ₁ _- ₄₂)에 결합하였다. h2731은 최대 100 ng/ml까지 Aβ_pE3 _-42에는 검출가능한 수준으로 결합하지 않았다.

실시예 13. 시험관내 식세포-매개 소거 - Aβ ₁ _-42 프로토피브릴의 THP -1 인간 단핵구-매개 흡수

S26C 돌연변이를 가진 Aβ₁ _-42의 합성 프로토피브릴을 Paranjape et al., ACS Chem. Neurosci. 2012, 3, 302-311에 기술된 바와 같이 구축하였다. 간략하게는, Aβ 펩타이드를 100% 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP)(SigmaAldrich, St. Louis, MO)에 1 mM로 용해하고, 이를 무균 미세원심분리관에 나누어 넣은 후 흄 후드에서 밤새 실온에서 열린 상태로 증발시켰다. 다음날, 분액을 진공-원심분리하여 임의의 잔류 HFIP를 제거한 다음 데시컨트에 넣어 -20℃에서 보관하였다. 일부 Aβ 펩타이드의 경우, HFIP 처리하기 전, 100% 트리플루오로아세트산을 처리하여 진공 원심분리하였다. 동결건조한 분액으로부터 바로 수득한 Aβ 올리고머 및 피브릴은, 동결건조한 Aβ 펩타이드 분액을 멸균 무수 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 5 mM로 재현탁하여 준비하였다. 올리고머를 준비하는 경우, 샘플을 멸균한 빙랭한 페놀 레드-프리 햄 F-12 세포 배양 배지 + L-글루타민 (F-12, Bioworld, Dublin, OH)에서 희석하여 24시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 피브릴을 준비하는 경우, 샘플을 10 mM HCl에서 100 μM로 희석하여 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이들 조제물에서 Aβ 농도는 펩타이드 건조 중량을 기반으로 한다.

성숙한 프로토피브릴을 시험관내 식세포-매개 소거 분석에 사용하기 전 pHrodo Red Maleimide (Thermo Fisher)에 접합하였다.

항체를 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.098 및 0.049 ㎍/ml 농도에서 pHrodo-Aβ₁ _-42 프로토피브릴과 실온에서 30분간 사전 인큐베이션한 다음 THP-1 식세포를 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 3시간 인큐베이션한 후, 항체-매개 식세포-매개 소거를 유세포 측정에 의한 세포 pHrodo 신호 측정으로 분석하였다.

도 28A 및 도 28B에 나타낸 바와 같이, 항-Aβ 항체는 농도-의존적인 방식으로 Aβ₁ _-42 프로토피브릴 식세포 활성을 발휘하였다. 이들 결과는, 본 발명의 항체가 뇌 조직에서 Aβ₁ _-42 소거를 유도할 수 있음을 시사한다.

실시예 14. 진행된 AD 환자의 뇌 조직에서 총 및 피로글루타메이트 -변형된 Aβ의 분포

Aβ₁ _- _XX (N-말단 항-Aβ 항체를 사용해 검출함) 및 항-Aβ_pE3 _-42의 분포를 확인하기 위해, AD 뇌 조직을 대상으로 전술한 그리고 본원에 기술된 IHC 방법을 수행하였다.

Aβ₁ _- _XX 및 Aβ_pE3 _-42 평가 결과, 진행된 AD 단계인 환자로부터 수득한 조직에서 이들 2종의 광범위한 분포가 검증되었다. 분포 패턴 (도 29A(1) 및 도 29A(2)(각각 획대도 도 29B(1) 및 도 29B(2)) 및 Aβ_pE3 _-42 대비 Aβ₁ _- _XX에 의해 망라되는 면적 %의 정량 결과 (도 29C)는 이전 실험에서와 일치하였으며, 이는 Aβ_pE3 _-42가 N-말단 Aβ 항체에 의해 표적화되는 비-변형된 Aβ와 혼성된 변형된 Aβ로 구성된 비교적 더 작은 풀임을 의미한다. Aβ_pE3 _-42는 도 29A(2) 및 도 29B(2)에 나타내고, 온전한 N-말단 Aβ는 도 29A(1) 및 도 29B(1)에 나타낸다. 항-Aβ_pE3 _-42 항체는 Aβ₁ _-42와 교차 반응하지 않았다 (데이터 도시 안함).

도 29A(1) 및 도 29B(1)에서 박스는 혈관에 인접한 변형된 Aβ_pE3 _-42 및 온전한 N-말단 Aβ를 함유한 Aβ 플라크를 표시한다. 아래 표 15는 도 29C에서 그래프로 나타낸, 도 29B(1) 및 도 29B(2)의 플라크 염색을 정량한 결과를 나타낸다. 평균 값 차이는 통계학적으로 유의하였다 (p=0.007, 쌍별 양측 t-검정).

항체	염색된 면적 % (평균 ± SD; N=5)
항-N-말단 Aβ 항체	12.59　±　4
항- Aβ_pE3 _-42 Aβ 항체	7.17　± 1.8

실시예 15. 항- Aβ 항체 h2731은 AD 뇌에서 AβpE3 -42와 동일 위치에서 국지화된다

h2731 면역염색 및 Aβ_pE3 _-42의 공동-국지화 (colocalization)를 면역형광 현미경 검경에 의해 평가하였다. N-말단 항-Aβ 항체 (이 경우, h2731)에 Cy3-2차 항-인간 항체 (Jackson Laboratories)를 미리 접합한 후 조직에 적용하였다. 마우스 항-Aβ_pE3-42 항체와 488-AlexaFluor-접합된 항-마우스 2차 항체를 이용해 Aβ_pE3 _-42를 검출하였다. Hamamatsu 카메라 (C10600-10B)가 연결된 Metamorph-assisted IX81 Olympus 현미경으로 슬라이드 사진을 촬영하였다.

도 30 (패널 A)은 Aβ 플라크에의 h2731 국지화를 보여주며; 도 30 (패널 B)은 Aβ 플라크에의 항-Aβ_pE3 _-42 항체 신호의 국지화를 보여주며; 도 30 (패널 C)은 Aβ 플라크에의 h2731 및 항-Aβ_pE3 _-42 항체 신호의 공동-국지화를 보여준다. 중첩되는 신호는 플라크의 고밀도 코어 영역에서 매우 강하게 나타났다.

실시예 16. 본 발명의 항- Aβ 항체는 생체외 AD 뇌 조직으로부터 Aβ _pE3 _-42 소거를 용량-의존적인 방식으로 아두카누맙보다 우수한 효능으로 촉진한다.

전술한 본원의 도처에 기술된 방법들을 이용해, 본 발명의 항체 (예, h2731) 및 아두카누맙이 Aβ_pE3 _-42 단백질을 AD 뇌 조직으로부터 제거하는 능력을 평가하였다.

h2731을 생리학적으로 관련한 용량-반응 시리즈 (3 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml 및 100 ng/ml)로 AD 환자 뇌 조직 단편 및 일차 마우스 이세아교세포와 72시간 동안 인큐베이션하였다. h2731은 용량-의존적인 방식으로 Aβ_pE3 _-42 소거를 촉진하였다. 이들 결과는 아래 표 16 및 도 31A에 나타낸다.

항체	농도 (ng/ml)	Ave Aβ _pE3 _-42 (pg/ml) (n=4)	Stdev
hIgG1 이소형	100	524.34	83.36
h2731	3	479.56	129.92
h2731	10	339.06	165.44
h2731	30	229.28	51.16
h2731	100	261.15	60.81

h2731은 AD 환자 뇌 조직 단편으로부터 미세아교세포 식세포 작용에 의해 용량-의존적인 방식으로, 비교적 짧은 인큐베이션 기간 (72시간) 동안 Aβ_pE3 _-42 소거를 견고하게 촉진하였다. 즉, 본 발명의 항체는 피하 투여로 도달될 것으로 예상되는 농도 범위에서 AD 환자의 뇌에서 Aβ_pE3 _-42의 생체외 소거를 촉진하였다.

다른 일련의 실험을 수행하여, h2731 25 ng/ml 및 75 ng/ml을 아두카누맙 25 ng/ml 및 225 ng/ml과 비교하였다. 그 결과는 표 17 및 도 31B에 나타낸다.

항체	농도 (ng/ml)	Ave Aβ _pE3 _-42 (pg/ml) (n=4)	Stdev
hIgG1 이소형	225	449.11	58.14
Adu	225	227.30	98.95
Adu	25	247.34	48.06
h2731	75	52.83	25.40
h2731	25	71.31	64.93

h2731은 아두카누맙과 비교해 심지어 9배 낮은 농도에서 우수한 Aβ_pE3 _-42 소거 활성을 나타내었다.

h2731 및 아두카누맙을 다른 생리학적으로 관련한 용량-반응 시리즈 (3 ng/ml, 25 ng/ml 및 225 ng/ml)로 IgG1 이소형 대조군과 비교해 AD 환자 뇌 조직 단편 및 일차 마우스 이세아교세포와 72시간 동안 인큐베이션하였다. h2731 및 아두카누맙 둘다 용량-의존적인 방식으로 Aβ_pE3 _-42 소거를 촉진하였지만, 재차 h2731이 유의하게 훨씬 더 강하였으며, p값 0.0005에 도달하는데 필요한 아두카누맙의 농도보다 9배 낮은 농도에서 p값 <0.0001이 달성되었다. 이들 결과는 아래 표 18 및 도 32A에 나타낸다.

항체	농도 (ng/ml)	AbpE3-42 (pg/ml)	Stdev
hIgG1 이소형	225	1.00	6.73
Adu	225	85.97	74.35
Adu	25	146.70	24.30
Adu	3	245.97	41.70
h2731	225	20.60	14.44
h2731	25	41.07	31.15
h2731	3	154.95	35.89

h2731-매개 생체외 식세포 활성이 미세아교세포에 의존하는지를 검증하기 위해, +/- 미세아교세포 실험을 수행하였다. 미세아교세포 단독은 AD 환자 조직 단편으로부터 일부 Aβ_pE3 _-42 소거를 유발하였지만, h2731 및 미세아교세포를 조합한 경우 소거가 유의하게 현저하였다. h2731 단독은 미세아교세포 없이는 활성이 없었으므로, h2731은 소거 활성에 미세아교세포의 존재가 필수적인 것으로 보인다. 이들 결과는 표 19 및 도 32B에 나타낸다.

항체	농도 (ng/ml)	AbpE3-42 (pg/ml)	Stdev
hIgG1 이소형	75	271.79	27.01
h2731	75	263.70	51.28
hIgG1 + 미세아교세포	75	174.58	15.75
h2731 + 미세아교세포	75	58.37	15.53

검사한 항체의 농도는, 인간에서 3 mg/kg 피하 h2731 (25-75 ng/ml) 또는 10 mg/kg 정맥내 아두카누맙 (25-225 ng/ml) 매달 투여 후, 약동학 모델에서 정상-상태 혈장 최소 및 최고 농도의 0.1%에서 추정된 CNS 범위를 기반으로 하였다 (도 33).

본 발명의 항체는 피하 투여로 도달될 것으로 예상되는 농도 범위에서 AD 환자로부터 Aβ_pE3 _-42의 생체외 소거를 아두카누맙에 비해 우수한 생물학적 활성으로 촉진하였다.

항체 h2731은 AD 뇌에서 Aβ_pE3 _-42 염색을 감소시켰다. 도 34는, 인간 IgG 이소형 대조군 항체가 처리된 AD 뇌에서, Aβ_pE3 _-42 (백색 화살표가 지시하는 염색)가 플라크 (백색 삼각형)에서 관찰되고 혈관과 연관되어 있음 (도 34A 및 도 34C에서 원 기호)을 보여준다 (도 34A 및 도 34B). h2731 처리는 플라크 감소에 의해 입증되는 바와 같이 미세아교세포-매개의 Aβ_pE3 _-42 수준 감소를 강화하였다 (도 34C 및 도 34D). 본 발명의 항체, 예를 들어 h2731은 조직에서 Aβ_pE3 _-42 함유 플라크를 감소시킨다.

실시예 17. h2731 표적 결합 (target engagement)

돌연변이 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP[V717I])과 돌연변이 인간 presenilin 1 (hPS1[A246E])을 발현하는 APPxPS1 암컷 마우스를 이용해, h2731 및 아두카누맙이 말초 투여 후 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 뇌에서 아밀로이드-베타 (Aβ) 플라크에 결합하는 능력을 평가하였다. 실험 개시시 동물의 평균 나이는 6.7개월이었다. 약물 투여하기 전날, 둘다 완전한 인간화 항체인 h2731 또는 아두카누맙을 투여하는 마우스에서 항-약물 항체의 형성을 방지하기 위해, 모든 동물에 항-CD4 항체 (20 mg/kg, 정맥내)를 주사하였다. h2731 (3 또는 10 mg/kg, 피하, SC) 또는 아두카누맙 (10 mg/kg, 정맥내)을 3주간 매주 투여하고, 1주일 후 동물은 안락사하였다. 빙랭한 식염수를 경심장 관류한 후 마우스에서 뇌를 적출하여 드라이아이스 위에서 2-메틸부탄 중에 급속 동결한 다음 -80℃에서 보관하였다.

Leica 3050S cryostat를 사용해 10 ㎛ 두께의 연속 두개골 냉동 조직 단편을 준비하였다. 이들 단편은 양으로 하전된 유리 슬라이드 위에서 바로 해동-탑재하고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. IHC 하기 전, 슬라이드를 10분간 4℃에서 중성의 완충화된 포르말린 10% 용액에 침지한 다음 PBS에서 헹구었으며, 이후 글루코스 옥시다제 용액 (20 mM beta D(+) 글루코스, 2 mM 소듐 아지드 및 2 unit/mL 글루코스 옥시다제 / 1X PBS)에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS에서 5분간 3번 헹군 후 자동 염색 장치에서 처리하기 위해 염색 랙으로 이동시켰다. 바이오틴-SP-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories #109-065-088)를 사용해, APPxPS1 뇌 조직에서 h2731 또는 아두카누맙을 검출하였다. 염색은 자동 Leica Bond Rx Stainer (Leica Biosystems)에서 Bond Research Kit (DS980, Leica Biosystems)를 사용해 수행하였다. 그런 후, 조직 단편에 대해 핵에 대한 헤마톡실린 대조염색을 수행한 다음 일련의 알코올 농도 증가 방식으로 탈수시킨 후, 크실렌 제거, 커버-슬립핑 및 공기-건조를 수행하였다. NanoZoomer 2.0HT slide scanner (Hamamatsu Corporation, Japan)에서 전체 조직 단편의 영상을 촬영하였다. Halo 소프트웨어 (V2.1.1537)에서 디지털 촬영한 이미지에 대한 형태 계측 분석을 수행하였다. 대상 영역으로서 뇌 피질을 전사 (delineation)한 후, 염색된 조직 면적 %를 결정하였다. 데이터는 표 20에 나타낸다.

	h2731		아두카누맙
	3 mg/kg, SC	10 mg/kg, SC	10 mg/kg, IV
플라크 결합 (% ROI)	0.070 ± 0.025	0.079 ± 0.034	0.060 ± 0.034
ROI = 분석 영역. 모든 데이터는 동물 n = 5/군의 평균 ± SD임

알츠하이머 질환에서 Aβ 플라크 개수 또는 크기 감소는 질환 진행의 서행 또는 역전과 관련 있을 수 있다. 본 발명의 항-Aβ 항체가 말초 투여 후 생체내 Aβ에 결합하여 이를 소거하는 능력은 이들 항체의 치료학적 물질로서의 잠재적인 유용성을 뒷받침한다.

즉, 본 발명의 항체는 AD 환자의 뇌 조직에서 미세아교세포-매개의 Aβ₁ _-42의 소거를 촉진한다. 본 발명의 항체가 피로글루타메이트 변형을 직접 표적화하진 못하지만, h2731에 의해 예시된 바와 같이, Aβ_pE3 _-42를 임상적으로 적절한 것으로 예측되는 농도에서, 아두카누맙과 비교해 더 우수한 효능과 높은 생물학적 활성으로, 효과적으로 소거할 수 있다. 이러한 항체에 의한 피로글루타메이트 종들의 소거는 옵소닌화된 플라크를 인지하고 내용물이 다양한 거대 입자를 삼키는 미세아교세포의 능력으로 인한 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 동일한 기전에 의해 플라크에 공동-침착된 다른 신경독성 요소를 제거할 수 있다.

인용된 모든 간행물 (GenBank 등재 번호, UniProtKB/Swiss-Prot 등재 번호 등), 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 및 특허 출원이 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 바와 같이 동일한 수준으로 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다. Genbank 및 UniProtKB/Swiss-Prot 등재 번호 등과 관련한 서열에 임의의 변동이 있을 경우, 본 출원은, 해당 등재 번호를 언급한 가장 빠른 우선일 또는 실제 출원일을 의미하는 본 출원의 유효 출원일을 기준으로 언급된 등재 번호에 기재된 서열을 지칭한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구현예 또는 측면은 달리 구체적으로 언급되지 않은 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명확하게 하고 이해를 돕기 위한 목적으로 예시로서 예를 들어 일부 상세히 기술되었지만, 첨부된 청구항 범위에서 일부 변경 및 수정이 실시될 수 있음은 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Othair Prothena Limited SKOV, Michael NIJJAR, Tarlochan GOVINDARAJAN, Sridhar PURCELL, Tom WELCH, Mark BARD, Frederique BARBOUR, Robin ZAGO, Wagner <120> ANTI-ABETA ANTIBODIES <130> 20-1030-WO <150> 63055813 <151> 2020-07-23 <150> 63086589 <151> 2020-10-01 <150> 63187379 <151> 2021-05-11 <150> 63219611 <151> 2021-07-08 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Thr Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Arg Ser Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Tyr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Tyr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Arg Val Thr Asn Arg Asp Thr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Arg Val Thr Asn Arg Asp Thr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Tyr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Ser Tyr Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Met Asp Thr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Tyr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asn Asp Tyr Asn 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Ser Ile Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 21 Ser Val Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Ser Val Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Ser Val Arg Ser Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Tyr Asp His Tyr Ser Gly Thr Ser Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Tyr Asp His Tyr Thr Gly Thr Ser Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Leu Val Ser Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Ala Gly Ala Gly 1 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Tyr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Met Asp Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Arg Val Thr Asn Arg Asp Thr 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Lys Val Ser Asn Arg Glu Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Lys Val Thr Asn Arg Glu Ser 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Gly Ala Gly Ala 1 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Ser 1 5 <210> 40 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 41 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr 65 70 75 80 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Cys 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Ala Gly Cys 355 <210> 43 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Thr Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 44 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Ala 355 <210> 45 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 225 230 235 240 Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 46 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr 65 70 75 80 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Cys 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Ala Gly Cys 355 <210> 47 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 225 230 235 240 Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 48 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Cys 355 <210> 49 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 225 230 235 240 Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 50 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 50 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Ala 355 <210> 51 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Thr Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 52 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Ala Gly Cys 355 <210> 53 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Ala 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Thr Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 54 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Cys 355 <210> 55 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 55 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Thr Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys 275 280 285 Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 56 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Ala 355 <210> 57 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 57 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Gly 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Cys Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Thr Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr 275 280 285 Thr Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 58 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 58 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Thr Ala Cys Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Ala Ala Thr Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Thr Cys Gly 355 <210> 59 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 59 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 60 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 60 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Thr Cys Ala 355 <210> 61 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 61 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr 180 185 190 Gly Ala Thr Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 62 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 62 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Ala Gly Cys 355 <210> 63 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 63 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Ala 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 64 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Ala Gly Cys 355 <210> 65 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 65 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Ala 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Ala Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 66 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 66 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr 65 70 75 80 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Thr Cys 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala 305 310 315 320 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Ala Gly Cys 355 <210> 67 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr 180 185 190 Gly Ala Thr Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr 195 200 205 Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr 290 295 300 Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 68 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr 340 345 350 Cys Gly Ala Gly Cys 355 <210> 69 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys 85 90 95 Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys 100 105 110 Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly 165 170 175 Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly 180 185 190 Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 210 215 220 Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala 260 265 270 Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala 275 280 285 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 70 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 71 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 72 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 73 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 73 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 74 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 75 Ala Ala Ala Gly 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 76 Ala Ala Gly Gly 1 <210> 77 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 77 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 78 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 79 Ala Ala Gly Gly 1 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 80 Ala Gly Gly Gly 1 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 81 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 82 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 82 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 83 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 83 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 84 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 84 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 85 <211> 770 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 85 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 86 <211> 993 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 86 Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 10 15 Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala 50 55 60 Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Gly 65 70 75 80 Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Ala 100 105 110 Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys 130 135 140 Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys 145 150 155 160 Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys 165 170 175 Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly 180 185 190 Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala 195 200 205 Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys 210 215 220 Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Cys 225 230 235 240 Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala 245 250 255 Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Ala Ala 260 265 270 Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly 275 280 285 Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Ala Ala Gly Ala 290 295 300 Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala 305 310 315 320 Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Thr 325 330 335 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys 340 345 350 Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr 355 360 365 Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr 370 375 380 Ala Ala Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Thr Cys 385 390 395 400 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys 405 410 415 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr 420 425 430 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr 435 440 445 Cys Cys Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala 450 455 460 Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly 465 470 475 480 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly 485 490 495 Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala 500 505 510 Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly 515 520 525 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Ala Ala 530 535 540 Cys Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys 545 550 555 560 Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly 565 570 575 Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala 580 585 590 Ala Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala 595 600 605 Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys 610 615 620 Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys 625 630 635 640 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr 645 650 655 Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys 660 665 670 Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Cys 675 680 685 Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Cys 690 695 700 Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala 705 710 715 720 Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly 725 730 735 Thr Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Thr 740 745 750 Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr 755 760 765 Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly 770 775 780 Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala 785 790 795 800 Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys 805 810 815 Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys 820 825 830 Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys 835 840 845 Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys 850 855 860 Cys Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala 865 870 875 880 Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly 885 890 895 Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Thr 900 905 910 Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly 915 920 925 Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr 930 935 940 Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Thr 945 950 955 960 Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys 965 970 975 Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala 980 985 990 Ala <210> 87 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 87 Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys 1 5 10 15 Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr 20 25 30 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly 35 40 45 Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala 50 55 60 Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly 65 70 75 80 Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala 100 105 110 Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr 115 120 125 Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala 130 135 140 Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly 145 150 155 160 Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala 165 170 175 Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys 180 185 190 Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala 195 200 205 Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly 225 230 235 240 Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Ala Cys Gly 245 250 255 Cys Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala 260 265 270 Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly 275 280 285 Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly 305 310 315 320 Thr Thr Ala Ala <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = Y of F <400> 88 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Xaa Gly Met Ser 1 5 10 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X = I or V <400> 89 Ser Xaa Arg Ser Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = S or T <400> 90 Tyr Asp His Tyr Xaa Gly Xaa Ser Asp Tyr 1 5 10 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 91 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = K or R <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = S or T <400> 92 Xaa Val Xaa Asn Arg Asp Xaa 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X = S or T <400> 93 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Xaa 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> X = F or Y <400> 94 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Xaa Phe Xaa 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X = S or A <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = Y or F <400> 95 Gly Phe Thr Phe Xaa Asn Xaa Gly Met Ser 1 5 10 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X = I or V <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X = S or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = S or G <400> 96 Ser Xaa Arg Ser Gly Xaa Xaa Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = K or R <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = V, M or L <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X = Y, T or S <400> 97 Xaa Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Asp Xaa Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = K or R <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X = E or D <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X = S or T <400> 98 Xaa Val Xaa Asn Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X = S or T <400> 99 Trp Gln Gly Xaa His Phe Pro Arg Xaa 1 5 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> X = S or T <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> X = F or Y <400> 100 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Xaa Phe Xaa Xaa 1 5 10 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 102 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3와 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3가 표 1A 및 표 1B의 항체들 중 하나에 대해 나타낸 것인, Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 표 1A 및 표 1B의 항체들 중 하나에 대해 나타낸 것인, 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 표 1A 및 표 1B의 항체들 중 하나에 대해 나타낸 것인, 항체 또는 이의 단편.
중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하고,
중쇄 CDR1이 서열번호 16, 19 또는 20 중 하나를 포함하고,
중쇄 CDR2가 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 하나를 포함하고,
중쇄 CDR3가 서열번호 18, 24 또는 25 중 하나를 포함하고,
경쇄 CDR1이 서열번호 26, 29, 31 또는 32 중 하나를 포함하고,
경쇄 CDR2가 서열번호 33, 34, 35 또는 36 중 하나를 포함하고,
경쇄 CDR3가 서열번호 28, 38 또는 39 중 하나를 포함하는,
Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이, CDR을 제외하고는, 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역이, CDR을 제외하고는, 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한, 항체 또는 이의 단편.
제5항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이, CDR을 제외하고는, 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 98% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역이, CDR을 제외하고는, 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 98% 동일한, 항체 또는 이의 단편.
제6항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택되고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택되는, 항체 또는 이의 단편.
중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하고,
중쇄 CDR1은 X₁이 Y 또는 F인 아미노산 서열 GFTFSNX₁GMS (서열번호 88)을 포함하고;
중쇄 CDR2는 X₁이 I 또는 V인 아미노산 서열 SX₁RSGSGRTYYSDNVKG (서열번호 89)을 포함하고;
중쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T인 아미노산 서열 YDHYX₁GX₂SDY (서열번호 90)을 포함하고;
경쇄 CDR1은 아미노산 서열 KSSQSLLDYDGKTYLN (서열번호 91)을 포함하고;
경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRDX₃ (서열번호 92)을 포함하고;
경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T인 아미노산 서열 WQGTHFPRX₁ (서열번호 93)을 포함하는,
Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제8항에 있어서, 상기 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 F 또는 Y인 WQGTHFPRX₁FX₂ (서열번호 94)를 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 중쇄 가변 영역과 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한 경쇄 가변 영역을 포함하고,
중쇄 CDR1은 X₁이 S 또는 A이고 X₂가 Y 또는 F인 아미노산 서열 GFTFX₁NX₂GMS (서열번호 95)을 포함하고;
중쇄 CDR2는 X₁이 I 또는 V이고, X₂가 S 또는 G이고 X₃가 S 또는 G인 아미노산 서열 SX₁RSGX₂X₃RTYYSDNVKG (서열번호 96)을 포함하고;
중쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T인 아미노산 서열 YDHYX₁GX₂SDY (서열번호 90)을 포함하고;
경쇄 CDR1은 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 V, M 또는 L이고 X₃가 Y, T 또는 S인 아미노산 서열 X₁SSQSLX₂DX₃DGKTYLN (서열번호 97)을 포함하고;
경쇄 CDR2는 X₁이 K 또는 R이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 E 또는 D이고 X₄가 S 또는 T인 아미노산 서열 X₁VX₂NRX₃X₄ (서열번호 98)을 포함하고;
경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T인 아미노산 서열 WQGX₁HFPRX₂ (서열번호 99)을 포함하는,
Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제10항에 있어서, 상기 경쇄 CDR3는 X₁이 S 또는 T이고 X₂가 S 또는 T이고 X₃가 F 또는 Y인 WQGTHFPRX₁FX₂X₃ (서열번호 100)를 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 IgG1 항체인, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체 또는 재조합 항체인, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 또는 Fv인, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 40에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 41에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Aβ의 아미노산 1-7로부터 유래한 아미노산 위치 3곳 이상을 포함한 아미노산 서열을 가진 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편; 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편의 제조 방법으로서, 상기 방법이 (a) 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 세포를, 세포가 항체 또는 이의 단편을 분비하도록 배양하는 단계; 및 (b) 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 생산하는 세포주를 구축하는 방법으로서, 상기 방법이 (a) 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄와 선별가능한 마커를 암호화하는 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 벡터를 증가된 카피 수로 포함하는 세포를 선별하기 위한 조건에서 세포를 증식하는 단계; (c) 선별한 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 항체 또는 이의 단편의 수율에 기반하여 선별한 단일 세포로부터 클로닝한 세포를 보관 (banking)하는 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 세포를 선별 조건에서 증식하는 단계, 및 천연적으로 발현하고 적어도 100 mg/L/10⁶ 세포/24 h으로 분비하는 세포주를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 생성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 아밀로이드 생성 질환이 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 알츠하이머 질환 환자에게 상기 질환을 치료하는데 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머 질환으로 진단된 환자를 치료하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 알츠하이머 질환 환자에게 상기 질환의 위험을 낮추거나 또는 발병 개시를 지연하는데 유효한 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 유전자 또는 생화학적 마커로부터 질환의 위험이 확정된 환자에서 알츠하이머 질환의 위험을 낮추거나 또는 알츠하이머 질환의 발병 개시를 지연하는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환과 관련한 병태 또는 질환을 가진 개체에서 인지 개선을 달성하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 아밀로이드 생성 질환이 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애인, 방법.
인간 개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 다운 증후군 또는 임상 또는 전임상 알츠하이머 질환을 치료하는 방법.
인간 개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 아밀로이드 플라크 생성을 저해하는 방법.
인간 개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체의 뇌에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효한 용법으로 투여하여 개체에서 아밀로이드 플라크를 저해 또는 감소시키는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가진 개체 또는 발병 위험이 있는 개체에서 아밀로이드 플라크를 저해 또는 감소시키는 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 플라크가 Aβ₁ _-42, Aβ의 피로글루타메이트 종 (예, Aβ_pE3 _-42) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계, 및 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가진 개체 또는 아밀로이드 생성 질환 위험이 있는 개체에서 아밀로이드 플라크를 검출하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 아밀로이드 생성 질환이 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애인, 방법.
제35항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 표지된, 방법.
제35항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 형광 표지 물질, 상자성 표지물질 또는 방사성 표지 물질로 표지된, 방법.
제38항에 있어서, 상기 방사성 표지 물질이 양전자 방출 단층촬영술 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 이용해 검출되는, 방법.
아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여한 다음 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편의 1차 함량을 검출함으로써, 치료하기 전 개체에서 아밀로이드 플라크의 1차 수준을 측정하는 단계,
(b) 개체에 치료제를 투여하는 단계,
(c) 개체에 항체 또는 이의 단편을 투여한 다음 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출함으로써, 치료 후 개체에서 아밀로이드 플라크의 2차 수준을 측정하는 단계를 포함하고,
아밀로이드 플라크의 수준 감소는 긍정적인 치료 반응을 의미하는, 방법.
아밀로이드 생성 질환에 대해 치료 중인 개체에서 치료 효능을 측정하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여한 다음 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편의 1차 함량을 검출함으로써, 치료하기 전 개체에서 아밀로이드 플라크의 1차 수준을 측정하는 단계,
(b) 개체에 치료제를 투여하는 단계,
(c) 개체에 항체 또는 이의 단편을 투여한 다음 개체에서 Aβ에 결합된 항체 또는 이의 단편을 검출함으로써, 치료 후 개체에서 아밀로이드 플라크의 2차 수준을 측정하는 단계를 포함하고,
아밀로이드 플라크의 수준 변화가 없거나 또는 아밀로이드 플라크의 소폭 증가는 긍정적인 치료 반응을 의미하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 Aβ의 소거를 촉진하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 Aβ가 개체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 Aβ를 소거하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 Aβ가 개체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 Aβ를 감소시키는 방법.
제46항에 있어서, 상기 Aβ가 개체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 Aβ 축적 또는 응집을 감소시키는 방법.
제48항에 있어서, 상기 Aβ가 개체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 개체에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 Aβ가 개체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하여 인간 개체에서 뇌 조직에서 Aβ의 소거를 촉진하는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가지거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ의 소거를 촉진하는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하여 개체의 뇌 조직에서 Aβ를 소거하는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가지거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ를 소거하는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하여 개체의 뇌 조직에서 Aβ를 감소시키는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가지거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ를 감소시키는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하여 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 감소시키는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가지거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 감소시키는 방법.
개체에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 유효 용법으로 투여하여 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해하는 것을 포함하는, 아밀로이드 생성 질환을 가지거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 뇌 조직에서 Aβ 축적 또는 응집을 저해하는 방법.
제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 생성 질환이 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 성숙기 발병 당뇨병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 전두측두엽 치매, 다운 증후군 또는 경도 인지 장애인, 방법.
제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Aβ가 Aβ₁ _-42, Aβ의 피로글루타메이트 종 (예, Aβ_pE3 _-42) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
제24항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 말초 투여에 의해 투여되는, 방법.
제59항에 있어서, 상기 말초 투여가 정맥내 또는 피하 투여인, 방법.