WO2016092865A1 - アミロイドβの２２位及び２３位のターン構造を極めて特異的に認識する抗体 - Google Patents

アミロイドβの２２位及び２３位のターン構造を極めて特異的に認識する抗体 Download PDF

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一馬 村上
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that highly specifically recognizes amyloid ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23, a method for measuring amyloid ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23 using the antibody,
  • the present invention also relates to a diagnostic method and a therapeutic method for Alzheimer's disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ amyloid ⁇ protein
  • a ⁇ 40 amyloid precursor protein
  • a ⁇ 42 amyloid precursor protein
  • a ⁇ 42 neurotoxicity through radical formation is closely related to radicalization at 10th tyrosine and 35th methionine with generation of reactive oxygen species.
  • evidence has shown that accumulation of oligomers of A ⁇ induces AD through synaptic toxicity.
  • AD model mice are inoculated with A ⁇ aggregates as a vaccine, deposition of A ⁇ in the brain is reduced and cognitive dysfunction is suppressed. Therefore, immunization with A ⁇ is considered to be a promising method for AD treatment. Therefore, a clinical trial (AN1792) in which AD patients were immunized with A ⁇ 42 was conducted, but has been discontinued due to a serious side effect of excessive immune activation. Thereafter, anti-A ⁇ antibodies are expected as AD therapeutic agents, and development is continued until now.
  • the present inventors have a turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ 42 by using, as an antigen, a peptide in which glutamic acid at position 22 of A ⁇ is substituted with proline and the turn structure at the site is fixed. It has been reported that an antibody that specifically recognizes a toxic conformer can be prepared (Patent Document 2).
  • JP 2006-265189 A International publication WO2011 / 045945
  • a ⁇ has a turn structure at the amino acids at positions 22 and 23, so that aggregation of amyloid is promoted and leads to the onset of AD.
  • 22,23-turn A ⁇ an antibody specifically recognizing A ⁇ having a turn structure in the amino acid
  • IBL-101 antibody deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit
  • the IBL-101 antibody has high specificity for binding to polymerized wild-type A ⁇ and low specificity for binding to A ⁇ without a turn structure. Therefore, IBL-101 antibody is expected to be applied to the diagnosis and treatment of AD. It had been. However, as a result of investigations on the IBL-101 antibody, a certain effect was suggested in a treatment experiment using an AD model mouse, but it was thought that the antibody could not be practically used as a therapeutic agent. Therefore, the present inventors conducted further analysis on the cause of such problems in the IBL-101 antibody.
  • the present inventors have recognized that the IBL-101 antibody recognizes relatively high oligomers of A ⁇ and wild type A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23, but has a turn structure at positions 22 and 23. It was noted that it could bind to other A ⁇ that was not taken.
  • the present inventors have found that an antibody excellent in specificity compared to the IBL-101 antibody is an AD model mouse. It has been found that it has an excellent effect of improving cognitive function, etc. in treatment experiments using. In particular, such an antibody showed an excellent effect not seen in conventional antibodies that improves memory ability of mice after onset of AD even after single administration.
  • binding to the oligomers of 22,23-turn A ⁇ is stronger than the binding to 22,23-turn A ⁇ monomers. It was found to be. From these results, we have very specific binding to 22,23-turn A ⁇ monomer (ie, hardly bind to A ⁇ of other structures) for diagnosis and treatment of AD, preferably Furthermore, it has been found that it is important to use an antibody that binds strongly to the oligomer of 22,23-turn A ⁇ .
  • the present inventors recognize an antibody that recognizes 22,23-turn A ⁇ very specifically, or an oligomer that recognizes 22,23-turn A ⁇ very specifically and is 22,23-turn A ⁇ . It has been found that treatment and diagnosis of AD can be performed by using an antibody that binds strongly to.
  • an antibody drug that binds only to an A ⁇ oligomer is used as a strategy for targeting only A ⁇ monomer and fibril (Aducanumab). Crenezumab, BAN2401). That is, the conventional idea was based on the presence or absence of toxicity depending on the degree of polymerization without distinguishing the A ⁇ monomer by structure. The present inventors have so far reported the hypothesis that even in the same A ⁇ monomer, there is a structure capable of exerting toxicity in the structure. However, according to the present invention, the therapeutic effect / diagnosis effect of AD can be improved. It has been found for the first time that it is important for antibodies to recognize 22,23-turn A ⁇ “very” specifically.
  • the inventors of the present invention have understood that the A ⁇ monomer, which has been understood without distinction by structure, is actually very precisely controlled by its structure, and 22,23-turn A ⁇ is cohesive.
  • a ⁇ having high (highly toxic) A ⁇ has a low aggregation property (low toxicity, physiological), and 22,23-turn A ⁇ is highly specific. It is the most important to develop anti-A ⁇ antibodies as AD therapeutics / diagnostics, and it has been found for the first time that it can solve problems of side effects and low effectiveness.
  • the antibody of the present invention can target not only A ⁇ oligomers but also A ⁇ monomers, it can suppress A ⁇ aggregation from the monomer stage before A ⁇ aggregation proceeds (before A ⁇ oligomer generation). In this respect, it is possible to provide a superior drug as compared with conventionally developed antibody drugs.
  • the present invention relates to an antibody that recognizes A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23 very specifically and use thereof.
  • the present invention relates to an antibody specific for 22,23-turn A ⁇ that binds to 22,23-turn A ⁇ but does not bind to A ⁇ having any other structure, and uses thereof.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • the term “A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23” means “E22P-A ⁇ ” or “IBL-102 antibody” May be replaced with “A ⁇ to which is bound”.
  • An antibody or an immunoreactive fragment thereof that recognizes A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23 very specifically but does not recognize A ⁇ having another structure.
  • the antibody or immunoreactive fragment thereof according to (1) which further recognizes an oligomer of A ⁇ .
  • the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (4), wherein the other structure of A ⁇ includes at least one structure selected from the following group: Turn structure at amino acids 21 and 22 of A ⁇ , Turn structure at amino acids 23 and 24 of A ⁇ , Turn structure at amino acids 24 and 25 of A ⁇ , Turn at amino acids 25 and 26 of A ⁇ Structure and turn structure at amino acids 35 and 36 of A ⁇ .
  • VH has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and VL recognizes an epitope bound by an antibody having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 very specifically.
  • An antibody or an immunoreactive fragment thereof that has the amino acid sequence of No. 4 and that does not recognize an epitope to which an antibody having a VL having the amino acid sequence of SEQ ID No. 11 does not bind.
  • VH has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and VL competitively inhibits the binding between an antibody having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and its antigen. 4.
  • An antibody or an immunoreactive fragment thereof that does not bind to an epitope that has the amino acid sequence described in 4 and that does not bind to an antibody whose VL has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, respectively, or the antibody or immunity thereof according to (8) Reactive fragment.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7, respectively. Or an immunoreactive fragment thereof.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, respectively, or the antibody or immunity thereof according to (10) Reactive fragment.
  • An antibody or an immunoreactive fragment thereof, wherein VH has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody or immunoreactive fragment thereof according to (12), wherein VL has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13).
  • the pharmaceutical composition according to (21) which is used for prevention, treatment or improvement of AD.
  • the pharmaceutical composition according to (21) for improving memory impairment in AD patients (25) A diagnostic composition comprising the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13).
  • the diagnostic composition according to (25) for use in diagnosis of AD (27) A kit for measuring a toxic conformer of A ⁇ , comprising the antibody or the immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13).
  • a method for measuring a toxic conformer level of A ⁇ in a sample comprising a step of bringing the sample into contact with the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13).
  • AD diagnosis method comprising the following steps: a) contacting a sample derived from a subject with at least one of the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13) in vitro; b) measuring the level of antigen bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof, and c) Diagnosing the presence or absence or degree of AD in the subject from the determined antigen level.
  • the level of the antigen binding to the antibody or the immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13) is higher than the same level in a sample derived from a healthy person, AD The method is diagnosed as being likely to be suffering from.
  • AD diagnosis method comprising the following steps: a) contacting a sample derived from a subject with at least one antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13); b) measuring the level of antigen bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof; c) measuring the total amount of A ⁇ in the subject-derived sample by contacting the non-A ⁇ structure-specific anti-A ⁇ antibody with the subject-derived sample and measuring the amount of the conjugate thereof; and d) The ratio of the level of the antigen binding to the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13) and the total A ⁇ level in the sample derived from the subject was calculated and determined.
  • the level of the antigen binding to the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13) with respect to the total A ⁇ level is higher than the same ratio in a sample derived from a healthy person In some cases, the method is determined to be likely to have AD.
  • a method for determining the presence or absence of a toxic conformer of amyloid ⁇ in a specimen (A) contacting the specimen with the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13); (B) detecting a toxic conformer of amyloid ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof; (C) If a toxic conformer of amyloid ⁇ is detected in the step, it is determined that a toxic conformer of amyloid ⁇ is present in the sample, and if a toxic conformer of amyloid ⁇ is not detected in the step, Determining the absence of a toxic conformer of amyloid ⁇ in the sample.
  • (33) A method for determining the level of a toxic conformer of amyloid ⁇ in a specimen, (A) contacting the specimen with the antibody or immunoreactive fragment thereof according to any one of (1) to (13); (B) measuring the amount of toxic conformer of amyloid ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof; (C) A method comprising calculating a level of toxic conformer of amyloid ⁇ in a specimen from the detected amount of toxic conformer.
  • a ⁇ having a turn structure at the 22nd and 23rd amino acids means A ⁇ having a bent structure (stereostructure) at the 22nd amino acid and the 23rd amino acid (in this specification) , “22,23-turn A ⁇ ”).
  • the 22,23-turn A ⁇ includes 22,23-turn A ⁇ 42 and 22,23-turn A ⁇ 40, and is preferably 22,23-turn A ⁇ 42.
  • the “turn structure at amino acids 22 and 23 of amyloid ⁇ ” means a folded structure (steric structure) at the 22nd and 23rd amino acids of A ⁇ .
  • the turn structure at the 22nd amino acid and the 23rd amino acid of A ⁇ and / or A ⁇ having this structure are collectively referred to as “toxic toxic conformer of A ⁇ ”.
  • the turn structure at amino acids 22 and 23 of amyloid ⁇ is, for example, the 22nd amino acid in an A ⁇ mutant (E22P-A ⁇ 42 such as E22P-A ⁇ 42 or E22P-A ⁇ 40) in which the 22nd glutamic acid is replaced with proline.
  • the bending (turn) structure in the 23rd amino acid may be sufficient.
  • “A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23” is “IBL- It may be replaced with “A ⁇ recognized by antibody 102”.
  • a ⁇ is an abbreviation for amyloid ⁇
  • a ⁇ 42 is a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15
  • a ⁇ 40 is a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. That is.
  • positions 22 and 23 in expressions such as “positions 22 and 23 of amyloid ⁇ ” or “A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23” are SEQ ID NO: 15 and It means the positions of the 22nd and 23rd amino acids (glutamic acid and aspartic acid in the wild type, respectively) in SEQ ID NO: 16.
  • the present invention recognizes “A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23” and / or “a turn structure at amino acids 22 and 23 of amyloid ⁇ ” (toxic conformer of A ⁇ ) very specifically. It relates to antibodies or immunoreactive fragments thereof. Therefore, the antibody of the present invention recognizes 22,23-turn A ⁇ 42 and / or 22,23-turn A ⁇ 40 very specifically.
  • the recognition of the toxic conformer of A ⁇ by the antibody of the present invention or its immunoreactive fragment may not depend on the type of the 22nd amino acid. That is, the “epitope” recognized by the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof requires the structure and amino acid (excluding the 22nd glutamic acid) present in A ⁇ having a turn structure at the 22nd and 23rd amino acids. However, it is not necessary that the 22nd amino acid is glutamic acid.
  • the antibody that recognizes the A ⁇ toxic conformer of the present invention very specifically does not limit the recognition site as long as it recognizes A ⁇ having a turn structure at amino acids 22 and 23 very specifically. Absent.
  • the site recognized by the antibody that recognizes the A ⁇ toxicity conformer of the present invention very specifically is, for example, the amino acid at position 23 of A ⁇ (aspartic acid) and / or its adjacent amino acid, for example, position 22 of A ⁇ or It may be an amino acid within 1 to 10 residues (preferably 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3 residues) from the 23rd amino acid.
  • the antibody of the present invention may be an antibody that recognizes A ⁇ toxic conformer very specifically and also recognizes the amino acid at position 23 (aspartic acid) of A ⁇ .
  • the antibody that specifically recognizes the toxic conformer of A ⁇ of the present invention is a steric epitope on A ⁇ that is distant from positions 22 and 23, and has a turn structure at amino acids at positions 22 and 23. You may recognize the epitope which may arise by having.
  • the antibody of the present invention may recognize a region where A ⁇ forms an intermolecular ⁇ sheet. More preferably, the antibody of the present invention recognizes the 27th asparagine and the 31st isoleucine present in such a region.
  • the antibody of the present invention may bind to the third glutamic acid and the fourth phenylalanine of A ⁇ .
  • the antibody of the present invention may bind to the 11th glutamic acid, the 12th valine, the 13th histidine, and the 14th histidine of A ⁇ .
  • oligomer of A ⁇ means an A ⁇ dimer to an icosamer or an aggregate of 90 to 650 kDa A ⁇ .
  • a ⁇ oligomers include A ⁇ dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers, heptamers, octamers, nonamers, decamers and protofibrils.
  • the oligomer of A ⁇ is a multimer forming an intermolecular ⁇ sheet.
  • the antibody of the present invention may preferably bind to an oligomer (for example, a dimer) of A ⁇ (preferably 22,23-turn A ⁇ or E22P-A ⁇ 42).
  • an oligomer for example, a dimer
  • the invention relates to an antibody or immunoreactive fragment thereof that binds to both 22,23-turn A ⁇ and / or E22P-A ⁇ 42 monomers and oligomers (eg, dimers).
  • a ⁇ can take various structures such as a structure having a turn structure at amino acids 22 and 23, a structure close to a straight line, and a structure having a turn structure at amino acids 25 and 26. Yes.
  • another structure (other than a structure having a turn structure at the 22nd and 23rd amino acids) means a structure of A ⁇ other than a structure having a turn structure at the 22nd and 23rd amino acids.
  • the turn structure at amino acids 21 and 22 of A ⁇ the turn structure at amino acids 23 and 24 of A ⁇ , the turn structure at amino acids 24 and 25 of A ⁇ , and the 25 position of A ⁇
  • the turn structure of amino acids at positions 26 the turn structure of amino acids at positions 35 and 36 of A ⁇
  • the linear structure including structures close to a straight line and structures not included in the turn structure, and so on.
  • “other structures” include A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, L34P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P-A ⁇ 42, G38P -A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ 42, and / or a structure possessed by I41P-A ⁇ 42, for example, a turn structure possessed by these peptides may be included.
  • a ⁇ having another structure means A ⁇ having a structure other than the turn structure at the 22nd and 23rd amino acids, specifically, the turn structure at the 21st and 22nd amino acids of A ⁇ .
  • a ⁇ having a turn structure at amino acids 23 and 24 of A ⁇ A ⁇ having a turn structure at amino acids 24 and 25 of A ⁇ , and having a turn structure at amino acids 25 and 26 of A ⁇ A ⁇
  • a ⁇ having a turn structure at the 33rd and 34th amino acids of A ⁇ A ⁇ having a turn structure at the 34th and 35th amino acids of A ⁇
  • a ⁇ having a turn structure at the 35th and 36th amino acids of A ⁇ A ⁇ having a turn structure at the amino acids at positions 36 and 37 of A ⁇ , and at the amino acids at positions 37 and 38 of A ⁇ A ⁇ having a ring structure, A ⁇ having a turn structure at amino acids 38 and 39 of A ⁇ , A ⁇ having a turn structure at amino acids 40 and 41 of A ⁇ , and a turn structure at amino acids 41 and 42 of A ⁇
  • a ⁇ having another structure includes A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, L34P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P- A ⁇ having a structure of A ⁇ 42, G38P-A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ 42, and / or I41P-A ⁇ 42 may be included.
  • the present invention relates to an antibody that recognizes the 22, 23-turn A ⁇ and / or the turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ very specifically.
  • the present invention specifically recognizes the turn structure at amino acids 22 and 23 of 22,23-turn A ⁇ and / or A ⁇ , but other forms of A ⁇ and / or A ⁇ having other structures.
  • Structure refers to an antibody that does not recognize. That is, the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof specifically recognizes the turn structure at the 22nd and 23rd amino acids of 22,23-turn A ⁇ or A ⁇ , but A ⁇ having other structures and / or It does not recognize other structures of A ⁇ , such as turn structures at other sites of A ⁇ .
  • does not bind” and “does not recognize” does not mean that they do not bind at all or does not recognize them at all, but can be sufficiently distinguished from the antigen of interest (a toxic conformer of A ⁇ ) It means low affinity for other structures.
  • does not bind” and “does not recognize” means the intensity (for example, fluorescence intensity) detected by ELISA or EIA for the binding of a test antibody to A ⁇ having another structure or other structure of A ⁇ .
  • Detection by ELISA or EIA can be carried out in accordance with the description in the following (known measurement methods using antibody molecules).
  • the antibody of the present invention can react with A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, to the main reaction (binding to 22,23-turn A ⁇ or E22P-A ⁇ 42), One or more arbitrary peptides selected from L34P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P-A ⁇ 42, G38P-A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ 42, and I41P-A ⁇ 42 (including all cases)
  • the cross-reaction rate of the bond to 10% or less, 8% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, 0.5% or less, or 0.3% or less It may be.
  • the antibodies of the present invention may react with A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, and M35P-A ⁇ 42 for the main reaction (binding to 22,23-turn A ⁇ or E22P-A ⁇ 42).
  • the cross-reaction rate of the bond to each was 0.3% or less, 0.3% or less, 0.5% or less, 0.4% or less, 0.6% or less, and 0.7% or less, respectively. Furthermore, 0.27% or less, 0.28% or less, 0.50% or less, 0.33% or less, 0.53% or less, and 0.68% or less, respectively. Good.
  • the cross reaction rate can be determined using the method described in (Cross reaction rate) described later.
  • an antibody or an immunoreactive fragment thereof recognizes (binds) "specifically” as a peptide or protein in which the antibody or immunoreactive fragment thereof has another amino acid sequence or other three-dimensional structure. It means to bind with substantially higher affinity to the toxic conformer of A ⁇ than its affinity for.
  • an antibody or immunoreactive fragment thereof recognizes (binds) “very specifically” when the antibody or immunoreactive fragment thereof is another amino acid that closely approximates its epitope or antigen. It means binding to the epitope or antigen with substantially higher affinity compared to the affinity for peptides or proteins having a sequence or other conformation.
  • the antibody of the present invention recognizes (binds) “very specifically” having the same amino acid sequence as A ⁇ as its antigen or an amino acid sequence close to E22P-A ⁇ 42 (difference of 1 to 2 amino acids) Peptide or peptide or protein having the same amino acid sequence as A ⁇ as its antigen or an amino acid sequence close to E22P-A ⁇ 42 (difference of 1 to 2 amino acids) and having a very close three-dimensional structure, ie, A ⁇ (Excluding 22,23-turn A ⁇ ) or A ⁇ variants (eg, A21P-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, L34P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P) -A ⁇ 42, G38P-A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ 42, and Or binding with 22,23-turn A ⁇ or E22P-
  • binding with substantially high affinity means to detect a specific amino acid sequence or three-dimensional structure of interest separately from other amino acid sequences or three-dimensional structures by a desired measuring apparatus or method. It means as high an affinity as possible.
  • the substantially high affinity is 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more as intensity detected by ELISA or EIA (for example, fluorescence intensity), It may mean 9 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, 50 times or more, 100 times or more.
  • the present invention provides an antibody or immunoreactive fragment thereof that binds specifically to E22P-A ⁇ 42 but does not bind to one or more (preferably all) peptides selected from the following group: Regarding: A21P-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, L34P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P-A ⁇ 42, G38P-A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ , And / or I41P-A ⁇ 42.
  • the antibody of the present invention recognizes (binds) “very specifically” even when the antibody or immunoreactive fragment thereof has a high concentration, or an epitope of the antibody or immunoreactive fragment thereof or It may mean that it does not bind to other amino acid sequences or other three-dimensional structures that are very close to the antigen.
  • the antibody of the present invention recognizes (binds) “very specifically” that other high-concentration antibodies or immunoreactive fragments thereof are closely related to other epitopes or antigens, or other amino acid sequences. It may mean that it binds to its epitope with a substantially higher affinity compared to the affinity for a peptide or protein having the following three-dimensional structure.
  • the high-concentration antibody or immunoreactive fragment thereof is, for example, 15 ng / mL or higher, 30 ng / mL or higher, 40 ng / mL or higher, 50 ng / mL or higher, 60 ng / mL or More, 70 ng / mL or more, 80 ng / mL or more, 90 ng / mL or more, 100 ng / mL or more, 110 ng / mL or more, 120 ng / mL or more, 130 ng / mL or more As above, it may be 140 ng / mL or more, or 150 ng / mL or more. Such specificity may also be measured, for example, in an ELISA or EIA assay.
  • the binding rate constant (Ka1) in the binding of the antibody of the present invention to the toxic conformer of A ⁇ or E22P-A ⁇ 42 is, for example, 1 ⁇ 10 4 Ms ⁇ 1 or more, 1 ⁇ 10 5 Ms ⁇ 1 or more, 2 ⁇ 10 5 Ms ⁇ 1 or more, 2.3 ⁇ 10 5 Ms ⁇ 1 or more can be mentioned, and preferably 2.32 ⁇ 10 5 or more.
  • the dissociation rate constant (Kd1) in the binding of the antibody of the present invention to the toxic conformer of A ⁇ or E22P-A ⁇ 42 is, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or less, 9 ⁇ 10 ⁇ 4 or less, or 8 ⁇ 10 ⁇ 4 or less.
  • the binding constant (KD) in the binding of the antibody of the present invention to the toxic conformer of A ⁇ or E22P-A ⁇ 42 is, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 8 (M) or less, 7 ⁇ 10 ⁇ 8 (M) or less, 5 ⁇ 10 It can be -8 (M) or less, 4 x 10 -9 or less, preferably 3.05 x 10 -9 or less.
  • the antibody association rate constant (Ka1), dissociation rate constant (Kd1), and association constant (KD) in this specification are BIACORE (GE Healthcare Biosciences, BIACORE-X100), and a manufacturer's manual.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • a “monoclonal antibody” is an antibody having a substantially uniform structure that reacts with a single antigenic determinant.
  • the antibody of the present invention includes non-human animal antibodies, antibodies having the amino acid sequences of non-human animal antibodies and human-derived antibodies, and human antibodies.
  • Non-human animal antibodies include, for example, antibodies such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, sheep, goats, chickens and ducks, and preferably hybridomas can be produced.
  • Examples of the antibody having the amino acid sequence of a non-human animal antibody and the amino acid sequence of a human-derived antibody include human chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • the term “chimeric antibody” is a non-human animal-derived antibody that has been genetically modified to have the same constant region as that of a human antibody. It is an antibody, and preferably a human / mouse chimeric antibody (see European Patent Publication EP0125023).
  • “Humanized antibody” refers to a human antibody having a primary structure other than the complementary recognition region (CDR) of the H and L chains of an antibody that is derived from a non-human animal and binds specifically to an A ⁇ toxic conformer. It is an antibody that has been genetically engineered into the primary structure.
  • CDR refers to Kabat et al. (“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E. et al., US Department of Health Services and Human Services, 1983) or ChoCho. Biol., 196: 901-917).
  • Human antibody refers to a human antibody that is an expression product of a completely human-derived antibody gene. For example, a monoclonal antibody produced using a transgenic animal into which a gene involved in human antibody production has been introduced (See European Patent Publication EP0546073).
  • the antibody of the present invention is preferably a human / non-human animal chimeric antibody, humanized antibody, or human It is an antibody.
  • the immunoglobulin class of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be any immunoglobulin class (isotype) of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, or IgY, preferably IgG.
  • any subclass IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 may be used.
  • the antibody of the present invention may be monospecific, bispecific (bispecific antibody), or trispecific (trispecific antibody) (for example, WO1991 / 003493).
  • an “immunoreactive fragment” is a protein or peptide containing a part (partial fragment) of an antibody, and retains the action (immunoreactivity / binding) of the antibody on the antigen. Means.
  • immunoreactive fragments include F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fab 3 , single chain Fv (hereinafter referred to as “scFv”), (tandem) bispecific single chain Fv ( sc (Fv) 2), single chain triple body, Nanobodies, Daibarento V H H, Pentabarento V H H, minibody, (double-stranded) diabody, a tandem diabody, bispecific bird body, bispecific by body , Dual affinity retargeting molecule (DART), triabody (or tribody), tetrabody (or [sc (Fv) 2 ] 2 ), or (scFv-SA) 4 ) disulfide bond Fv (hereinafter referred to as “dsFv”) , Compact IgG, heavy chain antibodies, or polymers thereof (N true Biotechnology, 29 (1): 5-6 (2011); Maneesh Jain et al., TRENDS in Biotechnology, 25 (7)
  • the antibody of the present invention includes (i) an antibody in which CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7, respectively, or an immune reaction thereof (Ii) the antibody or immunoreactive fragment of (i) above, wherein CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region are SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, respectively. Or an immunoreactive fragment thereof having the amino acid sequence described in 1.
  • an antibody or an immunoreactive fragment thereof that specifically recognizes a turn structure at amino acids 22 and 23 of amyloid ⁇ includes, for example, the following (iii) to (viii):
  • VH is encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4
  • VL is SEQ ID NO: 11
  • the heavy chain variable region CDR1, CDR2, and CDR3 are further represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • / or CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, respectively. Also good.
  • the reference to “IBL-102 monoclonal antibody” refers to the antibodies described in the above (i) to (viii) in a broad sense (unless in particular, it is inconsistent) And immunoreactive fragments thereof.
  • amino acid sequences described in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 are amino acid sequences represented by underline and bold in the amino acid sequence shown as IBL-102HC in FIG. They may be replaced in the order they appear after reading from the upper left to the left. That is, it may be SEQ ID NO: 5 (DYNMD), SEQ ID NO: 6 (DINPNTGVTIDNPKFKG), or SEQ ID NO: 7 (LPDNYVMDY).
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14 refers to three types of amino acid sequences indicated as IBL-102LC in FIG.
  • SEQ ID NO: 12 may be replaced with the amino acid sequence in the frame in the amino acid sequence shown as IBL-102HC in FIG.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 may be replaced with the amino acid sequence within the frame in the amino acid sequence shown as IBL-102LC in FIG.
  • the IBL-102 monoclonal antibody provided herein can bind to a substance having a high correlation with AD and provides a certain therapeutic effect, so that the antigen ( It has also been shown that a protein having an epitope to which the IBL-102 monoclonal antibody binds is deeply related to the onset / aggravation of AD and the toxic effects of A ⁇ . Such an effect was not confirmed in the IBL-101 antibody obtained from an antigen containing a turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ .
  • the antigen (or epitope) to which the IBL-102 monoclonal antibody binds and the antibody or immunoreactive fragment thereof that binds with the same specificity as IBL-102 can be used for the diagnosis and treatment of AD in the same manner as the IBL-102 monoclonal antibody. It was shown that it can be used.
  • the invention relates to an antibody or immunoreactive fragment thereof that binds very specifically to an antigen (or epitope) to which an IBL-102 monoclonal antibody binds.
  • the present invention recognizes an epitope that can be present in A ⁇ to which an IBL-102 antibody binds, but does not bind to an antibody that does not recognize an epitope that can be present in A ⁇ .
  • the present invention relates to an antibody that recognizes A ⁇ (or E22P-A ⁇ 42) to which IBL-102 antibody binds very specifically, but does not recognize A ⁇ having another structure to which IBL-102 antibody does not bind, or immunity thereof. It may be a reactive fragment.
  • the invention relates to specific binding of an IBL-102 antibody to A ⁇ (eg, 22, 23-turn A ⁇ , E22P-A ⁇ 42, or A ⁇ oligomers (including oligomers of E22P-A ⁇ 42)). It is a competing antibody or an immunoreactive fragment thereof, and preferably further relates to an antibody or an immunoreactive fragment thereof that does not bind to A ⁇ having a structure to which the IBL-102 antibody does not bind.
  • test antibody recognizes (binds) the target epitope or the target antigen very specifically is determined by the peptide having the epitope or the binding of the antibody to the antigen, and others. It can be determined by examining the binding of the antibody to other epitopes, antigens having other structures, or other antigens. Such binding can be measured according to the description in the following (known measurement method using antibody molecules). Whether or not the test antibody competes with the IBL-102 antibody for specific binding to A ⁇ (for example, a monomer or oligomer of 22,23-turn A ⁇ or E22P-A ⁇ 42) is determined according to IBL-102.
  • a ⁇ for example, a monomer or oligomer of 22,23-turn A ⁇ or E22P-A ⁇ 42
  • Amount of IBL-102 antibody bound to antigen after contacting antibody with antigen (eg, 22,23-turn A ⁇ monomer or oligomer, or E22P-A ⁇ 42) with test antibody or with IBL-102 antibody alone Can be determined by comparing. If the binding amount of the IBL-102 antibody to the antigen when the test antibody is reacted simultaneously is less than the binding amount of the antibody to the antigen when the IBL-102 antibody is added alone, The antibody can be determined to compete with the IBL-102 antibody.
  • the measurement of the binding of the antibody to the antigen can be performed according to the description in the following (known measurement method using antibody molecules).
  • An antibody or immunoreactive fragment thereof that binds specifically to the antigen (or epitope) to which the IBL-102 monoclonal antibody binds competes with the IBL-102 antibody for specific binding to A ⁇ (or E22P-A ⁇ 42). However, it does not bind to A ⁇ having a structure to which the IBL-102 antibody does not bind.
  • Antibodies or immunoreactive fragments thereof that bind very specifically to the antigen (or epitope) to which the IBL-102 monoclonal antibody binds preferably further bind to oligomers of A ⁇ (including E22P-A ⁇ 42).
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule having a polynucleotide encoding the above-described antibody of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 as VH, and a nucleic acid molecule having a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 as VL.
  • nucleic acid molecule having a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 as VH and a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 as VL.
  • the polynucleotide encoding the amino acid described in SEQ ID NO: 4 as VH may be, for example, a polynucleotide having the 126th to 479th base sequence in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 as VL may be a polynucleotide having the base sequence from the 130th position to the 465th position of SEQ ID NO: 8.
  • the present invention includes a vector having the nucleic acid molecule.
  • a vector is not particularly limited as long as it is a vector that can be used for expression of an antibody, and can be selected according to a host using an appropriate plasmid vector or the like.
  • the present invention relates to a host cell containing the vector.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a host cell that can be used for antibody expression, and includes mammalian cells (mouse cells, rat cells, rabbit cells, human cells, etc.), yeasts, microorganisms (E. coli, etc.). Can be mentioned.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the above-described antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof as an active ingredient.
  • AD can be mentioned as a target disease of the pharmaceutical composition of the present invention. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a prophylactic agent, therapeutic agent, progression inhibitor or ameliorating agent for AD.
  • the pharmaceutical composition of the present invention improves cognitive impairment (short-term or long-term memory impairment, disorientation, learning impairment, attention impairment, spatial cognitive function, and / or impaired ability to solve problems) in AD patients. It can be set as the pharmaceutical composition.
  • the present invention relates to the use of the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof for producing the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be any oral or parenteral formulation as long as it can be administered to a patient.
  • the composition for parenteral administration include injections, nasal drops, suppositories, patches, ointments and the like. Preferably, it is an injection.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can include a liquid or a lyophilized preparation.
  • a solubilizing agent such as propylene glycol or ethylenediamine
  • a buffer material such as phosphate
  • an isotonic agent such as sodium chloride or glycerin
  • a sulfite Additives such as stabilizers such as phenol, preservatives such as phenol
  • soothing agents such as lidocaine (see “Pharmaceutical Additives Encyclopedia” Yakuho Nippo Inc., “Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition” APHA Publications) .
  • examples of the storage container include ampoules, vials, prefilled syringes, pen-type syringe cartridges, infusion bags, and the like.
  • the present invention relates to a kit comprising the above-described antibody or immunologically binding fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be a kit for detecting or measuring an antigen to which an IBL-102 antibody binds.
  • the measurement kit of the present invention may be a kit for detecting or measuring a toxic conformer of A ⁇ .
  • the kit of the present invention can be used for diagnosis of AD.
  • the present invention also includes the use of the above-described antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof for producing such a kit.
  • the kit of the present invention preferably contains a carrier selected from the group consisting of a solid phase, a hapten, and an insoluble carrier.
  • the measurement kit of the present invention can be based on a known detection and / or measurement method using an antibody molecule.
  • kits for enzyme immunoassay EIA method
  • kits for simplified EIA method enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) ) Kit, radioimmunoassay method (RIA method kit), labeled immunoassay kit such as fluorescent immunoassay (FIA method) kit
  • immunoblotting method kit such as western blotting kit
  • colloidal gold agglutination Kit for immunochromatography such as kit for method
  • kit for chromatography such as kit for ion exchange chromatography and kit for affinity chromatography
  • kit for turbidimetric method TIA method
  • kit for specific wax method NIA method
  • Color method kit Latex aggregation method (LIA method) kit
  • Particle counting method CI
  • Kit for chemiluminescence assay CLIA method, CLEIA method
  • kit for precipitation reaction method kit for surface plasmon resonance method (SPR method); kit for resonant mirror detector method (RMD
  • kit of the present invention can perform desired detection and / or measurement is determined by performing each measurement method by a method well known to those skilled in the art using a standard sample or a target sample. It can be confirmed by determining whether it can be detected and / or measured.
  • the kit of the present invention comprises (i) a solid phase or hapten on which a first antibody that is the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is immobilized, and (ii) a labeled anti-A ⁇ antibody (anti-A ⁇ 42 antibody) , And an anti-A ⁇ 40 antibody, which is the same throughout the present specification).
  • a hapten it may further contain a solid phase on which a substance that specifically binds to the hapten is immobilized.
  • the first antibody may be a labeled antibody and the second antibody may be an immobilized antibody.
  • kits of the present invention (i) a solid phase on which the first antibody which is the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is immobilized, and (ii) a second antibody which is an anti-A ⁇ antibody is immobilized.
  • a solid phase on which the first antibody which is the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is immobilized (ii) a second antibody which is an anti-A ⁇ antibody is immobilized.
  • the kit may further contain a labeled substance that specifically binds to the hapten.
  • the first antibody may be a hapten-binding antibody
  • the second antibody may be a solid phase immobilized antibody.
  • kits of the present invention (i) an insoluble carrier on which the first antibody that is the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is immobilized, and (ii) a second antibody that is an anti-A ⁇ antibody is immobilized. It can be set as the kit of the immunochemical measurement containing an insoluble carrier.
  • the first antibody and the second antibody recognize different sites of A ⁇ (including A ⁇ 42 and A ⁇ 40, and the same throughout this specification).
  • the first antibody may be a monoclonal antibody or an immunoreactive fragment thereof
  • the second antibody may be a polyclonal antibody or an immunoreactive fragment thereof
  • the first antibody may be a polyclonal antibody or an immunoreactive fragment thereof
  • the antibody may be a monoclonal antibody or an immunoreactive fragment thereof
  • both the first and second antibodies may be a monoclonal antibody or an immunoreactive fragment thereof.
  • the first antibody is the above-mentioned antibody of the present invention
  • the second antibody is A ⁇ near the N-terminus (1 to 20 amino acids from the N-terminus) or C-terminus (1 to 20 from the C-terminus).
  • An antibody that specifically recognizes (amino acid) may be used.
  • kits of the present invention contains a labeled antibody or an immunobinding fragment thereof, a detectable label such as a radioactive label, an enzyme, a fluorescent label, a bioluminescent label, or a chemiluminescent label metal is used as the label. be able to.
  • a detectable label such as a radioactive label, an enzyme, a fluorescent label, a bioluminescent label, or a chemiluminescent label metal is used as the label. be able to.
  • labels include, but are not limited to, radioactive labels such as 32 P, 3 H, 125 I, and 14 C; ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, lactate oxidase, Enzymes such as alcohol oxidase, monoamine oxidase, horseradish peroxidase; coenzymes or prosthetic groups such as FAD, FMN, ATP, biotin, heme; fluorescein derivatives (fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein ovalbamil, etc.), rhodamine derivatives (Tetramethylrhodamine, Trimethylrhodamine (RITC), Texas Red, Rhodamine 110, etc.), Cy dyes (Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7), Cy-chromium, Spectrum Fluorescent labels such as green, spectrum orange, propidium iodide, allophycocyanin (APC),
  • the kit of the present invention may contain a coloring reagent, a reaction stopping reagent, a standard antigen reagent, a specimen pretreatment reagent, a blocking reagent, and the like, if necessary.
  • a coloring reagent a reaction stopping reagent
  • a standard antigen reagent a specimen pretreatment reagent
  • a blocking reagent a blocking reagent
  • the kit of the present invention may further contain a substrate that reacts with the label.
  • the kit of the present invention may include a package for storing the components of the kit such as a paper box or a plastic case, an instruction manual, and the like.
  • a tissue sample or liquid collected from a subject as a biopsy can be used as the specimen used in the kit of the present invention.
  • the biopsy used is not particularly limited as long as it is a target of desired detection and / or measurement.
  • Analysis by the kit of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively.
  • the present invention provides an agent or composition for use in the detection and / or measurement of an antigen or A ⁇ toxic conformer to which an IBL-102 antibody binds, comprising the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof.
  • an agent or composition for use in the detection and / or measurement of an antigen or A ⁇ toxic conformer to which an IBL-102 antibody binds comprising the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof.
  • the drug or composition for measurement includes a substance used for AD diagnosis, that is, a diagnostic agent for AD or a diagnostic composition for AD.
  • the present invention relates to the use of the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof for producing the diagnostic composition.
  • the detection or / and measurement agent or composition of the present invention may be applied to the above-described kit of the present invention, as necessary. Can be configured.
  • the drug or composition for detection and / or measurement of the present invention includes a form for use by administration into a living body (hereinafter referred to as “in vivo detection and / or measurement drug”, including for diagnostic imaging). Or “composition”).
  • in vivo detection and / or measurement drug including for diagnostic imaging
  • composition includes a form for use by administration into a living body (hereinafter referred to as “in vivo detection and / or measurement drug”, including for diagnostic imaging).
  • composition includes a form for use by administration into a living body (hereinafter referred to as “in vivo detection and / or measurement drug”, including for diagnostic imaging). Or “composition”).
  • the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof contains a labeling substance or is bound to the labeling substance.
  • a substance known to those skilled in the art such as a radioisotope
  • a radioisotope can be used, and preferably a positron emitting radioisotope or a ⁇ -ray radioisotope, but not limited thereto, List 131 I, 123 I, 124 I, 86 Y, 62 Cu, 64 Cu, 111 In, 67 Ga, 68 Ga, 99m Tc, 94 m Tc, 18 F, 11 C, 13 N, 15 O and 75 Br Can do.
  • the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof in the agent or composition for in vivo detection and / or measurement of the present invention is preferably a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • the in vivo detection and / or measurement agent or composition of the present invention is a pharmaceutically acceptable form suitable for administration to humans, and is a physiologically acceptable additive such as a pharmaceutical agent. May contain an acceptable diluent, buffer, solubilizer, soothing agent, solvent, stabilizer or antioxidant.
  • the dose of the drug or composition for in vivo detection and / or measurement of the present invention can be appropriately selected according to the target site, the detection / measurement / diagnosis method used, the age, sex and other conditions of the subject, and the degree of disease. it can.
  • XNY (X and Y are single-letter amino acids; N is a natural number) indicates that amino acid X at the N-position is substituted with amino acid Y
  • a ⁇ p-q (p and q are (Natural number) indicates a peptide consisting of the amino acid at the p-position to the amino acid at the p-position of A ⁇ .
  • a ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 are referred to as A ⁇ 40 and A ⁇ 42, respectively.
  • E22P-A ⁇ 42 is a peptide consisting of amino acids 1 to 42 of A ⁇ in which glutamic acid at position 22 is replaced with proline
  • G9C and E22P-A ⁇ 9-35 are those in which glycine at position 9 is replaced with cysteine.
  • a peptide consisting of amino acids from the 9th position to the 35th position of A ⁇ in which glutamic acid at position 22 is substituted with proline is shown.
  • the antibody of the present invention can bind to an A ⁇ toxic conformer with a very high specificity, it can exert an excellent effect in various uses targeting the A ⁇ toxic conformer.
  • the antibody of the present invention can be used for AD diagnosis.
  • the antibody of the present invention can bind to both the monomeric and dimeric states of the toxic conformer of A ⁇ , the use of A ⁇ polymerization contributes to the onset or exacerbation, for example, the treatment or prevention of AD Can be used for
  • the vertical axis shows the amount (pg / mL) of A ⁇ toxic conformer (A ⁇ that binds to IBL-102 antibody).
  • the left graph shows the results of the wild type A ⁇ 42 (Wt-A ⁇ 42) added group, and the right graph shows the results of the E22P-A ⁇ 42 added group.
  • the vertical axis shows the average value of the survival rate (%) relative to the group without cytotoxic stimulation and without antibody addition (Veh), and the error bar shows the standard error.
  • the error bar shows the standard error.
  • no cytotoxic stimulation and no antibody addition (Veh), with cell stimulation and no antibody addition (-), with cell stimulation and IgG addition (IgG), and with cell stimulation and IBL-102 Addition (IBL-102) is shown.
  • *** indicates p ⁇ 0.001 with respect to veh
  • # indicates p ⁇ 0.05
  • ## indicates p ⁇ 0.001.
  • the graph shows, from left to right, an antibody non-administered wild type mouse (Wt), an IgG-administered AD model mouse (Tg + IgG), an IBL-101-administered AD model mouse (Tg + IBL-101), and an IBL-102-administered AD model mouse (Tg + IBL-102). ).
  • Wt antibody non-administered wild type mouse
  • Tg + IgG Ig + IgG
  • IBL-101-administered AD model mouse Tg + IBL-101
  • IBL-102-administered AD model mouse Tg + IBL-102.
  • the graph shows, from left to right, an antibody non-administered wild type mouse (Wt), an IgG-administered AD model mouse (Tg + IgG), an IBL-101-administered AD model mouse (Tg + IBL-101), and an IBL-102-administered AD model mouse (Tg + IBL-102). ).
  • Wt antibody non-administered wild type mouse
  • Tg + IgG Ig + IgG
  • IBL-101-administered AD model mouse Tg + IBL-101
  • IBL-102-administered AD model mouse Tg + IBL-102.
  • the vertical axis of the graph represents the average number of senile plaques stained with the 82E1 antibody, and the error bar represents standard error.
  • the horizontal axis indicates the administered antibody. It is a graph which shows the count result of the dyeing
  • the vertical axis of the graph represents the average number of senile plaques stained with the 82E1 antibody, and the error bar represents standard error.
  • the horizontal axis indicates the administered antibody.
  • the vertical axis represents, in order from the top, the A ⁇ 40 concentration in the brain insoluble fraction, the A ⁇ 42 concentration in the brain insoluble fraction, and the A ⁇ 40 concentration in the brain soluble fraction (all pg / mg protein). ), And error bars indicate standard errors.
  • the horizontal axis indicates the administered antibody. This is the base sequence of the IBL-102 antibody (the heavy chain is SEQ ID NO: 1 and the light chain is SEQ ID NO: 8). Amino acid sequence of the IBL-102 antibody.
  • the heavy chain (HC) is described in SEQ ID NO: 2
  • the light chain (LC) is described in SEQ ID NO: 9.
  • the diagonal line indicates the signal sequence
  • the underline indicates the CDR
  • the frame indicates the variable region.
  • the vertical axis represents the absorbance at 492 nm
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of the test antibody.
  • the graph shows the results of using IBL-101, IBL-102, 4G8 as test antibodies in order from the top. It is a figure showing the protocol of IBL-102 single administration. It is a graph showing the result of an IBL-102 single dose test.
  • A shows Re-exploring score of each group when PBS or IBL-102 was administered to the control group and Tg2576 mice.
  • B is a comparison of Re-exploring score between PBS administration and IBL-102 antibody administration for each individual of Tg2576 mice.
  • the vertical axis represents the re-searching score (Re-exploring score).
  • Total A ⁇ 42 (right) and the ratio of A ⁇ binding to IBL-102 antibody to total A ⁇ 42 in cerebrospinal fluid from Alzheimer's disease patients (AD patient group) and non-AD control group (non-AD control group) (left)
  • the vertical axis represents A ⁇ 42 (ng / mL) (right diagram) and the A ⁇ toxicity conformer (A ⁇ binding to IBL-102 antibody) / total A ⁇ ratio (left diagram), respectively.
  • 2 is a graph showing the results of measuring the binding ability of IBL-102 antibody and IBL-101 antibody to each antigen by enzyme immunoassay. The upper graph shows the results using IBL-101 as the antibody, and the lower graph shows the results using IBL-102 as the antibody. In both graphs, the horizontal axis indicates the antigen used.
  • the vertical axis represents the absorbance at 492 nm.
  • the four bar graphs shown for each antigen represent the results using 15 ng / mL, 30 ng / mL, 60 ng / mL, and 120 ng / mL as the amount of antibody in order from the left. Represents the schedule and results of a single dose study.
  • the vertical axis represents (number of times of contact with the novel object B) / ((number of times of contact with the known object A) + (number of times of contact with the novel object B)) (Novel) or (number of times of contact with the known object A) / ((Number of times of contact with known object A) + (Number of times of contact with novel object B)) (Similar).
  • Wt indicates a wild type mouse
  • IgG indicates an IgG-treated Tg2576 mouse
  • IBL-102 indicates an IBL-102-administered Tg2576 mouse
  • n indicates the number of mice used in each group. *** represents P ⁇ 0.0005.
  • the antibody of the present invention is a substance having a turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ 42, preferably E22P-A ⁇ 42, A ⁇ -lactam (22K-23E), or P3-A ⁇ 42 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-265189).
  • an immunostimulant eg, mineral oil or aluminum precipitate and heat killed or lipopolysaccharide
  • Body Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, etc.
  • nonhuman mammals or birds can be immunized.
  • the immunized animal is not particularly limited as long as it can produce hybridomas such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, sheep, goats, chickens, ducks, etc.
  • a rat more preferably a mouse.
  • Administration of the immunogen to the animal is, for example, 0.1 to 1000 ⁇ g once or several times at appropriate intervals (usually about 1 to 10 immunizations once every 1 to 6 weeks), subcutaneously It can be performed by injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, intramuscular injection or footpad injection.
  • the antibody of the present invention can be obtained by purification from the serum of an animal exhibiting a sufficient antibody titer.
  • a monoclonal antibody can be obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from an immunized animal immunized by the above method with a myeloma cell (myeloma cell).
  • myeloma cell myeloma cell
  • Examples of the fusion method include the method of Milstein et al. (Galfre, G. & Milstein, C. (1981) Methods Enzymol., 73: 3-46).
  • the antibody-producing cells to be used can be collected from the spleen, pancreas, lymph nodes, and peripheral blood of mice or rats that have been immunized by the above-described method and whose serum shows a sufficient antibody titer.
  • the myeloma cell to be used is not particularly limited as long as it is a cell derived from a mammal such as a mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, or human and can be proliferated in vitro.
  • Examples of such cells include P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256, 495, 1975), P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (NS1) (Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976). ), P3X63Ag8U1 (P3U1) (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), P3X63Ag8.653 (653) (J.
  • the mouse-derived myeloma cell line is preferably P3U1 or P3X63-Ag8-653.
  • Methods for fusing antibody-producing cells and myeloma cells to form hybridomas include methods using polyethylene glycol (hereinafter referred to as “PEG”) and the like (PEG method), methods using Sendai virus, and methods using electrofusion devices.
  • PEG polyethylene glycol
  • Etc Selection of hybridoma cells producing a monoclonal antibody can be performed according to a known or similar method. Usually, selection of hybridoma cells is carried out by selective growth in animal cell medium supplemented with HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) usually for 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Can do.
  • HAT hyperxanthine-aminopterin-thymidine
  • the culture supernatant is collected, and a clone with extremely specific binding of A ⁇ toxic conformer is selected by ELISA or the like.
  • the selected clone is made into a single cell by repeating the limiting dilution method 1 to 5 times.
  • the specificity to the toxic conformer to A ⁇ is extremely high.
  • cells that stably produce antibodies with high specificity can be selected. Screening for antibodies that bind very specifically to the toxic conformers of A ⁇ of the present invention was performed using A ⁇ mutants (E22P-A ⁇ 42) with ⁇ -turn structures at positions 22 and 23 (K. Murakami et al. (2003) J. Biol.
  • Chem., 278: 46179-46187 and other A ⁇ structures (for example, A21P-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, M35P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42) It is performed by repeatedly selecting a clone with high specificity by giving priority to the specificity over the binding power, using as an index the low binding ability to one or more selected peptides or all of these peptides) be able to.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification methods used for ordinary proteins can be used for antibody separation and purification. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography such as affinity chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. Furthermore, an E22P-A ⁇ 42 solid phase column, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography or the like can be used regardless of the antibody class.
  • VH has an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, and VL is described in SEQ ID NO: 11
  • VH is 80% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, Having an amino acid sequence with 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homology
  • VL is 80%, 85%, 90%, 95% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, Antibodies or immunoreactive fragments thereof having amino acid sequences with 98% or 99% homology
  • CDRH1, CDRH2 and CDRH3 An antibody having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, and each of CDRL1, CDRL2, and CDRL3 having the amino acid
  • the antibody of the present invention is described in any one of SEQ ID NO: 2 (heavy chain having a signal peptide), SEQ ID NO: 3 (heavy chain not including a signal peptide), and SEQ ID NO: 4 (heavy chain variable region).
  • DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (heavy chain having a signal peptide), SEQ ID NO: 10 (heavy chain not including a signal peptide), and SEQ ID NO: 11 (light chain variable region)
  • a DNA having the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 8, and from the DNA, SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 9 to 11 can be produced by obtaining an H chain and an L chain having the amino acid sequence of 11, or a variable region thereof.
  • the antibody of the present invention is a humanized antibody
  • the amino acid sequence encoding the CDR of VH and VL of a non-human animal monoclonal antibody (for example, IBL-102 monoclonal antibody) that specifically recognizes the toxic conformer of A ⁇ is human antibody.
  • DNA encoding the V region transplanted into the VH and VL FRs of the above is constructed, the constructed DNA is combined with a human-derived immunoglobulin constant region cDNA and incorporated into an expression vector, and the vector is introduced into an appropriate host cell.
  • the CDR of the non-human animal monoclonal antibody includes the amino acid sequence predicted from the DNA sequence encoding the VH and VL of the non-human animal monoclonal antibody obtained by the above-described method, the entire amino acid sequence of VH and VL of the known antibody, Can be obtained by comparing.
  • the amino acid sequence of a known antibody can be obtained from the amino acid sequence of an antibody registered in a database such as a protein data bank.
  • the FR of the humanized antibody is not particularly limited as long as the antibody after transplantation exerts the effects of the present invention, but preferably the variable region of the humanized antibody (hereinafter referred to as “V region”). It is a human antibody FR having a three-dimensional structure similar to the V region of the non-human animal monoclonal antibody from which the CDR is derived, or a human antibody FR highly homologous to the amino acid sequence of the FR of the non-human animal monoclonal antibody to be used. In humanized antibodies, some of the amino acids constituting FRs derived from human antibodies (particularly, amino acids present sterically close to CDRs) are non-human animal monoclonal antibodies from which CDRs are derived as necessary.
  • the DNA sequence encoding the V region of the humanized antibody to be used is designed as a DNA sequence corresponding to the amino acid sequence obtained by combining the CDR amino acid sequence of the non-human animal monoclonal antibody and the FR amino acid sequence of the human antibody.
  • DNA encoding the V region of a humanized antibody can be prepared by a method well known to those skilled in the art based on the designed DNA sequence.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by using a human antibody phage library or a human antibody-producing transgenic mouse (Tomitsuka et al., Nature Genet., 15, 146-156 (1997)).
  • a human antibody phage library for example, by fixing E22P-A ⁇ 42 on a solid phase, reacting the phage antibody library, washing away unbound phage, and then recovering the bound phage, Desired clones can be obtained (panning).
  • a human antibody-producing transgenic mouse is a mouse in which an Ig gene of a human antibody is introduced into a mouse in which an endogenous immunoglobulin (Ig) gene is knocked out.
  • a human antibody-producing transgenic mouse as an immunized animal and immunizing with an antigen (preferably, E22P-A ⁇ 42) in accordance with the antibody production method of the present invention described above, a human antibody that specifically recognizes a toxic conformer of A ⁇ is obtained. Obtainable.
  • the antibody of the present invention has one or more selected from A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, and M35P-A ⁇ 42 for the main reaction (binding to E22P-A ⁇ 42).
  • the cross-reactivity of binding to any number (including all) of the peptide may be 5% or less, 3% or less, or 1% or less.
  • the antibody of the present invention is one or more selected from A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, and M35P-A ⁇ 42 for the main reaction (binding to E22P-A ⁇ 42).
  • the cross-reaction rates of binding to an arbitrary number (including all) of peptides are 0.3% or less, 0.3% or less, 0.5% or less, 0.4% or less, and 0.6, respectively, in order. % Or less and 0.7% or less, and 0.27% or less, 0.28% or less, 0.50% or less, 0.33% or less, or. It may be 53% or less and 0.68% or less.
  • the selection can be performed using the cross-reactivity of A ⁇ toxic conformer and A ⁇ having other structures (for example, A21P-A ⁇ 42 and E22V-A ⁇ 42) as an index. That is, it can be selected as an antibody having a cross-reaction rate within the above range.
  • a cross-reaction rate is determined by preparing a calibration curve using a toxic conformer of A ⁇ (for example, E22P-A ⁇ 42 or E22P-A ⁇ 40) as a standard substance, and then a non-toxic conformer (for example, , A21P-A ⁇ 42, and E22V-A ⁇ 42) were applied to a calibration curve prepared using a toxic conformer of A ⁇ to calculate the concentration, and the calculated concentration (actual value) / (Actual addition concentration of non-toxic conformer) ⁇ 100 (%).
  • the measurement in the method for determining the cross-reaction rate is not particularly limited as long as it is a known measurement method using an antibody molecule, and can be performed according to the measurement method for the A ⁇ toxicity conformer described later.
  • the nucleic acid of the present invention can be cloned from the hybridoma producing the antibody obtained above or by designing the nucleic acid sequence as appropriate based on the amino acid sequence of the antibody obtained above or an immunoreactive fragment thereof. Obtainable.
  • the vector of the present invention can be obtained by appropriately incorporating the obtained nucleic acid into a vector suitable for expression.
  • the vector of the present invention may contain a region (promoter, enhancer, terminator, etc.) necessary for expression in addition to the nucleic acid of the present invention.
  • the host cell of the present invention can be obtained by introducing the vector of the present invention into an appropriate cell line (for example, animal cells, insect cells, plant cells, yeast, microorganisms such as E. coli).
  • Binding of the label to the antibody or immunoreactive fragment thereof can be performed by methods common in the art. For example, when fluorescently labeling a protein or peptide, after washing the protein or peptide with a phosphate buffer, a dye adjusted with DMSO, buffer, etc. is added, mixed, and then allowed to bind at room temperature for 10 minutes. be able to.
  • a biotin labeling kit (Biotin Labeling Kit-NH2, Biotin Labeling Kit-SH: Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.), an alkaline phosphatase labeling kit (Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2, Alkaline Phosphatase Kit-NH2).
  • kits The present invention also relates to an A ⁇ toxicity conformer measurement kit containing the above-described antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof.
  • the kit of the present invention can be produced using a technique commonly used by those skilled in the art depending on the purpose, using an antibody or an immunoreactive fragment thereof prepared according to the above-described method.
  • the present invention relates to a method for detecting and / or measuring A ⁇ toxic conformers.
  • the method for detecting and / or measuring the A ⁇ toxic conformer of the present invention basically comprises a step of contacting a specimen with the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof, and the antibody of the present invention or the immunoreactivity thereof. Detecting and / or measuring a toxic conformer of A ⁇ bound to the fragment.
  • the detection and / or measurement method of the present invention may be performed in vitro or in vivo, but is preferably performed in vitro.
  • the detection and / or measurement method of the present invention can be performed based on a known detection and / or measurement method using an antibody molecule.
  • the detection method of the present invention includes, for example, the following methods: (A) contacting the specimen with an antibody or an immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ very specifically, but does not recognize the turn structure at other sites of A ⁇ ; (B) detecting a toxic conformer of amyloid ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof; (C) If a toxic conformer of amyloid ⁇ is detected in the step, it is determined that a toxic conformer of amyloid ⁇ is present in the sample, and if a toxic conformer of amyloid ⁇ is not detected in the step, A method for determining the presence or absence of a toxic conformer of amyloid ⁇ in a sample, comprising the step of determining that the toxic conformer of amyloid ⁇ is not present in the sample.
  • the measuring method of the present invention includes, for example, the following methods: (A) contacting the specimen with an antibody or an immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure at amino acids 22 and 23 of A ⁇ very specifically but does not recognize the turn structure at other sites of A ⁇ ; (B) measuring the amount of toxic conformer of amyloid ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof; (C) A method for determining the level of toxic conformer of amyloid ⁇ in a sample, comprising calculating the level of toxic conformer of amyloid ⁇ in the sample from the detected amount of toxic conformer.
  • a calibration curve is prepared by using a standard substance (for example, E22P-A ⁇ 42) serially diluted to a known concentration as appropriate in advance or separately from the detection of the sample.
  • concentration of toxic conformer of amyloid ⁇ can be calculated from the measured value based on the calibration curve.
  • the step of bringing the antibody or immunoreactive fragment thereof into contact with the specimen” and “the step of detecting or quantifying the toxic conformer of amyloid ⁇ in the specimen” can be performed by, for example, a sandwich ELISA. Specifically, a test sample (specimen) is brought into contact with the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof immobilized on a solid phase, washed, and then a label capable of binding to a detection target substance (a toxic conformer of amyloid ⁇ ) After adding the conjugated antibody, the unbound antibody is removed by washing, and the labeling of the antibody can be detected or the amount (or intensity) of the label can be measured.
  • a detection target substance a toxic conformer of amyloid ⁇
  • the sample When immunochromatography is performed, the sample is brought into contact with a labeled antibody capable of binding to a non-immobilized detection target substance (a toxic conformer of amyloid ⁇ ), and then the mixture is treated with the antibody of the present invention or its immune reaction. It can be carried out by bringing a sex fragment into contact with a carrier immobilized at a specific site and detecting the labeled antibody at the site or measuring the amount (or intensity) of the label.
  • a labeled antibody capable of binding to a non-immobilized detection target substance (a toxic conformer of amyloid ⁇ )
  • a non-immobilized detection target substance a toxic conformer of amyloid ⁇
  • a labeled antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is used in place of a labeled antibody capable of binding to a substance to be detected (a toxic conformer of amyloid ⁇ ), and the present invention
  • an antibody capable of binding to the substance to be detected may be used.
  • the antibody or immunoreactive fragment thereof of the present invention can also be used for detection and / or measurement of A ⁇ toxic conformers in vivo.
  • the present invention includes a step of administering the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof labeled with a fluorescent or radioactive substance in vivo, and a step of detecting and / or measuring the label in vivo.
  • a method for detecting or measuring a toxic conformer of A ⁇ is included.
  • the present invention includes a step of administering the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof labeled with a fluorescent or radioactive substance into a living body, detecting the label in the living body, and its location It may be a method for determining the location of a toxic conformer of A ⁇ in vivo, comprising the step of determining.
  • the present invention includes a step of administering the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof labeled with a fluorescent or radioactive substance into a living body, a step of measuring the amount or intensity of the label in the living body, and a measured labeling amount.
  • the present invention may be a method for determining the amount of A ⁇ toxic conformer in vivo, comprising the step of determining the level of A ⁇ toxic conformer from the strength.
  • the present invention includes a step of administering in vivo the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof labeled with a fluorescent or radioactive substance, a step of measuring the position and amount or intensity of the label in the living body, Determining the position and amount of A ⁇ toxic conformer in vivo, comprising determining the level of A ⁇ toxic conformer from the labeled amount or intensity, and correlating the position and level of A ⁇ toxic conformer It may be a method.
  • AD diagnosis method Toxic conformers of A ⁇ are associated with the onset and exacerbation of AD. That is, conventionally, it has been considered that the level of A ⁇ 40 or A ⁇ 42 (total A ⁇ amount) is associated with the onset and exacerbation of AD, but now, a specific three-dimensional structure of these A ⁇ s rather than an increase in the total amount of A ⁇ . It has been suggested that an increase in those taking (toxic conformers) is involved in the development of AD. Although it is known that A ⁇ can take various three-dimensional structures, the antibody of the present invention and its immunoreactive fragment recognize only the toxic conformer of A ⁇ very specifically. Therefore, the antibody and immunoreactive fragment thereof of the present invention can achieve more accurate diagnosis of AD.
  • the present invention includes a diagnostic agent for AD containing the above-described antibody of the present invention and an immunoreactive fragment thereof as active ingredients.
  • the present invention also provides a method for diagnosing AD, a method for providing information for diagnosing AD, comprising measuring a toxic conformer of A ⁇ using the above-described antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof, And a method for determining the therapeutic effect of a candidate AD therapeutic drug (hereinafter collectively referred to as “the diagnostic method and the like of the present invention”).
  • the diagnostic method and the like of the present invention the terms “diagnosis of AD” and “diagnose AD” “provide information for the diagnosis of AD, unless such interpretation is inconsistent.
  • the present invention relates to an antibody of the present invention or an immunoreactivity thereof for diagnosing AD (or monitoring the status or progression of AD or determining the therapeutic effect of a candidate AD therapeutic). Including the use of fragments.
  • the present invention provides an antibody of the present invention for producing a drug or composition for diagnosing AD (or monitoring the state or progression of AD or determining the therapeutic effect of a candidate AD therapeutic). Or the use of immunoreactive fragments thereof.
  • diagnosis is used to determine whether or not AD and / or determine the severity of AD, unless specifically interpreted as such. In addition to (diagnosis in a narrow sense), depending on the purpose, information for diagnosis of AD may be provided, or it may be interpreted as monitoring the state or progress of AD.
  • the presence or absence of A ⁇ toxic conformer in the diagnostic method of the present invention or the measurement of its level can be performed, for example, according to the above-described method for measuring the A ⁇ toxic conformer.
  • the AD diagnosis method of the present invention comprises a step of measuring the toxic conformer of A ⁇ in a specimen, and makes a diagnosis using the amount of toxic conformer of A ⁇ as an index. More specifically, the diagnostic method and the like of the present invention include the following methods: a) an antibody or immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure in the amino acids at positions 22 and 23 of at least one A ⁇ very specifically, but does not recognize the turn structure in other parts of A ⁇ , and a subject-derived specimen The step of contacting, b) measuring the toxic conformer of A ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof and determining the level of the toxic conformer of A ⁇ from the measured value; c) a method for diagnosing AD comprising the step of determining the presence or absence or degree of onset of AD in the subject from the measured level of A ⁇ toxicity conformer;
  • a subject with a high level of A ⁇ toxic conformer is determined to have AD or to have a high severity of the disease.
  • the diagnosis method or the like of the present invention is a method for providing information for diagnosis of AD
  • the following method is included: a) an antibody or immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure in the amino acids at positions 22 and 23 of at least one A ⁇ very specifically, but does not recognize the turn structure in other parts of A ⁇ , and a subject-derived specimen
  • the step of contacting b) measuring the toxic conformer of A ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof and determining the level of the toxic conformer of A ⁇ from the measured value;
  • c) providing information for diagnosis of AD comprising providing information on the result of determining the presence or absence or degree of AD onset in the subject from the level of A ⁇ toxicity conformer measured,
  • a subject with a high level of A ⁇ toxic conformer is determined to have AD or to have a high severity of the disease.
  • the diagnostic method of the present invention is a method for monitoring the state or progression of AD
  • the following method is included: a) an antibody or immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure in the amino acids at positions 22 and 23 of at least one A ⁇ very specifically, but does not recognize the turn structure in other parts of A ⁇ , and a subject-derived specimen
  • the step of contacting b) measuring the binding between the toxic conformer of A ⁇ in the specimen and the antibody or immunoreactive fragment thereof, and determining the level of the toxic conformer of A ⁇ from the measured value; c) Determine the change in AD onset in the subject by comparing the determined level of A ⁇ toxic conformer with the level of A ⁇ toxic conformer determined by the same method separately from the determination before the determination.
  • a method of monitoring the status or progress of AD comprising the steps of:
  • the AD progresses when the level of the A ⁇ toxic conformer determined is increased. It is determined that
  • the diagnostic method of the present invention when an antibody or an immunobinding fragment thereof that specifically binds to a toxic conformer of A ⁇ is administered in vivo, it can be diagnosed by image diagnosis.
  • the diagnostic method of the present invention includes the following methods: a) About a subject who has been administered an antibody or an immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure at amino acids 22 and 23 of at least one A ⁇ very specifically, but does not recognize the turn structure at other sites of A ⁇ Generating an image of a part or more of the antibody or an immunoreactive fragment thereof using an image diagnostic apparatus (for example, scintigraphy, PET or SPECT modality) Detecting and / or measuring, b) From the position or value (eg, intensity) of the antibody or immunoreactive fragment thereof detected and / or measured, the presence, localization, and / or level of A ⁇ toxic conformer in the subject's body is determined.
  • an image diagnostic apparatus for example, scintigraphy, PET or SPECT modality
  • Steps, and c) A subject whose presence or high level of A ⁇ toxicity conformer is determined, a subject whose A ⁇ toxicity conformer is detected in the brain, or a subject who has a high level of A ⁇ toxicity conformer in the brain suffers from AD. Or a method of diagnosing AD, comprising the step of determining that AD has high severity.
  • the AD diagnosis method or the like of the present invention includes a step of measuring the A ⁇ toxic conformer in a specimen, and makes a diagnosis using the ratio of the total A ⁇ amount and the A ⁇ toxic conformer as an index.
  • the diagnostic method and the like of the present invention include the following methods: A method for diagnosing AD comprising the following steps: a) contacting a sample from a subject with at least one antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof; b) measuring the level of an antigen bound to the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof bound to the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof; c) measuring the total amount of A ⁇ in the subject-derived sample by contacting the non-A ⁇ structure-specific anti-A ⁇ antibody with the subject-derived sample and measuring the amount of the conjugate thereof; and d) The ratio of the level of the antigen binding to the antibody of the present invention or the immunoreactive fragment thereof and the level of total A ⁇ in the sample derived from the subject is calculated, and the presence or degree
  • Determining step if the level of the antigen that binds to the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof relative to the level of total A ⁇ is high compared to the same ratio in a sample derived from a healthy person, there is a possibility of suffering from AD. Is determined to be high.
  • the method for diagnosing using the total A ⁇ amount and the toxic conformer amount and ratio of A ⁇ as an index should be a method according to the method for providing information for diagnosis of AD and the method for monitoring the state or progression of AD. You can also.
  • the “determination step” in the diagnostic method or the like of the present invention can be performed using the level of A ⁇ toxic conformer or the amount and ratio of A ⁇ toxic conformer to the total amount of A ⁇ .
  • the determining step is the level of A ⁇ toxicity conformer in the subject or the toxicity of A ⁇ to the total amount of A ⁇ .
  • Conformer levels and ratios are expressed as levels of A ⁇ toxic conformers or total A ⁇ levels in healthy individuals, non-AD patients, and / or patients believed not to be AD (hereinafter collectively referred to as “negative comparison controls”).
  • the amount is higher than the amount and ratio, it is determined that “the toxic conformer level of A ⁇ or the ratio of the toxic conformer amount of A ⁇ to the total amount of A ⁇ is high”, that is, suffering from AD or having high severity of AD
  • the level of A ⁇ toxic conformer in the specimen from the subject or the ratio of the A ⁇ toxic conformer to the total amount of A ⁇ in the specimen from the subject If the A ⁇ toxicity conformer amount and ratio are not high (ie, equivalent or low), then “A ⁇ toxicity conformer level or total Toxicity conformers amount of A ⁇ relative to ⁇ amount and ratio is not high ", i.e., it can be determined to be low severity or AD not suffering from AD.
  • the confidence interval of the present invention may be, for example, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% or 99.99%.
  • the p value of the present invention is, for example, 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0002, or 0.0001. It may be.
  • the level of A ⁇ toxic conformer in the “comparison control” can be measured in the same manner as the measurement of the level of A ⁇ toxic conformer in the subject.
  • the level of A ⁇ toxic conformer in the comparison control can be used as the level of A ⁇ toxic conformer in the comparison control or the ratio between the total A ⁇ amount and the A ⁇ toxic conformer amount. It can also be used.
  • the determination step includes, for example, the level of A ⁇ toxicity conformer in a negative comparison control obtained in advance or the ratio of A ⁇ toxicity conformer to the total A ⁇ amount, and AD patients or patients who are believed to be AD.
  • a threshold level or ratio is set as an index of the presence or absence of AD disease or an index of the severity of AD disease with respect to the level or the amount of A ⁇ toxicity conformer with respect to the level or the total amount of A ⁇ . This may be done by comparing with a set threshold level or ratio.
  • the determination step is simply to determine the level of A ⁇ toxic conformer or the ratio of A ⁇ toxic conformer to the total amount of A ⁇ in the negative comparison control and the positive comparison control obtained in advance. Can be diagnosed as the severity of control AD showing comparable levels of ⁇ toxic conformer levels or ratios of A ⁇ toxic conformers to total A ⁇ levels.
  • the step of determining “severity of AD affliction” may involve several group groups (classes) (for example, severe, moderate, mild, non-onset, etc.) This can be done by setting the degree.
  • the toxicity of A ⁇ Two or more threshold levels of conformers are set, and the lowest threshold level or a group whose upper limit is the ratio and ratio of toxic conformers of A ⁇ to the total amount of A ⁇ . Create at least three groups, the group with the upper and lower limits as the ratio and the group with the highest threshold level as the lower limit, and the severity of the controls belonging to each group (normal, unaffected, mild AD, moderate AD, or severe AD) is determined as the severity class of the group, And correlate the severity of AD disease.
  • the level of A ⁇ toxic conformer in the specimen derived from the subject is measured, the class including the level is determined, and the AD severity class associated with the determined class is determined as the AD severity of the subject. You may do it.
  • “information on the severity of AD onset” can be determined using various established indicators on AD onset. In the above classification, the higher the ratio of the A ⁇ toxic conformer to the A ⁇ toxic conformer level or the total A ⁇ toxic conformer amount, the higher the severity of AD onset.
  • the threshold level as described above has a sensitivity of 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, or 98% or more. Can be set as follows.
  • the threshold level is 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, or 98%. It can set so that it may become above.
  • the diagnostic method of the present invention is a method for determining the therapeutic effect of a candidate AD therapeutic agent
  • the following method is included: a) an antibody or immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure in the amino acids at positions 22 and 23 of at least one A ⁇ , but does not recognize the turn structure in other parts of A ⁇ , and a candidate AD therapeutic agent
  • a) an antibody or immunoreactive fragment thereof that recognizes the turn structure in the amino acids at positions 22 and 23 of at least one A ⁇ , but does not recognize the turn structure in other parts of A ⁇
  • a candidate AD therapeutic agent Contacting a specimen derived from a subject not administered with a specimen and / or a specimen derived from a subject administered with a candidate AD therapeutic, b) measuring the toxic conformer of A ⁇ bound to the antibody or immunoreactive fragment thereof, and determining the level of the toxic conformer of A ⁇ or the ratio of the toxic conformer of A ⁇ to the total amount of A ⁇ from the measured value; and c) Toxic conformer amount of A ⁇ relative to the
  • the diagnostic method of the present invention may be performed in combination with other indexes that are already used as AD indexes.
  • AD means diagnostic criteria for AIzheimer type dementia by the DSM-IV classification (American Psychiatric Association. C., 1994), or clinical diagnostic criteria for Alzheimer's disease of NINCDS-ADRDA Work Group (McKahann G et al: Clinical diagnosis of Alzheimer's disease-reportNCD). . -ADRDA Work Group under the auspieces of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease Neurology 34: 939, by 1984), meant to be diagnosed with AD or AD type dementia.
  • AD and AD type dementia may be diagnosed.
  • AD may be confirmed histopathologically in the brain obtained by biopsy or autopsy.
  • level means an index relating to a digitized abundance, and includes, for example, an index that can be used as a concentration, an amount, or an alternative. Therefore, the level may be a measurement value itself such as fluorescence intensity, or a value converted into a concentration. Further, the level may be an absolute numerical value (abundance, abundance per unit area, etc.), or may be a relative numerical value compared with a comparative control set as necessary. .
  • the sample to be used is not particularly limited as long as it is a sample capable of measuring the A ⁇ toxic conformer in the method of the present invention, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • “specimen” includes a cell culture supernatant, a cell lysate, a tissue sample collected from a subject as a biopsy, a liquid, and the like.
  • body fluid derived from the subject include body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, urine, serous fluid, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, joint fluid, aqueous humor, tear fluid, saliva, and fractions or treatments thereof. You can list things.
  • tissue sample derived from the subject examples include brain tissue or brain tissue lysate.
  • the sample used in the method of the present invention may be a sample obtained by subjecting a sample derived from the subject prior to the measurement test, or a sample collected from the subject may be used as the sample as it is.
  • the test subject includes humans and non-human animals.
  • the analysis in the method of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively.
  • a calibration curve is prepared using a standard solution in which a standard substance (E22P-A ⁇ 42) whose concentration is known in advance is serially diluted, and the concentration corresponding to the measured value from the calibration curve. Can be determined by calculating.
  • the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof is purified if necessary and then formulated in accordance with a conventional method to detect a pharmaceutical composition (including therapeutic and prophylactic agents for AD) or in vivo detection and / or measurement. It can be used as a drug or composition.
  • the present invention also relates to an antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof for producing a pharmaceutical composition (including therapeutic and prophylactic drugs for AD) or a drug or composition for in vivo detection and / or measurement. Including the use of Alternatively, the invention includes the use of an antibody of the invention or an immunoreactive fragment thereof for the treatment or prevention of AD or in vivo detection or measurement.
  • the pharmaceutical composition (therapeutic agent or prophylactic agent) or the in vivo detection or measurement agent or composition of the present invention can be used as an injection, and can be used as an intravenous injection, subcutaneous injection, or intradermal injection.
  • dosage forms such as intramuscular injections and infusions.
  • Such an injection can be prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or the like in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous liquid for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose, sucrose, mannitol, and other adjuvants can be used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol) ), Polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80, polysorbate 20, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)), etc.
  • alcohol eg, ethanol
  • Polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, polysorbate 20, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like can be used, and as a solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like can be used in combination.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule, vial, or syringe.
  • an appropriate excipient to the antibody of the present invention or an immunoreactive fragment thereof, a lyophilized preparation is prepared, and at the time of use, dissolved in water for injection, physiological saline, etc. to prepare an injection solution.
  • oral administration of proteins such as antibodies is difficult because they are degraded by the digestive organs, but there is a possibility of oral administration due to the ingenuity of antibody fragments and modified antibody fragments and dosage forms.
  • the preparation for oral administration include capsules, tablets, syrups, granules and the like.
  • the pharmaceutical composition (therapeutic agent or prophylactic agent) or the in vivo detection or measurement agent or composition of the present invention is preferably prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient. is there.
  • dosage forms of such dosage units include injections (ampoules, vials, prefilled syringes), and usually 5 to 500 mg, 5 to 100 mg, and 10 to 250 mg of the antibody of the present invention or immunization thereof per dosage unit dosage form. It may contain reactive fragments.
  • the administration of the pharmaceutical composition (therapeutic agent or prophylactic agent) of the present invention or the drug or composition for in vivo detection or measurement may be local or systemic. There is no restriction
  • the pharmaceutical composition (therapeutic agent or prophylactic agent) or the in vivo detection or measurement agent or composition of the present invention may be administered temporarily, or may be administered continuously or intermittently. For example, administration can be continued for 1 minute to 2 weeks.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it provides a desired therapeutic effect or preventive effect, and can be appropriately determined depending on symptoms, sex, age, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined using, for example, the therapeutic effect or preventive effect of AD as an index.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably 0.1 It is convenient to administer about ⁇ 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight by intravenous injection about 1 to 10 times a month, preferably about 1 to 5 times a month. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered.
  • the dose or the number of administrations may be increased according to the symptoms.
  • the dose of the in vivo detection or measurement drug or composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a dose capable of desired detection, measurement, or diagnosis, and is appropriately determined depending on symptoms, sex, age, and the like. Can be determined.
  • the dose of the active ingredient of the drug or composition for in vivo detection or measurement of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably Is about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight can be administered by intravenous injection once to several times. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered.
  • Example 1 Production of antibodies against toxic conformers having turn structures at positions 22 and 23 of A ⁇ 42
  • the maintenance and experiment of mice was approved by the Animal Protection Committee of the Institute for Immunobiology. According to the protocol.
  • the molecular weights of G9C, E22P-A ⁇ 9-35 and E22P-A ⁇ 9-35 were confirmed using MALDI-TOF-MS (K. Murakami et al. (2010) ACS. Chem. Neurosci., 1: 747-756).
  • G9C, E22P-A ⁇ 9 according to reported methods (K. Murakami et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun., 294: 5-10; K. Murakami et al. (2007) ChemBioChem, 8: 2308-2314).
  • a -35 peptide (CYEVHHQKLVFFAPDVGSNKGAIIGLM: SEQ ID NO: 1) was synthesized and used as an immunogen. At the N-terminus, cysteine was added instead of the 9th glycine, and it was conjugated with bovine thyroglobulin, a carrier protein (Y. Horikoshi et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun., 319: 733-737).
  • BALB / c mice (Charles River Japan, Japan) were immunized with 50 mg / mouse G9C, E22P A ⁇ 9-35 peptide fusion once a week for one month.
  • the obtained clones were cultured in 96-well Maxisorp plates (Nunc, Denmark) coated with 50 mg / mL of various antibody variants for 1 hour at room temperature, and then horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody (Sigma). , St. Louis, Missouri, USA) and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (Pierce, Rockfield, Illinois, USA) or o-phenylenediamine dihydrochloride base (Sigma) Quantified with.
  • the resulting 45 clones were transformed into A ⁇ mutants (E22Q-A ⁇ 42, E22G-A ⁇ 42, E22K-A ⁇ 42, E22P-A ⁇ 42, and D23N-A ⁇ 42) that tend to have ⁇ -turn structures at positions 22 and 23 (K. Murakami et al. (2003) J. Biol. Chem., 278: 46179-46187) were screened for clones and selected clones were subcloned. The screening was repeated to remove low positive or false positive clones. The obtained clone was further screened by Western blot to obtain clone IBL-102.
  • IBL-102 antibody The ability of the monoclonal antibody produced by the obtained clone IBL-102 (hereinafter referred to as IBL-102 antibody) to bind to the following antigens was measured by enzyme immunoassay: 22,23 lactam-A ⁇ , E22P-A ⁇ 42, E22G-A ⁇ 42, E22G-A ⁇ 40, E22K-A ⁇ 42, E22Q-A ⁇ 40, E22 ⁇ -A ⁇ 42, E22 ⁇ -A ⁇ 40, 25,26 Lactam-A ⁇ , A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ M35P-A ⁇ 42, wild type A ⁇ 38, wild type A ⁇ 40, wild type A ⁇ 42, recom.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Table 1 shows the absorbance at 450 nm.
  • the IBL-102 antibody showed highly specific immunoreactivity for E22P-A ⁇ 42 and low affinity for other antigens. This result indicates that the IBL-102 antibody recognizes only A ⁇ 42 having a turn structure at positions 22 and 23 very specifically.
  • a calibration curve was created from the E22P-A ⁇ 42 data shown in Table 1, and 4000 pg / mL was measured for each of A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, and M35P-A ⁇ 42.
  • the concentration as E22P was calculated by applying the OD value to the created calibration curve, and the cross-reaction rate was determined as the ratio (%) to the actually measured concentration (4000 pg / mL).
  • the cross-reaction rate to A21P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, D23P-A ⁇ 42, V24P-A ⁇ 42, G25P-A ⁇ 42, and M35P-A ⁇ 42 with respect to the main reaction of IBL-102 antibody (binding to E22P-A ⁇ 42) is They were 0.27%, 0.28%, 0.50%, 0.33%, 0.53%, and 0.68%, respectively, in order.
  • IBL-102 antibody The ability of the resulting monoclonal antibody IBL-102 (hereinafter referred to as IBL-102 antibody) to bind to the following antigens was measured by enzyme immunoassay: E22P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, wild type A ⁇ 42, wild type A ⁇ 40 And bovine serum albumin (BSA) as a control.
  • enzyme immunoassay E22P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, wild type A ⁇ 42, wild type A ⁇ 40 And bovine serum albumin (BSA) as a control.
  • Each antigen was added to a 96-well plate for ELISA at a concentration of 50 ng / well with a solid phase buffer (0.1 mM carbonate buffer PH 9.5), and allowed to react overnight at 4 ° C. for immobilization.
  • IBL-102 antibody After washing with PBS, blocking was performed with a blocking solution (1% BSA, 0.05% Tween 20 / PBS). After immobilizing each antigen in this manner, IBL-102 antibody is diluted to a concentration of 1,0.5, 0.25, 0.125 ⁇ g / mL and added to each solid phase antigen at 50 ⁇ L / well. . After the reaction at 37 ° C. for 30 minutes, washing was performed, and a labeled antibody (Anti-Mouse IgG (H + L) Goat Fab′-HRP) was added at 50 ⁇ L / well, and the reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes, followed by washing.
  • a labeled antibody Anti-Mouse IgG (H + L) Goat Fab′-HRP
  • a substrate solution for color development (o-phenylenediamine dihydrochloride; OPD) was added to develop color (shielded at room temperature for 15 minutes), a stop solution (1N H 2 SO 4 ) was added to stop, and the absorbance at 490 nm was measured.
  • OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
  • a stop solution (1N H 2 SO 4 ) was added to stop, and the absorbance at 490 nm was measured.
  • the IBL-101 antibody (# 10379, Anti-Human Amyloid ⁇ E22P (11A1) Mouse IgG MoAb Co., Ltd., Immunobiological Research Institute, Japan) was also tested in the same manner.
  • Table 2 shows the results of measuring the binding ability of IBL-102 antibody and IBL-101 antibody to each antigen.
  • the numerical value represents the absorbance at 490 nm.
  • the IBL-102 antibody showed highly specific immunoreactivity for E22P-A ⁇ 42 and low affinity for other antigens.
  • the IBL-101 antibody reacts weakly against E22V-A ⁇ 42, wild-type A ⁇ 42, wild-type A ⁇ 40, etc., whereas this result shows that the IBL-102 antibody only has A ⁇ 42 having a turn structure at positions 22 and 23. Is recognized very specifically.
  • Example 4 Diagnosis of Alzheimer's disease patients using IBL-102 antibody Among patients with dementia who visited Kyoto Prefectural University of Medicine and who obtained written consent, the subsequent clinical trials A patient diagnosed with AD through the course and image diagnosis was regarded as an AD patient. In addition, patients who underwent cerebrospinal fluid examination in the course of diagnosis of various neurological diseases and obtained written consent to use the specimens for research purposes were used as controls (healthy people). Cerebrospinal fluid samples were collected by the following method. Cerebrospinal fluid was collected directly into sterile individualized spitz (Asian equipment, PP screw spitz 15 mL) by lumbar puncture on an empty stomach.
  • sterile individualized spitz Asian equipment, PP screw spitz 15 mL
  • Anti-A ⁇ mouse monoclonal 82E1 antibody in 96-well plate (antibody recognizing human N ⁇ N-terminus (1st to 16th amino acids); Horikoshi Y et al., Biochem Biophys Res Commun. (2004) 319 (3): 733-7; Immunobiological Laboratories, Inc., # 10323. The same applies hereinafter) was immobilized (coated) at 1 ⁇ g / well using 0.1 M carbonate buffer. The specimen, serially diluted standard (E22P A ⁇ -40 dimer), and dilution buffer (blank) were placed in each well of 100 ⁇ L. After standing at 4 ° C. overnight, the reaction solution in the well was removed and washed.
  • the amount of A ⁇ 42 in the same cerebrospinal fluid sample was measured to determine the amount of total A ⁇ 42.
  • the amount of A ⁇ having a toxic conformer relative to the determined total amount of A ⁇ 42 was calculated, and the correlation with the onset of AD was examined.
  • FIG. 1 shows the results of measurement of a substance (A ⁇ toxic conformer: Toxic A ⁇ ) that binds to the IBL-102 antibody in cerebrospinal fluid from Alzheimer's disease patients (AD) and healthy individuals (Control). Further, FIG. 14 shows the result of calculating the ratio of the amount of A ⁇ having a toxic conformer to the amount of total A ⁇ 42 and the total amount of A ⁇ 42 in the same cerebrospinal fluid.
  • AD Alzheimer's disease patients
  • FIG. 14 shows the result of calculating the ratio of the amount of A ⁇ having a toxic conformer to the amount of total A ⁇ 42 and the total amount of A ⁇ 42 in the same cerebrospinal fluid.
  • Example 5 Effect of IBL-102 Antibody on A ⁇ 42-Induced Neurocytotoxicity
  • a ⁇ 42-induced neuronal cytotoxicity in rat primary neurons was determined by MTT. The assay evaluated (K. Murakami et al. (2003) J. Biol. Chem., 278: 46179-46187).
  • To cultured rat primary neurons 1 ⁇ M wild type A ⁇ 42 or E22P-A ⁇ 42 was added to give cytotoxic stimulation.
  • the control group no stimulation was the non-cytotoxic stimulation group.
  • 0.1 mg / mL IBL-102 antibody and IgG antibody negative control were added as test drugs, respectively.
  • the group without antibody added was used as a control (no drug).
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 4 days.
  • the concentration of A ⁇ used was 10 ⁇ 6 M, which is close to the IC50 value of wild type A ⁇ 42.
  • Statistical significance was evaluated by Tukey's test after one-way analysis of variance.
  • Rat primary neurons treated with 1 ⁇ M wild-type A ⁇ 42 and E22P-A ⁇ 42 showed lower viability compared to control cells.
  • Addition of IBL-102 antibody inhibited the cytotoxicity of A ⁇ 42 and E22P-A ⁇ 42. Therefore, it was shown that the IBL-102 antibody can remarkably inhibit the cytotoxicity by A ⁇ 42 and A ⁇ toxic conformers.
  • Example 6 Immunostaining of AD model mouse (promoted APP transgenic mouse) brain
  • APP transgenic mouse Tg2576 (K. Hsiao et al. (1996) Science, 274: 99-102) produces A ⁇ 42.
  • the mouse brain was removed under anesthesia with diethyl ether and fixed with 4% Paraform aldehyde.
  • the slice was prepared by embedding with paraffin and slicing to a thickness of 5 ⁇ m. .
  • the sections were deparaffinized and hydrophilized, and then the antigen was activated with formic acid to inactivate endogenous peroxidase, followed by serum blocking.
  • primary antibodies 1 ⁇ g / ml or 5 ⁇ g / ml 82E1 (positive control), 5 ⁇ g / ml or 20 ⁇ g / ml IBL-101 and 5 ⁇ g / ml or 20 ⁇ g / ml IBL-102 are reacted overnight at 4 ° C. After washing, a biotinylated anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody and allowed to react at room temperature. The intensity of immune reaction was enhanced using an avidin biotin complex kit and stained with 3,3′-Diaminobenzodin.
  • the positive control 82E1 clearly stained senile plaques by application at concentrations of 1 and 5 ⁇ g / ml.
  • IBL-101 was applied at 5 ⁇ g / ml, staining of brain parenchyma was observed in addition to senile plaques, and when applied at 20 ⁇ g / ml, staining was enhanced.
  • IBL-102 did not show senile plaques or brain parenchyma at any of the 5 ⁇ g / ml and 20 ⁇ g / ml concentrations.
  • IBL-102 did not react to the elderly group and was found to exhibit a characteristic reactivity.
  • the evaluation was conducted as Elevated plus-maze test and Nesting test as behavioral evaluation of neurological symptoms. Further, as pathological evaluation, immunohistochemical staining of senile plaques (using 82E1 antibody) and A ⁇ content in the brain (soluble fraction and insoluble fraction) by ELISA were measured. The soluble fraction and the insoluble fraction were prepared according to a conventional method. Statistical significance was evaluated by Tukey's test after one-way analysis of variance.
  • FIG. 4 shows the result of Elevated plus-maze test.
  • PS2 and Tg2576 showed a decrease in directivity to Closed arm in the IgG administration group.
  • Such neurological symptoms could not be improved by administration of IBL-101, but showed marked improvement by administration of IBL-102. From the above results, it was shown that high selectivity for toxic conformers is important for antibody treatment of AD, and that IBL-102 having high selectivity shows a remarkable therapeutic / preventive effect.
  • results of the nesting test are shown in FIG.
  • the nesting test was performed by placing a mouse in a cage containing 10 pieces of square 6 cm square paper pieces and scoring the nest-building after 4 days according to the following criteria. Score 0: No nesting (No Nesting); Score 1: Collect all strips in the corner (Gather all strips at a corner); Score 2: Collect all the strips in the corner and work (Gather and process all (Strips); Score 3: Collect and tear into small pieces (Gather and tear to small pieces). PS2 and Tg2576 showed a decrease in nesting score in the IgG administration group. Such neurological symptoms could not be improved by administration of IBL-101, but showed improvement by administration of IBL-102. From the above results, it was shown that high selectivity for toxic conformers is important for antibody treatment of AD, and that IBL-102 having high selectivity shows a therapeutic / preventive effect.
  • FIG. 6 brain
  • FIG. 7 hippocampus
  • IBL-101 and IBL-102 have no effect of reducing the number of senile plaques. IBL-102 is thought to have improved neurological symptoms regardless of the number of senile plaques.
  • the result of measuring the amount of A ⁇ in the brain by ELISA is shown in FIG.
  • a ⁇ 40 and A ⁇ 42 were detected in the IgG administration group.
  • a ⁇ 40 and A ⁇ 42 could not be reduced by administration of IBL-101 and IBL-102. From the above results, it was revealed that IBL-101 and IBL-102 have no effect of reducing the total amount of A ⁇ 40 and A ⁇ 42 in the brain. IBL-102 is thought to have improved neurological symptoms regardless of the total amount of A ⁇ 40 and A ⁇ 42.
  • Example 8 Sequencing of IBL-102 Antibody
  • Hc heavy chain
  • Lc light chain
  • MRNA was extracted from the hybridoma producing the IBL-102 antibody to prepare cDNA.
  • 5′-Rapid amplification cDNA end 5′-RACE was performed to determine the base sequences of the 5 ′ ends of the Hc and Lc genes.
  • the full length cDNAs were cloned using primers specific for Hc and Lc. The determined gene sequences of Hc and Lc were as shown in FIG.
  • Example 9 Measurement of dissociation constant by BIACORE
  • KD dissociation constant between the antibody and the antigen
  • BIACORE GE Healthcare Biosciences, BIACORE-X100
  • biotinylated E22P-A ⁇ 42 or biotinylated wild type A ⁇ 42 was immobilized on the SA chip, and then the IBL-101 antibody or IBL-102 antibody was allowed to flow.
  • Ka1 and the dissociation rate constant Kd1 were measured, and the binding constant KD value was determined using bivalent fitting.
  • Example 10 Measurement of binding ability to A ⁇ polymer A ⁇ is considered to be toxic by binding to each other to form an oligomer.
  • the ability to bind to the following antigens was measured by enzyme immunoassay: wild type A ⁇ 42; E22P-A ⁇ 42; E22P, V40L, LDap-A ⁇ 42 dimer; and E22P, A "30L, LDap-A ⁇ 40 dimer.
  • Each antigen was added to a 96-well plate for ELISA at a concentration of 50 ng / well with a solid phase buffer (0.1 mM carbonate buffer PH 9.5), and allowed to react overnight at 4 ° C. for immobilization.
  • the IBL-102 antibody After washing with PBS, blocking was performed with a blocking solution (1% BSA, 0.05% Tween 20 / PBS). After immobilizing each antigen in this way, the IBL-102 antibody is diluted to a concentration of 1,0.5, 0.25, 0.125 ⁇ g / mL and added to each solid phase antigen at 100 ⁇ L / well. . After the reaction at room temperature for 60 minutes, washing was performed, and a labeled antibody (Anti-Mouse IgG (H + L) Goat Fab′-HRP) was added at 50 ⁇ L / well, and the reaction was performed at room temperature for 60 minutes, followed by washing.
  • a labeled antibody Anti-Mouse IgG (H + L) Goat Fab′-HRP
  • Coloring substrate solution o-phenylenediamine dihydrochloride; OPD
  • stop solution 2N H2SO4
  • the absorbance at 492 nm was measured.
  • the IBL-101 antibody and the 4G8 antibody monoclonal antibody having an epitope on residues 18-22 (not the turn structure part) of the A ⁇ sequence; HM Wisniewski et al. (1989) Acta. Neuropathol., 78: 22- 27
  • the results are shown in FIG.
  • the IBL-101 antibody showed a weak binding force almost equal to that of the wild type A ⁇ 42, E22P-A ⁇ 42 monomer, E22P, V40L, LDap-A ⁇ 42 dimer, and E22P, V40L, LDap-A ⁇ 40 dimer.
  • the IBL-102 antibody had a binding ability to wild-type A ⁇ 42 that was equivalent to that of IBL-101, but strongly bound to the monomer of E22P-A ⁇ 42, and further, a dimer of E22P, V40L, LDap-A ⁇ 42, And E22P, V40L, and LDap-A ⁇ 40 dimers more strongly bound.
  • the 4G8 antibody used as a control bound strongly to wild-type A ⁇ 42, but only weakly bound to E22P mutant A ⁇ 42. This indicates that the IBL-102 antibody binds specifically and strongly to the A ⁇ oligomer.
  • IBL-102 antibody Single-dose vaccine test
  • IBL-102 antibody was administered to 18-month-old AD model mouse Tg2576.
  • the experimental schedule is shown in FIG. IBL-102 antibody (10-20 mg / kg) or PBS was alternately administered twice at a week interval from the initial antibody administration.
  • Behavioral tests were conducted before (Pre test) and after (Post test) the first and second administrations to examine the effects of antibody administration.
  • the contact time smelling time
  • an index of curiosity was scored by comparison with a control mouse (young B6).
  • the re-exploring score is calculated by calculating the (number of times of contact in the post test) / (number of times of contact in the pre test) of each individual in the IBL-102 administration group or the PBS administration group as the control mouse. It was determined by dividing by the average value of (number of contacts in Post test) / (number of contacts in Pre test) of the group. Different objects were used in the first and second dose behavioral tests.
  • Example 12 Measurement of binding specificity of IBL-102 antibody 3
  • the ability of IBL-102 antibody and IBL-101 antibody to bind to the following antigens was measured by enzyme immunoassay and compared: wild type A ⁇ 40, wild type A ⁇ 42, E22P-A ⁇ 42, E22V-A ⁇ 42, G33P-A ⁇ 42, L34P A ⁇ 42, L34P-A ⁇ 42, V36P-A ⁇ 42, G37P-A ⁇ 42, G38P-A ⁇ 42, V39P-A ⁇ 42, V40P-A ⁇ 42, I41P-A ⁇ 42.
  • 1 ⁇ g / well of 82E1 antibody recognizing 1-16 residues (not the turn structure) of the A ⁇ sequence; Y.
  • OPD o-phenylenediamine
  • FIG. 15 shows the results of measuring and comparing the binding ability of the IBL-102 antibody and the IBL-101 antibody to the respective antigens.
  • the numerical value represents the absorbance at 492 nm.
  • the IBL-102 antibody showed highly specific immunoreactivity for E22P-A ⁇ 42 and low affinity for other antigens. This result showed that the IBL-102 antibody recognizes only A ⁇ 42 having a turn structure at positions 22 and 23 very specifically.
  • IgG control Single-dose vaccine test (IgG control)
  • IBL-102 antibody was administered to 16-19 month old AD model mouse Tg2576.
  • Tg2576 two very similar objects A1 and A2 were memorized for 10 days a day for 3 days. The next day, wild type mice received PBS and Tg2576 received IgG or IBL-102 (20 mg / kg).

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Abstract

　本発明はＡβの特定のターン構造を有するＡβ（Ａβの毒性コンホマー）のみを標的とする抗体又はその免疫反応性断片を提供する。また、本発明は、Ａβの毒性コンホマーを特異的に認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物、又はＡβの毒性コンホマーの測定キット若しくはアルツハイマー病の診断薬等に関する。

Description

アミロイドβの２２位及び２３位のターン構造を極めて特異的に認識する抗体 クロスリファレンス
　本出願は、２０１４年１２月１２日に日本国において出願された特願２０１４－２５１８９８号、及び、２０１５年５月２２日に日本国において出願された特願２０１５－１０４４１１号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
　本発明は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを極めて特異的に認識する抗体、当該抗体を利用した２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの測定方法、並びに、アルツハイマー病の診断方法及び治療方法に関する。
　アルツハイマー病（以下、「ＡＤ」という）は、一般に老人斑におけるアミロイドの蓄積により特徴づけられる。アミロイドは、アミロイドβタンパク質（以下、「Ａβ」という）、特に、４０及び４２残基のアミノ酸からなるＡβ（以下、それぞれ、「Ａβ４０」及び「Ａβ４２」という）から構成される。これらのタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から、β－及びγ－セクレターゼの２つのプロテアーゼによる分解を受けて生成する。ＡＤの発症において、Ａβ４２は、その凝集傾向や神経毒性からＡβ４０よりも重要な役割を担っていると考えられている。最近の研究により、酸化ストレスがＡＤに関連する神経変性に寄与することが示されている。ラジカルの形成を介したＡβ４２の神経毒性は、活性酸素種の生成を伴う１０位のチロシン及び３５位のメチオニンにおけるラジカル化と緊密に関連している。一方で、Ａβのオリゴマーの集積がシナプス毒性を通じてＡＤを誘導する証拠が示されている。
　ＡＤモデルマウスにＡβ凝集体をワクチンとして接種すると、脳内におけるＡβの沈着を減少させ、認識機能障害を抑制することから、Ａβによる免疫付与は、ＡＤ治療の有望な方法と考えられている。そこで、Ａβ４２によりＡＤ患者を免疫した臨床試験（ＡＮ１７９２）が行われたが、過剰な免疫活性化という深刻な副作用から中止されている。その後、抗Ａβ抗体がＡＤ治療薬として期待され、現在に至るまで開発が続けられている。
　本発明者らは、これまで系統的プロリン置換法と共に固体ＮＭＲ法を用いた研究により、Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーと、Ａβ４２の２５位及び２６位にターン構造を有する生理的コンホマーが区別されること、及び、前者のコンホマーは、強力な凝集能と神経毒性を示すことを報告してきた（非特許文献１、特許文献１）。
　更に、本発明者らは、Ａβの２２位のグルタミン酸をプロリンに置換して当該部位におけるターン構造を固定したペプチドを抗原として用いることにより、Ａβ４２の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する毒性コンホマーを特異的に認識する抗体を作製できることを報告している（特許文献２）。
特開２００６－２６５１８９号 国際公開ＷＯ２０１１／０４５９４５号
Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１５１６８－１５１７４
　本発明者らは、これまで、Ａβが２２位及び２３位のアミノ酸においてターン構造をとることによりアミロイドの凝集が促進され、ＡＤ発症につながるのではないかと考え、既に報告した２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ（以下、「２２，２３－ターンＡβ」という）を特異的に認識する抗体として、ＩＢＬ－１０１抗体（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１－１－１　つくばセンター中央第６）；受託日：２００９年１０月１４日；受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２９０）を用いてＡＤの診断及び治療への応用について検討してきた。特に、ＩＢＬ－１０１抗体は、重合した野生型Ａβへの結合力も強く、かつ、ターン構造をもたないＡβに対する結合力が弱いという特異性があるため、ＡＤの診断及び治療への応用が期待されていた。しかし、ＩＢＬ－１０１抗体について検討を進めた結果、ＡＤモデルマウスを用いた治療実験において、一定の効果は示唆されたものの、治療薬としての実用化可能な程度に至らないと考えられた。そこで、本発明者らは、ＩＢＬ－１０１抗体におけるこのような問題の原因について更なる解析を行った。
　その結果、本発明者らは、ＩＢＬ－１０１抗体は２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ及び野生型Ａβのオリゴマーを比較的高く認識するものの、２２位及び２３位にターン構造をとらない他のＡβにも若干結合し得ることに注目した。また、本発明者らは、ＩＢＬ－１０１抗体以外の２２，２３－ターンＡβに特異的な様々な抗体について検討した結果、ＩＢＬ－１０１抗体と比較して、特異性において優れる抗体がＡＤモデルマウスを用いた治療実験において優れた認知機能改善効果等を有することを見出した。特に、このような抗体は、単回投与でもＡＤ発症後のマウスの記憶能力を改善するというこれまでの抗体に見られない優れた効果を示した。また、本抗体を用いて、ＡＤ患者と健常人の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＡβ量を測定した結果、ＡＤ患者において、本抗体に結合するＡβ量が多いことが確認された。さらに、解析を進めた結果、ＡＤ患者において、総Ａβ量に対する本抗体に結合するＡβ量の比が大きいことが確認された。そこで、本発明の抗体の結合特性について更に詳細な検討を行った結果、複数のターン構造や直線状構造などの様々な構造を持つＡβの中で、特に２２，２３－ターンＡβに対する特異性が極めて高く、他の構造を有するＡβへの結合がほとんど見られないことが確認された。更に、ＡＤにおいて最も毒性を発揮すると考えられているＡβオリゴマーへの本抗体の結合特性を解析した結果、２２，２３－ターンＡβモノマーへの結合より更に強く２２，２３－ターンＡβのオリゴマーと結合することが見出された。これらの結果から、本発明者らはＡＤの診断及び治療には、２２，２３－ターンＡβモノマーと非常に特異的に結合する（即ち、他の構造のＡβとはほとんど結合しない）、好ましくは、更に２２，２３－ターンＡβのオリゴマーに強く結合する抗体を利用することが重要であることを見出した。言い換えれば、本発明者らは、２２，２３－ターンＡβを極めて特異的に認識する抗体、又は、２２，２３－ターンＡβを極めて特異的に認識し、かつ、２２，２３－ターンＡβのオリゴマーに強く結合する抗体を用いることにより、ＡＤの治療及び診断が可能であることを見出した。
　これまでのＡβを標的とした免疫療法、特にはＡβワクチン（ＡＮ１７９２）や、抗Ａβモノマー抗体における副作用や効果の低さの理由の一つとして、生理的な（毒性の無い）Ａβ４２への結合が考えられている。実際に、Ａβモノマーには抗炎症作用などの利点も存在することが知られており（Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．　２０１２　Ａｕｇｕｓｔ　１；　４（１４５）：　１４５ｒａ１０５．）、生理的に重要な役割も担い得ることが知られていた。抗Ａβモノマー抗体の副作用の高さに加え、Ａβはオリゴマーとなることで毒性を発揮するが、更に凝集してフィブリルになると毒性を持たないことが知られていることから、現在のＡβを標的とした抗体医薬品開発は、生理的Ａβと区別して毒性のあるＡβのみを標的化するための戦略として、Ａβモノマーやフィブリルと結合せず、Ａβオリゴマーのみに結合する抗体を利用している（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ、Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ、ＢＡＮ２４０１）。すなわち、従来の発想は、Ａβモノマーを構造で区別することなく、その重合化の程度により毒性の有無の根拠としていた。本発明者らは、同じＡβモノマーであっても、その構造の中に毒性を発揮し得る構造が存在するとの仮説をこれまで報告してきたが、本発明により、ＡＤの治療効果・診断効果を発揮するためには、抗体が２２，２３－ターンＡβを“極めて”特異的に認識することが重要であることを初めて見出したものである。即ち、本発明者らは、これまで構造で区別することなく理解されてきたＡβモノマーが、実際には極めて緻密にその構造により機能が制御されており、２２，２３－ターンＡβは凝集性の高い（毒性の高い）Ａβであるのに対し、その他の構造を有するＡβは凝集性の低い（毒性の低い、生理的な）Ａβであること、並びに、２２，２３－ターンＡβを極めて特異的に標的化することが抗Ａβ抗体をＡＤ治療薬・診断薬として開発する上で最も重要であり、副作用の問題や効果の低さの問題を解決し得ることを初めて見出したものである。更に、本発明の抗体は、Ａβオリゴマーのみならず、Ａβモノマーをも標的とすることができるため、Ａβの凝集が進行する前（Ａβオリゴマー発生前）のモノマーの段階からＡβの凝集を抑制可能な点において、従来開発されてきた抗体医薬と比較してもよりすぐれた医薬を提供可能とするものである。
　よって、本発明は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβを極めて特異的に認識する抗体及びその利用に関する。本発明は、特に、２２，２３－ターンＡβとは結合するが、それ以外の構造を有するＡβとは結合しない、２２，２３－ターンＡβに特異的な抗体及びその利用に関する。具体的には、本発明は、以下の発明に関する。なお、以下の（１）～（３１）又は本明細書全体において、「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ」の語は、「Ｅ２２Ｐ－Ａβ」、又は、「ＩＢＬ－１０２抗体が結合するＡβ」と置き換えてもよい。
（１）　２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβを極めて特異的に認識するが、他の構造を有するＡβは認識しない抗体又はその免疫反応性断片。
（２）　更に、Ａβのオリゴマーを認識する、（１）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（３）　Ａβのオリゴマーがダイマーである、（２）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（４）　ＡβがＡβ４２である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（５）　Ａβの他の構造が、少なくとも、以下の群から選択される１種類以上の構造を含む、（１）～（４）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片：Ａβの２１位及び２２位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２３位及び２４位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２４位及び２５位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２５位及び２６位のアミノ酸におけるターン構造、及びＡβの３５位及び３６位のアミノ酸におけるターン構造。
（６）　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合するエピトープを極めて特異的に認識するが、ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合しないエピトープを認識しない抗体又はその免疫反応性断片。
（７）　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体とその抗原との結合を競合阻害するが、ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合しないエピトープには結合しない抗体又はその免疫反応性断片。
（８）　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
（９）　更に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、（８）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１０）　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、（１）～（７）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１１）　更に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、（１０）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１２）　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
（１３）　更に、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、（１２）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１４）　配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片をコードする核酸分子。
（１５）　配列番号１の１２６番目～４７９番目のヌクレオチド配列からなる核酸分子である、（１４）に記載の核酸分子。
（１６）　配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片をコードする核酸分子。
（１７）　配列番号８の１３０番目～４６５番目のヌクレオチド配列からなる核酸分子である、（１６）に記載の核酸分子。
（１８）　配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片、及び／又は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片を発現可能なベクター。
（１９）　（１４）又は（１５）に記載の核酸分子、及び／又は、（１６）又は（１７）に記載の核酸分子を含有する、（１８）に記載のベクター。
（２０）　（１８）又は（１９）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（２１）　（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する医薬組成物。
（２２）　ＡＤの予防用、治療用又は改善用である、（２１に記載の医薬組成物。
（２３）　ＡＤ患者の認知機能を改善するための、（２１に記載の医薬組成物。
（２４）　ＡＤ患者の記憶障害を改善するための、（２１に記載の医薬組成物。
（２５）　（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する診断用組成物。
（２６）　ＡＤの診断に使用するための（２５）に記載の診断用組成物。
（２７）　（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ａβの毒性コンホマーを測定するためのキット。
（２８）　（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ａβの毒性コンホマーの測定に使用するための組成物。
（２９）　検体と（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させるステップを備える、検体中におけるＡβの毒性コンホマーレベルの測定方法。
（３０）　以下のステップを備える、ＡＤの診断方法：
ａ）被験者由来の試料と、少なくとも１つの（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とをｉｎ　ｖｉｔｒｏで接触させるステップ、
ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した抗原のレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）決定された抗原レベルから、前記被験者におけるＡＤの有無又は程度を診断するステップ。
　ここで、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルが健常人由来の試料における同レベルと比較して高い場合には、ＡＤに罹患している可能性が高いと診断される、方法。
（３１）　以下のステップを備える、ＡＤの診断方法：
ａ）被験者由来の試料と、少なくとも１つの（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させるステップ、
ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した抗原のレベルを測定するステップ、
ｃ）Ａβの構造非特異的な抗Ａβ抗体と被験者由来の試料とを接触させ、その結合物の量を測定することにより、被験者由来の試料における総Ａβ量を測定するステップ、並びに、
ｄ）被験者由来の試料における、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルと総Ａβのレベルの比を計算し、決定された比から、前記被験者におけるＡＤの有無又は程度を判定するステップ、
　ここで、総Ａβのレベルに対する、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルが健常人由来の試料における同比と比較して高い場合には、ＡＤに罹患している可能性が高いと判定される、方法。
（３２）　検体中のアミロイドβの毒性コンホマーの存否を決定する方法であって、
（ａ）（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマーを検出するステップ；
（ｃ）前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出された場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在すると判定し、前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出されなかった場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在しないと判定するステップを備える、方法。
（３３）　検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを決定する方法であって、
（ａ）（１）～（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマー量を測定するステップ；
（ｃ）前記検出された毒性コンホマー量から、検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを算出するステップを備える、方法。
　本明細書において、「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ」とは、２２番目のアミノ酸及び２３番目のアミノ酸における折れ曲がり（ターン）構造（立体構造）を有するＡβ（本明細書において、「２２，２３－ターンＡβ」という）を意味する。２２，２３－ターンＡβは、２２，２３－ターンＡβ４２及び２２，２３－ターンＡβ４０を含み、好ましくは、２２，２３－ターンＡβ４２である。また、「アミロイドβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造」とは、Ａβの２２番目のアミノ酸及び２３番目のアミノ酸における折れ曲がり（ターン）構造（立体構造）を意味する。以下、本明細書において、Ａβの２２番目のアミノ酸及び２３番目のアミノ酸におけるターン構造及び／又はこの構造を有するＡβを総称して「Ａβの毒性コンホマー」という。アミロイドβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造は、例えば、２２番目のグルタミン酸がプロリンに置換されたＡβ変異体（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２又はＥ２２Ｐ－Ａβ４０等のＥ２２Ｐ－Ａβ）における、２２番目のアミノ酸及び２３番目のアミノ酸における折れ曲がり（ターン）構造であってもよい。また、別の表現においては、本発明のＩＢＬ－１０２抗体は、このような構造を有するＡβのみ認識することから、「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ」は、「ＩＢＬ－１０２抗体が認識するＡβ」と置き換えてもよい。
　本明細書において、Ａβとはアミロイドβの略語であり、Ａβ４２とは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するペプチドのことであり、Ａβ４０とは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチドのことである。本明細書において、「アミロイドβの２２位及び２３位」又は「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ」などの表現における、２２位及び２３位とは、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６における、２２番目及び２３番目のアミノ酸（それぞれ野生型ではグルタミン酸及びアスパラギン酸）の位置を意味する。
　本発明は、「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ」及び／又は「アミロイドβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造」（Ａβの毒性コンホマー）を極めて特異的に認識する抗体又はその免疫反応性断片に関する。よって、本発明の抗体は、２２，２３－ターンＡβ４２、及び／又は２２，２３－ターンＡβ４０を極めて特異的に認識する。
　本発明の抗体又はその免疫反応性断片による、Ａβの毒性コンホマーの認識は、２２番目のアミノ酸の種類に依存しなくてもよい。即ち、本発明の抗体又はその免疫反応性断片が認識する「エピトープ」は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβに存在する構造及びアミノ酸（２２番目のグルタミン酸を除く）を必須とするが、２２番目のアミノ酸がグルタミン酸であることは必要としなくてもよい。また、本発明のＡβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識する抗体は、２２位及び２３位のアミノ酸においてターン構造を有するＡβを極めて特異的に認識すれば、その認識部位が限定されるものではない。本発明のＡβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識する抗体が認識する部位は、例えば、Ａβの２３位のアミノ酸（アスパラギン酸）、並びに／あるいは、その隣接したアミノ酸、例えば、Ａβの２２位又は２３位のアミノ酸から１～１０残基（好ましくは、１～５、１～４、１～３残基）以内のアミノ酸であってもよい。例えば、本発明の抗体は、Ａβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識し、かつ、Ａβの２３位のアミノ酸（アスパラギン酸）を認識する抗体であってもよい。あるいは、本発明のＡβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識する抗体は、２２位及び２３位から遠位に存在するＡβ上の立体エピトープであって、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有することにより生じ得るエピトープを認識していても良い。例えば、本発明の抗体は、Ａβが分子間βシートを形成する領域を認識してもよい。より好ましくは、本発明の抗体は、このような領域に存在する２７番目のアスパラギン及び３１番目のイソロイシンを認識する。更に、本発明の抗体は、Ａβの３番目のグルタミン酸及び４番目のフェニルアラニンと結合してもよい。更に、本発明の抗体は、Ａβの１１番目のグルタミン酸、１２番目のバリン、１３番目のヒスチジン、及び１４番目のヒスチジンと結合していてもよい。
　Ａβは凝集してオリゴマーを形成し、更に凝集が進むとプロトフィブリルを形成し、より更に凝集が進むとフィブリルを形成する。ＡＤ発症においては、オリゴマーやプロトフィブリルなどの可溶性凝集体が何らかの毒性を発揮すると考えられている。本明細書において、「Ａβのオリゴマー」とは、Ａβのダイマーから二十量体又は９０～６５０ｋＤａのＡβの凝集体を意味する。たとえば、Ａβのオリゴマーは、Ａβのダイマー、トライマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー及びプロトフィブリルを含む。ある態様において、Ａβのオリゴマーは、分子間βシートを形成している多量体である。
　本発明の抗体は、好ましくは、Ａβ（好ましくは、２２，２３－ターンＡβ、又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２）のオリゴマー（例えば、ダイマー）に結合してもよい。即ち、一態様において、本発明は、２２，２３－ターンＡβ及び／又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２のモノマー及びオリゴマー（例えば、ダイマー）の両方に結合する抗体又はその免疫反応性断片に関する。
　Ａβは、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する構造のほか、直線に近い構造や２５位及び２６位のアミノ酸においてターン構造を有する構造など、様々な構造をとり得ることが知られている。本明細書において、（２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する構造以外の）「他の構造」とは、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する構造以外のＡβの構造を意味し、具体的には、Ａβの２１位及び２２位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２３位及び２４位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２４位及び２５位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２５位及び２６位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの３５位及び３６位のアミノ酸におけるターン構造、及び、直線状の構造（直線に近い構造、及びターン構造には含まれない構造を含む、以下同様）を含む。あるいは、「他の構造」は、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、及び／又はＩ４１Ｐ－Ａβ４２が有する構造、例えば、これらのペプチドが有するターン構造を含んでいても良い。また、「他の構造を有するＡβ」とは、２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造以外の構造を有するＡβを意味し、具体的には、Ａβの２１位及び２２位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの２３位及び２４位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの２４位及び２５位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの２５位及び２６位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３３位及び３４位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３４位及び３５位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３５位及び３６位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３６位及び３７位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３７位及び３８位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの３８位及び３９位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの４０位及び４１位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、Ａβの４１位及び４２位のアミノ酸におけるターン構造を有するＡβ、及び／又は、直線状の構造を有するＡβを含む。あるいは、「他の構造を有するＡβ」は、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、及び／又はＩ４１Ｐ－Ａβ４２が有する構造を有するＡβを含んでいても良い。
　一態様において、本発明は２２，２３－ターンＡβ及び／又はＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識する抗体に関する。別の態様において、本発明は２２，２３－ターンＡβ及び／又はＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を特異的に認識するが、他の構造を有するＡβ及び／又はＡβの他の構造は認識しない抗体に関する。即ち、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、２２，２３－ターンＡβ又はＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を特異的に認識するが、他の構造を有するＡβ及び／又はＡβの他の構造、例えば、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない。本明細書において、「結合しない」及び「認識しない」とは、全く結合しないこと又は全く認識しないことを意味するのではなく、目的の抗原（Ａβの毒性コンホマー）と十分に識別可能な程度に他の構造への親和性が低いことを意味する。例えば、「結合しない」及び「認識しない」とは、被検抗体と他の構造を有するＡβ又はＡβの他の構造との結合について、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより検出される強度（例えば、蛍光強度）が、当該被検抗体のＡβの毒性コンホマーへの結合について同じＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより検出される強度と比較して、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／１００以下であることを意味してもよい。ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡによる検出は、後述の（抗体分子を用いた公知の測定方法）の記載に準じて行うことができる。例えば、本発明の抗体は、主反応（２２，２３－ターンＡβ又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２に対する結合）に対する、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、及びＩ４１Ｐ－Ａβ４２から選択される１種類以上の任意のペプチド（全ての場合を含む）への結合の交差反応率が、１０％以下、８％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．３％以下であってよい。あるいは、本発明の抗体は、主反応（２２，２３－ターンＡβ又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２に対する結合）に対する、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、及びＭ３５Ｐ－Ａβ４２への結合の交差反応率が、それぞれ順に、０．３％以下、０．３％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．６％以下、及び０．７％以下であってもよく、更には、それぞれ順に、０．２７％以下、０．２８％以下、０．５０％以下、０．３３％以下、０．５３％以下、及び０．６８％以下であってもよい。交差反応率は、後述の（交差反応率）に記載の方法を用いて決定することができる。
　本明細書において、抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する（結合する）とは、その抗体又はその免疫反応性断片が他のアミノ酸配列や他の立体構造を有するペプチド又はタンパク質に対する親和性よりも、Ａβの毒性コンホマーに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。本明細書において、抗体又はその免疫反応性断片が「極めて特異的に」認識する（結合する）とは、該抗体又はその免疫反応性断片が、そのエピトープ又は抗原と非常に近似した他のアミノ酸配列や他の立体構造を有するペプチド又はタンパク質に対する親和性と比較して、実質的に高い親和性でそのエピトープ又は抗原と結合することを意味する。例えば、本発明の抗体が「極めて特異的に」認識する（結合する）とは、その抗原であるＡβと同一のアミノ酸配列若しくはＥ２２Ｐ－Ａβ４２と近いアミノ酸配列（１～２アミノ酸の相違）を有するペプチド、又は、その抗原であるＡβと同一のアミノ酸配列若しくはＥ２２Ｐ－Ａβ４２と近いアミノ酸配列（１～２アミノ酸の相違）を有し、かつ、非常に近い立体構造を有するペプチド又はタンパク、すなわち、Ａβ（２２，２３－ターンＡβを除く）又はＡβ変異体（例えば、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、及び／又はＩ４１Ｐ－Ａβ４２）に対する親和性と比較して、実質的に高い親和性で２２，２３－ターンＡβ若しくはＥ２２Ｐ－Ａβ４２（又はＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造）と結合することを意味しても良い。ここで、「実質的に高い親和性で結合する」とは、所望の測定装置または方法によって、目的とする特定のアミノ酸配列や立体構造を他のアミノ酸配列や立体構造から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、実質的に高い親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより検出された強度（例えば、蛍光強度）として、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上であることを意味していてもよい。よって、一態様において、本発明は、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２と極めて特異的に結合するが、以下の群から選択される１種類以上の（好ましくは全ての）ペプチドと結合しない抗体又はその免疫反応性断片に関する：Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、及び／又はＩ４１Ｐ－Ａβ４２。
　また、例えば、本発明の抗体が「極めて特異的に」認識する（結合する）とは、該抗体又はその免疫反応性断片が高濃度の場合でも、該抗体又はその免疫反応性断片のエピトープ又は抗原と非常に近似した他のアミノ酸配列や他の立体構造と結合しないことを意味してもよい。例えば、本発明の抗体が「極めて特異的に」認識する（結合する）とは、高濃度の該抗体又はその免疫反応性断片が、そのエピトープ又は抗原と非常に近似した他のアミノ酸配列や他の立体構造を有するペプチド又はタンパク質に対する親和性と比較して、実質的に高い親和性でそのエピトープと結合することを意味してもよい。ここで、高濃度の抗体又はその免疫反応性断片とは、例えば、１５ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、３０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、４０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、５０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、６０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、７０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、８０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、９０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、１００ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、１１０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、１２０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、１３０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、１４０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上、あるいは、１５０ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上であってもよい。また、このような特異性は、例えばＥＬＩＳＡ又はＥＩＡアッセイにおいて測定されたものであっても良い。
　本発明の抗体とＡβの毒性コンホマー又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２との結合における結合速度定数（Ｋａ１）としては、例えば、１×１０４Ｍｓ－１以上、１×１０５Ｍｓ－１以上、２×１０５Ｍｓ－１以上、２．３×１０５Ｍｓ－１以上を挙げることができ、好ましくは、２．３２×１０５以上である。また、本発明の抗体とＡβの毒性コンホマー又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２との結合における解離速度定数（Ｋｄ１）としては、例えば、１×１０－３以下、９×１０－４以下、８×１０－４以下であり、好ましくは、７．０９×１０－４以下である。本発明の抗体とＡβの毒性コンホマー又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２との結合における結合定数（ＫＤ）としては、例えば、１×１０－８（Ｍ）以下、７×１０－８（Ｍ）以下、５×１０－８（Ｍ）以下、４×１０－９以下であり得、好ましくは、３．０５×１０－９以下である。本明細書における抗体の結合速度定数（Ｋａ１）、解離速度定数（Ｋｄ１）、及び結合定数（ＫＤ）はＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ－Ｘ１００）を用いて、製造者提供のマニュアルに従い、ＳＡチップにビオチン化Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２又はビオチン化野生型Ａβ４２を固定後、被検抗体を流し、結合速度定数Ｋａ１、解離速度定数Ｋｄ１を測定し、ｂｉｖａｌｅｎｔフィッティングを用いて結合定数ＫＤ値を決定することができる
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明において、「モノクローナル抗体」は、単一な抗原決定基と反応する、構造がほぼ均一な抗体である。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウス、ラット又はウサギの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってＡβの毒性コンホマーと極めて特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってＡβの毒性コンホマーと極めて特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。例えば、本発明の抗体を治療、予防、又は体内に投与することにより用いる診断に使用する場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト・非ヒト動物のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
　本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラス（アイソタイプ）であってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体がＩｇＧの場合、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。また、本発明の抗体は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性抗体）、トリスペシフィック（三重特異性抗体）（例えば、ＷＯ１９９１／００３４９３号）であってもよい。
　抗体はその可変領域（特には、ＣＤＲｓ）が結合特性を付与していることが知られており、完全抗体でない抗体断片であってもその結合特性を利用可能であることが当業者に広く知られている。本明細書において、「免疫反応性断片」とは、抗体の一部分（部分断片）を含むタンパク質又はペプチドであって、抗体の抗原への作用（免疫反応性・結合性）を保持するタンパク質又はペプチドを意味する。このような免疫反応性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２９（１）：５－６　（２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ　Ｊａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２５（７）（２００７）：３０７－３１６；及び、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ　ｓｔｅｉｎら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８－１２３（２０１２）参照）。本明細書において、免疫反応性断片は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性）、トリスペシフィック（三重特異性）、及びマルチスペシフィック（多重特異性）のいずれであってもよい。
　本明細書のＡβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識する抗体又はその免疫反応性断片の具体例として、ＩＢＬ－１０２抗体又はその誘導体を挙げることができる。例えば、本発明の抗体は、（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；（ｉｉ）前記（ｉ）の抗体又は免疫反応性断片であって、更に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配を有する、抗体又はその免疫反応性断片が挙げられる。あるいは、本明細書の「アミロイドβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を特異的に認識する抗体又はその免疫反応性断片」としては、例えば、以下の（ｉｉｉ）～（ｖｉｉｉ）からなる群から選択される抗体又はその免疫反応性断片が挙げられる：（ｉｉｉ）ＶＨが、配列番号４に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片であって、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片、（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）の抗体又は免疫反応性断片であって、更に、ＶＬが配列番号１１に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；（ｖ）ＶＨが、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片であって、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片；（ｖｉ）前記（ｖ）の抗体又は免疫反応性断片であって、更に、ＶＬが、配列番号１１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；（ｖｉｉ）ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；（ｖｉｉｉ）前記（ｖｉｉ）の抗体又は免疫反応性断片であって、更に、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。ここで、前記（ｉｉｉ）～（ｖｉ）の抗体又はその免疫反応性断片は、更に、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、かつ／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有していてもよい。本明細書において、「ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体」との言及は、広義では（特にそのように解することが不整合である場合を除き）、前記（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に記載の抗体、及びそれらの免疫反応性断片を含むことがある。
　本明細書において、「配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列」は、図１０においてＩＢＬ－１０２ＨＣとして示したアミノ酸配列において下線及び太字で示した３種類のアミノ酸配列の左上から左向きに読んで登場する順でそれぞれ置き換えても良い。すなわち、配列番号５（ＤＹＮＭＤ）、配列番号６（ＤＩＮＰＮＴＧＶＴＩＤＮＰＫＦＫＧ）、配列番号７（ＬＰＤＮＹＶＭＤＹ）であってよい。また、本明細書において、「配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列」の語は、図１０においてＩＢＬ－１０２ＬＣとして示したアミノ酸配列において下線及び太字で示した３種類のアミノ酸配列を左上から左向きに読んで登場する順でそれぞれ置き換えても良い。すなわち、配列番号１２（ＲＣＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＮＬＨ）、配列番号１３（ＫＶＳＮＲＦＳ）、配列番号１４（ＳＱＳＴＹＶＰＬＴ）であってよい。本明細書において、「配列番号４に記載されたアミノ酸配列」の語は、図１０においてＩＢＬ－１０２ＨＣとして示したアミノ酸配列における枠内のアミノ酸配列と置き換えても良い。また、本明細書において、「配列番号１１に記載されたアミノ酸配列」の語は、図１０においてＩＢＬ－１０２ＬＣとして示したアミノ酸配列における枠内のアミノ酸配列と置き換えても良い。
　本明細書において提供されるＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体は、ＡＤとの相関関係が高い物質と結合することができ、また、一定の治療効果をもたらすことから、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合する抗原（又はＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合するエピトープを有するタンパク質）は、ＡＤの発症・増悪化やＡβの毒性発揮に深く関係していることが示された。このような効果は、同じくＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を含む抗原から取得されたＩＢＬ－１０１抗体においては確認されなかった。よって、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合する抗原（又エピトープ）とＩＢＬ－１０２と同等の特異性で結合する抗体又はその免疫反応性断片は、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体と同様にＡＤの診断及び治療に利用できることが示された。よって、別の態様において、本発明は、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合する抗原（又はエピトープ）に極めて特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片に関する。例えば、本発明は、ＩＢＬ－１０２抗体が結合する、Ａβ内に存在し得るエピトープを極めて特異的に認識するが、ＩＢＬ－１０２抗体が結合しない、Ａβ内に存在し得るエピトープを認識しない抗体又はその免疫反応性断片であってもよい。あるいは、本発明は、ＩＢＬ－１０２抗体が結合するＡβ（若しくは、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）を極めて特異的に認識するが、ＩＢＬ－１０２抗体が結合しない他の構造を有するＡβは認識しない抗体又はその免疫反応性断片であってもよい。別の態様において、本発明は、ＩＢＬ－１０２抗体と、Ａβ（例えば、２２、２３－ターンＡβ、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、又は、Ａβオリゴマー（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２のオリゴマーを含む））への特異的結合について競合する抗体又はその免疫反応性断片であり、好ましくは、更に、ＩＢＬ－１０２抗体が結合しない構造を有するＡβとは結合しない抗体又はその免疫反応性断片に関する。
　本明細書において、被検抗体が、目的のエピトープ又は目的の抗原を極めて特異的に認識する（結合する）か否かは当該エピトープを有するペプチド又は当該抗原への当該抗体の結合、及び、その他のエピトープ、その他の構造を有する抗原、又はその他の抗原への当該抗体の結合を調べることにより判定することができる。このような結合の測定は、後述の（抗体分子を用いた公知の測定方法）の記載に準じて行うことができる。また、被検抗体が、ＩＢＬ－１０２抗体と、Ａβ（例えば、２２，２３－ターンＡβのモノマー若しくはオリゴマー、又は、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）への特異的結合について競合するか否かは、ＩＢＬ－１０２抗体を被検抗体と共に又はＩＢＬ－１０２抗体単独で抗原（例えば、２２，２３－ターンＡβのモノマー若しくはオリゴマー、又は、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）に接触させた後、抗原に結合したＩＢＬ－１０２抗体の量を比較することにより決定することができる。被検抗体を同時に反応させた場合のＩＢＬ－１０２抗体の抗原への結合量がＩＢＬ－１０２抗体を単独で添加した場合の同抗体の抗原への結合量よりも少ない場合には、当該被検抗体はＩＢＬ－１０２抗体と競合すると決定することができる。抗体の抗原への結合の測定は、後述の（抗体分子を用いた公知の測定方法）の記載に準じて行うことができる。
　ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合する抗原（又はエピトープ）に極めて特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片は、ＩＢＬ－１０２抗体と、Ａβ（又は、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）への特異的結合について競合するが、ＩＢＬ－１０２抗体が結合しない構造を有するＡβとは結合しない。ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体が結合する抗原（又はエピトープ）に極めて特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片は、好ましくは、更に、Ａβ（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２を含む）のオリゴマーに結合する。
（核酸分子・ベクター・宿主細胞）
　別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子に関する。具体的には、本発明の核酸分子は、ＶＨとして配列番号４に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子、ＶＬとして配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子、又は、ＶＨとして配列番号４に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、及び、ＶＬとして配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子を含む。ＶＨとして配列番号４に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１における１２６番目から４７９番目の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。また、ＶＬとして配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号８の１３０番目から４６５番目の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。更に、本発明は、前記核酸分子を有するベクターを包含する。このようなベクターとしては、抗体の発現に利用可能なベクターであれば特に制限されるものではなく、適切なプラスミドベクターなどを使用する宿主に応じて選択することができる。別の態様において、本発明は、前記ベクターを含有する宿主細胞に関する。宿主細胞としては、抗体の発現に利用可能な宿主細胞であれば特に制限されるものではなく、哺乳類細胞（マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ヒト細胞など）、酵母、微生物（大腸菌など）を挙げることができる。
（医薬組成物）
　また、別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片を有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物の対象疾患としては、ＡＤを挙げることができる。よって、本発明の医薬組成物は、ＡＤの予防薬、治療薬、進行抑制剤又は改善薬とすることができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＡＤ患者における認知障害（短期若しくは長期の記憶障害、見当識障害、学習障害、注意障害、空間認知機能、及び／又は問題解決能力の障害）を改善するための医薬組成物とすることができる。あるいは、本発明は、前記医薬組成物を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。
　本発明の医薬組成物は、患者に投与することができる製剤であれば経口又は非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。好ましくは、注射剤である。本発明の医薬組成物の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ　Ｆｉｆｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
（キット）
　また、別の態様において、本発明は、上述の抗体又はその免疫結合性断片を備えるキットに関する。一態様において、本発明のキットは、ＩＢＬ－１０２抗体が結合する抗原の検出用又は測定用のキットであり得る。また、別の態様において、本発明の測定用キットは、Ａβの毒性コンホマーの検出用又は測定用のキットであり得る。更に別の態様において、本発明のキットは、ＡＤの診断用とすることができる。また、本発明は、このようなキットを製造するための、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用を含む。
　本発明のキットは、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の検出及び／又は測定方法に基づくことができる。本明細書において、「抗体分子を用いた公知の検出及び／又は測定方法」は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）用キット、簡易ＥＩＡ法用キット、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）用キット、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法用キット）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）用キット等の標識化免疫測定法用キット；ウェスタンブロッティング法用キット等のイムノブロッティング法用キット；金コロイド凝集法用キット等のイムノクロマト法用キット；イオン交換クロマトグラフィ法用キット、アフィニティークロマトグラフィ法用キット等のクロマトグラフィ法用キット；比濁法（ＴＩＡ法）用キット；比ろう法（ＮＩＡ法）用キット；比色法用キット；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）用キット；粒子計数法（ＣＩＡ法）用キット；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）用キット；沈降反応法用キット；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）用キット；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）用キット；比較干渉法用キット等を含む。本発明のキットが、所望の検出及び／又は測定を実施することが可能であるか否かは、標準検体又は目的の検体を用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出及び／又は測定可能であるか否かを判定することにより確認することができる。
　例えば、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）標識化された抗Ａβ抗体（抗Ａβ４２抗体、及び抗Ａβ４０抗体を含む、本明細書全体において同様）である第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。また、前記第一抗体を標識化抗体とし、前記第二抗体を固定化抗体としてもよい。
　または、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）抗Ａβ抗体である第二抗体が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。また、前記第一抗体をハプテン結合抗体とし、前記第二抗体を固相固定化抗体としてもよい。
　あるいは、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した不溶性担体、及び、（ｉｉ）抗Ａβ抗体である第二抗体が固定化した不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。
　上記のいずれのキットの例においても、前記第一抗体と前記第二抗体はＡβ（Ａβ４２、Ａβ４０を含む、本明細書全体において同様）の異なる部位を認識する。また、前記第一抗体をモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片とし、第二抗体をポリクローナル抗体又はその免疫反応性断片としてもよいし、第一抗体をポリクローナル抗体又はその免疫反応性断片とし、第二抗体をモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片としてもよいし、あるいは、第一及び第二の両方の抗体をモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片としてもよい。本明細書のキットにおいて、例えば、第一抗体を上述の本発明の抗体とし、第二抗体をＡβのＮ末近辺（Ｎ末から１～２０アミノ酸）又はＣ末近辺（Ｃ末から１～２０アミノ酸）を特異的に認識する抗体としてもよい。
　本発明のキットが標識化された抗体又はその免疫結合性断片を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ－クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ－メチルアクリジニウムエステル、Ｎ－メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
　本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、検体前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。更に、本発明のキットは、紙箱又はプラスチックケース等のキットの構成物を格納するパッケージ、及び取扱い説明書等を含んでいてもよい。
　本発明のキットに用いる検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、所望の検出及び／又は測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、脳脊髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液、脳組織またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のキットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
（検出・測定・診断用の薬剤、検出・測定・診断用組成物）
　別の態様において、本発明は、本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、ＩＢＬ－１０２抗体が結合する抗原又はＡβの毒性コンホマーの検出及び／又は測定に使用するための薬剤又は組成物（以下、「測定用の薬剤又は組成物」という）に関する。本明細書において、測定用の薬剤又は組成物は、ＡＤの診断用途に用いられる物、即ち、ＡＤの診断薬又はＡＤの診断用組成物を含む。あるいは、本発明は、前記診断用組成物を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。
　例えば、生体外で使用する（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏ）ことを目的とする場合、本発明の検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物は、必要に応じて、上述の本発明のキットに準じた構成とすることができる。
　また、本発明の検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物は、画像診断用を含む、生体内に投与して使用されるための形態（以下、「ｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物」という）であっても良い。本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物において、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、標識物質を含有し又は標識物質と結合している。標識物質としては、例えば、放射性同位元素等の当業者周知の物質を用いることができ、好ましくは陽電子放出放射性同位元素又はγ線放射性同位元素であり、これに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７５Ｂｒを挙げることができる。本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物における、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。また、本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤、例えば、薬学的に許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤、無痛化剤、溶剤、安定化剤又は酸化防止剤を含んでいてもよい。本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物の投与量は、対象部位、用いる検出・測定・診断方法、被験者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度により適宜選択することができる。
　本明細書において、「ＸＮＹ」（Ｘ及びＹはアミノ酸一文字表記；Ｎは自然数）は、Ｎ位のアミノ酸Ｘがアミノ酸Ｙに置換されていることを示し、「Ａβｐ－ｑ」（ｐ及びｑは自然数）は、Ａβのｐ位のアミノ酸からｑ位のアミノ酸からなるペプチドを示す。特にＡβ１－４０及びＡβ１－４２は、それぞれ、Ａβ４０及びＡβ４２と記載する。例えば、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２は、２２位のグルタミン酸がプロリンに置換されたＡβの１位から４２位までのアミノ酸からなるペプチドを示し、Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ－Ａβ９－３５は、９位のグリシンがシステインに置換され、２２位のグルタミン酸がプロリンに置換されたＡβの９位－３５位までのアミノ酸からなるペプチドを示す。
　本発明の抗体は、Ａβの毒性コンホマーと極めて高い特異的で結合することができることから、Ａβの毒性コンホマーを標的とした各種用途において優れた効果を発揮することができる。例えば、本発明の抗体は、ＡＤの診断用途に用いることができる。また、本発明の抗体は、Ａβの毒性コンホマーのモノマー及びダイマーの両方の状態と結合することができることから、Ａβの重合体化が発症又は増悪に寄与する疾患、例えば、ＡＤの治療又は予防用途に使用することができる。
アルツハイマー病患者（ＡＤ）及び健常人（Ｃｏｎｔｒｏｌ）由来の脳脊髄液中におけるＩＢＬ－１０２抗体と結合するＡβ量の比較を示すグラフである。縦軸はＡβの毒性コンホマー（ＩＢＬ－１０２抗体と結合するＡβ）量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ラットプライマリーニューロンを用いて、Ａβ４２誘発神経毒性に対するＩＢＬ－１０２抗体の神経毒性保護効果について検討した結果を示すグラフである。左のグラフは野生型Ａβ４２（Ｗｔ－Ａβ４２）添加群、右のグラフはＥ２２Ｐ－Ａβ４２添加群の結果を示す。縦軸は、細胞毒性刺激無しかつ抗体添加無し（Ｖｅｈ）群に対する生存率（％）の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。それぞれのグラフにおいて、左から順に細胞毒性刺激無しかつ抗体添加無し（Ｖｅｈ）、細胞刺激有りかつ抗体添加無し（－）、細胞刺激有りかつＩｇＧ添加（ＩｇＧ）、及び、細胞刺激有りかつＩＢＬ－１０２添加（ＩＢＬ－１０２）を示す。＊＊＊は、ｖｅｈに対してｐ＜０．００１を示し、＃は、ｐ＜０．０５を示し、＃＃＃は、ｐ＜０．００１を示す。 ＡＤモデルマウスの脳切片を用いて、８２Ｅ１、ＩＢＬ－１０１、ＩＢＬ－１０２の老人斑に対する染色性を免疫組織化学染色により検討した染色像である。写真の下の数値は、それぞれ免疫染色に用いた抗体の濃度を示す。 ＡＤモデルマウスが示す神経症状に対するＩＢＬ－１０２抗体の神経症状抑制効果についてＥｌｅｖａｔｅｄ　ｐｌｕｓ－ｍａｚｅ　ｔｅｓｔを用いて検討した結果である。縦軸は、ｃｌｏｓｅｄ　ａｒｍに滞在した時間の割合（％）の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。グラフは左から順に、抗体非投与野生型マウス（Ｗｔ）、ＩｇＧ投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩｇＧ）、ＩＢＬ－１０１投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩＢＬ－１０１）、及びＩＢＬ－１０２投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩＢＬ－１０２）を示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。 ＡＤモデルマウスが示す神経症状に対するＩＢＬ－１０２抗体の神経症状抑制効果についてＮｅｓｔｉｎｇ　ｔｅｓｔを用いて検討したグラフ示す。縦軸はスコアの平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。グラフは左から順に、抗体非投与野生型マウス（Ｗｔ）、ＩｇＧ投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩｇＧ）、ＩＢＬ－１０１投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩＢＬ－１０１）、及びＩＢＬ－１０２投与ＡＤモデルマウス（Ｔｇ＋ＩＢＬ－１０２）を示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。 ＡＤモデルマウスの脳内での老人斑の蓄積に対するＩＢＬ－１０２抗体の抑制効果について免疫組織化学染色を用いて検討した染色像および老人斑の計数結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、８２Ｅ１抗体により染色された老人斑の数の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。横軸は、それぞれ投与した抗体を示す。 ＡＤモデルマウスの海馬内での老人斑の蓄積に対するＩＢＬ－１０２抗体の抑制効果について免疫組織化学染色を用いて検討した染色像および老人斑の計数結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、８２Ｅ１抗体により染色された老人斑の数の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。横軸は、それぞれ投与した抗体を示す。 ＡＤモデルマウスの脳内でのＡβの蓄積に対するＩＢＬ－１０２抗体の抑制効果についてＥＬＩＳＡ法を用いて検討したグラフである。縦軸は、上から順に、脳内不溶解性画分中のＡβ４０濃度、脳内不溶解性画分中のＡβ４２濃度、及び、脳内可溶性画分中のＡβ４０濃度（全て、ｐｇ／ｍｇタンパク質）の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。横軸は、それぞれ投与した抗体を示す。 ＩＢＬ－１０２抗体の塩基配列（重鎖は配列番号１、軽鎖は配列番号８）である。 ＩＢＬ－１０２抗体のアミノ酸配列である。重鎖（ＨＣ）は配列番号２、軽鎖（ＬＣ）は配列番号９に記載されている。斜線はシグナル配列を示し、下線はＣＤＲを示し、枠内は可変領域を示す。 Ａβ重合体への結合能を測定した結果を表すグラフである。縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は被検抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。グラフは上から順に、被検抗体として、ＩＢＬ－１０１，ＩＢＬ－１０２、４Ｇ８を用いた結果を示す。 ＩＢＬ－１０２単回投与のプロトコールを表す図である。 ＩＢＬ－１０２単回投与試験の結果を表すグラフである。Ａは対照群およびＴｇ２５７６マウスにＰＢＳまたはＩＢＬ－１０２を投与したときの、各群のＲｅ－ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｓｃｏｒｅを示す。Ｂは、Ｔｇ２５７６マウスの各個体ごとにおける、ＰＢＳ投与時とＩＢＬ－１０２抗体投与時のＲｅ－ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｓｃｏｒｅの比較である。縦軸は再探索スコア（Ｒｅ－ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｓｃｏｒｅ）を表す。 アルツハイマー病患者（ＡＤ患者群）及び非ＡＤ対照群（非ＡＤ対照群）由来の脳脊髄液中における、総Ａβ４２（右図）、及び総Ａβ４２に対するＩＢＬ－１０２抗体と結合するＡβの比（左図）を示すグラフである。縦軸は、それぞれ、Ａβ４２（ｎｇ／ｍＬ）（右図）、及びＡβの毒性コンホマー（ＩＢＬ－１０２抗体と結合するＡβ）／総Ａβの比（左図）を示す。 ＩＢＬ－１０２抗体とＩＢＬ－１０１抗体の各抗原への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定した結果を表すグラフである。上段のグラフは抗体としてＩＢＬ－１０１を使用した結果を示し、下段は抗体としてＩＢＬ－１０２を使用した結果を示す。両グラフにおいて横軸は使用した抗原を示し、左から、野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、Ｉ４１Ｐ－Ａβ４２を表す。縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度を表す。各抗原について示された４本の棒グラフは、左から順に抗体量として１５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、及び１２０ｎｇ／ｍＬを使用した結果を表す。 単回投与試験のスケジュール及び結果を表す。縦軸は、（新奇物体Ｂへの接触回数）／（（既知物体Ａへの接触回数）＋（新奇物体Ｂへの接触回数））（Ｎｏｖｅｌ）、又は（既知物体Ａへの接触回数）／（（既知物体Ａへの接触回数）＋（新奇物体Ｂへの接触回数））（Ｓｉｍｉｌａｒ）を表す。「Ｗｔ」は野生型マウス、「ＩｇＧ」はＩｇＧ投与Ｔｇ２５７６マウス、「ＩＢＬ－１０２」は、ＩＢＬ－１０２投与Ｔｇ２５７６マウスを示し、ｎは各群で使用したマウスの数を示す。＊＊＊はＰ＜０．０００５を表す。
１．抗体の作製
（抗体の取得）
　本発明の抗体は、Ａβ４２の２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を備える物質、好ましくは、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、Ａβ－ラクタム（２２Ｋ－２３Ｅ）、又は、Ｐ３－Ａβ４２（特開２００６－２６５１８９号；Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１５１６８－１５１７４）を免疫源として、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくはマウスである。動物への免疫原の投与は、例えば、０．１～１０００μｇを１回または適当な間隔をあけて数回（通常１～６週毎に１回の免疫を合計２～１０回程度）、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができる。最後の免疫から１～２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
　モノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３－４６）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができる。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１－Ａｇ４－１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２，１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９，１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ－２（ＦＯ－２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができ、好ましくは、抗体産生細胞と同種動物由来の細胞であり、より好ましくは、抗体産生細胞と同系統の動物由来の細胞である。例えば、マウス由来の骨髄腫系細胞として、好ましくは、Ｐ３Ｕ１又はＰ３Ｘ６３－Ａｇ８－６５３である。
　抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン）を添加した動物細胞用培地で通常、５日～３週間、好ましくは１週間～２週間選択的に増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞の選別を行なうことができる。
　培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、Ａβの毒性コンホマー結合が極めて特異的であるクローンを選択する。選択されたクローンについて、限界希釈法を１～５回繰り返すことにより単一細胞化を行い、当該単一細胞化されたクローンが産生する抗体のうち、Ａβへの毒性コンホマーへの特異性が極めて高い抗体をスクリーニングすることにより、安定して高い特異性を示す抗体を産生する細胞を選択することができる。本発明のＡβの毒性コンホマーと極めて特異的に結合する抗体のスクリーニングは、２２位及び２３位にβ－ターン構造をとるＡβ変異体（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９－４６１８７）への結合能が高く、それ以外のＡβの構造（例えば、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２から選択される１種類以上のペプチド又はこれらの全てのペプチド）への結合能が低いことを指標とし、結合力よりは特異性を優先して特異性の高いクローンを選択することを繰り返すことにより行うことができる。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のカラムクロマトグラフィ、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。アフィニティークロマトグラフィに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。更に、抗体のクラスによらず、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いることもできる。
　あるいは、ＶＨが、配列番号４に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；ＶＨが、配列番号４のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ、配列番号５、６、及び７に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸配列をデザインし、当該デザインされたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得た抗体から、上述の方法に従ってＡβの毒性コンホマーへの特異性が極めて高い抗体をスクリーニングすることにより得ることができる。
　また、例えば、本発明の抗体は、配列番号２（シグナルペプチドを有する重鎖）、配列番号３（シグナルペプチドを含まない重鎖）、及び配列番号４（重鎖可変領域）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、並びに、配列番号９（シグナルペプチドを有する重鎖）、配列番号１０（シグナルペプチドを含まない重鎖）、及び配列番号１１（軽鎖可変領域）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、あるいは、配列番号１及び８に記載の核酸配列を有するＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡからぞれぞれ配列番号２～配列番号４、並びに配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖及びＬ鎖又はそれらの可変領域を得ることにより製造することができる。
（ヒト型キメラ抗体作製）
　本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、Ａβの毒性コンホマーを極めて特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１－６８５５，１９８４）。
（ヒト化抗体作製）
　本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、Ａβの毒性コンホマーを特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、ＩＢＬ－１０２モノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，４，７７３－７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ　Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７－４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。ヒト化抗体において、ヒト抗体に由来するＦＲを構成するアミノ酸の一部（特には、立体的にＣＤＲと近接した位置に存在するアミノ酸）は、必要に応じてＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲ配列に置換されていてもよい（Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５５８５０８９号参照）。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
（ヒト抗体）
　ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６－１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の本発明の抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）を免疫することにより、Ａβの毒性コンホマーを特異的に認識するヒト抗体を得ることができる。
（交差反応率）
　例えば、本発明の抗体は、主反応（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２に対する結合）に対する、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、及びＭ３５Ｐ－Ａβ４２から選択される１種類以上の任意の数（全てを含む）のペプチドへの結合の交差反応率が、５％以下、３％以下、又は１％以下であってよい。あるいは、本発明の抗体は、主反応（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２に対する結合）に対する、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、及びＭ３５Ｐ－Ａβ４２から選択される１種類以上の任意の数（全てを含む）のペプチドへの結合の交差反応率が、それぞれ順に、０．３％以下、０．３％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．６％以下、及び０．７％以下であってもよく、更には、それぞれ順に、それぞれ順に、０．２７％以下、０．２８％以下、０．５０％以下、０．３３％以下、０．５３％以下、及び０．６８％以下であってもよい。
　よって、例えば、前記選択は、Ａβの毒性コンホマーとそれ以外の構造を有するＡβ（例えば、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、及びＥ２２Ｖ－Ａβ４２）との交差反応性を指標として行うことができる。すなわち、交差反応率が前記範囲内に含まれる抗体として選択することができる。交差反応率は、まず、測定対象所望の測定系において、Ａβの毒性コンホマー（例えば、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、又はＥ２２Ｐ－Ａβ４０）を標準物質として用いて検量線を作成した上で、非毒性コンホマー（例えば、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、及びＥ２２Ｖ－Ａβ４２）について得られた測定値（例えば、吸光度）を、Ａβの毒性コンホマーを用いて作成した検量線に当てはめて濃度を算出し、算出された濃度（実測値）／（非毒性コンホマーの実際の添加濃度）×１００（％）により、求めることができる。交差反応率の決定方法における測定は、抗体分子を用いた公知の測定方法であれば特に限定されるものではなく、後述のＡβの毒性コンホマーの測定方法に準じて行うことができる。
（核酸、ベクター、宿主細胞）
　本発明の核酸は、上述において得られた抗体を産生するハイブリドーマからクローニングするか、あるいは、上述において得られた抗体またはその免疫反応性断片のアミノ酸配列を基に、適宜核酸配列を設計することにより得ることができる。本発明のベクターは、得られた核酸を適宜発現に適したベクターに組み込むことにより得ることができる。本発明のベクターは、本発明の核酸の他、発現に必要な領域（プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでいてもよい。また、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターを適切な細胞株（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、大腸菌等の微生物）に導入することにより得ることができる。
（標識）
　抗体又はその免疫反応性断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｒｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｒｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５５５　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ－Ｌａｂｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
（キット）
　また、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ａβの毒性コンホマー測定キットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体又はその免疫反応性断片を用いて、目的に応じて当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
（Ａβの毒性コンホマーの検出及び／又は測定方法）
　別の態様において、本発明は、Ａβの毒性コンホマーの検出及び／又は測定方法に関する。本発明のＡβの毒性コンホマーの検出及び／又は測定方法は、基本的な構成として、検体と本願発明の抗体又はその免疫反応性断片を接触させるステップ、及び、本願発明の抗体又はその免疫反応性断片に結合したＡβの毒性コンホマーを検出及び／又は測定するステップを備える。また、本発明の検出及び／又は測定方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれで行われるものであってもよいが、好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。例えば、本発明の検出及び／又は測定方法は、抗体分子を用いた公知の検出及び／又は測定方法に基づき行うことができる。
　より具体的には、本発明の検出方法は、例えば、以下の方法を含む：
（ａ）Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマーを検出するステップ；
（ｃ）前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出された場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在すると判定し、前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出されなかった場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在しないと判定するステップを備える、検体中のアミロイドβの毒性コンホマーの存否を決定する方法。
　また、本発明の測定方法は、例えば、以下の方法を含む：
（ａ）Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ；
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマー量を測定するステップ；
（ｃ）前記検出された毒性コンホマー量から、検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを算出するステップを備える、検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを決定する方法。
　本発明の測定方法を定量的に行う場合、予め適宜既知の濃度に段階希釈された標準物質（例えば、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）を検体の検出と同時又は別々に用いて検量線を作成し、検体中の測定値から当該検量線を基にアミロイドβの毒性コンホマーの濃度を計算して求めることができる。
　本明細書において、「抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ」及び「検体中のアミロイドβの毒性コンホマーを検出し又は定量するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで行うことができる。具体的には、固相に固定化された本発明の抗体又はその免疫反応性断片に被験試料（検体）を接触させ、洗浄後、検出対象物質（アミロイドβの毒性コンホマー）と結合可能な標識化抗体を添加した後、非結合抗体を洗浄により除去し、当該抗体の標識を検出又は標識量（又は強度）を測定することにより行うことができる。また、イムノクロマトにより行う場合には、固定化されていない検出対象物質（アミロイドβの毒性コンホマー）と結合可能な標識化抗体に検体を接触させた後、当該混合物を本発明の抗体又はその免疫反応性断片が特定部位に固定化された担体と接触させ、当該部位における前記標識化抗体を検出又は標識量（又は強度）を測定することにより行うことができる。本段落の記載においては、検出対象物質（アミロイドβの毒性コンホマー）と結合可能な標識化抗体の代わりに、標識化された本発明の抗体又はその免疫反応性断片を使用し、かつ、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の代わりに、検出対象物質（アミロイドβの毒性コンホマー）と結合可能な抗体を試用してもよい。
　あるいは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＡβの毒性コンホマーの検出及び／又は測定に使用することもできる。例えば、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその免疫反応性断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識を検出及び／又は測定するステップを備える、生体内におけるＡβの毒性コンホマーの検出方法又は測定方法を含む。例えば、その応用された態様として、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその免疫反応性断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識を検出してその存在位置を決定するステップを備える、生体内におけるＡβの毒性コンホマーの存在位置の決定方法であってもよい。又は、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその免疫反応性断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識の量又は強度を測定するステップ、測定された標識量又は強度からＡβの毒性コンホマーのレベルを決定するステップを備える、生体内におけるＡβの毒性コンホマー量を決定する方法であってもよい。あるいは、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその免疫反応性断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識の存在位置及び量又は強度を測定するステップ、測定された標識量又は強度からＡβの毒性コンホマーのレベルを決定するステップ、Ａβの毒性コンホマーの存在位置とレベルとを相関させるステップを備える、生体内におけるＡβの毒性コンホマーの存在位置とその量を決定する方法であってもよい。
（ＡＤの診断方法）
　Ａβの毒性コンホマーは、ＡＤの発症及び増悪化と関連する。即ち、従来はＡβ４０又はＡβ４２のレベル（総Ａβ量）がＡＤの発症及び増悪化と関連すると考えられてきたが、現在では、総Ａβ量の増加よりも、これらのＡβのうち特定の立体構造（毒性コンホマー）をとるものの増加がＡＤ発症に関与することが示唆されている。Ａβは様々な立体構造をとり得ることが知られているが、本発明の抗体及びその免疫反応性断片は、Ａβの毒性コンホマーだけを極めて特異的に認識する。よって、本発明の抗体及びその免疫反応性断片は、より正確なＡＤの診断を達成することができる。よって、本発明は、上述の本発明の抗体及びその免疫反応性断片を有効成分として含有する、ＡＤの診断薬を含む。また、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片を用いてＡβの毒性コンホマーを測定することを含む、ＡＤの診断方法、ＡＤの診断のための情報を提供する方法、ＡＤの状態又は進行をモニターする方法、及び、候補ＡＤ治療薬の治療効果の判定方法（以下、総称して「本発明の診断方法等」という）を含む。本明細書全体に亘って、「ＡＤの診断」及び「ＡＤを診断する」の用語は、そのように解することが不整合である場合を除き、「ＡＤの診断のための情報を提供する」、「ＡＤの状態又は進行のモニター」及び「ＡＤの状態若しくは進行をモニターする」、又は、「候補ＡＤ治療薬の治療効果の判定」及び「候補ＡＤ治療薬の治療効果を判定する」と読み替えてもよい。別の態様において、本発明は、ＡＤを診断する（又は、ＡＤの状態若しくは進行をモニターする、又は、候補ＡＤ治療薬の治療効果を判定する）ための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用を含む。あるいは、本発明は、ＡＤを診断する（又は、ＡＤの状態若しくは進行をモニターする、又は、候補ＡＤ治療薬の治療効果を判定する）ための薬剤又は組成物を製造するための本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。
　本明細書において、「診断」の語は、特にそのように解することが不整合である場合を除き、ＡＤであるか否かを判定し、及び／又はＡＤの重症度を判定すること（狭義の診断）の他に、その目的に応じて、ＡＤの診断のための情報を提供すること、又は、ＡＤの状態又は進行をモニターすることと解釈しても良い。本発明の診断方法等における、Ａβの毒性コンホマーの存否の検出又はレベルの測定は、例えば、上述のＡβの毒性コンホマーの測定方法に準じて行うことができる。
　本発明のＡＤの診断方法等は、検体中のＡβの毒性コンホマーを測定するステップを備え、Ａβの毒性コンホマー量を指標として診断を行う。より具体的には、本発明の診断方法等は、以下の方法を含む：
ａ）少なくとも１つのＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と、被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）該抗体又はその免疫反応性断片に結合したＡβの毒性コンホマーを測定し、測定値からＡβの毒性コンホマーのレベルを決定するステップ、並びに、
ｃ）測定されたＡβの毒性コンホマーのレベルから、該被験者におけるＡＤ発症の有無又は程度を判定するステップを備える、ＡＤの診断方法、
　ここで、Ａβの毒性コンホマーのレベルが高い被験者は、ＡＤに罹患している又は罹患の重症度が高いと判定される。
　ここで、本発明の診断方法等がＡＤの診断のための情報を提供する方法である場合、以下の方法を含む：
ａ）少なくとも１つのＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と、被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）該抗体又はその免疫反応性断片に結合したＡβの毒性コンホマーを測定し、測定値からＡβの毒性コンホマーのレベルを決定するステップ、並びに、
ｃ）測定されたＡβの毒性コンホマーのレベルから、該被験者におけるＡＤ発症の有無又は程度を判定した結果の情報を提供するステップを備える、ＡＤの診断のための情報を提供する方法であって、
　ここで、Ａβの毒性コンホマーのレベルが高い被験者は、ＡＤに罹患している又は罹患の重症度が高いと判定される。
　また、本発明の診断方法等がＡＤの状態又は進行をモニターする方法の場合、以下の方法を含む：
ａ）少なくとも１つのＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と、被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）該検体中のＡβの毒性コンホマーと、該抗体又はその免疫反応性断片との結合を測定し、測定値からＡβの毒性コンホマーのレベルを決定するステップ、並びに、
ｃ）決定されたＡβの毒性コンホマーのレベルと、当該決定以前に当該決定とは別に同じ方法により決定されたＡβの毒性コンホマーのレベルとを比較することにより、該被験者におけるＡＤ発症の変化を判定するステップを備えるＡＤの状態又は進行をモニターする方法であって、
　ここで、当該決定以前に当該決定とは別に同じ方法により決定されたＡβの毒性コンホマーのレベルと比較して、決定されたＡβの毒性コンホマーのレベルが上昇した場合には、ＡＤが進行していると判定される。
　また、本発明の診断方法等において、Ａβの毒性コンホマーと特異的に結合する抗体又はその免疫結合性断片を生体内に投与する場合、画像診断により診断することができる。画像診断により測定する場合、本発明の診断方法等は以下の方法を含む：
ａ）少なくとも１つのＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片を投与された被験者について、画像診断装置（例えば、シンチグラフィー、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴモダリティー）を用いて前記抗体又はその免疫反応性断片の一部以上の画像を生成させることにより、生体内における前記抗体又はその免疫反応性断片を検出及び／又は測定するステップ、
ｂ）検出及び／又は測定された前記抗体又はその免疫反応性断片の位置又は値（例えば、強度）から、該被験者の体内におけるＡβの毒性コンホマーの存否、局在、及び／又はレベルを決定するステップ、並びに、
ｃ）Ａβの毒性コンホマーが存在し若しくはレベルが高いと決定された被験者、脳内においてＡβの毒性コンホマーが検出された被験者、又は脳内におけるＡβの毒性コンホマーのレベルが高い被験者は、ＡＤに罹患しているか又はＡＤの重症度が高いと判定するステップを備える、ＡＤの診断方法。
　あるいは、本発明のＡＤの診断方法等は、検体中のＡβの毒性コンホマーを測定するステップを備え、かつ、総Ａβ量とＡβの毒性コンホマー量と比を指標として診断を行う。より具体的には、本発明の診断方法等は、以下の方法を含む：
　以下のステップを備える、ＡＤの診断方法：
ａ）被験者由来の試料と、少なくとも１つの本発明の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させるステップ、
ｂ）前記本発明の抗体又はその免疫反応性断片と結合した、本発明の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルを測定するステップ、
ｃ）Ａβの構造非特異的な抗Ａβ抗体と被験者由来の試料とを接触させ、その結合物の量を測定することにより、被験者由来の試料における総Ａβ量を測定するステップ、並びに、
ｄ）被験者由来の試料における、本発明の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルと総Ａβのレベルの比を計算し、決定された比から、前記被験者におけるＡＤの有無又は程度を判定するステップ、
　ここで、総Ａβのレベルに対する、本発明の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルが健常人由来の試料における同比と比較して高い場合には、ＡＤに罹患している可能性が高いと判定される、方法。
　総Ａβ量とＡβの毒性コンホマー量と比を指標として診断を行う方法は、上述のＡＤの診断のための情報を提供する方法、ＡＤの状態又は進行をモニターする方法に準じた方法とすることもできる。
　本発明の診断方法等における「判定ステップ」は、Ａβの毒性コンホマーのレベル、又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を利用して行うことができる。本発明の診断方法等においてＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を利用する場合、判定ステップは、被験者におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を、健常人、ＡＤではない患者、及び／又はＡＤではないと信じられている患者（以下、総称して「陰性比較対照」という）におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比と比較することにより行うことができる。被験者由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が、このような陰性比較対照由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比よりも高い場合には、「Ａβの毒性コンホマーレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が高い」、即ち、ＡＤに罹患している又はＡＤの重症度が高いと判定することができ、被験者由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が、このような比較対照由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量とＡβの毒性コンホマー量と比と比較して高くない（即ち、同等か低い）場合には、「Ａβの毒性コンホマーレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が高くない」、即ち、ＡＤに罹患していないか又はＡＤの重症度が低いと判定することができる。
　本明細書全体に亘って、検体中のＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が、それぞれ、比較対照となる検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比より高いか否かは、統計的分析により決定することができる。統計学的有意性は、２以上の検体を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ　ａｎｄ　Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
　本明細書全体に亘って、「比較対照」（陽性・陰性含む）におけるＡβの毒性コンホマーのレベルは、被験者におけるＡβの毒性コンホマーのレベルの測定と同様にして測定することができる。あるいは、既にこのような比較対照において測定したＡβの毒性コンホマーのレベルに関する情報があれば、そのような情報を比較対照におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量とＡβの毒性コンホマー量と比として利用することもできる。
　また、判定ステップは、例えば、予め得られた陰性比較対照におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比、並びに、ＡＤ患者、又はＡＤであると信じられている患者（以下、総称して「陽性比較対照」という）におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比（及びそのＡＤ発症の重症度に関する情報）から、Ａβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比についてＡＤ罹患の有無の指標又はＡＤ罹患の重症度の指標として閾値レベル又は比を設定し、被験者由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベルを、設定された閾値レベル又は比と比較することにより行っても良い。
　特に、「ＡＤ罹患の重症度」として診断する場合、判定ステップは、シンプルに予め得られた陰性比較対照及び陽性比較対照におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比と比較して、同程度のβの毒性コンホマーレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を示す対照のＡＤの重症度として診断することもできる。あるいは、「ＡＤ罹患の重症度」の判定ステップは、同程度のＡＤ罹患の重症度に関するいくつかのグループ群（クラス）（例えば、重度、中程度、軽度、未発症等、あるいは、認知障害の程度）を設定することにより行うことができる。即ち、予め得られた陰性比較対照及び陽性比較対照におけるＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量とＡβの毒性コンホマー量と比、及び、陽性比較対照のＡＤの重症度に関する情報から、Ａβの毒性コンホマーの閾値レベルを２種類以上設定し、最も低い閾値レベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を上限値とするグループ、最も近い２つの閾値レベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を上限値・下限値とするグループ、最も高い閾値レベルを下限値とするグループの、少なくとも３つのグループを作成し、それぞれのグループに属する比較対照の重症度（健常人、未発症、軽度ＡＤ、中程度ＡＤ、又は重度ＡＤなど）を当該グループの重症度クラスとして決定することにより、各クラス（グループ）についてＡＤ罹患の重症度を対応付けさせる。被験者由来の検体におけるＡβの毒性コンホマーのレベルを測定し、当該レベルが含まれるクラスを決定し、決定されたクラスに対応付けされたＡＤの重症度クラスを、当該被験者のＡＤの重症度として判定しても良い。上述において、「ＡＤ発症の重症度に関する情報」は、既に確立されたＡＤ発症に関する各種指標を用いて決定することができる。なお、前記クラス分けにおいては、Ａβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が高いほど、ＡＤ発症の重症度が高いクラスとして分類される。
　上述のような閾値レベルは、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
　また、本発明の診断方法等が候補ＡＤ治療薬の治療効果の判定方法の場合、以下の方法を含む：
ａ）少なくとも１つのＡβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を極めて特異的に認識するが、Ａβの他の部位におけるターン構造は認識しない抗体又はその免疫反応性断片と、候補ＡＤ治療薬が投与されていない被験者由来の検体、及び／又は、候補ＡＤ治療薬が投与された被験者由来の検体とを、それぞれ接触させるステップ、
ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片に結合したＡβの毒性コンホマーを測定して、測定値からＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を決定するステップ、並びに、
ｃ）候補ＡＤ治療薬が投与されていない被験者由来の検体、及び、候補ＡＤ治療薬が投与された被験者由来の検体における測定されたＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比を比較することにより、被験者における候補ＡＤ治療薬の奏効性を判定するステップを備える候補ＡＤ治療薬の治療効果の判定方法であって、
　ここで、候補ＡＤ治療薬が投与されていない被験者由来の検体と比較して、候補ＡＤ治療薬が投与された被験者由来の検体においてＡβの毒性コンホマーのレベル又は総Ａβ量に対するＡβの毒性コンホマー量と比が低い場合には、候補ＡＤ治療薬にＡＤ治療効果があると判定される、
　本発明の診断方法等は、既にＡＤの指標として用いられているその他の指標と組み合わせて行ってもよい。
　本明細書において、「ＡＤ」とは、ＤＳＭ－ＩＶ分類によるＡＩｚｈｅｉｍｅｒ型痴呆の診断基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｄ　ａｎｄ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｍｅｎｔａｌ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，　４ｔｈ　ｅｄ　（ＤＳＭ－ＩＶ）．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．，　１９９４）、又は、ＮＩＮＣＤＳ‐ＡＤＲＤＡ　Ｗｏｒｋ　ＧｒｏｕｐのＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病の臨床診断基準（ＭｃＫａｈａｎｎ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ　Ｗｏｒｋ　Ｇｒｏｕｐ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ａｕｓｐｉｅｃｅｓ　ｏｆ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　Ｔａｓｋ　Ｆｏｒｃｅ　ｏｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３４：９３９，　１９８４）により、ＡＤ又はＡＤ型痴呆と診断されることを意味する。具体的には、記憶障害及び認知機能の障害（失語、失行、失認又は実行機能）；認知障害による社会的または職業的機能の著しい障害等；ゆるやかな発症と持続的な認知の低下により特徴づけられる経過を示し；他の中枢神経疾患、全身性疾患、又は、外因性物質による痴呆ではなく；前記障害が、意識障害（せん妄）の期間中だけに出現するものではなく；前記障害が他の主要精神疾患により説明されない場合には、ＡＤ又はＡＤ型痴呆と診断されてもよい。あるいは、認知機能のうち二つ以上が障害され、記銘と他の認知機能が進行性に悪化し、意識障害がなく、痴呆の原因となる全身疾患やＡＤ以外の脳疾患がない場合に、ＡＤ又はＡＤ型痴呆と診断されてもよい。あるいは、生検か剖検で得られた脳で病理組織学的にＡＤを碓認してもよい。
（レベル）
　本明細書全体において、「レベル」とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる指標を含む。よって、レベルは蛍光強度等の測定値そのものであってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。
（検体）
　上述の全ての本発明の方法において、使用する検体は、本発明の方法においてＡβの毒性コンホマーを測定可能な検体であれば特に限定されず、利用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本明細書において、「検体」とは、細胞培養上清、細胞溶解物、生検として被験者から採取した組織試料または液体等を含む。被験者由来の体液としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、脳脊髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液等の体液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。また、被験者由来の組織試料としては、脳組織、又は脳組織溶解物を挙げることができる。また、本発明の方法において使用する検体は、被験者由来の試料を測定試験に先立ち前処理したものであってもよいし、被験者から採取した試料をそのまま検体として使用してもよい。ここで、被験者とは、ヒト及びヒト以外の動物を含む。また、本発明の方法における分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
（抗体分子を用いた公知の測定方法）
　抗体分子を用いた公知の測定方法のうち、ＥＩＡ法を採用する場合、Ａβの毒性コンホマーと特異的に結合する抗体又はその免疫結合性断片と検体中のＡβの毒性コンホマーとを反応させた後、前記Ａβの毒性コンホマーと結合する抗体又はその免疫結合性断片と、当該抗体又はその免疫結合性断片を認識する標識化した抗体とを結合させ、非結合抗体を除去後、標識物質に適した方法で測定して形成された複合体を測定することにより、Ａβの毒性コンホマーと特異的に結合する抗体又はその免疫結合性断片と検体中のＡβの毒性コンホマーとの結合を測定することができる。定量的な測定を行う場合には、予め濃度の判明している標準物質（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２）を段階希釈した標準液を利用して検量線を作成し、当該検量線から測定値に該当する濃度を計算することにより決定することができる。
　イムノクロマト法により測定する場合、検体を標識抗体と結合させた後、ニトロセルロース膜の毛細管現象を利用したクロマトグラフィを行い、固相化したＡβの毒性コンホマーと特異的に結合する抗体又はその免疫結合性断片と結合させることにより検出することができる。なお、イムノクロマト法において、標識として金コロイドを利用することにより、固相化抗体と検体／標識抗体複合体との結合を目視により確認することもできる。
（医薬組成物（治療薬、予防薬）及びｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物）
　本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、必要により精製した後、常法に従って製剤化することにより、医薬組成物（ＡＤの治療薬及び予防薬を含む）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物として用いることができる。また、本発明は、医薬組成物（ＡＤの治療薬及び予防薬を含む）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出及び／又は測定用の薬剤又は組成物を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用を含む。あるいは、本発明は、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の、ＡＤの治療若しくは予防又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定のための使用を含む。
　例えば、本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物は、注射剤として利用することができ、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体等を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液等が用いることができ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕等と併用することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などを用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。また、本発明の抗体又はその免疫反応性断片に適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。
　本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ）が例示され、投薬単位剤形当たり通常５～５００ｍｇ、５～１００ｍｇ、１０～２５０ｍｇの本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有していても良い。
　本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、上述のとおり非経口的又は経口的にに投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは血中への投与である。本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）又はｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、投与は、１分間～２週間の持続投与することもできる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、ＡＤの治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば、ＡＤ患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の医薬組成物の有効成分の１回量として、通常０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１～１０回程度、好ましくは１月１～５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
　また、本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物の投与量は、所望の検出、測定又は診断が可能である投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。例えば、ＡＤ患者の診断のために使用する場合には、本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ検出若しくは測定用の薬剤又は組成物の有効成分の１回量として、通常０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１回～数回程度、静脈注射により投与することができる。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。
　以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーに対する抗体の作製
　実施例１の実験において、マウスの維持及び実験は、免疫生物研究所の動物保護委員会の承認を受けたプロトコルに従って行った。Ｇ９Ｃ，Ｅ２２Ｐ－Ａβ９－３５及びＥ２２Ｐ－Ａβ９－３５の分子量はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いて確認した（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２０１０）ＡＣＳ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１：７４７－７５６）。
　報告されている方法（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９４：５－１０；Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００７）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，８：２３０８－２３１４）に従って、Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ－Ａβ９－３５ペプチド（ＣＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＰＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭ：配列番号１）を合成し、免疫原として使用した。Ｎ末には、９番目のグリシンの代わりにシステインを付加し、キャリアタンパク質であるウシサイログロブリンと結合させた（Ｙ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１９：７３３－７３７）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社、日本）を、５０ｍｇ／マウスのＧ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ　Ａβ９－３５ペプチド融合体で週に１回、１月間免疫した。得られたクローンは、５０ｍｇ／ｍＬの様々な抗体変異体でコートされた９６穴のＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）中、室温で１時間培養後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフィールド、イリノイ州、米国）又はｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩基質（シグマ社）で定量した。得られた４５クローンを、２２位及び２３位にβ－ターン構造をとる傾向にあるＡβ変異体（Ｅ２２Ｑ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｋ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、及びＤ２３Ｎ－Ａβ４２）（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９－４６１８７）への結合能の高いクローンをスクリーニングし、選択されたクローンをサブクローニングした。スクリーニングを繰り返して、陽性度が低いか又は擬陽性のクローンを除いた。得られたクローンについて、ウエスタンブロットによりさらにスクリーニングを行うことにより、クローンＩＢＬ－１０２を得た。
（実施例２）ＩＢＬ－１０２抗体の結合特異性の測定１
　得られたクローンＩＢＬ－１０２が産生するモノクローナル抗体（以下、ＩＢＬ－１０２抗体」という）の、次の各抗原への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定した：２２，２３ラクタム－Ａβ、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ－Ａβ４０、Ｅ２２Ｋ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｑ－Ａβ４０、Ｅ２２Δ－Ａβ４２、Ｅ２２Δ－Ａβ４０、２５，２６ラクタム－Ａβ、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、Ｍ３５Ｐ－Ａβ４２、野生型Ａβ３８、野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４２、ｒｅｃｏｍ．Ａβ４２、野生型Ａβ４３、及び野生型Ａβ４６。具体的には、１μｇ／ウェルの８２Ｅ１抗体（Ａβ配列の１－１６残基（ターン構造部分ではない）を認識する；Ｙ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００４　Ｊｕｌ　２；３１９（３）：７３３－７．参照；以下同じ）を０．１Ｍ炭酸緩衝液で固相化（コート）した９６穴プレートに、４０００，１０００，２５０，６２．５ｐｇ／ｍＬの前記各抗原、又はコントロールとして０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加した。４℃で一晩静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した。各ウェルにホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ａβマウスモノクローナル抗体ＩＢＬ－１０２を１００μＬ添加した。４℃で６０分間静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質液を１００μＬ添加し、遮光して室温で３０分間静置後、１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ加えて発色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
　ＩＢＬ－１０２抗体の前記各抗原への結合能を測定した結果を表１に示す。数値は、表１は４５０ｎｍにおける吸光度を表す。ＩＢＬ－１０２抗体はＥ２２Ｐ－Ａβ４２に極めて特異的な免疫反応性を示し、その他の抗原に対しては低いアフィニティを示した。この結果は、ＩＢＬ－１０２抗体は２２位及び２３位にターン構造を有するＡβ４２のみを非常に特異的に認識することを示している。表１に示したＥ２２Ｐ－Ａβ４２のデータから検量線を作成し、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、及びＭ３５Ｐ－Ａβ４２のそれぞれについて４０００ｐｇ／ｍＬを測定したＯＤ値を作成した検量線に当てはめてＥ２２Ｐとしての濃度を算出し、実際に測定した濃度（４０００ｐｇ／ｍＬ）との比（％）として交差反応率を求めた。その結果、ＩＢＬ－１０２抗体の主反応（Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２に対する結合）に対する、Ａ２１Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｄ２３Ｐ－Ａβ４２、Ｖ２４Ｐ－Ａβ４２、Ｇ２５Ｐ－Ａβ４２、及びＭ３５Ｐ－Ａβ４２への交差反応率は、それぞれ順に、０．２７％、０．２８％、０．５０％、０．３３％、０．５３％、及び０．６８％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例３）ＩＢＬ－１０２抗体の結合特異性の測定２
　得られたモノクローナル抗体ＩＢＬ－１０２（以下、ＩＢＬ－１０２抗体」という）の、次の各抗原への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定した：Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、野生型Ａβ４２、野生型Ａβ４０、及びコントロールとしての牛血清アルブミン（ＢＳＡ）。各抗原を固相用緩衝液（０．ｌＭ炭酸緩衝液ＰＨ９．５）で５０ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに加え、４℃で一晩反応させ固相化させた。ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳ）にてブロッキングした。このようにして各抗原を固相化した後、ＩＢＬ－１０２抗体を、１，０．５，０．２５，０．１２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、５０μＬ／ウェルで各固相抗原に加える。３７℃、３０分間の反応後、洗浄し、標識抗体（Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｇｏａｔ　Ｆａｂ’－ＨＲＰ）を５０μＬ／ウェル加え、３７℃、３０分間反応後、洗浄した。発色用基質液（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩；ＯＰＤ）を加え発色（遮光して室温、１５分間）、停止液（１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４）を加え停止した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてＩＢＬ－１０１抗体（＃１０３７９、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ａｍｙｌｏｉｄβ　Ｅ２２Ｐ（１１Ａ１）　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＭｏＡｂ株式会社免疫生物研究所、日本）も同様に試験した。
　ＩＢＬ－１０２抗体とＩＢＬ－１０１抗体の前記各抗原への結合能を測定した結果を表２に示す。数値は４９０ｎｍにおける吸光度を表す。ＩＢＬ－１０２抗体はＥ２２Ｐ－Ａβ４２に極めて特異的な免疫反応性を示し、その他の抗原に対しては低いアフィニティを示した。ＩＢＬ－１０１抗体はＥ２２Ｖ－Ａβ４２、野生型Ａβ４２、野生型Ａβ４０などに対しても弱く反応するのに対して、この結果は、ＩＢＬ－１０２抗体は２２位及び２３位にターン構造を有するＡβ４２のみを非常に特異的に認識することを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例４）ＩＢＬ－１０２抗体を利用したアルツハイマー病患者の診断
　京都府立医科大学神経内科を受診した認知症患者で文書による同意を得た上で髄液を採取した患者のうち、その後の臨床経過及び画像診断等によりＡＤと診断された患者をＡＤ患者とした。また、様々な神経疾患の診断の過程で髄液検査を行い、その検体を研究目的で使用することについて文書による同意を得た患者を対照（健常人）とした。髄液サンプルは、以下の方法により採取した。空腹時に腰椎穿刺により脳脊髄液を滅菌個装スピッツ（アジア器材、ＰＰスクリュースピッツ１５ｍＬ）に直接採取した。
　９６ウェルプレートに抗Ａβマウスモノクローナル８２Ｅ１抗体（ヒトＡβのＮ末（１～１６番目のアミノ酸）を認識する抗体；Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ　Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）３１９（３）：７３３－７；株式会社免疫生物研究所、＃１０３２３。以下同じ）を１μｇ／ウェルで０．１Ｍ炭酸緩衝液を用いて固相化（コート）した。検体、段階希釈した標準物質（Ｅ２２Ｐ　Ａβ－４０　ｄｉｍｅｒ）、及び希釈用緩衝液（ブランク）を各１００μＬそれぞれのウェルに入れた。４℃で一晩静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した。各ウェルにＨＲＰ標識抗Ａβマウスモノクローナル抗体ＩＢＬ－１０２を１００μＬ添加した。４℃で６０分静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した。ＴＭＢ基質液を１００μＬ添加し、遮光して室温で３０分静置後、１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を１００μＬして発色反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準物質により得られた検量線を用いて、各サンプル中の毒性コンホマーを有するＡβの量を決定した。
　また、既に報告された方法に従って、同じ髄液サンプル中のＡβ４２の量を測定し、全Ａβ４２の量を決定した。決定された全Ａβ４２量に対する、毒性コンホマーを有するＡβの量を計算し、ＡＤ発症との相関を調べた。
　アルツハイマー病患者（ＡＤ）及び健常人（Ｃｏｎｔｒｏｌ）由来の脳脊髄液中における、ＩＢＬ－１０２抗体と結合する物質（Ａβの毒性コンホマー：ＴｏｘｉｃＡβ）を測定した結果を図１に示す。また、同じ脳脊髄液中における全Ａβ４２、及び全Ａβ４２の量に対する、毒性コンホマーを有するＡβの量の比を算出した結果を図１４に示す。ＡＤ患者ではＩＢＬ－１０２抗体を用いることにより、ＴｏｘｉｃＡβレベルが高い値を示したのに対し、健常人ではＴｏｘｉｃＡβレベルは低い値を示した。Ｍａｎｎ　Ｗｈｉｔｎｅｙ　ｔｅｓｔにより検定した結果、Ｐ＝０．０６３５であった。このようなＡＤ患者と健常人における明確な違いはＩＢＬ－１０１抗体では見出すことができなかった（非図示）。更に、この差は全Ａβ４２の量に対する、毒性コンホマーを有するＡβの量の比として算出するとより顕著であることが示された。すなわち、ＡＤ患者の全Ａβ４２の量に対する、毒性コンホマーを有するＡβの量の比は、非ＡＤ患者の同比よりも有意（ｐ＜０．０５）に高いことが示された。よって、ＩＢＬ－１０２抗体は、ＡＤの診断に利用可能であることが示された。
（実施例５）ＩＢＬ－１０２抗体のＡβ４２誘導神経細胞毒性への効果
　ＩＢＬ－１０２抗体がＡβ４２の細胞毒性を抑制できるか否かを決定するため、ラットプライマリーニューロンでのＡβ４２誘導神経細胞毒性をＭＴＴアッセイにより評価した（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９－４６１８７）。培養したラットプライマリーニューロンに、１μＭの野生型Ａβ４２又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２を添加して細胞毒性刺激を与えた。細胞毒性刺激非添加群をコントロール（刺激無）とした。Ａβ４２又はＥ２２Ｐ－Ａβ４２添加後、被検薬剤として、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬのＩＢＬ－１０２抗体およびＩｇＧ抗体（陰性コントロール）を添加した。抗体非添加群をコントロール（薬剤無）とした。３７℃で４日間培養した。使用したＡβの濃度は、野生型Ａβ４２のＩＣ５０値に近い１０－６Ｍとした。統計学的な有意差は、一元配置分散分析後のＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔにより評価した。
　結果を図２に示す。１μＭの野生型Ａβ４２及びＥ２２Ｐ－Ａβ４２で処理したラットプライマリーニューロンは、コントロール細胞と比較して低い生存能を示した。ＩＢＬ－１０２抗体を添加することにより、Ａβ４２及びＥ２２Ｐ－Ａβ４２の細胞毒性が阻害された。よって、ＩＢＬ－１０２抗体は、Ａβ４２及びＡβの毒性コンホマーによる細胞毒性を顕著に阻害することができることが示された。
（実施例６）ＡＤモデルマウス（促進型ＡＰＰトランスジェニックマウス）脳の免疫染色
　ＡＤモデルマウスとして、ＡＰＰトランスジェニックマウス、Ｔｇ２５７６（Ｋ．Ｈｓｉａｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９－１０２）にＡβ４２産生酵素であるＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２を過剰発現させたマウス、ＰＳ２，Ｔｇ２５７６（Ｔ．Ｔｏｄａら（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１１，６１７９７４）を用いた。ジエチルエーテル麻酔下でマウスの脳を摘出し、４％Ｐａｒａｆｏｒｍ　ａｌｄｅｈｙｄｅにより固定した。パラフィンにより包埋し、５μｍの厚さで薄切することで切片を作製した。。切片は脱パラフィン処理、親水化処理の後、ギ酸により抗原を賦活化し、内因性ペルオキシダーゼを不活性化した後、血清ブロッキングを行った。一次抗体として、１μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌの８２Ｅ１（陽性対照），５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのＩＢＬ－１０１および５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのＩＢＬ－１０２を４℃で一晩反応させ、洗浄後、二次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を用いて室温で反応させた。アビジンビオチン複合体キットを用いて免疫反応強度を増強し、３，３‘－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅにより染色した。
　結果を図３に示す。陽性対照である８２Ｅ１は、１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの濃度での適用により老人斑を明瞭に染色した。ＩＢＬ－１０１は、５μｇ／ｍｌでの適用により、老人斑に加えて脳実質の染色が見られ、２０μｇ／ｍｌでの適用では染色性が増強された。一方、ＩＢＬ－１０２は、５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのいずれの濃度での適応においても、老人斑および脳実質の染色は見られなかった。ＩＢＬ－１０２は、ＩＢＬ－１０１と異なり老人班には反応せず、特徴的な反応性を示すことが明らかとなった。
（実施例７）ＡＤモデルマウス（促進型ＡＰＰトランスジェニックマウス）における薬効評価試験
　ＡＤモデルマウスとして、ＰＳ２，Ｔｇ２５７６を使用した。マウス誕生を０日目として、３月目から抗体投与を開始し、６月目に行動試験を行った。投与抗体としては、ＩｇＧ、ＩＢＬ－１０１抗体、及び、ＩＢＬ－１０２抗体を用いた（各群ｎ＝５～９）。各抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、週１回の頻度で３ヶ月間投与を行った。
　評価は、神経症状の行動評価として、Ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｐｌｕｓ－ｍａｚｅ　ｔｅｓｔ、Ｎｅｓｔｉｎｇ　ｔｅｓｔを行った。また、病理学的評価として、老人斑の免疫組織化学染色（８２Ｅ１抗体を使用）、並びに、ＥＬＩＳＡによる脳内（可溶性画分及び不溶解性画分）のＡβ量の測定を行った。可溶性画分及び不溶解性画分の調製は常法に従って行った。統計学的な有意差は、一元配置分散分析後のＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔにより評価した。
　Ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｐｌｕｓ－ｍａｚｅ　ｔｅｓｔの結果を図４に示す。ＰＳ２，Ｔｇ２５７６は、ＩｇＧ投与群においてＣｌｏｓｅｄ　ａｒｍへの指向性の低下を示した。このような神経症状は、ＩＢＬ－１０１の投与では改善できなかったが、ＩＢＬ－１０２の投与では顕著な改善を示した。以上の結果は、毒性コンホマーに対する選択性の高さが、ＡＤの抗体治療には重要であり、選択性の高いＩＢＬ－１０２は顕著な治療・予防効果を示すことが示された。
　Ｎｅｓｔｉｎｇ　ｔｅｓｔの結果を図５に示す。Ｎｅｓｔｉｎｇ　ｔｅｓｔは、６ｃｍ四方の正方形の紙片１０枚が入ったケージにマウスを入れ、４日後の巣作りの様子を以下の基準に従いスコアリングすることにより行った。スコア０：巣作り無し（Ｎｏ　Ｎｅｓｔｉｎｇ）；スコア１：隅に全ての細片を集める（Ｇａｔｈｅｒ　ａｌｌ　ｓｔｒｉｐｓ　ａｔ　ａ　ｃｏｒｎｅｒ）；スコア２：隅に全ての細片を集めて作業する（Ｇａｔｈｅｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｌｌ　ｓｔｒｉｐｓ）；スコア３：集めて細かい断片に裂く（Ｇａｔｈｅｒ　ａｎｄ　ｔｅａｒ　ｔｏ　ｓｍａｌｌ　ｐｉｅｃｅｓ）。ＰＳ２，Ｔｇ２５７６は、ＩｇＧ投与群において巣作りスコアの低下を示した。このような神経症状は、ＩＢＬ－１０１の投与では改善できなかったが、ＩＢＬ－１０２の投与では改善を示した。以上の結果は、毒性コンホマーに対する選択性の高さが、ＡＤの抗体治療には重要であり、選択性の高いＩＢＬ－１０２は治療・予防効果を示すことが示された。
　老人斑の免疫染色の結果を図６（脳）及び図７（海馬）に示す。ＰＳ２，Ｔｇ２５７６の脳内および海馬では、ＩｇＧ投与群において老人斑の存在が確認された。この老人斑の沈着を、ＩＢＬ－１０１およびＩＢＬ－１０２の投与は、抑制できなかった。以上の結果より、ＩＢＬ－１０１およびＩＢＬ－１０２は老人斑の数を減少させる効果はないことが明らかとなった。またＩＢＬ－１０２は、老人斑の数とは無関係に神経症状を改善したと考えられる。
　ＥＬＩＳＡによる脳内のＡβ量を測定した結果を図８に示す。ＰＳ２，Ｔｇ２５７６の脳内では、ＩｇＧ投与群においてＡβ４０およびＡβ４２が検出された。このＡβ４０およびＡβ４２を、ＩＢＬ－１０１およびＩＢＬ－１０２の投与は、減少させることはできなかった。以上の結果より、ＩＢＬ－１０１およびＩＢＬ－１０２は脳内のＡβ４０およびＡβ４２の総量を減少させる効果はないことが明らかとなった。またＩＢＬ－１０２は、Ａβ４０およびＡβ４２の総量とは無関係に神経症状を改善したと考えられる。
（実施例８）ＩＢＬ－１０２抗体の配列決定
　ＩＢＬ－１０２抗体の遺伝子配列を決定するため、重鎖（以下、「Ｈｃ」という）及び軽鎖（以下、「Ｌｃ」という）のクローニングを行った。ＩＢＬ－１０２抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。常法に従って、５’－Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ（５’－ＲＡＣＥ）を行い、Ｈｃ及びＬｃ遺伝子の５’末端の塩基配列を決定した。Ｈｃ、Ｌｃに特異的なプライマーを使用して、それぞれの全長ｃＤＮＡをクローニングした。決定されたＨｃ及びＬｃの遺伝子配列は図９（配列番号１及び配列番号８）、アミノ酸配列（シグナル配列を含む）は図１０（配列番号２及び配列番号９）にそれぞれ記載の通りであった。また、ＩＢＬ－１０２抗体のＶＨ及びＶＬの配列は、それぞれ順に配列番号４及び配列番号１１に記載のとおりであった。また、ＩＢＬ－１０２抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ順に、配列番号５，６，７，１２，１３，及び１４に記載のとおりであった。
（実施例９）ＢＩＡＣＯＲＥによる解離定数の測定
　ＩＢＬ－１０２抗体及びＩＢＬ－１０１抗体について、当該抗体と抗原との解離定数（ＫＤ）をＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ－Ｘ１００）を用いて測定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ－Ｘ１００）のマニュアルに従い、ＳＡチップにビオチン化Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２又はビオチン化野生型Ａβ４２を固定後、ＩＢＬ－１０１抗体又はＩＢＬ－１０２抗体を流し、結合速度定数Ｋａ１、解離速度定数Ｋｄ１を測定し、ｂｉｖａｌｅｎｔフィッティングを用いて結合定数ＫＤ値を決定した。
　Ｋａ１、Ｋｄ１、及びＫＤ値の結果を以下の表３に示す。以下のとおり、ＩＢＬ－１０２抗体はＩＢＬ－１０１抗体と比較して、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２及びＥ２２Ｐ－Ａβ４２ダイマーに強く結合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例１０）Ａβ重合体への結合能測定
　Ａβは互いに結合してオリゴマーとなることにより毒性を有すると考えられている。ＩＢＬ－１０２抗体のＡβオリゴマーへの結合を調べるため、次の各抗原への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定した：野生型Ａβ４２；Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２；Ｅ２２Ｐ，Ｖ４０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４２ダイマー；及び、Ｅ２２Ｐ，Ａ」３０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４０ダイマー。各抗原を固相用緩衝液（０．ｌＭ炭酸緩衝液ＰＨ９．５）で５０ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに加え、４℃で一晩反応させ固相化させた。ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳ）にてブロッキングした。このようにして各抗原を固相化した後、ＩＢＬ－１０２抗体を、１，０．５，０．２５，０．１２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、１００μＬ／ウェルで各固相抗原に加える。室温で、６０分間の反応後、洗浄し、標識抗体（Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｇｏａｔ　Ｆａｂ’－ＨＲＰ）を５０μＬ／ウェル加え、室温で６０分間反応後、洗浄した。発色用基質液（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩；ＯＰＤ）を加え発色（遮光して室温、３０分間）、停止液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４）を加え停止した後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてＩＢＬ－１０１抗体及び４Ｇ８抗体（Ａβ配列の１８－２２残基（ターン構造部分ではない）にエピトープを有するモノクローナル抗体；Ｈ．Ｍ．Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（１９８９）Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，７８：２２－２７）も同様に試験した。
　結果を図１１に示す。ＩＢＬ－１０１抗体は、野生型のＡβ４２、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２のモノマー、Ｅ２２Ｐ，Ｖ４０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４２のダイマー、Ｅ２２Ｐ，Ｖ４０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４０のダイマーのいずれともほぼ同等の弱い結合力を示した。それに対し、ＩＢＬ－１０２抗体は、野生型のＡβ４２への結合力はＩＢＬ－１０１と同等であったが、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２のモノマーに強く結合し、更に、Ｅ２２Ｐ，Ｖ４０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４２のダイマー、及びＥ２２Ｐ，Ｖ４０Ｌ，ＬＤａｐ－Ａβ４０のダイマーには更に強く結合した。コントロールとして用いた４Ｇ８抗体は、野生型のＡβ４２には強く結合したが、Ｅ２２Ｐ変異型のＡβ４２には弱くしか結合しなかった。このことから、ＩＢＬ－１０２抗体がＡβオリゴマーと特異的に強く結合することが示された。
（実施例１１）ワクチン単回投与試験
　ＩＢＬ－１０２抗体の静脈内への単回投与の効果について調べるため、１８月齢のＡＤモデルマウスＴｇ２５７６にＩＢＬ－１０２抗体を投与した。実験のスケジュールを図１２に示す。初回抗体投与から１週間間隔で合計２回、ＩＢＬ－１０２抗体（１０－２０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳを交互に投与した。マウスをＡ群及びＢ群の２群（各ｎ＝７）に分け、Ａ群には、初回：ＩＢＬ－１０２抗体、２回目：ＰＢＳを投与し、Ｂ群には、初回：ＰＢＳ、２回目：ＩＢＬ－１０２抗体を投与した。初回及び２回目投与の前（Ｐｒｅ　ｔｅｓｔ）および後（Ｐｏｓｔ　ｔｅｓｔ）に行動試験を行い、抗体投与による効果を調べた。行動試験は、新規物体に対する接触時間（匂いをかいでいる時間）を計測し、対照マウス（若齢Ｂ６）との比較により好奇心の指標をスコア化した。具体的には、再探索スコア（Ｒｅ－ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｓｃｏｒｅ）は、ＩＢＬ－１０２投与群又はＰＢＳ投与群の各個体の（Ｐｏｓｔ　ｔｅｓｔでの接触回数）／（Ｐｒｅ　ｔｅｓｔでの接触回数）を、対照マウス群の（Ｐｏｓｔ　ｔｅｓｔでの接触回数）／（Ｐｒｅ　ｔｅｓｔでの接触回数）の平均値で割って求めた。初回と２回目投与の行動試験では、異なる物体を使用した。
　結果を図１３に示す。ＰＢＳ投与群においては、Ｐｒｅ　ｔｅｓｔで一度接触したことを忘れ、Ｐｏｓｔ　ｔｅｓｔにおいて再度同じ物体を新規物体と認識して探索行動を取ったマウスが対照と比較して多かったのに対し、ＩＢＬ－１０２抗体を投与することにより、Ｐｒｅ　ｔｅｓｔで一度接触した物体には接触しないマウスの数が増えた。このことから、ＩＢＬ－１０２抗体の投与はＡβによる記憶障害を改善することが示された。
（実施例１２）ＩＢＬ－１０２抗体の結合特異性の測定３
　ＩＢＬ－１０２抗体とＩＢＬ－１０１抗体の、次の各抗原への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定し、比較した：野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ－Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ－Ａβ４２、Ｇ３３Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｌ３４Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３６Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３７Ｐ－Ａβ４２、Ｇ３８Ｐ－Ａβ４２、Ｖ３９Ｐ－Ａβ４２、Ｖ４０Ｐ－Ａβ４２、Ｉ４１Ｐ－Ａβ４２。具体的には、１μｇ／ウェルの８２Ｅ１抗体（Ａβ配列の１－１６残基（ターン構造部分ではない）を認識する；Ｙ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００４　Ｊｕｌ　２；３１９（３）：７３３－７．参照；以下同じ）を０．１Ｍ炭酸緩衝液で固相化（コート）した９６穴プレートに、２．５μｇ／ウェルの前記各抗原を添加した。室温で２時間静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した後、４℃で一晩ブロッキングした。各ウェルに抗Ａβマウスモノクローナル抗体ＩＢＬ－１０１及びＨＲＰ標識抗Ａβマウスモノクローナル抗体ＩＢＬ－１０２を１００μＬ添加した（１２０，６０，３０，１５ｎｇ／ｍＬ）。室温で６０分間静置後、ウェルの反応液を除去し、洗浄した後、　ＨＲＰ標識二次抗体を室温で一時間反応させた。ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質液を１００μＬ添加し、遮光して室温で３０分間静置後、２Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ加えて発色反応を停止させた。４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
　ＩＢＬ－１０２抗体とＩＢＬ－１０１抗体の前記各抗原への結合能を測定し、比較した結果を図１５に示す。数値は、４９２ｎｍにおける吸光度を表す。ＩＢＬ－１０２抗体はＥ２２Ｐ－Ａβ４２に極めて特異的な免疫反応性を示し、その他の抗原に対しては低いアフィニティを示した。この結果は、ＩＢＬ－１０２抗体は２２位及び２３位にターン構造を有するＡβ４２のみを非常に特異的に認識することを示した。
（実施例１３）ワクチン単回投与試験（ＩｇＧコントロール）
　ＩＢＬ－１０２抗体の静脈内への単回投与の効果について調べるため、１６－１９カ月齢のＡＤモデルマウスＴｇ２５７６にＩＢＬ－１０２抗体を投与した。野生型マウスおよびＴｇ２５７６に対して、２つの非常に類似した物体Ａ１およびＡ２を１日１０分間ずつ３日間記憶させた。その翌日、野生型マウスにはＰＢＳを、Ｔｇ２５７６にはＩｇＧまたはＩＢＬ－１０２（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与の翌日、２つの記憶させた物体Ａ１およびＡ２のうち、一方（Ａ１）および新規な物体Ｂの２つに対するマウスの接触回数を計数し、それぞれ、（物体Ａ１への接触回数）／（（物体Ａ１への接触回数）＋（物体Ｂへの接触回数））および（物体Ｂへの接触回数）／（（物体Ａ１への接触回数）＋（物体Ｂへの接触回数））を、マウスの記憶力の指標として評価した。
　結果を図１６に示す。野生型マウスでは、新奇物体（Ｎｏｖｅｌ：Ｂ）に対して有意に高い指向性を示した（ｐ＝０．０００３）が、ＩｇＧ投与Ｔｇ２５７６ではその傾向が見られず、記憶力の低下を示した。一方、ＩＢＬ－１０２投与Ｔｇ２５７６は、新奇物体に対する有意な指向性を示し（ｐ＝０．０００２）、記憶力の低下を示さなかった。このことから、ＩＢＬ－１０２抗体の投与はＡβによる記憶障害を改善することが示された。

Claims (33)

  1. 　２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβを極めて特異的に認識するが、他の構造を有するＡβは認識しない抗体又はその免疫反応性断片。
  2. 　更に、Ａβのオリゴマーを認識する、請求項１に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  3. 　Ａβのオリゴマーがダイマーである、請求項２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  4. 　ＡβがＡβ４２である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  5. 　Ａβの他の構造が、少なくとも、以下の群から選択される１種類以上の構造を含む、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片：Ａβの２１位及び２２位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２３位及び２４位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２４位及び２５位のアミノ酸におけるターン構造、Ａβの２５位及び２６位のアミノ酸におけるターン構造、及びＡβの３５位及び３６位のアミノ酸におけるターン構造。
  6. 　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合するエピトープを極めて特異的に認識するが、ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合しないエピトープを認識しない抗体又はその免疫反応性断片。
  7. 　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体とその抗原との結合を競合阻害するが、ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体が結合しないエピトープには結合しない抗体又はその免疫反応性断片。
  8. 　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
  9. 　更に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  10. 　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  11. 　更に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  12. 　ＶＨが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
  13. 　更に、ＶＬが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
  14. 　配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片をコードする核酸分子。
  15. 　配列番号１の１２６番目～４７９番目のヌクレオチド配列からなる核酸分子である、請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 　配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片をコードする核酸分子。
  17. 　配列番号８の１３０番目～４６５番目のヌクレオチド配列からなる核酸分子である、請求項１６に記載の核酸分子。
  18. 　配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片、及び／又は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片を発現可能なベクター。
  19. 　請求項１４又は請求項１５に記載の核酸分子、及び／又は、請求項１６又は請求項１７に記載の核酸分子を含有する、請求項１８に記載のベクター。
  20. 　請求項１８又は請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  21. 　請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する医薬組成物。
  22. 　ＡＤの予防用、治療用又は改善用である、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 　ＡＤ患者の認知機能を改善するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
  24. 　ＡＤ患者の記憶障害を改善するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
  25. 　請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する診断用組成物。
  26. 　ＡＤの診断に使用するための請求項２５に記載の診断用組成物。
  27. 　請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ａβの毒性コンホマーを測定するためのキット。
  28. 　請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ａβの毒性コンホマーの測定に使用するための組成物。
  29. 　検体と請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させるステップを備える、検体中におけるＡβの毒性コンホマーレベルの測定方法。
  30. 　以下のステップを備える、ＡＤの診断方法：
    ａ）被験者由来の試料と、少なくとも１つの請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とをｉｎ　ｖｉｔｒｏで接触させるステップ、
    ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した抗原のレベルを測定するステップ、並びに、
    ｃ）決定された抗原レベルから、前記被験者におけるＡＤの有無又は程度を診断するステップ。
    　ここで、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルが健常人由来の試料における同レベルと比較して高い場合には、ＡＤに罹患している可能性が高いと診断される、方法。
  31. 　以下のステップを備える、ＡＤの診断方法：
    ａ）被験者由来の試料と、少なくとも１つの請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させるステップ、
    ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した抗原のレベルを測定するステップ、
    ｃ）Ａβの構造非特異的な抗Ａβ抗体と被験者由来の試料とを接触させ、その結合物の量を測定することにより、被験者由来の試料における総Ａβ量を測定するステップ、並びに、
    ｄ）被験者由来の試料における、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルと総Ａβのレベルの比を計算し、決定された比から、前記被験者におけるＡＤの有無又は程度を判定するステップ、
    　ここで、総Ａβのレベルに対する、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片に結合する抗原のレベルが健常人由来の試料における同比と比較して高い場合には、ＡＤに罹患している可能性が高いと判定される、方法。
  32. 　検体中のアミロイドβの毒性コンホマーの存否を決定する方法であって、
    （ａ）請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ、
    （ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマーを検出するステップ、
    （ｃ）前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出された場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在すると判定し、前記ステップにおいてアミロイドβの毒性コンホマーが検出されなかった場合には、検体中にアミロイドβの毒性コンホマーが存在しないと判定するステップを備える、方法。
  33. 　検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを決定する方法であって、
    （ａ）請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片と検体とを接触させるステップ、
    （ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したアミロイドβの毒性コンホマー量を測定するステップ、
    （ｃ）前記検出された毒性コンホマー量から、検体中のアミロイドβの毒性コンホマーのレベルを算出するステップを備える、方法。
     
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