JP5765857B2 - Aβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用 - Google Patents
Aβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用 Download PDFInfo
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Description
(1)抗神経毒性活性;
(2)Aβアミロイド線維形成抑制活性;
(3)Aβオリゴマーのみを認識する特異性;
(4)AD脳においてAβオリゴマーを捕捉する能力;
(5)APPswe-トランスジェニックマウス(Tg2576)におけるアルツハイマー病様表現型発症(記憶障害、脳Aβ蓄積レベル)を予防する能力。
〔1〕 配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:3に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔2〕 配列番号:21に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔3〕 配列番号:41に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:43に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔4〕 配列番号:61に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:63に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔5〕 配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔6〕 配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体、
〔7〕 以下の(1)〜(38)のいずれかに記載の抗体、
(1)CDR1として配列番号:9に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:11に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:13に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(2)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:17に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:19に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体
(4)VHとして配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(5)VLとして配列番号:7に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体
(7)CDR1として配列番号:29に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(8)CDR1として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:37に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:39に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体
(10)VHとして配列番号:25に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(11)VLとして配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体
(13)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(14)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(15)(13)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体
(16)VHとして配列番号:45に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(17)VLとして配列番号:47に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(18)(16)に記載のH鎖、および(17)に記載のL鎖を含む抗体
(19)CDR1として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:73に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(20)CDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:77に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(21)(19)に記載のH鎖、および(20)に記載のL鎖を含む抗体
(22)VHとして配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(23)VLとして配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(24)(22)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体
(25)CDR1として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(26)CDR1として配列番号:95に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(27)(25)に記載のH鎖、および(26)に記載のL鎖を含む抗体
(28)VHとして配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(29)VLとして配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(30)(28)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体
(31)CDR1として配列番号:109に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:111に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(32)CDR1として配列番号:115に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:117に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:119に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(33)(31)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体
(34)VHとして配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(35)VLとして配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(36)(34)に記載のH鎖、および(35)に記載のL鎖を含む抗体
(37)(1)から(36)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(36)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体
(38)(1)から(36)のいずれかに記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体
〔8〕 抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、〔7〕に記載の抗体、
〔9〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、
〔10〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、抗認知機能障害剤、
〔11〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、アルツハイマー病治療剤、
〔12〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、アルツハイマー進行抑制剤、
〔13〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、老人斑形成抑制剤、
〔14〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、Aβ蓄積抑制剤、
〔15〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、抗神経毒性剤、
〔16〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、Aβアミロイド線維形成阻害剤、
〔17〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として含有する、抗シナプス毒性剤、
〔18〕 被験者から採取された試料に含まれるAβオリゴマーを、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体を用いて検出する工程を含む、Aβオリゴマーを測定する方法、
〔19〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体を用いて、被験者から採取された試料におけるAβオリゴマーを検出することを特徴とする、被験者がアルツハイマー病候補であるか否か診断する方法、
〔20〕 以下の工程を含む、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かを診断する方法であって、工程(b)に記載の量が健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると判定される方法、
(a)被験者から採取した試料、および〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体とを接触させる工程
(b)前記試料中におけるAβオリゴマーの量を測定する工程
〔21〕 以下の工程を含む、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かを診断する方法であって、工程(b)に記載の比が健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると判定される方法、
(a)被験者から採取した試料、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、およびAβモノマーに結合する抗体とを接触させる工程
(b)前記試料中におけるAβモノマーに対するAβオリゴマーの比を測定する工程
〔22〕 試料が血液もしくは脳脊髄液である、〔18〕〜〔21〕のいずれかに記載の方法、
〔23〕 〔18〕〜〔21〕のいずれかに記載の方法に用いるための薬剤、
〔24〕 〔18〕〜〔21〕のいずれかに記載の方法に用いるためのキット、
を提供するものである。
〔25〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、認知機能障害の予防および治療のいずれか、または両方のための方法、
〔26〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、アルツハイマー病の予防および治療のいずれか、または両方のための方法、
〔27〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、アルツハイマー病の進行を抑制する方法、
〔28〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、老人斑形成を抑制する方法、
〔29〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、Aβの蓄積を抑制する方法、
〔30〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、神経毒性を中和する方法、
〔31〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、Aβアミロイド線維の形成を阻害する方法、
〔32〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物を有効成分として投与する工程を含む、シナプス毒性を中和する方法、
〔33〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物の抗認知症機能障害剤の製造における使用、
〔34〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物のアルツハイマー病治療剤の製造における使用、
〔35〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物のアルツハイマー病進行抑制剤の製造における使用、
〔36〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物の老人斑形成抑制剤の製造における使用、
〔37〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物のAβ蓄積抑制剤の製造における使用、
〔38〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物の神経毒性活性中和(抑制)剤の製造における使用、
〔39〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物のAβアミロイド線維形成阻害剤の製造における使用、
〔40〕 〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物のシナプス毒性活性中和(抑制)剤の製造における使用、
〔41〕 認知機能障害の予防および治療のいずれか、または両方に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔42〕 アルツハイマー病の予防および治療のいずれか、または両方に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔43〕 アルツハイマー病進行抑制に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔44〕 老人斑形成抑制に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔45〕 Aβ蓄積抑制に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔46〕 神経毒性活性中和(抑制)に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔47〕 Aβアミロイド線維形成阻害に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
〔48〕 シナプス毒性活性中和(抑制)に使用するための、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体、または〔9〕に記載の組成物、
を提供する。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
(i)配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:3に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
(ii)配列番号:21に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
(iii)配列番号:41に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:43に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
(iv)配列番号:61に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:63に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
(v)配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
(vi)配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖(重鎖)、および配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有するL鎖(軽鎖)を含む抗体
なお本発明の抗体の一つの態様として、低分子化抗体を挙げることもできる。低分子化抗体は、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。抗体断片としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、Diabody、sc(Fv)2(single chain (Fv)2)などを挙げることができる。
(A)配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:3に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
(B)配列番号:21に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
(C)配列番号:41に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:43に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
(D)配列番号:61に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:63に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
(E)配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
(F)配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、および配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体が結合するAβオリゴマーと結合する抗体
また本発明は、本発明の抗体が結合するAβオリゴマーを提供する。抗体としては、好ましくは1A9モノクローナル抗体、2C3モノクローナル抗体、5A5モノクローナル抗体、5A9モノクローナル抗体、4F7モノクローナル抗体、4H5モノクローナル抗体、6E4モノクローナル抗体、または6H4モノクローナル抗体を挙げることができる。このようなAβオリゴマーは、抗体を調整するための抗原や、ワクチンとして利用できる。
(1)CDR1として配列番号:9に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:11に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:13に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(2)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:17に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:19に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体
(4)VHとして配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(5)VLとして配列番号:7に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体
(7)CDR1として配列番号:29に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(8)CDR1として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:37に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:39に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体
(10)VHとして配列番号:25に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(11)VLとして配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体
(13)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(14)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(15)(13)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体
(16)VHとして配列番号:45に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(17)VLとして配列番号:47に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(18)(16)に記載のH鎖、および(17)に記載のL鎖を含む抗体
(19)CDR1として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:73に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(20)CDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:77に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(21)(19)に記載のH鎖、および(20)に記載のL鎖を含む抗体
(22)VHとして配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(23)VLとして配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(24)(22)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体
(25)CDR1として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(26)CDR1として配列番号:95に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(27)(25)に記載のH鎖、および(26)に記載のL鎖を含む抗体
(28)VHとして配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(29)VLとして配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(30)(28)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体
(31)CDR1として配列番号:109に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:111に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(32)CDR1として配列番号:115に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:117に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:119に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(33)(31)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体
(34)VHとして配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
(35)VLとして配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(36)(34)に記載のH鎖、および(35)に記載のL鎖を含む抗体
(37)(1)から(36)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(36)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体
(38)(1)から(36)のいずれかに記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体
・認知機能障害の予防および治療のいずれか、または両方に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・アルツハイマー病の予防および治療のいずれか、または両方に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・アルツハイマー病進行抑制に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・老人斑形成抑制に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・Aβ蓄積抑制に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・神経毒性活性中和(抑制)に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・Aβアミロイド線維形成阻害に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
・シナプス毒性活性中和(抑制)に使用するための、上記本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物
即ち、本発明は、本発明に記載の抗体を用いて、被験者から採取された試料におけるAβオリゴマーを検出することを特徴とする、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かを診断する方法を提供する。
(a)被験者から採取した試料、本発明に記載の抗体、およびAβモノマーに結合する抗体とを接触させる工程
(b)前記試料中におけるAβモノマーに対するAβオリゴマーの比を測定する工程
抗原の作製(1A9および2C3)
合成Aβ1-42(ペプチド研、大阪)を蒸留脱イオン水または10 mM リン酸緩衝液中に溶解させ、それを37℃で18時間インキュベート後、NuPAGE Tris-Glycine gel 4-12% SDS-PAGEにてペプチドを分離し、CBB染色にて可視化後、Aβ1-42モノマーの混入のないAβ1-42テトラマーのみを切り出した。
合成したA-beta 1-40ペプチド(ペプチド研)のN末端に蛍光色素6-Carboxytetramethylrhodamine (6-TAMRA)(SIGMA)を化学結合した修飾A-betaを合成した。この修飾A-betaを、合成A-beta 1-40ペプチドとともに重合反応させることにより、オリゴマーを多く含む標品(Aβ1-40オリゴマー)を調製した。このときの条件として、後述のThTアッセイを用いて測定した蛍光強度が、修飾A-betaを混入させなかったときと比較して少なくとも1/4以下になることが望ましく、より具体的には、修飾A-betaと合成A-beta 1-40ペプチドを100μMずつ混合し、20時間重合させたものが好ましい。
上述の方法で作製した抗原をBalb-cマウスの肉趾に対して、免疫処置を行い、続いてさらに6回の追加免疫を行った。鼠径リンパ節を用いて、ポリエチレングリコール1500を用いたSp2/O-Ag14細胞との融合によってハイブリドーマを作製した。
精製免疫グロブリンのアイソタイプ判定は、Serotec(Oxford, UK)マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キットを用いて行った。
初期スクリーニングは、18時間プレインキュベートした2.5μlのAβ1-42(2.5μg/ドット)をニトロセルロース膜上に固相化するドットブロット解析で行った。膜上の非特異結合部位を5%低脂肪乳、1% BSA及び0.05%Tween-20を含有するリン酸緩衝液でブロッキング後、培養液上清とともにインキュベートした。培養上清中のAβオリゴマー結合抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスF(ab')2(1:3000;Amersham)で検出し、LAS3000 mini(Fujitsu, Tokyo, Japan)を用いる高感度化学発光(ECL)キットによって描出した。400種のクローンのうち、1A9および2C3を含むドットブロット陽性16種を下記の如く二次スクリーニングに供した。
一次スクリーニングにて選択した16種のクローンがAD脳内のAβオリゴマーを捕捉しうるか否かを調べる二次スクリーニングのため、Aβオリゴマーを大量に含有するアミロイド分画(Matsubara E, et al, Neurobiol Aging, 2004)にて免疫沈降実験(Ghiso J, et al, Biochem J, 1993)を行った。AD脳から調整した緩衝液不溶性・蟻酸可溶性の画分に、培養液上清およびプロテイン-G-Sepharoseとインキュベートした。免疫沈降させたAβオリゴマーはNuPAGE 4-12% Bis-トリス-グリシンゲルによって分離し、10%メタノールを含む10 mM 3-シクロヘキシルアミノ-1-プロパンスルホン酸(pH 11)を用いて、ニトロセルロース膜またはImmobilon P(Millipore)上に400 mAで1時間転写した。膜上の非特異結合部位を5%低脂肪乳、1% BSA及び0.05%Tween-20を含有するリン酸緩衝液にて室温で3時間ブロッキングした。免疫沈降させたAβオリゴマーの検出は、モノクローナル4G8(1:1000)または6E10(1:1000)を用いたイムノブロットを前述の如く行い、16種のクローンのうち2種のクローン、すなわち1A9および2C3を、アルツハイマー病に対する治療用抗体の候補として選び出した。
モノクローナル抗体6E10および4G8(Covance Immuno-Technologies, Dedham, MA)はヒトAβ配列の1-16および17-24をそれぞれエピトープとして認識する。Aβオリゴマーを特異的に認識するポリクローナルA11は、Biosource社(Camarillo, CA)より購入した。Alex Fluor(AF)488または594結合ヤギ抗マウスIgGおよびAlex Fluor(AF)488結合ヤギ抗ラットIgGはMolecular Probes社(Eugene, OR)より購入した。抗マウスIgG2bはSigma社(St. Louis, MO)より購入した。抗シナプトフィジン抗体はSanta Cruz社(Santa Cruz, CA)より、抗ドレブリン抗体はMBL社(Nagoya, Japan)より購入した。
1A9または2C3のサイズ特異性をさらに評価するためにSECを行った。以前に報告したように[Matsubara E, et al; Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]、この方法ではAβモノマーとAβオリゴマー、リポタンパク結合性Aβとリポタンパク非結合性Aβの選択的分離が可能であった。本発明者らはAPP/PS1を強発現させたHEK293細胞からの培養上清をMicrocon 3 kDa分子量カットオフフィルター(Millipore Corp.)を用いて約10倍に濃縮後、リン酸緩衝溶液によって平衡化したSuperose 12サイズ排除カラム(1 cm×30 cm、Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden、流速0.5 ml/分)で各1 mlの28画分を分画した。それぞれの画分の半分を1A9または2C3を用いて免疫沈降させた。その結果得られた免疫沈降物中に存在するAβは、4G8を用いたイムノブロットにて検出した。
合成Aβ1-42を0.02%アンモニア溶液中に250μMで溶解後、シードを含まないAβ溶液調整を目的に、シードとして作用する恐れのある溶解しなかったペプチドをOptima TL超遠心機(Beckman, USA)を用いて540,000 x gで3時間超遠心した。その上清を回収後分注し使用時まで-80℃で保存した。サンプル調整は使用直前に解凍したAβストック溶液をTris-緩衝食塩水(TBS:150 mM NaClおよび10 mM Tris-HCl、pH 7.4)で10倍希釈し、25μM溶液を以下の実験で使用した。合成Aβ1-40(HCL form,ペプチド研、大阪)では2倍濃度で調整を行った。
Aβ溶液(25μM)を指定濃度の抗体の存在下で、37℃で2時間または24時間インキュベートした。インキュベーション混合物におけるThT蛍光強度を蛍光分光光度計(RF-5300PC)(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)を用いて測定した。5μM ThTおよび50 mMグリシン-NaOHを含むpH 8.5の反応混合物(1.0 ml)を用い、励起波長および発光波長をそれぞれ446 nmおよび490 nmとしてAβアミロイド線維の至適蛍光強度を測定した。蛍光強度は混合物を調製した直後に測定した。
ラット褐色細胞腫PC12(PC12)細胞を、10%熱非働化ウマ血清(Invitrogen)および5%ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen)を加えたDulbecco変法Eagle培地(DMEM)(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で培養した。神経細胞へ分化誘導するため、ポリ-L-リジン(10 mg/ml)をコーティングした培養皿にPC12細胞を20,000個/cm2の密度でプレーティングし、100 ng/mlの神経成長因子を加えたDMEM中で6日間培養した(PC12N)(NGF;Alornone Labs, Jerusalem, Israel)。PC12Nに対して、抗体の存在下または非存在下で、シードフリーAβ1-42またはプレインキュベートしたAβ1-42 各25μMを4℃で48時間にわたって曝露させた。Aβ1-42が惹起する神経毒性は、Live/Dead二色蛍光アッセイを製造元の指示(Molecular Probes, Eugene, Oregon)に従って評価した。
神経毒性Aβオリゴマーの25μMでのサイズの特性を明らかにするために、Microcon 3 kDa、10 kDa、30 kDa、および100 kDaカットオフ膜を用いる連続的な限外濾過を行って、4種の濾液(<3 kDa、3〜10 kDa、10〜30 kDa、30〜100 kDa)および1種の保持液(>100 kDa)を調製した。それぞれの画分を前述の如くAβ誘発性神経毒性アッセイに供した。PC12Nを各画分に曝露させ、毒性画分を上記の通りに評価した。A11、1A9、2C3または4G8認識立体構造体の分布同定も、前述したドットブロット解析により行った。神経毒性オリゴマーの形態の特定は、それぞれの画分を原子間力顕微鏡検査に供し行った。
電子顕微鏡検査のためには、試料を蒸留水で希釈し、炭素コーティングしたグリッド上に散布した。グリッドを1%リンタングステン酸により陰性染色し、Hitachi H-7000電子顕微鏡(Tokyo, Japan)を加速電圧77 kVで用いて検査した。AFM評価は最近報告された通りに行った。試料を新たに劈開させた雲母上に滴下した。30分間そのまま置き、水で洗浄した後に、溶液状の試料を、タッピングモードに設定したNanoscope IIIa(Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA)を用いて評価した[Tero, R, et al., Langmuir 20, 7526-7531, 2004]。OMCL-TR400PSA(Olympus, Japan)をカンチレバーとして用いた。
本研究は、東京都老人総合研究所(Itabashi, Tokyo, Japan)の脳バンクによる剖検症例(n=50;男性26例、女性24例)を基にしている。この研究プロジェクトは、東京大学医学部、東京都老人総合研究所・東京都老人医療センター、および国立長寿医療研究所の施設内倫理委員会による承認を受けている。被験者および試料採取詳細は報告済みであるが、不溶性脳画分解析を特徴としている[Katsuno T, Neurology, 64: 687-692, 2005]。本プロジェクトにおいて、本発明者らは、過去の研究で特性が明らかにされていない可溶性脳画分を解析対象とした[Katsuno T, Neurology, 64: 687-692, 2005]。凍結組織試料(内嗅領皮質の前方部分)を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む9倍量のTris-食塩水(TS)緩衝液中でホモジネート化した。このホモジネートを265,000×gで20分間超遠心後回収した上清の3分の1(0.5 ml)をイムノブロット分析に供した。
Tg2576マウスの脳の左半球を、凍結ミクロトーム(RM 2145;Leica, Wetzlar, Germany)を用いて、30μm厚切片として矢状方向に切断した。チオフラビン-S染色を以前に記載された通りに行った(Wyss-Coray et al, 2001)。腫大変性神経突起形成観察はシナプトフィジン抗体(Chemicon, Temecula, CA)を用いて行い、各マウスに関して、脳の左半球1つにつき4〜5枚の切片におけるチオフラビン-S陽性斑とシナプトフィジン陽性腫大変性神経突起数を倍率40倍で算定した。Aβ沈着観察は連続切片を、ギ酸またはプロテアーゼ-Kによる短時間の前処理の後にAβ免疫染色キット(Sigma, St. Louis, MO)で行い、免疫陽性シグナルをABC eliteキット(Vector Laboratories)を用いて描出した。大脳皮質および海馬の画像を顕微鏡に接続したデジタルカメラを用いて取り込み、簡単なPCIソフトウエア(Compix Imaging System, Lake Oswego, OR)を用いて解析した。抗体の脳内移行は共焦点レーザー顕微鏡(Carl Zeiss LSM510)を用いて観察した。チオフラビン-S陽性斑とシナプトフィジン陽性腫大変性神経突起数定量は、二重盲検様式で報告した。
3カ月齢の雌性非トランスジェニック(非Tg)マウス、および家族性ADのSwedish二重変異(K670N;M671L)を有するヒトAPP遺伝子を保有しかつ過剰発現するTg2576マウスをTaconics社(Germantown, NY, USA)から購入し、本発明者らの動物飼育施設で13カ月齢になるまで飼育した。受動免疫治療によってアルツハイマー様表現型が予防されるか否かを判定するために、4カ月齢Tg2576に対して、13カ月齢になるまで1A9または2C3(0.4 mg/kg/週)またはPBSを尾静脈内投与した。記憶機能は13カ月齢の時点で、以前の記載の通りに4通りの行動パラダイムに関して計測した(Mouri A, FASEB J, 21: 2135-2148, 2007):(1)Y迷路試験における短期記憶;(2)新規物体認識試験;(3)Morris水迷路試験;(4)手がかりつき恐怖条件付け試験。行動試験の終了から3日後にマウスを生化学的および組織学的な評価のために屠殺した。実験結果は一元配置ANOVAおよび二元配置ANOVAによって分析し、post-hoc分析にはFisher検定を用いた。
CSFの分離後に、AD患者12例およびNC13例において、600μlのCSFおよび以前に記載されたプロトコール[Matsubara E, et al; Ann Neurol, 45: 537-541, 1999]を用いた調製用連続密度浮遊超遠心分離により、リポタンパク質の除去を行った。CSFの密度をKBrにて1.25 g/mlに調整し、Hitachi RP100AT遠心機を用いて100,000 rpm、16℃にて8時間にわたり超遠心を行った。密度1.25 g/mlにおける浮遊リポタンパク質とその除去をおこなった下澄み液(LPD-CSF)両者を3 kDaカットオフ膜(Microcon 3;Arnicon, Inc)を用いる限外濾過に供し、使用時まで凍結下または4℃で保存した。
以前に詳細に記載された通りに[Matsubara E, et al, Ann Neurol, 537-541, 1999; Matsubara E, et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]、全血漿またはLPDP Aβ種を特異的に定量するためにサンドイッチELISAを用いた。脳Aβ種の分析のためには、100μlの緩衝液可溶性Aβ種をELISAにそのまま供し、70%ギ酸抽出物の形態にある不溶性Aβ試料は、ELISAの前に1 M Tris-HCl(pH 8.0)で中和して1:1000に希釈した。その結果得られた値を脳の湿重量で補正し、最終的にはpmol/グラムとして表した。全てのプレート上の3つの標準的な血漿試料を含めることにより、プレートを互いに標準化した。
モノマー性AβではなくAβオリゴマーを特異的に検出するために、化学発光を利用するサンドイッチ固相酵素免疫アッセイ(化学発光-ELISA)を用いた。マイクロプレートをモノクローナル1A9(IgG2bアイソタイプ)、2C3(IgG2bアイソタイプ)または1A9/2C3の混合物でコーティングし、100μlの異なる試料(脳・脳脊髄液)とともに4℃で24時間連続インキュベートした上で、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合BA27Fab'断片(抗Aβ1-40、Aβ40に対して特異的、Wako pure chemical, Osaka, Japan)または西洋ワサビペルオキシダーゼ結合BCO5 Fab'断片(抗Aβ35-43、Aβ42に対して特異的、Wako pure chemical, Osaka, Japan)とともに4℃で24時間インキュベートした。SuperSignal ELISA Pico化学発光基質(Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて発生させた化学発光は、Veritasマイクロプレート照度計(Promega)にて定量した。
このアッセイに用いたAβオリゴマーは、合成Aβ1-40(HCl form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈し37℃で1時間保温することで調製した。また、Aβモノマーは合成Aβ1-40(TFA form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈することで調製した。まず、96well-immuno-plateにAβオリゴマー400ng/wellを固相化し、続いてBSAを用いてブロッキングを行った。次に、4F7、4H5、5A5、5A9、6E4および6H4抗体およびコントロールとして抗Aβ抗体(4G8と6E10)を100pg/ml〜100μg/mlの範囲で段階希釈したAβモノマーあるいはAβオリゴマーをそれぞれ混合し2時間保温後、上記96well-immuno-plateにそれぞれ添加し室温にて10分間保温した。固層化Aβオリゴマーと各抗体の結合力は、HRP標識抗マウスIgG抗体とTMB溶液を用いた発色反応を450nmの吸光度を測定することで検出した。
溶液中においてはAβオリゴマーとモノマーとは混在して存在している。このため、Aβオリゴマー特異的抗体を得るための抗原の調製においては、Aβモノマーの除去が不可欠である。図1Aに示した様に、本発明者らはSDS-PAGE分析により、Aβモノマーの混入を伴わずにSDS安定性Aβテトラマーのみを単離することができた。単離したAβテトラマーによるインビボ免疫処置後の陽性ハイブリドーマクローン選択には、ドットブロット分析を行った後に免疫沈降処置を行う2段階のスクリーニングを採用した。ドットブロット分析に供した400種のクローンのうち、16種が陽性と判定された(陽性率=4%)。選択した陽性クローンのオリゴマー特異性を評価するために、AD脳由来のリン酸緩衝液不溶性で蟻酸(FA)には可溶性であるアミロイド画分[Matsubara E et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]を、陽性ハイブリドーマ細胞培養物の上清を用いた免疫沈降法で解析した(図1B)。抗Aβモノクローナル4G8を用いたイムノブロット分析により、ダイマー、それよりも少量のトリマー、さらには凝集したAβ分子種の特徴であるより高分子量スメアーが検出された。微量のSDS存在下で解離したAβモノマーも認められた。Native 1A9または2C3立体構造体(オリゴマー)の存在をさらに検証するために、本発明者らは、変異型PS1 cDNAをトランスフェクトしたヒト胎児腎臓(HEK)293細胞の馴化培地(CM)中での検出を目指した(Nakaya Y et al, J Biol Chem, 280: 19070-19077, 2005)。本発明者らはSECを用いてHEK293 CMを分画後、オリゴマー同定を試みた。以前に報告した通り(Matsubara E et al, Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004; Yamamoto N, et al: J Biol Chem, 282: 2646-2655, 2007)、この手法はオリゴマー(画分8〜13)をモノマー(画分14〜20)から効果的に分離する。モノクローナル1A9は、CM中に分泌されるSDS安定性Aβダイマーを画分8(>680 kDa)に、SDS安定性ダイマーおよびトリマーを画分13(17〜44 kDa)に、さらにはごく微量のダイマーを画分16(図1C)中に免疫沈降させた。同様の結果が2C3での免疫沈降でも得られた(非提示データ)。これらのデータから、モノクローナル1A9または2C3が、Aβモノマーを認識することなく、Aβオリゴマーに対して真に特異的であることが明らかに示された。
モノクローナル1A9または2C3がAβ誘発性神経毒性を防御しうるか否かについて評価するために、NGFで分化させたPC12細胞(PC12N)を、モノクローナル抗体(mAb)の存在下または非存在下で、シードフリー25μMのAβ1-42(540,000×gによるThT陰性上清)とともに37℃で48時間インキュベートした。神経細胞の生存度はLIVE/DEADアッセイを用いて判定した(図2)。対照アッセイ(図2A)と比較して、Aβ1-42の存在下では有意な神経細胞死(50%)が観察された(図2Bおよび2G)。非特異的なIgG2b(図2Cおよび2G)は、Aβ1-42誘発性神経毒性を同一条件下で阻害することができなかった。市販のAβ特異的モノクローナル抗体4G8(IgG2bアイソタイプ、図2Dおよび2G)では毒性を増強する傾向がみられた。モノクローナル2C3(IgG2bアイソタイプ、図2Fおよび2G)は、Aβ1-42の神経毒性を濃度依存的にほぼ完全に中和したことから、de novo形成性の神経毒性2C3立体構造体はオリゴマー形態をとっていると考えられた。一方、1A9(IgG2bアイソタイプ、図2Eおよび2G)の抗神経毒性活性は2C3と非特異的IgG2bとの中間であり、このことは1A9立体構造体が2C3オリゴマーとは構造的に異なる立体構造を有することを示唆する。
神経毒性Aβ1-42オリゴマーの正確なサイズおよび形態の同定は現在、最重要課題の一つで熾烈な競争下にある。本発明者らは可溶性神経毒性Aβ1-42分子種を限外濾過および分子篩(UC/MS)によって単離し以下の5つの画分に分割することができた(図3A):画分1、<3 kDaの濾液(レーン1);画分2、3〜10 kDaの濾液(レーン2);画分3、10〜30 kDaの濾液(レーン3);画分4、30〜100 kDaの濾液(レーン4);画分5、>100 kDaの保持液(レーン5)。モノクローナル4G8を用いたイムノブロット分析(図3A)により、画分1(レーン1)にはAβが存在せず、画分2(レーン2)にはAβモノマーが、(レーン3)にはAβモノマーに加えて少量のダイマーが、画分4(レーン4)にはモノマーからペンタマーまでのAβが、画分5(レーン5)にはモノマーからペンタマーまでに加えて45〜160 kDaのバンドが認められた。これらのデータは、2%SDSが高分子量(HMW)Aβオリゴマーをモノマーおよび低分子量(LMW)オリゴマーへと脱重合させることを示している。毒性Aβ1-42のサイズ分布を検証するために、本発明者らはPC12Nとともに37℃で48時間コインキュベートした各画分の生物活性を調べた。図3Bおよび3Cに示されているように、画分1は非毒性であること、画分2の毒性もごくわずかであり、Aβモノマーおよびダイマーが有毒である可能性は低いことが示された。画分3〜5は有意な毒性を示し[One-way ANOVA解析、p<0.0001]、神経毒性オリゴマーのサイズが理論上トリマー以上に相当することを示唆している。オリゴマー特異的A11抗体を用いたドットブロット解析でも、神経毒性を有する上記3画分(3〜5)にA11陽性所見を認め、神経毒性体は確かにオリゴマーであるとの傍証が得られた(図3D)。2C3オリゴマーは画分4および5で観察され(図3D)、2C3が実際に神経毒性Aβオリゴマー(>30 kDa)と反応することが確認された。さらに2C3オリゴマーの大半は毒性の最も高い画分5に認められ(>100 kDa)、分子量が100 kDaを上回る2C3オリゴマーが強力な神経毒性を呈すると考えられた(図3D)。一方、1A9オリゴマーは毒性の最も高い画分5にわずかに分布するもののきわめて少量で、1A9による神経毒性中和活性が不十分であった結果(図2Eおよび2G)によく符合している。これに対して、抗神経毒性活性のないモノクローナル4G8は全ての画分に分布するAβ種を検出し(図3D)、同じサイズでもオリゴマーが非毒性重合体として存在している可能性が考えられた。
本発明者らは次に、1A9または2C3がAβアミロイド線維形成抑制活性をもつか否かの検討を行った。Aβ1-42アミロイド線維形成(0、10、25、50μM)を、ThT蛍光により37℃で72時間の長さにわたってアッセイした。本発明者らが施行した条件下では、シードフリーAβ1-42(540,000×g超遠心後のThT陰性上清画分)は、重合核依存的な機序により、アミロイド線維へと重合した(図4A)。1A9または2C3のAβアミロイド線維形成抑制活性を評価するために、本発明者らは、抗体の存在下または非存在下で、25μMのシードフリーAβ1-42を37℃で48時間インキュベートした。図4Bに示したように、ThT蛍光強度変化は2C3の濃度依存的であったが、モノクローナル1A9、4G8または非特異的IgG2bの存在下では変化を認めなかった。一方、2時間のインキュベートでのAβの重合では、2C3と同様に1A9においてもほぼ完全な線維形成抑制活性がみられた(図4C)。Aβアミロイド線維形成抑制活性はAβに対して2C3のモル比が低くてもみられ、2C3がAβ1-42アミロイド線維形成早期にde novo形成される重合核またはシード機能阻害効果を有していると推測された。同様の結果は形態的にも観察された。図4E(Aβ42単独)および図4F(Aβ42+2C3、25:3)に示した如く、Aβアミロイド線維形成がモノクローナル2C3の存在下では部分的に阻害され、1A9(図4G)存在下では阻害効果がわずかにしか認められなかったことが、電子顕微鏡検査(EM)によって実証された。一方、被験抗体はいずれも、24時間インキュベートであらかじめ形成されたAβ1-42アミロイド線維に対しては、その溶解効果や脱重合効果は観察されなかった(図4D)。
Aβ1-42オリゴマー化とアミロイド線維形成との間の構造的および動態学的な関係を解明するために、重合体形成のタイムコースをA11、1A9、2C3または4G8を用いたドットブロット解析にて行った。図5Aに示したように、A11抗体反応性オリゴマーの大半は重合のラグタイム期(0〜8時間)に構築され、ThT-蛍光値は相対的に弱い。次の線維伸長期(8〜24時間)には、A11免疫反応性オリゴマーのレベルはプラトーに達し、その後は72時間(プラトー期)もの間にわたって一定に保たれた(ピーク値の20%前後)。抗オリゴマーA11抗体は、アミロイド線維を認識せず、Aβオリゴマー形成を特異的に観察しうることが示されているため[Kayed R, et al, Science 300, 486-489, 2003]、本発明者らの結果は、Aβオリゴマー形成がアミロイド線維形成に先行し、しかもアミロイド線維形成経路に直接移行しないオリゴマー重合状態が存在することを示唆している。2C3オリゴマーとA11オリゴマーの動態は類似していたが、1A9オリゴマーの動態は異なるものであった。1A9オリゴマーは4時間後にはじめて検出され、その後経時的に2倍ほどの1A9免疫反応性上昇を認めた。これはとりもなおさず1A9オリゴマーが遅延型形成をとることを示唆する。これに対して、2C3オリゴマーはラグタイム期(O〜8時間)に一過性の出現をみた後、8〜72時間の間はオリゴマー重合状態としてごく微量(5%未満)存在していることが明らかとなった。これら本発明者らのデータは、A11、1A9および2C3オリゴマーが構造的および免疫学的に互いに異なる立体構造または安定性を有し、2C3オリゴマーは1A9オリゴマーに比し、比較的不安定である可能性が示唆された。
1A9または2C3の特異性および生物活性が実証されたことから、本発明者らは引き続いて、脳内の1A9または2C3重合体を免疫組織化学法によって検出することを目指した。本発明者らはまず慣例的な免疫組織化学法:すなわち、脳切片のホルムアルデヒド固定およびギ酸、SDSまたはマイクロ波処理による免疫反応性の増強法等を実施した。いずれの増強法を用いても、両抗体によるAD脳での免疫反応性は観察されなかった。本発明者らは免疫染色を改善することが知られているプロテアーゼ-Kで切片を前処理したところ[Wrzolek MA, et al: Am J Pathol, 141: 343-355, 1992]、多数の老人斑が1A9(図6A)、2C3(図6B)及びA11(図6C)によって免疫染色された。Aβアミロイド線維がAβオリゴマー誘発性神経毒性を中和するという本発明者らのインビトロ実験での知見と総合すると、老人斑はAβオリゴマーを隔離収納するための一種の防御的リザーバーであり、その内部には抗体は容易に到達できないものと考えられた。実際に、1A9または2C3を用いた免疫沈降では両抗体が認識するAβオリゴマーの存在が老人斑から構成されるアミロイド画分で確認されており、本発明者らの仮説はインビボでの整合性が証明された(図1B参照)。
インビボ神経毒性の原因となるAβ重合体(可溶性1A9-または2C3-免疫反応性12-mer)が脳実質中に存在することから、本発明者らは同重合体がCSF中にも存在するであろうと推測した。この予測を検証するために、本発明者らはAD患者およびage-matched健常対照者各10例をプールしたCSFをSECによって分画し、それぞれの画分を、捕捉および検出系に同一のモノクローナルBCO5またはBA27を使用したAβオリゴマーに対して特異的なサンドイッチELISAに供した。BC05-BC05オリゴマーELISAでは画分13に可溶性Aβ1-42の存在が同定され、一方、BA27-BA27 ELISAでは画分7〜14に可溶性Aβ1-40の存在が検出された(非提示データ)。しかし、いずれのELISAで得られた吸光度値(O.D.450 nm)も低値に止まり、CSF中に存在する微量のAβオリゴマーを検出するには感度不足が否めなかった。また、同一画分のBNT77-ELISAによるAβモノマーの検討から、リポタンパク結合性Aβモノマー(画分7〜14)およびリポタンパク非結合性Aβモノマー(画分15〜17)は同じ画分中でAβオリゴマーと共存していることが確認された(図7-1Aおよび7-1B)[Matsubara E, et al; Neurobiol Aging, 25: 833-841, 2004]。ADにおけるリポタンパク結合性Aβモノマーの値は健常対照値と同程度であり、一方、リポタンパク非結合型Aβ40モノマー(図7-1A)およびAβ42モノマー(図7-1B)は、age-matched正常対照と比較してADの方が低値であった。これらのアッセイにおいて、本発明者らはまた、BCO5抗体またはBA27抗体を捕捉抗体として使用し、HRPで標識した同一抗体を捕捉抗体として構築したELISAでは、オリゴマーに加え、リポタンパク質上に別々に存在するAβモノマーを検出しうることを発見した。本明細書に記載された同様のアッセイ(例えば、6E10/6E10 ELISA)を使用した先行する報告では[Lee EB, et al, J Biol Chem, 281: 4292-4299, 2006]、この問題は見落とされていた。このようなリポタンパク結合性AβモノマーとオリゴマーはSECでは同程度の保持時間で溶出されるため、同一抗体を捕捉・検出に使用するオリゴマーELISAでは互いを識別することが不可能であり、Aβオリゴマー非選択的な抗体でAβオリゴマーを分析するには、リポタンパクを含有したCSFそれ自体は、検体として不適切であることが判明した。
1A9(n=13)と2C3(n=11)投与による受動免疫療法のインビボ予防治療効果を検証するために、本発明者らはTg2576マウスの4カ月齢から13カ月齢まで1A9、2C3(0.4 mg/kg/week)またはPBSを尾静脈投与した。13カ月齢での記憶機能を4種の学習・行動パラダイムについて判定した:(1)Y迷路試験における短期記憶(図8A);(2)新規物体認識試験における物体認識記憶(図8B);(3)水迷路試験における空間記憶(図8C);(4)文脈的恐怖学習試験における連合情緒記憶(図8D)。PBSを投与したTg2576マウスは、1A9または2C3を投与したTg2576マウスと比較して有意な学習・行動障害を発症していた(図8A〜D)。PBSを投与したTg2576マウス(n=10)とは異なり、1A9または2C3を投与したTg2576マウスの記憶機能は、以前同月齢の非投与野生型マウスのコホートから得られた結果と識別不能であることから、1A9または2C3を投与したTg2576マウスではPBS投与群で認められた本来低下すべき短期記憶および長期記憶の両方が保たれていると確認された。即ち、記憶障害発症以前からAβオリゴマーを標的とした受動免疫療法を施行すれば、記憶障害発症予防、すなわちAD発症予防が可能である傍証を得ることができた。また、本結果はAβオリゴマーが記憶障害発症分子であることを直接示す初めてのin vivoエビデンスの提示である。
4カ月齢から13カ月齢まで受動免疫治療を受けたTg2576マウス(1A9投与群n=13, 2C3投与群n=11)とPBS投与をうけたTg2576マウス(n=10)を、学習・行動実験の終了後解剖し、脳内(大脳皮質vs海馬)Aβ蓄積量をプロテアーゼインヒビター含有トリス緩衝液、可溶性(2% SDS)と不溶性アミロイド(2% SDS不溶70% 蟻酸可溶)の3画分(150 mg/各抽出液)に連続抽出して検証した。トリス緩衝液中には非蓄積性の生理的Aβ分子が、2% SDSで可溶化されるAβには、アミロイド線維形成前の瀰漫性老人斑や免疫細胞化学的に検出不能なAβや立体構造変化をきたした蓄積性の可溶性オリゴマーAβが含有されていると考えられている。Aβは、Aβ40断端, Aβ42断端それぞれに特異的なELISA(BNT77/BA27 specific for Aβ40, BNT77/BC05 specific for Aβ42, WAKOキット)で分別定量した。非蓄積性生理的Aβ分子が主体のトリス緩衝液中Aβ濃度は3群間で著変を認めなかった(図9A,C, Aβx-40; 図9B,D, Aβx-42)。可溶性脳内Aβ蓄積量(SDS画分)においては、1A9投与群においてのみ大脳皮質Aβx-40とAβx-42の有意な蓄積抑制効果が確認された(図9E, Aβx-40; 図9F, Aβx-42)。海馬では蓄積抑制効果を認めなかった(図9G, Aβx-40; 図9H, Aβx-42)。一方、不溶性脳内Aβ蓄積量(FA画分)では、1A9投与群においてのみ大脳皮質Aβx-40の有意な蓄積抑制効果が確認された(図9I, Aβx-40; 図9J, Aβx-42)。海馬では蓄積抑制効果を認めなかった(図9K, Aβx-40; 図9L, Aβx-42)。可溶性SDS画分のA11イムノブロット解析では、大脳皮質においてA11陽性オリゴマー(4-mer)の蓄積抑制効果が両抗体治療群で確認された(図9M)。
4カ月齢から13カ月齢まで受動免疫治療を受けたTg2576マウス(1A9投与群n=13, 2C3投与群n=11)とPBS投与をうけたTg2576マウス(n=10)の3群間で血漿中Aβ濃度に有意差を認めなかった(図10A, Aβx-40; 図10B, Aβx-42)。Aβ40/42 ratioにも有意差は認めなかった(図10C)。
受動免疫治療群では免疫組織化学的なAβ沈着が抑制された(図11A)。チオフラビン-S染色陽性老人斑アミロイド数も大脳皮質・海馬の両者で優位にその形成が抑制され(図11B、上段)、その減少は組織学的にも明らかであった(図11B,下段)。シナプトフィジン陽性腫大変性神経突起形成も受動免疫療法群で優位に抑制された(図11C)。
1A9および2C3は、大脳新皮質における前および後シナプス変性を抑制した(図12)。
共焦点レーザー顕微鏡でAβ沈着と脳内マウスIgGの存在と局在を検討した結果、瀰漫性老人斑存在部位に、Aβ沈着とはほぼ独立した形でマウスIgGの存在を確認した。このマウスIgGは受動免疫治療群[1A9(図13A);2C3(図13B)]のみで観察され、PBS投与群(図13C)では認められなかったことから、血液中に投与した抗体の一部が脳内移行したと考えられた。この結果は、脳内移行した抗体が直接的に可溶性Aβ重合体の毒性を中和すること、さらに抗体と可溶性Aβ重合体の複合体の形で血液中にクリアランスされることで記憶障害予防効果が発揮されており、治療効果は複合的作用機序に基づいていると考えられた。
上述のAβ1-40オリゴマーを抗原として用いる方法で作成した33クローンのうち、ドットブロット解析にて確認をしたところAβオリゴマーを特異的に認識するモノクローナル抗体として6種が確認された。この6種の抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4および6H4)の抗体アイソタイプ判定を行ったところ、アイソタイプは、4F7(L鎖はκ、H鎖はIgG2a)、4H5(L鎖はκ、H鎖はIgG2a)、5A5(L鎖はκ、H鎖はIgG2b)、5A9(L鎖はκ、H鎖はIgG2b)、6E4(L鎖はκ、H鎖はIgG1)、6H4(L鎖はκ、H鎖はIgG2b)であった。またイムノドットブロット解析の結果、4F7、4H5、5A5、5A9、6E4および6H4抗体は、上記2C3と同様にAβモノマーを認識せずAβオリゴマー特異的に結合する抗体であった(図14参照)。
6種類の抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9, 6E4, 6H4)のAβオリゴマー選択的結合能を調べるために、各抗体と段階希釈したAβオリゴマーあるいはAβモノマー(inhibitor)を事前に混合した溶液をAβオリゴマー固層化済み96-well-immuno-plateに加えて反応させた(方法の項を参照)。また、AβオリゴマーおよびAβモノマーと区別なく結合するコントロール抗体として市販の4G8と6E10抗体を用いた。抗体がAβオリゴマーと選択的に結合する場合、Aβモノマーと事前に混合した抗体は溶液中のAβモノマーには吸収されないため固層化Aβオリゴマーと結合できる。逆にAβオリゴマーと事前に混合した抗体は溶液中のAβオリゴマーに吸収されるため濃度が高くなるにしたがって固層化Aβオリゴマーへの結合量が低下する。結果、6種類の抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9, 6E4, 6H4)ではAβオリゴマーで濃度依存的な抗体結合量の低下が検出されたのに対し、AβモノマーではAβオリゴマーほどの大きな結合力の低下は検出されなかった(図15参照)。一方、4G8および6E10ではAβモノマーとAβオリゴマーで同様の濃度依存的な抗体結合量の低下が検出された(図15参照)。これらの結果は、6種類の抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9, 6E4, 6H4)はAβオリゴマーに選択的に結合する抗体であることを示唆している。
6種類の抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9, 6E4, 6H4)にAβ誘発性神経毒性を中和する活性があるかどうかを評価するために、ヒト神経芽種細胞(SH-SY5Y)を抗体添加または無添加のAβ1-42(12.5μM)を含む培地中で24時間培養し、Aβ1-42が惹起する細胞毒性の変化を測定した。結果、Control IgG(3F1)で抗体の添加によって細胞毒性の増加が観察された。4F7と4H5でも抗体添加により細胞毒性の増加が観察されたが、その割合は3F1よりは低く抑えられていた(図16参照)。残りの4種類の抗体(5A5, 5A9, 6E4, 6H4)では顕著な細胞毒性の低下が観察された(図16参照)。以上より、4種類の抗体(5A5, 5A9, 6E4, 6H4)にAβ誘発性神経毒性を中和する強い活性があった。一方、4F7と4H5に関しては、コントロールIgGと比較すると細胞毒性が緩和されていたことから、Aβ誘発性神経毒性を中和する活性があると推測される。
6種類の抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9, 6E4, 6H4)がAβアミロイド線維形成の抑制活性を持つか否かを調べるため、Aβ誘発性神経毒性実験と同様の溶液組成中(培地中)のAβアミロイド線維形成をThT蛍光強度測定法にて測定した(方法の項参照)。6E4と6H4では抗体濃度依存的な線維形成抑制が観察された(図17参照)。他の4抗体(4F7, 4H5, 5A5, 5A9)でもコントロールIgGと比較し線維抑制傾向は観察されたことから、線維形成抑制する活性があると推測される。
本発明者らのデータは、モノクローナル1A9または2C3が、毒性活性または抗原線維形成活性の原因となる可溶性Aβ重合体の「神経毒性エピトープ」と「重合性エピトープ」を特異的に認識する抗体であることを報告するものである。モノクローナル1A9または2C3は生理的分子である可溶性Aβモノマーとは反応しないため、1A9や2C3に認識されるエピトープをもつ立体構造体は可溶性オリゴマー性重合体に特徴的であると断定できる。限外濾過および分子篩実験により、1A9または2C3免疫反応性オリゴマーのサイズは100 kDaを上回る(>20-mer)ことが明らかになった。AFMによる形態観察結果から、毒性重合体はheterogeneousな形態(粒状、数珠状、輪状)をとることも確認された。
Claims (9)
- Aβオリゴマーと結合する、以下の(1)または(2)に記載の抗体。
(1)CDR1として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:73に記載のアミノ酸配列を有するH鎖およびCDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:77に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体
(2)VHとして配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖および/またはVLとして配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体 - 抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
- 被験者から採取された試料に含まれるAβオリゴマーを、請求項1〜2のいずれかに記載の抗体を用いて検出する工程を含む、Aβオリゴマーを測定する方法。
- 請求項1〜2のいずれかに記載の抗体を用いて、被験者から採取された試料におけるAβオリゴマーを検出することを特徴とする、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かの診断に役立つデータを提供する方法。
- 以下の工程を含む、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かの診断に役立つデータを提供する方法であって、工程(b)に記載の量が健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると示される方法。
(a)被験者から採取した試料、および請求項1〜2のいずれかに記載の抗体とを接触させる工程
(b)前記試料中におけるAβオリゴマーの量を測定する工程 - 以下の工程を含む、被験者がアルツハイマー病候補であるか否かの診断に役立つデータを提供する方法であって、工程(b)に記載の比が健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると示される方法。
(a)被験者から採取した試料、請求項1〜2のいずれかに記載の抗体、およびAβモノマーに結合する抗体とを接触させる工程
(b)前記試料中におけるAβモノマーに対するAβオリゴマーの比を測定する工程 - 試料が血液もしくは脳脊髄液である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 請求項3〜6のいずれかに記載の方法に用いるための、請求項1〜2のいずれかに記載の抗体を含む薬剤。
- 請求項3〜6のいずれかに記載の方法に用いるための、請求項1〜2のいずれかに記載の抗体を含むキット。
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