CN102124105A

CN102124105A - 能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用

Info

Publication number: CN102124105A
Application number: CN2009801112374A
Authority: CN
Inventors: 松原悦朗; 柴田昌夫; 横关达己
Original assignee: National Center for Geriatrics and Gerontology; Immunas Pharma Inc
Current assignee: National Center for Geriatrics and Gerontology; Immunas Pharma Inc
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2011-07-13
Also published as: SG188116A1; ES2617604T3; CA2714413A1; KR101616136B1; US20130149316A1; JP5113853B2; EP2246427A4; US8378081B2; US20100028357A1; US9090680B2; KR20100113623A; JP5765857B2; PT2246427T; HUE031944T2; EP2246427A1; JPWO2009099176A1; DK2246427T3; WO2009099176A1; EP2246427B1; AU2009211635B2

Abstract

本发明人成功地生产了仅特异识别作为生理性分子的可溶性Aβ寡聚体而不识别可溶性Aβ单体的单克隆抗体。发现该抗体可以用作针对阿尔茨海默氏病诊断/治疗的单克隆抗体。

Description

能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及可特异性地结合Aβ寡聚体的抗体及其应用。

背景技术

多种证据已显示，记忆的衰退起因于由可溶性Aβ寡聚体触发的突触功能障碍(参见非专利文献1和2)。Aβ寡聚体的过量积聚和沉着可触发一系列病理学级联反应，导致阿尔茨海默氏病(AD)。因此，靶向Aβ寡聚体的治疗介入对阻断这些级联反应可能是有效的。然而，对于该导致神经退行性变淀粉状蛋白级联的假说中，由核心分子特别是由Aβ寡聚体介导的神经变性的实验证据来自体外实验(参见非专利文献3)。该神经变性未在体内得到直接证实。之前报道的体内实验最大的缺陷在于它们无法证明内源Aβ寡聚体的突触毒性，这是由于缺乏对构象具有特异性的分子工具(参见非专利文献4)。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中亦难以解决的问题，还没有办法在人类脑内解决。因而，内源Aβ的体内神经毒性往往受到忽视。为何在人类内嗅皮质中的NFT形成和神经细胞丧失发生于老年斑形成之前，以及Aβ如何涉及该机制，人们都尚不知晓。

涉及现行发明的现有技术文献信息如下所示：

[非专利文献1]Klein WL，Trends Neurosci.24：219-224，2001

[非专利文献2]Selkoe DJ，Science 298：789-791，2002

[非专利文献3]Hass C et al.：Nature Review 8：101-12，2007

[非专利文献4]Lee EB，et al.：J.Biol.Chem.281：4292-4299，2006

本发明的公开

[本发明需解决的问题]

本发明是鉴于上述情况完成的。本发明的一个目的为提供可特异性地结合Aβ寡聚体的抗体及其应用。更加具体而言，本发明提供了可特异性地结合Aβ寡聚体的抗体，以及使用该抗体检测Aβ寡聚体的方法，使用该抗体诊断阿尔茨海默氏病的方法，以及包含该抗体的药剂。

[解决该问题的手段]

本发明人产生了这样的单克隆抗体，它们仅对可溶性淀粉样蛋白β(Aβ)寡聚体具有特异性，而不识别属于生理性分子的可溶性Aβ单体，此外，本发明人确证了所述抗体具有：

(1)抗神经毒性活性；

(2)阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性；

(3)仅识别Aβ寡聚体的特异性；

(4)在AD脑中捕获Aβ寡聚体的能力；以及

(5)预防类阿尔茨海默氏病表型(记忆障碍，脑部Aβ积聚)在APPswe转基因小鼠(Tg2576)中发展的能力。

使用超滤/分子筛方法，在产生的抗体中，确定了单克隆抗体1A9和2C3特异性的识别30kDa或更大，主要为100kDa或更大的寡聚体，但不识别大约4.5kDa左右的单体。通过测量两种抗体在已分化为神经细胞的PC12细胞中针对Aβ1-42-诱导的神经毒性的中和作用，确证了它们具有神经毒性中和活性。硫代黄素T测定和电子显微镜观察显示所述抗体具有阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。通过使用1A9和2C3在具有SDS稳定性的4-，5-，8-以及12-聚体的存在下进行免疫沉淀反应，确证了这些抗体在AD脑中捕获Aβ寡聚体的能力。进一步，为确定在人脑中的体内神经毒性，对在主要为Braak NFT I到III期的人类内嗅皮质中所述抗体识别的多聚体的量进行了测量。对据报道在动物研究中具有神经毒性的12-聚体加以特别关注，结果确证了该多聚物的积聚发生于认知障碍出现之前，并随着Braak NFT期的进展而增加。该结果首次显示，被所述抗体所特异性识别的所述1 2-聚体是一种构象聚合体(conformational assembly)，在人脑中导致体内神经毒性。本发明人亦发现由所述抗体识别的寡聚构象结构存在于脑脊液(CSF)中，并在AD患者中增加。本发明人将1A9或2C3和其它神经病症同样地通过静脉内注射作为被动免疫治疗使用。经确证通过亚慢性被动免疫治疗保护了Tg2576小鼠免于罹患记忆缺陷、老年斑形成、突触障碍和Aβ积聚，且无有害副作用。本发明人获得的该结果首次说明，单克隆1A9和2C3很有希望被选择作为在Tg2576小鼠中预防类阿尔茨海默氏病表型的治疗抗体，其可望通过常规外周静脉内给药显示其效应，从而无需考虑脑内转移(brain transfer)的问题。

本发明人亦确证使用所述1A9和2C3抗体的被动免疫疗法可阻抑老年斑淀粉状蛋白形成以及肿大变性的神经突形成。进一步，本发明人发现投入血液的1A9和2C3中有一部分转移入脑部。

如上所述，本发明人在本文中公开了单克隆1A9和2C3——它们是特异性结合Aβ寡聚体的抗体——符合了所有诊断性/治疗性抗体的标准，并且是供诊断/预防阿尔茨海默氏病的治疗抗体的有望候选。

进一步，与所述1A9和2C3抗体相似，本发明人成功获取了5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4抗体，这些抗体特异性地结合Aβ寡聚体，但不识别Aβ单体。本发明人发现这六种类型的抗体具有中和Aβ诱导的神经毒性，以及阻抑Aβ淀粉样蛋白微纤维形成的活性。

本发明人公开了上述5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4抗体是供诊断/预防阿尔茨海默氏病的治疗抗体的有望候选。

更加具体而言，本发明提供了下述：

[1]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的L链的抗体；

[2]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的L链的抗体；

[3]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的L链的抗体；

[4]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的L链的抗体；

[5]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的L链的抗体；

[6]一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的L链的抗体；

[7]下述(1)到(38)中任一项的抗体：

(1)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：11的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：13的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(2)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：17的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：19的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(3)一种抗体，其包含(1)的H链和(2)的L链；

(4)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列作为VH的H链；

(5)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列作为VL的L链；

(6)一种抗体，其包含(4)的H链和(5)的L链；

(7)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：31的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：33的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(8)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：37的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：39的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(9)一种抗体，其包含(7)的H链和(8)的L链；

(10)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列作为VH的H链；

(11)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列作为VL的L链；

(12)一种抗体，其包含(10)的H链和(11)的L链；

(13)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：51的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：53的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：57的氨基酸序列作为CDR2，和SEQ ID NO：59的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(15)一种抗体，其包含(13)的H链和(14)的L链；

(16)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列作为VH的H链；

(17)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列作为VL的L链；

(18)一种抗体，其包含(16)的H链和(17)的L链；

(19)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：71的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：73的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(20)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：77的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：79的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(21)一种抗体，其包含(19)的H链和(20)的L链；

(22)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列作为VH的H链；

(23)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列作为VL的L链；

(24)一种抗体，其包含(22)的H链和(23)的L链；

(25)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：91的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：93的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(26)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：97的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：99的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(27)一种抗体，其包含(25)的H链和(26)的L链；

(28)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列作为VH的H链；

(29)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：87的氨基酸序列作为VL的L链；

(30)一种抗体，其包含(28)的H链和(29)的L链；

(31)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：111的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQID NO：113的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(32)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：117的氨基酸序列作为CDR2，和SEQ ID NO：119的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(33)一种抗体，其包含(31)的H链和(32)的L链；

(34)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：105的氨基酸序列作为VH的H链；

(35)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列作为VL的L链；

(36)一种抗体，其包含(34)的H链和(35)的L链；

(37)一种抗体，其是在(1)到(36)中任一项的抗体中替换，缺失，添加和/或插入一个或多个氨基酸而得到的，并具有与所述(1)到(18)中任一项的抗体等价的活性；以及

(38)一种抗体，其可结合(1)到(36)中任一项的抗体所结合的表位；

[8][7]所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体；

[9]一种组合物，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体和药用载体；

[10]一种抗认知障碍剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[11]一种阿尔茨海默氏病治疗剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[12]一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的药剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[13]一种阻抑老年斑形成的药剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[14]一种阻抑Aβ积聚的药剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[15]一种抗神经毒性剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[16]一种抑制Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的药剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[17]一种抗突触毒性剂，其包含[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分；

[18]一种检测Aβ寡聚体的方法，其包括使用[1]到[8]中任一项所述的抗体检测自受试者收集的试样中所含的Aβ寡聚体的步骤。

[19]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括使用[1]到[8]中任一项所述的抗体在收集自受试者的试样中检测Aβ寡聚体；

[20]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：

(a)使收集自受试者的试样与[1]到[8]中任一项所述的抗体接触；以及

(b)测定所述试样中Aβ寡聚体的量，

其中当步骤(b)中测得的量高于健康个体的量时，确定所述受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者；

[21]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：

(a)使收集自受试者的试样与[1]到[8]中任一项所述的抗体以及可结合Aβ单体的抗体接触；以及

(b)测定所述试样中Aβ寡聚体对Aβ单体的比例，

其中当步骤(b)中测得的比例高于健康个体的比例时，确定所述受试者可能为阿尔茨海默氏病患者；

[22][18]到[21]中任一项所述的方法，其中所述试样为血液或脑脊液；

[23]一种用于[18]到[21]中任一项所述的方法的药剂；以及

[24]一种用于[18]到[21]中任一项所述的方法的试剂盒。

进一步，本发明提供了下述：

[25]一种预防和/或治疗认知障碍的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[26]一种预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[27]一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[28]一种阻抑老年斑形成的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[29]一种阻抑Aβ积聚的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[30]一种中和神经毒性的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[31]一种抑制Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[32]一种中和突触毒性的方法，其包括将[1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物作为活性成分施用的步骤；

[33][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备抗认知障碍剂中的应用；

[34][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备阿尔茨海默氏病的治疗剂中的应用；

[35][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于阻抑阿尔茨海默氏病的进展的药剂中的应用；

[36][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于阻抑老年斑形成的药剂中的应用；

[37][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于阻抑Aβ积聚的药剂中的应用；

[38][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于中和(阻抑)神经毒性的药剂中的应用；

[39][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于抑制Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的药剂中的应用；

[40][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物在制备用于中和(阻抑)突触毒性的药剂中的应用；

[41][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于预防和/或治疗认知障碍；

[42][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病；

[43][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于阻抑阿尔茨海默氏病的进展；

[44][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于阻抑老年斑形成；

[45][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于阻抑Aβ积聚；

[46][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于中和(阻抑)神经毒性；

[47][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于抑制Aβ淀粉样蛋白原纤维形成；

[48][1]到[8]中任一项所述的抗体或[9]的组合物，用于中和(阻抑)神经毒性。

本发明的效果

由本发明提供的抗体预期将对以引起阿尔茨海默氏病病理状态的责任分子为对象的选择性预防/治疗方法的建立，以及阿尔茨海默氏病早期诊断标志的建立产生很大的贡献。本发明的发明人获得的证据显示，即使在靶向脑内病理状态的抗体疗法中，外周的静脉内施药已经足够，无需考虑脑内转移。从而，本发明预期将大大加快针对阿尔茨海默氏病的抗体药物的进展。

附图简述

图1的照片和图片显示对寡聚体特异性的抗体的生成和特征确定的结果。A：免疫原的电泳。使用SDS-PAGE分离无Aβ1-42单体(空心箭头)污染的Aβ1-42四聚体(黑色箭头)。泳道1：溶解于10mM磷酸缓冲液中的Aβ1-42；泳道2：溶解于去离子蒸馏水中的Aβ1-42。B：Aβ淀粉样蛋白，其不溶于缓冲液，但可使用甲酸自阿尔茨海默氏病患者的脑中提取出来，使用阳性杂交瘤细胞培养物的上清液对其进行免疫沉淀，并使用蛋白-G琼脂糖(Amersham)选择性地分离免疫复合物。测试了九个克隆；泳道2(星号)为1A9，泳道6(双星号)为2C3。C：一个条件化培养基的SEC的洗脱曲线(profile)。在所述24个经SEC收集的级分中，对级分8，13和16进行1A9免疫沉淀。使用4G8检测Aβ免疫反应性。黑色箭头指示三聚体，而空心箭头指示二聚体。星号(*)指示抗小鼠IgG轻链。

图2的照片和图片显示1A9和2C3的抗毒性活性。A到F：经NGF处理的PC12(PC12N)细胞的代表性图像，这些细胞在37℃下在所述抗体存在或不存在的情况下暴露于无种子(seed-free)的Aβ1-42 48小时(每个小图的左半部分)。钙黄绿素AM/PI染色的代表图，其中活细胞染为绿色而死细胞染为红色(每个小图的右半部分)。G：和下列抗体一起暴露于无种子的Aβ1-42(25μM)的细胞的存活率：非特异性IgG2b(实心方块)；4G8(空心三角)；1A9(空心方块)；以及2C3(实心圆)。

图3的照片和图片显示由1A9和2C3所靶向的毒性Aβ聚集体的大小和形态特征。A：对Aβ1-42(25μM)的540000xg上清液使用超滤膜进行连续的分子筛过程，超滤膜的分子量截留值为3、10、30和100 kDa(Microcon)。由此被分级的四种类型的滤液如下命名：级分1(＜3kDa)，级分2(3到10kDa)，级分3(10到30kDa)，级分4(30到100kDa)；以及最后保留的级分5(＞100kDa)。在上述每个级分中Aβ1-42的存在均用4G8免疫印迹法加以检测。B：用所述五个级分在37℃下处理48小时的经NGF处理的PC12(PC12N)细胞的代表性图像。每个级分的毒性如上面图2所述的方法衡量。C：经Aβ1-42的540000xg上清液以及五个级分(级分1到5)处理的细胞的活力。两次独立实验得到相似的结果。其值以相对对照的百分比(平均值±SD)表示。D：所述五个级分(级分1到5)的点印迹分析。使印迹与A11、1A9，2C3和4G8反应。E：5个级分的AFM图。在具有最强毒性的级分5(Fr.5)中，除了粒状分子外，还发现了环形与珠形结构。

图4的照片与图片显示1A9与2C3阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。A：通过ThT分析法在37℃下监视Aβ1-42在多种浓度下(10μM(空心方块)，25μM(实心菱形)与50μM(空心圆))的淀粉样蛋白原纤维形成直至72小时。B：对于2C3(空心圆)，观察到了针对Aβ1-42淀粉样蛋白原纤维形成的共存抗体剂量依赖性抑制(coexsisting antibody dose-dependent inhibition)。与之相对，1A9(空心方块)，4G8(实心三角)与非特异性IgG(实心方块)抗体并不抑制无种子的Aβ1-42的原纤维形成性组装(ThT阴性540000xg上清)。C：对于2C3(空心圆)，观察到了针对Aβ1-42原纤维形成性组装的共存抗体剂量依赖性抑制，且1A9(空心方块)于3μM亦见到近乎完全的抑制。D：预培育24小时以供Aβ1-42淀粉样蛋白原纤维形成，此后添加的所有测试抗体均无法使Aβ1-42淀粉样蛋白纤维溶解或解聚。E到G：Aβ1-42在不存在2C3与1A9(小图E)、或存在2C3(小图F)、或存在1A9(小图G)情况下的EM图像。

图5的照片与图片为关于与毒性相关的Aβ1-42寡聚体。A：点印迹分析法(小图A的上半部分)：Aβ1-42单体(25μM)在37℃下培育特定时间(0到72小时)，并固化于硝酸纤维素膜上，并对其用A11，1A9，2C3或4G8进行点印迹分析。对每个抗体测试了免疫反应性阳性结构的出现。免疫反应性强度分析(小图A的下边部分)：点印迹分析的结果使用Multi Gauge v 3.0软件(Fuji Film，Tokyo)进行半定量的分析。为将所述寡聚体形成与淀粉样蛋白原纤维形成相关联，在同一个时间轴上叠加了ThT荧光值(右边的Y轴)。B：在37℃下培育0，2，4与24小时后的Aβ1-42聚合体，以及所述Aβ1-42聚合体在进一步培育48小时后的变化。所述Aβ1-42聚合体是通过4G8免疫印迹法检测的。C：上述多种Aβ1-42聚合体的毒性活性。神经细胞的活力通过图2中所述LIVE/DEAD分析法确定。D：使用多种Aβ1-42聚合体(在37℃下0与2小时形成的Aβ1-42聚合体(“0h”与“2h”)；以及在540000xg下超速离心两小时后收集的ThT阳性上清(“2h sup”))，测量1A9与2C3的抗神经毒性活性。在所述抗体存在或不存在情况下暴露于多种Aβ1-42聚合体的PC12N细胞的代表性的图像示于小图D的左半部分(a：“0h”；b：“2h”；c：“2h sup”；d：“2h sup”+IgG2b；e：“2h sup”+1A9；f：“2h sup”+2C3)。在所述抗体存在或不存在情况下暴露于多种Aβ1-42聚合体的细胞的活力以相对于对照的百分比(平均值±SD)表示，并示于小图D的右半部分。较之“0h”Aβ1-42聚合体，“2h”Aβ1-42聚合体降低了神经毒性。“2h sup”使神经毒性恢复到类似于“0h”Aβ1-42聚合体的程度。非特异性的IgG2b无法阻断“2h sup”Aβ1-42聚合体的神经毒性诱导作用。单克隆1A9完全抑制了“2h sup”诱导的神经毒性，而2C3抑制该毒性的能力略为低下。在使用所述两种单克隆抗体(mAb)的实验中，在mAb∶Aβ比例为1∶＜25到50时观察到了所述mAb的抗毒性活性。这表明结构上不同的由1A9或2C3识别的寡聚性聚合体以相对低的浓度存在。

图6的照片和图显示可溶性的由1A9或2C3识别的寡聚体存在于人类脑中。针对Aβ寡聚体的抗体只有在用蛋白酶K预处理后方可在AD脑中检出老年斑与血管淀粉样蛋白。A：1A9染色；B：2C3染色；以及C：A11染色。D：用4G8对经1A9或2C3免疫沉淀的Aβ在可溶于缓冲液的AD脑中(泳道1，2，4与5)与健康对照脑中(泳道3与6)进行免疫印迹分析。1A9与2C3的代表性结果分别示于所述小图的左边与右边部分。E与F：在自健康老年人群的50个尸体剖检病例中获取的人内嗅皮质中，可溶性1A9免疫反应性12-聚体(小图E)与可溶性2C3-免疫反应性12-聚体(小图F)的半定量分析(肌动蛋白对照)(Braak NFT I期或II期：n＝35；Braak NFT III期或IV期：n＝13；以及Braak NFT＞IV期，AD病例：n＝2)。

图7-1的图片显示可溶性的由1A9或2C3识别的寡聚体存在于人类CSF中。用汇集的全脑脊液(CSF)(AD＝10，NC＝10)(小图A与B)与汇集的无脂蛋白(lipoprotein-depleted)CSF(AD＝10，NC＝10)(小图C与D)进行尺寸排阻色谱(SEC)。在小图A与B中，通过对收集的级分进行BNT77-BA27与BNT77-BC05 ELISA分析，考察了Aβ40与Aβ42单体的分布。小图C与D显示被1A9/2C3混合抗体捕获的Aβ40与Aβ42单体的存在。

图7-2为图7-1的继续。在12个AD病例(空心圆)与13个NC病例(实心圆)中测定了由1A9识别的寡聚性聚合体的量(1A9-BC05与1A9BA27ELISA)或由2C3识别的聚合体的量(2C3-BC05与2C3-BA27 ELISA)(小图E与G)。寡聚体/单体比例分别示于小图F(1A9)与H(2C3)。

图8的图片显示可通过被动免疫接种治疗来预防Tg2576小鼠记忆障碍的发病。将13月龄的Tg2576小鼠分为下列三组以实施学习/行为测试：PBS施用组：n＝10；1A9施用组：n＝13；以及2C3施用组：n＝11。所有这些测得的值均示为平均值±SE。(A)Y-迷宫测试。在每个组中测定8分钟期间的Y-迷宫任务中自发改变行为(spontaneous alteration behavior)。单向ANOVA的结果如下所述：F(1，52)＝3.09，p＜0.05；*与施用PBS的Tg2576小鼠相比较p＜0.05。(B)新物体识别测试。记忆期(retention session)在训练24小时后进行。在10分钟期间的新物体识别测试中测定每组的探查偏好(exploratory preference)。双向ANOVA的结果如下所述：训练/记忆，F(1，64)＝31.53，p＜0.01；动物组，F(2，64)～7.49，p＜0.01；所述动物组进行的反复训练/记忆，F(2，64)＝10.12，p＜0.01；**与对应的非训练小鼠相比较p＜0.01。##与施用PBS的Tg2576小鼠相比较p＜0.01。(C)在60秒期间的水迷宫测试中对每个组测量游泳路程长度。双向ANOVA的结果如下所述：试验，F(9，320)＝20.46，p＜0.01；动物组，F(2，320)＝12.59，p＜0.01；所述动物组进行的反复试验，F(18，320)＝1.78，p＜0.05；p＜0.05，**与施用PBS的Tg2576小鼠相比较p＜0.01。有条件的恐惧学习测试(fear-conditioned learning test)：确定了背景依赖性(context dependent)(D)与线索依赖性(clue dependent)僵直时间(freezing time)。双向ANOVA结果如下所述：背景依赖性测试，F(2，32)＝5.94，p＜0.01；线索依赖性测试，F(2，32)＝7.33，p＜0.01；*与施用PBS的Tg2576小鼠相比较p＜0.05；**与施用PBS的Tg2576小鼠相比较p＜0.01。

图9的图片与照片显示在Tg2576中被动免疫疗法可预防脑内Aβ积聚。对于三组13月龄的Tg2576小鼠(PBS施用组：n＝10；1A9施用组：n＝13；以及2C3施用组：n＝11)，以三个连续的步骤提取海马与大脑皮层，制备可溶于缓冲液的级分、可溶于SDS的级分、和可用甲酸(FA)抽提的级分。对每个部分进行Aβ特异性ELISA测定(WAKO试剂盒：对Aβx-40，BNT77-BA27；对Aβx-42，BNT77-BC05)。发现Aβ40(SDS与FA)与Aβ42(SDS)的积聚仅在经1A9处理的组中被显著阻抑。在来自两个抗体处理组的SDS可溶性大脑皮层级分中确证了对A11-阳性寡聚体(4-聚体)的积聚阻抑作用。

图10的照片与图片显示在Tg2576的血浆与脑中的Aβ寡聚体。A与B：作为ELISA分析的结果，未观察到血浆中Aβx-40与Aβx-42的量在PBS施用组与免疫治疗组之间有显著差异。C：类似地，在测试的三个组中未观察到Aβ40/Aβ42比例的差异。D：作为使用汇集的脑组织匀浆进行点印迹分析的结果，未观察到可溶于生理盐水的A11阳性寡聚体量在三个测试组间有差异。海马(左边小图)与大脑皮层(右边小图)。PBS施用组：n＝10；1A9施用组：n＝13；以及2C3施用组：n＝11。E：根据使用抗寡聚体抗体A11的免疫印迹分析，在SDS抽提的大脑皮层级分(右边小图)中Aβ四聚体的免疫反应性在施用1A9与2C3的组中较之施用PBS的组降低。而另一方面，在海马(左边小图)中未观察到此现象。F：汇集来自各个组的血液(除去白蛋白的血浆，小图F的上边部分；除去白蛋白/脂蛋白的血浆，小图F的下边部分)，并对其进行A11点印迹分析。其结果，发现A11免疫反应性在施用1A9与2C3的组中较之PBS施用组增加(小图F)。2C3识别的寡聚体的以脂蛋白结合形式存在的比例较之1A9识别的寡聚体为高(小图F的下边部分)。进一步，A11免疫印迹法亦在大约200kDa处显示阳性信号，其免疫反应性在 1A9与2C3施用组中较之PBS施用组明显增加(小图G)。由这些结果可以想到，在所述施用抗体的组中获得了仅靶向Aβ寡聚体分子的选择性的治疗功效，而没有影响到生理分子。

图11的照片与图片显示在Tg2576小鼠脑中通过被动免疫接种治疗阻抑了老年斑淀粉样蛋白形成(A：Aβ特异性抗体染色；以及B：硫代黄素-S阳性分析)与肿大变性神经突形成(C：突触泡蛋白阳性分析)。

图12的照片显示用1A9与2C3进行被动免疫接种治疗阻抑了突触变性。在突触前和突触后的点状外周细胞(dot-like peripheral cell)中对突触泡蛋白(左边小图)与脑发育调节蛋白(drebrin)(右边小图)的免疫染色。上图：施用PBS；中图：施用1A9；以及下图：施用2C3。

图13的照片显示所述抗体通过被动免疫接种治疗发生脑内转移。显示了抗体施用后在Tg2576小鼠脑中的分布。用抗Aβ抗体(左边小图)与IgG(中间小图)染色。施用1A9(A)，施用2C3(B)，以及施用PBS(C)。

图14的照片通过点印迹分析显示，单克隆抗体5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4特异于Aβ寡聚体(3到96小时)，但无法识别Aβ单体(0小时)。

图15的图显示六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)选择性结合Aβ寡聚体的能力。垂直轴指示在450nm波长处的吸光度，而水平轴指示作为抑制剂使用的Aβ寡聚体或Aβ单体的浓度。在每个图中，虚线指示当使用Aβ寡聚体作为所述抑制剂时的抗体结合活性，而实线指示当使用Aβ单体作为所述抑制剂时的抗体结合活性。

图16的图显示六类抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)针对Aβ诱导的神经毒性的中和活性。水平轴指示添加的抗体的量，而垂直轴显示以不含抗体的条件作为基准的相对细胞毒性(参见该图中的等式)。使用不结合Aβ42的对照抗体IgG(3F1)进行比较。

图17的图显示六类抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)针对Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的阻抑活性。将该抗体以三种不同浓度添加于Aβ1-42溶液(12.5μM)中。在37℃下培育24小时后，通过ThT荧光强度方法测量Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的水平。水平轴指示添加的抗体的量，而垂直轴显示的是将添加所述抗体时的淀粉样蛋白原纤维形成水平以未添加抗体时的淀粉样蛋白原纤维形成量作为基准相对化而得到的值。

发明的实施方式

本发明将在下面更加详细的加以说明。

如上所述，本发明发明人成功的获取下述抗体，其可特异性结合Aβ寡聚体而非Aβ单体。亦即，本发明提供了可结合Aβ寡聚体而非Aβ单体的抗体。所述抗体优选为分离的或纯化的。

术语“分离的”与“纯化的”的用于本发明的物质(抗体与其它)时，指明该物质实质上不包含至少一种其天然来源可能包含的物质。因此“分离的抗体”与“纯化的抗体”指下述抗体，即其实质上不包含该抗体(蛋白质)所来源的细胞或组织来源的细胞材料，例如烃类，脂肪或其它污染蛋白质。当所述抗体为化学合成时，该术语指下述抗体，即其实质上不含有化学前体物质或其它化学物质。在优选实施方案中本发明的抗体为分离的或纯化的。

“抗体”指具有相同结构特征的糖蛋白。抗体对特定抗原显示结合特异性。在本文中“抗原”指下述蛋白，其具有可结合相应抗体的能力，并可在体内诱导抗原-抗体反应。

Aβ蛋白，其为淀粉样蛋白的主要构成成分，为由40到42个氨基酸组成的肽，且已知其由称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的前体蛋白通过蛋白酶的作用产生。除了被收集于超速离心沉降级分中的淀粉样蛋白原纤维外，自APP产生的淀粉样蛋白分子还包括寡聚的非纤维性的聚合体(assembly)，以及可溶性单体。本发明中的“Aβ寡聚体”指非纤维性的聚合体。本发明的“Aβ寡聚体”包括，例如，Aβ40(Aβ1-40)寡聚体与Aβ42(Aβ1-42)寡聚体。举例而言，本发明的“Aβ42寡聚体”为在SDS-PAGE中显示分子量45到160kDa，并在Blue Native PAGE中显示分子量22.5到1035kDa的分子。使用分子筛时，所述分子主要被收集于＞100kDa的保留溶液。当在原子力显微镜下观察时，所述分子显示混合的形态，包括颗粒状、珠形与环形的分子，其高度为1.5到3.1nm。在凝胶过滤方法中，所述分子洗脱于分子量为680kDa或更高的空体积级分8中，和分子量为17到44kDa的级分15中。

对在本发明中所用的抗体的来源与形式并无限制，只要其可结合Aβ寡聚体而非Aβ单体。

本发明的“抗体”包括单克隆抗体与多克隆抗体两者。本发明的抗体亦包括任何类型的抗体，例如非人动物抗体，人源化抗体，嵌合抗体，人类抗体，近来描述的迷你抗体(minibody)，氨基酸序列被修饰的抗体，缀合有其它分子(例如，如聚乙二醇等多聚物)的修饰抗体，以及糖链被修饰的抗体。

在本文中所用的术语“单克隆抗体”指下述抗体，它们是从实质上同质的抗体群体中获取的。亦即，构成该群体的各个抗体彼此相同，除了可能以痕量存在的天然突变体之外。单克隆抗体具有非常高的特异性，且识别单一的抗原位点。每个单克隆抗体识别所述抗原的单一决定簇，这与常规的(多克隆)抗体制备物不同，后者通常含有针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体。

除上面提及的特异性外，单克隆抗体亦具有下述优势，即它们可由未经其它免疫球蛋白污染的杂交瘤培养物合成。因此“单克隆”是指抗体的可得自实质上同质的抗体群体的特征。该术语并不表示需要任何特定的抗体生产方法。

基本上，单克隆抗体可使用已知技术生产。举例而言，其可通过最先由Kohler and Milstein(Nature 256：495-7，1975)描述的杂交瘤技术，或由重组DNA方法(Cabilly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-7，1984)生成，但其方法并不仅限于此。举例而言，当使用所述杂交瘤方法时，Aβ寡聚体(例如，描述于实施例中的Aβ四聚体)用作致敏抗原，而免疫接种通过常规的免疫接种方法进行。所得的免疫细胞与已知的亲本细胞通过常规细胞融合方法融合，且可使用常规筛选方法筛选与分离抗体产生细胞。

本发明所述的单克隆抗体可如下所述产生。将合成的Aβ1-42(Peptide Institute，Inc.，Osaka)溶解于去离子蒸馏水或10mM磷酸盐缓冲溶液，并在37℃下培育18小时。随后，将肽用4-12％SDS-PAGE分离，并通过CBB染色显影，仅切出未经Aβ1-42单体污染的Aβ1-42四聚体部分作为抗原。另一方面，将(i)通过使用常规方法将6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)(SIGMA)化学连接于合成Aβ1-40多肽的N末端而制备的修饰Aβ1-40与(ii)合成Aβ1-40(Peptide Institute，Inc.大阪)以5∶100、10∶100、20∶100、30∶100、40∶100、50∶100、60∶100、70∶100或80∶100，优选90∶100，或较优选100∶100的比例混合，并进行三个小时，优选六个小时，或较优选20个小时的多聚反应，来制备含有大量Aβ1-40寡聚体的制备物。然后，对BALB/c小鼠，通过在其足垫上注射2.5μg的以弗氏完全佐剂乳化的Aβ1-42四聚体抑或Aβ1-40寡聚体的方式用所述抗原进行免疫接种。随后，进行六次的加强免疫(booster)。利用鼠蹊部淋巴结，通过使用聚乙二醇1500与Sp/O-Ag14细胞融合产生杂交瘤。

用致敏抗原免疫接种的动物并无特别限定，但优选考虑到与供细胞融合使用的亲本细胞的相容性进行选取。一般而言，使用啮齿类，兔形类或灵长类。啮齿类包括，例如，小鼠，大鼠与仓鼠。兔形类包括，例如，家兔。灵长类包括，例如，狭鼻(旧大陆)猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)，猕猴(Macaca mulatta)，阿拉伯狒狒与黑猩猩。

动物使用致敏抗原根据已知方法进行免疫接种。举例而言，作为标准方法，免疫接种通过腹腔内或皮下对哺乳类注射致敏抗原来进行。

与前述免疫细胞融合的亲本细胞的一个实例为Sp2/O-Ag14细胞，其描述于下面的实施例。然而可使用多种其它已知细胞系。

前述免疫细胞与骨髓瘤细胞间的细胞融合可基本上根据已知的方法进行，包括Kohler与Milstein的方法(Kohler G. and Milstein C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。

以此方式获取的杂交瘤通过对其在常规选择培养基中进行培养而进行选择，所述培养基可以举出HAT培养基为例，其含有次黄嘌呤，氨基蝶呤与胸苷。在上述HAT培养基中的培养通常持续数日至数周以提供充足时间杀灭除所期望的杂交瘤外的细胞(非融合细胞)。继之，可进行常规的有限稀释方法以筛选并单独克隆可产生所期望抗体的杂交瘤。

在此之后，将所得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔，并提取含有所期望单克隆抗体的腹水。举例而言，所述抗体可自所述腹水通过常规的蛋白质分离和/或纯化方法进行纯化，所述方法例如柱层析(包括但不仅限于亲和层析)、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及等电聚焦的选择组合(Antibodies：A Laboratory manual，Harlow and David，Lane(edit.)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。

蛋白A柱与蛋白G柱可用于亲和柱。使用的蛋白A柱的实例包括HyperD，POROS与Sepharose F.F.(Pharmacia)。

层析(排除亲和层析)包括离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析以及吸附层析(“Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual”，Daniel R Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。当进行层析时，可使用液相层析方法例如HPLC与FPLC。

以该方式制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可于常规的培养基中传代培养，且其可在液氮中长时间储藏。

任何哺乳类均可使用的免疫原进行免疫接种以生产抗体。然而，当通过产生杂交瘤制备单克隆抗体时，优选考虑与用于细胞融合以供产生杂交瘤的亲本细胞的相容性。

一般而言，啮齿类，兔形类或灵长类用于免疫接种。啮齿类包括，例如，小鼠，大鼠与仓鼠。兔形类包括，例如，家兔。灵长类包括，例如，狭鼻(旧大陆)猴，例如食蟹猴，猕猴，阿拉伯狒狒与黑猩猩。

使用具有人类抗体基因库的转基因动物在本领域是已知的(Ishida I，et al.，Cloning and Stem Cells 4：91-102，2002)。和其它动物一样，为获取人类单克隆抗体，对所述转基因动物进行免疫接种，随后自该动物收集抗体产生细胞，并与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，然后可自这些杂交瘤产生抗蛋白质的人类抗体(参见国际公布WO92/03918，WO94/02602，WO94/25585，WO96/33735和WO96/34096)。

或者，可使用用癌基因永生化的淋巴细胞来产生单克隆抗体。举例而言，对于用EB病毒等感染的人类淋巴细胞在体外用免疫原进行免疫接种。然后，将经免疫接种的淋巴细胞与源自人类，能够无限分裂的骨髓瘤细胞(U266，等)融合，从而获得产生所期望人类抗体的杂交瘤(日本公开专利公报(JP-A)昭63-17688)。

一旦单克隆抗体可通过任何前述方法获取，所述抗体亦可使用遗传工程方法(参见，例如Borrebaeck CAK and Larrick JW，Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers，UK，1990)制备。举例而言，重组抗体可通过从抗原产生细胞(如产生所述抗体的杂交瘤或经免疫接种的淋巴细胞)克隆出编码期望抗体的DNA，并将所克隆的DNA插入合适的载体中，再将该载体转染入合适的宿主细胞，来加以制备。上述重组抗体亦包含于本发明中。

本发明的单克隆抗体的实例包括1A9单克隆抗体，2C3单克隆抗体，5A5单克隆抗体，5A9单克隆抗体，4F7单克隆抗体，4H5单克隆抗体，6E4单克隆抗体与6H4单克隆抗体。所述单克隆抗体优选包括下述(i)到(vi)的抗体：

(i)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的L链(轻链)；

(ii)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的L链(轻链)；

(iii)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的L链(轻链)；

(iv)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的L链(轻链)；

(v)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的L链(轻链)；

(vi)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的L链(轻链)。

在一个实施方案中，本发明的抗体包括迷你抗体。迷你抗体包含缺乏全抗体的一部分的抗体片段，且无特别限制，只要其具有结合抗原的能力。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2与Fv。迷你抗体的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，scFv(单链Fv)，双抗体(diabody)，以及sc(Fv)2(单链(Fv)2)。

为获取针对本发明蛋白质的多克隆抗体，对经抗原致敏的哺乳动物，在确证所期望的抗体血清水平上升后，从其取出血液。通过已知方法自血液分离出血清。当使用多克隆抗体时，可使用含该多克隆抗体的血清。或者，若需要，可自血清分离出含所述单克隆抗体的级分然后再使用。举例而言，免疫球蛋白G或M可如下制备：使用与本发明的蛋白质偶联的亲和柱获得特异性识别所述蛋白质的级分，然后使用蛋白A或蛋白G柱提纯该级分。

在本发明中，可结合Aβ寡聚体的抗体，是可结合由5A5、5A9、4F7、4H5、6E4或6H4所结合的Aβ寡聚体的抗体。该抗体优选为下述(A)至(F)中任一项所述的抗体：

(A)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的L链(轻链)的抗体；

(B)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的L链的抗体；

(C)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的L链的抗体；

(D)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的L链的抗体；

(E)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的L链的抗体；

(F)一种可结合下述Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的L链的抗体。

进一步，本发明提供了本发明所述抗体所结合的Aβ寡聚体。优选地，所述抗体包括，例如，1A9单克隆抗体，2C3单克隆抗体，5A5单克隆抗体，5A9单克隆抗体，4F7单克隆抗体，4H5单克隆抗体，6E4单克隆抗体以及6H4单克隆抗体。这样的Aβ寡聚体可用作供制备抗体的抗原，或疫苗。

在优选实施方案中，本发明所述抗体包括，例如，下述(1)到(38)中任一项所述的抗体：

(1)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：11的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：13的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(2)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：17的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：19的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(3)一种抗体，其包含(1)的H链与(2)的L链；

(6)一种抗体，其包含(4)的H链与(5)的L链；

(8)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：37的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：39的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(9)一种抗体，其包含(7)的H链与(8)的L链；

(12)一种抗体，其包含(10)的H链与(11)的L链；

(13)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：51的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：53的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：57的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：59的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(15)一种抗体，其包含(13)的H链与(14)的L链；

(18)一种抗体，其包含(16)的H链与(17)的L链；

(19)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：71的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：73的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(20)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：77的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：79的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(21)一种抗体，其包含(19)的H链与(20)的L链；

(24)一种抗体，其包含(22)的H链与(23)的L链；

(26)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：97的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：99的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(27)一种抗体，其包含(25)的H链与(26)的L链；

(30)一种抗体，其包含(28)的H链与(29)的L链；

(31)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：111的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：113的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(32)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：117的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：119的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(33)一种抗体，其包含(31)的H链与(32)的L链；

(36)一种抗体，其包含(34)的H链与(35)的L链；

(37)一种抗体，其是(1)到(36)中任一项的抗体中替换，缺失，添加和/或插入一个或多个氨基酸而得到的，且具有与所述(1)到(36)中任一项的抗体等价的活性；以及

(38)一种抗体，其可结合(1)到(36)中任一项的抗体所结合的表位。

上述(1)中“具有SEQ ID NO：9(5A5抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：11(5A5抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：13(5A5抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中的VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：5(5A5抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(2)中“具有SEQ ID NO：15(5A5抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：17(5A5抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：19(5A5抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：7(5A5抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

上述(7)中“具有SEQ ID NO：29(5A9抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：31(5A9抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：33(5A9抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：25(5A9抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(8)中“具有SEQ ID NO：35(5A9抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：37(5A9抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：39(5A9抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：27(5A9抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

上述(1 3)中“具有SEQ ID NO：49(4F7抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：51(4F7抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：53(4F7抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：45(4F7抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(14)中“具有SEQ ID NO：55(4F7抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：57(4F7抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：59(4F7抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：47(4F7抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

上述(19)中“具有SEQ ID NO：69(4H5抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：71(4H5抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：73(4H5抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：65(4H5抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(20)中“具有SEQ ID NO：75(4H5抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：77(4H5抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：79(4H5抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：67(4H5抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

上述(25)中“具有SEQ ID NO：89(6E4抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：91(6E4抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：93(6E4抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：85(6E4抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(26)中“具有SEQ ID NO：95(6E4抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：97(6E4抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：99(6E4抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：87(6E4抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

上述(31)中“具有SEQ ID NO：109(6H4抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：111(6H4抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：113(6H4抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链”中VH的一个实例，是具有SEQ ID NO：105(6H4抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。

上述(32)中“具有SEQ ID NO：115(6H4抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：117(6H4抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO：119(6H4抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链”中VL的一个实例，是具有SEQ ID NO：107(6H4抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。

对本发明所述的5A5抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：1 2；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：13与SEQ ID NO：14；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：16；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：17与SEQ ID NO：18；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：19与SEQ ID NO：20。

对本发明所述的5A9抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：21与SEQ ID NO：22；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：23与SEQ ID NO：24；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：25与SEQ ID NO：26；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：27与SEQ ID NO：28；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：29与SEQ ID NO：30；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：31与SEQ ID NO：32；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：33与SEQ ID NO：34；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：35与SEQ ID NO：36；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：37与SEQ ID NO：38；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：39与SEQ ID NO：40。

对本发明所述的4F7抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：41与SEQ ID NO：42；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：43与SEQ ID NO：44；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：45与SEQ ID NO：46；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：47与SEQ ID NO：48；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：49与SEQ ID NO：50；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：51与SEQ ID NO：52；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：53与SEQ ID NO：54；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：55与SEQ ID NO：56；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：57与SEQ ID NO：58；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：59与SEQ ID NO：60。

对本发明所述的4H5抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：61与SEQ ID NO：62；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：63与SEQ ID NO：64；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：65与SEQ ID NO：66；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：67与SEQ ID NO：68；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：69与SEQ ID NO：70；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQID NO：71与SEQ ID NO：72；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：73与SEQ ID NO：74；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：75与SEQ ID NO：76；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：77与SEQ ID NO：78；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：79与SEQ ID NO：80。

对本发明所述的6E4抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：81与SEQ ID NO：82；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：83与SEQ ID NO：84；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：85与SEQ ID NO：86；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：87与SEQ ID NO：88；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：89与SEQ ID NO：90；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：91与SEQ ID NO：92；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：93与SEQ ID NO：94；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：95与SEQ ID NO：96；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：97与SEQ ID NO：98；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：99与SEQ ID NO：100。

对本发明所述的6H4抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：101与SEQ ID NO：102；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：103与SEQ ID NO：104；其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：105与SEQ ID NO：106；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：107与SEQ ID NO：108；其H链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：109与SEQ ID NO：110；其H链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：111与SEQ ID NO：112；其H链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：113与SEQ ID NO：114；其L链CDR1的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：115与SEQ ID NO：116；其L链CDR2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：117与SEQ ID NO：118；而其L链CDR3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：119与SEQ ID NO：120。

上面提及的(1)到(38)的抗体并不仅仅包括单价抗体，亦包括具有两个或更多结合价的多价抗体。本发明的多价抗体包括其抗原结合位点全部相同的多价抗体，以及其抗原结合位点部分或完全不同的多价抗体。

在一个优选实施方案中，上面提及的(37)的抗体是没有经修饰的CDR的抗体。举例而言，上面提及的(37)的抗体所述的“在(1)的抗体中替换，缺失，添加，和/或插入一个或多个氨基酸而得到的，其具有与(1)的抗体等价的活性的抗体”，优选为“具有与(1)的抗体等价的活性的，在(1)的抗体中替换、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸而得到的，且包括具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：11的氨基酸序列作为CDR2，与SEQ ID NO：13的氨基酸序列作为CDR3的H链的抗体”。另一个上述(37)的抗体的优选抗体可以类似的方式表述。

在本文中“等价的活性”指关注的抗体具有与本发明抗体的相似的生物学或生物化学活性。本发明所述“活性”的实例包括与Aβ寡聚体但不与Aβ单体特异性结合的活性，抗神经毒性活性，阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性，抗突触毒性的活性，与抗记忆障碍的活性。

本领域技术人员周知的制备具有与某多肽等价的活性的多肽的方法包括向多肽中导入突变的方法。举例而言，本领域技术人员可使用定点诱变等方法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W，and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)将合适的突变导入抗体，来制备其活性等价于本发明的抗体的活性的抗体。氨基酸突变亦可天然发生。本发明所述的抗体亦包括下述抗体：其包含在本发明抗体的氨基酸序列中发生一个或更多突变而得到的氨基酸序列，且具有与本发明所述抗体活性等价的活性。在这样的突变体中，突变氨基酸的数量通常可为50个氨基酸或更少，优选30个氨基酸或更少，且更优选十个氨基酸或更少(例如，五个氨基酸或更少)。

氨基酸残基优选突变为保留所述氨基酸侧链性质的其它氨基酸。举例而言，氨基酸根据其侧链性质进行如下分类：疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y与V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S与T)，具有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I与P)，具有含羟基侧链的氨基酸(S，T与Y)，具有含硫原子侧链的氨基酸(C与M)，具有含羧酸与含酰胺侧链的氨基酸(D，N，E与Q)，具有碱性侧链的氨基酸(R，K与H)，以及具有含芳环侧链的氨基酸(H，F，Y与W)(氨基酸在括号中以单字母密码表示)。

已知具有在某一氨基酸序列中一个或更多氨基酸残基经修饰(缺失，添加，和/或替换为其它氨基酸)而得到的氨基酸序列的多肽可保留其原来的生物学活性(功能)。

除上面提及的修饰外，本发明的抗体可与其它物质缀合，只要其活性得到保持即可。所述物质的实例包括肽，脂质，糖与糖链，乙酰基团，以及天然与合成多聚物。可实施这些修饰以给予所述抗体额外的功能，或使抗体稳定化。

本发明的抗体的氨基酸序列添加数个氨基酸残基而得的抗体包括含有该抗体的融合蛋白。在该融合蛋白中，该抗体与其它肽或蛋白质融合。产生融合蛋白的方法可通过将编码本发明的抗体的多核苷酸与编码另一多肽或蛋白质的多核苷酸阅读框一致地连接，并将其插入表达载体，并将该融合构建体在宿主中表达来进行。本领域技术人员已知的技术可用于该目的。与本发明的抗体融合的肽或多肽包括，例如，已知的肽，例如FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)，由六个组氨酸(His)残基组成的6x His，10x His，流感血凝素(HA)，人c-myc片段，VSV-GP片段，p18HIV片段，T7-标签，HSV-标签，E-标签，SV40T抗原片段，lck标签，α-微管蛋白片段，B-标签以及蛋白C片段；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；免疫球蛋白恒定区域；β-半乳糖苷酶；以及麦芽糖结合蛋白(MBP)，等等。编码这些肽或多肽的可市购的多核苷酸可与编码本发明所述抗体的多核苷酸融合，且可通过表达如是制备的融合多核苷酸来产生所述融合多肽。

本发明所述的抗体可在氨基酸序列，分子量，糖链的存在与否，结构等方面彼此不同，取决于产生该抗体的细胞或宿主，或者纯化方法。然而，只要所得抗体具有等价于本发明抗体活性的活性，其即包含于本发明中。

与上述(1)到(36)中任一项的抗体所结合的表位结合的抗体可通过本领域技术人员已知的方法获取。举例而言，该抗体可通过下述方法获取(i)用常规方法确定该(1)到(36)中任一项所述的抗体结合的表位，并使用包含该表位中含有的氨基酸序列的多肽作为免疫原产生该抗体；或(ii)通过常规方法确定所产生的抗体的表位，并选择其表位与(1)到(36)中任一项所述抗体的表位相同的抗体。

上面提及的(1)到(38)的抗体亦包括任何类型的抗体，例如上面提及的迷你抗体，具有修饰氨基酸序列的抗体，例如人源化抗体与嵌合抗体，非人动物抗体，人抗体，与其它分子(例如，如聚乙二醇的多聚物)缀合的修饰抗体，以及糖链修饰抗体。

在一个优选实施方案中，本发明所述的抗体为修饰抗体，例如嵌合抗体与人源化抗体。优选抗体的实例包括(i)其可变区源自2C3抗体、1A9抗体、5A5抗体、5A9抗体、4F7抗体、4H5抗体、6E4抗体或6H4抗体，且其恒定区源自人类免疫球蛋白的嵌合抗体；以及(ii)其CDR源自2C3抗体、1A9抗体、5A5抗体、5A9抗体、4F7抗体、4H5抗体、6E4抗体或6H4抗体，且其FR源自人类免疫球蛋白，且其恒定区源自人类免疫球蛋白的人源化抗体。这些修饰抗体可使用已知方法产生。

由于嵌合抗体或人源化抗体在人体内的抗原性降低，这样的抗体可用于为治疗等目的施用于人类。

嵌合抗体通过组合源自不同动物的序列来产生。嵌合抗体的实例包括这样的抗体，其包含小鼠抗体的重链可变区与轻链可变区，以及人类抗体的重链恒定区和轻链恒定区。嵌合抗体的产生可使用已知方法进行(参见，例如，Jones et al.，Nature 321：522-5，1986；Riechmann et al.，Nature 332：323-7，1988；以及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2：593-6，1992)。举例而言，首先，自抗体产生细胞的RNA通过聚合酶链式反应(PCR)等方法(参见，例如，Larrick et al.，“Methods：a Companion to Methods in Enzymology”，Vol.2：106，1991；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”in Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application；Ritter et al.(eds.)，page 166，Cambridge University Press，1995，以及Ward et al.，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications；and Birch et al.(eds.)，page 137，Wiley-Liss，Inc.，1995)制备编码目标抗体可变区或CDR的基因。将所制备的编码可变区的基因连接于编码恒定区或框架区的基因。所述编码恒定区或框架区的基因可用类似于针对CDR编码基因的方式确定，或者，其可基于已知抗体的序列信息制备。编码嵌合产物与CDR移植产物的DNA序列可完全或部分使用寡聚核苷酸合成技术加以合成。举例而言，可实施由Jones等(Nature 321：522-5，1986)描述的寡聚核苷酸合成。进一步，在一些情况下，可适当地使用定点诱变与聚合酶链式反应。由Verhoeyen et al.(Science 239：1534-6，1988)与Riechmann et al.(Nature 332：323-7，1988)描述的对已知可变区进行寡核苷酸特异性诱变的技术可用于修饰所述可变区序列，例如，以增强嵌合抗体的结合能力。进一步，若需要，可使用T4 DNA聚合酶对有缺口的寡聚核苷酸进行酶促填充，例如，描述于Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-33，1989与WO 90/07861)。

举例而言，CDR-移植技术在本领域为已知的(“Immunoglobulin genes”，Academic Press(London)，pp 260-74，1989；and Michael A et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：969-73，1994)。使用该技术，将给定抗体的CDR替换为另一个抗体的CDR。通过这样的替换，前者抗体的结合特异性改变为后者抗体的结合特异性。在这样的嵌合抗体中，其中框架氨基酸源自人类抗体的称为“人源化抗体(CDR-移植抗体)”。当使用抗体治疗人类时，优选使用人类抗体或人源化抗体。

一般而言，嵌合抗体包括非人哺乳类来源的抗体的可变区与源自人类抗体的恒定区。另一方面，人源化抗体包括非人哺乳类来源的抗体的互补决定区以及源自人类抗体的框架区与恒定区。

在产生所述嵌合抗体或人源化抗体后，可变区(例如，FR)或恒定区中的氨基酸可替换为其它氨基酸。

所述嵌合抗体的可变区或所述人源化抗体的CDR的来源并不特别限定。

源自人类抗体的C-区域用于所述嵌合抗体与人源化抗体的C-区域。举例而言，Cγ1，Cγ2，Cγ3，Cγ4，Cμ，Cδ，Cα1，Cα2与Cε可用于H-链的C-区域，而Cκ与Cλ可用与L-链的C-区域。它们的序列是已知的。进一步，所述人类抗体C区域可经修饰以改善该抗体的稳定性或其产生。

本发明所述抗体针对抗原(Aβ寡聚体)的结合活性可使用例如，吸光度测定方法、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法、酶免疫分析(EIA)方法、放射性免疫分析(RIA)方法和/或荧光免疫分析方法等方法来测定。在ELISA中，将抗体固化在平板上，且该抗体的抗原添加至板上，然后添加含有所期望抗体的试样，如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。接着，向平板添加识别一抗，并由如碱性磷酸酶的酶标记的二抗，并进行预培育。在洗涤后，将酶底物例如对硝基苯基磷酸酯添加至板上，并测定其吸光度以测量所述目标试样的抗原结合能力。所述测量可使用BIAcore(Pharmacia)来进行。

进一步，本发明提供了包括上面提及的本发明的抗体与药用载体的组合物。

如下所述，本发明强烈暗示单克隆1A9与2C3抗体为预防类阿尔茨海默氏病表型的治疗抗体的有望候选。人们已显示记忆衰退与由可溶性Aβ寡聚体引起的突触功能障碍相关(Klein WL，2001，Trends Neurosci；and Selkoe DJ，2002，Science)。Aβ寡聚体的过量积聚与沉着可触发导致阿尔茨海默氏病的复杂下游级联反应。若事实确为如此，则使用包含本发明抗体与药用载体的组合物的治疗介入可有效阻断所述病理学级联反应，并由此可使阿尔茨海默氏病的治疗成为可能。

本发明所述的“治疗”并不一定针对展示病症或疾病的症候具有完全的治疗或预防效果，但可具有部分的效果。

本发明中的“治疗阿尔茨海默氏病”指缓解至少一种可由阿尔茨海默氏病导致的症状，其实例包括缓解或阻抑认知障碍，缓解或阻抑老年斑形成，缓解或阻抑突触功能障碍，以及减少或阻抑Aβ在脑组织，血液等处的积聚。在本文中，“认知障碍”包括，例如，记忆障碍，包括长期/短期记忆障碍，物体认知记忆障碍，空间记忆障碍与联想及情绪记忆障碍。

本发明提供了包含如上所述的含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分的药物组合物或药剂。

在本发明中，短语“包含如上所述的含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分”意指包含如上所述的含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为主要活性成分，但并不限定其实际含量。

上面提及的药物组合物的实例包括抗认知障碍剂，阿尔茨海默氏病治疗剂，阿尔茨海默氏病进展阻抑剂，老年斑形成阻抑剂，Aβ积聚阻抑剂，抗神经毒性剂(神经毒性中和剂)，Aβ淀粉样蛋白纤维抑制剂，以及抗突触毒性剂(突触毒性中和剂)。

上面提及的本发明的药物组合物还可表述为，例如，“阻抑阿尔茨海默氏病的方法”，所述方法包括对受试者(个体)施用如上所述的包含本发明的抗体与药用载体的组合物。在其它实施方案中，实例包括阻抑认知障碍的方法，阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法。阻抑老年斑形成的方法，阻抑Aβ积聚的方法，中和(阻抑)神经毒性活性的方法，抑制Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的方法，以及中和(阻抑)突触毒性的方法。在进一步的实施方案中，实例包括预防和/或治疗认知障碍的方法，以及预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法。

本发明亦提供了包含本发明的上述抗体与药用载体的组合物在生产上面提及的药物组合物中的应用。

进一步，本发明涉及下述组合物。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于预防和/或治疗认知障碍。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑阿尔茨海默氏病的进展。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑老年斑形成。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑Aβ积聚。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于中和(阻抑)神经毒性活性。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成。

-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于中和(阻抑)突触毒性活性。

上面提及的本发明的药剂可施用于人类或其它动物。在本发明中，被施以所述药剂的非人动物包括小鼠，大鼠，豚鼠，家兔，鸡，猫，狗，绵羊，猪，牛，猴，狒狒与黑猩猩。这些动物优选展示至少一种选自下组的症状：例如，认知障碍，老年斑形成、突触功能障碍，脑组织或血液中的Aβ积聚，等等。

包含于本发明的药物组合物中的抗体并不特别限定，只要它们包括于上面提及的本发明的抗体中，其实例包括本文所描述的抗体。

当使用上面提及的本发明的抗体用于药物组合物时，它们可通过本领域技术人员已知的方法配制。举例而言，视需要，它们可用水或其它药用液体以可注射的无菌溶液或悬浮液的形式配制，且可用于非肠道施用。举例而言，包含于所述药物组合物中的抗体可与可接受的载体或介质，尤其是无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮液，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，溶剂，防腐剂，粘合剂等组合，并混合为通常需用于接受的药物实践的单位剂量。短语“药用”指该物质是惰性的，并含有通常用作稀释剂或溶媒的物质。合适的赋形剂与其配方描述于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，16^th ed.(1980)Mack Publishing Co.，ed.Oslo et al.。

生理盐水与其它含有葡萄糖或佐剂(举例而言，D-山梨醇，D-甘露糖，D-甘露醇与氯化钠)的等渗溶液可用作供注射的水溶液。它们可与合适的增溶剂，例如醇类，更具体而言，乙醇与多元醇(丙二醇，聚乙二醇等)，以及非离子表面活性剂(Polysorbate 80^TM，HCO-50等)一起使用。

芝麻油或大豆油可用作油性液，而苯甲酸苄酯或苯甲醇可组合用作增溶剂。缓冲液(例如，磷酸缓冲液与乙酸钠缓冲液)，镇痛剂(例如，盐酸普鲁卡因)，稳定剂(例如，苯甲醇与苯酚)，以及抗氧化剂可用于配方。制备好的注射液可注入合适的安瓿瓶。

给药优选为非肠道给药，具体的例子包括通过注射给药，经鼻给药，经肺给药，以及经皮给药。通过注射给药的实例包括系统性或局部性的通过静脉内注射，肌肉内注射，腹膜内注射，皮下注射等给药。

所述药物组合物包括药学有效量的活性组分(上面提及的本发明抗体)。“药学有效量(的化合物)”指所述的量足以治疗和/或预防上述本发明抗体针对的抗原在其中发挥重要作用的病症。举例而言，“药用量”可以是当所述化合物施用于个体(患者)时，减少Aβ积聚、中和Aβ诱导毒性、减少Aβ淀粉样蛋白形成等，由此治疗或预防由阿尔茨海默氏病造成的病状所需的量。所述减少或中和可为，例如，减少或中和至少大约5％，10％，20％，30％，40％，50％，75％，80％，90％，95％，99％或100％。

确定上面提及的本发明的抗体的上述药学有效量的评估可使用标准的临床方法进行，包括组织病理学诊断。

合适的给药方法可取决于患者的年龄与症状选取。含有抗体的药物组合物的剂量可在，例如，对于每次给药在每千克体重0.0001mg到1000mg的范围内选择。或者，例如，对于每个患者所述剂量可在0.001到100000mg/体重的范围内选择；然而所述剂量并不一定限定于这些范围内。尽管剂量与给药方法根据患者的体重，年龄，症状等变动，本领域技术人员可合适的对它们进行选择。在后面描述的动物实验中，所述剂量是基于免疫球蛋白大剂量静注疗法(400mg/kg)(该疗法为人类健康保险所涵盖)选取的。

进一步，本发明提供了在试样中检测Aβ寡聚体(实例包括Aβ40(Aβ1-40)与Aβ42(Aβ1-42))的方法。本发明中“试样”的实例包括自受试者收集的试样。具体而言，本方法包括使用本发明的抗体检测收集自受试者的试样中所含的Aβ寡聚体的步骤。试样中的Aβ寡聚体的检测可利用，例如，使用化学发光的夹心固相酶免疫测定法(sandwich solid-phase enzyme immunoassay method)(化学发光ELISA)，使用所得抗体的免疫沉淀方法、免疫印迹、流式细胞计数、质谱与免疫组织化学分析。

当通过上面提及的测量方法在收集自受试者的试样中检测出Aβ寡聚体时，所述受试者可能是阿尔茨海默氏病患者。举例而言，当将收集自受试者的试样中Aβ寡聚体的量与来自健康个体进行比较，且Aβ寡聚体的量在受试者中高于在健康个体中时，该受试者确定为可能的阿尔茨海默氏病患者。受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者通常由医师(包括受医师指导的个人，本文下同)诊断。通过本诊断方法获得的收集自受试者以及健康个体的试样中的Aβ寡聚体的量的数据对医师进行诊断将是有用的。因此，本诊断方法也可表述为，收集并呈现对医师诊断有用的数据的方法。

具体而言，本发明提供了诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其中所述方法包括使用本发明的抗体检测自受试者收集的试样中的Aβ寡聚体。

进一步，本发明提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：

(a)使自受试者收集的试样与本发明的抗体以及与Aβ单体结合的抗体相接触；以及

(b)测量所述试样中Aβ寡聚体对Aβ单体的比例，

其中若步骤(b)中测得的比例高于健康个体，则将所述受试者确定为可能的阿尔茨海默氏病患者。

首先，在本方法中，使收集自受试者的试样与本发明的抗体和可结合Aβ单体的抗体相接触。在本文中，“接触”可通过，例如，将上面提及的每个抗体添加入收集自受试者的试样(其置于试管中)来实施。在此情况下，所述抗体以溶液、冷冻干燥所得的固体等形式适宜添加。当将所述抗体作为水溶液添加时，所述溶液可纯粹包含所述抗体本身，或可包含，例如，表面活性剂，赋形剂，着色剂，调味剂，防腐剂，稳定剂，缓冲剂，助悬剂，张度剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，流动性促进剂或矫味剂。所述抗体添加的浓度并非特别限定。举例而言，如使用人类免疫球蛋白配方，可适宜使用500-mg，1000-mg与2500-mg等冷冻干燥的配方。

然后，测量前述试样中Aβ寡聚体对Aβ单体的比例(在本文中，亦称为“O/M指数”)。为测量该比例，适宜地使用下述方法。举例而言，在如下文的实施例中所述，可使用比较自相同试样获取的所述寡聚体与单体的ELISA值的方法来实施测量。

然后，将该比例与健康个体的比例进行比较。当该比例在受试者中较之健康个体中为高时，确定该受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者。

本发明的诊断方法既可在体外又可在体内进行，但其优选在体外进行。

优选地，本发明的“试样”并不特别限定，只要其为源自受试者的组织即可。实例包括受试者的脑(脑实质等)，器官与体液(血液，脑脊液等)。在本发明中，所述试样优选为血液(更优选血浆)或脑脊液。

进一步，本发明提供了用于上面提及的在试样中测量Aβ寡聚体的方法或诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法的药剂。

在本发明中，包含抗体的药物组合物可包含于产品与试剂盒中，所述产品与试剂盒包含对治疗受试者的病理状态有用的材料。所述产物可包括任何化合物的带标签容器。合适的容器包括瓶，小瓶与试管。所述容器可用多种材料制成，例如玻璃与塑料。容器表面的标签应指明所述组合物用于治疗或预防所述疾病的一种或更多种症候。所述标签亦可载明给药的描述等。

除上面提及的容器外，含包括抗体的药物组合物的试剂盒可任选地包括第二容器，其储藏药用稀释剂。所述试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度看期望的材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，填充剂，注射针头，注射器，以及载有用途描述的包装插页。

若需要，所述药物组合物可于包装或分配装置中提供，所述包装或分配装置包含一个或更多含有活性成分的单位剂量形式。所述包装可包括金属或塑料箔，或者例如为发泡包装。所述包装或分配装置可伴有给药说明书。

在上面提及的药剂与试剂盒中，除作为活性成分的本发明的抗体外，还可根据需要混合，例如，灭菌水，生理盐水，植物油，表面活性剂，脂质，助溶剂，缓冲剂，蛋白稳定剂(BSA，明胶等)，防腐剂，封闭溶液，反应溶液，反应淬灭溶液，处理试样的试剂等。

本发明人显示本发明抗体对于预防阿尔茨海默氏病是有效的。亦即，本发明提供了阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法，其中所述方法包括对患有阿尔茨海默氏病的个体施用包含上述本发明的抗体和药学上可接受载体的组合物的步骤。

所有本文引用的现有技术文献通过引用的方式并于本说明书中。

实施例

下文中，通过实施例详细描述本发明，但并不应认为本发明受实施例的限定。

方法

制备抗原(1A9和2C3)

将合成Aβ1-42(Peptide Institute，Inc.，Osaka)溶解于蒸馏水或10mM磷酸盐缓冲液，并在37℃下培育18小时。然后，用SDS-PAGE(4-12％NuPAGE Tris-甘氨酸胶)分离肽，并在用CBB染色显现后，仅切出Aβ1-42四聚体而无Aβ1-42的污染。

制备抗原(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)

将6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)(SIGMA)，一种荧光染料，化学连接于合成Aβ1-40肽(Peptide Institute，Inc.)的N末端以产生修饰的Aβ。通过将所述修饰的Aβ和合成的Aβ1-40肽共聚来制备富含寡聚体的试样(Aβ1-40寡聚体)。优选调节条件使得由如下所述的ThT法确定的荧光强度为修饰Aβ不存在时荧光强度的四分之一或更低。更具体而言，优选将所述修饰的Aβ和合成Aβ1-40肽各100μM混合，并共聚20小时。

制备产生抗体的杂交瘤

对BALB/c小鼠通过将如上所述方法制备的抗原注射入其足垫进行免疫接种。然后，进行六次的加强免疫接种。使用小鼠蹊部淋巴结，通过使用聚乙二醇1500与Sp/O-Ag14细胞融合来产生杂交瘤。

确定抗体同种型(antibody isotyping)

纯化的免疫球蛋白的同种型确定使用Serotec(Oxford，UK)小鼠单克隆抗体同种型确定试剂盒。

点印迹分析(初步筛选)

初始筛选使用硝酸纤维素膜进行点印迹分析，所述膜上固化了预培育18小时的2.5μl的Aβ1-42(2.5μg/点)。膜上非特异性结合位点用含5％低脂奶粉、1％BSA与0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液封闭，然后将该膜与培养上清一起培育。培养上清中的Aβ寡聚体结合抗体通过辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠F(ab’)₂(1∶3000；Amersham)检测，并使用增强化学发光(ECL)试剂盒与LAS3000 mini(Fujitsu，Tokyo，Japan)显影。在400个克隆中，对其中16个点印迹为阳性的，包括1A9与2C3，进行下述的二次筛选。

免疫沉淀与免疫印迹分析(二次筛选)

二次筛选使用富含Aβ寡聚体的淀粉样蛋白级分(Matsubara E，et al.，Neurobiol Aging，2004)进行免疫测定实验(Ghiso J，et al.，Biochem J，1993)，以评估在初步筛选中选出的16个克隆可否在AD脑中捕获Aβ寡聚体。将一个自AD脑制备的、不溶于缓冲液但可溶于甲酸的级分与组织上清和蛋白G-Sepharose一起培育。将被免疫沉淀的Aβ寡聚体使用NuPAGE4-12％Bis-Tris-甘氨酸凝胶分离，并使用含10％甲醇的10mM 3-环己基氨基-1-丙磺酸(pH11)在400mA下经一小时转移到硝酸纤维素膜或Immobilon P(Milliipore)上。膜上的非特异性结合位点用含5％低脂奶粉，1％BSA与0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液在室温下封闭3小时。通过免疫印迹法用4G8(1∶1000)或6E10(1∶1000)单克隆抗体如上所述地检测被免疫沉淀的Aβ寡聚体。自所述16个克隆中选出两个克隆，1A9与2C3，作为阿尔茨海默氏病治疗抗体的候选。

抗体

6E10与4G8单克隆抗体(Covance Immuno-Technologies，Dedham，MA)分别识别人类Aβ序列的氨基酸位置1-16与17-24的表位。特异性识别Aβ寡聚体的多克隆抗体A11购自Biosource(Camarillo，CA)。Alex Fluor(AF)488-或594-缀合的山羊抗小鼠IgG与Alex Fluor(AF)488-缀合的山羊抗大鼠IgG购自Molecular Probes(Eugene，OR)。抗小鼠IgG2b购自Sigma(St.Louis，MO)。抗突触泡蛋白抗体购自Santa Cruz(Santa Cruz，CA)，而抗脑发育调节蛋白抗体购自MBL(Nagoya，Japan)。

尺寸排阻层析法(SEC)

进行了SEC以评估1A9与2C3的尺寸特异性。如之前所报道(Matsubara E.，et al.，Neurobiol Aging，25：833-841，2004)，该方法可选择性地分离Aβ单体与Aβ寡聚体，或脂蛋白结合的Aβ与无脂蛋白的Aβ。本发明人使用Microcon 3kDa分子量截留滤器(Millipore Corp.)将来自过表达APP/PS1的HEK293细胞的培养上清液浓缩约十倍。然后，将浓缩液使用经磷酸盐缓冲液预平衡的Superose 12尺寸排阻柱(1cmx30cm；Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden；流速为0.5ml/min)分为28个1毫升的级分。对每个级分的一半使用1A9或2C3进行免疫沉淀。使用4G8通过免疫印迹法检测所得免疫沉淀物中所含的Aβ。

在相同条件下对自阿尔茨海默氏病患者或与其年龄匹配的健康个体各十例汇集的脑脊液(CSF)以及除去脂蛋白的CSF进行了分离。利用ELISA分析检测所收集的级分中的Aβ。为评估脂质，使用标准试剂盒(Wako，Osaka，Japan)对总胆固醇进行酶学定量。在本发明人的实验条件下，CSF的脂蛋白在级分7-14中洗脱，而级分15-28包含无胆固醇的蛋白质。

不含种子的Aβ溶液的制备

将合成Aβ1-42以250μM溶解于0.02％氨水中。然后，为制备不含种子的Aβ溶液，使用Optima TL超离心机(Beckman，USA)以540000xg超离心3小时以沉淀不溶解的肽(它们可能充当种子)。收集所得的上清，并将其等分并储藏于-80℃直至使用。试样的制备是在即将使用前将所述Aβ储藏溶液解冻，并用Tris缓冲盐水(TBS；150mM NaCl与10mM Tris-HCl(pH7.4))将其稀释10倍。所得的25μM溶液用于下述的实验。合成Aβ1-40(HCL形式；Peptide Institute，Inc.，Osaka)制备为2x浓度。

Aβ培育与ThT分析(Yamamoto N，et al.，J Biol Chem，282：2646-2655， 2007)

Aβ溶液(25μM)在预定浓度的抗体存在下在37℃下培育2或24小时。所述培育混合物的ThT荧光强度使用荧光分光光度计(RF-5300PC；Shimadzu Co.，Kyoto，Japan)确定。使用1ml含5μM ThT与50mM甘氨酸-NaOH(pH8.5)的反应混合物，在激发与发射波长为446与490nm的条件下，测定Aβ淀粉样蛋白原纤维的最适荧光强度。荧光强度在混合物制备后立即测定。

进一步，通过下述步骤评价4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4抗体阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。将用细胞培养基稀释到12.5μM的Aβ1-42溶液在各抗体存在或不存在的条件下在37℃下培育24小时。通过上述ThT荧光强度测定法确定形成的淀粉样蛋白纤维的量。

Aβ诱导性神经毒性测定(Yamamoto N，et al.，J Biol Chem，282： 2646-2655，2007)

将大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞在含10％热失活的马血清(Invitrogen)与5％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培育。为诱导其分化为神经细胞，将PC12细胞以20000个细胞/cm²的密度铺于经聚-L-赖氨酸(10mg/ml)包被的培养皿中，并在添加有100ng/ml神经生长因子(NGF；Alornone Labs，Jerusalem，Israel)的DMEM中培育六天(PC12N)。将PC12N在抗体存在或不存在的条件情况下在4℃下暴露于25μM不含种子的Aβ1-42或经预培育的Aβ1-42中48小时。由Aβ1-42诱导的神经毒性通过Live/Dead双色荧光测定法根据供应商的说明(Molecular Probes，Eugene，Oregon)来进行评估。

进一步，4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4抗体的中和Aβ诱导性神经毒性的活性通过下述方法评价。首先，将人类神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)在24孔板上含10％FBS的DMEM中，以150000细胞/孔的密度培育24小时。然后，将该培养基替换为不含血清、含Aβ1-42(12.5μM)、且添加或未添加抗体的培养基，并将所述细胞再培养24小时。为确定由Aβ1-42诱导的细胞毒性，利用CytoTox96试剂盒(Promega)测定释放到所述培养基中的源自死细胞的LDH的水平。

超滤与分子筛

为确定神经毒性Aβ寡聚体的尺寸依赖性特征，从25μM的Aβ寡聚体溶液通过使用Micron 3kDa，10kDa，30kDa与100kDa截留膜进行顺序超滤，制备四种滤出液(＜3kDa，3到10kDa，10到30kDa，30到100kDa)以及1种保留溶液(＞100kDa)。对每个级分进行上述的Aβ诱导性神经毒性测定。使PC12N暴露于每个级分，如上所述鉴定毒性级分。还通过如上所述的点印迹分析鉴定了由A11，1A9，2C3和4G8所识别的三维结构的分布。对各个级分进行原子力显微镜检查来鉴定神经毒性寡聚体的形态学特征。

电子显微镜检查(EM)与原子力显微镜检查(AFM)

用蒸馏水稀释试样，并将其喷洒在经碳包被的网格上以进行电子显微镜分析。所述网格用1％磷酸钨酸负染色，并在Hitachi H-7000电子显微镜(Tokyo，Japan)下用77kV的加速电压进行观察。AFM评价如近来所报道一般进行。将试样滴置于新剥开的云母上。让所述云母静置30分钟，然后用水洗涤，并使用Nanoscope IIIa(Digital Instruments，Santa Barbara，CA，USA)设为轻敲(tapping)模式分析液体试样。使用的悬臂(cantilever)为OMCL-TR400PSA(Olympus，Japan)。

受试者组织与抽提

本研究基于来自东京都老人综合研究所脑银行(Tokyo Metropolitan Brain Bank for Aging Research of the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)(Itabashi，Tokyo，Japan)的尸体剖检病例(n＝50；26位男性与24位女性)进行。本研究计划经东京大学医学部(the Faculty of Medicine，the University of Tokyo)、东京都老人综合研究所东京都老人医疗中心(the Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital of the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)、以及国立长寿医疗研究所(the National Center of Geriatrics and Gerontology)的机构内伦理委员会所批准。已有人报道了受试者与试样收集的细节(Katsuno T，Neurology，64：687-692，2005)。然而彼研究分析的是不溶性脑级分，而在本研究计划中，本发明人分析了可溶性脑级分，其在之前的研究中未经鉴定(Katsuno T，Neurology，64：687-692，2005)。将冷冻的组织试样(内嗅皮层的前部)在九倍体积的含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的Tris缓冲盐水(TS)中匀浆。将匀浆在265000xg下超离心20分钟。对所得上清等分试样的三分之一(0.5ml)进行免疫印迹分析。

免疫组织化学

Tg2576小鼠的左脑半球使用低温切片机(RM 2145；Leica，Wetzlar，Germany)切为30μm厚的矢状切片，并如前所述(Wyss-Coray et al.，2001)用硫代黄素S进行染色。利用抗突触泡蛋白抗体(Chemicon，Temecula，CA)进行肿大变性的神经突的形成的观察。在40倍放大率下观察来自每个小鼠左脑半球的四或五个切片，计数硫代黄素S阳性斑点数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数。为观察Aβ沉着，将连续切片用甲酸或蛋白酶K短暂地预处理，再用Aβ免疫染色试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)进行染色，使用ABC elite试剂盒(Vector Laboratories)显现免疫阳性的信号。使用与显微镜连接的数字照相机记录大脑皮层与海马的图像，并用简单的PCI软件(Compix Imaging System，Lake Oswego，OR)进行分析。使用共聚焦激光显微镜(Carl Zeiss LSM510)观察抗体的脑内移行(translocation)。硫代黄素S阳性的斑块数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数以双盲的方式确定。

被动免疫疗法与行为分析

三月龄的雌性非转基因(non-Tg)小鼠以及携带并过表达突变体人类APP基因的Tg2576小鼠购自Taconics(Germantown，NY，USA)，所述突变体基因具有源自家族性AD的瑞典型(Swedish-type)双重突变(K670N与M671L)。这些小鼠在本发明人的动物设施中养育直至13月龄。为确定被动免疫是否可阻止类阿尔茨海默氏病表型，将1A9或2C3(0.4mg/kg/周)，或PBS施用于四月龄的Tg2576的尾静脉中，并延续该给药直至13月龄。在第十三个月，如前人所述(Mouri A，FASEB J，21：2135-2148，2007)进行记忆功能评估，基于下列四个行为范式：

(1)短期记忆的Y-迷宫测试；

(2)新物体识别测试；

(3)Morris水迷宫测试；以及

(4)附线索的恐惧条件测试(contextual fear conditioning test)

在行为测试三日后，将所述小鼠处死以供生化与组织学评估。实验结果通过单向与双向ANOVA分析。使用Fisher检验进行事后(post-hoc)分析。

脂蛋白的分离与移除

自12个AD患者与13个NC个体收集CSF。然后，从600μl的每个CSF试样中通过制备性连续密度梯度超离心方法根据先前报道的规程(Matsubara E，et al.，Ann Neurol，45：537-541，1999)移除脂蛋白。CSF的密度用KBr调整为1.25g/ml。将所述CSF在100000rpm、16℃下使用HitachiRP100AT离心机超离心8小时。对漂浮于密度1.25g/ml处的脂蛋白与除去了脂蛋白的CSF使用3kDa截留膜(Microcon 3；Arnicon，Inc)进行超滤，然后将其冷冻储藏或于4℃下储藏直至使用。

亦通过亲和层析法使用PHML-LIPOSORB(Calbiochem，La Jolla，CA)移除脂蛋白。每个试样(血浆或脑)与PHML-LIPOSORB(Calbiochem，La Jolla，CA)以1.5∶1的比例合并，并混合60秒。随后将混合物在3000rpm下离心10分钟。对所得上清(无脂蛋白的试样)使用6E10进行针对寡聚体的ELISA。使用20mM脱氧胆酸钠从PHML-LIPOSORB洗脱与脂蛋白结合的试样。使用1％琼脂糖凝胶电泳(Beckmann)，然后用FAST-RED 7B(Wako，Osaka，Japan)染色，来确证特异性的脂蛋白移除。

人类Aβ的定量

通过夹心ELISA如前人所详述(Matsubara E，et al.，Ann Neurol，537-541，1999；Matsubara E，et al.，Neurobiol Aging，25：833-841，2004)特异性地对全血浆与LPDPAβ种类进行定量。为分析脑Aβ种类，对溶于100μl缓冲液的可溶性Aβ种类直接进行ELISA，而对于以70％甲酸提取物形式存在的不可溶Aβ试样，在ELISA前用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，并稀释1000倍。通过该分析获得的值用脑湿重标准化，最终表达为pmol/g。通过在所有三个板中包括三个标准血清试样来实现板之间的标准化。

Aβ寡聚体特异性ELISA

为了特异性地检测寡聚Aβ而非单体Aβ，使用了基于化学发光的夹心固相酶免疫测定(化学发光ELISA)。将微孔板用单克隆1A9(IgG2b同种型)或2C3(IgG2b同种型)，或1A9与2C3的混合物包被。添加100μl的试样(脑或脑脊液)并在4℃下连续培育24小时。然后，添加辣根过氧化物酶缀合的BA27 Fab’片段(特异于Aβ40的抗Aβ1-40；Wako pure chemical，Osaka，Japan)或辣根过氧化物酶缀合的BCO5 Fab’片段(特异于Aβ42的抗Aβ35-43；Wako pure chemical，Osaka，Japan)，并在4℃下培育24小时。使用Veritas Microplate Luminometer(Promega)对用 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce，Rockford，IL，USA)产生的化学发光进行定量。

为评估用单克隆1A9与2C3外周给药的体内效力，自经给药的小鼠采集血浆与器官试样，并使用特异于人类寡聚体的HRP标记6E10(Senetek PLC，Napa，CA，USA)通过ELISA对Aβ寡聚体进行分析。通过使用上述的化学发光系统实现了高敏感度检测。为避免结合于脂蛋白的Aβ单体的干扰，本发明人使用PHML-LIPOSORB以与前述相同的方法预处理了血浆和器官试样。所得的除去了脂蛋白的试样用于所述分析。

抑制性ELISA

在该分析中使用的Aβ寡聚体通过将合成Aβ1-40(HCl形式)用PBS稀释至0.1mg/ml的浓度，并将其在37℃温育一小时来制备。同时，通过将合成Aβ1-40(TFA形式)用PBS稀释至0.1mg/ml的浓度来制备Aβ单体。将Aβ寡聚体以400ng/孔固化于96孔免疫板上，然后用BSA对所述板进行封闭。随后，将逐步稀释至100pg/ml到100μg/ml范围的Aβ单体或寡聚体与4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4抗体，或对照抗Aβ抗体(4G8和6E10)进行反应。在温育两小时后，将所得混合物添加至如上所述的96孔免疫板中，并在室温下温育十分钟。固化的Aβ寡聚体与每种抗体的结合通过测定在使用HRP标记抗小鼠IgG抗体和TMB溶液的显色反应中450nm处的吸光度来检测。

实施例1

制备Aβ寡聚体特异性单克隆抗体(1A9与2C3)

Aβ寡聚体与单体在溶液中共存。因而，Aβ单体的移除对于为产生Aβ寡聚体特异性抗体的抗原制备而言非常关键。如图1A所示，本发明人成功的通过SDS-PAGE分离了不含Aβ单体污染的SDS稳定性Aβ四聚体。在用分离所得的Aβ四聚体进行体内免疫接种后，通过先进行点印迹分析再进行免疫沉淀的两步筛选法，选取了阳性杂交瘤克隆。在进行点印迹分析的400个克隆中，16个克隆被确定为阳性(阳性率＝4％)。为评估分离所得阳性克隆针对寡聚体的特异性，对源自AD脑的不溶于磷酸盐缓冲液但可溶于甲酸(FA)的淀粉样蛋白级分(Matsubara E et al.，Neurobiol Aging，25：833-841，2004)，使用所述阳性杂交瘤的细胞培养上清进行了免疫沉淀分析(图1B)。使用抗Aβ单克隆抗体4G8的免疫印迹分析检出了Aβ二聚体、较前者少量的三聚体、以及更高分子量的弥散(smear)，后者是聚集的Aβ分子种类的特征。亦检出了非常少量的在SDS存在下解离出的Aβ单体。为了进一步确证由天然1A9或2C3识别的三维结构(亦即寡聚体)的存在，本发明人在经突变体PS1 cDNA转染的人类胚胎肾(HEK)293细胞的条件化培养基(CM)中检测了所述寡聚体(Nakaya Y et al.，J Biol Chem，280：19070-19077，2005)。本发明人通过SEC对HEK293 CM进行分级分离，并然后鉴定出寡聚体。如之前报道的(Matsubara E et al.，Neurobiol Aging，25：833-841，2004；Yamamoto N，et al.，J Biol Chem，282：2646-2655，2007)，该方法可有效地将单体(级分14到20)与寡聚体(级分8到13)分离。当使用单克隆1A9进行免疫沉淀时，分泌到CM中的SDS稳定性Aβ二聚体在级分8(＞680kDa)中被沉淀出来；SDS稳定性Aβ二聚体与三聚体在级分13(17到44kDa)中被沉淀出来；还有非常少量的二聚体在级分16中被沉淀出来(图1C)。当使用2C3进行免疫沉淀时获得相似的结果(数据未显示)。这些数据说明单克隆1A9与2C3对Aβ寡聚体具有确切的特异性，而不识别Aβ单体。

实施例2

单克隆1A9与2C3的抗神经毒性活性

为评估单克隆1A9和2C3是否能够预防Aβ诱导的神经毒性，将NGF-分化的PC12细胞(PC12N)与25μM无种子(seed free)的Aβ1-42(ThT阴性540000xg上清)在所述单克隆抗体(mAb)存在或不存在的条件下在37℃下培育48小时。通过LIVE/DEAD分析来测定神经细胞的生存力(图2)。在Aβ1-42存在时，较之对照测定(图2A)，检出了显著高水平的神经细胞死亡(图2B与2G)。非特异性IgG2b(图2C与2D)无法在相同条件下抑制Aβ1-42诱导的神经毒性。可市购的Aβ特异性单克隆抗体4G8(IgG2b同种型；图2D与2G)具有增强毒性的倾向。单克隆2C3(IgG2b同种型；图2F与2G)以浓度依赖性方式几乎完全中和了Aβ1-42的神经毒性。因此推测从头形成(de novo-formed)性的神经毒性2C3三维结构为寡聚体形式。与此同时，1A9(IgG2b同种型；图2E与2G)的抗神经毒性活性落在2C3与非特异性IgG2b的抗神经毒性活性之间。这表明由1A9识别的三维结构与由2C3识别的寡聚体在结构上不同。

实施例3

当下，确定神经毒性Aβ1-42寡聚体的准确大小与构象是最紧要的课题之一，对此竞争激烈。本发明人成功地分离出可溶性神经毒性Aβ1-42分子种类，并通过超滤与分子筛(UC/MS)将这些种类分级分离为下述五个级分(图3A)：

级分1，＜3kDa的滤出物(泳道1)；

级分2，3到10kDa的滤出物(泳道2)；

级分3，10到30kDa的滤出物(泳道3)；

级分4，30到100kDa的滤出物(泳道4)；以及

级分5，＞100kDa的保留溶液(泳道5)。

使用单克隆4G8的免疫印迹分析(图3A)揭示：

级分1不含有Aβ(泳道1)；

级分2含有Aβ单体(泳道2)；

泳道3含有Aβ单体与少量Aβ二聚体；

级分4含有Aβ单体到五聚体(泳道4)；以及

级分5含有Aβ单体到五聚体，以及45到160kDa的分子(泳道5)。

这些数据表明，2％SDS可将高分子量(HMW)的Aβ寡聚体解聚成Aβ单体与低分子量(LMW)Aβ寡聚体。为评估毒性Aβ1-42的尺寸分布，本发明人测定了各个级分在37℃下与PC12N培育48小时后的生物学活性。如图3B与3C所示，说明了：级分1不具毒性，级分2毒性很弱，表明Aβ单体与二聚体具有毒性的可能性不高。级分3到5具有显著的毒性(单向ANOVA；p＜0.0001)，表明神经毒性寡聚体的尺寸理论上相当于三聚体或更高分子量的聚合物。使用寡聚体特异性A11抗体进行点印迹分析发现，上述三个神经毒性级分(3到5)对A11为阳性的，这支持了神经毒性分子为寡聚性的证据(图3D)。2C3识别的寡聚体在级分4与5中检出(图3D)。从而说明2C3实际上与神经毒性Aβ寡聚体(＞30kDa)反应。进一步，大部分2C3识别的寡聚体在毒性最高的级分5(＞100kDa)中检出，因此我们认为具有超过100kDa的分子量的2C3识别的寡聚体显示强神经毒性(图3D)。同时，仅仅极少量的1A9识别的寡聚体分布于最具毒性的级分5中。这与1A9对神经毒性的中和作用不足的结果(图2E与2G)相符。与之相对的是，不具有抗神经毒性活性的单克隆4G8可检出分布于所有级分中的Aβ种类(图3D)。这表明具有相同尺寸的非毒性和毒性寡聚体共存的可能性。

为进一步评估毒性-结构之间的相关性，对每个级分进行原子力显微镜(AFM)观察。在三个呈神经毒性的级分中检出了与其级分大小一致的球状颗粒形态的存在。图3E显示非毒性级分2(Fr.2)，毒性级分3(Fr.3)和4(Fr.4)，以及最具毒性的级分5(Fr.5)的原子力显微镜图像。毒性级分中清楚可见许多颗粒多聚物分子的形成。尤其是，发现级分5除了大小不同的粒状分子外，还包括珠形、环形分子等混在的不均一的毒性分子。

实施例4

1A9和2C3阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性

接下来，本发明人评估了1A9与2C3阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。Aβ1-42淀粉样蛋白原纤维的形成(在0，10，25与50μM下)通过在37℃下测定ThT荧光72小时来评估。在本发明人使用的条件下，无种子的Aβ1-42(通过在540000xg超离心获取的ThT阴性上清级分)通过成核依赖性聚合作用聚合为淀粉样蛋白原纤维(图4A)。为评估1A9与2C3阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性，本发明人将25μM无种子的Aβ1-42在所述抗体存在或不存在的条件下在37℃下培育48小时。如图4B所示，ThT荧光强度以2C3浓度依赖性形式改变，而单克隆1A9与4G8与非特异性IgG2b均未改变荧光强度。与此同时，当通过培育两小时使Aβ聚合化时，1A9及2C3都显示几乎完全阻抑所述原纤维形成的活性(图4C)。由于即使在2C3对Aβ的摩尔比低的时候亦检出阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性，暗示2C3具有在Aβ1-42淀粉样蛋白原纤维形成的早期阶段抑制从头开始形成的聚合核或种子功能(seed function)的活性。形态学观察获得了相似的结果。如图4E(仅Aβ42)与图4F(Aβ42+2C3，25：3)所示，电子显微镜(EM)观察显示Aβ淀粉样蛋白纤维的形成在单克隆2C3的存在下受到部分抑制，而在1A9存在下仅发生微弱的抑制作用(图4G)。与此同时，所述测试抗体对于通过24小时培育而形成的Aβ1-42淀粉样蛋白原纤维均不显示裂解或解聚作用(图4D)。

实施例5

1A9与2C3靶向的毒性相关寡聚体

为说明Aβ1-42寡聚化与淀粉样蛋白原纤维形成间的结构与动力学联系，通过使用A11，1A9，2C3与4G8的点印迹分析了聚合的时间进程。如图5A所示，大部分A11抗体-反应性寡聚体在聚合作用的时滞(lag time)期(0-8小时)形成，ThT荧光强度相对较弱。在接下来的纤维延伸期(8到24小时)中，A-11免疫应答性寡聚体的水平达到平台，并然后保持恒定(大约为峰值水平的20％)直至72小时(平台期)。有人揭示，抗寡聚体A11抗体并不识别淀粉样蛋白原纤维，可使用该抗体特异性地观察Aβ寡聚体形成(Kayed R，et al.，Science 300，486-489，2003)。因此，现在的结果表明Aβ寡聚体形成发生于淀粉样蛋白原纤维形成之前，且存在一个不直接进入淀粉样蛋白原纤维形成通路的寡聚化状态。2C3识别的寡聚体与A11识别的寡聚体在动力学上类似，但与1A9识别的寡聚体的动力学不同。1A9识别的寡聚体在四个小时后方检出，随后可见1A9的免疫反应性随时间增加到两倍。这就表明1A9识别的寡聚体形成较慢。与此相对的是，揭示了2C3识别的寡聚体在时滞期(0到8小时)瞬时出现，然后在8到72小时以非常低水平的寡聚状态(少于5％)存在。由本发明人获取的上述数据表明A11-，1A9-与2C3识别寡聚体可能具有结构上和免疫学上不同的三维结构或稳定性，而且2C3识别的寡聚体较之1A9识别的寡聚体而言相对不稳定。

为鉴定所述从头合成的毒性聚合状态，将PC12N在37℃下暴露于无种子的Aβ1-42(0小时)，或经2、4或24小时预培育的Aβ1-42 48小时(图5B)，并检验其神经毒性活性。如图5B所示，使用4G8的免疫印迹分析揭示在0小时时点已经存在了单体、二聚体和三聚体。所述2或4小时的预培育导致形成除所述单体到五聚体外，还得到了45到160kDa的高分子量(HMW)弥散图形。在24小时的时点，所述HMW弥散物急骤减少，且形成了两类主要组分：无法进入凝胶而残留于孔中高分子量种类，与少量单体。所述HMW弥散物在进一步在37℃下培育48小时后消失。如图3A与5C所示，分子筛实验揭示，无种子的Aβ1-42被转化为100kDa或更大的分子种类，并显示最强的毒性。在SDS-PAGE上显示，所述毒性分子除所述单体到五聚体种类外，亦包括呈现45到160kDa的高分子量(HMW)弥散图形的分子种类，且这些毒性多聚物在SDS的存在下可容易地解离为低分子量种类。然而当将无种子的Aβ1-42预培育2小时、4小时与24小时时，从头开始形成的Aβ寡聚体的神经毒性活性分别减少了约12.5％与26％(图5C)。该结果表明在Aβ聚合作用早期阶段从头开始形成的Aβ寡聚体水平为神经毒性的决定性因素，且所述形成在0-2小时的期间内达到峰值，然后随着时间推移形成的Aβ寡聚体水平降低。或者，也存在这样的可能，即Aβ淀粉样蛋白原纤维的从头开始聚合的核，或淀粉样蛋白原纤维自身，具有中和神经毒性的效果。本发明人培育Aβ1-42两小时，然后通过在540000xg下超离心3小时移除不可溶的Aβ聚合核与淀粉样蛋白原纤维。在540000xg下超离心所得的上清与沉淀展示相似水平的硫代黄素T信号，提示540000xg上清中也含有可溶性ThT阳性可溶性Aβ聚合体(ThT结合指示的是形成富含β片层的结构变化，而不是原纤维形成)。当将该可溶性聚合体暴露于PC12N时，所述神经毒性恢复且增强(图5D)。这表明不可溶的Aβ1-42自身具有抗毒性活性。在上述状况下，单克隆1A9完全中和了由富含β片层结构的可溶性Aβ寡聚体诱导的神经毒性，且该中和活性较之2C3的为高。与此同时，非特异性的IgG2b自身对培养PC12N的生存无影响。由此推测，具有神经毒性的由1A9识别的多聚体基本上为可溶性毒性寡聚体，其由于一些结构变化而略微被稳定化，而具有神经毒性的由2C3识别的多聚体基本上为短命的寡聚中间体，它们由于在聚合过程早期中巨大的结构变化而非常地不稳定。

实施例6

单克隆1A9与2C3在脑实质中识别Aβ寡聚体

本发明人实证了1A9与2C3的特异性与生物学活性。进一步，本发明人通过免疫组织化学在脑中检测1A9与2C3多聚体。本发明人实施了常规免疫组织化学方法以通过甲醛固定，以及甲酸，SDS或微波处理脑切片以增强免疫反应。使用这些增强方法都没有使所述两个抗体展示任何针对AD脑的免疫反应性。从而，本发明人用蛋白酶K预处理所述切片，该酶已知可改善免疫染色(Wrzolek MA，et al.，Am J Pathol，141：343-355，1992)。其结果，许多老年斑被1A9(图6A)，2C3(图6B)与A11(图6C)所染色。与本发明人进行的体外实验获得的发现，即Aβ淀粉样蛋白原纤维可中和Aβ寡聚体诱导的神经毒性结合起来看，上述结果提示老年斑充当隔离并储藏Aβ寡聚体的防御性仓库，因此抗体难以到达该仓库的内部。确实，使用1A9与2C3的免疫沉淀确认，由老年斑构成的淀粉样蛋白级分中含有由所述两种抗体识别的Aβ寡聚体。从而，证明了本发明人的假说与体内证据一致(参见图1B)。

为进一步评估“可溶性”的由1A9-与2C3-识别的多聚体在脑内的存在，本发明人使用所述两种抗体进行了免疫沉淀实验。使用Tris缓冲盐水(TBS)制备脑匀浆以避免在提取可溶性寡聚体过程中的化学修饰。用1A9从来自AD脑大脑皮层的TBS试样中免疫沉淀出了具有四聚体，五聚体，八聚体与十二聚体分子量的寡聚体(图6D，泳道2)，而在对照健康脑中所述寡聚体的水平低于检测限(泳道3)。四聚体，五聚体与八聚体的强度虽在1A9(泳道2)与单克隆4G8/6E10混合物(泳道1)间相似，1A9似较之4G8/6E10回收了较多量的十二聚体。用2C3进行的免疫沉淀显示了相似的结果(图6，第4-6道)。然后，本发明人鉴定了在人类内嗅皮质中导致体内神经毒性的分子。众所周知在一般高龄人群中，该病变中神经元纤维缠结(NFT)与神经细胞丧失发生于老年斑形成之前。本发明人提出这样的假说，即针对1A9与2C3识别的多聚体而言起作用的仓库(例如老年斑)的缺乏对内嗅皮层神经元是有害的，而且是记忆紊乱的可能原因。通过使用单克隆1A9与2C3的免疫印迹确定了之前报道的50个尸体剖检病例中可溶于缓冲液的级分中的十二聚体水平。所述50个病例包括两个AD病例，35个Braak NFT I到II期的病例与13个NFT III到IV期的病例(Katsuno et al.，Neurology，64：687-692，2005)。如图6E(1A9)与6F(2C3)所示，1A9或2C3免疫反应性十二聚体相对于肌动蛋白的免疫活性在AD患者中较之健康对照组(Braak NFT I到II期)与轻度认知障碍组(Braak NFT III到IV期)显著为高。有趣的是，所述十二聚体在健康对照组(Braak NFT I到II期)与轻度认知障碍组(Braak NFT III到IV期)的内嗅皮质中分别以约40％与60％的水平积聚(AD病例的水平为100％)(图6E与6F)。该结果表明12聚体的积聚发生于认知障碍病发之前，且随Braak NFT分期的推进而增加，暗示1A9与2C3免疫反应性十二聚体是导致体内神经毒性的聚合体。

实施例7

单克隆1A9与2C3在脑脊液中识别Aβ寡聚体

导致体内神经毒性的Aβ多聚体(可溶性1A9与2C3免疫反应性十二聚体)在脑实质中被发现。据此，本发明人推测，CSF亦含有所述多聚体。为证实这一点，本发明人将自十个AD患者与作为对照的十个年龄匹配的健康个体汇集的CSF通过SEC进行分级分离，并通过Aβ寡聚体特异性夹心ELISA对这些级分进行分析，其中在捕获与检测系统中使用单克隆BC05或BA27。BC05/BC05寡聚体ELISA在级分13中检测出可溶性Aβ1-42，而BA27/BA27 ELISA在级分7-14中检测出可溶性Aβ1-40(数据未显示)。然而，在每个ELISA中，吸光度(450nm处的O.D.)过低以致无法敏感地检出CSF中的少量Aβ寡聚体。在相同级分中通过BNT77 ELISA检测出Aβ单体，显示结合有脂蛋白的Aβ单体(级分7到14)与无脂蛋白的Aβ单体(级分15到17)在所述级分中与Aβ寡聚体共存(图7-1A与7-1B)(Matsubara E，et al.，Neurobiol Aging，25：833-841，2004)。在AD中结合有脂蛋白的Aβ单体的水平与健康对照相似，而在AD中无脂蛋白的Aβ-40单体(图7-1A)与Aβ42单体(图7-1B)较之年龄匹配的健康对照为低。本发明人亦发现在将ELISA设计为使用HRP标记的BC05或BA27作为捕获抗体时，除所述寡聚体外，与脂蛋白结合的Aβ单体可被检出。该问题在现有技术文献中未被注意(Lee EB，et al.，J Biol Chem，281：4292-4299，2006)，后者描述了与本文所述方法相似的分析方法(例如，6E10/6E10 ELISA)。因为所述寡聚体和与脂蛋白结合的Aβ单体在SEC中洗脱的保留时间相似，无法利用与在捕获与检测中使用的抗体相同的抗体通过寡聚体ELISA对它们进行区分。从而可知，在使用Aβ寡聚体-非选择性抗体分析Aβ寡聚体时，含脂蛋白的CSF不适于用作测试试样。

为克服这些现有技术方法的缺点，本发明人改进了用于ELISA的检测抗体与试样。预先CSF中去除脂蛋白，将所得的去除了脂蛋白的CSF(LPD-CSF)用作测定试样。Aβ寡聚体特异性1A9与2C3用作ELISA的检测抗体。进一步，建立了化学发光ELISA以增强敏感度。将汇集的LPD-CSF(图7-1C到D)通过SEC分级分离，且对于每一级分通过化学发光ELISA分析其Aβ寡聚体分布，其中使用1A9或2C3作为检测抗体。如图7-1C到D所示，Aβ寡聚体在SEC级分12到15(相对较大的Aβ，其分子量范围为18到108kDa，其对应于四聚体到二十四聚体的尺寸)中被检出。在所有AD患者来源的可检出寡聚体的级分中，1A9与2C3识别的寡聚体水平均变高。为评估所述Aβ寡聚体作为治疗标志的有用性，对来自AD患者LPD-CSF中与来自年龄匹配健康对照中的Aβ寡聚体水平进行比较，尽管仅分析了少数病例。如图7-2G所示，由Aβx-42组成的由2C3识别的寡聚体在AD患者组中较之正常对照组显著增加(非参数分析；p＝0.0103)。与之相对，对于由Aβx-42组成的由2C3识别的寡聚体，在所述两组间并无显著差异。另一方面，由Aβx-42组成的由1A9识别的寡聚体的水平在AD中较之在对照中为高，尽管该差异在统计上并非显著。对于由Aβx-40组成的由1A9识别的寡聚体，两组之间并无显著差异(图7-2E)。自Aβ单体变为寡聚体的结构变化发生在Aβ聚合过程的最早阶段。Aβ寡聚体与单体间的比例(O/M指数)可用作反映AD病理特征的临床指标。如图7-2F与7-2H所示，Aβ42与Aβ40的O/M指数在AD患者组中较之健康对照组均有显著提高(1A9，对Aβ42为p＝0.0137，而对Aβ40为p＝0.0429；2C3，对Aβ42为p＝0.0012而对Aβ4-0为p＝0.0051)。上述结果显示1A9与2C3阳性的三维结构以Aβ寡聚体的形式存在于LPD-CSF中，且在AD患者中增加。此外，本发明人获取的结果说明，AD患者的CSF中发生着从不带脂蛋白的可溶性Aβ到寡聚中间体的结构转换，且所述寡聚体可作为有用于诊断散发性AD的生物学标志加以检测。

实施例8

使用单克隆1A9与2C3的被动免疫疗法阻止在Tg2576中记忆紊乱的发病

为评估基于1A9(n＝13)或2C3(n＝11)给药的被动免疫疗法的体内预防/治疗效果，本发明人将1A9或2C3(0.4mg/kg/周)或PBS通过尾静脉在4到13个月龄期间施用于Tg2576小鼠。对13个月龄时的记忆功能以以下四种类型的学习/行为范式加以评估：

(1)Y迷宫测试中的短期记忆(图8A)；

(2)新物体识别测试中的物体认识记忆(图8B)；

(3)水迷宫测试中的空间记忆(图8C)；以及

(4)附线索的恐惧条件测试中的联想情感记忆(图8D)。

较之给药1A9与2C3的Tg2576小鼠，给药PBS的Tg2576小鼠显示显著的学习与行为障碍(图8A到8D)。与给药PBS的Tg2576小鼠(n＝10)的记忆功能不同，给药1A9或2C3的Tg2576小鼠的记忆功能与之前测得的年龄匹配的无给药野生型组小鼠的记忆功能之间不能区分。由此可见，施用1A9或2C3的Tg2576小鼠保持了短期与长期记忆，而在PBS施用组中短期与长期记忆受损。亦即，发明人获得了支持下述观点的证据，即如果在记忆紊乱发病之前进行靶向Aβ寡聚体的被动免疫疗法，可能预防记忆紊乱发病，特别是AD发病。进一步，上述结果是直接指明Aβ寡聚体是负责记忆障碍发病的分子的首个体内证据。

实施例9

单克隆1A9在Tg2576的脑中阻止Aβ积聚

对经施用PBS的Tg2576小鼠(n＝10)与在4到13月龄期间经被动免疫疗法处理的Tg2576小鼠(1A9给药组，n＝13；2C3给药组，n＝11)在所述学习/行为实验后进行解剖。测定下述三个通过连续提取制备的级分(每个提取物150mg)中积聚于脑中(大脑皮层：海马)的Aβ量：可溶于含蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液中的性级分；可溶于2％SDS的淀粉样蛋白级分；以及不可溶于2％SDS-但可溶于70％甲酸的淀粉样蛋白级分。我们认为，Tris缓冲液级分中包含非积聚性的生理性Aβ分子，而2％SDS可溶性Aβ中包含在淀粉样蛋白原纤维形成之前的散在老年斑中、免疫细胞化学上无法检出的Aβ、以及经过三维结构变化的、积聚性的可溶性寡聚Aβ。利用Aβ40-与Aβ42末端特异性ELISA(特异于Aβ40的BNT77/BA27，特异于Aβ42的BNT77/BC05，WAKO试剂盒)选择性地对Aβ进行定量。主要组分为非积聚性生理性Aβ分子的Tris缓冲液级分中的Aβ浓度在这三组之间并无显著差别(图9A与9C，Aβx-40；图9B与9D，Aβx-42)。至于积聚在脑中的可溶性Aβ(SDS级分)，仅于1A9给药组中确认了显著的针对Aβx-40和Aβx-42在大脑皮层中积聚的阻抑作用(图9E，Aβx-40；图9F，Aβx-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用(图9G，Aβx-40；图9H，Aβx-42)。与此同时，关于积聚在脑中的不可溶Aβ(FA级分)，仅于1A9给药组中观察到了显著的针对Aβx-40在大脑皮层中积聚的阻抑作用(图9I，Aβx-40；图9J，Aβx-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用(图9K，Aβx-40；图9L，Aβx-42)。对SDS可溶性级分的A11免疫印迹分析显示在所述两个抗体处理组中对大脑皮层中A-11阳性寡聚体(四聚体)积聚的阻抑作用(图9M)。

实施例10

用1A9与2C3的被动免疫疗法增加血浆Aβ寡聚体

下列三组间在血浆Aβ浓度方面并无显著差异：施用PBS的Tg2576小鼠(n＝10)，以及在4到13月龄期间经被动免疫疗法处理的Tg2576小鼠(1A9给药组，n＝13；2C3给药组，n＝11)(图10A，Aβx-40；图10B，Aβx-42)。Aβ40/42比例亦无显著差异(图10C)。

为了说明在Tg2576小鼠中使用1A9与2C3(IVIg)的被动免疫疗法针对AD样表型的预防作用背后隐藏的机理，本发明人在汇集的脑匀浆中评估了可溶于与不可溶于生理盐水的Aβ寡聚体的水平，以及在外周血与血浆中Aβ寡聚体的水平。汇集的脑匀浆中可溶于生理盐水的Aβ寡聚体的量在各处理组之间并无差异(图10D)，同时，发现不可溶Aβ寡聚体的量在1A9与2C3处理组中有所减少(图10E)。进一步，对各处理组内汇集的血浆(除去白蛋白的血浆，小图F上段；除去白蛋白/脂蛋白的血浆，小图F的下段)通过A11点印迹分析其所含的Aβ寡聚体。其结果显示来自给药PBS的Tg2576小鼠的血浆中存在所述寡聚体(图10F)。在被动免疫治疗组中，血浆中的A11-阳性寡聚体较之PBS给药组清楚地增加(图10F)。2C3识别的寡聚体以脂蛋白结合形式存在的比例较之1A9识别的寡聚体为高(小图F的下段)。进一步，通过A11免疫沉淀检测血浆Aβ寡聚体。结果发现，与PBS给药组相比，接受被动免疫治疗的Tg2576小鼠中约200kDa的寡聚体发生了增加(图10G)。血浆Aβ寡聚体在被动免疫治疗组中的这种增加可视为直接反映了脑内清除(cerebral clearance)的增加。从而，本发明人获得了下述证据，即静脉内被动免疫疗法的直接靶分子不但存在于脑中，亦存在于血液中，可通过在外周位点的作用来增强针对寡聚体的选择性脑内清除。亦即，本发明人显示了静脉内被动免疫疗法在临床上的有用性。

实施例11

使用1A9与2C3的被动免疫疗法可阻抑淀粉样蛋白老年斑与肿大变性神经突形成

在被动免疫疗法组中免疫组织化学Aβ沉着受阻抑(图11A)。硫代黄素S染色阳性老年斑淀粉样蛋白数在大脑皮层与海马中均显著受阻抑(图11B，上段)；组织化学也明确显示了该减少(图11B，下段)。在被动免疫治疗组中突触泡蛋白阳性肿大变性神经突形成亦显著被阻抑(图11C)。

实施例12

使用抗突触泡蛋白或抗脑发育调节蛋白抗体的免疫染色分析

1A9与2C3在大脑新皮质中阻抑了突触前与突触后变性(图12)。

实施例13

抗体的脑内移行

使用共焦聚激光显微镜评估了Aβ沉着与脑内小鼠IgG的存在/定位。其结果显示，小鼠IgG以几乎与沉着Aβ定位无关的方式定位在散在性老年斑存在的区域中。小鼠IgG仅见于被动免疫疗法组(1A9，图13A；2C3，图13B)中，但非PBS给药组(图13C)中。由此我们认为，施用于血液的抗体中一部分转移到了脑中。该结果显示：预防记忆障碍的作用的不但是通过转移到脑内的抗体直接中和可溶性Aβ多聚体的毒性，而且还通过可溶性Aβ多聚体以与所述抗体的复合物的形式被清除到血中来实现。因而认为其治疗系基于复合作用机制。

实施例14

Aβ寡聚体特异性单克隆抗体(5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4)的制备和点印迹分析

通过如上所述方法使用Aβ寡聚体作为抗原而制备的33个克隆通过点印迹分析进行评估。结果显示所述六种类型的单克隆抗体特异性地识别Aβ寡聚体。如下所示，确定了所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)的同种型：

4F7：L链为κ，H链为IgG2a；

4H5：L链为κ，H链为IgG2a；

5A5：L链为κ，H链为IgG2b；

5A9：L链为κ，H链为IgG2b；

6E4：L链为κ，H链为IgG1；

6H4：L链为κ，H链为IgG2b。

进一步，免疫点印迹分析显示，与如上所述的2C3一样，4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4抗体特异性地结合Aβ寡聚体但不识别Aβ单体(参见图14)。

实施例15

抑制性ELISA

为了衡量所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)的Aβ寡聚体选择性结合活性，将每种抗体与逐步稀释的Aβ寡聚体或单体(“抑制剂”)混合，并将预先混合好的溶液添加至固定化了Aβ寡聚体的96孔免疫板，然后温育(参见“方法”部分)。用可市购的4G8和6E10抗体作为非选择性结合Aβ寡聚体和单体的对照抗体。当抗体选择性结合Aβ寡聚体时，预先与Aβ单体混合的该抗体并不在溶液中结合Aβ单体，因此可结合固定化的Aβ寡聚体。另一方面，预先与Aβ寡聚体混合的抗体在溶液中与该Aβ寡聚体结合，并因此随着抑制剂浓度的增加，结合于固定化Aβ寡聚体的抗体的量减少。所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)的结果显示，当使用Aβ单体时，结合型抗体的量发生浓度依赖性的降低(参见图15)。与此相对照的是，对于4G8和6E10，当使用Aβ单体和寡聚体时，观察到结合型抗体的量的浓度依赖性降低(参见图15)。这些结果表明所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)选择性地结合Aβ寡聚体。

实施例16

所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)中和Aβ诱导神经毒性的活性

为了评估所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)是否具有中和Aβ诱导的神经毒性的活性，将人类成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)在存在或不存在所述抗体的情况下在含有Aβ1-42(12.5μM)的培养基中培养，并监视Aβ1-42诱导的细胞毒性的变化。其结果，对照IgG(3F1)的添加增强了细胞毒性。尽管4F7和4H5抗体的添加亦增加了细胞毒性，但其增加比3F1所观察到的增加要小(参见图16)。发现其余四类抗体(5A5、5A9、6E4和6H4)可显著地减少细胞毒性(参见图16)。如上所述的结果说明所述四类抗体(5A5、5A9、6E4和6H4)具有强烈的中和Aβ诱导的神经毒性的活性。由于4F7和4H5较之对照IgG降低了细胞毒性，亦推断这些抗体具有中和Aβ诱导的神经毒性的活性。

实施例17

所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性

为了评价所述所述六种类型的抗体(4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4)是否具有阻抑Aβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性，通过ThT荧光强度分析来检测与在Aβ诱导神经毒性实验(参见“方法”部分)中所用的溶液组成相同的溶液(培养基)中的Aβ淀粉样蛋白原纤维的形成。发现6E4和6H4以抗体浓度依赖性的方式阻抑纤维的形成(参见图17)。由于其他四种抗体(4F7、4H5、5A5和5A9)较之对照IgG显示阻抑纤维形成的倾向，亦推断这些抗体具有阻抑纤维形成的活性。

讨论

本发明人所得的数据显示单克隆1A9与2C3特异性地识别负责毒性活性与抗原纤维形成活性的可溶性Aβ多聚体的“神经毒性表位”与“聚合作用表位”。因为单克隆1A9与2C3不与属于生理性分子的可溶性Aβ单体反应，可得出下述结论，即具有由1A9或2C3识别的表位的三维结构是可溶性寡聚多聚体特有的。使用超滤与分子筛的实验揭示，1A9-和2C3-免疫反应性寡聚体的尺寸大于100kDa(＞20聚体)。通过AFM的形态学观察结果说明毒性多聚体在形态学上为异质的(颗粒状，珠形与环形)。

为证实所述毒性多聚体实际上为展示体内突触毒性的生物活性分子，本发明人对幼Tg2576小鼠在其记忆障碍发生之前用靶向1A9与2C3识别的毒性多聚体的抗Aβ寡聚体被动免疫疗法进行处理。本发明人首次提出了支持下述结论的证据，即通过使用抗Aβ寡聚体特异性抗体(1A9与2C3)的被动免疫疗法可以预防在Tg2576小鼠中天然发生的年龄依赖性记忆恶化。在本文中，通过Y迷宫测试评估的短期记忆障碍类似于在轻度认知障碍(MCI)与早期AD中观察到的与Aβ积聚相关的记忆障碍。对分别给药1A9与2C3后的Tg2576小鼠，所述Y-迷宫测试显示良好的、几乎正常的结果。当通过新物体识别任务，Morris水迷宫与附线索的恐惧条件任务评估时，所述抗Aβ寡聚体抗体使得长期记忆保持近乎正常。

较之PBS处理组，抗体处理的小鼠组中见到了血液中A11阳性寡聚体的选择性增加，该现象与该抗体预防记忆障碍发病的能力(记忆保持能力)相一致。1A9抗体处理亦展示了阻抑大脑Aβ积聚的作用。2C3抗体处理显示了较之1A9抗体处理更高的血液A-11阳性寡聚体水平。然而2C3抗体处理的大脑Aβ积聚阻抑功能并不清楚。因此，我们认为1A9识别的寡聚体较之2C3识别的寡聚体对大脑Aβ积聚具有更大的贡献。所述多聚体在大脑Aβ积聚中所起的作用可基于下述假定加以解释：神经毒性1A9多聚体是构象较为稳定的可溶性有毒寡聚体，而神经毒性2C3多聚体为非常不稳定、短命的寡聚中间体，其出现于聚合过程的早期阶段，其构象非常易于变化。

本发明人在本文中公开了抗寡聚体抗体对阿尔茨海默氏病的体内预防作用，这是第一个直接证明体内形成的毒性Aβ寡聚体能抑制神经细胞的功能，由此诱导阿尔茨海默氏病的症状的证据。

本发明人获取的数据也是支持Aβ在人脑中展示体内神经毒性这一观点的第一个证据。众所周知人类内嗅皮层为易受AD影响的区域。在此区域内，NFT形成与神经细胞丧失发生于老年斑形成之前。因此，内嗅皮层是被普遍接受的淀粉样蛋白级联假说无法适用的一个例外区域。然而该矛盾长期以来受人忽略，无人研究。

本发明人提出并检验了下述假说，即迄今为止未被鉴定的、不可见的Aβ寡聚体对内嗅皮质中的神经细胞有害，并可导致记忆障碍。为检验该假说，本发明人针对大多为Braak NFT I到III期的高龄人半定量地分析了他们内嗅皮层中的1A9与2C3免疫反应性十二聚体。1A9-与2C3-免疫反应性12聚体在Braak NFT I到II期的健康个体的内嗅皮质中已经存在，且随着Braak NFT分期的进展而增加。在AD中发现所述12聚体显著增加。从而说明，人脑中1A9-与2C3-免疫反应性12聚体的出现发生于认知障碍发病之前。另一方面，通过生物化学与免疫组织化学技术，证明了老年斑含有1A9-与2C3-免疫反应性Aβ寡聚体。而且，揭示了不溶化的淀粉样蛋白原纤维自身具有中和神经毒性的活性。这些发现表明，当存在Aβ寡聚体但无老年斑形成时，Aβ寡聚体发挥体内毒性，从而可成为记忆障碍的原因。

如上所述，本发明人的数据首次提出了内源Aβ寡聚体造成的突触功能障碍导致记忆障碍的直接体内证据。尽管之前使用过主动免疫疗法(Janus D，2000，Nature；Morgan D，2000，Nature)与被动免疫疗法(Bard F，2222，Nat med；DeMattos RB，PNAS，2001)，如何阻止学习能力丧失与记忆障碍的机理仍然仅为猜测。一个广泛提出的可能性是所述抗体通过血脑屏障到达脑部，并在体内直接中和导致记忆障碍的可溶性Aβ寡聚体。另一种可能性，即所谓“水槽理论(sink theory)”，认为所述抗体在外周起作用从而耗尽外周血Aβ池，并从而激活Aβ自脑中的清除。DeMattos等人报道外周施用的抗Aβ抗体不仅快速运输大脑Aβ单体，且亦运输Aβ二聚体进入血浆，并亦将脑Aβ运输入CSF(DeMattos RB et al.，PNAS，98；8850-8855，2001)。本发明人亦揭示Aβ寡聚体存在于人类CSF中，且在AD患者中增加。从而本发明人证明了Aβ寡聚体可用作AD的诊断标记。进一步，本发明人首次提供了支持下述观点的证据，即Aβ寡聚体存在于Tg2586小鼠的血浆中，并且，在通过静脉注射特异性捕获并中和Aβ寡聚体的被动免疫疗法中，无需向脑内递送抗体，而且在外周位点，即血管，可增强Aβ寡聚体从脑到血液中的清除。此外，本发明人首次提出了下述证据，即被动免疫疗法可阻抑老年淀粉样蛋白斑形成，而且可通过阻抑老年淀粉样蛋白斑间接阻抑神经细胞损伤(肿大变性的神经突形成)。这些结果确证所述Aβ寡聚体为阿尔茨海默氏病发病的分子基础，且使用寡聚体特异性抗体的选择性控制使人们不但可能从治疗性的视点控制阿尔茨海默氏病，从预防性的视点控制阿尔茨海默氏病也成为可能。进一步，我们证实了所施用抗体的一部分转移入脑部。这提示阻抑记忆障碍的效果是多种作用联合施加的，这些作用例如对脑中可溶性Aβ寡聚体的直接中和，通过新生Fc受体将抗体-Aβ寡聚体免疫复合物运输到血液中(Deane R，2005，J Neurosci)，以及上述“水槽”作用。

建立准确的发病前诊断以识别具有罹患AD高风险的病例对涉及预防/治疗策略而言非常重要。本文所报道的在AD中CSF中O/M比例的显著增加，期望其为发病前诊断标志的有力候选。

产业应用性

本发明所提供的抗体可用于，例如，对阿尔茨海默氏病基于静脉内注射的预防性被动免疫治疗，并作为对该疾病发病前诊断，疾病监视，药物功效监视/评价等的生物学标志。

进一步，本发明所述的抗体对于人们建立选择性针对引发阿尔茨海默氏病病理状况的责任分子的阿尔茨海默氏病预防/治疗方法，以及建立早期诊断标志，都有望作出很大的贡献。本发明人获取了支持下述结论的证据：抗体疗法，即使其以脑内病理学状况为靶标，亦可令人满意地通过外周静脉内给药来达成，而无需考虑所述抗体的脑内转移。此外，本发明人获得了证据显示：即使在外周静脉内给药疗法中，被施用的抗体的一部分转移到脑内，并产生直接效应，同样无需考虑所述抗体的脑内转移。从而，本发明可望大大加快阿尔茨海默氏病抗体疗法的进展。

Claims

1.一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的L链的抗体。

2.一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的L链的抗体。

3.一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的L链的抗体。

4.一种结合Aβ寡聚体的抗体，该Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的L链的抗体。

5.一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的L链的抗体。

6.一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合于包含具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的L链的抗体。

7.下述(1)到(38)中任一项的抗体：

(3)一种抗体，其包含(1)的H链和(2)的L链；

(6)一种抗体，其包含(4)的H链和(5)的L链；

(9)一种抗体，其包含(7)的H链和(8)的L链；

(12)一种抗体，其包含(10)的H链和(11)的L链；

(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：57的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：59的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(15)一种抗体，其包含(13)的H链和(14)的L链；

(18)一种抗体，其包含(16)的H链和(17)的L链；

(21)一种抗体，其包含(19)的H链和(20)的L链；

(24)一种抗体，其包含(22)的H链和(23)的L链；

(27)一种抗体，其包含(25)的H链和(26)的L链；

(30)一种抗体，其包含(28)的H链和(29)的L链；

(31)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：111的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：113的氨基酸序列作为CDR3的H链；

(32)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO：117的氨基酸序列作为CDR2，以及SEQ ID NO：119的氨基酸序列作为CDR3的L链；

(33)一种抗体，其包含(31)的H链和(32)的L链；

(36)一种抗体，其包含(34)的H链和(35)的L链；

(37)一种抗体，其是在(1)到(36)中任一项的抗体中替换，缺失，添加和/或插入一个或多个氨基酸而得到的，并具有与所述(1)到(36)中任一项的抗体等价的活性；以及

8.权利要求7所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。

9.一种组合物，其包含权利要求1到8任一项所述的抗体和药用载体。

10.一种抗认知障碍剂，其包含权利要求1到8任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

11.一种阿尔茨海默氏病治疗剂，其包含权利要求1到8任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

12.一种阿尔茨海默氏病进展阻抑剂，其包含权利要求1到8中任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

13.一种老年斑形成阻抑剂，其包含权利要求1到8任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

14.一种Aβ积聚阻抑剂，其包含权利要求1到8中任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

15.一种抗神经毒性剂，其包含权利要求1到8中任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

16.一种Aβ淀粉状蛋白纤维形成抑制剂，其包含权利要求1到8中任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

17.一种抗突触毒性剂，其包含权利要求1到8中任一项所述的抗体或权利要求9的组合物作为活性成分。

18.一种检测Aβ寡聚体的方法，其包括使用权利要求1到8中任一项所述的抗体检测从受试者收集的试样中所含的Aβ寡聚体的步骤。

19.一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括使用权利要求1到8中任一项所述的抗体检测从受试者收集的试样中的Aβ寡聚体。

20.一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：

(a)将从受试者收集的试样与权利要求1到8中任一项所述的抗体接触；和

(b)测量所述试样中Aβ寡聚体的量，

其中当步骤(b)中测得的量大于健康个体的量时，确定所述受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者。

21.一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：

(a)将从受试者收集的试样与权利要求1到8中任一项所述的抗体以及可结合Aβ单体的抗体接触；以及

(b)测量所述试样中Aβ寡聚体对Aβ单体的比例，

其中当步骤(b)中测得的比例大于健康个体的比例时，确定所述受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者。

22.权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述试样为血液或脑脊液。

23.一种用于权利要求18到21中任一项所述的方法的药剂。

24.一种用于权利要求18到21中任一项所述的方法的试剂盒。