CN107118260B - 一种多肽及其组成的疫苗和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽及其组成的疫苗和应用，所述的多肽包含(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：(a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(b)具有所述多肽功能的对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。本发明多肽为Aβ42寡聚体的构象模拟表位，其免疫产生的抗体能够特异性的靶向致病性的Aβ寡聚体，而不与Aβ单体及APP蛋白结合，能够有效地减少Aβ疫苗的自身免疫问题，具有较好的治疗AD前景。

Description

一种多肽及其组成的疫苗和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多肽，尤其涉及一种多肽及其组成的疫苗和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种严重威胁老年人生命健康的以记忆力下降为特征的神经退行性疾病，脑内病理特征主要表现为由β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在神经元细胞外形成的老年斑和由Tau蛋白在神经元细胞内形成的神经纤维缠结。据统计，截止到2015年底，全世界共有4600多万痴呆病人，预计到2050年这一数字会增长至1亿3千万。随着全球性的人口老龄化，AD的发病率及患病人数近年来呈现递增趋势。然而，目前尚无特异性治疗AD的药物，因此研发能够有效防治AD的药物异常迫切。
研究表明，由Aβ单体聚集成的寡聚体是AD发生的初始诱因，Aβ寡聚体可诱发一系列毒性级联反应，包括诱发Tau蛋白的聚集等，最终导致AD的发生。Aβ是由其前体蛋白APP经顺序性酶切而产生的多肽片段，APP及Aβ单体具有正常的生理功能，能够抑制神经突触的过度活化而减少突触兴奋性毒性产生。只有当各种因素导致Aβ产生和清除之间不平衡，导致Aβ累积后发生聚集，形成Aβ寡聚体，便会引发一系列不可逆转的AD病理变化。
因此，靶向Aβ的药物可能是治疗AD的突破口。其中，利用Aβ疫苗的免疫治疗发展迅速。目前已有多种Aβ疫苗经历过治疗AD的临床试验，包括AN1792，CAD106，ACC001，UB311，Affitope AD02等。这些Aβ疫苗在临床前动物实验阶段都表现出良好的治疗效果，能够减少老年斑形成并改善动物认知水平。但在AD临床试验中由于严重的副作用或者治疗效果欠佳，至今仍没有一种疫苗或者抗体通过III期临床试验。AN1792是由合成的人源Aβ1-42多肽在体外聚集而成，使用QS-21作为免疫佐剂，在临床II期试验中由于引发了严重的脑膜炎等副作用而被迫终止临床试验。随后分析表明，Aβ42本身携带的T细胞表位引发的T细胞反应是引发脑膜炎的主要原因。随后，CAD106，ACC001，UB311，Affitope AD02等第二代Aβ疫苗在设计时主要是以Aβ42N端的B细胞表位片段作为半抗原偶联至载体，制备疫苗。它们的特点是去除了Aβ42的T细胞表位区，从而减少Aβ导致的T细胞活化，以达到减少炎症反应的效果。
但是，系统的分析可以发现，目前所研发的Aβ疫苗都不是特异性地针对致病性的Aβ寡聚体。以Aβ全长或者Aβ的N端B细胞表位区制备的疫苗免疫产生的抗体可同时结合Aβ单体、寡聚体和纤维以及APP。这或许降低有限的抗体靶向寡聚体的能力。再者，靶向具有正常生理功能的Aβ和APP可导致副作用的发生，这种副作用可部分或全部抵消抗体或疫苗的治疗作用。
基于以上分析，如何找到一种能够特异针对致病性Aβ寡聚体的疫苗可能起到较好的治疗AD的作用是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽及其组成的疫苗和应用，该多肽为Aβ42寡聚体的构象模拟表位，其免疫产生的抗体能够特异性的靶向致病性的Aβ寡聚体，而不与Aβ单体及APP蛋白结合，能够有效地减少Aβ疫苗的自身免疫问题，具有较好的治疗AD前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有所述多肽功能的对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：Arg-Pro-Asp-Gln-Val-Met-Trp-Asp-Ser-Lys-Arg-Pro。
本发明中，所述的变体为具有和SEQ ID NO.1所述多肽相同的功能，够特异性地识别Aβ寡聚体，而不识别Aβ单体和纤维及APP蛋白，示例性地，所述突变体可以为所述多肽序列中的赖氨酸残基和精氨酸残基中的一个或多个突变为其他带正电的氨基酸残基所获得的变体。
根据本发明，所述多肽有多个拷贝数的时候也具有所述单个拷贝数的功能，所述多肽的拷贝数为1-10，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，优选为1-7。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码第一方面所述多肽的核酸序列。
第三方面，本发明提供一种重组质粒，所述重组质粒包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
根据本发明，所述重组质粒为pCTCON2载体。
第四方面，本发明提供一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含第三方面所述的重组载体。
根据本发明，所述重组酵母细胞为EBY100酿酒酵母细胞。
发明人发现，本发明所述多肽只有以酿酒酵母为载体才可以让所述多肽的功能得以实现，采用别的大肠杆菌或是别的重组细胞不能实现所述多肽的功能，不仅如此，本发明采用EBY100酿酒酵母细胞作为载体，可以最大程度的发挥多肽的功能，所述EBY100酿酒酵母细胞与所述多肽能够协同增效，进一步提高多肽的功效。
第五方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组酵母细胞中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述疫苗还包括药学上接受的辅料。
优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述疫苗在制备治疗阿尔茨海默病(AD)的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述多肽通过pCTCON2载体表达在EBY100酿酒酵母细胞后并展示在细胞表面制备的全酵母疫苗免疫阿尔茨海默病模型小鼠(APP/PS1小鼠)，能够刺激机体产生抗Aβ42寡聚体的抗体，并且这些抗体不与Aβ42单体结合，与Aβ42纤维结合较弱；
(2)本发明所述多肽明显降低小鼠脑内的老年斑和Aβ水平，尤其是Aβ42寡聚体水平，降低小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，改善AD小鼠的认知功能损伤，并且不诱发Aβ42特异性的T细胞活化和脑部微出血现象的发生；
(3)本发明多肽为Aβ42寡聚体的构象模拟表位，其免疫产生的抗体能够特异性的靶向致病性的Aβ寡聚体，而不与Aβ单体及APP蛋白结合，能够有效地减少Aβ疫苗的自身免疫问题，具有较好的治疗AD前景。
附图说明
图1为AOE1表位多肽的表达与展示，其中，图1(A)流式细胞仪分析检测EBY100酵母展示表位多肽情况，图1(B)激光共聚焦显微镜分析检测EBY100酵母展示表位多肽情况；
图2为AOE1疫苗免疫APP/PS1小鼠后抗体水平分析，其中，图2(A)AOE1免疫APP/PS1小鼠血清中抗表位多肽IgG滴度动力学，图2(B)抗Aβ42寡聚体IgG滴度动力学，图2(C)AOE1免疫APP/PS1血清中抗Aβ寡聚体IgG亚型分析；
图3为AOE1免疫抗体与不同聚集状态Aβ的结合特性分析，其中，图3(A)ELISA验证AOE1免疫抗体与不同聚集状态Aβ的结合，图3(B)Dot-blot检测AOE1免疫抗体与不同聚集状态的Aβ结合，图3(C)Western-blot检测AOE1免疫抗体与Aβ的结合，图3(D)免疫组织化学检测AOE1；
图4为新物体识别及Y迷宫系统检测AOE1免疫治疗AD小鼠后的认知改善情况，AD小鼠免疫治疗结束2周后，利用新物体识别系统和Y迷宫系统评价小鼠的认知与记忆能力，其中，图4(A)新物体识别实验中小鼠对新旧物体的探索次数统计(新物体探索次数与旧物体探索次数相比，*P<0.05)，图4(B)小鼠对新物体的偏好指数统计分析(与AD对照组相比，*P<0.05)，图4(C)Y-迷宫实验测试期小鼠在新臂的停留时间，图4(D)新臂选择次数(与AD对照组相比，*P<0.05)；
图5为AOE1免疫治疗对AD小鼠脑内Aβ老年斑的影响，其中，图5(A)A，C、ThS染色检测AD小鼠脑中的老年斑，图5(C)4G8免疫组化检测AD小鼠脑中的老年斑，图5(B)对ThS染色结果的量化统计分析，图5(D)4G8免疫组化结果的量化统计分析(与AD对照组相比，*P<0.05)；
图6为AOE1免疫治疗对AD小鼠的脑组织中Aβ水平的影响，其中，图6(A)-图6(D)动物行为学结束后，小鼠麻醉灌流后取脑，利用RIPA裂解液及盐酸胍研磨脑组织分别获得可溶性及不可溶性脑组织提取液，利用AβELISA检测试剂盒测定Aβ水平，图6(A)可溶性Aβ40水平，图6(B)不可溶性Aβ40水平，图6(C)可溶性Aβ42水平，图6(D)不可溶性Aβ42水平(与AD对照组相比，*P<0.05)，图6(E)RIPA可溶性脑组织提取液经12％SDS-PAGE、转膜印迹后，利用Aβ单克隆抗体4G8检测Aβ蛋白水平，β-actin作为上样内参，图6(F)WB结果量化统计分析(与AD对照组相比，*P<0.05)；
图7为AOE1免疫治疗对于AD小鼠脑内胶质细胞活化的影响，其中，图7(A)利用GFAP单克隆抗体通过免疫组化染色检测小鼠脑组织切片中皮层区及海马区星形胶质细胞活化情况，图7(B)星形胶质细胞免疫组化结果量化分析,图7(C)利用CD11b单克隆抗体通过免疫组化染色检测小鼠脑组织切片中皮层区及海马区小胶质细胞活化情况，图7(D)小胶质细胞免疫组化结果量化分析(与AD对照组相比，*P<0.05)；
图8为AOE1免疫AD小鼠后T细胞活化和脑部微出血情况检测，其中，图8(A)AOE1免疫AD小鼠结束后后，取小鼠脾脏细胞，分别以不同物质再次刺激，应用Elispot检测γ干扰素的分泌，图8(B)AOE1免疫AD小鼠结束后后，取小鼠脾脏细胞，分别以不同物质再次刺激，应用Elispot检测白介素4的分泌，图8(C)利用普鲁士蓝染色检测小鼠脑组织切片中微出血情况。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS缓冲液pH值为7.4的缓冲液，配方为：9g NaCl，5.73gNa2HPO4·12H2O，0.62g NaH2PO4·2H2O，用水配成1升，调pH为7.4。
下述实施例中AOE1的表位多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成制备。用于实验的AOE1表位多肽纯度为大于或等于95％，表位多肽保存于-20℃，避免反复冻融。
下述实施例中的所有实验数据表示为
Figure BDA0001293089360000071
数据的统计分析采用GraphPadPrism软件或/和Student’s t-test进行，以P<0.05为差异具有统计学意义。
下述实施例中的所有实验数据都是通过3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差，数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行，对于多组重复记忆力测定数据的比较分析则应用重复数据的Two-way ANOVA。
实施例1多肽的制备
(1)将AOE1表位多肽插入Aga2蛋白的C末端，进行全基因合成，其中，Aβ1-15片段的基因作为阳性对照，pCTCON2空载体作为阴性对照；
所述AOE1表位多肽的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2所示的核酸序列如下：
SEQ ID NO.2：
CGT CCG GAT CAG GTG ATG TGG GAT AGC AAA CGT CCG
再用NdeⅠ和XhoI双酶切pCTCON2质粒，将酶切后的载体pCTCON2与AOE1表位多肽进行融合表达，得到重组载体。
实施例2多肽的制备
相比于实施例1，除了增加了AOE1表位多肽的拷贝数，所述AOE1表位多肽的拷贝数为7之外，其他条件与实施例1相同。
制备得到的多肽的效果与实施例1类似，后续的实验采用实施例1制备的多肽进行。
实施例3疫苗的制备
(1)酵母感受态细胞制备
将酿酒酵母EBY100按1：100接种于50mLYPD液体培养基中，于30℃、260rpm振荡培养4-6h至对数前期；室温6000rpm离心10min；弃上清后用25mL重悬缓冲液重悬，转移至250mL摇瓶中，于30℃振荡培养10min；室温6000rpm离心10min，弃上清；用25ml无菌水重悬，于室温6000rpm离心10min，弃上清；用1mL无菌水重悬，即为感受态细胞；
(2)酵母细胞转化与鉴定
取1μL构建好的表达质粒加入100μL酵母感受态细胞中，冰上孵育5min后，进行电转。电转结束立即加入1mL YPD培养基，转移至1.5mLEp中，于30℃、260rpm振荡培养1h。培养结束后，将所有酵母细胞涂布于SD-TRP选择性培养基平板上，倒置放于湿盒中,于30℃静置培养72h。培养结束后，挑选单克隆并划线至YPD培养基平板中，倒置于湿盒中，30℃静置培养24h，再次获得单克隆。挑选单克隆涂布于YPD培养基平板中，30℃静置培养24h，以富集酵母。随后进行酵母印迹实验，将整板印迹转移至SD-TRP选择性培养基平板中，于30℃静置培养24h；
(3)酵母细胞展示表位多肽的诱导表达
挑单克隆至SDCAA液体培养基中，于30℃培养过夜；将过夜菌按照1：100接种至SDCAA培养基中，30℃、260rpm振荡培养8h至对数期；于室温6000rpm离心10min，弃上清；用与SDCAA同样体积的SGCAA培养基重悬酵母细胞，并转移至摇瓶中，于30℃、260rpm振荡培养72h；室温6000rpm离心10min收集酵母沉淀；无菌PBS清洗2遍；再用PBS重悬。此即为展示表位多肽的酵母细胞；
(4)酵母细胞灭活
将上步获得的酵母细胞于56℃灭活1h后，室温6000rpm离心10min；弃上清，无菌PBS清洗2遍；此即为灭活的酵母细胞。加入等体积30％甘油，冻存于-80℃冰箱中备用。同时，取部分酵母细胞进行表达表位多肽的检测；
(5)酵母细胞表达表位多肽检测
利用流式细胞仪对获得的酵母菌体进行计数，计数后取1×106个酵母细胞重悬于100μL 3％BSA中；按照1:100加入鼠源抗c-Myc抗体(9E10)，4℃静置作用30分钟；PBS洗三遍；按照1:100加入FITC标记的羊抗鼠二抗，4℃静置作用30分钟；PBS洗三遍；流式细胞仪检测。同时，取10μL标记好的酵母菌体滴于载玻片上，加上盖玻片后，封片进行激光共聚焦显微镜观察。
结果如图1所示，图1(A)结果表明，表达展示AOE1表位多肽和Aβ15的酵母细胞可利用流式细胞仪检测到明显的荧光信号，EBY100转化空白pET载体则无任何荧光信号产生；图1(B)结果表明，利用激光共聚焦显微镜可明显观察到AOE1表位多肽和Aβ15很好地展示于酵母细胞表面，EBY100转化空白pET载体则无任何荧光信号产生。
实施例4 AOE1诱导APP/PS1小鼠产生抗Aβ42寡聚体抗体
实验方法：
(1)动物及免疫：将6月龄大的雄性APP/PS1小鼠(华阜康生物公司，中国)随机分为对照组-即注射转化空白pET质粒EBY100(Control)，AOE1疫苗组(AOE1)和阳性对照组-即展示Aβ1-15片段的EBY100酵母细胞(Aβ15)，每组8只。同时以8只年龄相同的雄性C57BL/6J小鼠作为野生对照组(WT)，野生对照组以注射PBS作为对照(华阜康生物公司，中国)。
将上述四组小鼠进行如下处理：
以两周一次的间隔分别在第0、14、28、42、56、70、84、98天对小鼠进行皮下注射。疫苗组每只小鼠每次注射6×107个酵母细胞。野生对照组注射等体积的酵母注射液。
(2)抗体滴度测定：分别在免疫前、第二次及后续每次免疫后第十天尾静脉取血，将取出的血液于37℃静置2小时后，4000转/分钟离心5分钟，取上层血清，分装待用。
(3)将100μL表位多肽或者Aβ42寡聚体包被96孔酶联免疫微孔板(Aβ42寡聚体每孔包被0.5μg，多肽每孔包被1μg)，BSA为阴性对照，置4℃包被过夜，以PBS洗板3次；以3％BSA37℃封闭2小时，350μL/孔。以PBS洗板2次，加入以3％BSA梯度稀释的小鼠血清100μL，室温孵育1小时后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤8次。每孔加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1小时后，用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤6次。每孔加入底物溶液TMB100μL，放置37℃20分钟，然后每孔加入100μL 1mM硫酸终止反应，于酶标仪上测定OD值(波长450nm)，在相同的条件下重复三次。
实验结果如图2所示，抗表位多肽的抗体滴度如图2(A)所示，对照组在免疫前和数次免疫后的抗体滴度都为0；AOE1疫苗在免疫前抗表位多肽的抗体滴度为0，在免疫六次后抗体滴度达到平台期，约为1：24000；
抗Aβ42寡聚体的抗体滴度如图2(B)所示，对照组在免疫前的抗体滴度为0；在免疫第五次后产生抗体，滴度约1：50，并且达到平台期；AOE1疫苗在免疫前抗Aβ42寡聚体的抗体滴度为0，在免疫三次后开始出现抗体，滴度约1：50；免疫七次后抗体滴度达到平台期，约:1：800；Aβ15组免疫前抗体滴度为0，在免疫五次后抗体水平达到平台期，约为1：24000。
抗Aβ42寡聚体的抗体分型如图2(C)所示，AOE1疫苗产生的抗Aβ42寡聚体的IgG亚型:，其产生的抗体主要是Th2型的IgG1类抗体，而IgG2a、IgG2b、IgG3的含量较少。
实验结果表明，AOE1疫苗免疫APP/PS1转基因小鼠能够产生抗Aβ42寡聚体的抗体，并且这种抗体主要是Th2型的IgG1类抗体。
实施例5 AOE1疫苗免疫产生的抗体能特异性地识别Aβ42寡聚体，而不与Aβ42单体结合
(1)ELISA测定AOE1免疫血清与不同聚集状态Aβ42的结合：Aβ42按照1mg/mL的浓度加入DMSO后，于涡旋震荡仪上涡旋溶解3min，再用合适的移液器吹打2min，当吹打溶解至管壁不再沾液滴时，用预冷的PBS稀释至0.01mg/mL，此液体为单体Aβ溶液。Aβ42以DMSO溶解至2mg/mL，以PBS稀释至0.4mg/mL，37℃静置孵育2h，此液体为Aβ寡聚体溶液。Aβ42以DMSO溶解至2mg/mL，以PBS稀释至0.4mg/mL，37℃静置孵育7day，于12000rpm离心30min，取沉淀重新溶于适当体积的PBS中，此即为Aβ纤维。将不同聚集状态的Aβ包被于96孔板中(0.5μg/孔)，封闭后，将对照组免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将AOE1免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将Aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀释后用于检测；4G8抗体按照1:3000稀释后用于检测。
(2)Dot-blot测定AOE1免疫血清与不同聚集状态Aβ42的结合：将不同聚集状态的Aβ点样至NC膜上，封闭后，将对照组免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将AOE1免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将Aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀释后用于检测；4G8抗体按照1:3000稀释后用于检测。
(3)Western-blot测定AOE1免疫血清与不同聚集状态Aβ42的结合：利用7PA2细胞裂解液混合Aβ42单体制备电泳样品后进行4-12％SDS-PAGE，转膜封闭后，将对照组免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将AOE1免疫七次后的血清按照1:100稀释后用于检测；将Aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀释后用于检测；4G8抗体按照1:3000稀释后用于检测。
(4)免疫组织化学测定AOE1免疫血清与内源性Aβ的结合：利用12月龄APP/PS1转基因小鼠的脑组织切片进行了免疫组化分析，在同一张脑组织切片中，利用AOE1免疫血清(免疫七次后，1:100稀释)和ThS染色同时标记后，在脑组织切片的同一位置进行白光和荧光观察。同时，另外一张脑片使用4G8抗体(1:100稀释)和ThS染色同时标记后，在脑组织切片的同一位置进行白光和荧光观察。
实验结果如图3所示，ELISA结果如图3(A)所示，对照组免疫血清不能识别任何形式的Aβ42；
AOE1免疫血清与Aβ42寡聚体结合力最高，与Aβ42单体没有结合，与Aβ42纤维结合较弱；Aβ15免疫血清和4G8抗体相似，与不同聚集形式的Aβ42结合力相当。
Dot-blot结果如图3(B)所示，对照组免疫血清不能识别任何形式的Aβ42；AOE1免疫血清与Aβ42寡聚体结合力最高，不识别Aβ42单体，与Aβ42纤维结合较弱；
Aβ15免疫血清和4G8抗体相似，可识别不同聚集形式的Aβ42。
Western-blot结果如图3(C)所示，对照组免疫血清不能识别任何形式的Aβ42；AOE1免疫产生的Aβ抗体主要结合35-130kD大小之间的Aβ寡聚体，而不结合单体及较大聚集体；Aβ15免疫产生的抗体与4G8抗体相似，可结合所有的Aβ形式。
免疫组织化学结果如图3(D)所示，AOE1免疫血清中的抗体能够识别脑组织中弥散型的淀粉样沉积，但不识别ThS阳性的致密型斑块；而4G8抗体则可同时识别弥散型和致密型的淀粉样斑块。
结果表明，AOE1免疫产生的Aβ抗体主要结合寡聚体，而不与单体及高度聚集的纤维及斑块结合，显示出良好的特异性。
实施例6 AOE1疫苗免疫改善AD小鼠认知损伤
(1)新物体识别实验：利用50x50x30cm的空旷的活动箱，箱中特定位置上放置有A、B两个物体，将小鼠放置箱中让其自由探索5min。第一天为训练实验，A、B两个物体完全一样。将小鼠放置箱中记录小鼠对A、B两个物体的触碰次数(小鼠鼻子或嘴巴触及物体算作一次有效碰触)。5min结束后，将小鼠放回饲养盒中，将活动盒擦洗干净，进行第二只小鼠检测，步骤同上。第二天为检测实验，即24小时后，将场地内的A或者B物体换做一个新的物体C，C物体与A、B物体的形状和颜色都不同。同样，将小鼠放置入活动箱中分别记录小鼠对两个物体的探索次数。5min后，取出第一只小鼠，将活动盒擦洗干净，放置第二只小鼠开始试验。实验结束后，统计分析小鼠对于新旧物体的探索次数及鉴别指数(DI，discriminationindex)。DI＝(TN-TF)/(TN+TF)，其中TN为新物体的探索时间，TF为旧物体探索时间。
(2)Y-迷宫实验：Y迷宫由三个完全相同的臂组成。各个臂夹角120度，每一臂尺寸为30×8×15cm(长×宽×高)，在中央处各有一个可移动的隔板，迷宫各臂内贴有不同的几何图形，作为视觉标记。Y迷宫的3个臂被随机设为：新异臂(novel arm)、起始臂(startarm)和其他臂(other arm)，迷宫上方1.5m处安置摄像机，记录小鼠的运动轨迹。Y迷宫实验包含两个阶段，间隔1h。第一阶段为训练期，将新异臂用隔板挡住后，将小鼠由起始臂放入，使其在起始臂和其他臂中自由活动10min，训练结束后，将小鼠放回饲养笼。将迷宫设备擦洗干净后，进行第二只小鼠训练。1h后进行第二阶段实验。第二个阶段为检测期，打开新异臂隔板，同样，将小鼠由起始臂放入，使其在3个臂中自由活动5min。记录5min内小鼠在各个臂的停留时间和穿梭次数。检测结束后，擦洗Y迷宫设备去除小鼠残留气味，进行第二只小鼠检测。
实验结果如图4所示：新物体识别实验结果如图4(A)-图4(B)所示：AOE1免疫的AD小鼠对新物体的探索次数则明显多于旧物体(与旧物体的探索次数相比，P<0.05)；AOE1治疗组小鼠对新物体的偏好指数也明显高于AD对照组(与AD对照组相比，P<0.05)。
Y-迷宫实验结果如图4(C)-图4(D)所示：AOE1免疫的AD小鼠在新臂的停留时间和对新臂的探索次数明显都明显提高(与AD对照组相比，P<0.05)。
结果表明，AOE1免疫治疗能够改善AD小鼠的认知能力，降低记忆损伤。
实施例7 AOE1疫苗免疫治疗减少AD小鼠脑部的Aβ沉积
(1)动物行为学实验结束后，每只小鼠通过腹腔注射250μL 2％戊巴比妥钠进行麻醉；麻醉后，心脏灌注4℃预冷的含肝素(10U/ml)的PBS；断头取脑，脑组织沿矢状面一分为二。一半大脑置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定24h，依次用10％、20％、30％蔗糖梯度脱水。脱水结束后，OCT包埋剂包埋，利用冰冻切片机切片，脑切片厚度为20μm，用于后续的免疫组织化学实验。
(2)ThS染色：将冰冻脑组织切片于室温下复温30min；PBS洗涤3次，每次5min；将ThS染色液(1mg/mL,70％乙醇配制)滴在脑片上染色5min；70％乙醇脱色5min；PBS洗涤3次，每次5min；封片后利用荧光显微镜观察。
(3)免疫组化检测老年斑：脑组织冰冻切片平铺放置在组化盒中，室温复温30min；PBS洗涤3次，每次5min；80％甲醇(内含0.3％H2O2)浸泡20min，消除内源性的过氧化物酶；PBS洗涤3次，每次5min；用含0.3％Triton-X的10％山羊血清封闭液于室温封闭2h；加4G8(1:100稀释)，4℃作用过夜；PBS洗涤3次，每次5min；加HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1:100稀释)，室温作用1h；PBS洗涤4次，每次5min；DAB室温染色1min；流水终止染色，封片后进行观察。
实验结果如图5所示，ThS染色结果如图5(A)-图5(B)所示，AOE1免疫治疗后，AD小鼠脑内老年斑数量明显减少(与AD对照组相比，*P<0.05)
免疫组化检测老年斑结果如图5(C)-图5(D)所示，AOE1免疫治疗后，Aβ斑块数量明显减少(与AD对照组相比，*P<0.05)
结果说明AOE1疫苗免疫治疗能够减少AD小鼠脑内Aβ沉积水平。
实施例8 AOE1疫苗免疫减少AD小鼠脑内的Aβ水平
(1)脑组织提取液中Aβ水平测定:另一半大脑用1mL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液研磨裂解，于4℃、12000rpm离心30min，收集上清即为可溶性组分。沉淀中加入500μL 5M盐酸胍缓冲液(pH8.0，50mM Tris-HCl配制)，研磨裂解后于4℃、12000rpm离心30min，上清即为不可溶性组分。将可溶与不可溶组分分装后于-80℃保存。应用Aβ40和Aβ42ELISA检测试剂盒测定小鼠脑组织提取液中Aβ水平。将待测样品用稀释缓冲液进行适当稀释后包被于ELISA检测试剂盒中，同时包被Aβ40或Aβ42标准品，每孔100μL，于4℃包被过夜；次日弃掉包被液，洗板机洗涤9次，每次60s。加入标签抗体工作液，每孔100μL，4℃孵育1h后，洗板机洗涤9次，每次60s。加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应20min，终止后于450nm测定吸光度。
(2)Western-blot检测脑组织提取液中蛋白水平
将可溶性脑组织提取液进行电泳；电泳后以恒定电流300mA湿法转膜2h；5％脱脂牛奶室温封闭1h；加入合适稀释度的一抗，4℃作用过夜；0.1％PBST洗膜3次，每次5min；加入二抗室温孵育1h；0.1％PBST洗膜3次，每次10min。如果使用HRP标记的二抗则利用ECL系统进行曝光检测.
实验结果如图6所示，图6(A)-图6(D)表明，注射AOE1疫苗后，AD小鼠脑内可溶性及不可溶性Aβ40水平与AD对照组相比显著下降(*，P<0.05)；可溶性的Aβ42水平与AD对照组相比显著下降(*，P<0.05)，不可溶性的Aβ42水平下降，但无显著性差异。
图6(E)的Western-blot结果表明，AOE1疫苗免疫的AD小鼠脑中40-55kD大小的Aβ寡聚体水平明显下降(*，P<0.05)。说明AOE1疫苗免疫能够减少AD小鼠脑内的Aβ水平
实施例9 AOE1疫苗免疫减少AD小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的活化
(1)星形胶质细胞检测：脑组织冰冻切片平铺放置在组化盒中，室温复温30min；PBS洗涤3次，每次5min；80％甲醇(内含0.3％H2O2)浸泡20min，消除内源性的过氧化物酶；PBS洗涤3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％Triton-X)封闭液室温封闭2h；加GFAP抗体工作液(1:100稀释)，4℃作用过夜；PBS洗涤3次，每次5min；加荧光标记二抗工作液(1:100稀释)，室温作用1h；PBS洗涤4次，每次5min；利用抗荧光淬灭封片剂封片后进行荧光显微镜观察。
(2)小胶质细胞检测：脑组织冰冻切片平铺放置在组化盒中，室温复温30min；PBS洗涤3次，每次5min；80％甲醇(内含0.3％H2O2)浸泡20min，消除内源性的过氧化物酶；PBS洗涤3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％Triton-X)封闭液室温封闭2h；加CD11b抗体工作液(1:100稀释)，4℃作用过夜；PBS洗涤3次，每次5min；加荧光标记二抗工作液(1:100稀释)，室温作用1h；PBS洗涤4次，每次5min；DAB室温染色1min；流水终止染色；封片后进行观察。
(3)应用荧光显微镜采集图像(Olympus IX73，10倍物镜)。应用软件ImageJ(National Institutes of Health,Bethesda,MD)进行图像统计分析。
实验结果如图7所示：星形胶质细胞活化水平检测结果如图7(A)-图7(B)所示，AOE1免疫治疗后，AD小鼠海马区和皮层区活化的星形胶质细胞数量明显减少(*P<0.05)。
小胶质细胞活化水平检测结果如图7(C)-图7(D)所示，AOE1免疫治疗后，AD小鼠皮层区活化的小胶质细胞数量明显减少(*P<0.05)；海马区活化的小胶质细胞数量减少，但无显著性差异。
结果说明，AOE1疫苗免疫减少AD小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的活化水平。
实施例10 AOE1疫苗免疫不会活化Aβ特异性的T细胞，并且不诱发脑出血产生
(1)ELISPOT检测：AOE1最后一次免疫结束后第七天，取三只小鼠，颈椎脱臼处死后，于70％酒精浸泡10min，无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾脏；用注射器内芯或者研棒于200目筛网上研磨；用2mL Hank’s缓冲液冲洗；收集筛网下分离的脾细胞悬液，于2000rpm离心3min；弃上清后，加入8mL红细胞裂解液，颠倒混匀，静置5min；待红细胞完全破碎，；弃上清，用Hank’s缓冲液再次清洗2遍，每遍清洗后，于2000rpm离心3min；用含10％血清的RPMI-1640培养基重悬细胞；细胞计数，调整细胞浓度至5×106个/mL。将Elispot的预包被板活化后，加入调整好浓度的细胞悬液至各实验孔中，每孔100μL(5x105个细胞)；同时，加入对应刺激物，每孔10μL；于CO2培养箱中培养48小时；培养结束后，按照ELISpot试剂盒说明进行操作。
(2)普鲁士蓝染色：将冰冻脑组织切片于室温下复温30min；PBS洗涤3次，每次5min；80％甲醇(内含0.3％H2O2)浸泡20min，消除内源性的过氧化物酶；PBS漂洗3次，每次5min；滴加普鲁士蓝染液37℃反应2h；PBS洗涤3次，每次5min；封片后利用显微镜观察。
结果如图8所示，ELISPOT结果如图8(A)-图8(B)所示，Aβ42多肽刺激AOE1免疫组小鼠脾脏细胞不引发IFN-γ和IL-4的分泌增加。
普鲁士蓝染色结果如图8(C)所示，AOE1疫苗免疫组小鼠脑部只能检测到极少的脑部微出血现象。
结果表明，AOE1疫苗具有良好的安全性。
对比例1
相比于实施例3，除了重组细胞为大肠杆菌之外，其他条件与实施例3相同。
所述多肽在大肠杆菌中不进行表达。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种多肽及其组成的疫苗和应用
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
Arg Pro Asp Gln Val Met Trp Asp Ser Lys Arg Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.2
<400> 2
cgtccggatc aggtgatgtg ggatagcaaa cgtccg 36

Claims (12)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的拷贝数为1-10。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的拷贝数为1-7。
4.一种DNA片段，其特征在于，其为编码权利要求1-3任一项所述多肽的核酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组质粒为pCTCON2载体。
7.一种重组酵母细胞，其特征在于，所述重组酵母细胞包含权利要求5或6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组酵母细胞，其特征在于，所述重组酵母细胞为EBY100酿酒酵母细胞。
9.一种疫苗，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的多肽。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含药学上接受的辅料。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
12.根据权利要求9-11任一项所述的疫苗在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
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