EA022913B1 - Антигенсвязывающие белки - Google Patents

Abstract

Антигенсвязывающие белки, которые связываются с β-амилоидным пептидом; фармацевтические композиции, содержащие указанные антигенсвязывающие белки, для лечения ассоциированных с β-амилоидным пептидом заболеваний.

Description

Изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, в том числе антителам, которые связываются с β-амилоидным пептидом и в частности β-амилоидным пептидом человека. Настоящее изобретение также касается способов лечения заболеваний или расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида или β-амилоидными отложениями, в частности болезни Альцгеймера, и заболеваний или расстройств, поражающих глаз или зрительный нерв, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида или β-амилоидными отложениями, включая возрастную макулярную дегенерацию, заболевания глаукомой разного типа и образование β-амилоидзависимой катаракты с применением антигенсвязывающих белков, которые связываются с β-амилоидным пептидом, в частности β-амилоидным пептидом человека. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания.

Предшествующий уровень техники

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой наиболее распространенную причину возрастного снижения когнитивных функций, поражающую более 12 млн людей во всем мире (Сйтоп М. (2002) ΝαΙ. №ито5С1. 5, 8ирр1. 1055-1057). Самые ранние стадии данного заболевания характеризуются прогрессирующей потерей памяти с ассоциированным снижением когнитивных функций и развитием языковых и поведенческих дефицитов. На более поздних стадиях заболевания у пациентов развивается глобальная амнезия и значительно снижается моторная функция. Обычно смерть наступает через 9 лет после постановки диагноза и часто связана с другими состояниями, обычно с пневмонией (Иау13 К.Ь. и 8ати1ез 8.С. (1998) в РЬаттасо1одюа1 Мападетеп! оГ №иго1одюа1 апй РзусЫайгс О1зотйегз, под ред. Еппа 8.1. и Соу1е 1.Т. (МсСга\\-НП1. Уогк, рр. 267-316)). Современные терапии представляют собой симптоматические подходы, фокусирующиеся на уменьшении когнитивной недостаточности и улучшении поведенческих симптомов, ассоциированных с этиологией прогрессирующего заболевания. На практике эти виды лечения оказывают лишь непродолжительное благоприятное воздействие на когнитивную функцию в отношении степени когнитивной недостаточности, длящееся по сообщениям только до 2 лет включительно. Потенциал болезнь-модифицирующей терапии, замедляющей и возможно останавливающей прогрессирование данного заболевания, огромен. Такие подходы обеспечили бы радикальное и продолжительное улучшение качества жизни пациентов и, что важно, лиц, осуществляющих за ними уход, а также снижение очень большой суммарной стоимости медицинского обслуживания этого заболевания.

Клинический диагноз болезни Альцгеймера в настоящее время основан на комбинации тестов физических и умственных способностей, приводящих к постановке диагноза возможной или вероятной болезни Альцгеймера, хотя диагностические биомаркеры и визуализация остаются предметом исследования (8оппеп е! а1. (2007) Ехрег!. Кеу. №иго!Ьегареи!юз 7(8): 1021-1028; ЬоскЬап е! а1. (2007) Вташ 130: 2607-2615). После смерти наличие заболевания подтверждают присутствием хорошо охарактеризованных неврологических признаков в головном мозге, которые включают отложение Αβ в паренхимальных бляшках и сосудах головного мозга, внутринейронное образование нейрофибриллярных клубков, повреждение синапсов и повреждение нейронных субпопуляций в специфических участках головного мозга (Тепу Κ.Ό. (1991) 1. №ига1. Тгапз. 8ирр1. 53: 141-145).

Изобилие генетических, гистологических и функциональных доказательств подтверждает, что βамилоидный пептид (Αβ) является ключевым звеном в прогрессировании болезни Альцгеймера (8е1кое И.Т (2001) РЬузю1одюа1 Ре\ае\уз 81: 741-766), хотя не так давно стало менее понятно, являются ли фактически существующие Αβ-отложения, обнаруживаемые при обследовании после смерти, истинной причиной снижения когнитивных функций (Ретгеиа 8.Т. (2007) ЫГе 59(4-5): 332-345). Известно, что Αβ продуцируется в результате расщепления белка-предшественника β-амилоида (также известного как АРР) ферментом аспартилпротеазой, известным как ВАСЕ1 (бета-сайт-АРР-расщепляющий фермент 1) (также известным как β-секретаза, Азр2 или мемапсин-2) (Ие 8йоорет В. апй Кошд О. (1999) №!ите 402: 471472). В дополнение к отложению в паренхимальных тканях и сосудах постулируется, что растворимые олигомерные формы Αβ вносят вклад в начало развития АО и что они могут оказывать воздействие на нейронную функцию первоначально посредством ослабления синаптической функции (ЬатЪей е!. а1. (1998) Ртосеейтдз о! !Ье №-10опа1 Асайету о! 8шепсе, И.8.А. 95: 6448-6453; Кауей е! а1.

(2003) 8аепсе 300: 486-489; СЬепд е! а1. (2007) 1. Вю1. СЬет. 282(33): 23818-23828; Ретгеиа е! а1. (2007) БаГе 59: 332-345). Несмотря на то что при АО и при умеренной когнитивной недостаточности (МС1) рано обнаруживаются нерастворимые амилоидные бляшки, у таких индивидуумов также увеличиваются уровни растворимых Αβ-агрегатов (иногда называемых олигомерами или происходящими из Αβ диффундирующими лигандами (АОИЬ)), и уровни растворимого Αβ лучше коррелируют с нейрофибриллярной дегенерацией и потерей синаптических маркеров по сравнению с амилоидными бляшками (№з1ипй е!. а1. (2000) 1. Ат. Мей. Аззос. 283: 1571-1577, Уоипкт 8. (2001) ΝηΙ. Мей. 1: 8-19). К тому же эти олигомеры могут являться предшественниками на пути образования фибрилл, и их удаление или нейтрализация могут предотвратить токсические эффекты и образование фибрил (Реттейа 8.Т. (2007) ЬГе 59(4-5): 332-345; Оопд Υ. (2003) РNА8 100: 10417-10422). Несмотря на результаты этих исследований, высоко амилоидогенный Αβ42 и укороченные с аминоконца формы Αβх-42 представляют собой преобладающие виды Αβ, обнаруживаемые как в диффузных, так и в сенильных бляшках (1\уа1зиЪо Т. (1994)

- 1 022913

Ыеигоп. 13: 45-53, Огауша 8.А. (1995) 1. ΒίοΙ. СЬет. 270: 7013-7016) и, по-видимому, относительные уровни Αβ42 не только являются биомаркером для АО, но также ключевым регулятором агрегации Αβ в амилоидные бляшки. Показано, что Αβ42 образует агрегаты ίη νίΐτο легче, чем другие формы Αβ ОаггеП ТТ. (1993) ВюсЬет1з!гу, 32: 4693-4697), и как таковой, Αβ42 вовлечен в качестве инициирующей молекулы в патогенез АО (Уоипкш 8.О. (1998) 1. РЬузю1. (Рапв). 92: 289-292). Несмотря на то что обычно Αβ42 представляет собой минорный продукт метаболизма ΑΡΡ, незначительные сдвиги в его продуцировании связывают со значительным влиянием на отложение Αβ, и поэтому утверждается, что снижение только уровня Αβ42 может давать эффективный путь лечения АО (Уоипкш 8.О. (1998) 1. РЬузю1. (Рапз). 92: 289-292; БеуПез е! а1. (2007) 1. Сбит [пуезк 116(1): 193-201). В подтвержение этого имеется сообщение, что мутации в генах белка-предшественника амилоида (ΑΡΡ) и пресенилина главным образом увеличивают относительные уровни Αβ42 и вследствие этого сокращают время наступления болезни Αльцгеймера (АО) (8е1кое 0.1, Робйзпу М.В. (2002) Аппи. Кеу. Оепотюз Нит. Оепе!. 3: 67-99). Однако следует подчеркнуть, что скорость амилоидного отложения также зависит от общих уровней амилоида, катаболизма и эффективности клиренса Αβ из ЦНС, при этом отмечено негативное влияние возраста и повышенных уровней амилоида, как обнаружено при АО (Оеапе е! а1. (2005) 1. №игозст 25(50): 1149511503; \Уапд е1 а1. (2006) Эгид ОНсоуегу Тобау 11(19/20): 931-938). В этом отношении неожиданно стало очевидно, что транспорт Αβ между центральной нервной системой (ЦНС) и плазмой играет основную роль в регуляции уровней амилоида в головном мозге (8ЫЬа!а, е! а1. (2000) 1. С1т. 1пуез!. 106: 1489-1499), при этом Αβ быстро транспортируется из ЦНС в плазму посредством транспортных механизмов, как например с использованием ЬРР-1 (белок, подобный рецептору липопротеинов низкой плотности (1оте бепзйу йрорто!ет гесер!ог-ге1а!еб рто!еш 1)), и Αβ быстро импортируется из плазмы в ЦНС посредством связывания с КАОЕ (рецептор конечных продуктов усиленного гликозилирования (гесер!ог &т абуапсеб д1усабоп епбргобис!з)) (21окоую Β.ν. (2004) 1. Ыеигосйет. 89: 807-811). По этой причине способы активной вакцинации Αβ-пептидами или пассивного введения специфичных к Αβ антител, которые связываются с периферическим Αβ и, следовательно, воздействуют на динамическое равновесие между плазмой, С8Р (цереброспинальной жидкостью) и ЦНС, находятся в стадии разработки. Действительно, в настоящее время проводится много исследований, которые демонстрируют, что оба эти подхода могут приводить к снижению уровней Αβ, ослаблять ассоциированную с Αβ патологию и в некоторых случаях обеспечивать благоприятное воздействие на когнитивную функцию в различных трансгенных моделях амилоидоза. Кроме того, проведены ограниченные исследования на видах высших животных (Ьетете С.А. (2004) Ат. 1. Ра11ю1оду 165: 283-297; Оапбу, 8 (2004) АОЬешет ϋίδ. Аззос. О1зотб. 18: 44:46).

Животные модели амилоидного отложения созданы посредством сверхэкспрессии мутантных человеческих трансгенов у мышей. У мышей, сверхэкспрессирующих только трансгены ΑΡΡ человека, обычно развиваются бляшкоподобные β-амилоидные отложения в сосудах головного мозга, начиная с 12месячного возраста (Оатез О. е! а1., (1995) Ыа1иге 373: 523-527; Нз1ао К. е! а1., (1996) 8шепсе 274: 99102)), тогда как у мышей, несущих оба трансгена, мутантного человеческого ΑΡΡ и пресенилина-1 (Р81), бляшкоподобные β-амилоидные отложения в сосудах головного мозга обычно развиваются уже в 2месячном возрасте (Кий М.А. е! а1., (2001) Ехр.№ито1. 171: 59-71; МсОо\\ап Е. е! а1., (1999) №ито1Ью1. Э|з. 6: 231-244). Такие существенные биологические различия между этими разными используемыми трансгенными мышиными моделями создают трудности при сравнении фармакологии и эффективности разных подходов. Нет единого согласованного мнения относительно того, как в действительности работают иммунотерапии, направленно воздействующие на β-амилоид и его различные формы. Весьма вероятно, что разные антитела с разными связывающими свойствами дают различные результаты в этих животных моделях. Кроме этого, кажется обоснованным, что антитела могут действовать множественными механизмами и что разные описанные способы действия не являются взаимоисключающими (Ьеуйез е! а1. (2007) 1. С1ш. 1пуез!. 116(1): 193-201).

Первой примененной в клинике иммунотерапией, направленно воздействующей на амилоид в головном мозге, было использование ΛΝ-1792. активной вакцины от Е1ап/\Ууе1к Это лечение было прекращено после развития клинических признаков, сходных с менингоэнцефалитом. Αнализ в подгруппах подтвердил, что лечение замедляло снижение когнитивной функции (№Циге С1ш. Ргас!. №ито1. (2005) 1: 84-85). Посмертный анализ пациентов также показал факт очищения от бляшек (Обтап 8. е! а1., (2005) №иго1о§у 64 (9), 1553-1562).

Бапинеузумаб (Варшеи/итаК ААВ-001, Е1апЖуе!Ь), моноклональное антитело для пассивной иммунотерапии, находится в стадии разработки.

Другие заболевания или расстройства, характеризующиеся повышенными уровнями β-амилоида или β-амилоидными отложениями, включают умеренную когнитивную недостаточность (Ке11еу В.Т (2007) №ито1одю. Сйшсз 25 (3), 577-609), наследственную церебральную геморрагию с β-амилоидозом типа Ои!сЬ, церебральную β-амилоидную ангиопатию и различные типы дегенеративных деменций, как, например, таковые, ассоциированные с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортико-базальной дегенерацией и болезнью Αльцгеймера по типу болезни диффузных телец

- 2 022913

Леви (МоПеиЬаиег В. (2007) 1. №ига1. Тгаикт., опубликовано в электронном виде 23 февраля 2007 г.; уаи Оуеи М., Ьаисе! №иго1. 2006, 5: 655-60), синдромом Дауна (Мей!а Ρ.Ό. (2007) 1. №иго1. Зск 254: 22-7), возрастной макулярной дегенерацией (ΑΜΌ) (1оЬикои Ь.У. е! а1. (2002) ΡΝΑ3 ИЗА 99: 11830-11835; Аибегкои Ό.Η. е! а1. (2004) Ехр. Еуе Кек. 78: 243-256), заболеваниями глаукомой разного типа (Оио Ь. е! а1. (2007) Ргос. №!1. Асаб. Зек ИЗА, 104: 13444-13449) и образованием Αβ-зависимой катаракты (Оо1бк!еш Ь.Е. е! а1. (2003) Ьаисе! 361: 1258-1265; Ы О. е! а1. (2003) Мо1. Уяои 9: 179-183).

Возрастная макулярная дегенерация (АМЭ) является ведущей причиной слепоты в развитом мире. Существуют две основные клинические формы АМЭ. Атрофическая (сухая) АМЭ характеризуется дегенерацией ретинального пигментного эпителия (КРЕ) и зрительного нерва и сетчатки. Ранние стадии атрофической АМЭ связывают с образованием друз под слоем клеток КРЕ. Ранняя атрофическая АМЭ может прогрессировать в конечную стадию заболевания, когда КРЕ дегенерирует полностью и образуются четко различимые зоны атрофии КРЕ в области макулы: географическая атрофия. При этой форме заболевания дегенерация КРЕ вызывает вторичную гибель палочек и колбочек пятна сетчатки, и в таких случаях это приводит к тяжелой возрастной потере зрения. Доля пациентов с АМЭ возрастает, что может быть отнесено либо к другой форме, либо к дальнейшему осложнению заболевания. Приблизительно у 10-20% пациентов с АМЭ развивается неоваскуляризация хориоидеи (ΟΝν). Когда это происходит, форма данного заболевания известна как влажная АМЭ и это может сопровождаться некоторыми наиболее тяжелыми случаями потери зрения. При влажной АМЭ новые сосуды, относящиеся к сосудистой оболочке глаза, прорастают сквозь мембрану Бруха, ломают ее и пролиферируют внутрь и под КРЕ и зрительный нерв и сетчатку. В типичных случаях атрофическая АМЭ развивается в глазу до развития влажной формы, однако в редких случаях неоваскулярная форма может развиться без предварительного развития атрофической формы. При обеих формах заболевания потеря зрения происходит вследствие гибели фоторецепторных клеток, хотя при влажной АМЭ внутреннее кровотечение из дающих утечку сосудов, образовавшихся в процессе СNV, также приводит к потере зрения. В области терапии АМЭ наметился некоторый прогресс в разработке новых видов лечения, адресованных некоторым аспектам влажной АМЭ, в частности в отношении снижения кровотечения из дающих утечку сосудов при СNV под действием различных молекул, которые ингибируют или УЕОР (сосудистый эндотелиальный фактор роста), или путь передачи сигнала через рецептор νΈΟΡ. Однако в настоящее время не существует никаких оптимальных средств ни как для лечения очень распространенной атрофической формы АМЭ, ни как для предупреждения прогрессирования ранней сухой АМЭ либо в сторону географической атрофии, либо в сторону влажной АМЭ (РебикЬт К. (2007) ЕхрегЕ Ορίη. Тйеи Тагде!к, 11: 625-639).

Несмотря на то что точные механизмы, вызывающие продуцирование Αβ в КРЕ, и точный механизм или механизмы, посредством которых Αβ влияет на АМЭ, полностью не понятны, эти результаты означают, что устранение Αβ посредством агентов, которые связываются с и потенциально нейтрализуют или даже удаляют Αβ, может обеспечить возможный путь устранения друз при АМЭ путем уменьшения активации комплемента при АМЭ, уменьшения атрофии КРЕ и возможного уменьшения индукции экспрессии νΈΟΡ в КРЕ и его высоких уровней, локализованных вокруг друз. Поэтому такая терапия могла бы обеспечить средства предупреждения, задержки, ослабления или реверсирования потери зрения в результате АМЭ и ее прогрессирования в сторону географической атрофии и/или эксудативной АМЭ. Это может приводить к снижению уровней Αβ-содержащих друз и/или локально расположенных Αβ в окружении КРЕ и поэтому препятствовать как ранней, так и поздней стадии АМЭ, и воздействовать на лежащее в основе уменьшение количества клеток, которое вызывает потерю зрения.

Некоторые недавно опубликованные данные проливают свет на взаимодействие белков комплемента и бета-амилоида в развитии АМЭ (^аид 1. е! а1., (2008) 1. 1ттиио1. 181: 16651-6). Показано, что бетаамилоид связывается с фактором комплемента I, кофактором, который вместе с фактором Н отвечает за расщепление белка комплемента С3 из формы С3Б в его неактивную форму, Ю3Б (^аид 1. и др., 2008). Результаты недавно опубликованного исследования ш νίΙΐΌ подтвердили гипотезу, согласно которой бета-амилоид активирует систему комплемента внутри друз, блокируя функцию фактора комплемента I, что приводит к слабо выраженному хроническому воспалению в субретинальных тканях; таким образом, воедино связываются четыре фактора из факторов, ассоциированных с развитием АМЭ: воспаление, активация комплемента, отложение амилоида-бета и друзы (^аид 1. и др., 2008). Такое прямое доказательство влияния бета-амилоида на активацию альтернативного пути комплемента в результате возможного конкурирования с фактором комплемента Н за связывание с фактором комплемента I ранее не было документально подтверждено (^аид 1. и др., 2008).

Заболевания глаукомой разного типа представляет собой термин, используемый для группы заболеваний, которые могут вызывать повреждение глазного зрительного нерва и приводить к слепоте. Это основная причина слепоты в мире, вызываемая в конечном счете повышенным внутриглазным давлением (1ОР) и сниженной остротой зрения. Связь между 1ОР и то, каким образом это приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки (КОС), понятны недостаточно. Высокое 1ОР само может вызывать апоптоз (Согбеио М.Р. е! а1. (2004) Ргос. №И. Асаб. Зск ИЗА 101: 13352-13356; 0шд1еу Н.А. е! а1. (1995) 1иуек!. Орй!а1то1. У1киа1 Зск 36: 774-786), но само по себе оно не является единственной причиной гибели кле- 3 022913 ток оптических нейронов. Кроме этого, отмечено, что зрение может продолжать ухудшаться даже после нормализации ЮР после лечения понижающими глазное давление агентами (ОНует 1.Е. е! а1. (2002) Ат.

1. ОрЫйато1. 133: 764-772).

Не так давно сообщено о связи возможных цитотоксических эффектов β-амилоида на апоптоз КОС при глаукоме (МсКтипои 8.1. е! а1. (2002) 1пуе51 Орй1ато1 УЬиа1 8е1 43: 1077-1087). В животных моделях глаукомы продемонстрировано, что протеаза каспаза-3 активируется в КОС, что приводит к аномальному процессингу белка-предшественника амилоида (АРР) под действием каспазы-3 с образованием потенциально токсичных фрагментов АРР, включая β-амилоид (МсКтипои и др. (2002); СЬеипд Ζ.Η. е! а1. (2004) Мо1. Се11 №иго8с1 25: 383-393). Показано, что среди других клеток КОС экспрессируют АРР, и таким образом по-видимому являются вероятным источником β-амилоида. Как повышенные уровни АРР, так и повышенные уровни β-амилоида непосредственно связаны с активацией каспазы-3, хотя это преимущественно наблюдали в ίη уйго системах. Неясно, повышены ли также и уровни АРР в КОС при глаукоме, что может вносить вклад в образование еще большего количества β-амилоида по механизму положительной обратной связи. Совсем недавно на крысиной модели глаукомы подтверждено вовлечение β-амилоида в апоптоз КОС (Оио и др. (2007)). Тестировали некоторые агенты, направленно воздействующие на β-амилоид или на продуцирование β-амилоида, и было показано уменьшение гибели ганглиозных клеток сетчатки ίη У1уо с возможным умеренным эффектом улучшения в случае, когда все три вида лечения использовали совместно. Самый сильный эффект наблюдали при использовании антитела против β-амилоида, который был полностью равносилен эффектам, наблюдаемым для всех трех агентов совместно.

Несмотря на то что точные механизмы, вызывающие продуцирование β-амилоида в КОС и связь с 1ОР, полностью не понятны, эти результаты означают, что устранение β-амилоида посредством агентов, которые связываются с β-амилоидом и потенциально нейтрализуют или даже удаляют его, может обеспечить возможный путь предупреждения апоптоза КОС при глаукоме и, таким образом, обеспечить способ задержки, ослабления или реверсирования потери зрения при глаукоме. Это может приводить к снижению уровней β-амилоида в КОС и в окружающей их среде и поэтому воздействовать на лежащее в основе уменьшение количества клеток, которое вызывает потерю зрения.

β-Амилоид может играть роль в других глазных болезнях, и его связывают с образованием надъядерных катаракт, особенно наблюдаемых у пациентов с АО, и компоненты пути образования и процессинга Аβ присутствуют в хрусталике (Оо1Й81еш Ь.Е. и др. (2003); Ь1 О. и др. (2003)). Таким образом, терапевтические подходы, описанные для воздействия при АМЭ и заболеваниях глаукомой разного типа, могут быть применимы для предупреждения образования катаракты.

\УО 2008/110885 относится к способам лечения глазных заболеваний ингибиторами, направленными против β-амилоидного пептида. Конкретно, описано антитело 6О, связывающееся с эпитопом на Аβ140, который по всей видимости включает остатки 25-34 и 40.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном из аспектов настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, которое связывается с β-амилоидным пептидом, содержащее У_Н-домен, имеющий последовательность, приведенную в 8ЕС ГО ΝΌ:65, и У_ъ-домен, имеющий последовательность, приведенную в 8ЕС ГО ΝΌ:71.

В другом аспекте изобретения предложено терапевтическое антитело, которое связывается с βамилоидным пептидом, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, приведенную в 8ЕС ГО ЫО:27, и легкую цепь, имеющую последовательность, приведенную в 8ЕС ГО ЫО:28.

В еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения ассоциированных с β-амилоидным пептидом заболеваний, содержащая указанное терапевтическое антитело.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана детекция с помощью вестерн-блоттинга различных форм бета-амилоида с использованием антитела 6Р6 или 6Е10 (антитело, специфичное к Аβ1-16 человека; имеющийся в продаже реагент, Еитодейес) и 5О5 (антитело, специфичное к Аβ1-42; реагент собственной разработки);

на фиг. 2 - диаграммы, демонстрирующие отложение бляшек в срезах коры и гиппокампа головного мозга ЬАРР-трансгенных мышей после обработки 6Р6 (17 или 33 мг/кг), выраженное в % площади кортикальных бляшек, приведенной в виде средней величины ± стандартная ошибка средней величины;

на фиг. 3 - диаграммы, демонстрирующие отложение бляшек в срезах коры и гиппокампа головного мозга ЬАРР-трансгенных мышей после обработки 6Р6 (17 или 33 мг/кг), выраженное в количестве бляшек на мм², приведенном в виде средней величины ± стандартная ошибка средней величины;

на фиг. 4 - детекция бета-амилоида в сетчатке старых СЕН-/- мышей;

на фиг. 5 - перекрестная реактивность 6Е6 к бета-амилоиду в сетчатке старых СЕН-/- мышей. Подробное описание изобретения

1. Антигенсвязывающие белки.

Термин антигенсвязывающий белок, как он использован в данном описании, относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, таким как домены, конкретно к тем, кото- 4 022913 рые способны связываться с β-амилоидом, как дополнительно обсуждается ниже.

В одном из воплощений настоящего изобретения предложен терапевтический антигенсвязывающий белок, представляющий собой антигенсвязывающий белок, такой как антитело или его антигенсвязывающие фрагмент и/или производное, которые связываются с β-амилоидным пептидом и которые содержат следующие СГОК (гипервариабельные участки):

СОКН1: УУУУН (δΕΟ ΙΌ N0:1),

СЭВН2: ΚΙΌΡΕΝΟΕΤΙΥΤΡΚΒΡΌ (δΕΟ ΙΌ N0:2),

СОКН3: δΟΥ (δΕΟ ΙΌ N0:3),

СОИЕ1: ΚδδΚδΕΕΗΚΝΟΙΤΥΒΥ (δΕΟ ΙΌ N0:4),

СОКЬ2: ΟΜδΥΕΆδ (δΕΟ ΙΌ N0:5),

СОКЬ3: ΆΟΜ.ΕΙΛΥΤ (δΕΟ ΙΌ N0:6).

По всему данному описанию термины СОК, СОКЬ1, СОКЬ2, СОКЬЗ, СОКН1, СОКН2, СОКНЗ соответствуют системе нумерации КаЬар которая приведена в КаЬа! с1 а1.; δοςυοηοοχ о£ ргсЛснъ о£ Ιιηιηιιηοίοβίοίΐΐ [пксгскк, №Н, 1987. Следовательно, СОК по изобретению определены следующим образом:

СОК: Остатки

СОКН1: 31-35

СОКН2: 50-65

СОКН3: 95-97

СОКЬ1: 24-34

СОКЬ2: 50-56

СОКЬ3: 89-97

ЮНУ1-24 (δΕΟ ΙΌ N0:13) представляет собой последовательность зародышевой линии человека, которая является подходящим акцепторным каркасом для привития СОК У_Н. В конкретном аспекте акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека происходит из ЮНУ1-24.

Чтобы сконструировать полную У-область, каркасную область 4 необходимо добавить к ЮНУ1-24, кодируемой У-геном зародышевой линии. Подходящие последовательности каркасной области 4 включают таковые, кодируемые минигеном 1Н4 человека (КаЬак):

ΥΤΌΥΛΥΟΟΟΠΛΊΎδδ (δΙΤ) ГО N0:15).

Специалисту очевидно, что У-ген и 1-ген зародышевой линии не содержат кодирующей последовательности для полного С0К3 тяжелой цепи. Тем не менее в антителах по изобретению полный С0К3 тяжелой цепи обеспечивается донорным иммуноглобулином. Соответственно комбинации гена УН, такого как ЮНУ1-24, минигена 1Н, такого как 1Н4, и набора СОК тяжелой цепи, такого как δΕΟ ГО N0:1, δΕΟ ГО N0:2 и δΕΟ ГО N0:3 (собранной вместе так, чтобы имитировать зрелую, полностью реаранжированную вариабельную область тяжелой цепи), достаточно для задания вариабельной области тяжелой цепи по изобретению.

ЮКУ2-28 (δΕΟ ГО N0:16) представляет собой последовательность антитела зародышевой линии человека, которая является подходящим акцепторным каркасом для привития СОК У_ь. В конкретном аспекте акцепторный каркас легкой цепи антитела человека происходит из ЮКУ2-28.

Чтобы полностью сконструировать У-область, каркасную область 4 необходимо добавить к ЮКУ228, кодируемой У-геном зародышевой линии. Подходящие последовательности каркасной области 4 включают таковые, кодируемые минигеном 1К-1 человека (КаЬа1):

ΑΊΤαΟΟΤΚΥΕΙΚ (δΕΟ ΙΌ N0:18).

Специалисту очевидно, что У-ген и 1-ген зародышевой линии не содержат кодирующей последовательности для полного С0К3 легкой цепи. Тем не менее в антителах по изобретению последовательность С0К3 обеспечивается донорным иммуноглобулином. Первые два остатка из остатков минигена 1К-1 попадают в область С0К3. Для минигена 1К-1 эти остатки идентичны последним двум остаткам в легкой цепи СОКЬ3 (δΕΟ ΙΌ N0:6). Соответственно комбинации УЪ-гена, такого как ЮКУ2-28, РК4 (каркасной области 4), такой как 1К-1, и набора СОК легкой цепи, такого как δΕΟ ГО N0:4, δΕΟ ГО N0:5 и δΕΟ ГО N0:6, (собранной вместе с тем, чтобы имитировать зрелую, полностью реаранжированную вариабельную область легкой цепи) достаточно для задания вариабельной области легкой цепи по изобретению.

В конкретном воплощении изобретения акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека происходит из ЮНУ1-24 и минигена 1Н4, а акцепторный каркас легкой цепи антитела человека происходит из ЮКУ2-28 и минигена 1К-1, возможно с одной или более заменами аминокислотных остатков на основе соответствующих остатков, найденных в донорном У_Н-домене, имеющем последовательность: δΕΟ Ι_Β N0:19, и У_ъ-домене, имеющем последовательность: δΕΟ ГО N0:21, которые обеспечивают всю или, по существу, всю аффинность связывания донорного антитела с β-амилоидным пептидом. Под термином по существу, вся аффинность связывания понимают, что терапевтическое антитело характеризуется не более чем пятикратным, более конкретно двукратным уменьшением аффинности связывания по сравнению с донорным антителом.

В более конкретном воплощении акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека, происходя- 5 022913 щий из ΙΟΗΥ1-24 и 1Н4, содержит следующие остатки (или их консервативную замену):

Нумерация остатка по КаЬа!	Остаток из каркаса антитела человека (донор 1СН\/1-24)	Замена остатков
13	К	Е
24	V	Θ
27	Υ	Г
28	Т	N
29	1_	I
30	т	К
37	V	ί
40	А	ί
48	М	I
66	К	к
67	V	А
69	М	I.
71	Е	V
93	А	V
94	Т	3

В более конкретном воплощении изобретения акцепторный каркас легкой цепи антитела человека, происходящий из ΙΟΚΥ2-28 и 1К-1, содержит следующие остатки (или их консервативную замену):

Нумерация остатка по КаЬа1	Остаток из каркаса антитела человека (донор ΙΘΗνΐ-24)	Замена остатков
11	ί	N
64	С	5

1.1. Интактные антитела.

Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут представлять собой интактные антитела. Антигенсвязывающий белок по изобретению включает терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающие фрагмент и/или производное. Интактные антитела обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые и две легкие цепи. За исключением 1дМ интактные антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, составленные из двух одинаковых легких (Ь) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Обычно каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями разных изотипов иммуноглобулинов варьирует. Кроме того, каждая тяжелая и легкая цепь имеют дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (ν_Η), за которым следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (УД и константную область на его другом конце; константная область легкой цепи располагается на одной линии с первой константной областью тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи располагается на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи антител большинства видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух типов, называемых каппа и лямбда на основании аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области своих тяжелых цепей человеческие антитела могут быть отнесены к пяти разным классам: 1дА, 1§И, 1дЕ, 1§О и 1дМ. 1§О и 1дА могут быть дополнительно подразделены на подклассы Ι§01, Ι§02, Ι§03 и Ι§04; и 1§А1 и 1§А2. Видовые варианты существуют у мышей и крыс, имеющих по меньшей мере Ι§Ο2α. Ι§026. Вариабельный домен антитела обуславливает специфичность связывания антитела благодаря наличию определенных областей, проявляющих особую вариабельность, называемых определяющими комплементарность участками (СИК). Наиболее консервативные части вариабельной области называются каркасными областями (РК). Вариабельные домены каждой из интактных тяжелых и легких цепей содержат четыре РК, соединенные тремя СИК. СИК в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга благодаря РК-областям и вместе с СИК другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител. Константные области непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АИСС), в фагоцитозе посредством связывания с Рсу-рецептором, в регулировании периода полувыведения/скорости клиренса посредством неонатального Рс-рецептора (РсКп) и в комплементзависимой цитотоксичности посредством компонента С1с| каскада комплемента. Сообщалось, что константная область Ι§02 человека, по существу, лишена способности активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Сообщалось, что константная область 1§С4 лишена способности активировать комплемент классическим путем и только слабо опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела, по существу, лишенные этих эффекторных функций, могут быть названы нелитическими антителами.

1.1.2. Химерные и гуманизированные антитела.

- 6 022913

Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Применение интактных антител, отличных от человеческих, в лечении заболеваний или расстройств человека влечет за собой хорошо установленные в настоящее время проблемы возможной иммуногенности, особенно после повторного введения антител: то есть иммунная система пациента может распознавать интактное антитело, отличное от человеческого, как не свое и вызывать нейтрализующий ответ. В дополнение к разработке полностью человеческих антител (см. выше) с годами были разработаны различные методики для преодоления этих проблем, и они как правило включают уменьшение состава отличных от человеческих аминокислотных последовательностей в интактном терапевтическом антителе при одновременном сохранении относительной простоты в получении отличных от человеческих антител из неиммунизированных животных, например мыши, крысы или кролика. Для достижения этого широко используются два подхода. Первый представляет собой получение химерных антител, которые, как правило, содержат отличный от человеческого (например, от грызуна, такого как мышь) вариабельный домен, слитый с константной областью человеческого антитела. Поскольку антигенсвязывающий сайт антитела локализован внутри вариабельных областей, такое химерное антитело сохраняет присущую ему аффинность связывания с антигеном, но приобретает эффекторные функции константной области человеческого антитела и, следовательно, способно осуществлять эффекторные функции, как, например, описанные выше (выше). Химерные антитела обычно получают, используя методы рекомбинантной ДНК. Выделяют ДНК, кодирующую антитела, (например, кДНК) и секвенируют, используя традиционные методики (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с генами, кодирующими вариабельные области Н- и Ь-цепей антитела по изобретению, например ДНК с δΕΟ ГО N0:19 и 21, описанную выше). Гибридомные клетки служат в качестве типичного источника такой ДНК. После выделения ДНК помещают в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки хозяина, такие как Е.соП клетки С08 (фибробласты африканской зеленой мартышки), клетки СНО, клетки РегСб (человеческой сетчатки) или клетки миеломы, которые без этого не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для синтеза антитела. ДНК может быть модифицирована посредством замены кодирующей последовательности Ь- и Н-цепей на соответствующие Н- и Ь-константные области отличного от человеческого антитела (например, мышиного), см., например, Моткоп, ΡΝΑδ 81, 6851 (1984). Таким образом, в другом воплощении изобретения предложено химерное антитело, содержащее У_н-домен, имеющий последовательность δΕΟ ГО N0:19, и У_ъ-домен, имеющий последовательность δΕΟ ГО N0:21, слитые с константной областью (которая может быть изотипом 1§0, например 1§01) антитела человека.

Второй подход вовлекает создание гуманизированных антител, где содержание отличного от человеческого антитела уменьшено посредством гуманизации вариабельных областей. Популярны две методики гуманизации. Первая представляет собой гуманизацию посредством СГОР-привития. СОК формирует петли близко к Ν-концу антитела, где они формируют поверхность, закрепленную на остове, обеспечиваемом каркасными областями. Специфичность связывания антигена с антителом определяется главным образом топографией и химическими характеристиками поверхности его СОК. Эти характеристики, в свою очередь, определяются конформацией индивидуальных СОК, относительным расположением СОК и природой и расположением боковых цепей остатков, входящих в состав СОК. Большое снижение иммуногенности может быть достигнуто посредством привития только СОК нечеловеческого антитела (например, мышиного) (донорного антитела) на подходящий каркас (акцепторный каркас) и константные области антитела человека (см. 1опек е1 а1. (1986) №1иге, 321, 522-525 и УегНоеуеп М. е1 а1. (1988) §с1еисе, 239, 1534-1536). Однако само по себе СОК-привитие может не привести к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто обнаруживают, что некоторые остатки каркаса донорного антитела необходимо сохранить (иногда это называется как обратная мутация) в гуманизированной молекуле, если необходимо восстановить значительную аффинность связывания антигена (см. Оиееп С. е1 а1. (1989) ΡΝΑδ, 86, 10029-10033; Со, М е1 а1. (1991) №1иге, 351, 501-502). В этом случае У-области антитела человека, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательности (обычно на 60% или более) к донорному отличному от человеческого антителу, могут быть выбраны из базы данных для получения каркасных областей (РК) антитела человека. Отбор человеческих РК может быть проведен или на основании общих типичных элементов структуры антитела человека, или на основании индивидуальных антител человека. В случае необходимости ключевые остатки донорного антитела заменяют в акцепторном каркасе антитела человека для сохранения конформаций СОК. Для облегчения идентификации таких структурно важных остатков может быть использовано компьютерное моделирование антител, см. \Е0 99/48523.

Альтернативно, гуманизация может быть достигнута в результате процесса облицовки (уепеегшд). Статистический анализ уникальных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека и мыши показал, что точные картины экспонированных остатков различны в антителах человека и мыши, и для большинства индивидуальных положений на поверхности отдается строгое предпочтение небольшому числу разных остатков (см. Рай1ап Е.А. е1 а1; (1991) Мо1. 1ттипо1., 28, 489-498 и Рейегкеп ТТ. е1 а1. (1994) 1. Мо1. Вю1., 235: 959-973). Следовательно, возможно снизить иммуногенность Ρν отличного от человеческого антитела посредством замены тех экспонированных остатков

- 7 022913 в их каркасных областях, которые отличаются от остатков, обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку антигенность белка может быть скоррелирована с доступностью поверхности, замена поверхностных остатков может быть достаточной для того, чтобы сделать вариабельную область антитела мыши невидимой для иммунной системы человека (см. также Магк О.Е. и соавт. (1994) в НаибЬоок оГ Ехрег1теи!а1 РЬагтасо1оду, νοί. 113: Тйе рйагтасо1оду оГ топос1опа1 ЛибЬоЛез, 8рбидег-Уебад, рр. 105-134). Эта методика гуманизации называется облицовкой, потому что изменяется только поверхность антитела, опорные остатки остаются незатронутыми. Другие альтернативные подходы включают подходы, приведенные в \УО 04/006955, и методику Нитаиеебид™ (Ка1оЬю8), в которой применяют бактериальные экспрессирующие системы и продуцируют антитела, близкие по последовательности к антителам зародышевой линии человека (А1Геш!о-М. Л^аисшд Рго!еш Тйегареибск, 1аииату 2007, §аи О|едо. СаПГогша).

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что термин происходящий предназначен для обозначения не только источника в смысле физического происхождения материала, но также и для определения материала, структурно идентичного данному материалу, но не происходящему из указанного источника. Так, остатки, обнаруженные в донорном антителе не обязательно являются остатками, выделенными из донорного антитела.

В данной области техники общеизвестно, что некоторые аминокислотные замены считаются консервативными. Аминокислоты подразделяют на группы на основании общих свойств боковой цепи, и замены внутри группы, при которых сохраняется вся или по существу вся аффинность связывания терапевтического антитела по изобретению, рассматриваются как консервативные замены (см. следующую далее табл. 1).

Таблица 1

Боковая цепь	Члены
Гидрофобная	те1, а1а, уа1,1еи, ϊΐβ
Нейтральная гидрофильная	сув, эег, (Иг
Кислотная	азр, д|и
Основная	аэп, д1п, Τιί®, 1уэ, агд
Остатки, которые влияют на ориентацию цепи	д!у, рго
Ароматическая	1гр, (уг, рИе

2. Способы продуцирования.

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в трансгенных организмах, таких как козы (см. Ро11оск е! а1. (1999), 1. 1ттиио1. Ме!йоб8, 231: 147-157), цыплята (см. Могготе К.1.1. (2000) Оеиек Еид. №те, 20: 1-55), мыши (см. Ро11оск и др., там же) или растения (см. Потаи Р.М., (2000) Сигг. Оршюи Вю!есПио1. 11, 199-204; Ма ТК.-С. (1998), Ыа1. Меб. 4: 601-606; Вае/ 1. е! а1., ВюРйагт (2000) 13: 50-54; §!одег Е е! а1. (2000) Р1аи! Мо1. Βί6. 42: 583-590). Антитела также могут быть получены посредством химического синтеза. Тем не менее антитела по изобретению обычно получают, используя технологию рекомбинантного клеточного культивирования, хорошо известную специалистам в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и вставляют в репликативный вектор, такой как плазмида, для дальнейшего размножения или экспрессии в клетке хозяина. Одной из полезных экспрессионных систем является глутаматсинтетазная система (как, например, поставляемая на рынок бои/а В1о1од1е8), в частности, в которой клеткой-хозяином является СНО или N80 (см. ниже). Полинуклеотид, кодирующий антитело, легко выделяют и секвенируют, используя общепринятые методики (например, олигонуклеотидные зонды). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, среди которых плазмиды являются типичным воплощением. Как правило, такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь, так чтобы облегчить экспрессию. Полинуклеотид, кодирующий легкую и тяжелую цепи, может быть вставлен в отдельные векторы и введен (например, посредством трансформации, трансфекции, электропорации или транедукции) в ту же клетку хозяина одновременно или последовательно или, если это желательно, обе цепи, и тяжелая цепь и легкая цепь, могут быть вставлены в один и тот же вектор перед таким введением.

Специалистам в данной области техники будет естественно очевидно, что ввиду избыточности генетического кода также применимы альтернативные изложенным в данном описании полинуклеотиды, которые будут кодировать полипептиды по изобретению.

2.1. Сигнальные последовательности.

Антигенсвязывающие белки, например антитела по настоящему изобретению, могут быть продуцированы в виде слитого белка с гетерологической сигнальной последовательностью, имеющей специфический сайт расщепления на Ν-конце зрелого белка. Сигнальная последовательность должна распознаваться и процессироваться клеткой хозяина. В случае прокариотических клеток хозяина сигнальная по- 8 022913 следовательность может представлять собой лидерные последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах сигнальными последовательностями могут быть лидерная последовательность дрожжевой инвертазы, лидерная последовательность α-фактора или лидерные последовательности кислой фосфатазы, см., например, νθ 90/13646. В системах клеток млекопитающих приемлемыми являются вирусные секреторные лидерные последовательности, такие как сигнальная последовательность гликопротеина дЭ вируса простого герпеса, и природные сигнальные последовательности иммуноглобулинов (как например, тяжелой цепи 1д человека). Обычно сигнальную последовательность пришивают в рамке считывания к полинуклеотиду, кодирующему антитело по изобретению.

2.2. Ориджин репликации.

Ориджины репликации хорошо известны в данной области техники, при этом ориджин от рВК.322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, от 2 мкм плазмиды - для большинства дрожжей, а различные ориджины вирусов, таких как 8У40 (обезьяний вирус 40), вирус полиомы, аденовирус, У8У (вирус везикулярного стоматита) или ВРУ (папилломавирус крупного рогатого скота) для большинства клеток млекопитающих. Как правило, нет необходимости в компоненте ориджине репликации 8У40 для комбинированных экспрессирующих векторов для млекопитающих. Однако ориджин 8У40 может быть включен, поскольку содержит ранний промотор.

2.3. Селектируемый маркер.

Типичные селектируемые гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или (б) дополняют ауксотрофные дефициты или снабжают питательными веществами, недоступными в составе сред или (в) комбинируют того и другого. Схема селекции может включать остановку роста клетки хозяина, не содержащей вектор или векторы. Клетки, которые успешно трансформированные генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают ввиду, например, лекарственной устойчивости, придаваемой совместно доставляемым селектируемым маркером. Одним из примеров является селекционная система на основе ΌΗΡΚ (дигидрофолатредуктаза), где получают трансформантов отрицательных по ΌΗΡΚ штаммов хозяина (например, см. Раде апД 8уДепйаш, 1991, Вю!есйпо1оду 9: 64-68). В этой системе ген ΌΗΡΚ доставляется вместе с полинуклеотидными последовательностями антигенсвязывающего белка, то есть антитела, по изобретению, и ΌΗΡΚположительные клетки затем отбирают посредством отмены нуклеозидов. При желании также используют ингибитор ΌΗΡΚ, метотрексат, для отбора трансформантов с амплифицированным геном ΌΗΡΚ. Благодаря функциональному связыванию гена ΌΗΡΚ с последовательностями по изобретению, кодирующими антигенсвязывающий белок, например антитело или его функциональные производные, амплификация гена ΌΗΡΚ приводит к сопутствующей амплификации представляющих интерес последовательностей желаемого антигенсвязывающего белка, например антитела. СНО-клетки являются особенно полезной клеточной линией для такой селекции с использованием ΌΗΡΚ/метотрексата, и методы амплификации и селекции клеток хозяина с использованием системы на основе ΌΗΡΚ общеприняты в данной области техники, см. КаиРтап Κ.Ρ е! а1. 1. Мо1. Вю1. (1982) 159, 601-621, в качестве обзора см. Vе^ие^ Κ.Ο., Ыое V., Корр К., 8сЬ1и1ег М., Арргорпа!е таттайаи ехргеккюп 8у81ет8 Рог ЬюрйагтасеиДсаН, 48(8): 870-80, 1998 Аид. Другим примером является глутаматсинтетазная экспрессионная система (ВеЬЫпдроп е! а1. Вю1есйио1оду, 1992, Уо1. 10, р. 169). Подходящим селектируемым геном для применения в дрожжах является ген 1гр1; см. 8ДпсЬсотЬ е! а1. №Циг2 .а8Пр®цДР979ы.

Подходящие промоторы для экспрессии антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующей/кодирующим антигенсвязывающий белок, например антитело. Промоторы для прокариотических хозяев включают рйоА-промотор, бета-лактамазные и лактозные промоторные системы, промотор щелочной фосфатазы, триптофановый промотор и гибридные промоторы, такие как Тас (полученный из промоторов триптофанового и лактозного оперонов). Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают промоторы 3фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, например енолазы, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы и глюкокиназы. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают промоторы алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, металлотионеина и ферментов, отвечающих за метаболизм азота или утилизацию мальтозы/галактозы.

Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающих включают промоторы РНКполимеразы II, в том числе промоторы вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашних птиц и аденовирусы (например, аденовирус 2), папилломавирус крупного рогатого скота, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус (в особенности промотор немедленно ранних генов), ретровирус, вирус гепатита В, промотор актина, промотор вируса саркомы Рауса (Κ8Υ) и ранний или поздний промотор обезьянего вируса 40, и невирусные промоторы, такие как ΕΡ-1-альфа (М|/и5Ыта апД Ыада!а, Ыис1е1с АаДк Ре5. 1990 18(17): 5322). Выбор промотора может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина.

- 9 022913

2.5. Энхансерный элемент.

Там, где это целесообразно, например, для экспрессии в высших эукариотах, могут быть введены дополнительные энхансерные элементы вместо или вместе с таковыми, находящимися в описанных выше промоторах. Подходящие энхансерные последовательности для млекопитающих включают энхансерные элементы глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионина и инсулина. Альтернативно, можно использовать энхансерный элемент вируса эукариотических клеток, такой как энхансер 8У40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, бакуловирусный энхансер или локус мышиного 1дС2а (см. νθ 04/009823). Хотя такие энхансеры обычно располагаются в векторе в сайте вверх по течению по отношению к промотору, они могут быть расположены и в другом месте, например, внутри нетранслируемой области или вниз по течению по отношению к сигналу полиаденилирования. Выбор и расположение энхансера может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина.

2.6. Полиаденилирование/терминирование.

В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок, например антитело, по данному изобретению. Такие сигналы обычно помещают с З'-конца открытой рамки считывания. В системах млекопитающих неограничивающие примеры сигналов включают таковые, происходящие из ростовых гормонов, фактора элонгации 1-альфа и вирусных (например, 8У40) генов или ретровирусных длинных терминальных повторов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминирования включают таковые, происходящие из генов фосфоглицераткиназы (РСК) и алкогольдегидрогеназы 1 (ΑΌΗ). В прокариотических системах сигналов полиаденилирования обычно не требуется, и вместо них обычно используются более короткие и более определенные терминирующие последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/терминирования может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина.

2.7. Другие способы/элементы для увеличения выходов.

В дополнение к упомянутому выше, другие особенности конструкции, которые могут быть использованы для увеличения выходов, включают хроматин-ремоделирующие элементы, интроны и модификацию кодонов, специфичную для клеток хозяина. Поэтому использование кодонов антигенсвязывающих белков, например антитела, по данному изобретению, может быть модифицировано с целью согласования статистического отклонения кодонов (собой Ыак) клетки-хозяина для увеличения выхода транскрипта и/или продукта (например, Ноекета Α. е! а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ., 1987, 7(8): 2914-24). Выбор кодонов может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина.

2.8. Клетки хозяина.

Подходящими клетками хозяина для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, являются прокариотические, дрожжевые клетки или клетки высших эукариот. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерии, например энтеробактерии, такие как ЕкскегюЫа, например Е.соП (например, АТСС 31446; 31537; 27325), Еи!егоЪас1ег. Ег\уииа. К1еЪ81е11а Рго!еи8, 8а1тоие11а, например 8а1тоие11а (урЫтигшт, 8еггайа, например 8еггайа тагсезсаиз, и 8Ыде11а, а также ВашШ, такие как В. 8иЪ!Ш8 и В .ПскешГогпщ (см. ΌΌ 266710), Р8еиботопа8, такие как Р. аегидшо8а, и 8!гер!отусе8. Из дрожжевых клеток хозяев рассматриваются 8асскаготусез сегеу181ае, 8с1и/о8ассПаготусе8 ротЪе, К1иууеготусе8 (например, АТСС 16045; 12424; 24178; 56500), Уагго\\щ (ЕР402, 226), РюЫа ра81ог18 (ЕР183070, см. также Рейд е! а1., 1. Вю1есЬио1. 108 (2004) 185-192), также рассматриваются клетки хозяина СаибШа, ТпсПобегта гее81а (ЕР244234), РешаШи, То1урос1аШит и А8регдШи8, такие как Α. шби1аи8 и Α. шдег.

Несмотря на то что данным изобретением рассматриваются конкретно прокариотические и дрожжевые клетки хозяина, тем не менее в общем случае клетки хозяина по настоящему изобретению представляют собой клетки позвоночных. Подходящие клетки хозяина позвоночных включают клетки млекопитающих, такие как СО8-1 (№ в АТСС: СКЬ 1650), СО8-7 (ΑΤίΥ СКЬ 1651), клеточная линия 293 почки эмбриона человека, РегС6 (Сгисе11), клетки почки детеныша хомячка (ВНК) (АТСС СКЬ 1632), ВНК570 (№ в АТСС: СКЬ 10314), 293 (№ в АТСС: СКЬ 1573), клетки яичников китайского хомячка СНО (например, СНО-К1, № в АТСС: ССЬ 61, клеточная линия, дефектная по ΌΗΡΡ, такая как ЭС44 (Иг1аиЪ е( а1., 8ота!. Се11 Мо1. Сеие!. (1986) Уо1. 12, рр. 555-566), в частности те клеточные линии СНО, которые адаптированы для суспензионной культуры, мышиные клетки Сертоли, клетки почки обезьяны, клетки почки зеленой африканской мартышки (АТСС СКЬ-1587), ΗЕ^Α-клетки, клетки почки собаки (АТСС ССЬ 34), клетки легкого человека (АТСС ССЬ 75), Нер С2 (линия гепатоцеллюлярной карциномы человека) и клетки миеломы или лимфомы, например N80 (см. И8 5807715), 8р2/0, Υ0.

Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложена стабильно трансфицированная клетка-хозяин, содержащая вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела, как изложено в данном описании. Обычно такие клетки хозяина содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий указанную тяжелую цепь.

Такие клетки хозяина также могут быть дополнительно сконструированы или адаптированы с целью модификации качества, функции и/или выхода антигенсвязывающего белка, например антитела по

- 10 022913 данному изобретению. Неограничивающие примеры включают экспрессию специфически модифицирующих (например, посредством гликозилирования) ферментов и шаперонов белкового фолдинга.

2.9. Способы культивирования клеток.

Клетки хозяина, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, можно культивировать любым способом, известным специалистам в данной области техники. Клетки хозяина можно культивировать в роллерных колбах, встряхиваемых колбах, роллерных флаконах, волновых реакторах (например, 8у8!ет 1000 от №ауеЫо!есй.сот) или системах на полых волокнах, но предпочтительным для продуцирования в больших масштабах является использование реакторов с механическим перемешиванием или контейнерных реакторов (например, \Уауе Вю!есЬ, 8отег8е!, №\ν 1ет8еу, И8Л), в особенности для суспензионных культур. Обычно реакторы с механическим перемешиванием адаптируют для аэрирования, используя например барботеры, дефлекторы или импеллеры с низкой скоростью сдвига. Для барботирующих ферментеров и аэролифтных реакторов можно использовать непосредственное аэрирование пузырьками воздуха или кислорода. Когда клетки хозяина культивируют в культуральной среде, не содержащей сыворотки, она может быть дополнена защищающим клетки агентом, таким как Плуроник Р-68, для предупреждения разрушения клеток в результате процесса аэрирования. В зависимости от характеристик клетки хозяина либо можно использовать микроносители в качестве субстратов для нуждающихся в закреплении клеточных линий, либо клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (что типично). Культивирование клеток хозяина, в частности клеток хозяина позвоночного, можно осуществлять в разнообразных рабочих режимах, таких как периодический, периодический со снабжением сырьем, повторяющийся периодический режим проведения процесса (см. Эгареан е! а1. (1994) Су!о!есйпо1оду 15: 103-109), длительный периодический режим проведения процесса или режим в проточной культуре. Хотя рекомбинантно трансформированные клетки хозяина млекопитающего можно культивировать в средах, содержащей сыворотку, такую как фетальная телячья сыворотка (РС8), предпочтительно, чтобы такие клетки хозяина культивировали в средах, не содержащих сыворотки, как например изложено в Кееп е! а1. (1995) Су!о!есйпо1оду 17: 153-163, или имеющихся в продаже средах, таких ка РгоСНО-СЭМ или иИтаСНО™ (СатЬгех N1, И8Л), дополненных при необходимости источником энергии, таким как глюкоза, и синтетическими ростовыми факторами, такими как рекомбинантный инсулин. Для культивирования клеток хозяина в несодержащих сыворотки средах может потребоваться адаптация этих клеток для роста в условиях отсутствия сыворотки. Один из подходов адаптации состоит в культивировании таких клеток хозяина в средах, содержащих сыворотку, и периодической замене 80% культуральной среды на несодержащие сыворотки среды, с тем чтобы научить клетки хозяина адаптироваться к условиям в отсутствие сыворотки (см., например, 8сНагГепЬегд К. е! а1. (1995) в Лшта1 Се11 !есйпо1оду: Эеуе1ортеп15 Ю\\агб8 1Не 21δ! сеп!игу (Веиуегу Е.С. е! а1. еб§), рр. 619-623, К1и\уег Лсабетю риЬЙ8Йет8).

Антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, секретируемые в среды, можно извлечь и очистить из сред, используя разнообразные методики с получением степени чистоты, подходящей для предполагаемого использования. Например, использование терапевтических антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению для лечения пациентов людей обычно требует по меньшей мере 95% чистоты по данным 8Ό8-ΡΑΟΕ в восстанавливающих условиях, более типично 98% или 99% чистоты, по сравнению с культуральными средами, содержащими терапевтические антигенсвязывающие белки, например антитела. В первую очередь из культуральных сред обычно удаляют клеточный дебрис, используя центрифугирование с последующей стадией осветления супернатанта с применением, например микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубинной фильтрации. Альтернативно, антигенсвязывающий белок, например антитело, может быть собран микрофильтрацией, ультрафильтрацией или глубинной фильтрацией без предварительного центрифугирования. Доступно большое количество других методик, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографических методик, таких как хроматография на гидроксиапатите (НА), аффинная хроматография (возможно с использованием системы аффинного мечения, например, с применением полигистидина) и/или хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С, см. И8 5429746). В одном воплощении антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению после различных стадий осветления захватывают с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или С с последующими хроматографическими стадиями, такими как ионообменная хроматография и/или хроматография на НА, анионный или катионный обмен, эксклюзионная хроматография и осаждение сульфатом аммония. Обычно кроме этого применяют различные стадии для удаления вирусов (например, нанофильтрацию с использованием, например фильтра Όν-20). Проведение этих различных стадий обеспечивает получение очищенного (обычно моноклонального) препарата, содержащего по меньшей мере 10 мг/мл или более, например 100 мг/мл или более антитела по изобретению и следовательно составляет воплощение данного изобретения. Концентрация до 100 мг/мл или более может быть получена с применением ультрацентрифугирования. Соответственно такие препараты, по существу, не содержат агрегированных форм антител по изобретению.

Для экспрессии фрагментов антител особенно пригодны бактериальные системы. Такие фрагменты локализуются во внеклеточном пространстве или в периплазме. Нерастворимые периплазматические белки можно экстрагировать и подвергнуть рефолдингу с образованием активных белков в соответствии

- 11 022913 со способами, известными специалистам в данной области техники, см. 8апсНс/ е! а1. (1999) 1. Вю1ес1то1. 72, 13-20 и Сирй Р.М. е! а1. (1999) Ьей. Арр1. МютоЬюк, 29, 273-277.

3. Фармацевтические композиции.

Очищенные препараты антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению (в частности моноклональные препараты), как описано выше, могут быть включены в фармацевтические композиции для применения в лечении заболеваний и расстройств человека. Обычно такие композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый (то есть инертный) носитель, как его понимают и называют в приемлемой фармацевтической практике, см. например РетищЮщ Рйаттасеийса1 8с1еисе8, 16е издание (1980), Маск РиЬйкЫид Со. Примеры таких носителей включают стерильные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, забуференные подходящими буферами, такими как тригидрат ацетата натрия, до фармацевтически приемлемого рН, как например рН в диапазоне от 5 до 8. Фармацевтические композиции для инъекции (например, посредством внутривенной, внутрибрюшинной, интрадермальной, подкожной, внутримышечной доставки, доставки через воротную вену или посредством местной доставки в глаз путем местного или периокулярного нанесения в область глаза или инъекции в стекловидное тело глаза) или непрерывной инфузии соответственно не содержат видимых твердых частиц и могут содержать от 1 мг до 10 г терапевтического антигенсвязывающего белка, например антитела, обычно 5 - 1 мг, в частности 5 - 25 мг или 50 мг антигенсвязывающего белка, например антитела. Способы изготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области техники. В одном из воплощений фармацевтические композиции содержат от 1 мг до 10 г терапевтических антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями по применению. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть лиофилизированными (подвергнутыми сублимационной сушке) для повторного разведения перед введением в соответствии со способами, хорошо известными или очевидными специалистам в данной области техники. В тех случаях, когда воплощения данного изобретения содержат антитела по изобретению с изотипом 1дС1, в фармацевтическую композицию может быть добавлен хелатор ионов металлов, в том числе меди, такой как цитрат (например, цитрат натрия), или ΕΌΤΑ, или гистидин, для уменьшения степени металл-опосредованного разрушения антител этого изотипа, см. ЕР 0612251. Фармацевтические композиции также могут содержать солюбилизатор, такой как аргинин в форме основания, детергент/агент против агрегации, такой как полисорбат 80, и инертный газ, такой как азот, для замещения кислорода в свободном пространстве над поверхностью продукта.

Эффективные дозы и схемы лечения для введения антигенсвязывающего белка, например антитела, по изобретению обычно определяют эмпирически, и они зависят от таких факторов как возраст, масса и состояние здоровья пациента и заболевание или расстройство, которое будет подвергнуто лечению. Такие факторы находятся в сфере компетенции лечащего врача. Руководство в выборе соответствующих доз можно найти, например в 8тйй е! а1. (1977) АийЬоФек ίη йитаи Фадио818 аиб Фетру, Кауеи Рге88, №\ν Уогк, но в общем случае они будут находиться в диапазоне от 1 мг до 10 г. В одном из воплощений режим дозирования для лечения пациента человека составляет от 1 мг до 1 г терапевтического антитела по изобретению, вводимого подкожно один раз в неделю или каждые две недели либо путем внутривенной инфузии каждый месяц или каждые 2 месяца. Такое введение соответствует дозе 0,014-140 мг/кг, например 0,014-14 мг/кг. Композиции по настоящему изобретению также можно использовать в профилактических целях.

Кроме этого, композиции могут быть доставлены более локально в глаз или путем местного применения, или путем инъекции в стекловидное тело, или путем периокулярного введения, то есть под склеру посредством или ретробульбарной, или околобульбарной инъекции, или инъекции в субтеновое пространство глаза, или подконъюктивальной инъекции. Для уменьшения друз может быть достаточно системного введения посредством, например, внутривенного введения терапевтического антитела. С помощью других способов местного введения можно обеспечить более легкое достижение терапевтическим антителом заднего сегмента глаза при более низких дозах. Описано, что местное нанесение способствует проникновению фрагментов антител в заднюю часть глаза в мышиной модели (\УППат8 К.А., ВегеЮп Н.М., Ратта11 А., 81аибйе1б 8.Ό., Тау1ог 8.Ό., Кик Ь.А., Со81ег Ό.Ε (2005) Еуе 19: 910-913). Описана инъекция в стекловидное тело фрагментов антител или целых моноклональных антител, и она хорошо переносится пациентами с АМЭ, что касается продуктов ранибизумаба и бевацизумаба. Терапевтическое антитело также может быть введено с использованием интравитреального имплантата. Ретробульбарные и околобульбарные инъекции могут быть осуществлены с использованием специальных игл с размером от 23 до 26, и они менее инвазивны, чем инъекции в стекловидное тело. Благодаря инъекции в субтеновое пространство глаза композиция будет находиться в контакте со склерой длительное время, что может помочь проникновению в заднюю часть глаза. Инъекция белков точно под конъюнктиву описана в кроличьих моделях, и это позволяет молекулам напрямую диффундировать через склеру, достигая заднего сегмента глаза. Также могут быть применены системы доставки с непрерывным высвобождением лекарственного средства, которые позволяют осуществлять высвобождение вещества в течение длительного интервала времени в глаз или в область вокруг глаза для того, чтобы введение можно было осуществлять

- 12 022913 менее часто. Такие системы включают мицеллы, гели, гидрогели, наночастицы, микрокапсулы или имплантаты, которые могут быть заполнены или покрыты терапевтической композицией. Их можно доставлять в стекловидное тело глаза путем инъекции или любым другим описанным ранее менее инвазивным способом, то есть посредством периокулярного введения или введения под склеру. Примеры таких систем с непрерывным высвобождением и способы местной доставки включают термочувствительные гидрогели с медленным высвобождением для введения под склеру или интраветриального введения композиции на основе наночастиц, которая нацелена на задний слой сетчатки и КРЕ (Тапота К.О., Оииба 8., Бобби 8.Н.8., Мбта А.К., (2007) Ехрей. Θρίη. Бтид Бебу. 4: 371-388; Висб БО, Ыаид РО (2007) Ιηΐ. 1. Ыаиотеб. 2: 65-77).

Возможны многочисленные другие комбинации системы доставки и способа местного введения, и они могут быть рассмотрены для композиций терапевтического антитела. Кроме того, антитело можно доставлять с использованием физического устройства, такого как устройство для ионофореза (А’8ос1абои Ют Ке’еагсб ίη У18юи аиб Орб1ба1то1оду, 2008, Аиииа1 теебид, Αρτίΐ 27'¹' - Мау Г’¹. Ро’1ет8 № 98/А125 аиб № 1813/Б693 от ЕуеСа1е Рбатта: В1а1оск и др., и Рш/-Реге/ и др.).

4. Клинические применения.

Очевидно, что заболевания, характеризующиеся повышенными уровнями β-амилоида или βамилоидными отложениями, включают болезнь Альцгеймера, умеренную когнитивную недостаточность, синдром Дауна, наследственную церебральную геморрагию с β-амилоидозом типа Би1сб, церебральную β-амилоидную ангиопатию и различные типы дегенеративных деменций, как, например, таковые, ассоциированные с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикобазальной дегенерацией и болезнью Альцгеймера по типу болезни диффузных телец Леви, возрастной макулярной дегенерацией (АМБ), заболеваниями глаукомой разного типа и образованием Αβ-зависимой катаракты.

В одном из воплощений изобретения заболеванием, характеризующимся повышенными уровнями β-амилоида или β-амилоидными отложениями, является болезнь Альцгеймера.

В следующем воплощении изобретения заболеванием, характеризующимся повышенными уровнями β-амилоида или β-амилоидными отложениями, является возрастная макулярная дегенерация (АМБ), заболевания глаукомой разного типа и образование Αβ-амилоид-зависимой катаракты.

Несмотря на то что настоящее изобретение описано главным образом в отношении лечения заболеваний или расстройств человека, настоящее изобретение также может найти применение в лечении схожих заболеваний или расстройств у млекопитающих, не являющихся человеком.

Примеры

Методы.

АВ18200 - система флуоресцентной макроконфокальной клеточной детекции Аррбеб Вю8У81ет8 8200 для РМАТ;

В1асоге™/В1асоге - устройство, позволяющее измерять кинетику молекулярных взаимодействий в режиме реального времени с использованием 8РК (поверхностный плазмонный резонанс);

СМ5 - сенсорный чип В1асоте™ с универсальной поверхностью, покрытой матрицей из карбоксиметилированного декстрана;

с8ЬО - конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп;

ЕБ18А - твердофазный иммуноферментный анализ;

РМАТ - технология флуориметрического микроанализа (Аррбеб Вю8У81ет8);

РРЬС - быстрая жидкостная хроматография белков;

1НС - иммуногистохимия;

Шедта СЬ1000 минибиореакторы, поставляемые 1В8 1и1едта Вю’аеисе’;

М8Б® - Ме’о 8са1е Б1’соуету;

Рго8ерА НГГтар - колонки с иммобилизованным белком А для РРЬС, поставляемые ОЕ Неаббсате;

КБ - единицы резонансного отклика (условная единица для количественного измерения связывания с сенсорным чипом в измерениях с В1асоте);

8Б8-РАОЕ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия;

8РК - поверхностный плазмонный резонанс - физическое явление, применяемое в устройствах В1асоте™ для измерения изменений массы на сенсорном чипе;

8Р88 - программное обеспечение для статистического анализа;

8Ки - биосенсорная технология 8КИ ВГЫБ™, позволяющая производить регистрацию биохимических взаимодействий без применения метки.

Материалы.

В8А - бычий сывороточный альбумин;

С57/ВБ6 - С57 Ыаск 6 - обычная инбредная линия лабораторных мышей;

БАБ - 3,3'-диаминобензидин;

БАР1 - 4',6-диамидино-2-фенилиндол;

БМЕМ - модифицированная Дульбекко среда Игла;

- 13 022913

ΌΜδ0 - диметилсульфоксид;

ΌΤΤ - дитиотреит;

ΕΌΤΑ - этилендиаминтетрауксусная кислота;

РА - муравьиная кислота;

РСБ - фетальная телячья сыворотка;

Р1ТС - флуоресцеин-изотиоцианат;

С1и1атах - стабильная форма глутамина, добавляемая в культуральную среду (добавка: дипептид Ьаланин-Ь-глутамин);

НЕК - клетки почки эмбриона человека (293);

ΗΒδ-ΕΡ-буфер - универсальный буфер для В1асоге™, содержащий 0,01 М ΗΕΡΕδ рН 7,4; 0,15 М ЫаС1; 3 мМ ΕΌΤΑ; 0,005% поверхностно-активного вещества Р20;

ΗΕΡΕδ - Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-этансульфоновая кислота);

Н18(ос1еаг - агент для осветления тканей;

ΗΡΡ - пероксидаза хрена;

ΙΜδ - промышленный метилированный спирт;

Липофектамин - агент для трансфекции на основе катионных липидов, поставляемый Ιηνίΐτοдеи/СЪсо;

ЫаС1 - хлорид натрия;

Θρΐί-ΜΕΜ - среда от ^йтодеи/СЪсо на основе модифицированной среды Игла;

ΡΒδ - забуференный фосфатом физиологический раствор;

РРА - параформальдегид;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

ΡΡΌ - очищенное белковое производное;

ΡΚΡ Р12 - среда с питательной смесью Р-12 без фенолового красного;

ΚΙΒΙ - антигенный адъювант на основе эмульсии типа вода-в-масле;

ΚΤ-ΡΟΚ - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой;

ΤΑδΤΡΜ - линия дважды трансгенных мышей, созданная путем скрещивания мышей со шведской мутацией АРР695 (ΤΑδ10) с линией Ρδ-1Μ146ν(ΤΡΜ);

ΤΒδ - забуференный трисом физиологический раствор;

ΤππίδΕίδΙ - агент для липосомальной трансфекции, поставляемый Ρ^οтеда;

Трис ΗΤΊ - гидрохлорид трис-(гидроксиметил)аминометана;

Твин-20 - полиоксиэтиленсорбитан-монолаурат;

Версен - хелатирующий ионы металлов агент (этилендиаминтетрауксусная кислота).

Сокращения.

ΑΜΌ - возрастная макулярная дегенерация;

АРР - белок-предшественник амилоида;

ВМ - мембрана Бруха;

СРΗ - фактор комплемента Н;

СР1 - фактор комплемента I;

СНО - клетки яичников китайского хомячка;

СNV - неоваскуляризация хориоидеи;

СРМ - число импульсов в минуту;

СБР - спинномозговая жидкость;

Κν - интрацеребровентрикулярно;

1дС - иммуноглобулин С; в/б - внутрибрюшинно;

ΗΑΡΡ - человеческий белок-предшественник амилоида;

ΗΙΕΚ - индуцированное нагреванием восстановление антигена;

ΗνΤ - здоровый волонтер;

ΚΌ - равновесная константа диссоциации;

ΝΌδ - ΝΌδ нормальная сыворотка осла;

МО - возраст, выраженный в месяцах;

ΜΚΤ - среднее время удержания;

ОБ - наружные сегменты;

ΚΡΕ - клетки ретинального пигментного эпителия.

Образование мышиных моноклональных антител, специфичных к бета-амилоиду человека.

Одну группу мышей первоначально иммунизировали пептидом ССССNΚСΑIIС^ΜVСС (содержащим остатки 27-38 β-амилоида) (δΕΟ ΙΌ N0:7), присоединенным за Ν-конец к ΡΡΌ. Иммунный ответ этих мышей оценивали, отбирая образец сыворотки и тестируя его в ΕΜδΑ с конъюгатами овальбумина этого же пептида для определения титра антитела для иммунизированных мышей. Наблюдали только слабые ответы. В другом эксперименте группу мышей иммунизировали 10 мкг пептида

- 14 022913 ί'ΌΟΟΕΟνΟδΝΚΟΛΙΙΟΓΜνΟΟ (содержащего остатки 22-38 β-амилоида) (8ЕД ΙΌ N0:73), конъюгированного за Ν-конец к ΡΡΌ (очищенное белковое производное; СатЬгйде КекеагсБ ВюсБетюаЛ), в адъюванте ΡΙΒΙ посредством внутрибрюшинного введения. Иммунный ответ этих мышей оценивали как и ранее, отбирая образец сыворотки через 7 суток после каждой бустер-иммунизации и тестируя его в ЕЫ8А для определения титра антител у иммунизированных мышей. Как только мыши достигали состояния с оптимальным ответом (на основании сравнительного анализа титра антител в двух последних образцах сыворотки) после бустер-иммунизации с использованием 2,5 мкг конъюгата пептида, отбирали мышь с наилучшим титром антител и извлекали селезенку для получения гибридом. Гибридомы получали, выделяя клетки селезенки и производя их слияние с клетками миеломы, применяя методологию с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоля). Полученную в результате смешанную клеточную популяцию затем высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур.

Затем каждое из экспрессированных антител, содержащихся в культуральном супернатанте, подвергали скринингу в гомогенном иммуноанализе РМАТ (технология флуориметрического микроанализа). В результате этого каскадного скрининга были идентифицированы 29 положительных антител, отрицательных в отношении белка овальбумина, пассивно адсорбированного на полистирольных гранулах, но положительных в отношении:

(1) связанного с полистирольными гранулами конъюгата овальбумина с присоединенным за Νконец пептидом С000Е^V08NΚ0АII0^ΜV00 (22-38) (8ЕО ΙΌ N0:73);

(2) биотинилированного по Ν-концу пептида β-амилоида (1-40), связанного с покрытыми стрептавидином полистиролыными гранулами;

(3) биотинилированного по С-концу пептида β-амилоида (1-40), связанного с покрытыми стрептавидином полистирольными гранулами; и (4) биотинилированного по Ν-концу пептида β-амилоида (24-34), где остатки 24-34 β-амилоида представляют собой VС8NΚСΛIIС^ (8ЕД ΙΌ Ν0:8), связанного с покрытыми стрептавидином полистирольными гранулами.

Отобранные образцы супернатанта с антителами анализировали на предмет кинетики связывания с пептидом β-амилоида (1-40), как изложено ниже.

Определение констант скоростей диссоциации (кб), характеризующих связывание, в анализе с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

Устройство В1асоге А100 использовали для получения данных по кинетике диссоциации, характеризующих взаимодействие 29 отобранных антител с β-амилоидом (1-40). Для этого проточные ячейки стрептавидинового сенсорного чипа В1асоге модифицировали с использованием низких уровней биотинилированного по Ν-концу β-амилоида (1-40). Для каждого образца антитела получали три кривые и апроксимироаали к уравнениям скорости для получения скоростей диссоциации. Для 12 клонов дать оценку на основании константы скорости диссоциации было невозможно, так как в выбранных условиях эксперимента невозможно было измерить скорость диссоциации. Однако в этих условиях все 12 клонов показали значения константы скорости диссоциации (кб), равные по меньшей мере 10^-5.

Связывание с β-амилоидом человека по данным ЕЫ8А.

Идентифицированные выше 29 антител, содержащихся в супернатантах гибридом, повторно тестировали на предмет связывания с β-амилоидом (1-40) человека посредством ЕЫ8А. Для проведения обоснованного сравнения определяли концентрацию антител, содержащихся в культуральных супернатантах, используя количественный анализ ΙβΟ с помощью ЕЫ8А. Для определения изотипа функционального антитела, связывание с β-амилоидом человека анализировали посредством ЕЫ8А, используя набор антител для изотип-специфической детекции. Все 29 антител связывались с β-амилоидом (1-40) человека в этом формате ЕЫ8А. Изотипы для каждого связавшегося клонированного антитела могли быть идентифицированы с использованием изотипспецифического вторичного антитела к Ι§01, Ι§023 или Ι§Ο2Κ В одном случае наблюдали смесь функциональных изотипов.

Картирование эпитопов посредством ЕЫ8А с использованием перекрывающихся пептидов.

Эпитопы, распознаваемые 29 антителами, отобранными в результате первичного скрининга и содержащимися в супернатантах гибридом, картировали с помощью ЕЫ8А, используя набор из 31-го 12мерного перекрывающегося пептида, полностью перекрывающих последовательность пептида βамилоида (1-42). Все пептиды содержали С-концевой линкер из 3 аминокислот (глицин-серин-глицин) и концевой биотинилированный остаток лизина.

96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа в течение ночи при 4°С покрывали стрептавидином (8щша) (100 мкл; 0,5 мкг/лунка) в дистиллированной воде. Планшеты три раза промывали (РВ8/0,01% Твина 20) и лунки блокировали 3%-ным В8А (250 мкл/лунка) в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты три раза промывали и в трех повторах добавляли по 100 мкл растворов пептидов (0,5 мкг/лунка в 1%-ном В8А, 0,1%-ном Твине 20 в РВ8) на 3 ч при комнатной температуре. Кроме этого готовили контрольные лунки, содержащие только ΌΜ80. Планшеты промывали три раза и во все лунки добавляли по 100 мкл каждого из 29 супернатантов гибридом (разбавленных 1/20 в 1%-ном В8А/0,1%-ном Твине 20) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшеты промывали три раза и до- 15 022913 бавляли по 100 мкл/лунка конъюгата антитела против 1§С мыши с пероксидазой хрена (ЛтегзЬат, разбавленного 1:2000 в 1%-ном В8А, 0,1%-ном Твине 20 в РВ8). Планшеты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре, промывали три раза и детекцию связывания антитела проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (81дта) (100 мкл/лунка) в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре, регистрируя голубое окрашивание. Реакцию останавливали и оптическую плотность прочитывали для каждой лунки при 450 нм.

Все антитела связывались с очень схожей областью, содержащей мотив КОАПОЬМ (эквивалентный остаткам 28-35 β-амилоида) (8ЕО ГО N0:9).

Кинетика связывания, определенная в анализе с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

Аффинность связывания с β-амилоидом и кинетику для 8 антител, отобранных из пула 29 моноклинальных антител, более детально оценивали с использованием технологии В1асоге 3000. Захват очищенных препаратов антител мыши осуществляли на поверхности чипа с поликлональными антителами против 1§С мыши. Свежеприготовленный β-амилоид (1-40) человека разбавляли в буфере НВ8-ЕР и пропускали над поверхностью с захваченными антителами в концентрациях в диапазоне 4-500 нМ в течение 5 мин. Диссоциацию после введения пробы наблюдали в течение следующих 20 мин. Регенерацию осуществляли импульсной подачей 100 мМ Н₃РО₄. Было показано, что регенерация не влияла на последующие циклы захвата антитела и связывания с β-амилоидом. Для всех измерений использовали двойное сравнение против пустой (бланковой) поверхности и введений буфера сравнения. Полученные данные приведены в табл. 2.

Таблица 2. Данные по аффинности и кинетике для восьми отобранных очищенных антител, полученные с использованием В1асоге; показаны величины КО, полученные в одном эксперименте

тАЬ	(1/Мс)	кд (1/с)	№ (нМ)
2С1	6,63е4	1,29е-4	1,95
5С9	6,11е4	1,64е-4	2,69
404	7,32е4	8,27е-5	1,13
501	5,7е4	1г47е-4	2,57
6Р6	1,06е5	6,57е-5	0,62
14Β3	7,48е4	7,11е-5	0,95
2Е11	8,45е4	1,7е-4	2,01
16Ц4	8,12е4	6,18е-4	7,62

Результаты показали, что аффинности всех 8 моноклинальных антител были сопоставимы, хотя для 16Ό4 показана по меньшей мере в 12-2,5 раза меньшая аффинность по сравнению с другими клонами. Различия в величинах КО между остальными 7 антителами в таком одном эксперименте составили до 4,4 раза включительно. Два из этих клонов, 5Ό1 и 6Р6, отбирали для дальнейшего масштабирования и повторно тестировали в трех повторах. Эти данные показаны в табл. 3.

Таблица 3. Данные по кинетике и аффинности, полученные с использованием В1асоге, для очищенных моноклональных антител 6Р6 и 5Ό1 (измерение в трех повторах)

тАЬ	ка (1/М'с)	кд (1/с)	ю (нМ)
5Ш	6,58е4	1,35е-4	2,05
(п = 3)	±0,38е4	±0,10е-4	±0,15
6Р6	9,93е4	9,4е-5	1,02
(п = 3)	±0,93е4	±3,2е-5	±0,41

Этот же метод с использованием В1асоте также применяли для изучения связывания 6Р6 с человеческим и мышиным β-амилоидом (1-40) и β-амилоидом (1-42). Связывание 6Р6 со всеми этими пептидами характеризовалось аналогичными величинами.

Связывание с экспрессируемым клетками белком-предшественником амилоида (АРР). β-Амилоид состоит из пептидов, образованных в результате протеолитического расщепления трансмембранного белка-предшественника I типа, называемого белком-предшественником амилоида (АРР). Поскольку АРР содержит большой внеклеточный домен, связывание с этим белком могло бы потенциально инициировать реакцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС).

Анализ, основанный на использовании РМАТ™ АВ18200.

Технологию флуориметрического микроанализа (РМАТ; система клеточной детекции 8200) использовали для проведения основанного на использовании клеток анализа связывания 8 отобранных выше антител с белком-предшественником амилоида, экспрессированным в клетках НЕК 293Т. Клетки НЕК293Т, либо трансфицированные мнимо, либо трансфицированные плазмидой, кодирующей полноразмерный АРР человека, собирали через 48 ч после трансфекции. Трансфицированные клетки инкубировали с супернатантами гибридом в различных разведениях или с очищенными мышиными антителами

- 16 022913

1дО ЬЫ27 ^утеф к внеклеточнуму домену АРР в качестве положительного контроля и антителом, которое распознает только свободный Ν-конец β-амилоидного пептида (реагент собственной разработки), в качестве отрицательного контроля. Связывание антител выявляли, используя меченое красителем ЕМАТ голубым антимышиное антитело и детектировали с использованием системы клеточной детекции 8200. Фоновые сигналы, полученные от мнимо трансфицированных клеток, вычитали из сигналов для клеток, трансфицированных АРР. 7 клонов не показали никакого связывания с АРР, экспрессированным в клетках НЕК293Т, по сравнению с моноклинальным антителом ΕΝ27, взятым в качестве положительного контроля. При изучении результатов, полученных с мнимо трансфицированными клетками НЕК293Т, для одного клона (5С9) было получено доказательство неспецифического связывания с клетками НЕК293Т, делающее интерпретацию способности связывания с АРР для этого конкретного клона затруднительной.

Связывание с белком-предшественником амилоида (АРР) в срезах головного мозга трансгенных мышей.

Срезы головного мозга мышей ТА8ТРМ (НоЮеИ и др., 2008) в возрасте 2 месяцев или мышей ТА810 в возрасте 12 месяцев исследовали посредством 1НС. Срезы обрабатывали 85%-ной муравьиной кислотой и окрашивали на предмет связывания с полноразмерным АРР. На момент выбранного возраста у соответствующих мышей не наблюдается никаких отложений амилоидных бляшек, хотя имеется некоторое окрашивание, достигаемое с использованием данной методики, возможно обусловленное присутствием внутриклеточного амилоида. 6Е6 не давало никакого окрашивания на этих срезах, в то время как контрольное антитело на полноразмерный АРР ^утеф давало окрашивание.

Связывание с β-амилоидом человека по данным ЕЫ8А с использованием ЕаЬ-фрагмента.

ЕаЬ-фрагмент 6Е6 получали стандартным протеолитическим расщеплением, используя папаин, иммобилизованный на гранулах (Р1егсе, № 20341). Проводили ЕЫ8А на предмет связывания очищенных ЕаЬ-фрагментов 1дО 6Е6 с Аβ-пептидом (1-40), иммобилизованным на планшете для ЕЫ8А. Результаты одиночного эксперимента с примененим ЕЫ8А показали, что ЕаЬ-фрагмент 6Е6 по-прежнему способен связываться с Аβ-пептидом (1-40).

Связывание 6Е6 с нативным амилоидом человека в образцах плазмы волонтеров.

Цельную кровь волонтеров (НУТ) собирали в пробирку с К2-ЕБТА посредством венепункции и пробирку незамедлительно помещали на лед. Образец крови обрабатывали в течение 30 мин, откручивая при 2000 х д в течение 15 мин при 4°С для получения плазмы. Затем к плазме добавляли ингибитор протеаз (полный коктейль ингибиторов протеаз от КосЬе, № по каталогу: 11 973 580 001, КосЬе АррНеб. 80епсе) в соответствии с инструкциями производителя. Затем аликвоты плазмы замораживали при температуре ниже -70°С перед проведением анализа.

В анализе использовали 6Е6 в качестве захватывающего антитела в формате 96-луночного иммуноанализа с применением ЕСЬ (электрохемилюминесценции) (Мезо 8са1е Б1зсоуегу (М8Б)). Кратко, 6Е6 наносили точечно на 96-луночный планшет от М8Б; затем добавляли образцы (калибровочный стандарт для анализа, отрицательный контроль, рС (контроль качества) и тестируемые образцы). После инкубации, несвязавшийся материал отмывали и далее проводили инкубацию с детектирующим антителом (биотинилированным 4О8 (специфичным к эпитопу (17-24) β-амилоида)). Вслед за этим после промывки добавляли метку стрептавидин-сульфо-ТАО. По окончании этой инкубации применяли стадию промывки. Добавление в планшет буфера Т для прочтения от М8Б позволяло прочесть электрохемилюминесцентный сигнал на визуализирующем устройстве 8ес1ог 1та§ег 6000 от М8Б. Концентрацию аналита получали из сигнала М8Б путем обратных вычислений, используя калибровочную кривую для анализа, полученную с использованием известных концентраций Аβ1-42. Нижний предел количественного определения для данного анализа составлял 78,1 пг/мл.

В табл. 4 суммированы концентрации Аβ для 10 образцов плазмы НУТ, измеренные в описанном выше анализе с применением антител 6Е6-4О8. Все образцы тестировали в двух повторах.

Таблица 4. Концентрация Аβ в образцах НУТ, измеренная с применением антител 6Е6-4О8

Образец	Повтор 1	Повтор 2	Среднее
НУТ1	695,780	653,251	674,517
НУТ2	602,650	596,211	599,431
НУТЗ	685,350	684,026	684,688
НУТ4	660,760	653,754	657,259
НУГ5	629,980	582,975	606,478
НУТ6	524,470	517,987	521,230
НУТ7	681,420	678,934	680,175
НУТ8	618,910	579,181	599,045
НУТ9	616,190	605,367	610,779
НУТ10	1029,050	947,771	988,413
		Среднее 50 (стандартное отклонение)	662,202 125,153

- 17 022913

Связывание с Αβ1-42 в нативных и денатурирующих условиях по данным вестерн-блоттинга.

Изучали связывание очищенного моноклонального антитела 6Р6 с различными формами Αβ1-42 и анализировали, используя δΌδ-ΡΑΟΕ в нативных или денатурирующих условиях. Αβ1-42 использовали или свежеприготовленным, или предварительно обработанным: ΡΡΡ Р12 в течение ночи при 4°С, в течение ночи в ΡΒδ при 37°С или в течение ночи в 10 мМ НО при 37°С. Препараты разделяли, используя δΌδ-ΡΑΟΕ, и анализировали вестерн-блоттингом, применяя антитело 6Р6 или 6Е10 (антитело, специфичное к Αβ1-16 человека; имеющийся в продаже реагент, ΕιιΐΌβοηΙοα) и 505 (антитело, специфичное к Αβ1-42; реагент собственной разработки). При анализе гелей было обнаружено, что в нативных условиях 6Е10 распознает более высокомолекулярные формы амилоида, в то время как 6Р6 и 505 демонстрируют только относительно слабый сигнал по отношению к этим олигомерным и фибриллярным формам. В денатурирующих условиях 6Р6 и 505 распознавали главным образом мономерные формы бетаамилоида, в то время как специфичное к Шконцевой последовательности 6Е10 по-прежнему сохраняло способность связываться с более высокомолекулярными агрегатами бета-амилоида, которые не разделялись в денатурирующих условиях, использованных в этом эксперименте (фиг. 1). В заключении необходимо отметить, что это указывает на то, что в данных условиях и с использованием описанных выше препаратов амилоида 6Р6 предпочтительно связывается с низкомолекулярными формами и мономерами Αβ1 -42.

Картирование посредством ΕΌΙδΑ эпитопов очищенного моноклонального антитела 6Р6.

Очищенное моноклональное антитело 6Р6 использовали для повторения изложенной выше процедуры картирования эпитопов с применением ΕΌΙδΑ. Использовали тот же самый протокол за исключением того, что добавляли 100 мкл раствора разведенного очищенного антитела (0,1 мкг/мл в 1%-ном ΒδΑ) вместо разведенного культурального супернатанта гибридом.

Очищенное моноклональное антитело 6Р6 связывалось с мотивом КОЛПОй (эквивалентным остаткам 28-34 β-амилоида), но связывание значительно усиливалось, если в пептид был включен остаток 35М (мотив, эквивалентный остаткам 28-35 β-амилоида: (δΕΟ ΙΌ N0:9)). При использовании методики перекрывающихся эпитопов нельзя исключить незначительный вклад соседних остатков.

Картирование эпитопов моноклонального антитела 6Р6 с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

Очищенное моноклональное антитело 6Р6 в концентрациях 8-64 нМ впрыскивали в течение 3 мин над биотинилированными по С-концу пептидами, соответствующими последовательностям 24-35 (δΕΟ ГО N0:10: УОδNΚОЛIIО^ΜОδО), 28-39 (δΕΟ ГО N0:11: ΚОЛIIО^ΜУООУОδО) и 31-42 (δΕΟ ГО N0:12: IIО^ΜУООУУIΑОδО) β-амилоида, захваченными на сенсорном чипе, покрытым стрептавидином. Эксперимент проводили, используя устройство В1асоте 3000. Результаты показали, что 6Р6 было способно связываться с пептидом 24-35 и 28-39, но не с пептидом 31-42 β-амилоида, подтверждая полученные выше результаты с использованием перекрывающихся пептидов. Это также может указывать на то, что остатки 31-35 не являются существенными для связывания 6Р6 и остатки выше положения 35 повидимому не вовлечены в связывание этого антитела.

Влияние внутривенного введения моноклональных антител 6Р6 и 501 против β-амилоида на уровни амилоида в крови, обусловленные центрально введенным амилоидом.

Целью этого исследования было изучение уровней радиоактивности в крови после интрацеребровентрикулярной (ЮУ) инъекции ^^-амилоида 1-40 (1 мкКи) мышам, которым предварительно было внутривенно введено тестируемое антитело.

¹²⁵I-β-Αмилоид 1-40 (1 мкКи) вводили ЮУ-канюлированным самцам мышей С57ВЙ6/1 (п = 8-10 на одну обработку) посредством ЮУ-инфузии. За один час до ЮУ-инфузии ¹²⁵Ι-β-амилоида 1-40 мышам внутривенно вводили или забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒδ) или 600 мкг моноклонального антитела против β-амилоида 6Р6 или 501. Животных возвращали в домашние клетки после ЮУ-инфузии и через 4 ч после ЮУ-инфузии сортировали, отбирали образцы крови и проводили измерение гамма-излучения, определяя число импульсов в минуту (СРМ).

Подготовка к хирургической операции.

Мышей подвергали анестезии посредством ингаляционного введения изофлурана β-5%) и помещали в стереотаксический аппарат. Перед проведением каких-либо хирургических процедур мышам для аналгезии подкожно вводили 0,05 мл (разведение 1:10 из концентрированного раствора) уеЕгдемс® (бупренорфин). Делали разрез вдоль срединной линии кожи черепа и дорсальную часть черепа очищали и сушили. Через высверленное в черепе отверстие в латеральный желудочек вводили канюлю со следующими стереотаксическими координатами относительно брегмы (переднезаднее направление (ΑΡ): -0,5; боковое направление (Ь): +0,7; дорсально/вентральное направление (ОУ): -2,5). В черепе просверливали два дополнительных отверстия, в которые помещали кортикальные винты. Канюлю закрепляли на месте, используя цианоакрилатный гель, и разрез зашивали с загибом и окантовкой вокруг места нанесения цианоакрилатного геля. После операции мышам подкожно вводили 0,3 мл физиологического раствора и помещали в теплые условия для восстановления от анестезии. После восстановления установочного рефлекса мышей размещали поодиночке и обеспечивали стандартный послеоперационный уход в течение 5

- 18 022913 суток или до тех пор, пока не восстанавливался предоперационная масса тела.

Расположение канюли.

После восстановления проверяли расположение канюли, наблюдая за потреблением питьевой воды в ответ на введение ангиотензина II. Каждой мыши вводили 1СУ 100 нг ангиотензина II. После введения наблюдали за потреблением воды в течение 15 мин.

Результаты.

Наблюдали значительное увеличение радиоактивности в крови животных, которым вводили оба моноклональных антитела 6Р6 и 5Ό1, по сравнению с животными, которым вводили только растворитель, предпочтительно обусловленное способностью связывать в кровотоке меченый радиоактивной меткой β-амилоид и таким образом продлевать полупериод существования в крови меченого пептида 140 β-амилоида. Различия между этими моноклональными антителами были незначительными. Обработка 6Р6 и 5Ό1 приводила к статистически значимому увеличению СРМ по сравнению с контрольным введением растворителя (СРМ: растворитель 1280 +/- 312; 5Ό1 8152 +/- 2001; 6Р6 8875 +/- 2123). Одномерный ΑΝ0νΑ (дисперсионный анализ), Р (3,32) = 15,14, р < 0,001 (логарифмическое преобразование данных), апостериорный сравнительный Ь§О(наименьшая значимая разность)-тест ***р < 0,001; все группы сравнивали с растворителем.

Изучение фармакокинетики образования комплекса 6Р6-амилоид у морских свинок.

Целью этого исследования было изучение образования комплекса антитело-в-амилоид ίη νί\Ό у морских свинок, имеющих аминокислотную последовательность β-амилоида, идентичную людям. Этого достигали посредством измерения концентрации свободного антитела и концентрации комплексов антитело-в-амилоид в различные моменты времени в течение 19 суток.

Метод.

Самцам морских свинок Эиикт-НагНеу делали хирургическую операцию, используя анестезию изофлураном, вводя двойную канюлю в яремную вену. Канюлированным морским свинкам внутривенной инфузией вводили антитело 6Р6 (п = 6) в течение 1 ч. Препараты очищенного антитела в растворе ΡΒδ вводили в дозе 0,700 и 0,625 мл/кг/ч соответственно для достижения целевой дозы 3 мг/кг. У каждой морской свинки отбирали образцы крови (60 мкл) перед введением дозы (0 мин) и собирали, используя пробирки с ΕΌΤΑ, в следующие моменты времени (на протяжении 20 суток) после начала инфузии: 15, 30, 45, 60 (завершение в/в инфузии), 90, 120, 180, 360 мин, 8, 10, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 312, 360, 408 и 456 ч.

Образцы большого объема (0,5 мл) отбирали в момент времени 0, 10, 96, 216, 312 и 456 ч после начала инфузии. После отбора последнего образца крови на 20-е сутки животных подвергали анестезии и обескровливали. Образцы плазмы хранили при -80°С до проведения ΕΠδΑ-анализа. Уровни свободных антител оценивали посредством антигенсвязывающего ЕП8А, используя микротитрационные планшеты, покрытые р-амилоидом (1-40). В лунки добавляли образцы плазмы для 0, 10, 96, 196, 312 и 456 ч и связавшееся моноклональное антитело 6Р6 детектировали, используя конъюгат антимышиного ЦС и НКР. Комплексы β-амилоид-антитело детектировали, посредством захвата на планшетах, покрытых поликлональным антителом, специфичным к С-концу 42 β-амилоида. Захваченные комплексы детектировали посредством детекции моноклонального антитела 6Р6 с использованием конъюгата анти-мышиного ЦС с биотином и конъюгата стрептавидина и криптата европия.

Результаты.

Уровни содержания свободного антитела, как и ожидалось, быстро повышались после в/в (внутривенной) доставки, но также быстро снижались в течение первых 24 ч. Уровней устойчивого состояния достигали приблизительно через 160 ч. Согласно результатам показано, что скорость клиренса крови составляет 1,75 мл/ч/кг для антитела 6Р6, а среднее время удержания (МКТ) составляет 49,4 ч.

Уровни содержания комплекса также быстро возрастали после введения антитела, и средние уровни содержания комплекса оставались устойчивыми на протяжении оставшегося периода исследования. Однако у отдельных животных были отмечены значительные отклонения. У некоторых животных уровни содержания комплекса снижались, у некоторых животных уровни содержания комплекса повышались, но в большинстве случаев уровни содержания комплекса оказывались стабильными, начиная примерно с момента времени 216 ч и далее. Эксперимент показал, что комплексы с эквивалентным количеством амилоида человека могут быть образованы ίη νί\Ό и что уровень содержания комплексов в плазме после введения однократной дозы оказывается неизменным на протяжении длительного периода времени.

Исследование введения 6Р6 в течение 4 недель трансгенным мышам ТА8ТРМ.

Трансгенные (1§) мыши, сверхэкспрессирующие белок-предшественник амилоида человека (НАРР), являются моделью амилоидоза и подходят для изучения влияния лекарственных средств на продуцирование, секвестрацию и отложение амилоида. В этом исследовании асторы изобретения использовали трансгенных мышей ТА8ТРМ, сверхэкспрессирующих белок-предшественник амилоида человека и мутантную форму пресенилина 1 (линию дважды трансгенных мышей, созданную путем скрещивания мышей со шведской мутацией АРР695 (ТА810) с линией Р8-1М146У (ТРМ) (Не\\1е11 е1 а1. 2008)). Исследование проводили на самцах и самках мышей в возрасте приблизительно 10 недель.

- 19 022913

Животных разделяли на три обрабатываемые группы.

Обрабатываемые группы:

(A) Тд-животные, умерщвленные в 1-е сутки, не получавшие никакого соединения, для определения уровней амилоида в начальный момент исследования (п = 16: 9 самцов, 7 самок);

(Б) Тд-животные, получавшие растворитель (РВ8) посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю в течение 4 недель (п = 19: 9 самцов, 10 самок);

(B) Тд-животные, получавшие 6Ρ6 (300 мкг на мышь) посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю в течение 4 недель (п = 19: 9 самцов, 10 самок).

Животных разделяли на 3 обрабатываемые когорты с началом режима дозирования с интервалом в одну неделю.

Образцы крови отбирали из хвостовой вены перед введением 2-й, 4-й, 6-й и 8-й дозы у 3 самцов и 3 самок из каждой обрабатываемой группы. Конечные образцы плазмы с ΕΌΤΛ готовили для всех групп на 1-е сутки (группа А) или через 4 недели после введения первой дозы (группы Б и В). Отбирали левые и правые полушария головного мозга, мгновенно замораживали и хранили при -80°С до последующего анализа биохимических уровней амилоида. Также отбирали кончики хвостов и использовали для подтверждения генотипа.

Определение биохимической нагрузки амилоида в гомогенатах головного мозга.

Уровень Αβ1-40 и Αβ1-42 в выделенных образцах головного мозга определяли, используя технологию ΘΜ0ΕΝ (Цеп Iп1е^иа1^оиа1 Шс.). Кратко, полушария головного мозга взвешивали и экстрагировали в 5 М гуанидине ИС1 (СаШосйет), содержащем ингибитор протеаз Сотр1е!е™ (РосНе П1адпо8Йс), в концентрации 150 мг/мл (мас./об.), используя ручной механический гомогенизатор. Экстракты разбавляли в Цеп-буфере и в анализе использовали разведения 1:10 и 1:40, осветленные центрифугированием при 20000 д.

В анализе ΘΜΟΕΝ использовали покрытые стрептавидином гранулы ЭупаЬеаДк (Эупа1) с иммобилизованным биотинилированным антителом 6Е10 (специфичным к Αβ1-16 человека; 81дпе! ЬаЬк) для захвата Αβ из образцов, и детекцию связанного Αβ с применением меченного оп-меткой 0210 (антитела, специфичного к Αβ1-40; реагента собственной разработки) или 505 (антитела, специфичного к Αβ1-42; реагента собственной разработки).

Αнализ посмертных отложений Αβ1-40 и Аβ1-42 в каждой группе не показал никакого связанного с обработкой 6Ρ6 уменьшения отложений амилоида в головном мозге в этом исследовании и с использованием примененного здесь аналитического метода. Окончательные заключения о возможном снижении уровня амилоида в головном мозге не могли быть сделаны из-за того, что картина увеличения Αβ в головном мозге обработанных растворителем животных в ходе исследования была слабовыраженной и не единообразной среди всех животных.

Определение уровней антитела 6Ρ6 в плазме.

Отбираемые в течение продолжительного времени и конечные образцы плазмы с ЕЭТА оценивали по уровням антител посредством ЕЫ8А. Кратко, готовили разведения образцов 1:50, 1:500 и 1:5000 и добавляли в планшеты для ЕЫ8А вместе с 0,5 мкг/мл иммобилизованного пептида Αβ1-40, разбавленного в РВ8. Образцы инкубировали в течение ночи при 4°С, промывали и связанное антитело 6Ρ6 детектировали, используя конъюгат анти-мышиного антитела с пероксидазой хрена. Концентрации в образцах определяли, применяя стандартную кривую, полученную с использованием 6Ρ6 в 8 известных концентрациях в диапазоне от 0 до 30 мкг/мл.

Результаты показали, что введение всем мышам антитела 6Ρ6 было выполнено успешно и что конечные концентрации в плазме характеризовались средней величиной приблизительно 250 мкг/мл. Для отобранных в течение продолжительного времени образцов плазмы было показано увеличение уровней в плазме между 2-й и 4-й дозой, обусловленное повторным введением, но сохранение уровня по меньшей мере равного 150 мкг/мл до конца исследования у всех животных, у которых отбирали образцы.

Определение комплексов амилоид-антитело в плазме посредством иммунопреципитации и вестернблоттинга.

Чтобы проверить, образовывались ли комплексы антитело-Αβ в этом исследовании ш У1уо, образцы плазмы исследовали на предмет образования комплексов, используя иммунопреципитацию и последующий анализ вестерн-блоттингом. Кратко, образцы плазмы по 15 мкл инкубировали и встряхивали в течение 3 ч при 4°С с 10 мкл суспензии гранул сефарозы с иммобилизованным белком Α. Гранулы промывали 5 раз, используя по 1 мл охлажденного во льду РВ8, содержащего ингибитор протеаз. Каждый раз образцы центрифугировали в течение 2 мин при 2000 об/мин и 4°С. После промывки гранулы ресуспендировали в 20 мкл буфера для электрофоретических образцов, содержащего 0,1 М ЭТТ. Образцы кипятили в течение 5 мин и центрифугировали, как описано выше. После повторного кипячения супернатанта образцы наносили на минигели (10% бис/трис) и разделение проводили, используя электрофорез. С гелей делали реплики на нитроцеллюлозную мембрану, блокировали и исследовали с применением антитела 6Е10 (специфичного к Αβ1-16 человека; 81дпе! ЬаЬк). Детекцию связанного 6Е10 осуществляли с помощью ИК-красителя 800, конъюгированного с антителом козы против Ц0 (Η+Ь) мыши (Κ^ΕΠ^). Репли- 20 022913 ки визуализировали, используя систему визуализации в инфракрасном излучении Обу8ее.

Результаты показали, что низкомолекулярный Αβ, очищенный с использованием метода совместной иммунопреципитации, может быть детектирован на репликах. Это позволяет сделать заключение, что образование комплексов 6Р6 с Αβ происходило ίη У1уо, и они присутствовали в образцах плазмы. У протестированных самок животных интенсивность зон была слабее. В целом это подтвердило, что 6Р6 способно связываться с Αβ человека ίη У1уо и образовывать стабильные комплексы, которые могут быть детектированы вестерн-блоттингом.

Исследование введения 6Р6 в течение 16 недель трансгенным по ΗΑΡΡ мышам.

Использовали трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ΗΑΡΡ(751) под контролем мышиного промотора ТЬу-1, которые экспрессируют АРР человека в высоких уровнях с лондонской (717) и шведской (670/671) мутациями, что приводит к зависящему от возраста увеличению уровней бета-амилоида (1-40) и бета-амилоида (1-42) (Λβ1-40 и Ав 1-42). У этих мышей развиваются бляшки, содержащие амилоидные отложения, в раннем возрасте, начиная приблизительно с 4 месяцев. Тяжесть патологии головного мозга коррелирует с увеличением возраста и поведенческими дефицитами.

Это исследование было проведено вслепую исследователем, которому была неизвестна природа вводимого соединения. Самок трансгенных мышей в возрасте 4 месяцев распределяли на 3 группы (п = 15 на группу), а также создавали группу нетрансгенных детенышей одного помета и еженедельно обрабатывали внутрибрюшинно в течение 4 месяцев. Группа детенышей одного помета и одна Тд-группа, получавшие контрольный 1дС, служили в качестве контролен По окончании обработки проводили поведенческое тестирование (водный лабиринт Морриса, задание по распознаванию новых объектов (Νρ» ОЬ)ес1 РесодпЮоп Та8к)) и животных умерщвляли. Собирали образцы головного мозга, С8Р и плазмы крови. Одно полушарие каждого головного мозга подготавливали для гистологической оценки, второе незамедлительно замораживали для определения Αβ1-38, Αβ1-40 и Αβ1-42 во фракциях гомогената головного мозга в ТВ8, тритоне Х-100, 8Ό8 и муравьиной кислоте (РА), а также в С8Р. Определяли отложение бляшек в головном мозге в фиксированных образцах, применяя иммуноокрашивание с использованием антитела 6Е10 против бета-амилоида, площадь поверхности бляшек и количество бляшек определяли и подсчитывали, применяя программное обеспечение (1таде Рго Р1и8, версия 4.5.1.29) для компьютерного анализа изображений. Плотность синапсов изучали с использованием окрашивания специфичным к синаптофизину антителом (№отаткет8®), меченым биотинилированным вторичным антителом с использованием системы детекции с применением νΐΡ (визуальная иммунопреципитация (у18иа1 1ттипоргеаркаЕоп)) ШесЮг®).

Обрабатываемые группы: 3 группы Тд-животных (15/группа) и одна группа нетрансгенных С57ВЬ6 животных (п = 15):

(А) Тд-животные, получавшие соединение 6Р6 (17 мг/кг массы тела еженедельно (п = 15));

(Б) Тд-животные, получавшие соединение т1дС2а (17 мг/кг массы тела (п = 15));

(Г) Тд-животные, получавшие соединение 6Р6 (33 мг/кг массы тела (п = 15));

(Д) нетрансгенные детеныши одного помета, получавшие т1дС2а (17 мг/кг массы тела (п = 15)).

Определение биохимической нагрузки амилоида в последовательно экстрагированных гомогенатах головного мозга и С8Р.

С8Р собирали у животных обрабатываемых групп А, Б и Г и незамедлительно замораживали до проведения дальнейшего анализа с использованием методики ЕБ18А. Для получения гомогенатов головного мозга замороженные полушария от животных групп А, Б и Г гомогенизировали в 5 мл забуференного трисом физиологического раствора (ТВ8), содержащего коктейль ингибиторов протеаз. Приблизительно половину гомогенизатов головного мозга незамедлительно замораживали в виде аликвот. Другую половину центрифугировали при 74500 д в течение 1 ч и полученные супернатанты (= ТВ8-фракция) разделяли на аликвоты и хранили при -20°С до проведения определения. Осадки после центрифугирования суспендировали в тритоне Х-100 (2,5 мл), центрифугировали, супернатанты разделяли на аликвоты и хранили при -20°С. Эти стадии повторяли с 8Ό8 (2,5 мл). Осадки после центрифугирования 8Ό8фракции суспендировали в 70%-ной муравьиной кислоте (0,5 мл) перед последующим центрифугированием. Полученные супернатанты нейтрализовали 1 М трисом (9,5 мл), разделяли на аликвоты и хранили при -20°С. С8Р, а также образцы четырех фракций головного мозга использовали для определения Αβ38, Αβ340 и Αβ342, применяя имеющийся в продаже набор β-плексный набор для определения бета амилоида от Ме8о8са1е И18соуету (Ме8о8са1е И18соуету АЬе!а 3-р1ех кН) № К15148Е) с использованием 8ес!ог 1тадег М82400, следуя инструкциям производителя. Данные для головного мозга рассчитывали в виде количества Αβ в нг на один г влажного мозга, данные для С8Р рассчитывали в виде количества Αβ в пг на мл.

В ТВ8-фракции уровни Αβ были наиболее низкими для животных группы Б для всех трех видов амилоида. Что касается Αβ342, то такое увеличение для групп А и Г с обработкой 6Р6 было значительным по сравнению с контрольной группой Б (р < 0,05 в сравнении с группой А и р < 0,001 в сравнении с группой Г), но не было значительным для Αβ338 и Αβ340. Во фракциях с тритоном Х-100 средние уровни Αβ342 также были значительно повышены в группах с обработкой 6Р6 (А (р < 0,05) и Г (р < 0,01)) по

- 21 022913 сравнению с контрольной группой Б. Уровни Αβ340 в группах Б и Г не различались значительно, в то время как для группы А они были по-прежнему значительно повышенными по сравнению контрольной группой Б (р < 0,05). Наблюдали увеличение, хотя и не статистически значимое, уровня Αβ338 в группе А с обработкой 6Р6 по сравнению с контрольной группой Б, но в группе Г с обработкой 6Р6 уровень Αβ38 был слегка снижен по сравнению с контрольной группой Б. Уровень связанного и нерастворимого в воде Αβ по результатам измерений в 808- и РА-фракции был значительно выше в головном мозге животных группы А с обработкой 6Р6 по сравнению с группами Б (А(338 и Αβ42) или Г (А|338 и Αβ40). Контрольная группа Б и группа Г с обработкой 6Р6 сильно не различались.

В образцах С8Р не наблюдали значительных различий между группами для Αβ38, Αβ40. Уровни Αβ38, Αβ40 и Αβ42 были немного ниже у животных в контрольной группе Б по сравнению с обработанной 6Р6 группой А. Уровни Αβ42 в С8Р у животных группы Г, обработанной 6Р6, были значительно выше по сравнению с контрольной группой Б (р<0,05), что возможно указывает на мобилизацию растворимого Αβ42 посредством секвестрации в С8Р или не напрямую через кровоток.

Определение плотности синапсов.

По три среза на одно животное окрашивают, используя антитело против синаптофизина (1:200; №о Магкегз; № по каталогу КМ9111-8О) и биотинилированное вторичное антитело (1:200; Уес!от ЬаЪота!опез; № по каталогу РК-6101) с последующим развитием окраски посредством У1Р (субстратный набор для пероксидазы; № по каталогу 8К4600). Для определения индивидуальной средней плотности синапсов оценивают по три изображения на область (гранулярный слой из гиппокампальных структур СА1, СА3 и зубчатой извилины медиальной поверхности (ЭОтЪ)) и срез, применяя процедуру измерения в макромасштабе. В процессе макропрочтения изображения подвергают равномерному контрастированию и подсчитывают синапсы выше постоянного порога. Одиночные и последовательные синапсы подсчитывают по отдельности, используя ограничения по размеру. Общую площадь последовательных синапсов делят на средний размер одиночных синапсов. Окончательное количество синапсов рассчитывают по следующей формуле:

~ площадь последовательных синапсов > Синапсы = количество дискретных синапсов+средняя площадь дискретных синапсов

Кроме того, площадь изображения корректируют с учетом фона в терминах уменьшения площади кровеносных сосудов и количество синапсов рассматривают с учетом общей площади изображения, уменьшенной на площадь кровеносных сосудов.

Измерение количества синапсов в области СА1, СА3 и ОЭтЪ срезов гиппокампа головного мозга, взятых у обрабатываемых групп А, Б и Г, показало, что плотность синапсов оставалась неизменной среди обрабатываемых групп.

Определение уровней общего и несвязанного (свободного) β-амилоида в образцах плазмы, отбираемых в течение продолжительного времени.

Образцы крови ш νί\Ό отбирали перед началом обработки (0-е сутки) и вновь через 3, 6, 9 и 12 недель из лицевой вены/артерии, расположенной в области нижней челюсти. С целью получения плазмы образцы крови собирали во флаконы с ЕЭТА, не имеющие крышек. Все образцы плазмы замораживали и хранили до проведения анализа.

Уровни несвязанного (свободного) амилоида и уровни общего амилоида (несвязанного Αβ и в комплексе с антителом) определяли, используя автоматизированное рабочее место Оуго1аЪ™. Биотинилированное тАЪ мыши 6Р6 использовали в качестве захватывающего реагента для анализа свободного βамилоида, а биотинилированное специфичное к Ν-концу антитело против β-амилоида (реагент собственной разработки) использовали в качестве захватывающего реагента для анализа общего β-амилоида. Захват обоих захватывающих реагентов осуществляли на захватывающей колонке Оугоз ВюаГГу СО, содержащей матрицу, покрытую стрептавидином. Захватывающие антитела добавляли в концентрации 700 нМ. Для детекции в обоих видах анализов использовали А1еха647-меченое (антитело) 4О8 (специфичное к эпитопу 17-24 β-амилоида) в концентрации 12,5 нМ. Для количественного определения β-амилоида в образцах получали калибровочную кривую, используя Аβ1-42 (Λβ1-42 от 1пиодепе1юз) в динамическом диапазоне от 31,25 до 20000 пг/мл. Разведения Αβ1-42 для получения калибровочной кривой и разведения образцов плазмы проводили в истощенной по β -амилоиду плазме крови человека. Данные анализировали, используя собственное программное обеспечение компьютера, и затем представляли в графическом виде в Ехсе1.

Уровни общего β-амилоида возрастали более чем в 2000 раз через 3 недели (первая временная точка) в обеих группах, обработанных 6Р6 (как 17 мг/кг, так и 33 мг/кг). В группе, обработанной 33 мг/кг, уровень общего β-амилоида, наблюдаемый на протяжении исследования, был незначительно выше, но не коррелировал с повышением уровня дозы, что возможно указывает на достижение эффекта насыщения. Уровни свободного р-амилоида для обеих обработанных 6Р6 групп находились на уровне фона, соответствующего уровню для нетрансгенных мышей в первую временную точку обработки (3 недели), повидимому вследствие того, что большая часть, если не весь детектируемый в этом анализе β-амилоид,

- 22 022913 был включен в состав комплексов антитело^-амилоид. При отсутствии обработки базисные уровни бета-амилоида у трансгенных мышей были приблизительно в 6 раз выше, чем у нетрансгенных контрольных мышей.

Определение отложения бляшек посредством окрашивания с использованием 6Е10.

Из полушарий головного мозга 18 Тд-мышей (по 6 из Тд-групп Α, Б и Г) готовили достаточное количество срезов на каждый головной мозг для количественного определения амилоидного отложения. Иммунореактивность по отношению к 6Е10 количественно оценивали в гиппокампе и коре головного мозга. Делали по 15 сагиттальных срезов на один слой (в целом 5 слоев в соответствии с фиг. 104-105, 107-108, 111-112, 115-116 и 118-119 согласно морфологическому атласу ТЬе Мойке Вгаш от Рахшок аиб РгаикЕи, 2-е издание), каждый толщиной 5 мкм (Ьека ЗМ 2000К). С тканями всех исследуемых трансгенных животных манипулировали в точности одним и тем же образом, чтобы избежать ошибок, обусловленных отклонениями в данной процедуре.

Αмилоидные отложения и отложения бляшек определяли, используя моноклональное антитело 6Е10 (З1дие!®), направленное против положения 1-17 амилоидного пептида человека. Измеряемые площади областей гиппокампа и коры головного мозга были постоянными во всех исследованных образцах головного мозга, что исключает негативное влияние на ткань стадий иммуногистохимического окрашивания (например, сжатия, разных условий получения срезов и т.д.), и указывает на отсутствие какой-либо вызванной обработкой атрофии. Данные об отложении бляшек соотносили с размером индивидуальной области на срезе для того, чтобы иметь возможность справиться с артефактами, образованием складок или потерей фрагментов. Обработка большой дозой 6Ρ6 (группа Г) приводила к значительному уменьшению доли занятой бляшками площади в гиппокампе и коре головного мозга по сравнению с группой, обработанной низкой дозой 6Ρ6, (группа Α; ΑNΟУΑ: кора головного мозга и гиппокамп: р < 0,01) и контрольной группой Б (фиг. 2). Такая же тенденция наблюдалась и для количества бляшек на один мм², которое и в этом случае оказалось меньше в обработанной 6Ρ6 группе Г по сравнению с контрольной группой Б (!-тест: кора головного мозга: р = 0,093) и группой Α, обработанной низкой дозой 6Ρ6 (!-тест: гиппокамп: р = 0,051; фиг. 3). Средний размер бляшек оставался неизменным среди всех обрабатываемых групп.

Демонстрация наличия амилоидоза в глазах мышей, дефицитных по Фактору комплемента Н: модель сухой АМИ.

Животные.

сГЬмышей в возрасте десяти недель, 3, 6, 9 месяцев и одного года (и = 6) (с обратным скрещиванием с генетической фоновой линией С57ВЬ/6 в течение более 10 поколений) и обычных мышей С57ВЬ/6 в соответствующем возрасте (и = 6) размещали в условиях контролируемой температуры с 12-часовым циклом день (160 люкс)-ночь и содержали на обычной лабораторной диете (лабораторный корм для грызунов без ограничений). Мышей подвергали анестезии (0,75 мл кетамина, 0,5 мл домитора, 0,75 мл стерильной воды в дозе по 0,2 мл/100 г, в/б, при необходимости с добавками) и их зрачки расширяли, вводя местно 1%-ный тропикамид и 2,5%-ный гидрохлорид фенилэфрина за 10-15 мин до получения изображения с помощью сЗЬО. Перед каждой последовательной серией получения изображения на глаз наносили капли гидроксипропил-метилцеллюлозы (0,3%-ной) для предотвращения высыхания. Все экспериментальные процедуры согласовывались и проводились в соответствии с Αктом о животных (Порядок научных исследований) Великобритании (Иш!еб Ктдбот Ашта1к (Зшеиййс Ргосебигек) Ас!) 1986 года.

Получение изображений сетчатки.

Изображения получали для сГЬ мышей в возрасте 3, 6 и 12 месяцев (и = 12) и контрольных мышей (и = 6) в соответствующем возрасте, как подробно описано ниже. Изображения сетчатки с высоким разрешением и высокой контрастностью получали с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа, как описано ниже. Кратко, получение изображений в отраженных лучах осуществляли с использованием спектральных линий излучения лазера 488 и 820 нм. Изображения сетчатки мышей, полученные с помощью аутофлуоресценции и флуоресцентной ангиографии, регистрировали, используя 488 нм. Для возбуждения и внутренней стандартной эмиссии использовали фильтр с ограниченной полосой пропускания с краем барьера (величина 50% пропускания) при 498 нм.

Мышей подвергали анестезии (0,75 мл кетамина, 0,5 мл домитора, 0,75 мл стерильной воды в дозе по 0,2 мл/100 г, в/б, при необходимости с добавками), и их зрачки расширяли, вводя местно 1%-ный тропикамид и 2,5%-ный гидрохлорид фенилэфрина за 10-15 мин до получения изображения. Перед каждой последовательной серией получения изображения на глаз наносили капли гидроксипропилметилцеллюлозы (0,3%-ной) для предотвращения высыхания. Изображения сетчатки с высоким разрешением и высокой контрастностью получали ш У1уо с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа (Не1бе1Ьегд Кейиа АидюдгарЬ, Не1бе1Ьегд Еидшеейид, Не1бе1Ьегд, Оегтаиу), используя модификацию описанных методов (Оио Ь., За1! Т.Е., Маакк А., Ьиоид У., Мокк З.Е., ΡίΙ/ке Ρ.^., Согбейо М.Р. (2006) 1иуек!. ОрЬ!Ьа1то1. Уй. Зск 47: 626-633). Кратко, диаметр точечного отверстия уменьшали до 100 мкм для улучшения аксиального разрешения и увеличивали мощность лазера для улучшения отношения сигнала к шуму. Было измерено, что мощность в области зрачка мыши составляла 1400 Вт при 488 нм.

- 23 022913

Мышам подбирали специально разработанные плоско-вогнутые контактные линзы, и подвод оптической энергии обеспечивали, используя 50-кратные линзы со сверхбольшим рабочим расстоянием, что улучшало оптическое разрешение и позволяло осуществлять детекцию структур микрокапилляров до 3 мкм в диаметре. Томографические слои регистрировали при последовательном передвижении плоскости осевого сечения с интервалами 15 мкм, в направлении стекловидное тело^склера и центра периферия для визуализации сосудистой сети сетчатки насквозь от первичного (сосудистого) сплетения до внешнего (сосудистого) сплетения. Захват всех последовательных серий изображений осуществляли при 8,9 Гц в поле зрения 10° и оцифровывали в виде файлов изображений 8-бит, 768x768 пикселей, получая в результате боковое разрешение изображения 1,2 мкм/пиксель. Измеренное осевое разрешение в глазу мыши составило 5-8 мкм.

Ρазличия между с£й^-/- и соответствующими по возрасту контрольными животными в количестве подсетчаточных аутофлуоресцентных отложений на уровне КРЕ анализировали, применяя к данным изображениям непарный !-тест Стьюдента с использованием 8Р88 (СЫсадо, 6Ь).

Гистология и иммуногистохимия.

Кратко, животных подвергали глубокой анестезии кетамином и дормитором и затем с£й^-/- мышей в возрасте десяти недель (п = 6), 3 месяцев (п=3), 6 месяцев (п=3), 9 месяцев (п=3) и 1 года (п=6) обрызгивали 0,1 М РВ8, затем 4%-ным параформальдегидом (в 0,1 М РВ8; рН 7,2). Извлекали глаза и помещали в 4%-ный параформальдегид, после чего осуществляли криопротекцию в 30%-ном растворе сахарозы (в 0,1 М РВ8 буфере) и оставляли на 24 ч при 4°С. Хрусталики извлекали, надрезая роговицу, и глаза быстро замораживали в смеси ОСТ (орбта1 си!бпд !етрега!иге сотроипб) (смесь для поддержания оптимальной температуры при приготовлении срезов) и делали срезы толщиной 10 мкм для иммуногистохимического анализа, подробности см. ниже. У некоторых животных отделяли нейронную сетчатку и сосудистую оболочку глаза и независимо закрепляли на плоской поверхности.

Глазные срезы от с£й^-/- мышей (п = 20) и соответствующих по возрасту контрольных мышей (п = 20) инкубировали с первичными антителами (Таблица 5), затем с соответствующими конъюгированными с флуоресцентной меткой вторичными антителами и ИАРб для окрашивания ядер, подробности см. ниже.

Иммуногистохимию проводили при комнатной температуре на криостатных срезах глаз толщиной 10 мкм, фиксированных в 4%-ном параформальдегиде. Срезы сетчатки блокировали в течение 1 ч в 5%ной нормальной ослиной сыворотке в 0,1 М забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8), рН 7,4 с 0 ,3% тритона Х-100 и инкубировали в течение ночи с первичными антителами, разбавленными 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в 0,1 М РВ8 с 0,3% Тритона Х-100. Ρазведения каждого первичного антитела осуществляли, как описано ниже. После обработки первичными антителами проводили отмывку и, если необходимо, обработку конъюгированными с флуоресцентной меткой соответствующими вторичными антителами (8ап!а Сги/, Вю!есЬпо1оду, 1пс., ослиные анти-мышиные антитела зс-2099), приготовленными в РВ8 с 0,3% Тритона и 2% нормальной сыворотки (разведение 1:100 в том же растворителе, что и для первичных антител), и срезы оставляли на 2 ч (Р1ТС 8ап!а Сги/, Вю!есЬпо1оду, 1пс., ослиные антимышиные антитела зс-2099). Отрицательные контроли представляли собой как равноценное антитело неродственного изотипа, так и контроль с отсутствием первичного антитела. После этого окрашивали ядра, используя 0,5 мл 4',6-диамино-2-фенилиндола (1 мкл концентрированного раствора ИАРб в 5 мл 0,1 М РВ8; 8^дта-Λ1б^^сЬ) в течение 1 мин. Далее срезы несколько раз промывали 0,1 М РВ8 с последующими четырьмя промывками в забуференном трисом физиологическом растворе (рН 7,4) и в конце заключали в стеклянные покровные стекла в VЕСТА8НIЕ^^ (поддерживающая среда для измерения флуоресценции) ^ес!от БаЬогаЮпез).

Срезы рассматривали и изображения запечатлевали либо с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа (Ьеюа 8Р2; Бей/) в режиме 8 бит/канал и 1024x1024 пикселей, либо с использованием эпифлуоресцентного микроскопа для наблюдения по методу светлого поля (О1утриз ВХ50Р4, О1утриз, барап), при этом данные собирали в виде 24-битных цветных изображений с разрешением 3840x3072 пикселей, используя цифровую камеру №коп ΌΧΜ1200 (№коп.Токуо, барап).

Имеющиеся в продаже первичные антитела.

С3 (конъюгированные с РбТС антимышиные антитела козы, разведение 1:100; IСN Вютебюа1з) использовали для окрашивания срезов сетчатки в указанных разведениях.

В этой работе использовали следующие антитела против бета-амилоида:

(1) кроличьи поликлональные АЬ (Соуапсе 81О-39153), специфичные к бета-амилоиду грызунов, рекомендованные для использования в 1НС в залитых парафином срезах в разведении 1/250;

(2) мышиные моноклональные АЬ (Са1ЬюсЬет ΝΡ1002 (4О8)), (1дО2Ь), распознающие как человеческий, так и мышиный бета-амилоид, рекомендованные для использования в 1НС в залитых парафином срезах при разведении 1/100 - 1/1000 (необходима предварительная обработка муравьиной кислотой);

(3) кроличьи поликлональные АЬ (аЬ2539 от АЬеат), распознающие как человеческий, так и мышиный бета-амилоид, рекомендованные для использования в 1НС в залитых парафином срезах в разведении 1/100 (перед процедурой 1НС-окрашивания необходимо опосредованное нагреванием восстановление антигена).

- 24 022913

Имеющиеся в продаже вторичные антитела.

Таблица 5. Использованные в этой работе имеющиеся в продаже вторичные АЪ

Ослиные, конъюгированные с ПТС, против 1дО мыши	Зап1а Сгиг Вю(еоЬ ίηο.	50-2099	1:300
Ослиные, конъюгированные с ПТС, против 1дО кролика	5ап1а Сгиг Вю1есИ ίηο.	зс-2090	1:300
Конъюгированный с А1еха Ниог 488 фрагмент антитела козы против 1д6 мыши	1гт1годеп	А11017	1:2000

Детекция друзоподобных отложений у сГН мышей.

В сетчатке старых сГН^-/- мышей можно детектировать аутофлуоресцентные отложения. Первые флуоресцентные липидные друзоподобные отложения у сГН^-/- мышей можно детектировать примерно в возрасте 14 недель, их присутствие увеличивается с возрастом, и они располагаются в субретинальном пространстве (апикальная сторона ΚΡΕ). Эти отложения также присутствуют у мышей дикого типа, но в значительно меньшей степени. Например, изображения сетчатки 6-месячной сГН мыши, полученные с помощью сБЬО, демонстрируют наличие некоторого количества аутофлуоресцентных белых пятен на сером фоне, и их можно видеть ίη νίΙΐΌ в сетчатке, растянутой на поверхности для проведения ИС, при 10-кратном и 40-кратном увеличении, которые легко идентифицируются в виде аутофлуоресцентных отложений в зеленом (ΕΙΤΕ') канале. Эмиссионные спектры аутофлуоресцентных отложений характеризуются большим разнообразием (данные не показаны).

При изучении срезов сетчатки с£Ъ^-/- мышей с использованием ИС можно наблюдать, что аутофлуоресцентные друзоподобные отложения ассоциированы с сайтами отложения компонента С3 комплемента в субретинальном пространстве на апикальной стороне клеток ΚΡΕ. Это можно наблюдать у 12месячных сГН мышей (данные не показаны).

Анализ глаз сГН -/- мышей с использованием имеющихся в продаже АЪ против бета-амилоида.

На имеющихся в продаже срезах фиксированных образцов головного мозга людей с болезнью Альцгеймера было подтверждено положительное окрашивание на Αβ (аЪ4582 от АЪеат), когда их использовали для проверки перекрестной реактивности трех имеющихся в продаже АЪ против бета-амилоида, показанных в табл. 6.

Для этого использовали следующую методику.

Для парафиновых срезов головного мозга:

1. ксилол -10 мин.

2. 100%-ный этанол - 8 мин.

3. 95%-ный этанол - 5 мин.

4. Дистиллированная вода - 5 мин.

5. Восстановление антигена:

АЪ2539 ΗΕΚ с использованием цитратного буфера;

ΝΕ1002 (4С8) - 70%-ная муравьиная кислота; -БЮ-39153.

Для парафиновых и замороженных срезов:

6. промыть ΡΒδ, 3 раза по 5 мин каждый раз.

7. Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в течение 1 ч.

8. Быстро промыть ΡΒδ.

9. Применить первичное антитело в разведении:

АЪ 2539-1:100;

№Г002(4С8)-1:200;

δΙ&39153-1:250.

Инкубировать в течение ночи.

10. Промыть ΡΒδ, 3 раза по 5 мин каждый раз.

11. Применить вторичное антитело в разведении: для АЪ2539 - АЪ кс-2090 1/100;

для ΝΕ1002 - АЪ 5с-2099 1/100; для БЮ-39153 - АЪ кс-2090 1/100.

Инкубировать в течение 1 ч.

12. Промыть ΡΒδ, 3 раза по 5 мин каждый раз.

13. ΌΛΡΙ в течение 1 мин.

14. Промыть ΡΒδ, 3 раза.

15. Промыть ΤΒδ, 4 раза по 5 мин каждый раз.

16. Закрепить, заключить под покровное стекло и герметично закрыть.

Как и ожидалось, только для первичных антител, способных давать перекрестную реакцию с бетаамилоидом человека (ΝΕ1002 (4С8) и АЪ2539), отмечали положительную детекцию бляшек бетаамилоида человека в тканях головного мозга людей с болезнью Альцгеймера (данные не показаны).

Детекция бета-амилоида в глазах старых (в возрасте более 1 года) и 10-недельных СРЮ/- мышей с использованием имеющихся в продаже АЪ.

- 25 022913

Таблица 6. Использованные в этом исследовании первичные антитела против бета-амилоида

Кроличье поликлональное антитело против бета-амилоида	АЬСат Ш.	аЬ2539	1:100
Мышиное тАЬ против β-амилоида	Са1Ьюс(тет 1пс.	ΝΕ1002	1:100
Очищенное поликлональное антитело против Αβ грызунов	Соуапсе 1пс.	51С-39153	1:100

Выполняли следующую методику.

1. Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов.

2. Промыть 3 раза.

3. Блокировать 5%-ной N08 в течение 1 ч.

4. Подготовить первичные антитела из табл.6 следующим образом:

а) 81С39153-1:250;

б) №1002(4С8)-1:200; в)АЬ2539-1:500.

5. Быстро промыть и инкубировать с первичными антителами в течение ночи.

6. Промыть 3 раза.

7. Подготовить следующие вторичные антитела:

а) анти-кроличьи Р1ТС;

б) анти-мышиные Р1ТС, инкубировать в течение 1 ч.

8. Промыть 3 раза.

9. Применить ΩΑΓΙ в течение 1 мин.

10. Промыть 3 раза РВ8.

11. Промыть 4 раза ТВ8.

12. Закрепить, заключить под покровное стекло и герметично закрыть. Первоначально фиксированную ткань сетчатки глаза соответствующих по возрасту сГЛ мышей и контрольных мышей дикого типа одного помета (С57В1/6) в возрасте 12-13 месяцев изучали, используя три имеющиеся в продаже первичные антитела (ΑΒ) против бета-амилоида, описанные выше. Каждое первичное ΑЪ детектировали, используя релевантное вторичное флуоресцентно меченное ΑΚ Для ΑЪ 81С39153 не удалось детектировать никакого сигнала в любой ткани, несмотря на следование рекомендованному производителем протоколу (как и в образцах головного мозга, описанных выше) (данные не показаны). Тем не менее оказалось возможным специфически детектировать бета-амилоид в сетчатке старых сП!^- мышей (но не мышей дикого типа одного помета) с использованием двух других имеющихся в продаже первичных антител против бета-амилоида. Пример таких результатов показан на фиг. 4, где на панели (А) показана ткань сетчатки старой мыши дикого типа, а на панели (В) показана ткань старой сГЛ мыши, при этом обе проанализированы с использованием ΑЪ2539 в качестве первичного ΑΠ; а на панели (С) показана ткань сетчатки старой мыши дикого типа, и на панели (Ό) показана ткань старой сП!^- мыши, при этом обе проанализированы с использованием ΝΞ1002 (4С8) в качестве первичного ΑΚ Эти данные демонстрируют, что отложения бета-амилоида образуются вокруг мембраны Бруха, в особенности у старых сЛГмышей. Положительный сигнал перекрестной реактивности антител в отношении отложений бета-амилоида на границе раздела КРЕ/мембрана Бруха можно наблюдать в виде интенсивной белой полосы, отмеченной белой стрелкой на фиг. 4 (В) и (Ό). Некоторые амилоидные отложения также можно наблюдать в области слоя нервных волокон и ганглиоцитов глаз сЛГ^- мышей, например белую полосу, отмеченную белой стрелкой в верхней части фиг. 4 (В).

В дальнейшем фиксированную ткань сетчатки глаза 10-недельных сГЛ^-/-мышей и соответствующих по возрасту мышей дикого типа из одного помета (С57В1/6) исследовали, используя оба (ΝΞ1002 (4С8) и ΑЪ2539) первичных антитела против бета-амилоида. И вновь оказалось возможным специфически детектировать бета-амилоид в сетчатке сП!^- мышей, но не мышей дикого типа из одного помета (данные не показаны). Эти данные демонстрируют, что отложение бета амилоида имеется в 10% случаев в сетчатке 10-недельных сП!^- мышей (и = 3) (данные не показаны). Отложение локализуется главным образом на базальной стороне слоя ретинального пигментного эпителия (КРЕ) и, по-видимому, ассоциировано с базальными ламинарными отложениями (данные не показаны). Отметим, что отложение бета-амилоида в возрасте 10 недель аналогично по времени тому моменту, когда впервые у сЛГ^- мыши появляются друзоподобные аутофлуоресцентные отложения и отложения компонента С3 комплемента.

Перекрестная реактивность 6Р6 с бета-амилоидом в сетчатке глаз сЛГ^- мышей.

Первичные антитела, использованные в этом исследовании.

(1) Моноклональное мышиное ΑЪ 6Р6, 1дС2а.

(2) Контрольное моноклональное мышиное ΑЪ изотипа 1дС2а (реагент собственной разработки), специфичное к антигену цитозиндезаминазы.

(3) Контрольное моноклональное мышиное ΑЪ (аЪ18413, ΑЪсат) изотипа 1дС2а-каппа (МОРС-173) неизвестной специфичности, происходящее из клона миеломы Ва1Ъ/с.

Выполняли следующую методику.

1. Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов.

2. Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

- 26 022913

3. Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в РВ8 с 0,3% Тритона Х-100, инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.

4. Подготовить первичное антитело, разбавив в 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в РВ8 с 0,3% Тритона Х-100:

а) мышиное моноклональное против бета-амилоида 6Р6: 1) - 1:1000, 1:2000 и 1:4000,

б) контрольное мышиное 1дО2а: 2) 1:1000, 1:2000 и 1:4000.

Быстро промыть.

5. Применить первичное антитело и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день.

1. Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

2. Подготовить вторичные антитела, разбавив 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в РВ8 с 0,3% Тритона Х-100:

а) козьи анти-мышиные с А1еха Р1иог 488 (1:2000).

Применить вторичное антитело и инкубировать в течение 1 ч при КТ.

3. Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

4. Применить БАР1 1:5000 в РВ8 и инкубировать в течение 1 мин в темноте.

5. Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

6. Промыть 1хТВ8 4 раза по 5 мин каждый раз.

7. Закрепить с помощью Уес1а’1йе1б, заключить под покровное стекло и герметично закрыть.

Первоначально фиксированную ткань сетчатки глаза соответствующих по возрасту сГН мышей и контрольных мышей дикого типа одного помета (С57В1/6) в возрасте 12-13 месяцев изучали, как изложено выше. Несмотря на то, что имелась перекрестная реактивность 6Р6 по отношению к той же области сетчатки, которую детектировали имеющимися в продаже АЬ против бета-амилоида, имелась схожая перекрестная реактивность с контрольным антителом, хотя в некоторой степени это может быть обусловлено фоновой перекрестной реактивностью только вторичного АЬ. Некоторое фоновое окрашивание также можно было наблюдать в образцах дикого типа.

Чтобы разрешить описанное выше фоновое окрашивание, эксперимент повторяли, но для вторичного антитела заменяли меченное А1еха Р1иог 488 анти-мышинное АЬ (1дО) на меченную Р1ТС молекулу. Кроме этого, первичное контрольное антитело заменяли на имеющееся в продаже контрольное антитело изотипа, указанного в (3).

Для этого эксперимента использовали следующую методику.

Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов.

Промыть 1хРВ8 1 раз в течение 5 мин.

Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в РВ8 0,3% Тритона Х-100, инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.

Подготовить первичное антитело, разбавив 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в РВ8 0,3% Тритона Х-100:

а) мышиное 1дО2а-каппа АЬ18413 (1:100).

Быстро промыть.

Применить первичное антитело и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день.

Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

Подготовить вторичные антитела, разбавив в 1 %-ной нормальной ослиной сыворотке в РВ8 с 0,3% Тритона Х-100.

б) ослиные анти-мышиные с Р1ТС (1:300).

Применить вторичное антитело и инкубировать в течение 1 ч при КТ.

Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

Применить БАР1 (1:5000) в РВ8 и инкубировать в течение 1 мин в темноте.

Промыть 1хРВ8 3 раза по 5 мин каждый раз.

Промыть 1хТВ8 4 раза по 5 мин каждый раз.

Закрепить с помощью Уес1а’1йе1б, заключить под покровное стекло и герметично закрыть.

Пример данных, полученных с применением изложенной выше методики окрашивания, показан на фиг. 5. На панели (А) показаны данные, полученные с использованием 6Р6 в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки старой сГН^-/- мыши, на панели (В) показаны данные, полученные с использованием контрольного изотипа (3) в качестве первичного антитела (в таком же разведении (мас./об.), как и 6Р6) для окрашивания секции сетчатки старой сГН мыши (имеющийся в продаже меченный сГ1^-/- отрицательный контроль), на панели (С) показаны данные, полученные с использованием 6Р6 в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки мыши дикого типа соответствующего возраста, взятой в качестве контроля, на панели (Ό) показаны данные, полученные с использованием контрольного изотипа (2) (меченый сГН^-'Отрицательный контроль) в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки старой сГ1^-/- мыши.

- 27 022913

Эти данные подтверждают, что 6Р6 способно специфически детектировать отложение бетаамилоида в сетчатке сГН мышей (фиг. 5А), которого нет у соответствующих по возрасту мышей дикого типа (фиг. 5С). Специфичность 6Р6 была подтверждена полным отсутствием окрашивания с использованием имеющихся в продаже контрольных изотипов в качестве первичных антител в разведениях (мас./об.), аналогичных разведению 6Р6, (фиг. 5В). Данные, полученные с использованием другого антитела собственной разработки с контрольным изотипом (2) в разведении 1:4000, (фиг. 5Ό) подтверждают специфическое окрашивание сетчатки у сГН^-/- мышей. Однако это может быть объяснено специфичностью такого изотипически сходного антитела, поскольку цитозиндезаминаза является маркером клеточного распада, который может иметь место в сетчатке старых сГН^-/- мышей. Оглядываясь назад, можно сказать, что это был неудачный выбор для изотип-специфического контрольного АЬ в этом эксперименте.

Динамика перекрестной реактивности амилоида в сетчатке глаз сГН мышей к 6Р6 и 408.

Мышей С57ВР6 (дикий тип) и соответствующих по возрасту сГН^-/- мышей аналогичным образом анализировали посредством иммуногистохимии в промежуточные временные точки между 10 неделями и 12 месяцами: в возрасте 3 месяцев (п = 3), 6 месяцев (п = 3) и 9 месяцев (п = 3). Анализ осуществляли, используя либо 6Р6, либо ΝΕ1002 (408) (Са1Ьюсбеш) в качестве первичного детектирующего антитела. В возрасте трех месяцев можно было наблюдать небольшое различие между мышами дикого типа и сГН^-/мышами в уровне общего роста. Однако для возраста шести месяцев можно было отчетливо детектировать амилоидное отложение вокруг границы раздела мембраны Бруха и клеток ретинального пигментного эпителия (КРЕ) у сГН мышей, но не у соответствующих по возрасту контрольных мышей дикого типа (данные не показаны). Для момента времени шести месяцев окрашивание с использованием 408 выглядело покрывающим всю границу раздела между КРЕ и ВМ, в то время как аналогичное окрашивание с использованием 6Р6 в качестве первичного антитела было более прерывистым (данные не показаны). Для момента времени, соответствующего возрасту шести месяцев, было показано четкое различие в уровне амилоидного отложения, зафиксированного посредством ГНС, в сетчатке сГН мышей по сравнению с соответствующими по возрасту контрольными мышами дикого типа.

Суммируя, можно сказать, что сГН мыши представляют собой модель быстрого развития амилоидоза глаза, особенно сетчатки, и это может быть тесно связано с фенотипом модели сухой АМЭ. Такие мыши будут представлять хорошую модель для анализа влияния терапевтических АЬ против бетаамилоида, таких как 6Р6, на бета-амилоид в сетчатке.

Демонстрация способности 6Р6 препятствовать связыванию бета-амилоида с фактором комплемента Ι.

В недавно опубликованных данных показано, что непосредственное взаимодействие между бетаамилоидом-бета и фактором комплемента Ι (СР^, партнером и кофактором для фактора комплемента Н (СРН) (\Уапд Б и др., 2008) может помочь в объяснении быстрого появления отложения бета-амилоида в сетчатке сГН мышей. В отсуствие СРН бета-амилоид может свободно связываться с любым не имеющим партнера СРI в сетчатке мыши (\Уапд Б и др., 2008; неопубликованные данные). Для демонстрации того, что терапевтическое антитело против бета-амилоида 6Р6 или эквивалентное ему гуманизированное антитело может препятствовать взаимодействию между бета-амилоидом и СРI посредством связывания с бета-амилоидом, можно провести серии экспериментов, аналогичных описанным \Уапд Б и др. (2008). Влияние предварительной инкубации 6Р6 с имеющимися в продаже препаратами белка бета-амилоида (например, от Рерббе бМПШе) на его способность связываться с имеющимся в продаже белком СРI (Дшбе1 Согрогабоп) в присутствии и в отсутствие имеющегося в продаже белка СРН (Дшбе1 Согрогабоп) может быть определено, как описано (\Уапд, Б и др., 2008, с. 716-717), и проанализировано или с использованием стандартной коиммунопреципитации, и/или анализа с примененим В1аСоге. Аналогично, способность антитела 6Р6 разрушать сформированный ранее комплекс бета-амилоид:СΡI в присутствии и в отсутствие СРН может быть установлена с использованием коиммунопреципитации и/или анализа с примененим В1аСоге. Аналогично, влияние предварительной инкубации 6Р6 с имеющимися в продаже препаратами белка бета-амилоида (например, от Рерббе бъбиие) на его способность влиять на функцию имеющегося в продаже белка СРI (Дшбе1 Согрогабоп) в присутствии имеющегося в продаже белка СРН (Дшбе1 Согрогабоп) можно измерить, используя анализ расщепления с применением компонента С3Ь комплемента (Дшбе1 Согрогабоп), как описано (ХУапд, Б и др., 2008, с. 717), и проанализировать посредством стандартного 8Э8-РА0Е. Аналогично, способность антитела 6Р6 разрушать сформированный ранее комплекс бета-амилоид:СРI в присутствии СРН и поэтому восстанавливать расщепляющую функцию С3Ь в отношении комплекса СРРСРН, можно установить, как уже описано (\Уапд, Б и др., 2008, с. 717), и проанализировать посредством стандартного 8Э8-РА0Е.

Результаты недавно опубликованного исследования ш νί6Ό подтвердили гипотезу, согласно которой бета-амилоид активирует систему комплемента внутри друз, блокируя функцию фактора комплемента Ι, что приводит к слабо выраженному хроническому воспалению в субретинальных тканях; таким образом, воедино связываются четыре фактора из факторов, ассоциированных с развитием АМЭ: воспаление, активация комплемента, отложение амилоида-бета и друзы (\Уапд Б и др., 2008). Такое прямое доказательство влияния бета-амилоида на активацию альтернативного пути комплемента в результате

- 28 022913 возможного конкурирования с фактором комплемента Н за связывание с фактором комплемента I ранее не было документально подтверждено (^аид 1. и др., 2008). Вмешательство в негативное влияние бетаамилоида на клиренс компонентов СЗ системы активации комплемента посредством терапевтического введения антител, таких как 6Р6, может составить новый механизм действия для остановки или реверсирования АМИ.

Детекция отложения бета-амилоида в глазах пожилых людей с использованием окрашивания тиофлавином Т и перекрестной реактивности 6Р6.

Образцы донорской ткани глаз человека получали из банка роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания (МоогПе1б8 Еуе Ваик, МоогПе1б8 Еуе Но8рйа1, Роибои, ИК). Первым полученным образцом был образец от 65-летнего мужчины европеоидной расы (банк роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания). Глаза фиксировали и обрабатывали, как описано ранее, и срезы окрашивали тиофлавином Т (81дта Т3516), используя описанный ранее протокол (Аибегеои е! а1, Ехр. Еуе Ке8. (2004), 78: 243-256; Ьеуше Н., Мебюб8 ш Еи/уто1оду (1999), 309: 274-284). Данные, полученные с помощью окрашивания тиофлавином Т глазной ткани, показали наличие флуоресцентного сигнала тиофлавина Т, связанного с бета-амилоидом, который можно было наблюдать в виде дымчатого белого окрашивания вокруг базальных ламинарных отложений и друз в области границы раздела КРЕ и мембраны Бруха в глазной ткани внешней сетчатки человека.

Следующие далее образцы глазной ткани донора человека получали из банка роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания, включая образцы от мужчины в возрасте 41 года и мужчины в возрасте 90 лет. Эти глаза опять фиксировали и обрабатывали, как описано ранее, но в этом случае срезы подвергали окрашиванию с помощью 6Р6 в качестве первичного антитела и визуализировали с использованием конъюгированного с Р1ТС вторичного антитела против 1дО мыши, как описано ранее. Несмотря на то что образец глаз 90-летнего мужчины потерял во время обработки большую часть сетчатки, перекрестную реактивность 6Р6 к амилоиду можно было детектировать во внешних сегментах оставшейся ткани. Это окрашивание отсутствовало как во внешних сегментах, так и в сетчатке глаза мужчины в возрасте 41 года. Людям, донорам глазной ткани, формально не был поставлен диагноз АМЭ, но наличие тяжелых базальных ламинарных отложений и также их ассоциация с бета-амилоидом является строгим подтверждением этиологии ранней сухой АМЭ в глазной ткани, окрашенной тиофлавином Т, у 65-летнего мужчины. Несмотря на то что в образце глаза 90-летнего мужчины обработка ткани приводила к потере большей части сетчатки, тот факт, что перекрестную реактивность 6Р6 к амилоиду можно детектировать в оставшейся ткани, а не во внешних сегментах и не в сетчатке глаза мужчины в возрасте 41 года (представляется слишком молодым, чтобы иметь симптомы АМЭ), сулит хорошие возможности использования антител, подобных 6Р6, в связывании с амилоидом, обнаруженным в глазах старых людей.

Клонирование вариабельных областей антител гибридом.

Последовательности вариабельных областей.

Общую РНК экстрагировали из всех гибридомных клеточных линий и затем последовательности кДНК вариабельных областей тяжелых и легких доменов получали, используя обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (КТ-РСК). Прямой праймер для КТ-РСК представлял собой смесь вырожденных праймеров, специфичных для лидерных последовательностей генов иммуноглобулинов мыши, а обратный праймер был специфичным к константным областям антител, как например, для тяжелой цепи изотипа 1дО2а 6Р6 мыши и легкой цепи-каппа антитела мыши. Праймеры конструировали в соответствии со стратегией, описанной 1оие8 и Веиб1д (В1о/ТесЬио1оду 9: 88, 1991). КТ-РСК проводили в двух повторах для обеих последовательностей У-области с целью обеспечения последующей проверки корректных последовательностей У-области. Продукты У-области, созданные с помощью КТ-РСК, клонировали (набор для клонирования от 1иуйгодеи ТА) и получали данные о последовательностях.

Аминокислотная последовательность У_Н 6Р6 (8ЕО ГО N0: 19)

ЕУС11.С1056АЕ1_УЕР6А5УК1_8СТС56ГН1КУУУУНУУ1К01.ТЕС!61_ЕУУ10К1РРЕМ6Е

Т1УТРКГйРКАТ1_ТУРТ55ЦТАУ1_С)1.551_Т8ЕРААУУУСУ336УУУОООТП_ТУЗЗ.

Последовательность ДНК У_Н 6Р6 (8Е0 ГО N0: 20)

САССТТСАССТССАеСАСТСТОССеСАСАССТТСТОСАСССАеСбСССТСАСТ

СААСТТетсСТеСАСАСОТТСТООСТТСААСАТТААООТСТАСТАТеТССАСТеО

СТСААССАСТТСАСТСАбСАСССССТеОААТбСАТТССААСеАТТСАТССТСАА

ААТОСТСАААСТАТАТАТАСССССАААТТССАССАСААССССАСТТТСАСАСТАС

АСАСАТСАТССААСАСАбССТАССТбСАССТСАССАбССТСАСАТСТеАбСАСб

СТССССТСТАСТАТТСТеТТАСТТСССеСТАСТСОССССААСССАССАС

ТСТСАСАСТСТССТСА

Аминокислотная последовательность У_ъ 6Р6 (8Е0 ГО N0: 21)

- 29 022913

ΡΐνΜΤ03ΑΡ8ΝΡνΤΙ.6Τ3Α5Ι80Κ58Κ8Ι_ί.ΗΚΝ6ΠΎΙ_ΥννΥΙ.0ΚΡ60ΡΡ0Ι·Ι·ΙΥ0Μ8Ν ίΑ56νΡΡΗΕΤ53Ο8ΟΤΡΡΤίΚΙ3ΡνΕΑΕΡν6νΥΥ0Α0ΝίΕΐννΤΓ6ΟΟΤΚίΕΙΚ.

Последовательность ДНК У_ь 6Р6 (8ЕО ΙΌ N0: 22)

САТАТТСТСАТСАСеСАСТСТССАТТСТССААТССАбТСАСТСТТебААСАТСАС

СТТССАТСТССТОСАОСТСТАССААСАСТСТССТАСАТАСОААТСОСАТСАССТА

ТТТСТАТТОСТАТСТССАСААеССАССССАСССТССТСААСТССТеАТТТАТСАС

АтетссААСсттбсстсАееАбтсссАбАСАсеттсАСТАбСАетеебтсАебА

АСТСАТТТСАСТСТСААААТСАССАСАСТССАбССТСАССАТСТССеТСТТТАТТ

АСТетеСТСААААТСТАСААСТТТСбАССТТСеСТССАСССАССААОСТССАААТ

СААА.

Области, определяющие комплементарность, (СОК) подчеркнуты в аминокислотных последовательностях.

Клонирование и экспрессия химерного антитела 6Р6.

Химерное антитело 6Р6 (6Р6с), состоящее из родительских мышиных У-областей, привитых на 1§С1 человека для тяжелой цепи или к С-областям-каппа антитела человека для легкой цепи, получали с целью экспрессии рекомбинантного антитела, которое можно было бы использовать для подтверждения корректного клонирования функциональных У-областей антитела мыши. ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепь У-области мышиного 6Р6 и мышиную сигнальную последовательность (КаЬа! е! а1. 8есщеисех оГ 1ттиио1одюа1 1и!егез!, ΝΙΗ, 1991, пятое издание, р. 30, 95УМР'СЬ), клонировали в рамке считывания в экспрессирующие векторы для млекопитающих КЬИ-ЬзЬе (для тяжелой цепи) и КЬ^ЬзЬе (для легкой цепи), уже содержащие константные области антитела человека (нефункциональный Рс 1§С1 или С-каппа антитела человека, соответственно). Посредством введения подходящего сайта клонирования аминокислотную последовательность в РК4 (каркасной области 4 (последовательность У-области, следующая за СГОК3 и предшествующая первому константному домену)) в аминокислотной последовательности У_Н изменяли с ТТИТУ88, как показано в 8Е0 ГО N0:19, на ТЬУТУ88.

Элементы экспрессирующего вектора К'ГО-Ьзйе для экспрессии тяжелой цепи

Пары оснований

0-1014

1015-2442

2443-2765

2766-3142

3239-3802

3803-4162

4163-6322

5077-5937 (комплементарная цепь)

Описание сегмента ДНК

Промотор (3ν40/Β3ν) Тяжелая цепь антитела Поли А

ВО-промотор РНРР Поли А Общий остов Бета-лактамаза (положение элементов и общий размер приведенного выше вектора даны только в целях иллюстрации и будут зависеть от размера вставки цепи антитела).

Элементы экспрессирующего вектора КЬ^ЬзЬе для экспрессии легкой цепи

Пары оснований Описание сегмента ДНК

0-1014 Промотор (5У40/К5У)

1015-1731 Легкая цепь антитела

1732-2051 Поли А

2388 2764 ВС-промотор

2774-3568 Неомицин

3569-3876 Поли А

3877-6063 Общий остов

5077-5937 (комплементарная цепь) Бета-лактамаза (положение элементов и общий размер приведенного выше вектора даны только в целях иллюстрации и будут зависеть от размера вставки цепи антитела).

Идентифицировали клоны с корректно клонированными У_Н- и У_ъ-последовательностями и получали плазмиды для экспрессии в СНО-клетках. Экспрессированное антитело 6Р6с очищали из супернатанта клеточной культуры хроматографией на иммобилизованном белке А на РРЬС-системе и затем тестировали на предмет связывания с Аβ посредством ЕЫ8А и 8РК с использованием технологии В1асоте™. Результаты показали, что были клонированы и экспрессированы корректные У-области 6Р6 мыши, что привело к получению функционального антитела с характеристиками, аналогичными характеристикам родительского мышиного антитела 6Р6.

Стратегия гуманизации тяжелой цепи.

Для вариабельной последовательности тяжелой цепи 6Р6 мыши был выбран акцепторный каркас зародышевой линии антитела человека (ЮНУ1-24, 8Е0 ГО N0:13), который имел 58% идентичности (включая СГОК) с вариабельной последовательностью тяжелой цепи 6Р6 мыши (8Е0 ГО N0:19), вместе с минигеном 1Н4 (КаЬа!: УРИУ\УСОСТЕУТУ88 (8Е0 ГО N0:15)). Первые четыре остатка минигена 1Н4 попадают в область СИКЗ, которую заменяют посредством введения СГОК из донорного антитела.

Создавали панель из 34 вариантов гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. СГОК тяжелой цепи 6Р6 мыши (с использованием определения по КаЬа!) (8Е0 ГО N0: 1, 2 и 3) прививали к акцепторному карка- 30 022913 су антитела человека, отобранному выше. Конструировали ряд вариантов гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи, содержащих замены в положениях в количестве от двух до пятнадцати, выбранных из положений 1, 5, 13, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 40, 41, 48, 66, 67, 69, 71, 75, 76, 93 и 94 (нумерация по КаЪа!) (табл. 7). Положения 93 и 94, непосредственно прилегающие к СОКН3 в соответствии с определением по КаЪа!, были включены во все исследуемые варианты.

Таблица 7. Список исследованных обратных мутаций в У_Н

Стратегия гуманизации легкой цепи.

Для вариабельной последовательности легкой цепи 6Р6 мыши был выбран акцепторный каркас зародышевой линии антитела человека (1ОКУ2-28), который имел 79% идентичности (включая СОК) с вариабельной последовательностью легкой цепи 6Р6 мыши (8ЕЦ ГО N0:21), вместе с 1-областью (соединяющей областью) каппа 1 (КаЪа!: ^ТРОЦОТКУЕ1К) на основании схожести последовательностей. Первые два остатка минигена 1К-1 попадают в область СОК3 и идентичны последним двум остаткам СОК3 легкой цепи 6Р6 мыши.

СОК легкой цепи 6Р6 мыши (с использованием определения по КаЪа!) (8ЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6) прививали к акцепторному каркасу антитела человека, отобранному выше, получая привитую напрямую вариабельную последовательность легкой цепи Ь0. Далее создавали панель из 13 вариантов гуманизированной вариабельной области легкой цепи на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела на функцию антитела. Конструировали гуманизированные варианты вариабельной области легкой цепи, содержащей замены в одном из четырех положений, выбранных из положений 8, 11, 43, 63, 64, 100 и 104 (нумерация по КаЪа!) (табл. 8).

Таблица 8. Список исследованных обратных мутаций в У_ъ

Нумерация остатка по КаЬа1	Остаток каркаса антитела человека (донор 1СНУ1-24)	Соответствующий остаток в мышином 6Р6
8	Р	А
11	1	N
43	3	Р
63	5	т
64	Θ	3
100	о ик-1)	6
104	V <ΰΚ-1)	1

Конструирование ДНК гуманизированной тяжелой и легкой цепи.

Гуманизированные У-области синтезировали йе поуо с применением перекрывающихся олигонуклеотидов и РСК-амплификации или с помощью сайт-специфического мутагенеза с использованием существующих вариантов в качестве матрицы. Вводили сайты рестрикции для клонирования в экспрессирующие векторы для млекопитающих КЬО-ЪзЬе и ΚΟΝ-ЪзЬе и мышиную сигнальную последовательность (КаЪа! е! а1. 'Ъесщепсез оГ 1ттипо1одюа1 1п!егез!, ΝΙΗ, 1991, пятое издание, р. 30, 95У№'СЬ). Продукты РСК, кодирующие гуманизированные У-области вместе с сигнальными последовательностями и сайтами рестрикции, затем клонировали в рамке считывания в экспрессирующие векторы для млекопитающих: варианты тяжелой цепи клонировали в КЬО-ЪзЬе для получения ДНК, кодирующей полноразмерные мутированные тяжелые цепи Рс 1дО1 человека; варианты легкой цепи клонировали в рамке считывания в ΚΕΝ-ЪзЬе, содержащий ДНК, кодирующую константную область каппа антитела человека, для получения ДНК, кодирующей полноразмерные легкие цепи каппа антитела человека.

Репрезентативные примеры экспрессии комбинаций тяжелой и легкой цепи гуманизированных антител.

Клетки СНОК1 подвергали временной трансфекции в малом масштабе в 6-луночных планшетах первоначально для того, чтобы оценить комбинации конструкций ДНК с гуманизированной легкой и тяжелой цепью. Клетки СНОК1, перенесенные в ОМЕМ Р12 с 5% фетальной телячьей сывороткой, содержащей сверхмалые количества 1дО, и 2 мМ глутамином, выращивали до конфлюэнтности в 6луночных планшетах. Конфлюэнтные клетки трансфицировали суммарно 7,5 мкг ДНК и 30 мкг липида для трансфекции (подходящий липид см. в \УО 2006/053783) в среде Орйтет О1и1атах (1пуйгодеп).

- 31 022913

Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С с 5% СО₂. Через 72 ч супернатанты собирали и анализировали концентрацию антител и затем тестировали на предмет связывания с Аβ человека посредством ЕЫ8А.

Гуманизированные антитела также экспрессировали в большом масштабе посредством проведения котрансфекции клеток СНО плазмидами ΡΕΌ и ΓΕΝ, кодирующими тяжелые и легкие цепи, используя электропорацию. Стабильную поликлональную популяцию клеток, экспрессирующих соответствующее антитело, отбирали, используя не содержащую нуклеозидов среду. Антитела извлекали и очищали из супернатанта, используя ЕРЬС на колонках Рго8ерА НПгар.

Оценка связывания с β-амилоидом гуманизированных У_Н-вариантов посредством ЕЬ18А.

гуманизированных У_Н-варианта, экспрессированных в малом масштабе в 6-луночных культурах, оценивали на предмет связывания с Аβ-пептидом (1-40) человека. Все 34 тяжелых цепи тестировали в комбинации с легкой цепью Ь2 (см. табл. 8, ниже). Некоторые комбинации с Ь2 экспрессировали антитело, но оно не связывалось с β-амилоидом (1-40), и поэтому для этих комбинаций невозможно было получить никаких величин ЕС50. В тех случаях, когда можно было получить величины ЕС50, они варьировали от эксперимента к эксперименту, но лежали в диапазоне от примерно 30-кратно увеличенных величин ЕС50 до величин, идентичных, если их сравнивать, величине ЕС50 для химерной конструкции с используемыми в ней У-областями мышиного 6Е6, которая присутствовала в каждом эксперименте в качестве образца сравнения. Остатки 93 и 94, непосредственно прилегающие к СЭКН3 в соответствии с определением по КаЬа!, содержались во всех гуманизированных вариантах. Положения 27-30, которые можно рассматривать в терминах структуры как часть СЭКН1 (СЬо1Ыа апй Ьезк (1987) 1. Мо1. Бю1. 196(4): 901917), обеспечивали лучшее связывание, когда их подвергали обратным мутациям, чем только замены в остатках 93 и 94. Обратные мутации совместно в обоих остатках 24 и 37 были необходимы для получения прочного связывания: без какого-либо одного из этих остатков гуманизированные варианты не связывались эффективно с Аβ-пептидом (1-40) в этом формате ЕЬ18А и в комбинации с легкой цепью Ь2. В табл. 9 в терминах свойств по связыванию с амилоидом показаны наилучшие гуманизированные У_Нварианты, основанные на комбинации с легкой цепью Ь2.

Таблица 9. Отобранные гуманизированные У_Н-варианты

- означает остаток из акцепторной каркасной последовательности 1ОНУ1-24, оставшийся неизменным.

Оценка связывания с β-амилоидом гуманизированных У[-вариантов посредством ЕЬ18А. Гуманизированные Ь0- и У_ъ-варианты, экспрессированные в малом масштабе в 6-луночных культурах, оценивали на предмет связывания с Аβ-пептидом (1-40) человека. Все варианты тестировали в комбинации с Н11. В табл. 10 суммированы все полученные функциональные У[-варианты.

Таблица 10. Отобранные гуманизированные У[-варианты

Гуманизированный Уц-вариант	Номер по КаЬа!	8	11	43	63	64	100	104
6Р6	А	N	Р	т	5	с	ь
ЮКУ-2-28	Р	|	5	5	е	о	V
ЬО				-	-	-	-	-
Ь2				-	-	3	-	-
ЬЗ			Р	-	-	-	-
1 4			-	т	-	-	-

суспензии СНО-клеток. Результаты двух независимых экспериментов с двумя различными концентрациями Аβ-пептида (1-40), использованными для нанесения покрытия, показаны ниже в табл. 11.

- 32 022913

Таблица 11. Величины ЕС50 для гуманизированных вариантов, связывающихся с Αβ-пептидом (1-40)

	0,1 мкг/мл Αβ 1-40 Эксп. 1	0,5 мкг/мл Αβ1-40 Эксп. 1	0,1 мкг/мл Αβ 1-40 Эксп. 2	0,1 мкг/мл Αβ 1-40 Эксп. 3
6Р6с	0,085 (ргеб) + 0,009	0,06 ±0,003	0,043 ± 0,002	0,048 ±0,003
Н1Ю2	0,205 ± 0,008	0,119 ±0,005	0,102 ±0,004	0,068 ±0,004
Н111-9	0,09 ± 0,009	0,061 ± 0,002	0,051 ± 0,002	0,04 ±0,002
Н11И0	0,148 ±0,004	0,071 ± 0,002	0,054 ± 0,002	0,056 ±0,001
Н11И2	0,189 ± 0,011	0,06 ±0,003	0,055 ± 0,003	0,058 ±0,002
Н11ИЗ	0,224 + 0,008	0,064 ± 0,002	0,056 ± 0,002	0,061 ±0,002

Концентрации относятся к Αβ-пептиду, использованному для нанесения покрытия на микротитрационные планшеты; приведены величины для лунок в двух повторах, показаны 8Ό для каждой пары.

Конкурентный ЕЫ8А для связывания с β-амилоидом (1-40) человека в растворе.

6Ρ6с и гуманизированные антитела Ш1Ь2, Ш1Ь9, Ш1Ь10, Ш1Ь12 и Ш1Ь13 оценивали на предмет их способности связываться с пептидом Αβ1-40 в растворе и ингибировать взаимодействие пептида Αβ1-40 человека с мышиным моноклональным антителом 6Ρ6 в конкурентном ЕЫ8А. Биотинилированный β-амилоид (1-40) в постоянной концентрации предварительно инкубировали с серийно разведенными количествами гуманизированных вариантов антитела 6Ρ6. Смесь, включающую амилоид в комплексе и свободный амилоид, затем добавляли в лунки, содержащие иммобилизованное мышиное моноклональное антитело 6Ρ6, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре.

Планшеты промывали и количество свободного β-амилоида, который все еще был способен связываться с иммобилизованным родительским моноклональным антителом 6Ρ6, далее детектировали, используя конъюгат стрептавидин-ΗΚР.

В табл.12 показаны величины ГС50 для этого конкурентного анализа, полученные в двух независимых экспериментах с использованием очищенного антитела. Все гуманизированные варианты были способны эффективно конкурировать за связывание с родительским моноклональным антителом 6Ρ6 с очень сходными величинами ГС50.

Таблица 12. Величины ГС50 в конкурентном анализе за связывание с β-амилоидом (1-40) человека гуманизированных вариантов и моноклонального антитела 6Ρ6, измеренные посредством ЕЫ8А

	Эксп. 1	Эксп. 2
Г уманизированный вариант	1С50, мкг/мл	Стандартная ошибка	Ю50, мкг/мл	Стандартная ошибка
6Р6с	0,566	0,027	0,451	±0,013
Η11ί2	0,862	0,024	0,578	±0,024
Н111 9	0,588	0,018	0,518	±0,028
Н11Ы0	0,622	0,041	0,519	±0,016
Н1И12	0,561	0,025	0,549	±0,018
Н11ЫЗ	0,616	0,015	0,531	±0,023

Кинетика связывания гуманизированных вариантов, определенная в анализе с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

Αффинность отобранных комбинаций тяжелой и легкой цепей определяли, используя устройство В1асоте Т100. Проводили три независимых эксперимента, используя гуманизированное антитело, иммобилизованное через белок Α на поверхности чипов В1асоте, и введение пептидов β-амилоида (1-40). Химерная молекула 6Ρ6 служила в качестве молекулы сравнения. С этой целью белок Α иммобилизовали на СМ5-чипе посредством реакции сочетания с первичным амином в соответствии с рекомендациями производителей. На этой поверхности осуществляли захват антитела против β-амилоида и после периода стабилизации над поверхностью пропускали β-амилоид (1-40) человека в концентрациях 256-2 нМ, используя двукратные разведения. Пропускание буфера над поверхностью с захваченными антителами использовали для двойного сопоставления набора данных в соответствии с наилучшей практикой В1асоте. С помощью регенерации в выбранных мягких кислотных условиях удаляли захваченное антитело, но это существенно не влияло на способность поверхности с белком Α осуществлять новый акт захвата. Эту процедуру проводили в ΗВ8-ΕР при 25°С. Результаты суммированы в табл. 13 в виде средних значений для всех трех экспериментов.

Таблица 13. Αффинность и кинетические данные, полученные с использованием В1асоте, для отобранных вариантов очищенных гуманизированных антител

Конструкция антитела	Средняя величина Κϋ [нМ]	5ϋ
6Р6с	3,74	1,20
Н111 2	9,57	2,31
Н111 9	4,91	1,25
Н11Н0	5,57	1,66
Н111 12	6,95	2,34
НЛ 11 13	7,41	2,39

Данные показывают среднюю величину КО и 8Ό для трех независимых экспериментов.

Тонкое картирование эпитопов гуманизированного антитела Η11Ь9.

Проводили тонкое картирование минимального связывающего эпитопа гуманизированного моноклонального антитела Ш1Ь9, используя планшетный ридер 8Κυ ВШЭ (8Κυ Вю^уЧепъ). Для тонкого картирования эпитопа получали три набора пептидов на основании последовательности из 18 аминокис- 33 022913 лот: а) набор пептидов для аланин-сканирования, в котором каждый из 10 остатков 27-37 был последовательно заменен на остаток аланина; б) набор укороченных с Ν-конца пептидов, в которых поочередно по одному остатку были удалены остатки с Ν-конца 18-мерного пептида, начиная с остатка 23, и в) набор укороченных с С-конца пептидов, в которых поочередно по одному остатку были удалены остатки с Сконца 18-мерного пептида, начиная с остатка 40.

Все пептиды получали в следующем формате: биотин-(линкер 8С8С)-ПЕПТИД-амид, линкер удлиняли, где необходимо, для обеспечения того, чтобы все пептиды были 22-мерными.

Покрытый стрептавидином биосенсорный планшет (§КИ ВюкукЮтк) промывали РВ§ и скручивали вверх дном для удаления буфера, затем промывали РВ§ с 0,1% Твина 20 и 0,4% ацетонитрила и скручивали вверх дном для удаления остатков буфера. Содержимое лунок ресуспендировали в 100 мкл РВ§ с 0,1% Твина 20 и 0,4% ацетонитрила и прочитывали на планшетном ридере 8КИ для установления базовой линии. После этого удаляли 50 мкл буфера, добавляли 50 мкл разбавленного пептида и оставляли для связывания. Затем планшет дважды промывали РВ§, содержимое лунок далее ресуспендировали в 100 мкл РВ§ и проводили повторное измерение базовой линии. Как только базовая линия стабилизировалась, удаляли 50 мкл буфера и добавляли Н11Ь9 и контрольное антитело до конечной концентрации 30 мкг/мл. Связывание антител регистрировали. Планшеты дважды промывали РВ§, содержимое лунок ресуспендировали в 100 мкл РВ§, планшеты повторно измеряли и снова сравнивали с данными на момент добавления антитела для обнаружения слабо связывающихся соединений, которые могли быть удалены на стадии промывки. Брали уровни связывания для промытых планшетов и анализировали на предмет связывания антитела с различными наборами пептидов.

Делеция Ν-концевой области не оказала никакого эффекта на связывание в том случае, когда последовательно удаляли остатки с Ό23 по Ν27. Делеция К28 вызывала уменьшение связывание более чем на 50%, но делеция остатков С29-А30 не вызывала дальнейшего уменьшения связывания. Делеция остатка 131 и далее полностью упраздняла связывание. Это позволяет определить Ν-концевую границу, как необходимость присутствия К28 для полного связывания. Делеция С-концевой области не оказала никакого эффекта на связывание, когда остатки с У40 по Ь34 удаляли один за другим. Однако связывание полностью упразднялось в результате делеции в положении С33 и далее. Это позволяет определить Сконцевую границу, как необходимость присутствия по меньшей мере остатка С33 для связывания. Следовательно, данные по Ν- и С-концевым делециям, взятые вместе, позволяют осуществить тонкое картирование минимального эпитопа Н11Ь9 в виде КСАПС (остатки 28-33) бета-амилоидного пептида. Это подтверждает результаты проведенного ранее картирования с перекрывающимися пептидами эпитопа моноклинального антитела 6Р6, за исключением того, что удаление остатка М35, по-видимому, вызывает уменьшение сигнала связывания с 6Р6.

Аланинзамещающее сканирование остатков от Ν27 до С37 показало, что замена аминокислот ^2 и в особенности С33 на аланин оказывала наибольшее влияние на связывание. Эти данные также подтвердили данные, полученные ранее с помощью С-концевой делеции, о том, что С33 представляется ключевым для связывания этого антитела. Результаты суммированы в табл. 14 в форме схематического изображения.

Таблица 14. Схематическое изображение тонкого картирования эпитопа для Н11Ь9

№ остатка в Яета-амилоиле	23	24	26	26	27	28 |29 130 |31 |32 |33	34	35	36	37	36	39	40
Аминокислота	О	V	С	8	N	к |с |а |ι | |с	!	М	V	<3	с	V	V
Аланин-скани во ванне
Укопачипание с Ν-κοήια >
Уктмчимник г. С-кпния <

§ Неисследованный остаток в пептидном наборе.

Нет воздействия на связывание (аналогично связыванию полноразмерного 1 &»мера)

Пониженное СвязываниеУдаление остатка приводит к потере связывания Оценку провести невозможно

Деиммунизация гуманизированного антитела Н11Ь9.

Проводили оценку ίη кШсо возможных эпитопов ТН-клеток и выбранные остатки в аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи (8ЕЦ ГО Ν0:24 и 5ЕЦ ГО Ν0:26 соответственно) заменяли на альтернативные остатки, чтобы разрушить эти эпитопы с сохранением при этом функциональности. Положения 23, 30, 31, 38, 42, 61 и 95 для У_Н и остатки 11, 30, 52 и 53 для У_ъ были заменены альтернативными аминокислотами, показанными в табл.15 и 16 для каждого положения.

- 34 022913

Таблица 16. Отдельные аминокислотные замены в гуманизированном У_ь-варианте Ь9

У-области синтезировали бе ηονο с применением перекрывающихся олигонуклеотидов и ΡΟ^ амплификации, как описано выше, или с помощью сайт-специфического мутагенеза с использованием вариантов тяжелой и легкой цепей Н11 и Ь9 в качестве матриц. Вводили сайты рестрикции для клонирования в экспрессирующие векторы для млекопитающих НЬЭ-ЬзНе и К1^-ЬзНе и мышиную сигнальную последовательность (КаЬа! е! а1. 'Ъедиепсез о£ ИптигкйощсдП Шегез!, №Н, 1991, пятое издание, р. 30, 95У№'СЬ). Продукты, кодирующие модифицированные У-области, затем клонировали в экспрессирующие векторы для млекопитающих: варианты тяжелой цепи клонировали в КЬО-ЬзНе с ρΕΡпромотором для получения ДНК, кодирующей полноразмерные мутированные тяжелые цепи Рс Ι§Ο1 человека; варианты легкой цепи клонировали в рамке считывания в К1^-ЬзНе вместе с ρΕΡ-промотором, содержащий ДНК, кодирующую константную область каппа антитела человека, для получения ДНК, кодирующей полноразмерные легкие цепи каппа антитела человека.

Первоначально новые УН-варианты Н36-Н44 экспрессировали и оценивали в комбинации с легкой цепью Ь9, а новые У_ь-варианты Π5-Π8 экспрессировали и оценивали в комбинации с тяжелой цепью Н11. Экспрессированные антитела анализировали на предмет связывания с синтетическим бетаамилоидом (1-40), используя культуральный супернатант, ΕΟδΑ и анализ с применением В1асоге. После этой оценки объединяли варианты с единичными заменами, которые наилучшим образом сохраняли эффективность связывания, получая конструкции тяжелых и легких цепей Н45-Н51 и Ы9-Ь22. Эти новые варианты цепей опять экспрессировали в комбинации с цепями-партнерами Н11 и Ь9, как изложено выше. Из этого второго набора вариантов наилучшие тяжелые (Н48-Н51) или легкие цепи (Ы9-Ь21) объединяли друг с другом, получая третий набор, который опять экспрессировали и исследовали с применением В1асоге кинетику связывания с бета-амилоидом (1-40). В табл. 17 показаны эти комбинации и параметры кинетики связывания.

Таблица 17. Отобранный набор гуманизированных деиммунизированных конструкций и параметры кинетики связывания (В1асоге)

Конструкции	ка	кб	КО (нМ)
Н48И9	1.474Е+5	4.643Е-4	3,15
Н49И9	1.549Е+5	4.780Е-4	3,09
Н50И9	1.333Е+5	3,682Е-4	2,76
Н5И19	1.405Е+5	3.717Е-4	2,65
Η48Ι.20	1.024Е+5	2.065Е-4	2,02
Η49Ι.20	9,967Е+4	2.223Е-4	2,23
Η50Ι.20	8.486Е+4	2.122Е-4	2,50
Н5И20	9.646Е+4	2.149Е-4	2,23
Н481 21	1.453Е+5	2.922Е-4	2,01
Η49Ι.21	1.405Е+5	3,621 Е-4	2,58
Η50Ι.21	1.232Е+5	2,671 Е-4	2,17
Н5И21	1.383Е+5	2.840Е-4	2,05
Н11Ь9 (супернатант)	1.019Е+5	2.517Е-4	2,47
Н111 Э (очищ.)	1.013Е+5	2,490Е-4	2,46
Химерное 6Е6 (очищ.)	1,815Е+5	1.809Е-4	1,00

В1асоге-метод, использованный для изучения кинетики связывания.

Проводили сочетание антитела против Ι^Ο человека (В1асоге ВК-1008-39) с биосенсорным чипом СМ5 посредством реакции сочетания с первичным амином. На этой поверхности осуществляли захват

- 35 022913 антител против β-амилоида. Затем над ней пропускали бета-амилоид (1-40) в концентрации 256, 64, 16, 4 и 1 нМ, а также 0 нМ (то есть над поверхностью с захваченным антителом пропускали только буфер), что используется для двойного сопоставления. Между всеми пропусканиями амилоида поверхность регенерировали, используя 3 М Μ§Ο₂, с помощью чего удаляли захваченное антитело, но существенно не изменяли способности поверхности захватывать антитела в последующем анализе. Данные анализировали, используя собственную для Т100 модель 1:1. Работу проводили при 25°С и 37°С, используя ΗΒδ-ΕΡ в качестве рабочего буфера.

Для некоторых конструкций из этой панели также оценивали кинетику связывания при физиологической температуре. В табл. 18 показаны параметры кинетики связывания для подгруппы конструкций при 37°С.

Таблица 18. Оценка кинетики связывания для отобранной подгруппы конструкций из табл. 17 при 37°С (Ыасоге)

Конструкция	ка	кс!	КЦ (ΗΜ)
Η48Ι.20	3.080Ε+5	1,091 Ε-3	3,54
Η50ί20	2.704Ε+5	9.466Ε-4	3,50
Н5И20	2.67ΟΕ+5	1.037Ε-3	3,89
Η48Ι.21	3.776Ε+5	1.017Ε-3	2,69
Η50Ι_21	3.503Ε+5	Э.463Е-4	2,70
Η51ί21	3.384Ε+5	9,817Ε-4	2,90
Η48Ι_17	2,839Ε+5	1.340Ε-3	4,72
Н49И7	3.439Ε+5	1.448Ε-3	4,21
Η11 ί9 (супернатант)	2.970Ε+5	3,592Ε-(	2,89
Η111_Э (очищ.)	3,261 Ε+5	1.015Ε-3	3,11

Аминокислотные последовательности ν-областей акцепторных каркасов и гуманизированных вариантов.

Аминокислотная последовательность ν-области акцепторного каркаса тяжелой цепи ЮУШ-24 (δΕΟ ΙΌ N0: 13)

Ων0ίν03ΘΑΕνΚΚΡ6Α3νκν30Κν3ΘΥΤΙΤΕί3ΜΗνννΚΩΑΡΘΚΘίΕννΜΘ(3Ρ0ΡΕ

ΟΘΕΤΙΥΑΟΚΡΟΟΚνΤΜΤΕΟΤ3ΤΟΤΑΥΜΕ133ίΚ3ΕΟΤΑνΥΥΟΑΤ.

ДНК ν-области акцепторного каркаса тяжелой цепи Ι&ΥΗ1-24 (δΕΟ ΙΌ N0: 14) САСОТССАестеоТАСАОТСТббббСТбАССТеААбААбССТССееССТСАСТ еААССТСТССТбСААОСТТТССееАТАСАСССТСАСТеААТТАТССАТССАСТее СТСССАСАОССТССТССААААССССТТбАбТееАТееСАССТТТТСАТССТСАА САТССТСАААСААТСТАСССАСАСААСТТССАСбССАСАСТСАССАТЕАССбАС ОАСАСАТСТАСАОАСАСАОССТАСАТСеАОСТбАССАСЗССТеАеАТСТеАееАС АсеессететАттАстотесААСА.

Аминокислотная последовательность ν-области акцепторного каркаса легкой цепи ΙΟΚν2-28 (δΕΟ ΙΌ N0: 16) □ΐνΜΤα3Ρί5Ι_Ρ\σΡΘΕΡΑ3Ιδ0Ρ330311Η5Ν0ΥΝΥίθν)ΎΙ_αΚΡ003Ραΐ_Ι-ΙΥΙ_Ο3

ΝΡΑ80\/Ρ0ΡΡ565β50Τ0ΡΤΙ_ΚΙ5ΡνΕΑΕ0ν(5νΥΥ0Μ0ΑΙ_0ΤΡ

ДНК ν-области акцепторного каркаса легкой цепи ЮКУ2-28 (δΕΟ ΙΌ N0: 17) САТАТТСТСАТеАСТСАСТСТССАСТСТСССТССССеТСАССССТССАСАСССе еССТССАТСТССТССАеСТСТАСТСАОАбССТССТССАТАОТААТОбАТАСААСТ АтттсбАттеетАсстесАОААбССАсеесАСтстссАСАССтсстбАТСт АтттббсттстААтсееесстссеееетссстеАСАССттсАетеесАетесАт САееСАСАСАТТТТАСАСТСААААТСАССАСАСТССАбССТеАССАТбТТеССб ТТТАТТАСТССАТССААССТСТАСАААСТССТ

Последовательность ДНК гуманизированного варианта Н11 ν-области тяжелой цепи (δΕΟ ΙΌ N0:

23) сАестссАестсстАСАСтстссеестслеетсААССАссстессесстсАст

СААССТСТССТССААСееТТСССбАТТСААСАТТААееТСТАСТАТеТССАСТбС

СТСССАСАССТТССТ66ААААСС6СТТСАСТССАТСС6ААССАТТСАТССТСАА

ААТСбТСАААСТАТАТАТАСССССАААТТССАССАСААССССАССТТСАССбТАС

АСАСАТСТАСАСАСАСАбССТАСАТеСАССТСАеСАСССТСАСАТСТСАбСАСА сесссетстАттАСтетсттАбттсесестАСтееесссАеебСАСАСТАбтеА ссетстссАсс

Аминокислотная последовательность гуманизированного варианта Н11 ν-области тяжелой цепи (δΕΟ ΙΌ N0: 24) αναΐ_ν055ΑΕνΚΕΡ6Α5νΚν50Κ65ΘΡΝΙΚνΥΥνΗννΐ_Καΐ_ΡΘΚβΙ_Εννΐ6ΚΙ0ΡΕΝ6

ΕΤΙΥΤΡΚΡα0ΚΑΤΙΤν0Τ3Τ0ΤΑΥΜΕ[-35Ι-Ρ3Ε0ΤΑνΥΥ0ν356ΥνΛ3α6ΤΐνΤν33.

- 36 022913

Последовательность ДНК гуманизированного варианта Ь9 ν-области легкой цепи (8Εβ ГО NО: 25) САТАТТСТСАТСАСТСАбТСТССАСТСТССААТССССТСАССССТССАСАСССС СССТССАТСТССТССАССТСТАССААеАеТСТССТАСАТАееААТСССАТСАССТ АтттетАттеетАССтесАеААессАбббСАетстссАСАбстсстеАтст АтсАедтетссААСсттбсстсАсееетссстбАСАбеттсАетАбСАетесАт САСССАСАСАТТТТАСАСТСААААТСАССАСАСТСеАееСТеАССАТСТТСССС ТТТАТТАСТССеСТСААААТСТАСААСТТТеСАСеТТСбеССААбСбАССАА ССТСОАААТСААА.

Аминокислотная последовательность гуманизированного варианта Ь9 ν-области легкой цепи (8Εβ ГО 26):

ΟΐνΜΤΟδΡΙδΝΡνΤΡβΕΡΑ5ΙδΟΚ5δΚ811ΗΚΝ6ΙΤΥΙ_Υν\/ΥΙ_αΚΡΟΟδΡΟΙ-Ι-ΙΥΟΜδΝ ίΑδΟνΡΟΚΡδδδΟδΟΤϋΡΤΙΚΙδΚνΕΑΕΟνβνΥΥΟΑΟΝΙΕίνΥΓΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ.

Зрелая аминокислотная последовательность тяжелой цепи Н11 (8Εβ ГО NО: 27) ΟνΟίνΟδΘΑΕνΚΕΡΟΑδνκνδΟΚΟδΘΡΝΙΚνΥΥνΗννίΡΩίΡΟΚΟίΕννίΘΡΙΟΡΕΝΟ ΕΤΙΥΤΡΚΡΟΟΚΑΤίΤνΟΤδΤΟΤΑΥΜΕΙδδΙΡδΕΟΤΑνΥΥΟνδδΘΥννΟΟΟΤίντνδδΑ δΤΚΟΡδνΕΡίΑΡδδΚδΤδΟΘΤΑΑΙ_ΟΟΙ.νΚΟΥΡΡΕΡντνδ1Λ/ΝδΟΑΙ_Τ86νΗΤΡΡΑνΐ_α δδΘίΥδΙδδνντνΡδδδΙΘΤΩΤΥΙΟΝνΝΗΚΡδΝΤΚνΟΚΚνΕΡΚδΟΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡ ΕΙΑΘΑΡδνΡΙΡΡΡΚΡΚΟΤΙΜΙδΡΤΡΕνΤΟνννΟνδΗΕΟΡΕνΚΡΝννΥνΟΘνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΡΕΕΟΥΝ5ΤΥΡνν3νΐ-Τνΐ_ΡΚ30ννΐ_Ν6ΚΕΥΚ0Κν3ΝΚΑΙ_ΡΑΡΙΕΚΤ18ΚΑΚΌΩΡΡΕΡ α\/ΥΤΙΡΡδΚ0ΕΙ_ΤΚΝθνδΙ.Τ0Ι_νΚΟΡΥΡ30ΙΑνΕννΕδΝΘ(3ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐ_Οδ06δ ΡΡίΥ3ΚίΤν0Κ3Ρνν(Μ6ΝνΡ303νΜΗΕΑΙ-ΗΝΗΥΤαΚ31.3Ι_3ΡεΚ.

Зрелая аминокислотная последовательность легкой цепи Ь9 (8Εβ ГО NО: 28) 0ΐνΜΤα3ΡΙ-3ΝΡνΤΡΟΕΡΑ3Ι30Ρ133Κ3Ι_Ι_ΡΙΡ!ΝΟΙΤΥΙ-ΥννΥΙ-0ΚΡΟΟ3Ραΐ_Ι-ΙΥ0Μ3Ν ΙΑ3θνΡϋΚΡ353δ3<3ΤΟΠΊ_ΚΙ3Ρ!νΕΑΕθν6νΥΥΟΑαΝΙ_ΕΙ-\νΤΡθαθΤΚνΕΙΚΡΤνΑ ΑΡδνΡΙΡΡΡ3ΒΕ<2Ι.Κ3ΘΤΑ3νν<;ΐ.Ι.ΝΝΕΥΡΚΕΑΚν<3ννκνθΝΑΕαδΟΝδ<ΪΕ3νΤΕαθ 3Κ05ΤΥ8133ΤΙ_Τ13ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑΟΕνΤΡΙΟΘΙ_33ΡνΤΚ3ΡΝΡΟΕΟ

Оптимизированная ДНК тяжелой цепи Н11 (8Εβ ГО NО: 29)

САСбтесАестсетссАСАесеесессеАсетсАААСААССсбссбссАССб

ТСААССТСАОСТеСААеееСАОССССТТСААСАТСАААеТСТАСТАССТеСАСТ есстеАббСАбстасссесАААСбосстееАстооАттоесАеоАтсеАСССс бАСААСееСбАЙАССАТСТАСАСССССААеТТССАСбАСААССССАСССТОАСС

СТеСАСАССАССАССбАСАСССССТАСАТбСААСТеАССАбССТеАСОТССОА ссАТАсссссетстАСТАСтесетсАССАСсееетАттеесессАСсесАСАС

ТАбТОАССОТСАССАОССССАССАССААОССССССАбСетеТТСССССТСССС

СССАССАССААСАаСАССАССОСССбСАСАСССССССТСееСТСССТбеТеАА сеАСТАСттсссссАесссетсАСсететсстобААСАесееАсссстеАСАА ассеаатосАСАССттссссессбтестесАеАесАссбесстбТАСАбсста

АеСА6С6ТСеТСАСАСТеСССА0СА6САСССТееССАСССАСАССТАСАТСТе

СААССТеААССАСААССССАбСААСАССААееТСеАСААеААССТеСАбСССА

АОАССТеССАСААСАСССАСАССТаСССССССТбСССТСССССТСААСТбеСС

ООАеСССССТССеТОТТССТ<ЗТТСССССССАА(ЗСССААе<ЗАСАСССТСАТ<ЗАТС

АсссссАссссссАсетсАсстесетеетсетссАсстеАессАСбАСбАСС

СТбАССТСААСТТСААТТееТАСбТеСАССеСеТОСАССТССАСААССССААСА ссААбссссеееАееААСАстАСААСАесАсстАссесстоотетссбтесте

АСС6ТеСТеСАССАС0АСТ66СТ6ААСееСАААеААТАСАА6Т6СААС6ТеТСС

ААСААС0СССТСССТеСССССАТСеАвААААССАТСА6САА66ССАА666ССА бСССАебСААССССАССТСТАСАСССТОССССССТСССеОСЗАСаАССТСАССА

АСААССАсететссстбАсстотстеетсААсессттстАссссАссеАСАтсе

ССетСОАбТеееАСАССААССОССАСССССАОААСААСТАСААеАССАССССС

ССТеТеСТООАСАССОАСбеСАССТТСТТССТСТАСАОСААССТеАССеТСеАС

ААСАССССетеССАССАССССААСетСТТСАССТССАСССтеАТССАСеАССС

ССТбСАСААССАСТАСАСССАСААбАбССТСАСССТеТСССССееСААС.

- 37 022913

Оптимизированная ДНК легкой цепи Ь9 (8Е0 ГО NО: 30)

ОАСАТСбТеАТеАСССАОАеСССАСТОАаСААТСССетСАСТСССССССАеСС

ССССТСААТСАеСТССАСбАеСАеСААСАСССТбСТССАСАСбААССССАТСА сстАССтетАстеетАтстссАОААесссесссАбАесссссАССтестсАтст

АССАаАТОТССААССТСеССАССббСетеСССОАСССаТТСТСТАССАОСОеА

АессесАсссАсттсАссстеААСАтсАесАееетеоААессеАесАсетеос

СбТеТАСТАСТбСОСССАСААССТООАбСТСТССАССТТСеСССАСееСАССАА оетеелеАтслААСотАсоетесссосссссАесотсттсАтсттсссссссАе сеАтеАССАестедАСАесеосАСССссАбсотеетететстестсААСААСтт стАсссссееелеессААбетссАетссААсетесАСААтессстбСАбАСсе

ССААСАСССАООАСАССОТОАСС6АОСА66АСАЕСАА66АСТССАССТАСАСС

СТбАеСАбСАСССТОАСССТбАОСААССССбАСТАССАбААбСАСААСетеТА сосстотеАЕЕтеАСССАССАееасстетссАессссетеАССААСАесттсА

Асссеееседетес.

Аминокислотная последовательность варианта Н51 У-области тяжелой цепи (8ЕО ГО NО: 65) 0УС11Л/а5САЕУКЕРеА5УКУ5СК65еРМ1НТУ'Л/Н\Л/1-КС|1-РЕКе1_Е\Л/1СРЮРЕМе ΕΤΙΥΤΡΚΡ(2ΟΚΑΤΙΤνθΤ3ΤΟΤΑΥΜΕΙ_δ5Ι_Κ3ΕΟΤΑνΥΥ0ν38<3Υν/Ο0ΟΤΐντν3δ

Последовательность ДНК варианта Н51 У-области тяжелой цепи (8ЕО ГО NО: 66) САсетбСАсстсетесАеАесессбссеАсетеАААбААсссеесессАесе ТСААОбТеАССТеСААббССАбСееСТТСААСАТССАСАССТАСТАСбТОСАСТ ссстсАсесАсстсссссАеААсессстесАстееАттеесАесАтсеАСССС САеААСееССАеАССАТСТАСАСССССААСТТССАОеАСААееССАСССТеАСС бтееАСАссАесАСсеАСАСсесстАСАтебААстоАбСАесстсАоетссоА ССАТАСССССбТСТАСТАСТСССТбАССАССбССТАТТСесСССАССССАСАС тАетбАСсетотссАбс.

Аминокислотная последовательность варианта Ь21 У-области легкой цепи (8ЕО ГО NО:71) οινΜτοδΡίδΝΡντρΰΕΡΑδίδΟΡδδκδίίΗΚΝΕΚΤΥίΥννΥίακΡΘαδΡΟΐίΐΥΟΜΟ ΝΙΑδΕνΡΟΚΡδδδΕδΰΤϋΡΤίΚΙδΡνΕΑΕΟνΕνΥΥΟΑΟΝΙΕίννΤΡΟΟΕΤΚνΕΙΚ.

Последовательность ДНК варианта Ь21 У-области легкой цепи (8ЕО ГО NО: 72) САСАТсотеАтеАсссАеАбсссАстеАесААтсссбтеАСтсссеесеАесс ССССТСААТСАеСТССАССАбСАССААбАСССТбСТеСАСАОСААСебСААбА ССТАССТСТАСТееТАТСТеСАСААСССССЕССАСАЕСССССАССТеСТеАТСТ АССАСАТееАСМССТееССАССССССТСССССАССССТТСТСТАССАССССА АеСОССАССЕАСТТСАСССТСААСАТСАССАеСбТСОААеССбАеОАСОТеее СеТеТАСТАСТеС6СССА0ААССТебАаСТСТе<ЗАССТТС66ССА60ССАССАА еетеедбАтслАА.

- 38 022913

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЭЛЛИС Джонатан Генри ФОРД Сюзанна Карен ГЕРМАШЕВСКИЙ Фолькер СОДЕН Питер Эрнест УОТТАМТревор Энтони Кеннет АЛАР Филипп Марк Луи ЛЬЮИС Алан ТОМАС Памела Джоан <120> Антигенсвязывающие белки <130> РВ62764 <140> РСТ/ЕР2008/067138 <141> 2008-12-09 <150> СВ 0724185.4 <151> 2007-12-11 <150> СВ 0806230.9 <151> 2008-04-04 <150> 08 61/043839 <151> 2008-04-10 <160> 73 <170> ГазЬЗЕО для Игпбомз версия 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СОНН1 аа <400> 1

Уа1 Туг Туг 7а1 Н1з

5 <210> 2 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СОТН2 аа <400> 2

Агд Не Аар Рго С1и Азп 61у С1з ТЬг 11е Туг ТЬг	Рго Ьуз РЬе С1п
1	5	10	15
Азр

<210> 3 <211> 3

- 39 022913 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СРКНЗ аа <400> 3

Зег С1у Туг 1 <210> 4 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СРКЫ аа <400> 4

Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Ьед Нгз Агд Азп С1у Не ТЬг Туг Ьеи Туг 15 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СбКЬ2 аа <400> 5

51п Ме1 Зег Азп Ьеи А1а Зег 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СбКЬЗ аа <400> 6

А1а 61п Азп Ьеи С1и Ьеи Тгр ТЬг 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептидный конъюгат, содержащий остатки 27-38 бета-амилоида, используемый для иммунизации и скрининга <400> 7

Суз С1у С1у С1у Азп Ьуз С1у А1а 11е 11е С1у Ъеи МеЬ Уа1 С1у С1у

- 40 022913

10 15 <210> 8 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Анализируемый пептид, содержащий остатки 24-34 бета-амилоида <400> 8

Уа1 С1у Зег Аап Ьуз С1у А1а Не 11е С1у Ьеи 15 10 <210> 9 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Используемый для картирования эпитопов пептид, содержащий остатки 28-35 бета-амилоида <400> 9

Ьуз С1у А1а 11е 11е С1у Ьеи Мер 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Используемый для картирования эпитопов пептид, содержащий остатки 24-35 бета-амилоида <400> 10

Уа1 С1у Зег Азп Ьуе б1у А1а Не Не 61у Ьеи Мер С1у Зег С1у 15 10 15 <210> 11 .

<211> 15 ' <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Используемый для картирования эпитопов пептид, содержащий остатки 28-39 бета-амилоида <400> 11

Ьуз С1у А1а Не Не С1у Ьеи Мер Ча1 31у С1у Уа1 С1у Зег С1у 15 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> ПРТ

- 41 022913 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Используемый для картирования эпитопов пептид, содержащий остатки 31-42 бета-амилоида <400> 12

Не 11е С1у Ьеи МеС Уа1 С1у С1у Уа1 Уа1 11е А1а С1у Зег С1у 15 10 15 <210> 13 <211> 98 <212> ПРТ <213> Ното зарсепз <400> 13

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

ьуз

7а1

Зег

С1у

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

С1и

Ьеи

20

25

30

Зег

Мес

Нл.3

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

СЬу

Ьеи

С1и

Тгр

Мес

35

40

45

61у

61у

РЬе

Азр

Рго

61и

Азр

61 у

С1и

ТЬг

11е

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

61п

С1у

Агд

Уа1

ТНг

МеС

ТЬг

61и

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

тьг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мес

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

ТЬг

*

<210> 14 <211> 294 <212> ДНК <213> Ното зарьепз <400> 14 саддСссадс СддСасадСс СддддсСдад дСдаадаадс сСддддссСс адСдааддСс 60

СссСдсаадд СССссддаСа сасссСсасС даассаСсса СдсасСдддС дсдасаддсС 120 осСддаааад ддсССдадСд даСдддаддС СССдаСссСд аадаСддСда аасааСсСас 180 дсасадаадС Сссадддсад адСсассаСд ассдаддаса саСсСасада сасадссСас 240 аСддадсСда дсадссСдад аСсСдаддас асддссдСдС аССасСдСдс ааса 294 <210> 15 <211> 15 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 15

Туг РЬе Азр Туг Тгр 61у 61п С1у ТЬг Ьеи 7а1 ТЬг Уа1 Зег Зег

1	5
<210> 16 <211> 100 <212> ПРТ <213> Ното	зархепз
<400> 16

- 42 022913

Азр 1

Не

Уа1 МеЬ

ТЬг С1п 5

Зег

Рго

Ьеи Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

С1у

С1и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

ΗΪ5

Зег

20

25

30

Азп

С1у

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Ьеи

С1у

Зег

Азп

Агд

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

МеЬ

С1п

А1а

85

90

95

Ьеи

61П

ТЬг

Рго

100

<210> 17 <211> 300 <212> ДНК <213> Ногтю зархепз <400> 17 даЬаЬЬдЬда ЪдасЬсадЬс ЬссасЬоЬсс оБдсссдЬса ссссЬддада дссддссЬсс 60 аЬсЬссЬдса ддЬсЬадЬса дадссЬссЬд саЬадЬааЬд даЬасаасЬа ЬЬЬддаЬЬдд 120

ЬассЬдсада адссадддса дЬсЬссасад сЬссЬдаЬсЬ аЬЬЬдддЬЬс ЬааЬсдддсс 180

ЬссддддЬсс сЬдасаддЬЬ садЬддсадЬ ддаЬсаддса садаЬЬЬЬас асЬдааааЬс 240 адсададЬдд аддсЬдадда ЬдЬЬддддЬЬ ЬаЬЬасЬдса ЬдсаадсЬсЬ асааасЬссЬ 300 <210> 18 <211> 12 <212> ПРТ <213> Ното зар!епз <400> 18

Тгр ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз

1

5

10

<210> 19 <211> 112 <212> ПРТ

<213> Миз тизси1из

<400> 19 С1и Уа1 С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

А1а

<31и

Ьеи

Уа1

С1и

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег 1/а1 Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

ТЬг

С1у

Зег

61у

РЬе

Азп

Не

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг Уа1 Ηί3

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Ьеи

ТЬг

С1и

е1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у Агд Не

Азр

Рго

С1и

Азп

С1у

С1и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п Азр Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи С1п Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

А1а

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1 Зег Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

<31у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

НО

- 43 022913 <210> 20 <Ξ11> 336 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 20 даддССсадс Гдсадсадгс Сддддсадад сггдгддадс саддддссгс адГсаадССд 60

ГссСдсасад дСГсСддсСС саасаГГаад дСсСасГаГд ГдсасГддсГ даадсадГГд 120 асСдадсадд дссСддааГд даГГддаадд аГГдаГссГд ааааГддГда аасГаГаГаГ 180 ассссдаааС Ьссаддасаа ддссасГГГд асадгадаса сагсагссаа сасадссСас 240 сСдсадсСса дсадссСдас аСсСдаддас дсСдссдСдС асЬаССдСдС гадССсдддс 300

СасСддддсс ааддсассас СсСсасадСс СссСса 336 <210> 21 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз шизси1из <400> 21

Азр

Не

Уа1

Мес

ТЬг

О1п

Зег

А1а

РЬе

Зег

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи

С1у

1

5

10

15

ТЬг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

ЬуЗ

Зег

Ьеи

Ьеи

Нгз

Агд

20

25

30

Азп

С1у

Не

ТАг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Рго

35

40

45

Рго

61п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1п

Мег

Зег

Аз η

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

АЗр

Агд

РЬе

ТАг

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1п

Аз η

85

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

НО

<210> 22 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тивси1из <400> 22 даСаССдСда СдасдсадСс СдсаССсСсс ааСссадСса сСсССддаас аСсадсССсс 60 аСсСссСдса ддСсСадсаа дадСсСссСа саСаддааСд дсаСсассСа СССдСаССдд 120

СаСсСдсада адссаддсса дссСссСсаа сСссСдаССС аСсадаСдСс саассССдсс 180

СсаддадСсс садасаддСС сасСадсадС дддСсаддаа сСдаСССсас СсСдааааСс 240 адсададСдд аддсСдадда СдСдддСдСС СаССассдСд сСсааааСсг адаасссадд 300 асдССсддСд даддсассаа дсСддаааСс ааа 333 <210> 23 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК УН НИ <400> 23 саддСссадс СддСасадСс СддддсСдад дСдааддадс сСддддссСс адСдааддСс 60

СссСдсаадд дССссддаСС саасаСааад дгсСасСаСд СдсасСддсС дсдасадсСС 120 ссСддаааад ддсССдадСд даСсддаадд аССдаСссСд ааааСддСда аасСаСаСаС 180 ассссдаааС сссаддасаа ддссассССд ассдСадаса саСсСасада сасадссСас 240

- 44 022913 аСддадсСда дсадссСдад аСсСдаддас асддссдСдС аССасСдСдС СадССсдддс 300 СасСддддсс адддсасасС адСдассдСд Сссадс 336 <210> 24 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> УН НИ аа <400> 24

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

Й1п

Зег

61у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

С1и

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

ЬуЗ

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

С1у

Зег

С1у

РЬе

Азп

Не

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Ηΐ5

Тгр

Ьеи

Агд

51п

Ьеи

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Теи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Агд

Не

Азр

Рго

С1и

Азп

С1у

С1и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Теи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мес

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

СЬу

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

НО

<400> 26

Азр

Не

Уа1

МеС

ТЬг

61п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Рго

СЬу

1

5

10

15

С1и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Нгз

Агд

20

25

30

Азп

С1у

Не

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

СЬу

С1п

Зег

35

40

45

Рго

εΐη

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1п

МеС

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

- 45 022913

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Аар

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Ча!

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Ча1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1д

Аз η

85

90

95

Ьеи

51и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

61у

е1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210> 27 <211> 442 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа тяжелой цепи Н11 <400> 27

С1п Уа1 1

С1п

Ьеи Уа1 5

С1п Зег

С1у

А1а

С1и 10

Уа1

Ьуз

С1и

Рго

С1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

С1у

Зег

С1у

РЬе

Азп

Не

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Ηίί

Тгр

Ьеи

Агд

С1п

Ьеи

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Агд

Не

Азр

Рго

С1и

Азп

61у

С1и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

51п

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер

СТи

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

СТи

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

С1у

Туг

Тгр

61у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

но

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

115

120

125

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

130

135

140

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

145

150

155

160

С1у

Уа1

ΗΪ5

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

165

170

175

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

51 у

ТЬг

С1п

ТЬг

130

185

190

Туг

Не

Суз

Аз η

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

195

200

205

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

ΗΪ5

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

210

215

220

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

С1у

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

225

230

235

240

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Мес

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

245

250

255

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

С1и

Азр

Рго

61и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

260

265

270

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СТи

275

280

285

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

290

295

300

Ηίϊ

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

305

310

315

320

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

325

330

335

С1п

Рго

Агд

<31и

Рго

51п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

5ег

Агд

Азр

С1и

340

345

350

- 46 022913

Ьеи

ТЬг Ьуз Азп 355

61п

Уа1

Зег

Ьеи 360

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз 365

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

51и

Азп

370

375

380

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

385

390

395

400

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

61п

С1у

Азп

405

410

415

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Нгз

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ5

Азп

Нгз

Туг

ТЬг

420

425

430

31п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

435

440

<210> 28 <211> 218 <212> ПРТ <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> аа легкой цепи Ь9
<400> 28
Азр Не Уа1 МеЬ ТЬг	С1п Зег Рго Ьеи Зег Азп Рго Уа1 ТЬг Рго С1у
1 5	10 15
С1и Рго А1а Зег Не	Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Ьеи Нхз Агд
20	25 30
Азп С1у Не ТЬг Туг	Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С1у С1п Зег
35	40 45
Рго б1п Ьеи Ьеи Не	Туг С1п Ме1: Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго
50	55 60
Азр Агд РЬе Зег Зег	Зег 61у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не
65	70 75 80
Зег Агд Уа1 С1и А1а	С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз А1а С1п Азп
85	90 95
Ьеи С1и Ьеи Тгр ТЬг	РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 31и Не Ьуз Агд
100	105 110
ТЬг Уа1 А1а А1а Рго	Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п
115	120 125
Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг	А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг
130	135 140
Рго Агд С1и А1а Ьуз	Уа1 61п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег
145	150 155 160
С1у Азп Зег С1п С1и	Зег Ή ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг
165	170 175
Туг Зег Ьеи Зег Зег	ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз
130	185 190
ΗΪ5 Ьуз Уа1 Туг А1а	Суз С1и Уа1 ТЬг Нхз С1п 61у Ьеи Зег Зег Рго

195 200 205

Ή1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз 210 215 <210> 29 <211> 1326 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК (оптимизированная) тяжелой цепи НИ

- 47 022913 <400> 29 саддЁдсадс ЁсдЁдсадад сддсдссдад дЁдааадаас ссддсдссад сдедааддЁд 60 адсЁдсаадд дсадсддсЁЁ саасаЁсааа дЁдЁасЁасд ЁдсасЁддсЁ даддсадсЁд 120 сссддааадд дссЁддадЁд даЁЁддсадд аЁсдассссд адаасддсда дассаЁсЁас 180 асссссаадЁ Ёссаддасаа ддссасссЁд ассдбддаса ссадсассда сассдссЁас 240 абддаасЁда дсадссЬдад дбссдаддаС ассдссдСсС асЁасЁдсдЁ дадсадсддд 300

ЁаЁЁддддсс адддсасасЁ адЁдассдЁд адсадсдсса дсассааддд ссссадсдЁд 360

ЁЁсссссЁдд сссссадсад саададсасс адсддсддса садссдсссб дддсСдссЁд 420 дЁдааддасЁ асЁЁссссда дсссдЁдасс дЁдЁссбдда асадсддадс ссСдасаадс 480 ддддЁдсаса ссЁЁссссдс сдЁдсЁдсад адсадсддсс СдСаоадссС дадсадсддд 540 дЁдасадЁдс ссадсадсад ссЁдддсасс садассСаса ЁсЁдсаасдЁ даассасаад 600 сссадсааса ссааддЁдда саадааддСд дадсссаада дсСдсдасаа дасссасасс 660

ЁдсссссссЁ дсссСдсссс ЁдаасЁддсс ддадсссссЁ ссдЁдЁЁссЁ дЁСссссссс 720 аадсссаадд асасссЁдаЁ даСсадссдд асссссдадд СдассЁдсдЁ ддСддСддас 780 дбдадссасд аддасссЁда ддЁдаадЁЁс ааЁЁддЁасд ЁддасддсдЁ ддаддСдсас 840 аасдссаада ссаадссссд ддаддаасад Сасаасадса ссСассдддС ддЁдЁссдЁд 900 сЁдассдЁдс Ёдсассадда сЁддсЁдаас ддсааадааЁ асаадЁдсаа ддЁдЁссаас 960 ааддоссЁдс сЁдсссссаЁ сдадаааасс аЁсадсаадд ссаадддсса дсссадддаа 1020 ссссаддЁдЁ асасссСдсс ссссЁсссдд дасдадсЁда ссаадаасса ддСдЁсссЁд 1080 ассЁдЁсЁдд ЁдаадддсЁЁ сЁассссадс дасаЁсдссд ЁддадЁддда дадсаасддс 1140 садсссдада асаасЁасаа дассассссс ссЁдЁдсЁдд асадсдасдд садс;ЁсЁЁс 1200 сЁдЁасадса адсЁдассдЁ ддасаададс сддсддсадс адддсаасдб дЁЁсадсЁдс 1260 адсдЁдаСдс асдаддсссЁ дсасаассас Ёасасссада ададссЁдад ссЁдЁссссс 1320 ддсаад 1326 <210> 30 <211> 654 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК (оптимизированная) легкой цепи Ь9 <400> 30 дасаЁсдЁда Ёдасссадад сссасЁдадс ааЁсссдЁда сЁсссддсда дсссдссЁса 60 аЁсадсЁдса ддадсадсаа дадссЁдсЁд сасаддаасд дсаЁсассЁа ссЁдЁасЁдд 120

ЁаЁсЁдсада адсссддсса дадсссссад сЁдсЁдаЁсЁ ассадаЁдЁс саассЁддсс 180 адсддсдЁдс ссдассддЁЁ сЁсЁадсадс ддаадсддса ссдасЁЁсас ссЁдаадаЁс 240 адсадддЁдд аадссдадда сдЁдддсдЁд ЁасЁасЁдсд сссадаассЁ ддадсЁСЁдд 300 ассЁЁсддсс адддсассаа ддЁддадаЁс ааасдеасдд Ёддссдсссс садсдЁдЁЁс 360 эёсёёссссс ссадсдаЁда дсадсЁдаад адсддсассд ссадсдСддЁ дЕдЁСЁдсЁд 420 аасаасЁЁсЁ асссссддда ддссааддЁд садЁддаадд ЁддасааЁдс ссЁдсададс 480 ддсаасадсс аддададсдЁ дассдадсад дасадсаадд асЁссассЁа садссЁдадс 540 адсасссЁда сссЁдадсаа ддссдасЁас дадаадсаса аддЁдЁасдс сЁдЁдаддЁд 600 асссассадд дссЁдЁссад ссссдЁдасс аададсЁЁса ассддддсда дЁдс 654 <210> 31 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миз шизси1из <400> 31

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

νβΐ

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

ТЬг

С1у

Зег

С1у

РЬе

Аз η

11е

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Ча1

ΗΪ8

Тгр

Ьеи

Ьуз

61п

Ьеи

ТНг

С1и

С1п

51у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Агд

11е

Азр

Рго

С1и

Аз η

61у

61и

ТЬг

Не

Туг

А1а

Рго

Ьуз

РЬе

- 48 022913

	50					55
С1п 65	Азр	Ьуз	А1а	ТНг	Ьеи 70	ТНг	Уа1
Ьеи	С1п	Ьеи	Зег	Зег 85	Ьеи	ТНг	Зег
Уа1	Зег	Зег	С1у 100	Туг	Тгр	С1у	С1п

			60
Азр	ТНг	Зег	Зег	Аз η	ТНг	А1а	Туг
		75					80
С1и	Азр	ТНг	А1а	7а1	Туг	Туг	Суз
	90					95
С1у	ТНг	ТНг	Ьеи	ТНг	Уа1	Зег	Зег
105					110

<210> 32 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 32 даддЬСсадс

НссСдсасад асНдадсадд дссссдаааЕ сНдсадсНса

НасНддддсс

СасадсадНс дННсСддсНН дссНддааНд

Сссаддасаа дсадссСдас ааддсассас

Сддддсадад саасаССаад дасСддаэдд ддссасСССд аСсСдаддас

СсСсасадСс сССдЬдаадс дСсСасСаСд аСЬдаСссСд асадСадаса асСдссдСсС

СссСса саддддссСс СдсасСддсС ааааСддСда саСсаСссаа аССаССдСдС адСсаадССд даадсадССд аасСаСаСаС сасадссСас

СадССсдддс

120

180

240

300

336 <210> 33 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мид щизсиЬиз <400> 33

Азр 1

Не

Уа1

МеС

ТНг 5

С1п

Зег

А1а

РНе

Зег 10

Азп

Рго

Уа1

ТНг

Ьеи 15

61у

ТНг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Нгз

Агд

20

25

30

Азп

С1у

11е

ТНг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1п

Мен

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

61 у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РНе

ТНг

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

30

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

νβΐ

Туг

Туг

Суз

А1а

01п

Азп

85

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТНг

РНе

С1у

С1у

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

<210> 34 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 34 даЬаССдСда аСсСссСдса

СаСсСдсада

СсаддадСсс адсададСдд асдССсддСд

СдасдсадСс ддСсСадСаа адссаддсса садасаддСС аддсСдадда даддсассаа

СдсаССсСсс дадСсСссСа дСсСссСсад сасСадсадС

СдСдддСдСС дсСддаааСс ааСссадСса саСаддааСд сСссСдаССС дддСсаддаа

СаССасСдСд ааа сСсССддаас дсаСсассСа аСсадаСдСс ссдасссеас сСсааааСсС аСсадсССсс СС СдСаССдд саассССдсс СсСдааааСс адаасСССдд

120

180

240

300

333 <210> 35 <211> 112

- 49 022913 <212> ПРТ <213> Миз шизси1из <400> 35

61и

Уа1

σΐη

Ьеи

61п

61п

Зег

С1у

А1а

51и

Уа1

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

ТЬг

А1а

Зег

С1у

РЬе

Азп

11е

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Не

Н1з

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Ьеи

ТЬг

51и

61п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Агд

Не

Азр

Рго

С1и

Аз η

61у

51и

ТЬг

Ьуз

Туг

Уа1

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

ВО

Ьеи

Н1з

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

51и

Азр

ТЬг

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

ТЬг

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЫ

νβΐ

Зег

Зег

100

105

но

<210 36 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 36 даддНсадс ЬдсадсадЬс Ьддддсадад дНдЬдаадо саддддссСс адСсаадНд 60

СссСдсасад сССсСддсСЬ саасаНааа дЬсСасЬаСа СссасСддЫ: даадсадССд 120 асСдадсадд дссСадааСд даССддаадд аЫдаСссЬд ааааСддЬда аасСаадЬаС 180 дЬсссдаааС Ьссадддсаа ддссасЬЫза асадСадаса саСссСссаа сасадссРас 240 сРдсассРса дсадссСдас аРсРдаддас асСддсдРсР аррасрдрдр РассРсдддс 300

Расрддддсс ааддсассас РсЬсасадРс РссРса ЗЗй <210> 37 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 37

Азр 1

Не

Уа1

Мер

ТЬг 5

С1п

А1а

А1а

РЬе

Зег 10

Азп

Рго

Уа1

А1а

Ьеи 15

С1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1з

Зег

20

25

30

Азп

61у

Не

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

51 у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

αΐη

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

61п

Мер

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

51у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Да1

С1и

А1а

51и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

61п

Азп

85

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

01 у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

<210> 33 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизси1из

- 50 022913 <400> 38 даСаССдСда аСсСссСдса

СаСсСдсада

Ссаддадссс адсададСдд асдССсддСд

Сдасдсаддс ддСсСадСаа адосаддсса садасаддСС аддсСдадда даддсассаа

СдсаССсСсс ааСссадСсд сесССддаас аСсадсССсс дадСсСссСа саСадСааСд дсаСсасССа СССдСаССдд дСсСссСсад сСссСдаССС аСсадаСдСс саассССдсс садСадсадС дддссаддаа сСдаСССсас асСдадааСс СдСдддСдСС СаССасСдСд сСсааааСсС адаасСССдд дсЬддаааСс ааа

120

180

240

300

333 <210> 39 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миг тизси1из <400> 39

С1и 1

Уа1

61п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег

51у

А1а

61и 10

Ьеи Уа1

01и

Рго

Й1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

ТЬг

61у

Зег

С1у

РЬе

Азп

11е

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Н1з

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Ьеи

ТЬг

01и

С1п

61у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Агд

Не

Азр

Рго

01и

Азп

С1у

С1и

ТЬг

Ьеи

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

61у

Туг

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

Зег

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

110

<210> 40 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз шизси1из <400> 40 даддССсадс СдсадсадСс Сддддсадад сССдСддадс саддддссСс адСсаадССд 60

СссСдсасад дсссСддсСС саасаССаад дСсСасСаСд ССсасСддсС даадсадССд 120 асСдадсадд дссСддааСд даССддаадд аССдаСссСд адааСддСда аасСсСаСас 180 ассссдаааС Сссадддсаа ддссасСССд асадСадаса саСсаСссаа сасадссСас 240 сСдсадсСса асадссСдас аСсСдаддас асСдссдСсС аССаССдСдС СадССсдддс 300

СасСддддсс ааддсассСс СсСсасадСс СссСса 336 <210> 41 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз шизсиЬиз <400> 41

Азр 1

11е

Уа1

Мес

ТЬг 5

61п

Зег

А1а

РЬе

Зег 10

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи 15

С1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Бег

Ьеи

Ьеи

Н1з

Агд

20

25

30

Азп

61у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1п

МеС

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

30

- 51 022913

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр \?а1 С1у Уа1 Туг Туг Суз АДа С1п Азп 35 90 95

Деи С1и Деи Тгр ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Дуз Деи С1и Не Дуз 100 105 110 <210> 42 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз гаизси1из <400> 42 даЕаЕЕдЕда ЕдасдсадЕс ЕдсаЕЕсЕсс ааЕссадЕса сЕсЕЕддаас аЕсадсЕЕсс 60 аЕсЕссЕдса ддЕсЕадсаа дадЕсЕссЕа саЕаддааЕд дсаЕсассЕа ЕЕЕдЕаЕЕдд 120

ЕаЕсЕдсада адссаддсса дЕсЕссЕсад сЕссЕдаЕЕЕ аЕсадаЕдЕс саассЕЕдсс 180

ЕсаддадЕсс садасаддЕЕ сасЕадсадЕ дддЕсаддаа сЕдаЕСЕсас ЕсЕдааааЕс 240 адсададЕдд аддсЕдадда ЕдЕдддЕдЕЕ ЕаЕЕасЕдЕд сЕсааааЕсЕ адаасЕЕЕдд 300 асдЕЕсддЕд даддсассаа дсЕддаааЕс ааа 333 <210> 43 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 43

С1и

Уа1

С1п

Деи

С1п

С1п

Зег

С1у

АДа

СДи

РЬе

УаД

Агд

Рго

СДу

АДа

1

5

10

15

Зег

Уа1

Дуз

Деи

З.ег

Суз

ТЬг

АДа

Зег

С1у

РЬе

Азп

11е

Дуз

ТЬг

Туг

20

25

30

Туг

11е

НДз

Тгр

Деи

Дуз

С1п

Агд

ТЬг

Азр

СДп

СДу

Деи

СДи

Тгр

11е

35

40

45

61у

Агд

11е

Азр

Рго

С1и

Азр

С1у

С1и

ТЬг

Дуз

РЬе

СДу

Рго

Дуз

РЬе

50

55

60

Агд

С1у

Дуз

А1а

ТЬг

Деи

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

АДа

Зег

65

70

75

80

Деи

О1п

Деи

Зег

Зег

Деи

ТЬг

Зег

СДи

Азр

ТЬг

СДу

УаД

Туг

Туг

Суз

35

90

95

Уа1

ТЬг

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

бДу

ТЬг

ТЬг

Деи

Зег

УаД

Зег

Зег

100

105

110

<210> 44 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизсиДиз <400> 44 даддЕЕсадс ЕдсадсадЕс Еддддсадад ЕЕЕдЕдаддс саддддссЕс адЕсаадЕСа 60 ЕссЕдсасад сЕЕсЕддсЕЕ саасаЕЕааа ассЕасЕаЕа ЕасасЕддсЕ дааасададд 120 асЕдассадд дссЕддадЕд даЕЕддаадд аЕЕдаЕсссд аддаЕддЕда аасЕаааЕЕЕ 180 ддсссдаааЕ Ессддддсаа ддссасЕЕЕа асадсадаса саЕссЕссаа сасадссЕсс 240 сЕасаасЕса дсадЕсЕдас аЕсЕдаддас асЕддсдЕсЕ аЕЕасЕдЕдЕ ЕассЕсдддс 300 ЕасЕддддсс ааддсассас ЕсЕсЕсадЕс ЕссЕса 336 <210> 45 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз тизсиДиз

- 52 022913 <400> 45

Азр

11е

Уа1

МеД

ТЬг

61п

АД а

А1а

РЬе

Зег

Аз η

Рго

νβΐ

ТЬг

Деи

СДу

1

5

10

15

ТЬг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Дуз

Зег

Деи

Деи

НДз

Зег

20

25

30

Азп

С1у

Не

ТЬг

Туг

Деи

Туг

Тгр

Туг

Деи

61п

Дуз

Рго

61у

61п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Деи

Деи

11е

Туг

61п

МеЬ

Зег

Аз η

Деи

А1а

Зег

СДу

УаД

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

СДу

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Деи

Агд

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

51и

А1а

С1и

Азр

УаД

СДу

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

СДп

Аз η

85

90

95

Деи

<31 и

Деи

Тир

ТЬг

РЬе

СДу

СДу

С1у

ТЬг

Дуз

Деи

СДи

11е

Дуз

100

105

110

<210> 46 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 46 даСаЬЬдЬда аЬсЬссЬдса

ЬаДсДдсада

ЬсаддадЬсс адсададСдд асдСЬсддбд

Сдасдсаддс ддЬсЬадЬаа адссаддсса садасаддЫ;

аддсСдадда даддсассаа

СдсаЫзсЬсс ааСссадЬса сЬсЬСддаас аСсадссЬсс 60 дадЬсЬссЬа саЬадЬааЬд дсаЬсасЫа ЫГдЬаЬг дд 120 дЬсДссДсад сЬсДЬдаЬЬД аДсадаЬдЬс саассЬДдсс 160 садЬадсадС дддЬсаддаа сЬдаЬСЬсас асЬдадааГс 240 ЬдЬдддЬдСС СаЬЬасЬдСд сЬсааааСсС адаасСЬСдд 300 дсЬддаааДс ааа 333 <210> 47 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миз тизсиДиз <400> 47

СДи 1

Уа1

61п

Деи

С1п 5

С1п

Зег

СДу

А1а СДи Деи 10

Уа1

Дуз

Рго

СДу 15

АДа

Зег

УаД

Дуз

Деи

Зег

Суз

ТЬг

С1у

Зег

СДу

РЬе

Аз η

11е

Дуз

УаД

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Ηΐ3

Тгр

Деи

Дуз

61п

Деи

ТЬг

СДи

С1п

СДу

Деи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

СДу

Агд

11е

Азр

Рго

61и

Азп

СДу

СДи

ТЬг

Дуз

Туг

А1а

Рго

Дуз

РЬе

50

55

60

С1п

Азр

Дуз

АД а

ТЫ

Деи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Аз η

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Деи

Ηί3

Деи

Зег

Зег

Деи

ТЬг

Зег

СДи

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

СДу

Туг

Тгр

СДу

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Деи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

но

<210> 48 .

<211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизсиДиз <400> 48 даддЬДсадс ДдсадсадДс бддддсадад сДДдСдаадс саддддссЬс адЬсаадЬЬд 60 ЬссЬдсасад дЬЬсСддсЬС саасаЫаад дСсЬасЬаЬд ЬдсасЬддсС даадсадЬЬд 120

- 53 022913 асбдадсадд дссЬддааГд даЬГддаадд аГЬдаЬссЬд ааааГддЬда аасГаааГаЬ 180 дссссдаааС Гссаддасаа ддссасЕСЬд асадрадаса саРссСссаа РасадссРас 240 сРРсассРса дсадссРдас арсрдаддас асРдссдРсР аРРаРРдРдР РадСЬсдддс 300 РасРддддсс ааддсассас РсРсасадРс РссРса 336 <210> 49 <211> 111 <212> ПРТ <213> Низ шиеси1из <400> 49

Азр

11е

Уа1

МеР

ТЬг

С1п

Зег

А1а

РЬе

Зег

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи

С1у

1

5

10

15

ТЬг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1з

Агд

20

25

30

Азп

61у

Не

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

О1у

61п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

С1п

Мер

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

Зег

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

61и

Азр

Уа1

61у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

61п

Азп

85

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у

61у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

Не

Ьуз

100

105

но

<210> 50 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <40й> 50 дасаРРдРда рдасдсадрс РдсаРРсРсс аарссадрса сРсРРддаас аРсадсРРсс 60 аРсРссРдса ддРсРадРаа дадРсРссРа сараддаард дсаРсассРа РРРдРаРРдд 120

РаРсРдсада адссаддсса дРсРссРсад сРссРдаРРР аРсадаРдРс саассРРдсс 180

РсаддадРсс садасаддРР сасРадсадР дддрсаддаа сРдаРРРсас РсРдааааРс 240 адсададрдд аддсРдадда рдрдддрдрр РаРРаРРдРд сРсааааРсР адаасРРРдд 300 асдррсддрд даддсассаа дсРддаааРс ааа 333 <210> 51 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 51

61и

Уа1

61п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

61у

А1а

61ц

Ьеи

ν«ι

61ц

Рго

61у

АЬа

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

ТЬг

61у

Зег

61у

РЬе

Азп

Не

Ьуз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

НЬз

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Ьеи

ТЬг

С1и

С1п

С1у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Агд

Пе

Азр

Рго

61и

Азп

61у

61и

ТЬг

Ьеи

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

С1у

Ьуз

АЬа

ТЬг

РЬе

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

61ц

Азр

ТЬг

АЬа

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

61у

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

- 54 022913

100 105 НО <210> 52 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 52 даддССсадс СдсадсадСс Сддддсадад сССдСддадс саддддссСс адСсаадССд 60 СссСдсасад дССсСддсСС саасаССаад дСсСасСаСд ССсасСддсС даадсадССд 120 аседадсадд дссСддааСд даССддаадд аССдаСссСд адааСддСда ааеСсСаСаС 180 ассссдаааС Сссадддсаа ддссассссс асадСадаса саСсаСссаа сасадссСас 240 сСдсадсСса дсадссСдас аСсСдаддас асСдссдСсС аССаССдСдС СадССсдддс 300 СасСддддсс ааддсассас СсСсасадСс СссСса 336 <210> 53 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз тизсиЬиг <400> 53

Азр 1

11е УаЬ

МеС

ТЬг 5

С1п Зег

АЬа

РЬе

Зег Азп Рго УаЬ ТЬг Ьеи

СЬу

10

15

ТЬг

Зег

АЬа

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1в

Агд

20

25

30

Азп

СЬу

Не

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

СЬу

61п

Зег

35

40

45

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

61п

МеС

Зег

Азп

Ьеи

АЬа

Зег

61у

Уаь

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

Зег

Зег

61 у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

УаЬ

61и

А1а

С1и

Азр

Уа1

СЬу

Уа1

Туг

Туг

Суз

АЬа

С1п

Азп

85

90

95

Ьеи

61и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

СЬу

61 у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 54 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизсиЬиз <400> 54 даСаССдСда СдасдсадСс СдсаССсСсс ааСссадСса сСсССддаас аСсадсССсс 60 аСсСссСдса ддСсСадсаа дадСсСссСа саСаддааСд дсаСсассСа СССдСасСдд 120 СаСсСдсада адссаддсса дСсСссСсад сСссСдаССС аСсадаСдСс саассССдсс 180 СсаддадСсс садасаддСС сасСадсадС дддСсаддаа сСдаСССсас СсСдааааСс 240 адсададСдд аддсСдадда СдСдддСдСС СаССасСдСд сСсааааСсС адаасСССдд 300 асдССсддСд даддсассаа дсСддаааСс ааа 333 <210> 55 <211> 112 <212> ПРТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 55

61и Уа1 С1п Ьеи С1п 61п Зег СЬу АЬа 61и Ьеи νβΐ Ьуз Рго СЬу А1а 15 10 15

- 55 022913

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи Зег 20

Суз

ТЬг

А1а

Зег 25

61у РЬе

Азп

11е

Ьуз 30

Азр

Туг

Туг

Мес

Н±3

Тгр

Ьеи

ьуз

С1п

Ьеи

ТЬг

С1и

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Агд

Не

Азр

Рго

61и

АЗ η

61у

С1и

ТЬг

С1п

Туг

А1а

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

С1у

Ьуз

А1а

Зег

Ьеи

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

30

Ьеи

НгЗ

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

110

<210>	56
<211>	336
<212>	ДНК
<213>	Миз тизси1из

<400> 56 даддССсадс СдсадсадЪс Сддддсадад сЬСдСдаадс саддддссСс адСсаадССд 60

СссСдсасад сССсСддсСС саасаССааа дасСасСаСа СдсасСддСС даадсадССд 120 асСдадеадд дссСддааСд даССддаадд аССдаСссСд ааааСддСда аасСсааСаС 180 дссссдаааС Сссадддсаа ддссСсСССа асадсадаса саСссСссаа сасадссСас 240 сССсасеСса дсадссСдас аСсСдаддас аеСдссдСсС аССасСдСдС СадССсдддс 300

СасСддддсс ааддсассас СеСсасадСс СссСса 336 <210> 53 <211> 111 <212> ПРТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 57

Азр 1

11е

Уа1

МеС

ТЬг СЬп А1а А1а 5

РЬе

Зег 10

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи 15

С1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

ΗΪ3

Зег

20

25

30

Азп

С1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

61у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

61п

МеС

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61 и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1п

Азп

35

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

61у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

11е

Ьуз

100

105

но

<210> 58 <211> 333 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 53 даСаССдСда Сдасдсаддс СдсаССсСсс ааСссадСса сСсССддаас аСсадсССсс 60 аСсСссСдса ддСсСадСаа дадСсСссСа саСадСааСд дсаСсасССа СССдСаССдд 120

СаСсСдсада адссаддсса дСсСссСсад сСссСдаССС аСсадаСдСс саассССдсс 180

СсаддадСсс садасаддСС садСадсадС дддСсаддаа ссдаСсссас асСдадаасс 240 адсададсдд аддссдадда сдСдддСдСС СаССасСдСд сСсааааСсС адаасСССдд 300

- 56 022913 асдЫсддЬд даддсассаа дсьддаааьс ааа 333 <210> 59 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа тяжелой цепи Н48 <400> 59

С1п 1

Уа1

61п

Ьеи Уа1 5

С1п

Зег С1у

А1а

61 и 10

Уа1

Ьуз

С1и

Рго

61у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

С1у

Зег

С1у

РЬе

Азп

Не

Н13

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Нгз

Тгр

Ьеи

Агд

61п

Ьеи

Рго

61и

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61 у

Агд

11е

Азр

Рго

61и

Азп

61у

61и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

сш

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЫ

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ме!

61ц

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

61у

Туг

Тгр

61у

61 п

61у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

110

<210> 60 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК тяжелой цепи Н48 <400> 60 саддЬдсадс ГсдЬдсадад сддсдссдад дбдааадаас ссддсдссад сдЬдааддбд 60 адсЬдсаадд дсадсддсЬЬ саасаЬссас дЬдЬасЬасд ЬдсасЬддсЬ даддсадсЬд 120 сссдадаадд дссЬддадЬд даЬЬддсадд аЬсдассссд адаасддсда дассаЬсЬас 180 асссссаадь Сссаддасаа ддссасссЬд ассдЬддаса ссадсассда сассдссрас 240 аЬддаасСда дсадссьдад дсссдаддаС ассдссдЬсЬ асЬасЬдсдЬ дадсадсддд 300 ЬаНддддсс адддсасас! адЬдассдЬд Ьссадс 336 <210> 61 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа тяжелой цепи Н49 <400> 61

61ь

Уа1

61 п

Ьеи

Уа1

61п

Зег

61у

А1а

61и

Уа1

Ьуз

61и

Рго

61у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

С1у

Зег

С1у

РЬе

Азп

Не

Ьуз

ТЬг

Туг

20

25

30

Туг

7а1

Нгз

Тгр

Ьеи

Агд

61п

Ьеи

Рго

61и

Ьуз

61у

Ьеи

61 и

Тгр

Не

35

40

45

61у

Агд

Не

Азр

Рго

61и

Азп

61 у

С1и

ТЬг

Не

Туг

ТЫ

Рго

Ьуз

РЬе

- 57 022913

	50					55
С1п 65	Азр	Ьуз	А1а	ТЬг	Ьеи 70	ТЬг	Уа1
МеС	С1и	Ьеи	Зег	Зег 85	Ьеи	Агд	Зег
Уа1	Зег	5ег	С1у 100	Туг	Тгр	61у	С1п

Азр	ТЬг	Зег	60 ТЬг	Азр	ТЬг	А1а	Туг
С1и	Азр	75 ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг	80 Суз
61у	90 ТЬг	Ьеи	Уа1	ТЬг	Уа1	95 Зег	Зег
105					110

<210> 62 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК тяжелой цепи Н49 <400> 62 саддСдсадс адсСдсаадд сссдадаадд асссссаадС аСддаасСда

СаССддддсс

СсдСдсадад дсадсддсСС дссСддадСд

Сссаддасаа дсадссСдад адддсасасС сддсдссдад саасаСсааа дассддсадд ддссасссСд дСссдаддаС адСдассдСд дСдааадаас ассСасСасд аСсдассссд ассдСддаса ассдссдСсС

Сссадс ссддсдссад

СдсасСддсС адаасддсда ссадсассда асСасСдсдС сдСдааддСд даддсадсСд дассаСсСас сассдссСас дадсадсддд

120

180

240

300

336 <210> 63 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа тяжелой цепи Н50 <400> 63

61п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

61и

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

ТЬг

С1у

Зег

61у

РЬе

Азп

11е

Нгз

Уа1

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

ΗΪ3

Тгр

Ьеи

Агд

С1п

Ьеи

Рго

61и

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

61у

Агд

Не

Азр

Рго

С1и

Азп

С1у

С1и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеС

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

35

90

95

Уа1

Зег

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

110

<210> 64 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК тяжелой цепи Н50 <400> 64 саддСдсадс СсдСдсадад сддсдссдад дСдааадаас ссддсдссад сдСдааддСд 60

- 58 022913 адсЕдсассд дсадсддсЕЕ саасаЕссас дЕдЕасЕасд ЕдсасЕддсЕ даддсадсЕд 120 сссдадаадд дссЕддадЕд даЕЕддсадд аЕсдассссд адаасддсда дассаЕсЕас 180 асссссаадЕ Ессаддасаа ддссасссЕд ассдЕддаса ссадсассда сассдссЕас 240 аЕддаасЕда дсадссЕдад дЕссдаддаЕ ассдссдЕсЕ асЕасЕдсдЕ дадсадсддд 300 ЕаЕЕддддсс адддсасасЕ адЕдассдЕд Ессадс 336 <210> 65 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа тяжелой цепи Н51 <400> 65

С1п Уа1 1

61п Ьеи Уа1 5

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и Уа1 10

Ьуз

С1и

Рго

С1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

С1у

Зег

С1у

РЬе

Азп

Не

ΗΪ5

ТЬг

Туг

20

25

30

Туг

Уа1

Н1з

Тгр

Ьеи

Агд

61п

Ьеи

Рго

С1и

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

С1у

Агд

11е

Азр

Рго

С1и

Азп

61у

61и

ТЬг

Не

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

Азр

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЕ

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Зег

Зег

С1у

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

110

<210> 66 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК тяжелой цепи Н51 <400> 66 саддСдсадс ЕсдЕдсадад сддсдссдад дЕдааадаас ссддсдссад сдЕдааддЕд 60 адсЕдсаадд дсадсддсЕЕ саасаЕссас ассЕасЕасд ЕдсасЕддсЕ даддсадсЕд 120 сссдадаадд дссЕддадЕд даЕЕддсадд аЕсдассссд адаасддсда дассаЕсЕас 180 асссссаадЕ Ессаддасаа ддссасссЕд ассдЕддаса ссадсассда сассдссЕас 240 аЕддаасЕда дсадссЕдад дЕссдаддаЕ ассдссдЕсЕ асЕасЕдсдЕ дадсадсддд 300

ЕаЕЕддддсс адддсасасЕ адЕдассдЕд Ессадс 336 <210> 67 <211> 111 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа легкой цепи Ы9 <400> 67

Азр Не Уа1 МеЕ ТЬг С1п Зег Рго Ьеи Зег Азп Рго Уа1 ТЬг Рго С1у 15 10 15

С1и Рго А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Ьеи Нгз Агд

- 59 022913

20

25

30

Авп

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи.

Ьеи

Не

Туг

С1п

МеЁ

Азр

Ηΐ3

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Аар

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

ео

Зег

Агд

Уа1

Е1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1п

АЗ η

85

90

95

Ьеи

Е1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

Е1у

Е1п

С1у

ТЬг

Ьуз

7а1

С1и

Не

Ьуз

100 105 НО <210> 63 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК легкой цепи Ь19 <400> 68 дасаЁсдЁда аЁсадсЁдса

ЁаЁсЁдсада адсддсдЁдс адсадддЁдд ассЁЁсддсс

Ёдасссадад сссасЁдадс ааЁсссдЁда сЁсссддсда дсссдссЁса ддадсадсаа дадссЁдсЁд сасаддаасд дсаадассЁа ссЁдЁасЁдд адсссддсса дадсссссад сЁдсЁдаЁсЁ аееадаЁдда ссассЁддсс ссдассддЁЁ сЁсЁадсадс ддаадсддса ссдасЁЁсас ссЁдаадаЁс аадссдадда сдЁдддсдЁд ЁасЁасЁдсд сссадаассЁ ддадсЁСЁдд адддсассаа ддЁддадаЁс ааа

120

180

240

300

333 <210> 69 <211> 111 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа легкой цепи Ь20 <400> 69

Азр 1

Не

Уа1

МеЁ

ТЬг Е1п Зег 5

Рго

Ьеи

Зег 10

Азп

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

С1у

С1и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1з

Агд

20

25

30

Аз η

С1у

Не

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

б1п

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

С1п

МеЁ

Азр

Н13

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1п

Азп

85

90

95

Ьеи

С1и

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

Е1у

С1п

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 70 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 60 022913 <223> ДНК легкой цепи 1,20 <400> 70 дасаСсдСда Сдасссадад сссасСдадс ааСсссдСда сСсссддсда дсссдссСса 60 аСсадсСдса ддадсадсаа дадссСдсСд сасаддаасд дсаСсассСа ссСдСасСдд 120

СаСсСдсада адсссддсса дадсссссад сСдсСдаСсС ассадаСдда ссассСддсс 180 адсддсдСдс ссдассддСС сСсСадсадс ддаадсддса ссдасССсас ссСдаадаСс 240 адсадддСдд аадссдадда сдСдддсдСд СасСасСдсд сссадаассС ддадсСсСдд 300 ассССсддсс адддсассаа ддСддадаСс ааа 333 <210> 71 <211> 111 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аа легкой цепи Ь21 <400> 71

Азр

Не

УаЬ

МеС

ТЬг

СЬп

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Азп

Рго

УаЬ

ТЬг

Рго

СЬу

1

5

10

15

С1и

Рго

АЬа

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Шз

Агд

20

25

30

Азп

61у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

61п

Зег

35

40

45

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

СЬп

МеС

Азр

Азп

Ьеи

А1а

Зег

СЬу

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

А1а

СЬи

Азр

Уа1

СЬу

Уа1

Туг

Туг

Суз

АЬа

СЬп

Азп

85

90

95

Ьеи

СЬи

Ьеи

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьуз

УаЬ

СЬи

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 72 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> ДНК легкой цепи Ь21 <400> 72 дасаСсдСда Сдасссадад сссасСдадс ааСсссдСда сСсссддсда дсссдссСса 60 аСсадсСдса ддадсадсаа дадссСдсСд сасаддаасд дсаадассСа ссСдСасСдд 120 саСссдсада адсссддсса дадсссссад сСдсСдаСсС ассадаСдда саасссддсс 180 адсддсдСдс ссдассддСС сСсСадсадс ддаадсддса ссдасССсас ссСдаадаСс 240 адсадддСдд аадссдадда сдСдддсдСд СасСасСдсд сссадаассС ддадсСсСдд 300 ассССсддсс адддсассаа ддСддадаСс ааа 333 <210> 73 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> пептидный конъюгат, содержащий остатки 22-38 бета-амилоида, используемый для иммунизации и скрининга <400> 73

Суз С1у С1у С1у С1и Азр 7а1 С1у Зег Азп Ьуз С1у АЬа Не Не СЬу 15 10 15

Ьеи МеС УаЬ С1у СЬу 20

- 61 022913

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическое антитело, которое связывается с β-амилоидным пептидом, содержащее У_Ндомен, имеющий последовательность, приведенную в §ЕЦ ГО Ν0:65, и Ун-домен, имеющий последовательность, приведенную в §ЕЦ ГО Ν0:71.
2. 2. Терапевтическое антитело, которое связывается с β-амилоидным пептидом, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, приведенную в §ЕЦ ГО Ν0:27, и легкую цепь, имеющую последовательность, приведенную в §ЕЦ ГО Ν0:28.
3. 3. Фармацевтическая композиция для лечения ассоциированных с β-амилоидным пептидом заболеваний, содержащая терапевтическое антитело по любому из пп.1, 2 в эффективном количестве.