TWI388334B - 抗原結合蛋白質 - Google Patents

Description

抗原結合蛋白質

本發明係關於與β-澱粉狀蛋白肽且尤其與人類β-澱粉狀蛋白肽結合之抗原結合蛋白質(包括抗體)。本發明亦係關於用結合β-澱粉狀蛋白肽(尤其人類β-澱粉狀蛋白肽)之抗原結合蛋白質治療以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之疾病或病症，尤其為阿茲海默氏病及以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之影響眼或視神經之疾病或病症(包括年齡相關之黃斑退化、青光眼型疾病及β-澱粉狀蛋白依賴性白內障形成)的方法。本發明之其他態樣將由以下描述顯而易見。

阿茲海默氏病(AD)為年齡相關之認知下降之最常見病因，其影響全世界超過一千二百萬個體(Citron M(2002)Nat. Neurosci 5,Suppl 1055-1057)。疾病之最初階段係以進行性記憶喪失及相關的認知下降及語言及行為缺陷為特徵。在疾病之稍後階段，患者產生完全遺忘且運動功能極大降低。死亡通常在診斷後9年發生且通常與其他病狀(通常為肺炎)相關(Davis K.L.及Samules S.C.(1998),Pharmacological Management of Neurological及Psychiatric Disorders Enna S.J.及Coyle J.T.編(McGraw-Hill,New York 第267-316頁))。目前療法代表症狀性方法，其集中在減輕認知障礙及改善與進行性疾病病因相關之行為症狀。實際上，此等治療僅在據報導僅持續至多2年之認知水平障礙下提供短暫認知益處。減緩且可能中止疾病進程之疾病調節性療法的潛力巨大。該等方法將提供患者及(重要地)其看護者以生活品質之根本及持續改善以及降低此疾病之巨大的總體醫療費用。

阿茲海默氏病之臨床診斷目前係基於得出可能或大概阿茲海默氏病之診斷的身體與心理測試組合，但診斷性生物標記及影像正在研究中(Sonnen等人(2007)Expert Rev Neurotherapeutics 7(8):1021-1028；Lockhart等人(2007)Brain 130:2607-2615)。屍檢時，疾病係由腦中明確的神經病學特點證實，該等特點包括實質性斑塊及腦血管中Aβ沈積、神經元內形成神經原纖維纏結、特定腦區中突觸喪失及神經元亞群喪失(Terry,RD(1991)J Neural Trans Suppl 53:141-145)。

很多遺傳學、組織學及功能跡象表明β-澱粉狀蛋白肽(Aβ)為阿茲海默氏病進程之關鍵(Selkoe,D. J.(2001)Physiological Reviews 81:741-766)，儘管最近愈加不明晰屍檢所觀測到的實際Aβ沈積是否為認知下降之真正原因(Ferreira ST(2007)Life 59(4-5):332-345)。已知Aβ係經由藉由稱為BACE1之天冬胺醯蛋白酶(亦稱為β-分泌酶、Asp2或Memapsin-2)裂解β-澱粉狀蛋白前驅蛋白(亦稱為APP)而產生(De Strooper,B.及Konig,G.(1999)Nature 402:471-472)。除實質及血管沈積以外，推測可溶性寡聚形式之Aβ促使AD發作且其最初可藉由損傷突觸功能來影響神經元功能(Lambert等人(1998)Proceedings of the National Academy of Science,U.S.A. 95:6448-6453；Kayed等人(2003)Science 300:486-489；Cheng等人(2007)J Biol Chem 282(33):23818-23828；Ferreira等人(2007)Life 59:332-345)。儘管不溶性澱粉狀蛋白斑塊見於AD早期及輕度認知障礙(MCI)，但此等個體體內之可溶性Aβ凝集體含量(有時稱為寡聚物或Aβ衍生之可擴散配位體(ADDL))亦增加，且可溶性Aβ含量與澱粉狀蛋白斑塊相比與神經原纖維退化及突觸標記喪失更佳相關(Naslund等人(2000)J Am Med Assoc 283:1571-1577,Younkin,S.(2001)Nat. Med. 1:8-19)。此外，此等寡聚物可表示原纖維形成途徑之前驅物且其移除或中和可防止毒性作用及原纖維形成(Ferreira ST(2007)Life 59(4-5):332-345；Gong Y(2003)PNAS 100:10417-10422)。儘管存在此等觀測結果，但高度澱粉狀Aβ42及胺基端截短形式之Aβx-42為見於擴散及老年斑塊中之佔優勢Aβ種類(Iwatsubo,T(1994)Neuron . 13:45-53,Gravina,SA(1995)J. Biol. Chem . 270:7013-7016)且Aβ42之相對含量不僅表現為AD之生物標記，且亦為Aβ凝集為澱粉狀蛋白斑塊之關鍵調控子。已展示Aβ42比其他Aβ形式更易活體外凝集(Jarrett,JT(1993)Biochemistry .32:4693-4697)，且因此暗示Aβ42為AD發病機制中之引發分子(Younkin SG,(1998)J. Physiol. (Paris) . 92:289-292)。儘管Aβ42通常為APP代謝之次要產物，但其產生之微小改變與對Aβ沈積之較大效應相關且因此推測單獨之Aβ42降低可為治療AD之有效手段(Younkin SG,(1998)J. Physiol. (Paris) . 92:289-292；Levites等人(2007)J Clin Invest. 116(1):193-201)。以下結果支持此觀點，已報導澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)及早老素基因中之突變顯著增加Aβ42之相對含量且因此縮短阿茲海默氏病(AD)之發作時間(Selkoe D.J.,Podlisny M.B.(2002)Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:67-99)。然而，應強調澱粉狀蛋白沈積速率亦視總澱粉狀蛋白含量、分解代謝及自CNS清除Aβ之效率而定，已展示該效率受年齡及AD中所見之澱粉狀蛋白含量升高之不利影響(Deane等人(2005)J Neurosci 25(50):11495-11503；Wang等人(2006)Drug Discovery Today 11(19/20):931-938)。在此方面，愈發顯而易見的是中樞神經系統(CNS)與血漿之間的Aβ轉運在腦澱粉狀蛋白含量調控中起重要作用(Shibata等人(2000)J Clin Invest 106:1489-1499)，Aβ係藉由諸如LRP-1之轉運機制自CNS快速轉運至血漿且Aβ係藉由與RAGE結合自血漿快速進入CNS中(Zlokovic BV(2004)J Neurochem 89:807-811)。因此，主動接種Aβ肽或被動投與與周邊Aβ結合且因此改變血漿、CSF與CNS之間的動態平衡的特異性Aβ抗體正在研發中。實際上，現在有大量研究表明此等兩種方法可在各種澱粉樣變性病之轉殖基因模型中降低Aβ含量，減輕Aβ病理病狀且在某些情況下提供認知益處。亦在高級物種中進行有限研究(Lemere,CA(2004)Am J Pathology 165:283-297；Gandy,S(2004)Alzheimer Dis Assoc Disord 18:44:46)。

澱粉狀蛋白沈積之動物模型係藉由於小鼠體內過度表現突變人類轉殖基因而產生。過度表現單一人類APP轉殖基因之小鼠通常自12個月大時產生大腦斑塊樣β-澱粉狀蛋白沈積物(Games D.等人，(1995)Nature 373:523-527；Hsiao K.等人，(1996)Science 274:99-102)，而具有突變人類APP及早老素-1(PS-1)轉殖基因之小鼠通常早在2個月大時即產生大腦斑塊樣β-澱粉狀蛋白沈積物(Kurt M.A.等人，(2001)Exp.Neurol. 171:59-71；McGowan E.等人，(1999)Neurolbiol. Dis.6:231-244)。所使用之各種轉殖基因小鼠模型中之此等大量生物差異使得難以比較不同方法之藥理及效率。在此領域中靶向β-澱粉狀蛋白及其各種形式之免疫療法實際如何起作用還無真正一致觀點。極其可能具有不同結合特性之不同抗體在彼等動物模型中具有變化之結果。據說抗體可藉由多種機制起作用且所述不同作用模式不相互排斥亦為合理的(Levites等人(2007)J Clin Invest. 116(1):193-201)。

臨床上靶向大腦澱粉狀蛋白之首選免疫療法為Elan/Wyeth之AN-1792(一種活性疫苗)。此治療在產生符合腦膜腦炎之臨床症狀後終止。次群體分析(Subgroup analyse)表明治療減緩認知功能下降(Nature Clin Pract Neurol(2005)1:84-85)。患者之屍檢分析亦展示斑塊清除之跡象(Gilman S.等人，(2005)Neurology 64(9)1553-1562)。

Bapineuzumab(AAB-001，Elan/Wyeth)(一種被動單株抗體)正在研究中。

以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之其他疾病或病症包括輕度認知障礙(Kelley BJ(2007)Neurologic Clinics 25(3),577-609)、伴有Dutch型β-澱粉樣變性病之遺傳性大腦出血、大腦β-澱粉狀蛋白血管病變及各種類型之退化性癡呆(諸如與帕金森氏病(Parkinson's disease)相關之彼等癡呆)、進行性核上眼神經麻痹症、皮質-基底核退化及擴散型路易體型阿茲海默氏病(Mollenhauer B(2007)J Neural Transm 2007年2月23日電子公開，van Oijen,M Lancet Neurol. 2006 5:655-60)、唐氏症候群(Down's syndrome)(Mehta,PD(2007)J Neurol Sci. 254:22-7)、年齡相關之黃斑退化(AMD)(Johnson LV等人(2002)PNAS USA 99:11830-11835；Anderson DH等人(2004)Exp Eye Res 78:243-256)、"青光眼型"病(Guo L等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104:13444-13449)及Aβ依賴性白內障形成(Goldstein LE等人(2003)Lancet 361:1258-1265；LiG等人(2003)Mol Vision 9:179-183)。

在發達世界中，年齡相關之黃斑退化(AMD)為失明之主要原因。AMD存在兩種主要臨床表現。萎縮型(乾式)AMD係以視網膜色素上皮(RPE)及神經視網膜退化為特徵。萎縮型AMD早期係與RPE細胞層下之脈絡膜疣形成相關。早期萎縮型AMD可進展為晚期疾病，其中RPE完全退化且在黃斑區內形成明顯區別之RPE萎縮區："地圖狀萎縮"。在此形式之疾病中，RPE退化引起繼發性黃斑視桿細胞及視錐細胞死亡且在此等情況下其引起嚴重的年齡相關之視力損失。一定比例之AMD患者患上可視為不同形式之疾病或疾病之其他併發症。約10-20%之AMD患者有脈絡膜新血管形成(CNV)。當此發生時，將該形式之疾病稱為"濕式AMD"且其可與某些最嚴重視力損失相關。在濕式AMD中，新脈絡膜血管經由布氏膜(Bruch's membrane)中之破裂而生長且增生至RPE及神經視網膜中及其下。在典型病例中，萎縮型AMD係於眼中產生，隨後發展為濕式形式，然而，在很少情況下，可在不存在先前產生之萎縮型形式下有新血管形式。在兩種形式之疾病中，視力損失係由於感光細胞死亡而產生，但在濕式AMD中，來自CNV期間形成之滲漏血管的內部出血亦引起視力損失。就AMD療法而言，在研發處理濕式AMD之某些方面，詳言之藉由抑制VEGF(血管內皮生長因子)或VEGF受體信號轉導路徑之各種分子降低來自CNV之滲漏血管出血的新穎治療方面存在一些進步。然而，目前不存在用於極普遍萎縮型AMD之確定的治療方法及預防早期乾式AMD進展為地圖狀萎縮或濕式AMD之方法(Petrukhin K(2007)Expert Opin Ther Targets 11:625-639)。

儘管引起RPE中Aβ產生之確切機制及Aβ用以影響AMD之確切機制尚未完全清楚，但有跡象表明藉由結合且可能中和或僅移除Aβ之試劑清除Aβ可提供可能之途徑來清除AMD中之脈絡膜疣，降低AMD中補體活化，減輕RPE萎縮且可能降低RPE中VEGF表現之誘發及其以高含量定位在脈絡膜疣周圍。因此，該療法可提供預防、延緩、減輕或逆轉由於AMD造成之視力損失及其進展至地圖狀萎縮及/或滲出性AMD之方法。其可致使RPE周圍環境中含Aβ脈絡膜疣及/或局部Aβ含量降低且藉此干擾早期及晚期AMD且治療引起視力損失之潛在細胞下降。

一些最近公開之資料闡明在AMD產生中補體蛋白與澱粉狀蛋白β之相互作用(Wang,J.等人，(2008)J. Immunol. 181:16651-6)。已展示澱粉狀蛋白β與補體因子I結合，伴有因子H之輔因子造成補體蛋白C3自C3b形式斷裂為其失活形式iC3b(Wang,J.等人，2008)。表明來自最近公開之活體外研究之結果支持以下假設：澱粉狀蛋白β藉由阻斷補體因子I功能而活化脈絡膜疣內的補體系統，在視網膜下組織中引起低度慢性炎症；從而聯繫與AMD產生相關之四種因素：炎症、補體活化、澱粉狀蛋白β沈積及脈絡膜疣(Wang,J.等人，2008)。澱粉狀蛋白β藉由可能與補體因子H競爭與補體因子I結合而活化補體旁路之效應的該直接證明先前無論述(Wang,J.等人，2008)。

"青光眼型疾病"為用於可引起眼視神經損害且導致失明之疾病群之術語。其為世界上最終由增加之眼內壓(IOP)及降低之視敏度引起之失明的主要原因。IOP與其如何引起視網膜神經節細胞(RGC)細胞凋亡之間的聯繫尚未完全清楚。高IOP單獨可誘發細胞凋亡(Cordeiro M F等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13352-13356；Quigley H A等人(1995)Invest Ophtalmol Visual Sci 36:774-786)，但其自身並非視神經元細胞死亡之唯一原因。此外，已觀測到視力甚至可在以眼壓降低劑治療後的IOP標準化後持續受損(Oliver JE等人(2002)Am J Ophthamol 133:764-772)。

近來已報導β-澱粉狀蛋白之潛在細胞毒性效應與青光眼中RGC細胞凋亡有聯繫(McKinnon SJ等人(2002)Invest Ophtamol Visual Sci 43:1077-1087)。在青光眼動物模型中已表明在RGC中卡斯蛋白酶-3蛋白酶活化，引起藉由卡斯蛋白酶3異常處理澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)，產生包括β-澱粉狀蛋白之潛在毒性APP片段(McKinnon等人(2002)；Cheung ZH等人(2004)Mol Cell Neurosci 25:383-393)。在其他細胞中，已展示RGC表現APP且因此其具有β-澱粉狀蛋白之可能來源。使卡斯蛋白酶-3活化涉及APP含量升高及β-澱粉狀蛋白含量升高，但此主要係在活體外系統中觀測到。不清楚青光眼中RGC中APP含量是否亦增加從而促進以正反饋機制產生甚至更多之β-澱粉狀蛋白。甚至更近來，已提出青光眼大鼠模型中β-澱粉狀蛋白與RGC細胞凋亡相關(Guo等人(2007))。測試靶向β-澱粉狀蛋白或β-澱粉狀蛋白產生之數種試劑且展示在將所有三種治療一起使用時，活體內視網膜神經節細胞死亡減少，其中有可能的輕度增強效應。藉由使用抗β-澱粉狀蛋白抗體可見最大效應，該效應幾乎與一起使用所有三種試劑所見之效應相匹配。

儘管並不完全清楚引起RGC中β-澱粉狀蛋白產生之確切機制及與IOP之聯繫，但有跡象表明藉由結合及可能中和或僅僅移除β-澱粉狀蛋白之試劑來清除β-澱粉狀蛋白可提供預防青光眼中RGC細胞凋亡之可能途徑且因此提供延緩、減輕或逆轉青光眼中視力損失之方法。此可致使RGC及周圍環境中β-澱粉狀蛋白含量減少且藉此解決引起視力損失之潛在細胞下降之問題。

β-澱粉狀蛋白可在其他眼部疾病中起作用且與尤其在彼等見於AD患者中之超核性白內障形成相關，且Aβ產生與加工路徑之組份存在於晶狀體中(Goldstein LE等人，(2003)；Li G等人，(2003))。因此，關於介入AMD及青光眼型疾病所述之治療方法可適用於預防Aβ依賴性白內障形成。

WO 2008/110885係關於用針對澱粉狀蛋白-β肽之抑制劑治療眼科疾病之方法。詳言之，揭示與似乎包括25-34及40的Aβ1-40上抗原決定基結合之抗體6G。

在本發明之一態樣中，提供識別含有β-澱粉狀蛋白之殘基28-35之β-澱粉狀蛋白肽的抗原決定基之治療用抗原結合蛋白質。

在一特定實施例中，治療用抗原結合蛋白質識別含有β-澱粉狀蛋白殘基28-34之β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基。

在一更特定實施例中，治療用抗原結合蛋白質識別含有β-澱粉狀蛋白殘基28-33之β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基。

在本發明之另一實施例中，提供識別β-澱粉狀蛋白殘基28-35區域內之β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基的治療用抗原結合蛋白質。

在本發明之另一實施例中，提供識別由β-澱粉狀蛋白之殘基28-33、28-34或28-35組成的β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基之治療用抗原結合蛋白質。

在本發明之一實施例中，提供需要用於結合之β-澱粉狀蛋白殘基32及33之治療用抗原結合蛋白質。

在本發明之一實施例中，治療用抗原結合蛋白質為抗體或其抗原結合片段及/或衍生物。

在本發明之一實施例中，提供治療用抗原結合蛋白質，其為與β-澱粉狀蛋白肽結合之抗原結合蛋白質，諸如抗體或其抗原結合片段及/或衍生物，且其包含以下CDRs：

CDRH1：VYYVH(SEQ ID No:1)

CDRH2：RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No:2)

CDRH3：SGY(SEQ ID No:3)

CDRL1：RSSKSLLHRNGITYLY(SEQ ID No:4)

CDRL2：QMSNLAS(SEQ ID No:5)

CDRL3：AQNLELWT(SEQ ID No:6)

在本發明之另一實施例中，提供特異性結合β-澱粉狀蛋白肽且包含為以上所列序列變異體之CDR的抗原結合蛋白質，諸如抗體或其抗原結合片段。

CDR變異體包括藉由缺失或取代一至數個CDR胺基酸或藉由添加或插入一至數個胺基酸至CDR中或藉由其組合的CDR胺基酸序列之部分改變。CDR變異體可在CDR胺基酸序列中含有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代、添加或缺失。CDR變異體可在CDR胺基酸序列中含有1、2或3個胺基酸取代、插入或缺失。胺基酸殘基中之取代可為保守性取代，例如將一個疏水性胺基酸取代為替代疏水性胺基酸。舉例而言，可以纈胺酸或異白胺酸取代白胺酸。

包含變異CDR之抗原結合蛋白質具有與包含上述CDR之彼等抗原結合蛋白質相同或類似的功能特性。因此，包含變異CDR之抗原結合蛋白質將以與本文中所述之CDR相同或類似之結合親和力結合至相同標靶蛋白或抗原決定基。

例示性抗體為6F6鼠類單株抗體。在本發明之一實施例中，提供包含以上所鑑別之6F6之CDR的人類化或嵌合抗體。舉例而言，嵌合抗體可包含6F6鼠類抗體之可變區，亦即SEQ ID No:19(V_H )及SEQ ID No:21(V_L )。基於鼠類6F6之人類化抗體之實例為包含具有SEQ ID No:27之重鏈及具有SEQ ID No:28之輕鏈的抗體。

在本說明書全文中，術語"CDR"、"CDRL1"、"CDRL2"、"CDRL3"、"CDRH1"、"CDRH2"、"CDRH3"遵循如Kabat等人;Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987中所闡明之Kabat編號系統。因此，以下定義根據本發明之CDR：

CDR：殘基

CDRH1：31-35

CDRH2：50-65

CDRH3：95-97

CDRL1:24-34

CDRL2:50-56

CDRL3:89-97

IGHV1-24(SEQ ID No:13)為人類生殖系序列，其為用於移植V_H CDR之合適受體構架。在一特定態樣中，人類受體重鏈構架係源自IGHV1-24。在本發明之替代實施例中，人類受體構架包含與鼠類6F6重鏈可變序列在其全長(排除CDR序列)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之人類重鏈可變區序列。

對於胺基酸及核酸序列而言，術語"相同"或"序列一致性"表示當最佳比對且與適當插入或缺失比較時，兩個胺基酸或兩個核酸序列之間的一致性程度。或者，當DNA區段在選擇性雜交條件下雜交至互補鏈時存在實質一致性。兩個序列之間的一致性百分比隨序列共用之相同位置數而變化(亦即一致性%=相同位置數/位置總數×100)，此情形考慮到為達成兩個序列之最佳比對所需要引入的間隙數及各間隙之長度。如下所述，可使用數學演算法實現序列比較及兩個序列之間的一致性百分比之測定。

兩個核苷酸序列之一致性百分比可使用GCG軟體包中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。兩個核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用已併入ALIGN程式(版本2.0)中之E. Meyers及W. Miller演算法(Comput. Appl. Biosci.,4:11-17(1988))，使用PAM120殘基重量表、12之間隙長度罰分及4之間隙罰分來測定。此外，可使用併入GCG軟體包中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。

舉例而言，聚核苷酸序列可與所述參考聚核苷酸序列相同(亦即100%相同)或其與參考序列相比可包括至多某一整數之核苷酸改變，諸如至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%相同。該等改變係選自由至少一個核苷酸缺失、取代(包括轉換及顛換)或插入組成之群，且其中該等改變可在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處或彼等末端位置之間的任何處(個別散布在參考序列中之核苷酸中或散布在參考序列內的一或多個鄰近基團中)發生。核苷酸改變數目係藉由參考聚核苷酸序列中之核苷酸總數乘以各別一致性百分比之百分比數(除以100)且自參考聚核苷酸序列中之該核苷酸總數減去彼乘積或藉由下式來確定：

其中n_n 為核苷酸改變數目，x_n 為參考聚核苷酸序列中核苷酸總數，且y對於50%為0.50，60%為0.60，70%為0.70，75%為0.75，80%為0.80，85%為0.85，90%為0.90，95%為0.95，98%為0.98，99%為0.99或100%為1.00，‧為乘法算子符號，且其中在自x_n 減去前使x_n 與y之任何非整數乘積四捨五入至最接近的整數。

類似地，多肽序列可與本文中所述之多肽參考序列相同(亦即100%相同)或其與參考序列相比可包括至多某一整數之胺基酸改變，使得一致性%小於100%，諸如至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%相同。該等改變係選自由至少一個胺基酸缺失、取代(包括保守及非保守取代)或插入組成之群，且其中該等改變可在參考多肽序列之胺基或羧基末端位置處或彼等末端位置之間的任何處(個別散布在參考序列中之胺基酸中或散布在參考序列內的一或多個鄰近基團中)發生。給定一致性%之胺基酸改變數目係藉由以本文中所述之多肽參考序列編碼的多肽序列中之胺基酸總數乘以各別一致性百分比之百分比數(除以100)且接著自多肽參考序列中該胺基酸總數減去彼乘積或下式來測定：

其中n_a 為胺基酸改變數目，x_a 為多肽序列中胺基酸總數，且y對於50%為0.50，60%為0.60，70%為0.70，75%為0.75，80%為0.80，85%為0.85，90%為0.90，95%為0.95，98%為0.98，99%為0.99或100%為1.00，‧為乘法運算子符號，且其中在自xa減去前使xa與y之任何非整數乘積四捨五入至最接近之整數。

一致性%可在序列整個長度中。

為建構完整V區，必需將構架4添加至生殖系編碼V基因IGHV1-24中。合適構架4序列包括藉由人類JH4小基因編碼之序列(Kabat)：

YFDYWGQGTLVTVSS　(SEQ ID No:15)

熟習此項技術者瞭解生殖系V基因及J基因不包括整個重鏈CDR3之編碼序列。然而，在本發明抗體中，整個重鏈CDR3係由供體免疫球蛋白來提供。因此，VH基因(諸如IGHV1-24)、JH小基因(諸如JH4)及重鏈CDR(諸如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2及SEQ ID No:3)組之組合(以使得模擬成熟、完全重新排列之重鏈可變區之方式組裝)足以限定本發明之重鏈可變區。

IGKV2-28(SEQ ID No:16)為人類生殖系序列，其為用於移植V_L CDR之合適受體構架。在一特定態樣中，人類受體輕鏈構架係源自IGKV2-28。在本發明之替代實施例中，人類受體構架包含與鼠類6F6輕鏈可變序列在其全長(排除CDR序列)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之人類輕鏈可變區序列。

為建構完整V區，必需將構架4添加至生殖系編碼V基因IGKV2-28中。合適構架4序列包括藉由人類JK-1小基因編碼之序列(Kabat)：

WTFGQGTKVEIK　(SEQ ID No:18)

熟習此項技術者瞭解生殖系V基因及J基因不包括整個輕鏈CDR3之編碼序列。然而，在本發明之抗體中，CDR3序列係由供體免疫球蛋白來提供。JK-1小基因殘基之頭兩個殘基屬於CDR3區。對於JK-1小基因而言，此等殘基與輕鏈CDRL3(SEQ ID No:6)中之最後兩個殘基相同。因此，V_L 基因(諸如IGKV2-28)、FR4(諸如JK-1)與輕鏈CDR(諸如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5及SEQ ID No:6)組之組合(以使得模擬成熟、完全重新排列輕鏈可變區之方式組裝)足以限定本發明之輕鏈可變區。

在本發明之一特定實施例中，人類受體重鏈構架係源自IGHV1-24及JH4小基因且人類受體輕鏈構架係源自IGKV2-28及JK-1小基因，該等構架視情況含有一或多個基於見於具有序列SEQ ID No:19之供體V_H 域及具有序列SEQ ID No:21之供體V_L 域中的相應殘基之胺基酸殘基取代(該等取代維持所有或大體上所有β-澱粉狀蛋白肽供體抗體之結合親和力)。"大體上所有結合親和力"意謂治療用抗體與供體抗體相比，結合親和力降低至多五倍(更詳言之兩倍)。

在本發明之一更特定實施例中，源自IGHV1-24及JH4之人類受體重鏈構架具有一或多個(諸如一至十五個，更詳言之二至十五個)選自以下殘基之胺基酸殘基取代(或其保守性取代)：

在一更特定實施例中，源自IGHV1-24及JH4之人類受體重鏈構架包含以下殘基(或其保守性取代基)：

在本發明之一更特定實施例中，源自IGKV2-28及JK-1之人類受體輕鏈構架具有一或多個(諸如一至四個，更詳言之兩個)選自以下殘基之胺基酸殘基取代(或其保守性取代)：

在本發明之一更特定實施例中，源自IGKV2-28及JK-1之人類受體輕鏈構架包含以下殘基(或其保守性取代)：

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:24中列出之序列之V_H 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:26中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:24中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:26中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:59中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:67中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:61中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:67中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:63中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:67中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:65中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:67中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:59中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:69中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:61中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:69中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:63中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:69中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:65中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:69中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:59中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:71中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:61中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:71中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:63中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:71中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

在本發明之一實施例中，提供包含具有於SEQ ID No:65中列出之序列之V_H 域及具有於SEQ ID No:71中列出之序列之V_L 域的治療用抗體。

抗體重鏈可變區可與SEQ ID NO:24、59、61、63或65中任一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。抗體輕鏈可變區可與SEQ ID NO:26、67、69或71中任一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。

在本發明之一實施例中，提供一種治療用抗體，該抗體包含具有於SEQ ID No:27中列出之序列之重鏈。

在本發明之一實施例中，提供一種治療用抗體，該抗體包含具有於SEQ ID No:28中列出之序列之輕鏈。

在本發明之一實施例中，提供一種治療用抗體，該抗體包含具有於SEQ ID No:27中列出之序列之重鏈及具有於SEQ ID No:28中列出之序列之輕鏈。

重鏈可變區之任一者均可與合適人類恆定區組合。輕鏈可變區之任一者均可與合適恆定區組合。

在一特定實施例中，本發明之治療用抗原結合蛋白質為本質上缺少以下功能之抗體或其片段及/或衍生物：a)藉由經典路徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性。

在本發明之另一態樣中，提供包含本發明之治療用抗原結合蛋白質或治療用抗體之醫藥組合物。

在本發明之另一態樣中，提供治療罹患β-澱粉狀蛋白肽相關疾病之人類患者的方法，該方法包含以下步驟：向該患者投與治療有效量之本發明之治療用抗原結合蛋白質或治療用抗體。

在本發明之一實施例中，β-澱粉狀蛋白肽相關疾病為阿茲海默氏病。在本發明之另一實施例中，β-澱粉狀蛋白肽相關疾病為以升高之β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物為特徵之影響眼或視神經的疾病或病症。詳言之，β-澱粉狀蛋白肽相關疾病可為年齡相關之黃斑退化(AMD)、青光眼或β-澱粉狀蛋白依賴性白內障形成。

在本發明之另一實施例中，投與治療用抗原結合蛋白質以及補體路徑(尤其為補體旁路)抑制劑，該等抑制劑係(例如，但不排除)其他抗補體手段：補體因子H(CFH)或其片段、可溶性補體受體1(sCR1)或其片段、可溶性膜輔因子蛋白(MCP)及其片段、可溶性衰變加速因子(DAF)及其片段。在此上下文中，補體路徑抑制劑為用以負性調控補體路徑(尤其為補體旁路)活性之分子。

在本發明之另一實施例中，投與治療用抗原結合蛋白質以及補體路徑活化子抑制劑(尤其為補體旁路活化子抑制劑，例如但不排除其他抑制方法或其他補體路徑標靶：抗體或抗體片段(例如結構域抗體))來中和補體因子D(CFD)或補體因子B(CFB)活性。在本發明之上下文內亦考慮補體組份C3之13殘基肽抑制劑康莫斯汀(compstatin)及抗C5a補體組份抗體培克珠單抗(pexelizumab)為補體路徑活化子抑制劑。一般而言，補體路徑活化子抑制劑為在某種程度上抑制或拮抗給定補體活化子之生物活性使得該效應負性調控補體路徑(尤其補體旁路)之活性的試劑。

最近已綜述靶向補體之治療方法(Ricklin,D & Lambris,J.(2007)Nature Biotechnology 25:1265-75，其全文以引用的方式併入本文中)，且文中所述之抗補體路徑方法均可能與抗澱粉狀蛋白β抗體組合使用來提供治療方法。所考慮之抗補體方法包括：(i)蛋白酶抑制劑，例如補體因子D抑制劑，(ii)可溶性補體調控劑，例如可溶性經截短補體受體1，(iii)治療用抗體，例如對抗補體因子D或B，(iv)補體組份抑制劑，例如C5抑制劑及(v)受體拮抗劑，例如小分子C5a受體拮抗劑。

補體路徑抑制劑或補體路徑活化子抑制劑可與本發明之治療用抗原結合蛋白質同時或相繼、單獨或以交替方式投與。

亦提供包含本文中所定義之治療用抗原結合蛋白質及補體路徑抑制劑或補體路徑活化子抑制劑之醫藥組合物。

亦提供本發明之治療用抗原結合蛋白質或治療用抗體用於製造供治療β-澱粉狀蛋白肽相關疾病用之藥劑的用途。

亦提供具有對β-澱粉狀蛋白(諸如含有如上所述β-澱粉狀蛋白殘基28-35之β-澱粉狀蛋白肽的抗原決定基)之第一特異性及對補體路徑活化子之第二特異性的雙特異性抗體或其雙特異性片段。

亦提供本發明之抗原結合蛋白質，本發明之抗體或本發明之雙特異性抗體或其雙特異性片段，其係用於治療β-澱粉狀蛋白肽相關疾病。

在本發明之另一實施例中，提供包含具有序列SEQ ID No:19之鼠類V_H 域及具有序列SEQ ID No:21之鼠類V_L 域的抗體或其片段。

在本發明之另一實施例中，提供編碼包含具有序列SEQ ID No:19(尤其SEQ ID No:20之聚核苷酸)之V_H 域之抗體重鏈或其片段的聚核苷酸。

在本發明之另一實施例中，提供編碼包含具有序列SEQ ID No:21(尤其SEQ ID No:22之聚核苷酸)之V_L 域之抗體輕鏈或其片段的聚核苷酸。

在本發明之一態樣中，提供一種抗原結合蛋白質，其在ELISA檢定中與包含具有於SEQ ID No:27中列出之序列之重鏈及具有於SEQ ID No:28中列出之序列之輕鏈的抗體競爭結合至β-澱粉狀蛋白。

熟習此項技術者應瞭解為使抗原結合蛋白質(抗原結合蛋白質A)與包含具有於SEQ ID No:27中列出之序列之重鏈及具有於SEQ ID No:28中列出之序列之輕鏈的抗體(抗體B)競爭結合特異性結合位點(β-澱粉狀蛋白)，抗原結合蛋白質A必須以足以在該檢定中具有效應之量存在。在一特定實施例中，抗原結合蛋白質A及抗體B係以等莫耳量存在。在另一實施例中，存在抗原結合蛋白質A在ELISA檢定中使抗體B與β-澱粉狀蛋白之結合降低超過10%、20%、30%、40%或50%。在另一實施例中，在ELISA檢定中β-澱粉狀蛋白與免疫檢定盤結合。在另一實施例中，抗原結合蛋白質A降低抗體B與同盤結合之β-澱粉狀蛋白之結合，而非β-澱粉狀蛋白特異性對照物不降低此結合。

在本發明之另一態樣中，抗原結合蛋白質為包含重鏈及輕鏈之治療用抗體，該抗體包含分別與胺基酸序列SEQ ID No:27及SEQ ID No:28至少90%、95%、96%、97%、98%或99%相同之多肽，其中該抗體結合β-澱粉狀蛋白。在一較佳實施例中，抗體識別含有β-澱粉狀蛋白殘基28-35之β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基。

在本發明之另一態樣中，提供一種抗原結合蛋白質，其如表面電漿共振所測定，結合至包含β-澱粉狀蛋白殘基24-35(SEQ ID No:10)或28-39(SEQ ID No:11)之C末端生物素標記β-澱粉狀蛋白肽，該肽與抗生蛋白鏈菌素感應晶片結合。

在本發明之另一態樣中，提供抗原結合蛋白質(尤其為單株抗體或其片段)，其特異性結合至β-澱粉狀蛋白且需要β-澱粉狀蛋白28-35區中之至少一個殘基以供結合。在一較佳實施例中，抗原結合蛋白質另外需要至少一個與β-澱粉狀蛋白28-35區中該至少一個殘基側接之殘基或結構上相鄰之殘基以便結合。因此，抗原結合蛋白質可獨立需要一、二、三、四、五或更多選自由β-澱粉狀蛋白之28、29、30、31、32、33、34及35組成之群的殘基，及側接或結構上相鄰之殘基。

熟習此項技術者可易於在ELISA檢定中使用(例如)丙胺酸置換掃描來鑑別該等抗原結合蛋白質。在此方面，抗原結合蛋白質是否需要β-澱粉狀蛋白之28-35區域中之殘基或側接或結構上相鄰殘基以便結合可藉由以丙胺酸獨立取代β-澱粉狀蛋白之該殘基且比較抗原結合蛋白質對經丙胺酸取代之β-澱粉狀蛋白肽之結合親和力與抗原結合蛋白質與野生型β-澱粉狀蛋白之結合親和力來測定。是否需要β-澱粉狀蛋白28-35區中之殘基係藉由抗原結合蛋白質與經丙胺酸取代之β-澱粉狀蛋白肽的結合親和力與野生型β-澱粉狀蛋白肽相比之降低來定義，其中該降低係如Biacore或ELISA親和力量測所測定超過1、2、3、4或5倍。

此外，在此上下文中結構上相鄰之殘基為與所論及殘基三維空間緊密鄰近且藉由抗原結合蛋白質結合之殘基。熟習此項技術者瞭解抗原決定基可為線性或非線性肽序列。在後種非線性情況下，儘管殘基來自不同肽鏈區，但其可在抗原三維結構中緊密鄰近。該等結構上相鄰殘基可經由電腦模型化程式或經由由此項技術中已知之方法(諸如X線結晶學)獲得之三維結構來測定。

在本發明之另一態樣中，提供製作本發明之抗體之方法，該方法包含於宿主細胞中表現編碼抗體之聚核苷酸。

在本發明之另一態樣中，提供編碼治療用抗體重鏈之聚核苷酸，其包含具有於SEQ ID No:24中列出之序列之V_H 鏈。

在本發明之另一態樣中，提供編碼治療用抗體輕鏈之聚核苷酸，其包含具有於SEQ ID No:26中列出之序列之V_L 域。

在本發明之另一態樣中，提供編碼治療用抗體重鏈之聚核苷酸，其具有於SEQ ID No:27中列出之序列。

在本發明之另一態樣中，提供編碼治療用抗體輕鏈之聚核苷酸，其具有於SEQ ID No:28中列出之序列。

在本發明之一更特定實施例中，提供編碼治療用抗體重鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含於SEQ ID No:29中列出之序列。

在本發明之另一更特定實施例中，提供編碼治療用抗體輕鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含於SEQ ID No:30中列出之序列。

1.抗原結合蛋白質

本文中所使用之術語"抗原結合蛋白質"係指抗體、抗體片段及其他蛋白質構築體(諸如結構域)，尤其為彼等如下進一步論述之能夠結合至β-澱粉狀蛋白者。

1.1完整抗體

本發明之抗原結合蛋白質可為"完整抗體"。本發明之抗原結合蛋白質包括為抗體或其抗原結合片段及/或衍生物之治療用抗體。完整抗體通常為雜多聚醣蛋白，其包含至少兩個重鏈及兩個輕鏈。除IgM以外，完整抗體為大約150KDa之雜四聚醣蛋白，其包含兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈。通常，各輕鏈係藉由一共價二硫鍵連接至重鏈，而不同免疫球蛋白同型之重鏈之間的二硫鍵數目會有變化。各重鏈及輕鏈亦具有鏈內二硫橋。各重鏈在一端有可變域(V_H )，該可變域後為許多恆定區。各輕鏈具有可變域(V_L )且在其另一端具有恆定區；該輕鏈恆定區與重鏈之第一恆定區比對且輕鏈可變域與重鏈之可變域比對。基於恆定區之胺基酸序列，來自大多數脊椎動物物種之抗體之輕鏈可歸為稱作κ及λ之兩種類型之一者。視其重鏈恆定區之胺基酸序列而定，人類抗體可歸為五種不同種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA可進一步再分為子類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；及IgA1及IgA2。物種變異體存在於具有至少IgG2a、IgG2b之小鼠及大鼠中。抗體可變域藉由展示特定可變性之某些區(稱作互補決定區(CDR))來賦予抗體結合特異性。可變區之更保守部分係稱作構架區(FR)。完整重鏈及輕鏈之可變域各自包含藉由三個CDR相連接之四個FR。各鏈中之CDR藉由FR區而緊密鄰近地連接在一起且與來自另一鏈之CDR促成抗體之抗原結合位點的形成。該等恆定區不直接涉及抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如參與抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、經由結合Fcγ受體之噬菌作用、經由新生Fc受體(FcRn)之半衰期/清除率及經由補體級聯之Clq組份之補體依賴性細胞毒性。已報導人類IgG2恆定區本質上缺少藉由經典路徑使補體活化之能力或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。已報導IgG4恆定區缺少藉由經典路徑使補體活化之能力及僅微弱地介導抗體依賴性細胞毒性之能力。本質上缺少此等效應功能之抗體可稱為"非溶胞"抗體。

1.1.1人類抗體

本發明之抗原結合蛋白質可為人類抗體。可藉由熟習此項技術者已知之多種方法來製造人類抗體。可使用人類骨髓瘤或小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株，藉由融合瘤法製造人類抗體，參見Kozbor J.Immunol 133,3001,(1984)及Brodeur,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker Inc,1987)。替代方法包括使用噬菌體庫或轉殖基因小鼠，兩者皆利用人類V區譜(參見Winter G,(1994),Annu.Rev.Immunol 12,433-455,Green LL(1999),J.Immunol.methods 231,11-23)。

現可利用轉殖基因小鼠之若干菌株，其中已以人類免疫球蛋白基因區段置換其小鼠免疫球蛋白基因座(參見Tomizuka K,(2000)PNAS 97,722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol. 14,845-851,Mendez MJ,1997,Nature Genetics,15,146-156)。抗原激發後，該等小鼠能夠產生人類抗體譜，可自該人類抗體譜選擇所關注之抗體。

特別關注Trimera^TM 系統(參見Eren R等人(1998)Immunology 93:154-161)，其中將人類淋巴細胞移植至經輻射小鼠，經選擇淋巴細胞抗體系統(Selected Lymphocyte Antibody System)中(SLAM，參見Babcook等人，PNAS(1996)93:7843-7848)，其中人類(或其他物種)淋巴細胞有效經受大範圍集中之活體外抗體產生程序，隨後去卷積(deconvulated)，限制性稀釋及選擇程序及Xenomouse II^TM (Abgenix Inc)。使用Morphodoma^TM 技術，自Morphotek Inc獲得替代方法。

可使用噬菌體呈現技術來製造人類抗體(及其片段)，參見McCafferty;Nature,348,552-553(1990)及Griffiths AD等人(1994)EMBO 13:3245-3260。根據此技術，抗體V域基因係經同框選殖至絲狀噬菌體(例如M13或fd)之蛋白質基因之主要或次要衣殼中且係呈現(通常借助於輔助噬菌體)為該噬菌體顆粒表面上之功能抗體片段。基於該抗體之功能特性之選擇造成編碼具有彼等特性之抗體之基因的選擇。可使用噬菌體呈現技術自取自罹患上述疾病或病症之個體或另外取自未經免疫之人類供體的人類B細胞製成之庫選擇抗原特異性抗體(參見Marks;J.Mol.Biol. 222,581-597,1991)。當需要包含Fc域之完整人類抗體時，必需將具有衍生之片段的噬菌體重新選殖至哺乳動物表現載體中，該載體包含所需恆定區且建立穩定表現之細胞株。

可使用親和力成熟技術來改良結合親和力。其可(例如)藉由以天然產生之變異體相繼置換H及L鏈V區且基於經改良之結合親和力選擇而達成(Marks;Bio/technol 10,779-783(1992))。現亦可獲得此技術之變化形式，諸如"抗原決定基印痕作用"(WO 93/06213,Waterhouse;Nucl.Acids Res 21,2265-2266(1993))。近年來，已藉由例如藉由使用易產生誤差之RNA複製酶且隨後藉由核糖體呈現選擇技術自此等庫選擇來使V區或CDR隨機突變而獲得親和力成熟抗體(Kopsidas G BMC Biotechnology. 7:18,2007)。

1.1.2嵌合及人類化抗體

本發明之抗原結合蛋白質可為"嵌合"或"人類化"抗體。使用完整非人類抗體來治療人類疾病或病症目前尤其在重複投與抗體後具有明確的潛在免疫原性的問題：亦即患者免疫系統可將非人類完整抗體識別為非自身的且施加中和反應。除開發完全人類抗體(見上文)之外，經多年已開發出多種技術來克服此等問題且一般涉及降低在完整治療用抗體中之非人類胺基酸序列之組份，同時保持相對容易地自經免疫動物(例如小鼠、大鼠或兔子)獲得非人類抗體。已廣泛地使用兩種手段來達成此目的。第一為嵌合抗體，其一般包含與人類恆定區融合之非人類(例如齧齒動物，諸如小鼠)可變域。因為抗體之抗原結合位點侷限於可變區內，所以嵌合抗體對抗原保持其結合親和力但獲得該人類恆定區之效應功能且因此能夠執行如上文所描述之效應功能。通常使用重組DNA方法來產生嵌合抗體。使用習知程序將編碼抗體之DNA(例如cDNA)分離且定序(例如，藉由使用寡核苷酸探針，其能夠特異性結合至編碼本發明之抗體H及L鏈可變區的基因，例如上文所述SEQ ID NO 19及21之DNA)。將融合瘤細胞用作該DNA之典型來源。一旦經分離，即將DNA置於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至宿主細胞(諸如大腸桿菌、COS細胞、CHO細胞、PerC6細胞或骨髓瘤細胞)中，該等宿主細胞另外不產生免疫球蛋白來獲得該抗體之合成。可藉由用人類L及H鏈之編碼序列取代相應非人類(例如鼠類)H及L恆定區來修飾該DNA，例如，參見Morrison;PNAS 81,6851(1984)。因此，在本發明之另一實施例中，提供融合至人類恆定區(其可能具有IgG同型，例如IgG1)之包含具有序列SEQ ID No:19之V_H 域及具有序列SEQ ID No:21之V_L 域的嵌合抗體。

第二種手段涉及產生人類化抗體，其中藉由使可變區人類化來降低抗體之非人類內容物。用於人類化之兩種技術已經獲得普及。第一種為藉由CDR移植來人類化。CDR建立接近抗體N末端之環，其中該等環形成安裝在構架區所提供之支架上之表面。抗體之抗原結合特異性主要係藉由構形及藉由其CDR表面之化學特徵來限定。此等特徵又係藉由個別CDR之構形，藉由CDR之相對排列，且藉由包含CDR之殘基側鏈之性質及排列來確定。可藉由僅移植非人類(例如鼠類)抗體("供體"抗體)之CDR至合適的人類構架("受體構架")及恆定區上來達成免疫原性之大幅降低(參見Jones等人(1986)Nature 321,522-525及Verhoeyen M等人(1988)Science 239,1534-1536)。然而，CDR移植本身不能導致抗原結合特性之完全保留且頻繁發現若需要恢復顯著抗原結合親和力，則必須將供體抗體之一些構架殘基保留(有時候稱作"回復突變")在人類化分子中(參見Queen C等人(1989)PNAS 86,10,029-10,033,Co,M等人(1991)Nature 351,501-502)。在此情況下，為提供人類構架(FR)，可能自資料庫選擇具有與非人類供體抗體最大序列同源性(通常60%或更大)之人類V區。可自人類一致或單個人類抗體來選擇人類FR。若需要，則將來自供體抗體之關鍵殘基取代至人類受體構架中來保留CDR構形。可使用抗體之電腦模型來幫助識別該等結構重要殘基，參見WO 99/48523。

或者，可藉由"表合(veneering)"法來達成人類化。獨特人類及鼠類免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之統計分析揭示在人類及鼠類抗體中經曝露殘基之確切圖案係不同的，且大多數單個表面位置對少量不同殘基具有較強偏好(參見Padlan E.A.等人；(1991)Mol.Immunol.28,489-498及Pedersen J.T.等人(1994)J.Mol.Biol. 235;959-973)。因此可能藉由替代其構架區中之經曝露殘基(其不同於通常在人類抗體中所見之彼等殘基)來降低非人類Fv之免疫原性。因為蛋白質抗原性可與表面可達性相關，所以置換表面殘基可足以使得小鼠可變區對於人類免疫系統為"不可見的"(亦參見Mark G.E.等人(1994)Handbook of Experimental Pharmacology第113卷：The pharmacology of monoclonal Antib odies,Springer-Verlag，第105-134頁)。此人類化程序係稱作"表合"，因為僅改變抗體表面，該等支撐殘基保持原狀。其他替代方法包括WO 04/006955中闡明之方法及利用細菌表現系統且產生序列接近人類生殖系之抗體的程序(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics 2007年1月，San Diego,California)。

熟習此項技術者將明白術語"衍生"不僅意欲定義在其為材料之物理起源意義上之來源且亦定義結構上與材料相同但不起源於參照來源的材料。因此，不一定需要將"見於供體抗體中之殘基"自供體抗體純化。

在此項技術中明確地認識到某些胺基酸取代被認為係"保守的"。基於共同側鏈特性將胺基酸劃分成各組且認為在維持本發明治療用抗體之所有或大體上所有結合親和力之基團內的取代為保守取代，參見下表1：

1.1.3多特異性及雙特異性抗體

本發明之抗原結合蛋白質可為多特異性的，亦即其可結合一種以上抗原。在一特定實施例中，抗原結合蛋白質為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體衍生物且亦形成本發明之部分。製造該等抗體之方法在此項技術中已知。傳統上，雙特異性抗體之重組製造係基於兩條免疫球蛋白H鏈-L鏈對之共同表現，其中兩條H鏈具有不同結合特異性，參見Millstein等人，Nature 305 537-539(1983),WO 93/08829及Traunecker等人EMBO,10,1991,3655-3659。由於H鏈及L鏈之隨機分類，因此產生十種不同抗體結構之可能混合物，其中僅一種具有所需結合特異性。替代方法包括將具有所需結合特異性之可變域與包含鉸鏈區、CH2及CH3區之至少部分的重鏈恆定區融合。CH1區較佳含有存在於至少一個融合體中之供輕鏈結合所必需之位點。編碼此等融合體之DNA及(若需要)L鏈插入分離表現載體中且接著經共轉染至合適宿主有機體中。但可能將兩條或全部三條鏈之編碼序列插入一個表現載體中。在一較佳方法中，該雙特異性抗體包含在一臂中具有第一結合特異性之H鏈及在另一臂中提供第二結合特異性之H-L鏈對，參見WO 94/04690。亦參見Suresh等人Methods in Enzymology 121,210,1986。

血腦障壁(BBB)之存在妨礙治療用蛋白質向腦之傳遞且在眼與血流之間存在類似血液視網膜障壁。若需要傳遞本發明之抗原結合蛋白質(諸如本發明抗體或本發明抗體片段)橫穿生物障壁(諸如BBB)，已提出各種策略來增強該傳遞(當需要時)且類似策略可適用於使得能夠橫穿血液視網膜障壁。

為自血液獲得所需營養物質及因子，BBB具有一些特定受體，該等受體將來自循環血液之化合物轉運至腦。研究已表明一些化合物，如胰島素(參見Duffy KR等人(1989)Brain Res. 420:32-38)、運鐵蛋白(參見Fishman JB等人(1987)J.Neurosci 18:299-304)及胰島素樣生長因子1及2(參見Pardridge WM(1986)Endocrine Rev.7:314-330及Duffy KR等人(1986)Metabolism 37:136-140)經由受體介導之轉胞吞作用橫穿BBB。因此，此等分子之受體為本發明之治療用抗體提供使用所謂"經載體化"抗體以進入大腦的可能方式(參見Pardridge WM(1999)Advanced Drug Delivery Review 36:299-321)。舉例而言，已展示運鐵蛋白受體之抗體以動力學方式轉運至大腦實質中(參見Friden PM等人(1991)PNAS 88:4771-4775及Friden PM等人(1993)Science 259:373-377)。因此，一種可能之方法為產生諸如上文所述之雙特異性抗體或雙特異性片段，其中第一特異性係針對如上所述之含有β-澱粉狀蛋白殘基28-35之β-澱粉狀蛋白肽抗原決定基且第二特異性係針對位於BBB處之轉運受體，例如第二特異性針對運鐵蛋白轉運受體。

本發明所設想之其他雙特異性抗體包括雙特異性抗體或其雙特異性片段，其具有針對β-澱粉狀蛋白之第一特異性及針對補體路徑活化子(例如(但不排除其他)：補體因子，諸如補體因子D)之第二特異性，目的在於抑制其活性。

本發明之多特異性抗原結合蛋白質包括具有針對β-澱粉狀蛋白(諸如如上所述含有β-澱粉狀蛋白殘基28-35之β-澱粉狀蛋白肽之抗原決定基)之第一特異性，針對位於BBB或血液視網膜障壁之轉運受體之第二特異性及針對補體路徑活化子之第三特異性的蛋白質。

1.2抗體片段及其他蛋白質構築體，諸如結構域

在本發明之某些實施例中，提供治療用抗體，其為抗原結合片段。該等片段可為完整及/或人類化及/或嵌合抗體之功能抗原結合片段，諸如上文所述之抗體之Fab、Fd、Fab'、F(ab')₂ 、Fv、ScFv片段。缺少恆定區之片段缺少藉由經典路徑使補體活化之能力或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。傳統上，該等片段係藉由完整抗體之蛋白水解消化(例如藉由木瓜蛋白酶消化)產生(例如，參見WO 94/29348)，但可自經重組轉型之宿主細胞直接產生。關於ScFv產生，參見Bird等人；(1988)Science,242,423-426。此外，可使用如下文所述之多種工程化技術來製造抗體片段。

Fv片段似乎具有比Fab片段低之兩條鏈之相互作用能。為使V_H 與V_L 結構域之締合穩定，將其使用肽(Bird等人，(1988)Science 242,423-426;Huston等人，PNAS,855879-5883)、二硫橋(Glockshuber等人，(1990)Biochemistry,29,1362-1367)及"球洞(knob in hole)"突變(Zhu等人(1997)，Protein Sci.,6,781-788)來連接。

可藉由熟習此項技術者熟知之方法來製造ScFv片段，參見Whitlow等人(1991)Methods companion Methods Enzymol,2,97-105及Huston等人(1993)Int.Rev.Immunol 10,195-217。ScFv可在細菌細胞(例如大腸桿菌)中產生但更通常在真核細胞中產生。ScFv之一缺點在於產物為一價，其防止歸因於多價結合之親合力增加及其較短半衰期。克服此等問題之嘗試包括藉由化學偶合由含有額外C末端半胱胺酸之ScFv(Adams等人(1993)Can.Res53,4026-4034及McCartney等人(1995)Protein Eng. 8,301-314)或藉由含有未配對C末端半胱胺酸殘基之ScFv的自發位點特異性二聚作用(參見Kipriyanov等人(1995)Cell. Biophys 26,187-204)產生二價(ScFv')₂ 。或者，可藉由將肽連接子縮短至3至12個殘基之間迫使ScFv形成多聚體來形成"雙功能抗體"，參見Holliger等人PNAS(1993),90,6444-6448。縮短連接子還可進一步產生ScFv三聚體("三功能抗體"，參見Kortt等人(1997)Protein Eng,10,423-433)及四聚體("四功能抗體"，參見Le Gall等人(1999)FEBS Lett,453,164-168)。亦可藉由與蛋白質二聚基元基因融合來達成二價ScFV分子之構建以形成"微型抗體"(參見Pack等人(1992)Biochemistry 31,1579-1584)及"微型功能抗體"(參見Hu等人(1996),Cancer Res. 56,3055-3061)。亦可藉由以第三肽連接子連接兩個ScFv單元來產生ScFv-Sc-Fv串聯((ScFV)₂ )，參見Kurucz等人(1995)J.Immol. 154,4576-4582。可經由兩個單鏈融合產物(其係由來自一個抗體之V_H 域藉由短連接子連接至另一抗體之V_L 域組成)之非共價締合而產生雙特異性雙功能抗體，參見Kipriyanov等人(1998),Int.J.Can 77,763-772。可藉由引入如上文所述之二硫橋或"球洞"突變或藉由形成單鏈雙功能抗體(ScDb)(其中經由肽連接子來連接兩個雜交ScFv片段)來增強該等雙特異性雙功能抗體之穩定性，參見Kontermann等人(1999)J.Immunol.Methods 226 179-188。例如，藉由使ScFv片段與IgG分子之CH3域或經由鉸鏈區與Fab片段融合來獲得四價雙特異性分子，參見Coloma等人(1997)Nature Biotechnol. 15,159-163。或者，藉由雙特異性單鏈雙功能抗體之融合來產生四價雙特異性分子(參見Alt等人，(1999)FEBS Lett 454,90-94)。亦可藉由使用含有螺旋-環-螺旋基元之連接子使ScFv-ScFv串聯(DiBi微型抗體，參見Muller等人(1998)FEBS Lett 432,45-49)二聚化或使以阻止分子內配對定向的含有四個抗體可變域(V_H 及V_L )之單鏈分子(串聯雙功能抗體，參見Kipriyanov等人，(1999)J.Mol.Biol. 293,41-56)二聚化來形成較小四價雙特異性分子。可藉由Fab'片段之化學偶合或藉由經由白胺酸拉鏈之雜二聚作用來產生雙特異性F(ab')2片段(參見Shalaby等人，(1992)J.Exp.Med. 175,217-225及Kostelny等人(1992)，J.Immunol. 148,1547-1553)。亦可獲得經分離之V_H 及V_L 結構域，參見US 6,248,516、US 6,291,158、US 6,172,197。

短語"免疫球蛋白單一可變域"係指無關於不同V區或V域而特異性結合抗原或抗原決定基之抗體可變域(V_H 、V_HH 、V_L )。免疫球蛋白單一可變域可以一定形式(例如同質多聚體或異源多聚體)與其他不同可變區或可變域一起存在，其中藉由單一免疫球蛋白可變域之抗原結合不需要其他區域或結構域(亦即其中免疫球蛋白單一可變域無關於額外可變域而結合抗原)。在術語在本文中使用時，"結構域抗體"或"dAb"與能夠結合至抗原之"免疫球蛋白單一可變域"相同。免疫球蛋白單一可變域可為人類抗體可變域，且亦包括來自諸如齧齒動物之其他物種之單一抗體可變域(例如，如WO 00/29004所揭示之護士鯊及駱駝科V_HH dAb)。駱駝科V_HH 為源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝及原駝之物種之免疫球蛋白單一可變域多肽，其產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體。可根據此項技術中可獲得之標準技術將該等V_HH 域人類化且仍認為該等結構域為本發明之"結構域抗體"。本文中所使用之"V_H "包括駱駝科V_HH 域。

抗原結合片段亦可藉助於在諸如結構域之非抗體蛋白質骨架上排列一或多個CDR來提供。結構域可無關於不同可變區或可變域而特異性結合抗原或抗原決定基。其可為如上所述之結構域抗體或可為選自由下列各物組成之群之骨架衍生物的結構域：CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、Affibody、親合體(avimer)、GroEl、運鐵蛋白、GroES及纖維結合蛋白/adnectin，使該結構域經受蛋白質工程化以獲得與不同於天然配位體之抗原的結合。

在此上下文中術語"結構域"係指摺疊蛋白質結構，其具有無關於蛋白質剩餘部分之三級結構。一般而言，結構域造成不連續之蛋白質功能特性，且在許多情況下可經添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失蛋白質及/或結構域剩餘部分之功能。"單一可變域"為包含抗體可變域之序列特徵的摺疊多肽域。因此其包括完全抗體可變域及經修飾可變域(例如其中一或多個環經不為抗體可變域特徵之序列置換)；或經截短或包含N-或C-末端延伸之抗體可變域，以及保留至少全長結構域之結合活性及特異性之可變域摺疊片段。

1.3雜共軛抗體

雜共軛抗體為亦形成本發明之一實施例之衍生物。雜共軛抗體包含使用任何便利交聯法形成之兩個共價接合抗體。參見US 4,676,980。

1.4其他修飾

咸信抗體Fc區與各種Fc受體(FcγR)之間的相互作用介導抗體之效應功能，其包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體之固定、噬菌作用及抗體之半衰期/清除率。可視所需效應特性來進行本發明抗體之Fc區之各種修飾。詳言之，本質上缺少a)藉由經典路徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性之功能的人類恆定區包括揭示於EP 0307434(WO 8807089)、EP 0629 240(W09317105)及WO 2004/014953中的含有特定突變(如例如位置234、235、236、237、297、318、320及/或322處之突變)之IgG4恆定區、IgG2恆定區及IgG1恆定區。已分別描述重鏈恆定區CH2域內之殘基235或237處(Kabat編號，EU指數系統)之突變降低與FcγRI、FcγRII及 FcγRIII之結合且因此降低抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Duncan等人Nature 1988,332;563-564；Lund等人J. ImmunoL. 1991,147;2657-2662；Chappel等人PNAS 1991,88;9036-9040；Burton及Woof,Adv. Immunol. 1992,51;1-84；Morgan等人，Immunology 1995,86;319-324；Hezareh等人，J. Virol. 2001,75(24);12161-12168)。此外，一些報導亦描述在募集或介導補體依賴性細胞毒性(CDC)中涉及此等殘基中之一些(Morgan等人，1995；Xu等人，Cell. Immunol. 2000;200:16-26；Hezareh等人，J. Virol. 2001,75(24);12161-12168)。因此，殘基235及237皆突變為丙胺酸殘基(Brett等人Immunology 1997,91;346-353;Bartholomew等人Immunology 1995,85;41-48及WO 9958679)來降低補體介導及FcγR介導之效應。可將包含此等恆定區之抗體稱為"非溶胞"抗體。

吾人可將補救受體結合抗原決定基併入抗體中來增加血清半衰期，參見US 5,739,277。

存在五種目前識別之人類Fcγ受體，FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及新生FcRn。Shields等人(2001)J.Biol.Chem 276,6591-6604證明常見IgGl殘基組涉及於所有FcγR結合中，而FcγRII及FcγRIII利用此常見組以外之不同位點。一組IgGl殘基在改變為丙胺酸：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297及Pro-239時降低與所有FcγR之結合。所有均在IgG CH2域中且在鉸鏈接合CH1及CH2附近叢集。FcγRI僅利用常見IgGl殘基組來結合，而FcγRII及FcγRIII除常見組以外亦與不同殘基相互作用。一些殘基之改變僅降低與FcγRII(例如Arg-292)或FcγRIII(例如Glu-293)之結合。一些變異體展示與FcγRII或FcγRIII改良之結合，但不影響與其他受體之結合(例如，Seγ-267Ala改良與FcγRII之結合，但與FcγRIII之結合不受影響)。其他變異體展現與FcγRII或FcγRIII之改良結合，而降低與其他受體之結合(例如，Seγ-298Ala改良與FcγRIII之結合且降低與FcγRII之結合)。對於FcγRIIIa而言，最佳結合IgGl變異體在Seγ-298、Glu-333及Lys-334處具有經組合之丙胺酸取代。咸信新生FcRn受體涉及於保護IgG分子使免於降解且因此提高血清半衰期及橫穿組織之轉胞吞作用中(參見Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16. 29-57及Ghetie等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。確定直接與人類FcRn相互作用之人類IgGl殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435。

本發明之治療用抗體可併入以上恆定區修飾中之任一者。

在一特定實施例中，治療用抗體本質上缺少以下功能：a)藉由經典路徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性。在一更特定實施例中，本發明提供具有以上詳述殘基變化中之任一者(或多者)之本發明之治療用抗體來改變半衰期/清除率及/或諸如ADCC及/或補體依賴性細胞毒性及/或補體溶胞之效應功能。

在本發明之另一態樣中，治療用抗體具有在位置235(例如L235A)及237(例如G237A)處(根據以Kabat概述之EU流程編號)具有丙胺酸(或其他斷裂)取代之同型人類IgGl恆定區。

本發明之其他衍生物包括本發明抗體之糖基化變異體。已知在恆定區中保守位置處之抗體的糖基化作用對抗體功能，尤其效應功能(諸如上文所述之彼等)具有顯著作用，參見(例如)Boyd等人(1996),Mol.Immunol. 32,1311-1318。涵蓋本發明之治療用抗體之糖基化變異體，其中添加、取代、缺失或修飾一或多個碳水化合物部分。天冬醯胺酸-X-絲胺酸或天冬醯胺酸-X-蘇胺酸基元之引入產生供碳水化合物部分之酶附著的潛在位點且因此可用以操縱抗體之糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry 40,8868-8876中，經由使用β-1,4-半乳醣基轉移酶及/或α,2,3唾液酸轉移酶再次半乳糖苷化及/或再次唾液酸化之方法來增加TNFR-IgG免疫黏附素之末端唾液酸化。咸信增加末端唾液酸化能提高免疫球蛋白之半衰期。與大多數醣蛋白一樣，抗體通常實際上係以糖型混合物產生。當在真核，尤其哺乳動物細胞中產生抗體時，此混合物特別明顯。已開發多種方法來製造所定義之糖型，參見Zhang等人Science(2004),303,371；Sears等人，Science,(2001)291,2344；Wacker等人(2002)Science,2981790；Davis等人(2002)Chem. Rev. 102,579；Hang等人(2001)Acc. Chem. Res 34,727。因此，本發明係關於複數種如本文所述之治療用抗體(其可能為IgG同型，例如IgG1)，其包含指定數目(例如7或更少，例如5或更少，諸如2或單一)之該等抗體之糖型。

本發明之衍生物亦包括與非蛋白聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚環氧烷)偶合之本發明治療用抗體。蛋白質與PEG之共軛為一種已確立之技術，其可用於提高蛋白質之半衰期，以及降低蛋白質之抗原性及免疫原性。使用完整抗體以及Fab'片段來研究具有不同分子重量及類型(直鏈或支鏈)之PEG化作用之用途。參見Koumenis I.L.等人(2000)Int.J.Pharmaceut. 198:83-95。一特定實施例包含不具有以下效應功能的偶合至PEG之本發明之抗原結合片段(諸如Fab片段或scFv)：a)藉由經典路徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性。

2.產生方法

本發明抗體可於轉殖基因生物體中產生，該等轉殖基因生物體係諸如山羊(參見Pollock等人(1999)，J. Immunol.Methods 231：147-157)、雞(參見MorroW KJJ(2000)Genet. Eng. News20：1-55)、小鼠(參見如上Pollock等人)或植物(參見Doran PM,(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11,199-204,MaJK-C(1998),Nat.Med.4;601-606,Baez J等人，BioPharm(2000)13：50-54,Stoger E等人；(2000)PlantMol.Biol.42：583-590)。亦可藉由化學合成來產生抗體。然而，通常使用熟習此項技術者所熟知之重組細胞培養技術來產生本發明抗體。將編碼抗體之聚核苷酸分離且插入可複製載體中，諸如用於在宿主細胞中進一步繁殖或表現之質體中。一適用表現系統為麩胺酸合成酶系統(諸如由Lonza Biologics市售)，尤其當宿主細胞為CHO或NS0時(參見下文)。使用習知程序(例如寡核苷酸探針)易於將編碼抗體之聚核苷酸分離且定序。可使用之載體包括質體、病毒、噬菌體、轉座子、微型染色體，其中質體為一典型實施例。一般而言，該等載體另外包括操作性連接至輕鏈及/或重鏈聚核苷酸以有利於表現之信號序列、複製起點、一或多個標誌基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。編碼輕鏈及重鏈之聚核苷酸可插入獨立載體中且同時或相繼引入(例如藉由轉型、轉染、電穿孔或轉導)同一宿主細胞中或(若需要)重鏈及輕鏈皆可在該引入前被插入同一載體中。

熟習此項技術者將立即明白：由於遺傳編碼之冗餘，亦可獲得本文中所揭示之彼等之替代聚核苷酸，其將編碼本發明之多肽。

2.1信號序列

本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)可能以與異源信號序列形成的融合蛋白質形式產生，該異源信號序列在成熟蛋白質之N末端具有特異性裂解位點。應藉由宿主細胞來識別及加工信號序列。對於原核宿主細胞而言，信號序列可為鹼性磷酸酶、青黴素酶或熱穩定性腸毒素II前導子。對於酵母分泌而言，信號序列可為酵母轉化酶前導子、α因子前導子或酸性磷酸酶前導子，例如參見WO 90/13646。在哺乳動物細胞系統中，可獲得病毒分泌前導子(諸如單純疱疹gD信號)及原生免疫球蛋白信號序列(諸如人類Ig重鏈)。通常信號序列係以閱讀框架形式接合至編碼本發明抗體之聚核苷酸。

2.2複製起點

複製起點在此項技術中係熟知的，其中pBR322適合於大多數革蘭氏陰性細菌、2μ質體適用於大多數酵母且各種病毒起點(諸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用於大多數哺乳動物細胞。一般而言，完整哺乳動物表現載體無需SV40複製起點組份。然而，可包括SV40 ori，因為其含有早期啟動子。

2.3選擇標誌

典型選擇基因編碼蛋白質，該等蛋白質(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline)之抗性或(b)補充營養不足或供應在複合培養基中不可獲得之營養物。選擇機制可包括使不含有載體之宿主細胞生長停滯。由於(例如)共同傳遞之選擇標誌所賦予的藥物抗性，故細胞(以編碼本發明之治療用抗體之基因成功轉型)存活。一實例為DHFR選擇系統，其中轉型物係於DHFR陰性宿主菌株中產生(例如，參見Page及Sydenham 1991 Biotechnology 9:64-68)。在此系統中，DHFR基因係與本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)聚核苷酸序列共同傳遞，且接著藉由核苷撤回來選擇DHFR陽性細胞。若需要，亦採用DHFR抑制劑甲胺喋呤來選擇具有DHFR基因擴增之轉型物。藉由將DHFR基因操作性連接至本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)編碼序列或其功能衍生物，DHFR基因擴增致使所關注之所需抗原結合蛋白質(例如抗體)序列並行擴增。CHO細胞為用於此DHFR/甲胺喋呤選擇之尤其適合之細胞株且使用DHFR系統來擴增及選擇宿主細胞之方法在此項技術中明確知曉，參見Kaufman R.J.等人J.Mol.Biol.(1982)159,601-621，關於論述，參見Werner RG,Noe W,Kopp K.Schluter M,"Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals"，Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80,1998 Aug。另一實例為麩胺酸酯合成酶表現系統(Bebbington等人Biotechnology 1992第10卷第169頁)。用於酵母之合適選擇基因為trp1基因；參見Stinchcomb等人Nature 282,38,1979。

2.4啟動子

用於表現本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之合適啟動子係操作性連接至編碼抗原結合蛋白質(例如抗體)之DNA/聚核苷酸。原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸及雜合啟動子(諸如Tac)。適用於在酵母細胞中表現之啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛3磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶及葡萄糖激酶。誘導性酵母啟動子包括乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及造成氮新陳代謝或麥芽糖/半乳糖利用之酶。

用於在哺乳動物細胞系統中表現之啟動子包括RNA聚合酶II啟動子，其包括病毒啟動子(諸如多瘤病毒、禽痘及腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥肉瘤病毒、細胞巨化病毒(詳言之立即早期基因啟動子)、反轉錄病毒、肝炎B病毒、肌動蛋白、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子及早期或晚期猿病毒40)及非病毒啟動子(諸如EF-1α)(Mizushima及Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322)。啟動子之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之合適相容性。

2.5強化子元件

適當時，(例如)用於在高級真核生物中表現時，可包括額外強化子元件來替代見於位於上述啟動子中之元件或與該等元件一起。合適哺乳動物強化子序列包括來自血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、金屬硫蛋白及胰島素之強化子元件。或者，吾人可使用來自真核細胞病毒之強化子元件，諸如SV40強化子、細胞巨化病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子、桿狀病毒強化子或鼠類IgG2a基因座(參見WO 04/009823)。儘管該等強化子通常位於載體上啟動子上游位點處，但其亦可位於其他處(例如)位於多聚腺苷酸化信號之未轉譯區或下游內。強化子之選擇及定位可基於與用於表現之宿主細胞之合適相容性。

2.6多聚腺苷酸化/終止

在真核系統中，多聚腺苷酸化信號係操作性連接至編碼本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之聚核苷酸。該等信號通常位於開放閱讀框架之3'處。在哺乳動物系統中，非限制性實例信號包括彼等源自生長激素、伸長因子1α及病毒(例如SV40)基因或反轉錄病毒長末端重複之信號。在酵母系統中，多聚腺苷酸化/終止信號之非限制性實例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)及乙醇脫氫酶1(ADH)基因之彼等信號。在原核系統中，通常不需要多聚腺苷酸化信號且其通常轉而採用較短且更為限定之終止序列。多聚腺苷酸化/終止序列之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之合適相容性。

2.7用於增強產率之其他方法/元件

除上述以外，可用以增強產率之其他特徵包括染色質重塑元件、內含子及宿主細胞特異性密碼子修飾。其本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之密碼子選擇可經修飾以容納宿主細胞之密碼子偏好使得增加轉錄及/產物產率(例如Hoekema A等人Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24)。密碼子之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之合適相容性。

2.8宿主細胞

用於選殖或表現編碼本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之載體的合適宿主細胞為原核、酵母或更高等真核細胞。合適原核細胞包括真細菌，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichi)，例如大腸桿菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325)、腸桿菌(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克氏桿菌變形桿菌屬(Klebsiella Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌屬(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌屬(Serratia marcescans))及志賀氏菌屬(Shigella))以及桿狀菌(諸如枯草桿菌(B.subtilis)及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis))(參見DD 266 710)、假單胞菌屬(例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))及鏈球菌屬(Streptomyces)。在酵母宿主細胞中，亦涵蓋釀酒酵母菌屬(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、刻魯維拉菌屬(Kluyveromyces)(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、子囊菌類酵母(yarrowia)(EP402,226)、甲醇酵母(Pichia Pastoris)(EP183,070，亦參見Peng等人J.Biotechnol. 108(2004)185-192)、念株菌屬(Candida)、里氏木黴屬(Trichoderma reesia)(EP244,234)、青黴素、彎頸黴(Tolypocladium)及麯黴屬(Aspergillus)宿主(例如構巢麯黴(A.nidulans)及黑麯黴(A.niger))。

儘管本發明特別涵蓋原核及酵母宿主細胞，但通常本發明之宿主細胞為脊椎動物細胞。合適脊椎動物宿主細胞包括哺乳動物細胞，諸如COS-1(ATCC第CRL 1650號)COS-7(ATCC CRL 1651)、人類胚腎株293、PerC6(Crucell)、幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC第CRL 10314號)、293(ATCC第CRL 1573號)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1，ATCC第CCL 61號，DHFR除去CHO細胞株，諸如DG44(Urlaub等人，Somat Cell Mol Genet(1986)第12卷第555-566頁)、尤其適用於懸浮液培養之彼等CHO細胞株、小鼠塞爾托利(Sertoli)細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞(ATCCCRL-1587)、HELA細胞、犬科腎細胞(ATCC CCL 34)、人類肺細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞(例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0、Y0)。

因此，在本發明之一實施例中，提供經穩定轉型之宿主細胞，其包含編碼如本文所述之治療用抗體重鏈及/或輕鏈之載體。通常該等宿主細胞包含編碼輕鏈之第一載體及編碼該重鏈之第二載體。

該等宿主細胞亦可經進一步工程化或調適以改變本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之品質、功能及/或產率。非限制性實例包括特定修飾(例如糖基化)酶及蛋白質摺疊伴隨蛋白之表現。

2.9細胞培養方法

可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來培養以編碼本發明之治療用抗原結合蛋白質(例如抗體)之載體轉型之宿主細胞。可將宿主細胞於旋轉燒瓶、搖瓶、滾瓶、波反應器(例如來自wavebiotech.com之System 1000)或中空纖維系統中培養，但對於大規模生產而言，較佳將攪拌反應槽或袋反應器(例如Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)特別用於懸浮液培養。通常攪拌槽經調適以便使用(例如)噴霧器、隔板或低剪切葉輪來通風。對於氣泡塔及氣升反應器而言，可使用空氣或氧氣泡直接通風。當在無血清培養基中培養宿主細胞時，以細胞保護劑(例如普流尼克(pluronic)F-68)來補充該培養基以有助於防止由於通風過程造成之細胞損傷。視宿主細胞特徵而定，可能使用微載體作為固著依賴性細胞株之生長基質或細胞可能適於懸浮液培養(其為典型的)。宿主細胞(尤其脊椎動物宿主細胞)之培養可利用多種操作模式，例如分批、分批饋入、重複分批法(參見Drapeau等人(1994)cytotechnology 15:103-109)、擴展分批法或灌注培養。儘管可在含血清培養基(例如包含胎牛血清(FCS)之培養基)中培養經重組轉型之哺乳動物宿主細胞，但較佳在無血清培養基(諸如Keen等人(1995)Cytotechnology 17:153-163中所揭示之培養基)或可購得培養基(諸如ProCHO-CDM或UltraCHO^TM (Cambrex NJ,USA))(若需要則以能源(諸如葡萄糖)及合成生長因子(諸如重組胰島素)補充)中培養該等宿主細胞。宿主細胞之無血清培養可需要彼等細胞經調適在無血清條件中生長。調適方法為在含血清培養基中培養該等宿主細胞且重複將80%培養基更換為無血清培養基以使宿主細胞學會適應無血清條件(例如參見Scharfenberg K等人(1995)Animal Cell technology:Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.等人編)，第619-623頁，Kluwer Academic publishers)。

可將分泌至培養基中之本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)回收且使用多種技術自培養基純化以提供適於所欲用途之純化度。舉例而言，本發明之治療用抗原結合蛋白質(例如抗體)用於治療人類患者之用途通常要求在與包含治療用抗原結合蛋白質(例如抗體)之培養基比較時，如還原SDS-PAGE所測定至少95%純度，更通常98%或99%純度。在第一種情況下，通常使用離心，隨後進行(例如)使用微過濾、超濾及/或深度過濾澄清上清液之步驟來自培養基移除細胞碎片。或者，可無需事先離心而藉由微過濾、超濾或深度過濾來收集抗原結合蛋白質(例如抗體)。可使用多種其他技術，諸如透析及凝膠電泳法及層析技術(諸如羥磷灰石(HA)、親和力層析(視情況包括親和力標記系統，諸如聚組胺酸)及/或疏水性相互作用層析(HIC，參見US 5,429,746))。在一實施例中，在多個澄清步驟後，使用蛋白質A或G親和層析，隨後進行進一步層析步驟(諸如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排斥層析及硫酸銨沈積)來俘獲本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)。通常，亦採用多種病毒移除步驟(例如使用(例如)DV-20過濾器進行奈米過濾)。此等多個步驟後，提供包含至少10mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)本發明抗體之經純化(通常單株)製劑且因此形成本發明之一實施例。可藉由超速離心產生100mg/ml或100mg/ml以上之濃度。合適地，該等製劑大體上不含聚集形式之本發明抗體。

細菌系統特別適合於抗體片段之表現。該等片段侷限於細胞內或胞間質內。可根據熟習此項技術者已知之方法將不溶性胞間質蛋白質萃取且再摺疊以形成活性蛋白質，參見Sanchez等人(1999)J.Biotechnol. 72,13-20及Cupit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol,29,273-277。

3.醫藥組合物

如上所述之本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之經純化製劑(特定單株製劑)可被併入用於治療諸如上文概述之彼等人類疾病及病症的醫藥組合物中。通常，該等組合物另外包含已知且可接受之醫藥實踐所需要之醫藥學上可接受之(亦即惰性)載劑，參見(例如)Remingtons Pharmaceutical Sciences，第16版，(1980),Mack Publishing Co。該等載劑之實例包括經殺菌載劑，諸如生理食鹽水、林格氏溶液(Ringers solution)或右旋糖溶液，其經合適緩衝液(諸如三水合乙酸鈉)緩衝至醫藥學上可接受之pH值(諸如在5至8範圍內之pH值)。注射用醫藥組合物(例如藉由靜脈內、腹膜內、皮內、皮下、肌肉內、門靜脈內或藉由以局部或眼周塗覆於眼或玻璃體內注射至眼內而局部傳遞至眼)或連續輸液合適地不含可見顆粒物質且可包含1mg至10g治療用抗原結合蛋白質(例如抗體)，通常5mg至1g，更詳言之5mg至25mg或50mg抗原結合蛋白質(例如抗體)。該等醫藥組合物之製備方法為熟習此項技術者所熟知。在一實施例中，醫藥組合物包含1mg至10g呈單位劑型之本發明之治療用抗原結合蛋白質(例如抗體)視情況連同使用說明書一起。本發明之醫藥組合物可根據熟習此項技術者所熟知或顯而易見之方法經凍乾(冷凍乾燥)以便在投藥前復水。若本發明之實施例包含具有IgGl同型之本發明抗體，則可添加金屬離子(包括銅)螯合劑，諸如檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組胺酸至醫藥組合物中來降低此同型抗體之金屬介導之降解度，參見EP 0612251。醫藥組合物亦可包含增溶劑(諸如精胺酸鹼)、清潔劑/抗凝劑(諸如聚山梨醇酯80)及惰性氣體(諸如氮)來置換小瓶頂部空間之氧。

投與本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)之有效劑量及治療方案一般係由經驗確定且視諸如患者年齡、體重及健康狀態及待治療疾病或病症之因素而定。該等因素在主治醫生能力範圍之內。選擇適當劑量之指導可見於(例如)Smith等人(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy,Raven Press,New York中，但劑量一般在1mg至10g。在一實施例中，治療人類患者之給藥方案為每週一次或每兩週一次皮下投與1mg至1g本發明之治療用抗體或藉由每1或2月靜脈內輸液。該劑量對應於0.014-140mg/kg，諸如0.014-14mg/kg。本發明組合物亦可預防性使用。

組合物亦可藉由局部施用、玻璃體內注射或眼周投藥(亦即經由眼球後、眼球周、筋膜囊下或結膜下注射鞏膜下投藥)來更局部地傳遞至眼。全身投藥可足以經由被動(例如靜脈內投與治療用抗體)來達成脈絡膜疣減少。其他局部投藥途徑可使得治療用抗體較易於以較低劑量達到眼後段。已描述局部施用使得在兔模型中允許抗體片段滲透至眼後部(Williams KA,Bereton HM,Farrall A,Standfield SD,Taylor SD,Kirk LA,Coster DJ (2005) Eye 19;910-913)。玻璃體內注射抗體片段或全單株抗體已經描述且使AMD患者良好耐受產品蘭尼單抗(ranibizumab)及貝伐單抗(bevacizumab)。亦可藉由玻璃體內植入物來投與治療用抗體。眼球後及眼球周注射可使用特殊23至26規格針來達成且侵襲性低於玻璃體內注射。筋膜囊下注射使得組合物與鞏膜接觸較長時段，其有助於滲透至眼後部。已於兔模型中描述緊鄰結膜下注射蛋白質且其使得分子更直接擴散穿過鞏膜到達眼後段。亦可使用持續釋放藥物傳遞系統，其使得在較長時段內釋放物質至眼中或眼周，以便給藥可較不頻繁。該等系統包括可以治療用組合物填充或塗覆之微胞、凝膠、水凝膠、奈米顆粒、微囊或植入物。其可藉由注射或藉由先前所述之其他侵襲性較小途徑中任一者(亦即經由眼周或鞏膜下途徑)傳遞至眼玻璃體中。該等持續釋放系統及局部傳遞途徑之實例包括熱敏感性緩慢釋放水凝膠以供鞏膜下投與或玻璃體內投與靶向視網膜後部及RPE層之基於奈米顆粒的調配物(Janoira KG,Gunda S,Boddu SHS,Mitra AK,(2007)Expert Opin Drug Deliv 4:371-388;Birch DG,Liang FQ,(2007)Int J Nanomed 2:65-77)。傳遞系統與局部投藥途徑之許多其他組合為可能的且可考慮用於治療用抗體組合物。抗體亦可藉由物理設備(諸如經由離子導入療法)來傳遞(Association for Research in Vision and Ophthalmology,2008,Annual meeting,4月27日-5月1日,來自EyeGate Pharma:Blalock等人，& Ruiz-Perez等人之Posters #98/A125 & #1813/D693)。

4.臨床用途

應瞭解以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之疾病包括阿茲海默氏病、輕度認知障礙、唐氏症候群、伴有Dutch型β-澱粉樣變性病之遺傳性大腦出血、大腦β-澱粉狀蛋白血管病變及各種類型之退化性癡呆(諸如與帕金森氏病、進行性核上眼神經麻痹症、皮層基底退化及擴散性路易體型阿茲海默氏病相關之彼等癡呆)、年齡相關之黃斑退化(AMD)、"青光眼型"病及Aβ依賴性白內障形成。

在本發明之一實施例中，以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之疾病為阿茲海默氏病。

在本發明之另一實施例中，以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之疾病為年齡相關之黃斑退化(AMD)、"青光眼型"疾病或Aβ依賴性白內障形成。

儘管本發明已主要關於人類疾病或病症之治療來描述，但本發明亦可應用於治療非人類哺乳動物之類似疾病或病症。

實例

特異於人類β澱粉狀蛋白之小鼠單株抗體之產生

最初以在N末端與PPD偶合之肽CGGGNKGAIIGLMVGG(含有β-澱粉狀蛋白殘基27-38)(SEQ ID No:7)使一組小鼠免疫。此等小鼠之免疫反應係藉由獲取血清樣本且將其於ELISA中以同一肽之卵白蛋白共軛物測試來評定以測定經免疫小鼠之抗體力價。僅觀測到弱反應。在另一實驗中，經由腹膜內途徑以於RIBI佐劑中之10μg共軛至PPD(經純化蛋白質衍生物；Cambridge Research Biochemicals)的N末端偶合之CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG肽(含有β-澱粉狀蛋白殘基22-38)(SEQ ID No:73)使一組小鼠免疫。再次藉由在每次激發後7天獲取血清樣本且將其於ELISA中測試來評定此等小鼠之免疫反應以測定經免疫小鼠之抗體力價。小鼠在藉由以2.5μg肽共軛物激發達到最佳反應(基於最後兩個血清樣本中抗體力價之比較分析)後，挑選具有最佳抗體力價之小鼠且獲取脾臟用於產生融合瘤。融合瘤係藉由獲得脾臟細胞且使用PEG(聚乙二醇)法將其與骨髓瘤細胞融合而產生。接著將所得混合細胞群體濾出至96孔細胞培養盤中。

接著於FMAT(螢光微體積檢定技術)均質免疫檢定中篩檢包含於培養物上清液中之各表現抗體。由此篩檢級聯來鑑別29個陽性抗體，該等抗體對於被動吸附在聚苯乙烯珠粒上之卵白蛋白呈陰性，但對於下列各物呈陽性：(i)結合至聚苯乙烯珠粒之N末端經偶合之CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG(22-38)(SEQ ID No:73)卵白蛋白共軛物，(ii)結合至經抗生蛋白鏈菌素塗覆之聚苯乙烯珠粒之N末端生物素標記β-澱粉狀蛋白(1-40)肽，(iii)結合至經抗生蛋白鏈菌素塗覆之聚苯乙烯珠粒之C末端生物素標記β-澱粉狀蛋白(1-40)肽及(iv)結合至經抗生蛋白鏈菌素塗覆之聚苯乙烯珠粒之N末端生物素標記β-澱粉狀蛋白(24-34)肽，為VGSNKGAIIGL(SEQ ID No:8)之β-澱粉狀蛋白之殘基24-34。

分析所選抗體上清液樣本與如下所述β-澱粉狀蛋白(1-40)肽之結合動力學。

使用表面電漿共振檢定測定結合相互作用解離速率(kd)

使用Biacore A100儀器來提供29個經選擇抗體與β-澱粉狀蛋白(1-40)之相互作用的解離速率動力學。為此，以低含量N末端生物素標記β-澱粉狀蛋白(1-40)來衍生抗生蛋白鏈菌素Biacore感應晶片流動細胞。產生各抗體樣本之三條曲線，且將其與速率方程擬合來獲得解離速率。對於12個純系而言，不可能基於解離速率排序，因為使用所選實驗條件不可能量測解離速率。然而，在此等條件下，所有12個純系均展示至少10^-5 之解離速率(kd)。

人類β-澱粉狀蛋白結合ELISA

藉由ELISA再測試以上所鑑別之包含於融合瘤上清液中之29個抗體與人類β-澱粉狀蛋白(1-40)之結合。為使比較有效，使用IgG定量ELISA來測定包含於培養物上清液中之抗體濃度。為測定功能抗體同型，使用一組同型特異性偵測抗體來進行人類β-澱粉狀蛋白結合ELISA。所有29個抗體在此ELISA格式中均結合至人類β-澱粉狀蛋白(1-40)。可藉由用於IgGl、IgG2a或IgG2b之同型特異性二次抗體來鑑別各結合抗體純系之同型。在一種情況下，觀測到功能同型之混合物。

使用重疊肽藉由ELISA進行之抗原決定基定位

藉由選自初始篩檢且包含於融合瘤上清液中之29個抗體識別之抗原決定基係藉由ELISA，使用覆蓋β-澱粉狀蛋白1-42肽全序列之一組31,12聚體重疊肽來定位。所有肽均含有3個胺基C末端連接子(甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸)及末端生物素標記離胺酸殘基。

在4℃下將96孔免疫檢定盤以100μl每孔0.5微升之蒸餾水中之抗生蛋白鏈菌素(Sigma)塗覆隔夜。將培養盤洗滌三次(PBS/0.01%Tween 20)且在室溫下將孔以每孔250微升之PBS中3%BSA阻斷1小時。將培養盤洗滌三次且在室溫下添加100微升肽溶液(在PBS中1%BSA 0.1%Tween 20中每孔0.5微升)至三個重複孔中歷時3小時。亦製備僅DMSO之對照孔。洗滌培養盤三次且將100 μl 29融合瘤上清液(在1%BSA/0.1%Tween 20中稀釋至1/20)添加至所有孔中且在4℃下培育隔夜。洗滌培養盤三次且添加每孔100微升抗小鼠IgG抗體辣根過氧化酶共軛物(Amersham，在PBS中1%BSA，0.1%Tween20中1:2000稀釋)。將培養盤在室溫下培育一小時，洗滌三次且在室溫下使用每孔100微升四甲基聯苯胺(Sigma)受質歷時約5min來監控藍色之顯影而揭示偵測抗體之結合。停止反應且在450nm下讀取各孔之光學密度。

所有抗體均結合至含有基元KGAIIGLM之極類似區(等同於β-澱粉狀蛋白殘基28-35)(SEQ ID No:9)。

藉由表面電漿共振檢定測定結合動力學

使用Biacore 3000技術更詳細評定選自29個抗體組之8個單株抗體的β-澱粉狀蛋白結合親和力及動力學。於多株抗小鼠IgG抗體晶片表面上俘獲經純化之小鼠抗體製劑。將新鮮製備之人類β-澱粉狀蛋白1-40於HBS-EP緩衝液中稀釋且以4-500nM範圍內之濃度通過俘獲抗體表面歷時5分鐘。再觀測注射後解離歷時20分鐘。經由100mM H₃ PO₄ 脈衝來達成再生。顯示隨後之抗體俘獲及β-澱粉狀蛋白結合週期不受再生之影響。所有運作均為參照空白表面及空白緩衝液注射液之雙重運作。將所獲資料展示在表2中。

表2-八個經選擇純化抗體之Biacore親和力及動力學資料；所展示之KD值來自一個實驗

結果展示所有8個單株抗體之親和力相當，但16D4與其他純系相比展示低至少12至2.5倍之親和力。在此實驗中，剩餘7個抗體之間的KD值差異高達4.4倍。選擇此等純系中之兩者(5D1及6F6)來進一步擴大規模且以一式三份再測試。將此資料展示於表3中。

亦使用相同Biacore法來研究6F6與人類及小鼠β-澱粉狀蛋白(1-40)及β-澱粉狀蛋白(1-42)之結合。6F6以類似值結合至所有此等肽。

與細胞表現之澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)結合

β-澱粉狀蛋白包含藉由蛋白水解裂解稱為澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)之I型跨膜前驅蛋白而形成的肽。因為APP具有較大胞外域，故與此蛋白質之結合可能起始抗體依賴性細胞毒性反應(ADCC)。

基於FMAT^TM ABI8200之檢定

使用螢光微量檢定技術(FMAT；Cellular Detection System 8200)來進行表現於HEK 293T細胞上之澱粉狀蛋白前驅蛋白與以上所選8個抗體的以細胞為主之結合檢定。在轉染後48小時收集經模擬轉染或以編碼全長人類APP之質體轉染的HEK293T細胞。將經轉染細胞以融合瘤上清液之各種稀釋液或以經純化之對APP胞外域呈陽性的對照抗體LN27(Zymed)小鼠IgG及僅識別β-澱粉狀蛋白肽游離N末端之陰性對照抗體培育(家用試劑)。使用經FMAT藍標記之抗小鼠抗體揭示抗體結合且使用細胞偵測系統8200偵測抗體結合。將由經模擬轉染之細胞獲得之背景信號自經APP轉染之細胞中減去。與陽性對照單株抗體LN27相比，7個純系展示不與表現於HEK293T細胞上之APP結合。在研究經模擬轉染之HEK293T細胞之結果時，一個純系(5C9)表明與HEK293T細胞非特異性結合之證據使解譯此特定純系之APP結合能力困難化。

與轉殖基因小鼠大腦切片中澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)之結合

藉由IHC研究2個月大TASTPM(Howlett等人2008)或12個月大TAS10小鼠之腦切片。將切片以85%甲酸處理且染色以供全長APP結合。在所選年齡下，各別小鼠不展示任何澱粉狀蛋白斑塊沈積物，但一些染色可能歸因於可使用此技術獲得之胞內澱粉狀蛋白。6F6在此等切片中不展示染色，而全長APP之對照抗體(Zymed)確實展示染色。

Fab片段形式之人類β-澱粉狀蛋白結合ELISA

使用固定於珠粒上之木瓜蛋白酶(Pierce #20341)，藉由標準蛋白酶裂解來產生6F6之Fab片段。進行ELISA來將經純化之6F6 IgG之Fab片段結合至固定於ELISA盤上之人類Aβ肽(1-40)。來自單一ELISA實驗之結果展示6F6之Fab片段仍能夠結合至Aβ肽(1-40)。

6F6與來自人類志願者血漿樣本中之原生人類澱粉狀蛋白之結合

藉由靜脈穿刺將來自健康志願者之全血(HVT)收集在K2EDTA管中且立即將管置放在冰上。藉由在4℃下以2000×g旋轉15分鐘在30分鐘內處理血樣以獲得血漿。接著根據製造者說明書，將蛋白酶抑制劑(Roche完全蛋白酶抑制劑混合液，目錄號：11 973 580 001，Roche Applied Science)添加至血漿中。接著將血漿等分試樣在低於-70℃下冷凍，隨後分析。

檢定係以96孔ECL免疫檢定格式(Meso Scale Discovery,MSD)使用6F6作為俘獲抗體。簡言之，將6F6點塗於96孔MSD培養盤上；接著添加樣本(檢定校正器，陰性對照，QC及測試樣本)。培育後，將未結合之材料沖走且接著將偵測抗體(生物素標記4G8(特異於β-澱粉狀蛋白抗原決定基17-24))應用於培育。其後在洗滌後添加抗生蛋白鏈菌素-磺基-TAG。在此培育末，應用洗滌步驟。將MSD讀取緩衝液T添加至培養盤中使得能夠在MSD Sector Imager 6000上讀取電致化學發光信號。使用以已知濃度之Aβ1-42確立之檢定標準曲線由MSD信號反計算分析物濃度。檢定定量之下限為78.1pg/mL。

表4概述如藉由上述6F6-4G8抗體檢定量測之10HVT血漿樣本之Aβ濃度。所有樣本係以一式兩份測試。

在原生及變性條件下，藉由西方墨點法與Aβ1-42結合

研究經純化6F6單株抗體與各種形式之Aβ1-42之結合且在原生或變性SDS-PAGE下分析其。使用新製之Aβ1-42或將其在4℃下經PRFF12預處理隔夜，在37℃下於PBS中預處理隔夜或在37℃下於10mMHC1中預處理隔夜。製劑係藉由SDS-PAGE分離且使用6F6抗體或6E10(特異於人類Aβ1-16之抗體；商用試劑，Eurogentec)及5G5(特異於Aβ1-42之抗體，家用試劑)藉由西方墨點法分析其。結果展示在原生凝膠上6E10識別較高級形式之澱粉狀蛋白，而6F6及5G5僅對此等寡聚及纖維形式展示相對較弱信號^。 在變性條件下，6F6及5G5主要識別單體形式之β澱粉狀蛋白，而N末端特異性6E10仍能夠結合至無法藉由用於此實驗之變性條件解析之較高級β澱粉狀蛋白聚集體，圖1)。總之，其表示在此等條件下且使用上述澱粉狀蛋白製劑，6F6較佳結合至較低分子量形式及單體Aβ1-42。

藉由經純化單株抗體6F6之ELISA進行的抗原決定基定位

使用經純化之6F6單株抗體來重複藉由ELISA之上述抗原決定基定位。所使用之方案相同，但添加100μl經稀釋經純化之抗體溶液(1%BSA中0.1μg/ml)替代經稀釋之融合瘤培養物上清液。

經純化之6F6單株抗體結合至基元KGAIIGL(等同於β-澱粉狀蛋白殘基28-34)，但若在肽中包括殘基35M(等同於β-澱粉狀蛋白殘基28-35；(SEQ ID No：9))，則極大增強結合。使用重疊抗原決定基定位技術無法排除相鄰殘基之次要促進作用。

藉由單株抗體6F6之表面電漿共振進行的抗原決定基定位

在表示藉由以抗生蛋白鏈菌素塗覆之感應晶片俘獲之β-澱粉狀蛋白序列的24-35(SEQ ID No:10：VGSNKGAIIGLMGSG)、28-39(SEQ ID No:11：KGAIIGLMVGGVGSG)及31-42(SEQ ID No:12：IIGLMVGGVVIAGSG)之C末端生物素標記肽上，以8-64_n M注入經純化6F6單株抗體歷時3min。使用Biacore 3000儀器來進行實驗。結果展示6F6能夠結合至肽24-35及28-39，但不結合至β-澱粉狀蛋白之肽31-42，證實以上重疊肽結果。其亦可表明殘基31-35不足以結合6F6且位置35上之殘基似乎不涉及於結合抗體中。

靜脈內投與抗β-澱粉狀蛋白單株抗體6F6及5D1對中樞投與澱粉狀蛋白後澱粉狀蛋白血液含量之影響

此研究之目的在於研究在靜脈內預注射測試抗體之小鼠體內側腦室(ICV)注射¹²⁵ I(1μCi)β-澱粉狀蛋白1-40後血液中之放射能級。

藉由ICV輸液向經ICV插管之雄性C57BL6/J小鼠(每次治療n=8-10)投與¹²⁵ I(1 μCi)β-澱粉狀蛋白1-40。在¹²⁵ I β-澱粉狀蛋白1-40之ICV輸液前一小時，對小鼠靜脈內注射磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或600μg抗β-澱粉狀蛋白單株抗體6F6或5D1。ICV輸液後使動物返回籠中且在ICV輸液後4小時進行挑選且採集血樣且偵測每分鐘計數(CPM)γ輻射。

外科預備

藉由吸入異熒烷(isofluorane)(3-5%)使小鼠麻醉且將其置於立體定位框架中。在任何外科手術程序之前，使小鼠接收0.05ml(原料1:10稀釋物)皮下vetergesic(丁丙諾啡(Buprenorphine))來止痛。沿頭皮中線切開一切口且清潔及乾燥顱骨背面。以相對於前囟之以下立體定位座標(前後軸(AP)：-0.5，外側(L)：+0.7，背側/腹側(DV)：-2.5)經由顱骨之鑽孔將套管置於側腦室中。另外兩個鑽孔鑽通顱骨至置放皮質骨螺釘之處。將套管藉由氰基丙烯酸酯凝膠固定在適當位置且在氰基丙烯酸酯凝膠頭帽(headcap)周圍縫合切口。手術後，使小鼠接收皮下0.3ml生理食鹽水且將其置於溫暖環境中以便自麻醉恢復。翻正反射(righting relex)恢復後，將小鼠單獨圈養且經受5天標準術後護理。不進行其他程序歷時5天或直至恢復術前體重。

套管置放

恢復之後，藉由血管緊張素II飲水反應來驗證套管置放。各小鼠接收100ng血管緊張素II之ICV投與。投藥後，觀察水攝取歷時15分鐘。

結果

觀測到與以媒劑給藥之動物相比以兩種單株抗體6F6及5D1給藥之動物的血液中放射能顯著增加，大概係由於循環中結合經放射素標記β-澱粉狀蛋白之能力，且因此延長經標記β-澱粉狀蛋白1-40肽於血液中之半衰期。單株抗體之間的差異不顯著。6F6及5D1處理使得CPM對比以媒劑注射對照組之統計上顯著增加(CPM：媒劑1280+/-312：5D1 8152+/-2001；6F6 8875+/-2123)，Univariate ANOVA，F(3,32)=15.14，p<0.001(資料對數轉化)、事後LSD測試***p<0.001，所有組對比媒劑。

研究天竺鼠體內6F6澱粉狀蛋白複合物形成之藥物代謝動力學

此研究之目的在於測定具有與人類相同之β-澱粉狀蛋白胺基酸序列之天竺鼠體的活體內抗體-β-澱粉狀複合物形成。其係藉由在各時間點量測游離抗體濃度及抗體-β-澱粉狀蛋白複合物經19天之時段而達成。

方法

使雄性Dunkin-Hartley天竺鼠在使用雙頸靜脈套管之異熒烷麻醉下外科預備。經插管之天竺鼠經1h接收抗體6F6靜脈內輸液(n=6)。分別投與0.700及0.625mL/kg/h之PBS溶液中經純化抗體製劑以達成3mg/kg之標靶劑量。給藥前(0min)將血樣(60μl)自各天竺鼠移除且在輸液開始後之以下時間(20天內)使用EDTA管收集：15、30、45、60(iv輸液關閉)、90、120、180、360min、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、312、360、408及456h。

在輸液開始後0、10、96、216、312及456h獲取大樣本(0.5ml)。在第20天最後一個血樣後，使動物麻醉且抽血。將血漿樣本在-80℃下儲存直至藉由ELISA分析。使用以β-澱粉狀蛋白1-40塗覆之微量滴定盤，藉由抗原結合ELISA評定游離抗體含量。將來自0、10h、96h、196h、312h及456h之血漿樣本添加至此等孔中且使用抗小鼠IgG-HRP共軛物偵測經結合之6F6單株抗體。藉由俘獲於經β-澱粉狀蛋白42C末端特異性多株抗體塗覆之盤上來偵測β-澱粉狀蛋白-抗體複合物。藉由抗小鼠IgG生物素共軛物及抗生蛋白鏈菌素氪酸銪(europium kryptate)經由6F6單株抗體來偵測經俘獲複合物。

結果

游離抗體含量如所預期在IV(靜脈內)傳遞後快速增加，但亦在頭24h之時段內快速降低。含量在約160h達到穩態水平。結果展示1.75ml/h/kg之6F6抗體血液清除率及49.4h之平均滯留時間(MRT)。

複合物含量在投與抗體後亦快速升高且在剩下的研究中平均複合物含量保持穩定在彼含量。然而，個別動物展示相當大的差異。在某些動物中，複合物含量降低，在某些動物中，複合物含量增加，但在大多數情況下複合物含量似乎自約216h時間點向前為穩定的。實驗展示具有人類等效澱粉狀蛋白之複合物可在活體內形成且在單次劑量投藥後，血漿中複合物含量似乎保持不變歷時較長時段。

在轉殖基因TASTPM小鼠中使用6F6之4週給藥研究

過度表現人類澱粉狀蛋白前驅蛋白(hAPP)之轉殖基因(tg)小鼠提供澱粉樣變性病模型且適用於研究藥物對澱粉狀蛋白產生、螯合作用及沈積之影響。對於此研究而言，吾人使用過度表現人類澱粉狀蛋白前驅蛋白及突變形式之早老素1之TASTPM轉殖基因小鼠(藉由使APP695 Swedish突變小鼠(TAS10)與PS-1M146V菌株(TPM)雜交產生之雙轉殖基因小鼠菌株)(Howlett等人2008)。於約10週大之雄性及雌性小鼠中進行該研究。

將動物分為三個治療組：

治療組

(A)不接收化合物的在第1天終止之Tg動物以測定研究起始時之澱粉狀蛋白含量(n=16，9隻雄性，7隻雌性)，(B)每週兩次接收腹膜內注射媒劑(PBS)歷時4週之Tg動物(n=19，9隻雄性，10隻雌性)，(C)每週兩次接收腹膜內注射，每隻小鼠300微克6F6歷時4週之Tg動物(n=19，9隻雄性，10隻雌性)。

將動物分為3個治療群體，間隔一週開始給藥方案。

在第2、第4、第6及第8次給藥前藉由尾部靜脈放血自每個治療組3隻雄性及3隻雌性動物獲取血樣。末端EDTA血漿樣本係在第1天(組A)或初次給藥後4週(組B及C)自所有組製備。取出左右腦半球，將其速凍且儲存在-80℃下直至隨後分析生物化學澱粉狀蛋白含量。亦獲取尾端且將其用於確認基因型。

測定腦勻漿中生物化學澱粉狀蛋白量

使用ORIGEN技術(Igen Intematioanl Inc)來測定經萃取腦樣本中Aβ1-40及Aβ1-42之含量。簡言之，將腦半球稱重且使用手持式杵以150mg/ml w/v於含有完整TM蛋白酶抑制劑(Roche Diagnostic)之5M胍HCl(Calbiochem)中萃取。將萃取物於Igen緩衝液中稀釋，且將1:10及1:40稀釋液以20000g離心使之澄清，並使用於本檢定中。

ORIGEN檢定使用具有固定之經生物素標記之6E10抗體(特異結合人類Aβ1-16，Signet Labs)之經抗生蛋白鏈菌素塗覆之Dynabeads(Dynal)自樣本俘獲Aβ，且使用經ori標籤標記之G210(特異結合Aβ1-40之抗體，家用試劑)或5G5(特異結合Aβ1-42之抗體，家用試劑)偵測結合之Aβ。

分析各組屍檢之Aβ1-40及Aβ1-42負荷顯示，在此研究中及藉由本文中所採用之分析法無與6F6治療相關之腦澱粉狀蛋白負荷降低。無法對可能之腦澱粉狀蛋白降低作出確切結論，因為在研究過程中，經媒劑處理之動物腦中Aβ增加模式較小且在所有動物中不一致。

測定6F6抗體之血漿中含量

藉由ELISA來評定縱向及末端EDTA血漿樣本之抗體含量。簡言之，將樣本以1:50、1:500及1:5000稀釋並添加至具有0.5μg/ml稀釋於PBS中之經固定之Aβ1-40肽的ELISA盤中。將樣本在4℃下培育隔夜，洗滌且使用抗小鼠辣根過氧化酶共軛物偵測經結合之6F6抗體。藉由使用標準曲線來測定樣本濃度，該曲線係使用0至30μg/ml範圍內之8個已知6F6濃度而產生。

結果顯示，成功地給予所有小鼠6F6抗體且最終血漿濃度具有約250μg/ml之平均值。在所有動物樣本中，縱向血漿樣本顯示，第2與第4劑量之間的血漿含量由於重複投藥而增加，但維持在至少150μg/ml之水平直至研究結束。

藉由免疫沈澱及西方墨點來測定血漿中澱粉狀蛋白-抗體複合物

為檢查此活體內研究中是否已形成抗體-Aβ複合物，使用免疫沈澱及隨後之西方墨點分析來研究血漿樣本中之複合物形成。簡言之，將15μl血漿樣本在4℃下與10μl蛋白質A瓊脂糖珠粒漿料一起震盪反應3h。將珠粒於含有蛋白酶抑制劑之1ml冰冷PBS中洗滌5次。每次洗滌時樣本均在4℃下以2000rpm離心2min。洗滌後，將珠粒再懸浮於20μl含有0.1M DTT之電泳樣本緩衝液中。使樣本沸騰5min且如上所述離心。上清液再沸騰後，將樣本裝填在10%Bis/tris微凝膠中並藉由電泳分離。將凝膠轉漬於硝化纖維素膜上，填阻且以6E10抗體(特異結合人類Aβ1-16；Signet Labs)探測。使用經IR dye800共軛之山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Rockland)偵測結合之6E10。使用Odysee紅外成像系統使墨點顯像。

結果顯示，可於墨點上偵測到使用免疫沈澱法共純化之低分子量Aβ。據此推斷6F6與Aβ之複合物於活體內形成且存在於血漿樣本中。所測試之雌性動物之帶(band)強度較弱。總之，此證實6F6能夠與人類Aβ活體內結合且形成可藉由西方墨點偵測之穩定複合物。

在轉殖基因hAPP小鼠中使用6F6之16週給藥研究

使用在鼠類Thy-1啟動子控制下過度表現hAPP(751)之轉殖基因小鼠，其大量表現具有London(717)及Swedish(670/671)突變之人類APP，導致年齡依賴性之澱粉狀蛋白β1-40及澱粉狀蛋白β1-42(Aβ1-40及Aβ1-42)增加。此等小鼠在幼年(約4個月起始)產生由澱粉狀蛋白沈積物組成之斑塊。腦病理狀況之嚴重性與年齡增長及行為缺陷相關。

此研究係在研究者不知情，事先不向其揭示所投與化合物之特性情況下進行。將4個月大之雌性轉殖基因小鼠分配為3組(每組n=15)加上一組非轉殖基因仔畜且每週經由腹腔內途徑治療4個月之時段。將仔畜組及一個接收對照IgG之Tg組用作對照。在治療結束時，進行行為測試(Morris Water Maze,New Object Recognition Task)且處死動物。收集腦、CSF及血漿。處理各大腦之一個半球用於組織評估，將第二個即刻冷凍來測定TBS、Triton X-100、SDS及甲酸(FA)腦勻漿部份以及CSF中Aβ1-38、Aβ1-40及Aβ1-42。使用以抗β澱粉狀蛋白抗體6E10免疫染色來測定經固定樣本中之大腦斑塊負荷且測定斑塊表面積及斑塊數且以電腦化圖像分析軟體(Image Pro Plus，版本4.5.1.29)來計數。使用VIP偵測系統(Vector)，使用生物素標記二次抗體標誌之突觸小泡蛋白特異性抗體染色(Neomarkers)抗體來研究突觸密度。

治療組：3組Tg動物(每組15隻)及一組非轉殖基因C57BL6動物(n=15)：(A)每週接收17mg/kg bw化合物6F6之Tg動物(n=15)(B)接收化合物mIgG2a 17mg/kg bw之Tg動物(n=15)(D)接收化合物6F6 33mg/kg bw之Tg動物(n=15)(E)接收mIgG2a 17mg/kg bw之非轉殖基因仔畜(n=15)

測定經連續萃取之腦勻漿及CSF中生物化學澱粉狀蛋白負荷

自治療組A、B及D之動物收集CSF且將其即刻冷卻直至準備使用ELISA技術進一步分析。為獲得腦勻漿，將來自組A、B及D動物之經冷凍半球於5ml含有蛋白酶抑制劑混合液之TRIS經緩衝生理食鹽水(TBS)中均質化。將約一半腦勻漿以等分試樣即刻冷凍。將另一半在74.500g下離心1小時且將所得上清液(=TBS部分)等分試樣且保持在-20℃下直至測定。將顆粒懸浮在Triton X-100(2.5ml)中，離心且將上清液等分試樣且保持在-20℃。使用SDS(2.5ml)重複此等步驟。將SDS部分之顆粒懸浮於70%甲酸(0.5ml)中，隨後進行後續離心。將所得上清液以1M TRIS(9.5ml)中和，等分試樣化且保持在-20℃。根據製造商說明書，使用可購得之套組(使用Sector Imager MS2400之Mesoscale Discovery Abeta 3-plex套組#K15148E)將CSF以及四個大腦部分之樣本用於Aβ38、Aβ40及Aβ42測定。大腦值經計算為每公克濕大腦之Aβ毫微克數，CSF值經計算為每毫升之Aβ皮克數。

在TBS部分中，組B動物之所有三種澱粉狀蛋白種類中Aβ含量最低。對於Aβ42而言，此6F6治療組A及D之增加顯著超過對照組B(對組A，p<0.05且對組D，p<0.001)但對於Aβ38及Aβ40而言不顯著。在Triton X-100部分中，平均Aβ42含量亦在6F6治療組A(p<0.05)及D(p<0.01)中顯著增加超過對照組B。組B及D之Aβ40含量不顯著不同，而組A之彼等含量與對照組B相比仍顯著增加(p<0.05)。儘管缺少顯著性，但觀測到6F6治療組A之Aβ38增加超過對照組B，但6F6治療組D比對照組B略微降低。如於SDS及FA部分中所量測經結合且不溶於水之Aβ在6F6治療組A動物大腦中與組B(Aβ38及Aβ42)或D(Aβ38及Aβ40)相比顯著較高。對照組B及6F6治療組D不顯著不同。

在CSF樣本中，未觀測到關於Aβ38、Aβ40含量之顯著組差異。與6F6治療組A相比，對照組B動物體內之Aβ38、Aβ40及Aβ42含量略微較低。6F6治療組D動物之CSFAβ42含量與對照組B相比顯著增加(p<0.05)，其可能表明可溶性Aβ42經由螯合作用移動至CSF中或間接經由血流移動。

突觸密度之測定

使用抗突觸小泡蛋白抗體(1:200，Neo Markers；目錄號RM9111-SO)及生物素標記二次抗體(1:200；Vector Laboratories；目錄號PK-6101)來染色每隻動物三個薄片，隨後進行VIP顯影(過氧化酶之受質套組；目錄號SK4600)。為測定個體平均突觸密度，以基於宏觀之量測程序每區(來自海馬CA1、CA3及齒狀回中葉(DGmb)之粒層)及薄片評估三個影像。在宏觀運作期間，等同地對比影像且計數超過恆定臨限值之突觸。在使用尺寸限制下分別計數單一及連續突觸。將連續突觸之總面積除以單一突觸之平均尺寸。最終突觸計數係以下式計算：

此外，依據血管面積之降低背景校正影像面積，且相對於藉由血管面積而降低之總影像面積來考慮突觸總和。

量測獲自治療組A、B及D之海馬大腦部分之CA1、CA3及GDmb區之突觸數，在治療組中突觸密度保持不變。

測定總及未經結合(游離)β-澱粉狀蛋白之縱向血漿含量

藉由自面靜脈/動脈下頜取樣，在開始治療前(第0天)獲取活體內血樣且在第3、6、9及12週再次獲取活體內血樣。將血樣收集至EDTA及未覆蓋小瓶中以獲得血漿。將所有血漿樣本冷凍且儲存直至分析。

使用Gyrolab^TM 工作台來測定未結合(游離)澱粉狀蛋白含量及總澱粉狀蛋白(未經結合Aβ及與抗體複合之Aβ)含量。將生物素標記6F6鼠類mAb用作游離β-澱粉狀蛋白檢定之俘獲試劑且將生物素標記N末端特異性抗β-澱粉狀蛋白抗體(家用試劑)用作總β-澱粉狀蛋白檢定之俘獲試劑。將兩種俘獲試劑俘獲於含有經抗生蛋白鏈菌素塗覆之基質的Gyros Bioaffy CD俘獲塔上。以700nM之濃庫添加俘獲抗體。對於兩種檢定而言，使用12.5nM濃度之經Alexa 647標記之4G8(特異於β-澱粉狀蛋白抗原決定基17-24)來偵測。為了定量樣本中β-澱粉狀蛋白之量，製備Aβ1-42標準曲線(Innogenetics Aβ1-42)得到31.25pg/ml至20000pg/ml之動態範圍。於β-澱粉狀蛋白耗盡之人類血漿中進行Aβ1-42標準曲線及血漿樣本之稀釋。使用機器所固有之軟體來分析資料且接著以Excel製圖。

在17mg/kg及33mg/kg 6F6治療組中，總β-澱粉狀蛋白含量至第3週(第一個時間點)增加超過2000倍。在研究期間觀測到，33mg/kg治療組具有略微較高水平之總β-澱粉狀蛋白含量，但與可能表示效應達到飽和之增加之劑量水平無關。在治療後第一個時間點(3週)觀測到兩個6F6治療組之游離β-澱粉狀蛋白含量為非轉殖基因小鼠所展示之背景水平，大概係由於此檢定所偵測之大多數(非所有)β-澱粉狀蛋白均用於抗體-β-澱粉狀蛋白複合物中。在無治療介入下，轉殖基因小鼠之β-澱粉狀蛋白基線水平比非轉殖基因對照小鼠之基線水平大致高6倍。

使用6E10染色測定斑塊負荷

由18Tg小鼠之半腦(Tg組A、B及D中之6隻)，每個大腦製備足夠數量之薄片來定量澱粉狀蛋白沈積物。於海馬區及皮質區中定量評估6E10免疫反應性。矢狀切割出每層15個部分(總共5層，對應於Paxinos及Franklin之"The Mouse Brain"，第2版形態圖之圖104至105，107至108，111至112，115至116及118至119)，各自5μm厚(Leica SM 2000R)。以完全相同之方式來操縱所研究之所有轉殖基因動物之組織以避免歸因於此程序之變化的偏差。

使用針對人類澱粉狀蛋白肽之位置1-17之單株6E10抗體(Signet)來測定澱粉狀蛋白沈積物及斑塊負荷。在所有經研究之大腦中所量測之海馬及皮質區面積恆定，其排除在免疫組織化學染色步驟中對組織之負效應(例如皺縮，不同切割環境等)且表明治療不誘發萎縮。斑塊負荷資料係關於能夠解決假影、摺疊或遺失塊問題之薄片中個別區域尺寸。以高劑量6F6處理(組D)起起海馬及皮質中斑塊面積百分比與低劑量6F6處理(組A；ANOVA：皮質及海馬：p<0.01)及對照組B相比顯著減低(圖2)。每平方毫米之斑塊數亦具有相同趨勢，6F6治療組D中之每平方毫米斑塊數再次小於對照組B(t測試：皮質：p=0.093)及低劑量6F6治療組A(t測試：海馬：p=0.051；圖3)中之每平方毫米斑塊數。所有治療組中平均斑塊尺寸保持不變。

補體因子H缺陷小鼠眼中澱粉樣變性病之論證："乾式"AMD模型

動物

將十週大、3個月大、6個月大、9個月大及一年大之cfh^-/- 小鼠(n=6)(回交於C57BL/6遺傳背景上歷時超過10代)及年齡匹配之正常C57BL/6小鼠(n=6)以12h畫(160 lux)-夜循環圈養於溫度控制之環境中且維持正常實驗室飲食(隨意供給實驗室食物)。使小鼠麻醉(0.75ml氯胺酮，0.5ml Domitor，每100公克0.2毫升之0.75ml無菌水，若需要i.p.補充)，且在cSLO成像前10-15min局部使用1%托品醯胺(tropicamide)及2.5%鹽酸苯腎上腺素使其瞳孔擴張。在各影像序列之前，在眼上置放數滴羥丙基甲基纖維素(0.3%)來防止乾燥。所有實驗程序均遵照United Kingdom Animals(Scientific Procedures)Act 1986且係在UnitedKingdom AnimaIs(Scientific Procedures)Act 1986下進行。

視網膜成像

如以下詳細描述，成像係關於3個月、6個月及12個月cfh^-/- (n=12)及年齡匹配之對照(n=6)小鼠進行。如下所述使用共焦掃描雷射檢眼鏡來獲取高解析度及高對比視網膜影像。簡言之，使用488及820nm雷射線來進行反射成像。藉由使用488nm來記錄小鼠視網膜之自體螢光及螢光素血管造影圖像。激勵及內建式標準發射截止過濾器在498nm處具有障壁邊緣(50%透射率之值)。

使小鼠麻醉(0.75ml氯胺酮，0.5ml Domitor，每100公克0.2毫升之0.75ml無菌水，若需要i.p.補充)，且在成像前10-15min局部使用1%托品醯胺(tropicamide)及2.5%鹽酸苯腎上腺素使其瞳孔擴張。在各影像序列之前，在眼上滴一滴羥丙基甲基纖維素(0.3%)來防止乾燥。使用所述之改進方法以共焦掃描雷射檢眼鏡(Heidelberg Retina Angiograph,Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)活體內獲取高解析度及高對比視網膜影像(Guo L,Sa1tTE,Maass A,Luong V,Moss SE,FitZke FW,Cordeiro MF(2006)Invest Ophthalmol Vis Sci 47:626-633)。簡言之，使小孔直徑縮減至100 μm來改良經增加以改良訊雜比之軸向解析度及雷射功率。在488nm下在小鼠瞳孔處量測功率為1400W。小鼠裝備有經特殊設計之平凹隱形眼鏡且使用具有超長焦距之50倍顯微鏡頭來提供光強度，其改良光學解析能力且使得偵測直徑小至3μm之微觀毛細結構。記錄層析成像影像堆疊，其中將軸面以15μm之間隔，玻璃體至鞏膜及中心至周邊連續移動以觀測來自第一叢直至外部叢之視網膜維管結構。所有影像序列係在8.9Hz，10°視場誤差下俘獲，且數字化為8位元，768 768像素影像檔案，產生每像素1.2微米之側面影像解析度。小鼠眼中之軸向解析度經量測為5-8μm。

藉由使用SPSS(Chicago,IL)對影像資料應用Student未配對t測試來分析RPE含量下cfh^-/- 與年齡匹配之對照動物之間在視網膜下自體螢光沈積物數量方面的差異。

組織學及免疫組織化學

簡言之，使動物以氯胺酮(ketamin)及dormitor深度麻醉且接著對十週大cfh^-/- 小鼠(n=6)、3個月(n=3)、6個月(n=3)、9個月(n=3)及1年大之cfh^-/- 小鼠(n=6)灌注0.1M PBS，隨後灌注4%三聚甲醛(於0.1M PBS中，pH 7.2)。將眼移除且置放於4%三聚甲醛中，隨後於30%蔗糖溶液中冷凍保護(於0.1M PBS緩衝液中)且使其在4℃下靜置24h。將晶狀體經由角膜切口移除，且使眼在OCT化合物中快速冷凍且切片為10μm厚度以供免疫組織化學分析，參見以下詳述。將所選動物之神經視網膜及脈絡膜分離且獨立平坦固定。將來自cfh^-/- 小鼠(n=20)及年齡匹配之對照(n=20)小鼠之眼部切片用一次抗體培育(表5)，隨後以適當螢光共軛之二次抗體及DAPI培育來染色核，參見以下詳述。

免疫組織化學係在室溫下進行且在固定於4%三聚甲醛中之來自眼之10μm厚之冷凍切片上進行。將視網膜切片在具有0.3% Triton X-100之0.1 M磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(pH7.4)中5%正常驢血清中阻斷1小時且以一次抗體培育隔夜，以具有0.3% Triton X-100之0.1 M PBS中1%正常驢血清稀釋。一次抗體之各稀釋液係如下所述。一次抗體暴露後進行洗滌且(若需要)暴露螢光共軛之適當二次抗體(Santa Cruz,Biotechnology,Inc.，於具有0.3% Triton及2%正常血清之PBS中構成的驢抗小鼠sc-2099(1:100稀釋，與初始相同之稀釋劑)及切片2小時(FITC Santa Cruz,Biotechnology,Inc.，驢抗小鼠sc-2099)。負性對照係由無關同型匹配抗體或遺漏一次抗體組成。隨後將核以0.5ml4'6-二甲脒基-2-苯基吲哚(1μl DAPI儲備溶液至5m 10.1M PBS；Sigma-Aldrich)染色歷時1min。接著將載片以0.1M PBS洗滌若干次，隨後於Tris緩衝生理食鹽水(pH7.4)中洗滌四次且最後將蓋玻片安裝於VECTASHIELD(Vector Laboratories)中。

檢視切片且將影像以每通道8個位元及1024×1024 px俘獲於雷射掃描共焦顯微鏡(Leica SP2;Leitz)上或Epi螢光明視場顯微鏡(olympus BX50F4,Olympus,Japan)上，其中使用Nikon DXM1200(Nikon,Tokyo,Japan)數位攝影機俘獲3840×3072 px解析度之24位元彩色影像形式的資料^。

可購得之一次抗體

使用C3(與FITC共軛之山羊抗小鼠1:100稀釋物；ICN Biomedicals)以供在所指示之稀釋度下染色視網膜切片。用於此操作之抗澱粉狀蛋白β抗體：(1)在1/250稀釋度下推薦用於經IHC石蠟包埋之切片的特異於齧齒動物澱粉狀蛋白β之Covance SIG-39153兔多株Ab，(2)在1/100-1/1000稀釋度下推薦用於經IHC石蠟包埋之切片的識別人類及小鼠澱粉狀蛋白β之Calbiochem NE1002(4G8)小鼠單株Ab(IgG2b)(需要甲酸預處理)，(3)在1/100稀釋度下，推薦用於經IHC石蠟包埋之切片之識別人類及小鼠澱粉狀蛋白β的Abcam ab2539兔多株Ab(在IHC染色程序前需要熱介導之抗原修復)，

可購得之二次抗體

偵測cfh^-/- 小鼠體內之類脈絡膜疣樣沈積物

可在年老cfh^-/- 小鼠視網膜中偵測到自體螢光沈積物。可在約14週大之cfh^-/- 小鼠體內首先偵測到螢光脂質類脈絡膜疣樣沈積物，且其存在隨年齡增加且位於視網膜下空間(RPE之頂面)。此等沈積物亦存在於野生型小鼠體內(但以顯著較小之程度存在)。舉例而言，6個月大cfh^-/- 小鼠視網膜之cSLO影像在灰色背景上鑑別出一些自體螢光白斑且如可易於在綠色(FITC)通道中鑑別之自體螢光沈積物，其可以10倍及40倍放大倍率見於IHC之活體外視網膜散布中。自體螢光沈積物之間的螢光發射光譜存在大差異(資料未展示)。

當藉由IHC自體螢光來檢查cfh^-/- 小鼠之視網膜切片時，可見類脈絡膜疣樣沈積物與RPE細胞頂面上視網膜下空間中的補體C3沈積部位相關。其可見於12個月大之cfh^-/- 小鼠體內(資料未展示)。

使用可購得之抗澱粉狀蛋白βAb來分析CFH^-/- 小鼠眼睛

使用經證實為Aβ染色陽性之可購得固定人類阿茲海默氏腦切片(Abcam ab4582)來檢查展示於表6中之三種可購得抗澱粉狀蛋白βAb的交叉反應性。

用於其之程序為：對於腦石蠟切片而言：1.二甲苯-10min2.100%乙醇-8min3.95%乙醇-5min4.蒸餾水-5min5.抗原修復-使用檸檬酸鹽緩衝液之Ab2539 HIER-NE1002(4G8)-70%甲酸-SIG-39153對於石蠟及經冷凍切片而言；6.以PBS洗滌3次，每次5分鐘7.以5%正常驢血清阻斷1小時8.以PBS簡單洗滌9.在以下條件下應用一次抗體：-Ab 2539-1:100-NE1002(4G8)-1:200-SIG-39153-1:250培育隔夜10.以PBS洗滌3次，每次5min11.在以下條件下應用二次抗體：對於ab2539而言-Ab sc-2090 1/100對於NE1002而言-Absc-2099 1/100對於SIG-39153而言-Ab sc-2090 1/100培育1小時12.以PBS洗滌3次，每次5min13.DAPI歷時1min12.以PBS洗滌3次13.以TBS洗滌4次，每次5min14.固定、蓋玻片及密封

如所預期，僅一次抗體能夠與人類β澱粉狀蛋白(NE1002[4G8]及ab2539)交叉反應，提供人類阿茲海默氏腦組織中人類澱粉狀蛋白β斑塊之陽性偵測(資料未展示)。

使用可購得之Ab偵測年老(>1歲)及10週大小鼠CFH^-/- 眼中之澱粉狀蛋白β。

接著進行以下程序：1.使載玻片風乾若干小時2.洗滌3次3.以5% NDS阻斷1小時4.如下製備來自表6之一次抗體：a.SIG39153-1:250b.NE1002(4G8)-1:200c.Ab25391:5005.簡單洗滌且以一次抗體培育隔夜6.洗滌3次7.如下製備二次抗體：a.抗兔FITCb.抗小鼠FITC培育1小時8.洗滌3次9.應用DAPI歷時1min10.以PBS洗滌3次11.以TBS洗滌4次12.固定、蓋玻片及密封

最初，使用如上所述三種可購得之抗澱粉狀蛋白β一次抗體(Ab)來檢查來自年齡匹配之cfh^-/- 小鼠及12-13個月大之野生型同窩仔對照(C57BI/6)之固定視網膜眼組織。使用經相關第二螢光標記之二次Ab來偵測各一次Ab。對於Ab SIG39153而言，儘管根據製造者推薦之方案，但在任一組織中無信號可偵測到(如在上述腦樣本中)(資料未展示)。然而，使用其他可購得之抗澱粉狀蛋白β一次抗體可特別在年老cfh^-/- 小鼠視網膜中偵測到澱粉狀蛋白β(但在野生型同窩仔中偵測不到)。將此資料之實例展示於圖4中，其中組(A)展示來自年老野生型小鼠之視網膜組織且組(B)展示來自年老cfh^-/- 小鼠之組織，兩者皆係以ab2539作為一次Ab來探測，且組(C)展示來自年老野生型小鼠之視網膜組織且組(D)展示來自年老cfh^-/- 之組織，兩者皆係以NE1002(4G8)作為一次Ab來探測。資料表明澱粉狀蛋白β沈積在特別係年老cfh^-/ 小鼠之布魯赫膜周圍。抗體與經沈積澱粉狀蛋白β在RPE/布魯赫膜界面處之交叉反應性之正信號在圖4(B)及(D)中可視為以白色箭頭突出顯示之緻密白色條狀物。一些澱粉狀蛋白沈積物亦可見於cfh^-/- 小鼠眼中神經纖維層及神經節細胞區中，例如在圖4(B)頂部以白色箭頭突出顯示之白色信號。

隨後，使用NE1002(4G8)及ab2539抗澱粉狀蛋白β一次抗體來檢查來自10週大的年齡匹配之cfh^-/ 小鼠及野生型同窩仔對照(C57BI/6)之固定視網膜眼組織。此外，尤其在cfh^-/- 小鼠視網膜中可偵測到澱粉狀蛋白β，但在野生型同窩仔中偵測不到(資料未展示)。資料表明10%之10週大cfh^-/- 小鼠視網膜(n=3)中出現澱粉狀蛋白β沈積(資料未展示)。沈積物大體上在視網膜色素上皮層(RPE)基面上且呈現與基底層狀沈積物相關(資料未展示)。注意在10週大時澱粉狀蛋白β沈積類似於在cfh^-/- 小鼠體內首次出現"類脈絡膜疣"自體螢光沈積物及補體C3沈積物的時間。

在cfh^-/- 小鼠眼視網膜中6F6與澱粉狀蛋白β之交叉反應性用於此研究中之一次抗體

(i)6F6小鼠單株Ab，IgG2a，(ii)特異於胞嘧啶脫胺酶抗原之小鼠IgG2a同型對照單株Ab(家用試劑)，(iii)小鼠IgG2a，κ[MOPC-173]同型對照單株Ab(ab18413,Abcam)，具有未知特異性之源自Balb/c骨髓瘤之純系。

接著進行以下程序：1.使載玻片風乾若干小時，2.以1×PBS洗滌3次，每次5min3.以PBS中0.3% Triton X-100中5%正常驢血清阻斷，在室溫下培育1小時，4.製備一次抗體，以PBS中0.3% Triton X-100中1%正常驢血清稀釋，a.小鼠單株澱粉狀蛋白β6F6 i)-1:1000，1:2000及1:4000b.小鼠IgG2a對照ii)1:1000，1:2000及1:4000簡單洗滌5.應用一次抗體且在室溫下培育隔夜次日：1.以1×PBS洗滌3次，每次5min2.藉由於PBS中0.3% Triton X-100中1%正常驢血清中稀釋來製備二次抗體a.山羊抗小鼠Alexa Fluor 488(1:2000)應用二次抗體且在RT下培育1小時3.以1×PBS洗滌3次，每次5min4.應用以1:5000於PBS中之DAPI，且在黑暗中培育1min5.以1×PBS洗滌3次，每次5min6.以1×TBS洗滌4次，每次5min7.以Vectashield固定、蓋玻片及密封

最初如上所述檢查來自年齡匹配cfh^-/- 小鼠及12-13個月大之野生型同窩仔對照(C57BI/6)之固定視網膜眼組織。儘管6F6與以商用抗澱粉狀蛋白βAb偵測之區域之類似視網膜區存在交叉反應性，但使用對照抗體存在類似交叉反應性，儘管其中一些可歸因於單獨之二次Ab的背景交叉反應性。一些背景染色法亦可見於野生型樣本中。

為消除上述背景染色，重複實驗，但使二次抗體自經Alexa Fluor 488標記之抗小鼠IgG Ab轉換為經FITC標記之分子。亦使一次對照抗體轉換為可購得之同型對照物(iii)。

用於此實驗中之程序為：使載玻片風乾若干小時，以1×PBS洗滌1次歷時5min以PBS中0.3%Triton X-100中5%正常驢血清阻斷，在室溫下培育1小時，製備一次抗體，以PBS中0，3%Triton X-100中1%正常驢血清稀釋，a)小鼠IgG2a，κab18413 1：100簡單洗滌應用一次抗體且在室溫下培育隔夜次日：以1×PBS洗滌3次，每次5min藉由於PBS中0.3% Triton X-100中1%正常驢血清中稀釋來製備二次抗體b)驢抗小鼠FITC(1：300)應用二次抗體且在RT下培育1小時以1×PBS洗滌3次，每次5min應用以1：5000於PBS中之DAPI，且在黑暗中培育1min以1×PBS洗滌3次，每次5min以1×TBS洗滌4次，每次5min以Vectashield固定、蓋玻片及密封。

將使用上述染色程序獲得之資料之實例展示於圖5中。組(A)展示以1：4000稀釋之作為一次抗體之6F6染色年老cfh^-/- 小鼠視網膜切片所獲得之資料且組(B)展示使用同型對照(iii)作為一次抗體(以與6F6類似之w/v稀釋度)染色年老cfh^-/- 小鼠視網膜切片(經標記cfh^-/- 商用負性對照)而獲得的資料，且組(C)展示使用以1:4000稀釋之作為一次抗體之6F6染色年齡匹配之野生型對照小鼠視網膜切片而獲得的資料且組(D)展示使用以1:4000稀釋之作為一次抗體之同型對照物(ii)(經標記cfh^-/- 負性對照)來染色年老cfh^-/- 小鼠視網膜切片而獲得的資料。

資料證實6F6能夠特異性偵測沈積於cfh^-/- 小鼠視網膜中之澱粉狀蛋白β(圖5A)(不存在於年齡匹配之野生型小鼠中(圖5C))。6F6之特異性係藉由完全不存在使用可購得之同型對照物(以與6F6類似之w/v稀釋度)作為一次抗體染色來證實(圖5B)。使用以1:4000稀釋之另一種家用同型對照抗體(ii)獲得之資料(圖5D)暗示cfh^-/- 小鼠之特定視網膜染色。然而，其可能藉由此同型匹配之抗體之特異性來解釋，因為胞嘧啶脫胺酶為可以在年老cfh^-/- 小鼠視網膜中出現之細胞破裂之標誌。回顧上文，在此實驗中其並非用於同型特異性Ab對照物之適當選擇。

cfh^-/ 小鼠眼視網膜中澱粉狀蛋白與6F6及4G8之交叉反應性之時程

在彼等10週與12個月之間的中間時間點：3個月大(n=3)，6個月大(n=3)及9個月大(n=3)時藉由免疫組織化學類似地分析年齡匹配之C57BI/6(野生型)及cfh^-/ 小鼠。使用6F6或Calbiochem NE1002(4G8)作為一次偵測抗體來執行分析。在三個月大時，可見在大體含量上野生型與cfh^-/- 小鼠之間幾乎無差異。然而，在六個月大時：可在cfh^-/- 小鼠(而非年齡匹配之野生型對照小鼠)中在布魯赫膜及視網膜色素上皮(RPE)細胞邊界周圍清楚地偵測到澱粉狀蛋白沈積物(資料未展示)。在六個月之時間點時，使用4G8之染色似乎覆蓋RPE與BM之間的整個邊界，而使用6F6作為一次抗體之類似染色具有較多斑點(資料未展示)。六個月大之時間點展示藉由IHC之cfh^-/- 小鼠與年齡匹配之野生型對照相比視網膜中澱粉狀蛋白沈積水平的清楚區別。

總而言之，cfh^-/- 小鼠表示眼中(尤其為視網膜中)澱粉樣變性病之快速模型，且其可與模型之"乾式"AMD表型緊密相關。小鼠表示用於分析治療用抗澱粉狀蛋白βAb之效應(諸如6F6對視網膜中澱粉狀蛋白β之效應)的良好模型。

論證6F6干擾澱粉狀蛋白β與補體因子I之結合的能力

展示澱粉狀蛋白β與補體因子I(CFI)、補體因子H(CFH)之"搭配物"及輔因子之間直接相互作用的最近公開資料(Wang,J.等人，2008)可有助於解釋cfh^-/- 小鼠視網膜中快速澱粉狀蛋白β沈積。在不存在CFH下，澱粉狀蛋白β可自由結合至小鼠視網膜中任何"未經搭配"之CFI(Wang,J.等人，2008，未公開之資料)。為論證治療用抗澱粉狀蛋白β抗體6F6或人類化等效物可藉由結合至澱粉狀蛋白β來干擾澱粉狀蛋白β與CFI之間的相互作用，可類似於Wang,J.等人，2008所述之彼等實驗來執行一系列實驗。在存在及不存在可購得之CFH蛋白(Quidel Corporation)下，使用可購得之澱粉狀蛋白β蛋白製劑(例如來自Peptide Institute)預培育6F6對其結合可購得之CFI蛋白(Quidel Corporation)之能力的效應可如所述(Wang,J.等人，2008，第716-717頁)來測定且藉由標準免疫共沈澱研究及/或藉由BiaCore分析來分析。類似地，6F6抗體在存在及不存在CFH下破壞預成形之澱粉狀蛋白β:CFI複合物的能力可藉由免疫共沈澱研究及/或藉由BiaCore分析來確定。類似地，使用可購得之澱粉狀蛋白β蛋白製劑(例如來自Peptide Institute)預培育6F6對其在可購得之CFH蛋白(Quidel Corporation)存在下影響可購得之CFI蛋白(Quidel Corporation)功能之能力的效應可使用所述補體C3b(Quidel Corporation)裂解檢定(Wang,J.等人，2008，第717頁)來量測且藉由標準SDS PAGE來分析。類似地，6F6抗體在CFH存在下破壞預成形澱粉狀蛋白β:CFI複合物且藉此恢復對CFI/CFH複合物C3b裂解功能之能力可如所述來確定(Wang,J.等人，2008，第717頁)且藉由標準SDS PAGE來分析。

提示來自最近公開之活體外研究之結果支持以下假設：其中澱粉狀蛋白β藉由阻斷補體因子I功能活化脈絡膜疣內之補體系統，在視網膜下組織中引起低級、慢性炎症；從而將與AMD發生相關之四個因素聯繫起來：炎症、補體活化、澱粉狀蛋白β沈積及脈絡膜疣(Wang,J.等人，2008)。先前未記錄澱粉狀蛋白β藉由可能與補體因子H競爭結合補體因子I來活化補體旁路之效應的該直接證據(Wang,J.等人，2008)。藉由治療性投與抗體(諸如6F6)干擾澱粉狀蛋白β對清除活化補體C3組份的不良效應可構成停止或逆轉AMD之新穎作用機制。

使用硫代磺色素(Thioflavin)T染色及6F6交叉反應性偵測年老人類眼中之澱粉狀蛋白β沈積

人類供體眼組織樣本係獲自Moorfields Eye Bank,Moorfields Eye Hospital,London,UK。所獲得之第一樣本為65歲大白種男人的樣本(Moorfields Eye Bank,Moorfields Eye Hospital,London,UK)。將眼如上所述固定且加工且使用先前公開之方案使切片經受以硫代磺色素T(Sigma T3516)染色(Anderson等人，Exp Eye Res(2004),78;243-256；Levine,H,Methods in Enzymology(1999),309;274-284)。使用眼組織產生之硫代磺色素T染色資料展示來自與硫代磺色素T結合之澱粉狀蛋白β之螢光信號，可將其視為眼組織人類外視網膜中基底層狀沈積物周圍及RPE布魯赫膜界面周圍之脈絡膜周圍的模糊白色染色。

人類供體眼組織之其他樣本係獲自Moorfields Eye Bank,Moorfields Eye Hospital,London,UK，包括來自41歲及90歲男性之彼等樣本。將此等眼再次如上所述固定且加工，但此次使切片經受使用6F6作為一次抗體之染色且藉由如先前所述使用與FITC共軛之抗小鼠IgG二次抗體來觀測。儘管90歲大之眼樣本在加工期間損失大多數視網膜，但可在剩餘組織外部中偵測到澱粉狀蛋白與6F6之交叉反應性。此染色不存在於來自41歲男性眼之外部或視網膜中。眼組織之人類供體未經AMD正式診斷，但重基底層狀沈積物之存在以及其與澱粉狀蛋白β之締合有力地表明來自65歲男性之經硫代磺色素T染色的眼組織中早期乾式AMD病因。儘管在90歲大之眼樣本中，組織處理已損失大多數視網膜，但事實係可在41歲男性(設想其過於年輕而不會具有AMD之症狀)眼之剩餘組織中而非眼外部亦非眼視網膜中偵測到澱粉狀蛋白與6F6之交叉反應性，預示著6F6樣抗體在結合見於年老人類眼中澱粉狀蛋白中之用途。

融合瘤可變區之選殖

可變區序列

自所有融合瘤細胞株中提取總RNA且接著藉由反轉錄及聚合酶鏈反應(RT-PCR)產生重鏈及輕鏈可變域cDNA序列。RT-PCR之正向引子為特異於鼠類免疫球蛋白基因前導序列之簡併引子混合物且反向引子特異於抗體恆定區，從而(例如)對於重鏈而言特異於6F6鼠類同型IgG2a且對於輕鏈而言特異於鼠類κ。根據Jones及Bendig所述之策略(Bio/Technology 9:88,1991)設計引子。以一式兩份對兩個V區序列進行RT-PCR使能夠實現隨後對正確V區序列之驗證。選殖藉由RT-PCR產生之V區產物(Invitrogen TA選殖套組)且獲得序列資料。

6F6 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:19)

6F6 V_H DNA序列(SEQ ID No:20)

6F6 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:21)

6F6 V_L DNA序列(SEQ ID No:22)

2C1 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:31)

2C1 V_H DNA序列(SEQ ID No:32)

2C1 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:33)

2C1 V_L DNA序列(SEQ ID No:34)

2E11 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No：35)

2E11 V_H DNA序列(SEQ ID No：36)

2E11 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No：37)

2E11 V_L DNA序列(SEQ ID No：38)

4D4 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No：39)

4D4 V_H DNA序列(SEQ ID No：40)

4D4V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:41)

4D4 V_L DNA序列(SEQ ID No:42)

5C9 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:43)

5C9 VH DNA序列(SEQ ID No:44)

5C9 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:45)

5C9 V_L DNA序列(SEQ ID No:46)

5D1 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:47)

5D1 VH DNA序列(SEQ ID No:48)

5D1 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:49)

5D1 V_L DNA序列(SEQ ID No:50)

14B3 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:51)

14B3 V_H DNA序列(SEQ ID No:52)

14B3 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:53)

14B3 V_L DNA序列(SEQ ID No:54)

16D4 V_H 胺基酸序列(SEQ ID No:55)

16D4 V_H DNA序列(SEQ ID No:56)

16D4 V_L 胺基酸序列(SEQ ID No:57)

16D4 V_L DNA序列(SEQ ID No:58)

對胺基酸序列中互補決定區(CDR)加下劃線。

6F6嵌合體之選殖及表現

產生由對於重鏈而言移植至人類IgGl之親本鼠類V區或對於輕鏈而言人類C κ區組成之嵌合6F6抗體(6F6c)來表現可用以證實正確選殖功能性鼠類V區之重組抗體材料。編碼6F6鼠類重鏈及輕鏈V區之DNA及鼠類信號序列(Kabat等人"Sequences of Immunological Interest",NIH,1991，第五版，第30頁95VNP'CL)經同框選殖至已含有人類恆定區(分別為無效之IgGl Fc或人類C κ)之哺乳動物表現載體RLD-bshe(對於重鏈而言)及RLN-bshe(對於輕鏈而言)中。經由引入合適選殖位點，V_H 胺基酸序列之FR4(構架區4(CDR3之後及第一恆定域之前的V區序列))中胺基酸序列自如Seq ID19中所示之TTLTVSS變為TLVTVSS。

用於重鏈表現之RLD-bshe表現載體之元件

(上述元件位置及載體總尺寸僅為說明目的且視抗體鏈插入物尺寸而定)

用於輕鏈表現之RLN-bshe表現載體之元件：

(上述元件位置及載體總尺寸僅為說明目的且視抗體鏈插入物尺寸而定)

識別具有經正確選殖之V_H 及V_L 序列之純系且製備用於在CHO細胞中表現之質體。將經表現之6F6c抗體藉由FPLC系統上之蛋白質A層析而自細胞培養物上清液純化，且接著使用Biacore^TM 技術藉由ELISA及SPR測試與Aβ之結合。結果表明正確6F6小鼠V區經選殖及表現，產生具有與親本鼠類抗體6F6類似之特徵的功能抗體。

重鏈人類化策略

對於6F6小鼠可變重鏈序列而言，選擇與小鼠6F6可變重鏈序列(SEQ ID No:19)具有58%一致性(包括CDR)之人類生殖系受體構架(IGHV1-24,SEQ.I.D.NO:13)以及JH4小基因(Kabat：YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No:15))。JH4小基因殘基之頭四個殘基屬於經來自供體抗體之進入CDR置換的CDR3區。

基於序列比較及對抗體功能之可能影響來產生一組34個人類化可變重鏈變異體。將6F6鼠類重鏈CDR(使用Kabat定義)(SEQ ID No：1、2及3)移植至以上所選人類受體構架中。設計在選自位置1、5、13、24、27、28、29、30、37、40、41、48、66、67、69、71、75、76、93及94(Kabat編號)之兩至十五個位置處包含取代的許多人類化可變重鏈變異體(表7)。與Rabat定義之CDRH3緊鄰之位置93及94係包括在所研究之所有變異體中。

輕鏈人類化策略

對於6F6小鼠可變輕鏈序列而言，基於序列類似性選擇與小鼠6F6可變輕鏈序列(SEQ ID No：21)具有79%一致性(包括CDR)之人類生殖系受體構架(IGKV2-28)以及J區κ1(Kabat：WTFGQGTKVEIK)。JK-1小基因殘基之頭兩個殘基屬於CDR3區且與小鼠6F6輕鏈CDR3中之最後兩個殘基相同。

將6F6鼠類輕鏈CDR(使用Kabat定義)(SEQ ID No:4、5及6)移植至以上所選人類受體構架中得到可變直鏈移植輕鏈L0。基於序列比較及對抗體功能之可能影響來進一步產生一組13個人類化可變輕鏈變異體。設計在選自位置8、11、43、63、64、100及104(Kabat編號)之一至四個位置處包含取代的人類化可變輕鏈變異體(表8)。

人類化重鏈及輕鏈DNA之建構

藉由建立重疊寡聚物及PCR擴增或藉由使用現存變異體作為模板定向突變來重新合成人類化V區。包括選殖至哺乳動物表現載體RLD-bshe及RLN-bshe中之限制位點及小鼠信號序列(Kabat等人"Sequences of Immunological Interest",NIH,1991，第五版，第30頁95VNP'CL)。接著將編碼人類化V區以及信號序列及限制位點之PCR產物同框選殖至哺乳動物表現載體中：將重鏈變異體選殖至RLD-bshe中以產生編碼全長人類IgG1 Fc突變重鏈之DNA；將輕鏈變異體同框選殖至含有編碼人類κ恆定區DNA之RLN-bshe中以產生編碼全長人類κ輕鏈的DNA。

人類化重鏈及輕鏈抗體組合表現之代表性實例

CHOK1細胞最初係以小規模瞬時轉染來評定6孔培養盤中人類化輕鏈與重鏈DNA構築體之組合。使在具有5%超低IgG胎牛血清及2mM麩醯胺酸之DMEM F12中繼代之CHOK1細胞在6孔培養盤中生長至融合。將長滿細胞於Optimem Glutamax培養基(Invitrogen)中以總共7.5μgDNA:30μg轉染脂質(關於合適脂質，參見WO 2006/053783)轉染。將經轉染之細胞在37℃下在5% CO₂ 下培育。在72小時，收集上清液且檢定抗體濃度且接著藉由ELISA測試其與人類Aβ之結合。

藉由經由電穿孔共轉染編碼重鏈及輕鏈之RLD及RLN質體至CHO細胞中而以大規模表現人類化抗體。使用不含核苷之培養基來選擇表現適當抗體之穩定多株細胞群體。回收抗體且將其藉由使用ProsepA HiTrap管柱之FPLC自上清液純化。

評定β-澱粉狀蛋白結合ELISA中人類化V_H 變異體

評定以小規模表現於6孔培養物中之34個人類化V_H 變異體與人類Aβ肽(1-40)之結合。與L2輕鏈組合測試所有34條重鏈(參見下表8)。某些與L2之組合確實表現抗體物質，但不與β-澱粉狀蛋白1-40結合且因此不產生此等組合之EC50值。當可產生EC50值時，其可因實驗而有不同，但在與包含於各實驗中作為參照之使用6F6鼠類V區之嵌合構築體EC50值比較時在增加約30倍之EC50值至相同值的範圍內。將與Kabat定義之CDRH3緊鄰之殘基93及94維持在所有人類化變異體中。在結構上可考慮為CDRH1之部分的位置27-30(Chothia及Lesk(1987)J.M01. Biol. 196(4):901-917)在回復突變時提供比單獨93及94處取代更佳的結合。需要在殘基24及37處共同回復突變得到穩定結合，在此ELISA格式中且在與L2輕鏈組合時，沒有此等殘基中之任一者，則人類化變異體無法有效地結合Aβ肽(1-40)。表9展示基於與L2輕鏈之組合的依據澱粉狀蛋白結合特性的最佳人類化V_H 變異體。

"-"意謂保持自IGHV1-24受體構架序列不變之殘基

評定β_- 澱粉狀蛋白結合ELISA中人類化V_L 變異體

評定以小規模表現於6孔培養物中之人類化L0及V_L 變異體與人類Aβ肽(1-40)之結合。與H11組合測試所有變異體。表10概述所產生之所有功能性V_L 變異體。

更仔細檢查與輕鏈L2及L9、L10、L12及L13之最佳V_H 變異體H11重鏈組合。對於此等實驗而言，使用於懸浮CHO細胞中產生之經純化抗體物質。將使用兩種不同塗覆濃度之Aβ肽(1-40)之兩個獨立實驗結果展示於下表11中。

濃度係指用以塗覆微量滴定盤之Aβ肽；所展示之值係來自雙重孔且展示各對之SD。

結合溶液中人類β-澱粉狀蛋白1-40之競爭性ELISA

在競爭ELISA中評定6F6c及人類化抗體H1IL2、H11L9、H11L10、H11L12及H11L13結合溶液中Aβ1-40肽且抑制人類Aβ1-40肽與小鼠6F6單株抗體相互作用之能力。將恆定濃度之生物素標記之β-澱粉狀蛋白1-40以連續稀釋量之人類化6F6抗體變異體預培育。接著將包括經複合及游離澱粉狀蛋白之混合物添加至含有經固定小鼠6F6單株抗體之孔中且在室溫下培育15分鐘。洗滌培養盤且接著使用抗生蛋白鏈菌素-HRP共軛物來偵測仍可用於結合經固定親本6F6單株抗體之游離β-澱粉狀蛋白之量。

表12展示使用經純化之抗體物質之兩個獨立實驗之此競爭的IC50值。所有人類化變異體能夠以極類似IC50值有效地競爭與6F6親本單株抗體之結合。

藉由表面電漿共振檢定測定人類化變異體之結合動力學

使用Biacore T100儀器來測定所選重鏈與輕鏈組合之親和力。使用經由蛋白質A表面Biacore晶片固定之人類化抗體且注射β-澱粉狀蛋白1-40肽來進行三個獨立實驗。將6F6之嵌合分子用作參照分子。為此，根據製造者推薦藉由第一胺偶合將蛋白質A固定在CM5晶片上。使抗β-澱粉狀蛋白抗體俘獲在此表面上且穩定一段時間後，使人類β-澱粉狀蛋白1-40以等分稀釋液中256-2nM之濃度通過。使用經俘獲抗體表面上之緩衝注射液來雙參考根據Biacore最佳實踐之資料組。所選輕度酸性再生條件移除經俘獲抗體，但不顯著影響蛋白質A表面進行另一俘獲作用之能力。在25℃下於HBS-EP中進行此操作。以所有三種實驗平均值之形式將結果概述於表13中。

資料展示三個獨立實驗之平均KD及SD。

人類化抗體H11L9之抗原決定基精細定位

人類化單株抗體H11L9之最小結合抗原決定基係使用SRU BIND盤讀取器(SRU Biosytems)來精細定位。三個肽組係基於抗原決定基精細定位之18個胺基酸序列而產生：a)丙胺酸掃描肽組，其中殘基27-37中之10個經丙胺酸殘基連續置換；b)一組N末端經截短之肽，其中將一個殘基自以殘基23起始之18聚體肽N末端相繼移除，及c)一組C末端經截短之肽，其中將一個殘基自以殘基40起始之18聚體肽C末端相繼移除。

所有肽係以如下格式產生；生物素-SGSG連接子-PEPTIDE-醯胺，(若需要)延長連接子以確保所有肽為22聚體。

將經抗生蛋白鏈菌素塗覆之生物感應器培養盤(SRU Biosytems)以PBS洗滌且顛倒旋轉來移除緩衝液且接著以PBS、0.1% tween20及0.4%乙腈洗滌且顛倒旋轉來移除殘餘緩衝液。將孔再懸浮於100μl PBS，0.1% tween20及0.4%乙腈中且於SRU盤讀取器上讀取來確立基線值。接著移除50μl緩衝液且添加50μl經稀釋之肽且使其結合。接著將培養盤以PBS洗滌兩次且接著再懸浮於100μl PBS中且再量測基線值。基線值穩定後，移除50μl緩衝液且添加H11L9及對照抗體至30μg/ml之最終濃度。監控抗體之結合。將培養盤以PBS洗滌兩次且再懸浮於100μl PBS中，且將培養盤再量測且反向參照抗體添加來尋找藉由洗滌步驟移除之弱黏合劑。獲取經洗滌之培養盤結合水平且分析其與各種肽組之抗體結合。

區域之N末端缺失在相繼缺失殘基D23至N27時展示對結合無效。缺失K28引起結合降低超過50%，但缺失殘基G29至A30不進一步降低結合。缺失殘基I31及超出其之殘基完全破壞結合。其界定N末端邊界需要K28來完全結合。區域之C末端缺失在逐個缺失殘基V40至L34時展示對結合無效。然而，藉由缺失位置G33及超出其之位置完全破壞結合。其界定C末端邊界需要至少殘基G33來結合。因此，N及C末端缺失資料共同將H11L9精細定位至β-澱粉狀蛋白肽內最小抗原決定基KGAIIG殘基28-33。其證實使用單株抗體6F6之先前重疊之肽抗原決定基定位(但消除殘基M35)似乎引起信號與6F6結合之下降。

自殘基N27至G37之丙胺酸替代掃描展示以丙胺酸替代胺基酸I32及詳言之G33對結合具有最大影響。此資料亦證實G33對此抗體結合似乎為關鍵的以上C末端缺失資料。將結果以示意形式概述於表14中。

人類化抗體H11L9之去免疫

進行可能之Th細胞抗原決定基的矽評定，且重鏈可變及輕鏈可變域中之胺基酸序列(分別為SEQ ID No:24及SEQ ID No:26)中所選殘基經替代殘基置換以破壞此等抗原決定基同時保持功能性。V_h 之位置23、30、31、38、42、61及95及V_L 之殘基11、30、52及53經展示於表15及16中之替代胺基酸在各位置處置換。

藉由如上所述建立重疊寡聚物及PCR擴增或藉由使用H11及L9重鏈及輕鏈變異體作為模板定向突變來重新合成V區。包括選殖至哺乳動物表現載體RLD-bshe及RLN-bshe中之限制位點及小鼠信號序列(Kabat等人"Sequences of Immunological Interest",NIH,1991，第五版，第30頁95VNP'CL)。接著將編碼經修飾V區之產物選殖至哺乳動物表現載體中：將重鏈變異體選殖至具有pEF啟動子之RLD-bshe中來產生編碼全長人類IgGl突變重鏈之DNA；將輕鏈變異體同框選殖至具有含有編碼人類κ恆定區之DNA之pEF啟動子的RLN-bshe中來產生編碼全長人類κ輕鏈的DNA。

起初，表現新V_h 變異體H36-H44，且將其與L9輕鏈組合評定且表現新V_L 變異體L15-L18且將其與H11重鏈組合評定。使用表現培養物上清液及ELISA及Biacore分析來檢定經表現抗體與合成β澱粉狀蛋白1-40之結合。根據此評定，將最佳保留結合效力之單一變化組合，產生重鏈及輕鏈構築體H45-H51及L19-L22。如上所述此等新鏈變異體再次係與搭配物鏈H11及L9組合表現。由此第二組變異體，將最佳重鏈(H48-H51)或輕鏈(L19-L21)彼此組合來產生第三組，再次表現該第三組且藉由Biacore研究其與β澱粉狀蛋白1-40之結合動力學。表17展示彼等組合及結合動力學。

用以測定結合動力學之Biacore方法

藉由第一胺偶合將抗人類IgG(Biacore BR-1008-39)與CM5生物感應器晶片偶合。將抗β澱粉狀蛋白抗體俘獲於此表面上。接著使β澱粉狀蛋白(1-40)以256、64、16、4及1nM與用於雙重參考之OnM一起通過(亦即使緩衝液單獨通過經俘獲之抗體表面)。在各澱粉狀蛋白注射之間，使用3M MgCl₂ 使表面再生，其移除經俘獲之抗體，但不顯著影響抗人類表面俘獲抗體以用於後續分析的能力。使用T100所固有之1:1模型來分析資料。使用HBS-EP作為電泳緩衝液在25℃及37℃下進行電泳。

亦評定來自此組之一些構築體在生理溫度下之結合動力學。表18展示在37℃下此等構築體之子集之結合動力學。

受體構架V區之胺基酸序列及人類化變異體

IGVH1-24重鏈受體構架V區，胺基酸序列(SEQ ID No:13)

IGVH1-24重鏈受體構架V區DNA(SEQ ID No:14)

IGKV2-28輕鏈受體構架V區胺基酸序列(SEQ ID No:16)

IGKV2-28輕鏈受體構架V區DNA(SEQ ID No:17)

人類化重鏈V區變異體H11 DNA序列(SEQ ID No:23)

人類化重鏈V區變異體H11胺基酸序列(SEQ ID No:24)

人類化輕鏈V區變異體L9 DNA序列(SEQ ID No:25)

人類化輕鏈V區變異體L9胺基酸序列(SEQ ID No:26)

成熟H11重鏈胺基酸序列(SEQ ID No:27)

成熟L9輕鏈胺基酸序列(SEQ ID No:28)

最佳H11重鏈DNA(SEQ ID No:29)

最佳L9輕鏈DNA(SEQ ID No:30)

H48重鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:59)

H48重鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:60)

H49重鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:61)

H49重鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:62)

H50重鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:63)

H50重鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:64)

H51重鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:65)

H51重鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:66)

L19輕鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:67)

L19輕鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:68)

L20輕鏈V區變異體胺基酸序列(SEQ ID No:69)

L20輕鏈V區變異體DNA序列(SEQ ID No:70)

L21輕鏈V區2異體胺基酸序列(SEQ ID No:71)

L21輕鏈V區2異體DNA序列(SEQ ID No:72)

圖1展示使用6F6抗體或6E10(特異於人類Aβ1-16之抗體；商用試劑，Eurogentec)及5G5(特異於Aβ1-42之抗體；家用試劑)的各種形式β-澱粉狀蛋白之西方墨點偵測。

圖2展示條形圖，其展示在以17mg/kg或33mg/kg6F6處理後，以表述為平均值±平均值標準差之皮質斑塊面積%表述的皮質及海馬區轉殖基因hAPP小鼠腦切片中之斑塊負荷。

圖3展示條形圖，其展示在以17mg/kg或33mg/kg6F6處理後，以表述為平均值±平均值標準差之每平方毫米斑塊數目表述的皮質及海馬區轉殖基因hAPP小鼠腦切片中之斑塊負荷。

圖4展示偵測年老CFH-/-小鼠視網膜中澱粉狀蛋白β。

圖5展示年老CFH-/-小鼠視網膜中6F6與澱粉狀蛋白β之交叉反應性。

(無元件符號說明)

Claims (41)

1. 一種治療用抗體，其為與β-澱粉狀蛋白肽結合之抗體或其抗原結合片段及/或衍生物，且其包含以下CDR：CDRH1：VYYVH(SEQ ID No：1)CDRH2：RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No：2)CDRH3：SGY(SEQ ID No：3)CDRL1：RSSKSLLHRNGITYL(SEQ ID No：4)CDRL2：QMSNLAS(SEQ ID No：5)CDRL3：AQNLELWT(SEQ ID No：6)。
2. 如請求項1之治療用抗體，其中人類受體重鏈構架係源自IGHV1-24(SEQ ID No：13)以及構架4(SEQ ID No：15)。
3. 如請求項2之治療用抗體，其中整個重鏈CDR3序列係由供體免疫球蛋白提供。
4. 如請求項1之治療用抗體，其中人類受體輕鏈構架係源自IGKV2-28(SEQ ID No：16)以及構架4(SEQ ID No：18)。
5. 如請求項1之治療用抗體，其中該人類受體重鏈構架係源自IGHV1-24及JH4小基因，且該人類受體輕鏈構架係源自IGKV2-28及JK-1小基因，該等構架視情況含有一或多個基於見於具有序列SEQ ID No：19之供體V_H 域及具有序列SEQ ID No：21之供體V_L 域之相應殘基的胺基酸殘基取代，其維持供體抗體對β-澱粉狀蛋白肽之所有結合親和力，或相較於供體抗體對β-澱粉狀蛋白肽結合親和力 降低至多五倍。
6. 如請求項5之治療用抗體，其中該人類受體重鏈構架具有一或多個選自以下殘基之胺基酸殘基取代(或其保守取代)：
7. 如請求項6之治療用抗體，其中該人類受體重鏈構架包含以下殘基(或其保守取代)：
8. 如請求項5至7中任一項之治療用抗體，其中該人類受體輕鏈構架具有一或多個選自以下殘基之胺基酸殘基取代(或其保守取代)：
9. 如請求項8之治療用抗體，其中該人類受體輕鏈構架包含以下殘基(或其保守取代)：
10. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：24列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：26列出序列的V_L 域。
11. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：59列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：67列出序列的V_L 域。
12. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：61列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：67列出序列的V_L 域。
13. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：63列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：67列出序列的V_L 域。
14. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：65列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：67列出序列的V_L 域。
15. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：59列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：69列出序列的V_L 域。
16. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：61列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：69列出序列的V_L 域。
17. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：63列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：69列出序列的V_L 域。
18. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：65列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：69列出序列的V_L 域。
19. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：59列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：71列出序列的V_L 域。
20. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：61列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：71列出序列的V_L 域。
21. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：63列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：71列出序列的V_L 域。
22. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：65列出序列的V_H 域及具有SEQ ID No：71列出序列的V_L 域。
23. 一種治療用抗體，其包含具有SEQ ID No：27列出序列的重鏈及具有SEQ ID No：28列出序列的輕鏈。
24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至23中任一項之治療用抗體。
25. 一種如請求項1-23中任一項之治療用抗體之用途，其係用於製造用於治療β-澱粉狀蛋白肽相關疾病之藥劑。
26. 如請求項25之用途，其中該疾病為阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、年齡相關之黃斑退化(AMD)、青光眼或β-澱粉狀蛋白依賴性白內障形成。
27. 如請求項25之用途，其中該藥劑係與補體路徑抑制劑或補體路徑活化子抑制劑組合投與。
28. 如請求項27之用途，其中該補體路徑抑制劑為補體因子H(CFH)或可溶性補體受體1(sCR1)。
29. 如請求項27之用途，其中該補體路徑活化子抑制劑為補體因子D(CFD)抑制劑。
30. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1-23中任一項之抗體 及補體路徑抑制劑或補體路徑活化子抑制劑。
31. 如請求項30之醫藥組合物，其中該補體路徑抑制劑為補體因子H(CFH)或可溶性補體受體1(sCR1)。
32. 如請求項30之醫藥組合物，其中該補體路徑活化子抑制劑為補體因子D(CFD)抑制劑。
33. 如請求項1至7及10至23中任一項之抗體，其係用於治療β-澱粉狀蛋白肽相關疾病。
34. 如請求項33之抗體，其中該β-澱粉狀蛋白肽相關疾病為阿茲海默氏病或以β-澱粉狀蛋白含量或β-澱粉狀蛋白沈積物升高為特徵之影響眼或視神經之疾病或病症。
35. 一種抗體或其片段，其包含具有序列：SEQ ID No：19之V_H 域及具有序列：SEQ ID No：21之V_L 域。
36. 一種抗原結合蛋白質(抗原結合蛋白質A)，其在ELISA檢定中與包含具有SEQ ID No：27所列序列之重鏈及SEQ ID No：28所列序列之輕鏈的抗體(抗體B)競爭結合β-澱粉狀蛋白。
37. 如請求項36之抗原結合蛋白質A，其中抗原結合蛋白質A與抗體B係以等莫耳量存在。
38. 如請求項36或37之抗原結合蛋白質A，其中抗原結合蛋白質A之存在，使抗體B與β-澱粉狀蛋白之結合在ELISA檢定中降低超過10%、20%、30%、40%或50%。
39. 如請求項36或37之抗原結合蛋白質A，其中在ELISA檢定中將β-澱粉狀蛋白結合至免疫檢定盤上。
40. 如請求項39之抗原結合蛋白質A，其中抗原結合蛋白質A 降低抗體B與結合於盤上之β-澱粉狀蛋白之結合，而非β-澱粉狀蛋白特異性對照物則否。
41. 一種包含重鏈及輕鏈之抗體，其包含分別與SEQ ID No：27及SEQ ID No：28胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%相同之多肽，其中該抗體與β-澱粉狀蛋白結合。