CN101970484A - 抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种结合β-淀粉样肽，尤其是人β-淀粉样肽的抗原结合蛋白；公开使用所述的抗原结合蛋白治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白的水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加，尤其是阿尔茨海默病，和特征是β-淀粉状蛋白的水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加而影响眼睛或视神经的疾病或病症(包括年龄相关性黄斑变性、青光眼型疾病和β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成)；还公开一种包括所述的抗原结合蛋白的药物组合物；以及还公开了制备方法。

Description

抗原结合蛋白
技术领域
本发明涉及包括抗体的抗原结合蛋白，其中所述的抗体结合β-淀粉样肽，尤其是结合人β-淀粉样肽。本发明还涉及使用结合β-淀粉样肽，尤其是结合人β-淀粉样肽的抗原结合蛋白治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白的水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加，尤其是阿尔茨海默病和特征是β-淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加而影响眼睛或视神经的疾病或病症(包括年龄相关性黄斑变性、青光眼型疾病和β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成)。通过以下的说明书的描述，本发明的其它方面将会显而易见。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是与年龄相关的认知功能减退的最主要诱因，影响全球超过一千两百万人(Citron M(2002)Nat.Neurosci 5，Suppl 1055-1057)。该病的最早阶段的特征是与认知功能减退以及语言和行为缺陷相关的记忆力的渐进性丧失。在疾病的后期阶段，病人发展到全面性遗忘，且行动能力大大减退。一般在确诊后9年内死亡，且该病通常伴有其它病症，常见的是肺炎(Davis K.L.和Samules S.C.(1998)in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J.and Coyle J.T.(McGraw-Hill，New York pp267-316))。当前的治疗是根据病症进行治疗的方法，集中在缓解认知障碍和改善与渐进性病因有关的行为症状。实践中，这些治疗仅对认知障碍的水平提供短期益处，据报道，仅仅持续多达2年。减缓和可能阻止疾病的恶化的修正疾病的疗法的可能性是很大的。这些方法将对患者的生活质量提供根本和持续的改善，重要的是改善患者的护理者的生活质量，以及在整体上降低该病所需的巨大的卫生保健费用。
尽管诊断性的生物标记物和成像正在研究中，但是诊断阿尔茨海默病的临床诊断目前基于诊断有可能或很可能是阿尔茨海默病患者的体力和智力测试的组合(Sonnen等人(2007)Expert Rev Neurotherapeutics 7(8)：1021-1028；Lockhart等人(2007)Brain 130：2607-2615)。患者死亡后，通过在大脑中明确表征的神经特征以证实该疾病，该特征包括在实质斑块和脑血管中的Aβ的沉积、神经原纤维缠结的神经内形成、突触损失和在特定脑区的神经细胞亚群的损失(Terry，RD(1991)J Neural Trans Suppl 53：141-145)。
尽管在死后的检测中观察到的实际Aβ沉积是否是认知衰退的真实原因近来变得越来越不清楚(Ferreira ST(2007)Life 59(4-5)：332-345)，但是大量的遗传学、组织学和功能性证据表明β-淀粉样肽(Aβ)对阿尔茨海默病的发展起重要作用(Selkoe，D.J.(2001)Physiological Reviews 81：741-766)。业已知道，通过称作BACE1的天冬氨酸蛋白酶(也称β-分泌酶、Asp2或Memapsin-2)来裂解β-淀粉样前体蛋白(也称作APP)制备Aβ(De Strooper，B.和Konig，G.(1999)Nature 402：471-472)。除了实质和血管的沉积，已假定Aβ的可溶性低聚物形式有助于AD的发病，且它们可通过最初损害突触功能来影响神经功能(Lambert等人(1998)Proceedings of the National Academy of Science，U.S.A.95：6448-6453；Kayed等人(2003)Science 300：486-489；Cheng等人(2007)J Biol Chem 282(33)：23818-23828；Ferreira等人(2007)Life 59：332-345)。尽管很早就在AD和轻度认知障碍(MCI)中发现有不溶的淀粉样斑块，但是可溶的Aβ聚集(有时指低聚物或Aβ衍生的离散配体(ADDLs))的水平在这些个体中也有增加，并且可溶的Aβ的水平与神经原纤维退化和突触标记物的损失比淀粉样斑块都更相关(Naslund等人(2000)J Am Med Assoc 283：1571-1577，Younkin，S.(2001)Nat.Med.1：8-19)。此外，这些低聚体在原纤维形成的过程中可代表前体，清除或中和它们可阻止毒性效应和原纤维的形成(Ferreira ST(2007)Life59(4-5)：332-345；Gong Y(2003)PNAS 100：10417-10422)。尽管有这些发现，但是高度促淀粉样变的Aβ42和氨基末端截短形式的Aβx-42是在弥漫和衰老的斑中发现的Aβ的最主要的种类(Iwatsubo，T(1994)Neuron.13：45-53，Gravina，SA(1995)J.Biol.Chem.270：7013-7016)，且Aβ42的相对水平似乎不仅是AD的生物标记，而且也是Aβ聚集为淀粉样斑块的主要调节剂。业已表明Aβ42比其它的Aβ形式更容易在体外聚集(Jarrett，JT(1993)Biochemistry.32：4693-4697)，且也已表明这种Aβ42是AD发病机理的启动分子(Younkin SG，(1998)J.Physiol.(Paris).92：289-292)。尽管Aβ42通常是APP代谢的少量产物，但是其产量的细微变化会给Aβ的沉积带来巨大的影响，因此，已想到单独地减少Aβ42可能是治疗AD的有效途径(Younkin SG，(1998)J.Physiol.(Paris).92：289-292；Levites等人(2007)J Clin Invest.116(1)：193-201)。为支持该论点，有报道指出淀粉样前体蛋白(APP)和早老素基因的突变显著地升高了Aβ42的相对水平，因而缩短了阿尔茨海默病(AD)的发病时间(Selkoe D.J.，Podlisny M.B.(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：67-99)。然而需要强调的是，淀粉状蛋白的沉积比例也取决于整体的淀粉状蛋白的水平、分解代谢和从CNS中清除Aβ的效率，其中已表明，CNS受年龄和AD病人中发现的淀粉状蛋白的水平升高的负面影响，(Deane等人(2005)J Neurosci 25(50)：11495-11503；Wang等人(2006)Drug Discovery Today 11(19/20)：931-938)。在该方面已越来越明显，Aβ在中枢神经系统(CNS)与血浆之间的输送对大脑淀粉状蛋白水平的调节起着很重要的作用(Shibata，等人(2000)J Clin Invest 106：1489-1499)，Aβ通过输送机制(如LRP-1)快速地从CNS输送到血浆中，且Aβ通过结合到RAGE的方式快速地从血浆输入到CNS中(Zlokovic BV(2004)J Neurochem 89：807-811)。因此，正在开发带Aβ肽的活性疫苗或结合周围的Aβ从而改变血浆、CSF与CNS之间的动力学平衡的特异性Aβ抗体的被动给药。事实上，现在有很多研究都表明这些方法可降低Aβ的水平、减轻A的病理，且在某些情况下对淀粉状蛋白病的多种转基因模型提供认知益处。也在更高级的种属上作了有限的研究(Lemere，CA(2004)Am J Pathology 165：283-297；Gandy，S(2004)Alzheimer Dis Assoc Disord 18：44：46)。
通过在小鼠中过表达突变人转基因，以得到淀粉状蛋白沉积的动物模型。过量表达单个人类APP转基因的小鼠通常从12个月龄发展类似大脑斑块状的β-淀粉状蛋白沉积(Games D.等人.，(1995)Nature 373：523-527；Hsiao K.等人.，(1996)Science 274：99-102))，而携带突变人类APP和早老因子-1(PS-1)转基因的小鼠通常早在2个月龄时就发展类似大脑斑块状的β-淀粉样沉积(Kurt M.A.等人.，(2001)Exp.Neurol.171：59-71；McGowan E.等人.，(1999)Neurolbiol.Dis.6：231-244)。在多种用于转基因小鼠模型中的这些巨大的生物差异导致很难比较不同方法的药理作用和效率。对于免疫疗法如何靶向β-淀粉状蛋白以及它的各种形式如何实际工作，在该领域还没有真正达成共识。很有可能是带有不同结合特性的不同抗体在那些动物模型中具有可变化的结果。也有可能是抗体可通过多种机制起作用，且已记述的不同作用模式并不相互排斥(Levites等人(2007)J Clin Invest.116(1)：193-201)。
临床使用的靶向大脑淀粉状蛋白的首个免疫疗法是Elan/Wyeth’sAN-1792，一种活性疫苗。在出现与脑膜脑炎一致的临床症状后停止上述治疗。亚群分析表明治疗使认知功能的衰退减慢(Nature Clin Pract Neurol(2005)1：84-85)。病人的验尸分析也发现有斑块被清除的证据(Gilman S.等人，(2005)Neurology 64(9)1553-1562)。
正在研发一种被动单克隆抗体-Bapineuzumab(AAB-001，Elan/Wyeth)。
特征是β-淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加的其它疾病或病症包括轻度认知功能障碍(Kelley BJ(2007)Neurologic Clinics 25(3)，577-609)、具有荷兰(Dutch)型β-淀粉状蛋白病的遗传性脑出血、脑淀粉样血管病和各种类型的变性痴呆如与帕金森病相关的那些疾病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性和弥漫性路易体型(Lewis body)阿尔茨海默病(Mollenhauer B(2007)J Neural Transm e-published 23 Feb 2007，van Oijen，M Lancet Neurol.20065：655-60)、唐氏综合征(Mehta，PD(2007)J NeurolSci.254：22-7)、年龄相关性黄斑变性(AMD)(Johnson LV等人(2002)PNAS USA 99：11830-11835；Anderson DH等人(2004)Exp Eye Res 78：243-256)，“青光眼型”疾病(Guo L等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104：13444-13449)以及Aβ依赖的白内障形成(Goldstein LE等人(2003)Lancet 361：1258-1265；Li G等人(2003)Mol Vision 9：179-183)。
在发达地区，年龄相关性黄斑变性(AMD)是导致失明的主要原因。AMD有两种主要的临床表现。萎缩性(干的)AMD的特征是视网膜色素上皮(RPE)和视神经视网膜(neuroretina)的变性。萎缩性AMD的初期阶段与在RPE细胞层下的玻璃疣的形成有关。早期的萎缩性AMD可逐渐发展到疾病的末期，其中RPE完全退化并在黄斑区急剧形成RPE萎缩的标定区域：“地理萎缩”。在这种形式的疾病中，RPE的退化导致黄斑视网膜杆和视锥的二次死亡，且在这些情况下将导致严重的与年龄相关的视力丧失。一部分AMD患者发展成可被认作不同的形式，或者更进一步发展成更复杂的疾病。大约10-20％的AMD患者演变成脉络膜新生血管病(CNV)。当这种情况发生时，这种疾病称作“湿AMD”，且这可与一些最严重的视力丧失相关。在湿AMD中，新的脉络膜血管生成，其穿过布鲁赫(Bruch)膜的破裂处并在RPE和视神经视网膜中及其下层进行增殖。在通常情况下，萎缩性AMD在湿的形式发展之前就在眼中进展，然而，虽然不常见，但可在没有先前的萎缩形式形成之前发展新生血管形式。在该疾病的两种形式中，由于感光细胞的死亡而导致视力丧失，尽管在湿的AMD形式中，从CNV阶段形成的渗漏血管的内部出血也会导致视力丧失。鉴于AMD的治疗，已经研究出新颖的治疗方法来解决一些湿AMD的问题，尤其是通过抑制VEGF(血管内皮生长因子)或VEGF受体信号路径的各种分子以减少从CNV渗漏血管的出血。然而，目前仍然没有确定的治疗方法来治疗非常普遍的AMD萎缩形式或者预防早期的干AMD进展成地理萎缩或湿的AMD(Petrukhin K(2007)Expert Opin Ther Targets 11：625-639)。
尽管还没有完全理解导致RPE中的Aβ产生的确切机理和Aβ影响AMD的确切机理，但是有证据表明通过结合且可能中和或仅仅除去Aβ的药剂来清除Aβ可能提供清除AMD中的玻璃疣的一条可能的途径，从而减少AMD的互补的激活作用，减少RPE萎缩并可能减少RPE中的VEGF表达的诱导和在玻璃疣附近以高水平定位。因此，由于AMD及其发展到地理萎缩和/或渗出性AMD，这种疗法可预防、延缓、减轻或者是逆转视力丧失。这将导致含有玻璃疣的Aβ和或RPE的周围环境中的局部Aβ的水平降低，从而干扰早期和晚期AMD并治疗导致视力丧失的潜在的细胞衰亡。
近来，一些出版物清楚地表明补体蛋白与在AMD形成中的淀粉状蛋白β有相互作用(Wang，J.等人.，(2008)J.Immunol.181：16651-6)。业已显示，淀粉状蛋白β结合到补体因子I，与因子H结合的辅因子负责将C3b从补体蛋白C3裂解成它的不活跃的形式iC3b(Wang，J.等人.，2008)。近期出版的体外研究结果表明支持这一假设，其中淀粉状蛋白β通过阻止补体因子I的功能，从而引起视网膜下组织的低级、慢性炎症来激活玻璃疣中的补体系统；因而其连接与AMD形成相关的四个因素：炎症、补体激活、淀粉状蛋白β沉积和玻璃疣(Wang，J.等人.，2008)。这种淀粉状蛋白β通过与补体因子H潜在竞争与补体因子I结合对激活可替代的补体路径的效应的直接证据在以前还没有记载(Wang，J.等人.，2008)。
“青光眼型疾病”是用于导致眼睛的视神经损伤并引起失明的一组疾病的总称。世界上最终引起失明的主要原因是眼内压升高(IOP)和视力下降。眼内压升高与如何导致视网膜神经节细胞(RGC)的凋亡之间的联系还没有完全清楚。仅仅是高的IOP可诱导凋亡(Cordeiro M F等人(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101：13352-13356；Quigley H A等人(1995)InvestOphtalmol Visual Sci 36：774-786)，但其本身并非视神经细胞死亡的唯一因素。此外，业已发现视力会持续变坏，即使在使用降低眼压的药剂治疗后，IOP正常以后也会持续变坏(Oliver JE等人(2002)Am J Ophthamol133：764-772)。
近期有报道指出β-淀粉状蛋白的潜在的细胞毒效应与青光眼中的RGCs的细胞凋亡有关(McKinnon SJ等人(2002)Invest Ophtamol Visual Sci43：1077-1087)。在青光眼的动物模型中，已证明胱天蛋白酶-3蛋白酶在RGCs中被激活，其通过胱天蛋白酶-3产生的包括β-淀粉状蛋白的APP的潜在的有毒片段，引起淀粉样前体蛋白(APP)的异常加工(McKinnon等人(2002)；Cheung ZH等人(2004)Mol Cell Neurosci 25：383-393)。在其它细胞中，RGCs已显示表达APP，因此这看起来是β-淀粉状蛋白的可信来源。尽管主要在体外系统中发现，但是APP水平的升高与β-淀粉状蛋白水平的升高都表明与激活胱天蛋白酶-3有关。但对以下的问题还是不清楚，即是否RGCs中的APP水平也在青光眼中升高，从而有助于在正反馈机制中产生更多的β-淀粉状蛋白。即使是在最近，在青光眼的大鼠模型中的RGCs的细胞凋亡也表明涉及β-淀粉状蛋白(Guo等人(2007))。对靶向β-淀粉状蛋白或β-淀粉状蛋白生成的几种药剂做了试验，得出当所有的3种治疗一起进行时，体内的视网膜神经节细胞的死亡以可能轻度的增强效应减少。通过使用抗β-淀粉状蛋白的抗体，能观察到最大效应，该效应几乎与一起使用3种药剂所观察到的效应相当。
尽管导致RGCs中β-淀粉状蛋白产生的确切机理以及其与IOP联系还没有完全明白，但证据表明通过使用结合并可能中和或仅仅除去β-淀粉状蛋白的药剂以清除β-淀粉状蛋白可提供一条可能的途径来预防青光眼的RGC细胞凋亡，由此得到延迟、减轻或逆转青光眼的视力丧失的方法。这将导致RGCs和周围环境中的β-淀粉状蛋白的水平降低，藉此解决了引起视力丧失的可能的细胞衰亡。
β-淀粉状蛋白可在其它的眼病中起作用，且其与超核性白内障(尤其是在AD患者中观察到的那些)的形成有关，Aβ产生的成分和加工途径呈现在透镜中(Goldstein LE，等人.，(2003)；Li G，等人.，(2003))。因此，所述用于干扰AMD和青光眼型疾病的治疗方法可用于预防Aβ依赖的白内障的形成。
WO 2008/110885涉及用针对淀粉样-β肽的抑制剂以治疗眼科疾病的方法。具体地，该发明公开了结合在似乎包括25-34和40的Aβ1-40上的表位的抗体6G。
发明内容
根据本发明的一方面，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位。
在具体的实施方式中，所述治疗性的抗原结合蛋白识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-34的β-淀粉样肽表位。
在更具体的实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-33的β-淀粉样肽的表位。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别在β-淀粉状蛋白的残基28-35的区内的β-淀粉样肽的表位。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别由β-淀粉状蛋白的残基28-33、28-34或28-35组成的β-淀粉样肽的表位。
在本发明的实施方式中，本发明提供结合需要的β-淀粉状蛋白的残基32和33的治疗性抗原结合蛋白。
在本发明的实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物。
在本发明的实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其是抗原结合蛋白，如抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，该抗原结合蛋白结合β-淀粉样肽且包括以下的CDRs：
CDRH1：VYYVH(SEQ ID No：1)
CDRH2：RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No：2)
CDRH3：SGY(SEQ ID No：3)
CDRL1：RSSKSLLHRNGITYLY(SEQ ID No：4)
CDRL2：QMSNLAS(SEQ ID No：5)
CDRL3：AQNLELWT(SEQ ID No：6)
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种抗原结合蛋白，如抗体或其抗原结合片段，该抗原结合蛋白特异性结合β-淀粉样肽并包括为上述的序列的变体的CDR’s。
CDR变体包括通过以下方式得到的CDR氨基酸序列的部分变化：通过CDR的一个至多个氨基酸缺失或置换，或者通过在CDR的一个至多个氨基酸添加或插入，或前述的组合方式。CDR变体可包含在CDR的氨基酸序列中的1、2、3、4、5或6个氨基酸置换、添加或缺失。CDR变体可包含在CDR氨基酸序列中的1、2或3个氨基酸置换、插入或缺失。氨基酸残基中的置换物可以是保守性置换，例如将一个疏水性氨基酸用另一个疏水性氨基酸酸进行置换。例如，可用缬氨酸或异亮氨酸置换亮氨酸。
包含变体CDR的抗原结合蛋白与上述讨论的那些包含CDRs的抗原结合蛋白的功能特性相同或相似。因此，包含变体CDR的抗原结合蛋白将以与上述的CDR的相同或相似的结合亲和力结合到相同的靶蛋白或表位。
例示性的抗体是6F6鼠科单克隆抗体。在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种包括前述的6F6的CDRs的人源化或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可包括6F6鼠科抗体的可变区，即SEQ ID No：19(VH)和SEQ ID No：21(VL)。基于鼠科6F6的人源化抗体的例子是包含具有SEQ ID No：27的重链或具有SEQ ID No：28的轻链的抗体。
在整份说明书中，术语″CDR″、″CDRL1″、″CDRL2″、″CDRL3″、″CDRH1″、″CDRH2″和″CDRH3根据Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH，1987阐释的Kabat编号系统定义。因此，以下是本发明的CDRs的定义：
CDR：残基
CDRH1：31-35
CDRH2：50-65
CDRH3：95-97
CDRL1：24-34
CDRL2：50-56
CDRL3：89-97
IGHV1-24(SEQ ID No：13)是人类种系序列，其是移植VH CDRs的合适的接受者构架。在特殊的方面，人接受者重链构架是源自IGHV1-24。在本发明的替代性实施方式中，所述人接受者构架包括人重链可变区序列，其中该序列相对于整条鼠科6F6重链可变序列(排除CDR序列)具有90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
对于氨基酸和核酸序列，术语“相同”或“序列的同一性”是指当最佳排列并与适当的插入部分或缺失部分进行比较时，两个氨基酸或两个核酸序列之间的同一性程度。或者，当在可选择的杂交条件下，DNA片段与链的补体杂交时，存在基本同一性。考虑到需要被引入以得到两个序列的最佳排列的间隙(gap)数量和每个间隙的长度，两个序列之间的同一性百分比随着序列共用的相同位置的数量而变(即％同一性＝相同位置的数量/位置总数量，再乘以100％)。如下所述，使用数学算法可完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。
使用GCG软件包中的GAP程序和使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的间隙重量和1、2、3、4、5或6的长度重量，可计算出两个核苷酸序列之间的同一性百分比。使用PAM120重量残基表，间隙长度损失(penalty)12和间隙损失(gap penalty)4，两个核苷酸或氨基酸序列的同一性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller的算法测定(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))，其已并入ALIGN程序(2.0版)中。此外，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的间隙重量和1、2、3、4、5或6的长度重量，并使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法可确定两个氨基酸序列的同一性百分比，该算法已并入GCG软件包的GAP程序中。
举例说明，多核苷酸序列可与所述的参考多核苷酸序列相同，也就是有100％的同一性，或者与参考序列比较，它包括多达某个整数的核苷酸改变，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性。这样的改变选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换或颠换)或插入，其中，所述的变化可在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置发生，或在那些末端位置之间的任何位置发生，该变化单独地分散在参考序列的核苷酸中或在参考序列中的一个或多个相邻的组中。核苷酸变化的数量通过如下方法得到：参考多核苷酸序列中的核苷酸的总数量乘以各自的同一性百分比的百分比数值(除以100)并从参考多核苷酸序列中的所述核苷酸的总数量减去得到的上述结果，或者：
nn≤xn-(xn·y)，
式中，nn是核苷酸变化的数量，xn是参考多核苷酸序列中的核苷酸的总数量，对于50％y为.50、60％则y为0.60、70％则y为0.70、75％则y为0.75、80％则y为0.80、85％则y为0.85、90％则y为0.90、95％则y为0.95、98％则y为0.98、99％则y为0.99或者100％则y为1.00，·表示乘号，且其中xn和y的任何的非整数结果都四舍五入到最接近的整数，再用xn减去该四舍五入的结果。
类似地，正如本文所述，多肽序列也可能与多肽参考序列相同，即是100％的相同，或者它可与参考序列相比含有多达某一整数值氨基酸的变化，以至于同一性百分比小于100％，例如至少是50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性。这种变化选自以下的方式：至少一个氨基酸缺失、置换(包括保守性的和非保守性的置换)、或者插入，且其中所述的变化可以发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置上，或者发生在那些末端位置之间的任何位置，其单独地分散在参考序列的氨基酸中或在参考序列中的一个或多个相邻的组中。对于给定的同一性百分比值的氨基酸变化数量通过如下方法得到：由本文所述的多肽参考序列编码的多肽序列中的氨基酸总数量乘以各自的同一性的百分比值(除以100)，再从所述多肽参考序列中的氨基酸总数中减去得到的数值，或者：
na≤xa-(xa·y)，
式中，na是氨基酸变化的数量，xa是多肽序列中氨基酸的总数量，对于50％则y为0.50、60％则y为0.60、70％则y为0.70、75％则y为0.75、80％则y为0.80、85％则y为0.85、90％则y为0.90、95％则y为0.95、98％则y为0.98、99％则y为0.99或者100％则y为1.00，·表示乘号，且其中xa和y的任意的非整数结果都四舍五入到最相近的整数，然后再用xa减去该整数。
％同一性可与序列的长度交叉(across)。
为了构建完整的V-区，构架4必须被加入到V-基因IGHV1-24编码的种系中。合适的构架4序列包括人类JH4小基因(Kabat)编码的序列：YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No：15)
本领域的技术人员应该理解，种系V基因和J基因不包括重链CDR3的完整性的编码序列。然而，在本发明的抗体中，完整的重链CDR3由供体免疫球蛋白提供。因此，VH基因(如IGHV1-24)、JH小基因(如JH4)与一系列的重链CDRs(如SEQ ID No：1，SEQ ID No：2和SEQ ID No：3，其以模仿成熟的完全重新排列的重链可变区的方式组合)的结合足以限定本发明的重链可变区。
IGKV2-28(SEQ ID No：16)是人类种系序列，是一种移植VL CDRs的合适的接受者构架。在一特定的方面，人接受者轻链构架源自IGKV2-28。在本发明的替代性的实施方式中，人接受者构架包括人的轻链可变区序列，相对于整个长度(排除CDR序列)，其与鼠科6F6的轻链可变序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
为了构建完整的V-区，构架4必须被加入到V-基因IGKV2-28编码的种系中。合适的构架4序列包括人类JK-1小基因编码(Kabat)的序列：WTFGQGTKVEIK(SEQ ID No：18)
本领域的技术人员应该理解，种系V基因和J基因不包括轻链CDR3的完整性的编码序列。然而，在本发明的抗体中，CDR3序列由供体免疫球蛋白提供。JK-1小基因残基的首两个残基在CDR3区的范围内。对于JK-1小基因，这些残基与轻链CDRL3(SEQ ID No：6)的最后两个残基相同。因此，VL基因(如IGKV2-28)、FR4(如JK-1)与一系列的轻链CDRs(如SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6，其以模仿成熟的完全重新排列的轻链可变区的方式组合)的结合足以限定本发明的轻链可变区。
在本发明具体的实施方式中，人接受者重链构架源自IGHV1-24和JH4小基因，且人接受者轻链构架源自IGKV2-28和JK-1小基因，基于在具有序列SEQ ID No：19的供体VH结构域和具有序列SEQ ID No：21的VL结构域中发现的相应的残基，所述的小基因任选包含一个或多个氨基酸残基取代，其中，所述的VH结构域和VL结构域维持供体抗体对β-淀粉样肽的全部或基本上全部的结合亲和力。“基本上全部的结合亲和力”是指与供体抗体相比，治疗抗体的结合亲和力减少最多减小5倍，更具体的是减少到1/2。
在本发明更具体的实施方式中，源自IGHV1-24和JH4的人接受者重链构架具有一个或多个，例如是1-15个，更具体的是2-15个氨基酸残基取代，该取代选自以下的残基(或其保守性的取代)：
Figure BPA00001204856700111
  13   K   E
  24   V   G
  27   Y   F
  28   T   N
  29   L   I
  30   T   K
  37   V   L
  40   A   L
  41   P   T
  48   M   I
  66   R   K
  67   V   A
  69   M   L
  71   E   V
  75   T   S
  76   D   N
  93   A   V
  94   T   S
在更具体的实施方式中，源自IGHV1-24和JH4的人接受者重链构架包括以下的残基(或其保守性的取代)：
Figure BPA00001204856700121
  40   A   L
  48   M   I
  66   R   K
  67   V   A
  69   M   L
  71   E   V
  93   A   V
  94   T   S
在本发明更具体的实施方式中，源自IGKV2-28和JK-1的人接受者轻链构架具有一个或多个，例如1-4个，更具体的是2个氨基酸残基取代，所述取代选自以下的残基(或其保守性的取代)：
Figure BPA00001204856700131
在本发明更具体的实施方式中，源自IGKV2-28和JK-1的人接受者轻链构架包括以下的残基(或其保守性的取代)：
Figure BPA00001204856700132
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：24所示的序列的VH结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：26所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：24所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：26所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其包含具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
抗体的重链可变区可与SEQ ID NO：24、59、61、63或65中的任意一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。抗体的轻链可变区可与SEQ ID NO：26、67、69或71中的任意一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，该抗体包含具有SEQ ID No：27所示的序列的重链。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，该抗体包含具有SEQ ID No：28所示的序列的轻链。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，该抗体包含具有SEQ ID No：27所示的序列的重链和具有SEQ ID No：28所示的序列的轻链。
任何重链可变区可与合适的人恒定区结合。任何轻链可变区可与合适的恒定区结合。
在具体的实施方式中，本发明的治疗性抗原结合蛋白是一种抗体或其片段和/或其衍生物，其基本上缺少以下功能：a)经经典路径激活补体；以及b)介导抗体依赖性细胞毒作用。
在本发明的另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括本发明的治疗性的抗原结合蛋白或治疗抗体。
在本发明的另一方面，本发明提供一种人类患者患有的与β-淀粉样肽相关的疾病的治疗方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的治疗性的抗原结合蛋白或治疗抗体给予所述患者的步骤。
在本发明的一个实施方式中，与β-淀粉样肽相关的疾病是阿尔茨海默病。在本发明的另一实施方式中，与β-淀粉样肽相关的疾病是影响眼睛或视神经的疾病或病症，其特征是β-淀粉样水平升高或β-淀粉样沉积增加。具体而言，所述与β-淀粉样肽相关的疾病可以是年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼或β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成。
在本发明的另一实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白与补体路径的抑制剂，例如尤其是替代性的补体路径的抑制剂联合给药，但不排除其它的抗-补体的方法：补体因子H(CFH)或其片段、可溶的补体受体1(sCR1)或其片段、可溶的膜辅因子蛋白(MCP)及其片段、可溶的衰变加速因子(DAF)及其片段。在上下文中，补体路径抑制剂是用于负调节补体路径尤其是替代性补体路径活性的分子。
在本发明的更进一步的实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白与补体路径激活剂的抑制剂，例如尤其是替代性的补体路径激活剂的抑制剂联合给药，但不排除其它的抑制方式或其它的补体路径标靶：抗体或抗体片段，如结构域抗体，以中和补体因子D(CFD)或补体因子B(CFB)的活性。
在本发明的上下文中，将补体成分C3的13-残基肽抑制剂compstatin和抗C5a补体成分抗体pexelizumab也被考虑用作补体路径激活剂的抑制剂。总的来讲，补体路径激活剂的抑制剂是在一定程度上抑制或拮抗给定的补体激活剂的生物活性，以至于其效应是负调节补体路径的活性，尤其是替代性的补体路径的活性。
近来，已有对靶向补体的治疗方法的综述(Ricklin，D & Lambris，J.(2007)Nature Biotechnology 25：1265-75，其整体地并入本文中作为参考)，且其中描述的抗补体路径的方式均可与抗淀粉状蛋白β的抗体组合使用，以提供新的治疗方法。被考虑的抗补体方法包括：(i)蛋白酶抑制剂如补体因子D抑制剂，(ii)可溶的补体调节剂，如可溶性截短的补体受体1，(iii)治疗性抗体，如针对补体因子D或B，(iv)补体成分抑制剂，如C5抑制剂，以及(v)受体拮抗剂，如小分子C5a受体拮抗剂。
补体路径抑制剂或补体路径激活剂的抑制剂可以同时、相继或错开的方式与本发明的治疗性抗原结合蛋白给药。
本发明还提供药物组合物，其包括本文定义的治疗性抗原结合蛋白和补体路径抑制剂或补体路径激活剂的抑制剂。
本发明还公开治疗性抗原结合蛋白或治疗性抗体在制备治疗β-淀粉样肽相关的疾病的药物中的用途。
本发明提供一种双特异性的抗体或其双特异性的片段，其第一特异性是针对β-淀粉状蛋白，例如是含有前述的β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位，以及第二特异性是针对补体路径的激活剂。
本发明还提供了本发明的抗原结合蛋白、本发明的抗体或本发明的双特异性抗体或其双异性片段在治疗与β-淀粉样肽相关的疾病中的应用。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种抗体或其片段，其包含具有序列SEQ ID No：19的鼠科VH结构域和具有序列SEQ ID No：21的鼠科VL结构域。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种编码抗体重链或其片段的多核苷酸，其包含具有序列SEQ ID No：19的鼠科VH结构域，尤其是提供SEQ ID No：20的多核苷酸。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种编码抗体轻链或其片段的多核苷酸，其包含具有序列SEQ ID No：21的鼠科VL结构域，尤其是提供SEQ ID No：22的多核苷酸。
在本发明的一个方面，本发明提供一种抗原结合蛋白，其在ELISA试验中与抗体竞争结合β-淀粉状蛋白，其中所述的抗体包含具有SEQ IDNo：27所示的序列的重链和SEQ ID No：28所示的序列的轻链。
本领域的技术人员应该理解，为了使抗原结合蛋白(抗原结合蛋白A)与包含具有SEQ ID No：27所示的序列的重链和SEQ ID No：28所示的序列的轻链的抗体(抗体B)竞争特异性的结合位点(β-淀粉状蛋白)，抗原结合蛋白A必须以足够的量存在，以在所述的试验中取得较好的效果。在具体的实施方式中，抗原结合蛋白A和抗体B以等摩尔量存在。在另一实施方式中，抗原结合蛋白A的存在使得在ELISA试验中抗体B与β-淀粉状蛋白的结合降低超过10％、20％、30％、40％或50％。在另一实施方式中，β-淀粉状蛋白结合到ELISA试验中的免疫测试板中。在另一实施方式中，抗原结合蛋白A使抗体B与结合β-淀粉状蛋白板的结合减少，而无β-淀粉状蛋白特异性的对照则未减少。
在本发明的进一步的方面中，所述抗原结合蛋白是包括重链和轻链的治疗性抗体，所述的重链和轻链包括分别与SEQ ID No：27和SEQ IDNo：28的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽，其中，所述的抗体结合了β-淀粉状蛋白。在优选的实施方式中，所述抗体识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位。
在本发明的另一方面中，本发明提供一种抗原结合蛋白，其与C-末端的生物素化的β-淀粉样肽结合，所述C-末端的生物素化的β-淀粉样肽包含由表面等离子共振确定的β-淀粉状蛋白的残基24-35(SEQ ID No：10)或28-39(SEQ ID No：11)，所述的肽固定在链霉亲和素的传感器芯片上。
在本发明的进一步的方面中，本发明提供一种抗原结合蛋白，尤其是单克隆抗体或其片段，其与β-淀粉状蛋白特异性结合并需要在β-淀粉状蛋白的28-35区中的至少一个残基以作连接之用。在优选的实施方式中，所述抗原结合蛋白还需要至少一个在所述的β-淀粉状蛋白的28-35区的至少一个残基侧翼的残基或与其结构上近似的残基以作连接之用。因此，所述抗原结合蛋白可独立地需要1、2、3、4、5个或更多个选自以下的残基：β-淀粉状蛋白的28、29、30、31、32、33、34和35，和侧翼或结构上近似的残基。
本领域的技术人员可用例如在ELISA试验中丙氨酸取代扫描，容易识别这种抗原结合蛋白。在此，不管抗原结合蛋白是否需要β-淀粉状蛋白的28-35区的残基或侧翼结构上近似的残基以作连接之用，其可通过用丙氨酸独立地取代所述的β-淀粉状蛋白的残基来确定，并使抗原结合蛋白与丙氨酸取代的β-淀粉样肽结合的结合亲和力与抗原结合蛋白与野生型的β-淀粉状蛋白结合的结合亲和力进行比较。不管是否需要β-淀粉状蛋白的28-35区的残基，其都通过抗原结合蛋白与丙氨酸取代的β-淀粉样肽的结合亲和力比与野生型的β-淀粉样肽的结合亲和力降低来确定，其中所述的降低的值比Biacore或ELISA亲和力测试得到的结果大1、2、3、4或5倍。
而且，上下文的结构近似的残基是与所讨论的残基在三维空间上非常近似的残基，且与抗原结合蛋白结合。本领域的技术人员应该理解，抗原表位可以是线性的或是非线性的肽序列。在后者的非线性的情况下，尽管所述残基来自肽链的不同区，但是它们可以在抗原的三维结构上非常近似。这种结构近似的残基可通过计算机模化程序确定或通过经本领域众所周知的方法得到的三维结构确定，例如X-射线结晶法。
本发明的另一方面提供一种制备本发明的抗体的方法，所述的方法包括在宿主细胞中表达编码抗体的多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种编码包含具有SEQ ID No：24所示的序列的VH结构域的治疗性抗体重链的多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种编码包含具有SEQ ID No：26所示的序列的VL结构域的治疗性抗体轻链的多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种编码包含具有SEQ ID No：27所示的序列的治疗性抗体重链的多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种编码包含具有SEQ ID No：28所示的序列的治疗性抗体轻链的多核苷酸。
在本发明的更具体的实施方式中，本发明提供一种编码治疗性抗体重链的多核苷酸，所述的多核苷酸包含SEQ ID No：29所示的序列。
在本发明的另一更具体的实施方式中，本发明提供一种编码治疗性抗体轻链的多核苷酸，所述的多核苷酸包含SEQ ID No：30所示的序列。
附图说明
图1所示为使用6F6抗体或6E10(人Aβ1-16的特异性抗体；商售试剂，Eurogentec)和5G5(Aβ1-42的特异性抗体；实验室试剂)的各种形式的β-淀粉状蛋白的Western blot检测结果。
图2所示为柱状图，其表示经过17mg/kg或33mg/kg 6F6治疗之后，转基因hAPP小鼠的皮层和海马的脑切片中的斑块的量，以看得见的斑块区的平均百分比表示，其结果表示为平均值±平均值的标准误差。
图3所示为为柱状图，表示用17mg/kg或33mg/kg 6F6治疗之后，转基因hAPP小鼠的皮层和海马脑切片中的斑块的量，以每mm2的斑块的数量进行表示，其结果表示为平均值±平均值的标准误差。
图4所示为成年CFH-/-小鼠的视网膜中的β-淀粉状蛋白的测定结果。
图5所示为6F6与成年CFH-/-小鼠的视网膜中的β-淀粉状蛋白的交叉反应。
具体实施方式
1.抗原结合蛋白
本文中使用的术语“抗原结合蛋白”是指抗体、抗体片段和其它的蛋白质构建体如结构域，尤其是以下所述的能够结合β-淀粉状蛋白的那些。
1.1完整抗体
本发明的抗原结合蛋白可以是“完整抗体”。本发明的抗原结合蛋白包括治疗性的抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物。完整抗体通常是含有至少两个重链和轻链的异源多体糖蛋白。除了IgM，完整抗体是大约150KDa的异源多体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。一般地，每个轻链通过一个共价的二硫键连接到重链上，而不同的免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数目是不同的。每个重链和轻链也都具有链内的二硫键。每个重链的一个端部具有可变的结构域(VH)，其连接多个恒定区。在其另一端每个轻链具有可变的结构域(VL)和恒定区，轻链的恒定区与重链的第一恒定区对准，且轻链的可变域与重链的可变域对准。基于恒定区的氨基酸序列，大多数脊椎类动物的抗体的轻链可指定为称作Kappa和Lambda类型中的一种。根据其重链的恒定区的氨基酸序列，人抗体可分成5个不同类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可分别进一步分成子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。含有不同IgG2a和IgG2b的小鼠和大鼠存在种属变体。根据抗体的不同，抗体的可变结构域使得具有显示特殊可变性(称作互补决定区CDRs)的某些区的抗体具有结合特异性。可变区的较保守的部分叫做构架区(FR)。完整的重链和轻链的可变结构域各包含经3个CDRs连接的4个FR。每个链中的CDRs经FR区紧紧地连在一起，其它链的CDRs有助于抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接参与抗体与抗原的连接，但是其具有不同的效应子功能，如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、通过结合到Fcγ受体的吞噬作用、经新生的Fc受体(FcRn)的半衰期/清除率和经补体级联的C1q组分的补体依赖的细胞毒性。已有报道指出，人IgG2恒定区基本上不能通过经典路径激活补体或介导抗体依赖性细胞毒作用。也有报道指出，IgG4恒定区缺乏通过经典路径激活补体的能力，且仅仅能微弱地介导抗体依赖性细胞毒作用。基本缺乏这些效应子功能的抗体可称作“非裂解性”抗体。
1.1.1人抗体
本发明的抗原结合蛋白可以是人抗体。可用本领域技术人员熟知的一些方法制备人抗体。使用人的骨髓瘤或鼠-人异源骨髓瘤细胞系，可通过杂交方法制备人抗体，参见Kozbor J.Immunol 133，3001，(1984)以及Brodeur，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp51-63(Marcel Dekker Inc，1987)。其它的方法包括使用噬菌体库或转基因小鼠，两者都要使用人V区库(repertories)(参见Winter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol 12，433-455，Green LL(1999)，J.Immunol.methods 231，11-23)。
转基因小鼠的多个株都是可以购买的，其中它们的鼠免疫球蛋白基因座已用人免疫球蛋白基因片段代替(参见Tomizuka K，(2000)PNAS97，722-727；Fishwild D.M  (1996)Nature Biotechnol.14，845-851，Mendez MJ，1997，Nature Genetics，15，146-156)，基于抗原的攻击，这些小鼠能够生成人抗体所有组成成分，可以从其中选择目标抗体。
特别需要注意的是TrimeraTM系统(参见Eren R等人，(1998)Immunology 93：154-161)，其中人的淋巴细胞被移植到被辐射的小鼠中；选定的淋巴细胞抗体系统(SLAM，参见Babcook等人，PNAS(1996)93：7843-7848)，其中人(或其它种属)淋巴细胞有效地通过大量汇集体外抗体生成步骤后，再deconvulated，限制性地稀释和进行选择程序；以及Xenomouse IITM(Abgenix Inc)。其它替代的方式是使用MorphodomaTM技术从Morphotek公司得到。
噬菌体显示技术可用作制备人抗体(和其片段，参见McCafferty；Nature，348，552-553(1990)和Griffiths AD等人(1994)EMBO13：3245-3260)。根据该技术，抗体V结构域基因框内克隆成丝状噬菌体的主要的或次要的衣壳蛋白基因，如M13或fd，并在噬菌体粒子的表面表现为(通常需要辅助噬菌体的帮助)功能抗体片段。基于抗体的功能特性的选择取得编码表现出那些特性的抗体的基因的选择，噬菌体展示技术可用以从患有上述疾病或病症的个体或从未接受免疫接种的人供体中取出的人B细胞得到的文库中选择抗原特异性的抗体(参见Marks；J.Mol.Biol.222，581-597，1991)。当完整人抗体需要包括Fc结构域时，必须将源自片段的展示的噬菌体重新克隆入哺乳动物表达载体，其中所述的载体包括需要的恒定区和建立的稳定的表达细胞系。
亲和力成熟技术可用以提高结合亲和力。例如，可通过使用天然形成的变体依次取代H和L链的V区，并基于提高的结合亲和性进行选择的方法达到(Marks；Bio/technol 10，779-783(1992)。现在，这种技术的变体如“表位印迹”也是可利用的(WO 93/06213，Waterhouse；Nucl.Acids Res 21，2265-2266(1993))。最近，通过V区或CDRs的随机诱变，例如通过使用易错RNA复制酶，再经核糖体展示选择技术从这些文库中进行选择，业已得到亲和力成熟的抗体(Kopsidas G BMC Biotechnology.7：18，2007)。
1.1.2嵌合或人源化抗体
本发明的抗原结合蛋白可以是“嵌合”或“人源化”抗体。当前，随着完整的非人抗体在治疗人的疾病或病症中的应用、尤其是重复给予所述抗体的时候存在潜在的免疫原性的明确确定的问题：即患者的免疫系统可将非人类完整抗体识别为非自身的抗体，并作中和应答。除了开发完全人抗体(见上)，这些年也已经开发了各种技术以解决这些问题，一般地，这些方法包括减少完整的治疗抗体中的非人类氨基酸序列的组成，同时保持相对容易地从受免疫的动物如小鼠、大鼠或兔子中获得非人类抗体。一般而言两种方式都实现了该目的。第一种是嵌合抗体，其通常包含融合到人恒定区的非人类(如啮齿目动物如小鼠)可变结构域。由于抗体的抗原结合位点位于可变区内，嵌合抗体保持它与抗原的结合亲和力，但是获得人恒定区的效应子功能并因此能够执行如前述的效应子功能。通常使用重组DNA的方法制备嵌合抗体。使用传统的方法(如通过使用能够特异性结合编码本发明的抗体的H和L链可变区的基因的寡核苷酸探针，如前述的SEQ ID No：19和21的DNA)分离编码抗体的DNA(如cDNA)并测序。杂交瘤细胞作为这种DNA的典型来源。一经分离后，将所述DNA置于表达载体中，接着将载体转染到宿主细胞中，如E.Coli、COS细胞、CHO细胞、PerC6细胞或多发性骨髓瘤细胞，然而，这些细胞并不产生免疫球蛋白以进行抗体的合成。可通过取代相应于非人类(如鼠科动物)的H和L恒定区的人类L和H链的编码序列来修饰DNA，例如参见Morrison；PNAS 81，6851(1984)。因此，在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种包含具有序列SEQ ID No：19的VH结构域和具有融合到人恒定区(可能为IgG同种型，如IgG1)的序列SEQ ID No：21的VL结构域的嵌合抗体。
第二种方式包括人源化抗体的生成，其中抗体的非人类部分通过使可变区的人源化而减少。人源化的两种技术都已经普及。第一种是通过CDR移植的人源化。CDRs在靠近抗体的N-末端处形成环，其中这些环形成安装在构架区提供的支架上的表面。抗体的抗原结合特异性主要通过拓扑图和通过它的CDR表面的化学特征来限定。依次通过以下方式确定这些特征：单个CDRs的构型、CDRs的相对排列以及包含CDRs的残基的侧链的性质和排列。仅仅通过将非人类(如鼠科动物)抗体(“供体”抗体)移植到合适的人类构架(“接受者构架”)和恒定区上，可大大地降低免疫原性(参见Jones等人(1986)Nature 321，522-525和Verhoeyen M等人(1988)Science 239，1534-1536)。然而，CDR移植本身并不能完整地保留抗原结合特性，而且已经多次发现，如果需要恢复重要的抗原结合亲和性，则需要在人源化分子中保留(有时指“反突变”)供体抗体的一些构架残基(参见Queen C等人(1989)PNAS 86，10,029-10,033，Co，M等人(1991)Nature 351，501-502)。在这种情况下，表现出与非人类供体抗体具有最大的序列同一性(通常是60％或更大)的人类V区可以从数据库中选择，以便得到人类构架(FR)。可从人共有序列或单个人抗体中选择人FR。如有必要，供体抗体的主要残基被取代进入人接受者构架中，以保持CDR的构型。抗体的计算机模拟可用于帮助识别这些结构上重要的残基，参见WO99/48523。
或者，可通过“覆盖(veneering)”的方法实现人源化。独特的人和鼠科动物免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的统计分析表明，暴露的残基的精确模型在人和鼠科动物的抗体中是不同的，且大多数单独的表面位置对少数不同的残基有很强的偏好(参见Padlan E.A.等人；(1991)Mol.Immunol.28，489-498和Pedersen J.T.等人(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因此，通过取代与通常在人的抗体中发现的那些不同的构架区中的暴露残基，有可能降低非人Fv的免疫原性。由于蛋白的抗原性可与表面的可接近性相关，表面残基取代可足以使人的免疫系统对小鼠的可变区“视而不见”(仍参见Mark G.E.等人(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113：The pharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，pp105-134)。人源化的这个方法之所以称作“覆盖”，是因为只有抗体的表面发生变化，支持的残基并没有受到干扰。另外可替代的方法包括WO04/006955中阐述的方法，以及HumaneeringTM(Kalobios)方法，该方法使用细菌表达系统并产生序列靠近人的种系的抗体(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007，San Diego，California)。
显然，本领域的技术人员将会理解，术语“源自”意在不仅用于限定从某种意义上说是材料的物理起源的来源，而且用于限定结构上与材料相同但不起源于所述参考来源的材料。因此，“供体抗体中发现的残基”不需要从供体抗体中纯化。
本领域明确认识到，某些氨基酸取代被认为是“保守的”。基于通常的侧链的特性，将氨基酸分成多个组，维持全部或基本上全部的本发明的治疗性抗体的结合亲和力的组内的取代基被认为是保守性的取代，见下表1：
表1
  侧链  成员
  疏水的  met，ala，val，leu，ile
  中性亲水   cys，ser，thr
  酸   asp，glu
  碱   asn，gln，his，lys，arg
  影响链方向的残基   gly，pro
  芳香族   trp，tyr，phe
1.1.3多-和双特异性的抗体
本发明的抗原结合蛋白可以是多特异性的，即它们可结合多于一个抗原。在具体的实施方式中，所述抗原结合蛋白是双特异性的抗体。双特异性的抗体是具有结合至少两个不同的表位的特异性的抗体衍生物，也形成本发明的一部分。制备这些抗体的方法在本领域已知。传统上，重组制备双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白H链-L链对的共表达，其中两个H链具有不同的结合特异性，参见Millstein等人，Nature 305537-539(1983)，WO93/08829和Traunecker等人EMBO，10，1991，3655-3659。由于H和L链的随机分类，可能得到10种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所要求的结合特异性。另外的替代性方法包括将具有所需结合特异性的可变结构域融合到包括至少部分铰链区、CH2和CH3区的重链恒定区上。优选的是具有包括存在于至少一个融合物的轻链结合必需的位置的CH1区。将编码这些融合物的DNA和L链(如有需要)插入单独的表达载体中，并接着共转染进入合适的宿主有机体。有可能将两个或所有的三个链的编码序列都插入一个表达载体中。在一个优选的方式中，所述双特异性的抗体由在一臂中具有第一结合特性的H链和在另一臂中具有第二结合特性的H-L链对组成，参见WO94/04690。还参见Suresh等人Methods in Enzymology121，210，1986。
血脑屏障(BBB)的存在，已阻碍了治疗性蛋白到脑的输送，并且在眼睛和血流之间也有类似的血视网膜屏障。如需要将本发明的抗原结合蛋白(如本发明的抗体或本发明的抗体片段)穿过生物屏障(如BBB)输送，已提议多种策略以增强这种输送(如有需要)，且可采用类似的策略以穿过血视网膜屏障。
为了从血液中得到所需要的营养素和因子，BBB具有一些特异性的受体，其将化合物从血液循环输送到大脑。研究表明一些化合物如胰岛素(参见Duffy KR等人(1989)Brain Res.420：32-38)、转铁蛋白(参见Fishman JB等人(1987)J.Neurosci 18：299-304)和胰岛素样生长因子1和2(参见Pardridge WM(1986)Endocrine Rev.7：314-330和Duffy KR等人(1986)Metabolism 37：136-140)可通过受体介导的转胞吞跨过BBB。因此，使用所谓的“带载体的”抗体，这些分子的受体给本发明的治疗性抗体提供一种可能的方式到达大脑(参见Pardridge WM(1999)Advanced Drug Delivery Review 36：299-321)。例如，转铁蛋白受体的抗体已表明是动态地转运进入脑实质中(参见Friden PM等人(1991)PNAS 88：4771-4775and Friden PM等人(1993)Science 259：373-377)。因此，一种可能的方法是生产双特异性的抗体或双特异性片段，如前述的那些，其中第一特异性是针对含有前述的β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位，而第二特异性是针对位于BBB处的转运受体，例如第二特异性针对转铁蛋白转运受体。
本发明提出的其它双特异性抗体包括双特异性抗体或其双特异性片段，其具有针对β-淀粉状蛋白的第一特异性，以及针对补体路径激活剂的第二特异性，目的是诸如抑制它的活性，但是并不排除其它药剂：补体因子，如补体因子D。
本发明的多特异性的抗原结合蛋白包括具有第一特异性、第二特异性和第三特异性的的蛋白，其中第一特异性是针对含有前述的β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位，第二特异性是针对位于BBB或血视网膜屏障处的转运受体，而第三特异性是针对补体路径的激活剂。
1.2抗体片段和其它的蛋白构建体，例如结构域
在本发明的某些实施方式中，本发明提供一种治疗抗体，其是抗原结合片段。这种片段可以是完整的和/或人源化的和/或嵌合抗体的功能性的抗原结合片段，如前述的抗体的Fab、Fd、Fab′、F(ab′)2、Fv和ScFv片段。缺少恒定区的片段没有通过经典路径激活补体或介导抗体依赖性细胞毒作用的能力。通常，通过经例如木瓜蛋白酶消化作用进行的完整抗体蛋白水解消化作用来制备这样的片段(例如参考WO 94/29348)，但是也可以直接从重组转化的宿主细胞制备。对于ScFv的制备，参见Bird等人；(1988)Science，242，423-426。此外，可使用前述的多种工程技术来制备抗体片段。
看起来Fv片段的两个链的相互作用能量似乎比Fab片段的低。为稳定VH和VL结构域的联系，它们用肽(Bird等人，(1988)Science 242，423-426，Huston等人，PNAS，85，5879-5883)、二硫键(Glockshuber等人，(1990)Biochemistry，29，1362-1367)和“孔中突起”突变(Zhu等人(1997)，Protein Sci.，6，781-788)连接。可利用本领域熟知的方法制备ScFv片段，参见Whitlow等人(1991)Methods companion Methods Enzymol，2，97-105和Huston等人(1993)Int.Rev.Immunol 10，195-217。可在细菌细胞如E.Coli中制备ScFv，但更通常的是在真核细胞中制备。ScFv的一个缺点是一价产物，因多价结合这排除了增加的需求，和它们的半衰期短。解决这些问题的尝试包括通过化学耦合从含有额外的C末端半胱氨酸的ScFV制得的二价(ScFv′)2(Adams等人(1993)Can.Res 53，4026-4034和McCartney等人(1995)Protein Eng.8，301-314)，或者通过含有不成对的C末端半胱氨酸残基的自发位点特异性二聚作用制得的二价(ScFv′)2(参见Kipriyanov等人(1995)Cell.Biophys 26，187-204)。或者，通过将肽连接子缩短到3-12个残基形成“双抗体”的方式，ScFv可被强制形成多聚体，参见Holliger等人PNAS(1993)，90，6444-6448。减少连接子仍然可导致形成ScFV三聚体(″triabodies″，参见Kortt等人(1997)Protein Eng，10，423-433)和四聚体(″tetrabodies″，see Le Gall等人(1999)FEBS Lett，453，164-168)。也可以通过与蛋白二聚基序的基因融合形成“微抗体”(参见Pack等人(1992)Biochemistry 31，1579-1584)和“微小体”(see Hu等人(1996)，Cancer Res.56，3055-3061)构建二价ScFV分子。通过第三肽连接子连接两个ScFv单元也可以制备ScFv-Sc-Fv串联体((ScFV)2)，参见Kurucz等人(1995)J.Immol.154，4576-4582。通过两个单独的链融合产物的非共价联合可制成双特异性双抗体，其中，该链融合产物由通过短连接子一个抗体的VH结构域连接到另一抗体的VL结构域组成，参见Kipriyanov等人(1998)，Int.J.Can 77，763-772。通过引入上述的二硫键或“孔中突起”突变或者通过形成单链双抗体(ScDb)，可提高这些双特异性的双抗体的稳定性，其中，两个杂合的ScFv片段通过肽连接子连接，参见Kontermann等人(1999)J.Immunol.Methods 226 179-188。例如，通过将ScFv片段融合到IgG分子的CH3结构域或经铰链区融合到Fab片段上，可得到四价双特异性分子，参见Coloma等人(1997)Nature Biotechnol.15，159-163。或者，已经通过融合双特异性的单链双抗体而制成四价双特异性分子(参见Alt等人，(1999)FEBS Lett 454，90-94)。也可以通过使ScFv-ScFv串联体与由包含螺旋-环-螺旋基序的连接子连接(DiBi微小抗体，参见Muller等人(1998)FEBSLett 432，45-49)的二聚化作用，或者使在防止分子内成对的方向上含有四个抗体可变结构域(VH和VL)的单链分子(串联式双抗体，参见Kipriyanov等人，(1999)J.Mol.Biol.293，41-56)的二聚化形成较小的四价双特异性分子。通过Fab′片段的化学耦合或通过亮氨酸拉链的杂二聚化作用，可制成双特异性F(ab′)2片段(参见Shalaby等人，(1992)J.Exp.Med.175，217-225和Kostelny等人(1992)，J.Immunol.148，1547-1553)。分离的VH和VL结构域也是可以制备的，参见US 6,248,516、US 6,291,158和US 6,172,197。
短语“免疫球蛋白的单个可变结构域”是指特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)，其独立于不同的V区或结构域。免疫球蛋白的单个可变结构域可以与其它不同的可变区或可变结构域结合的形式(如同质或异质多聚体)存在，其中通过单个的免疫球蛋白可变结构域的抗原结合不需要其它的区或结构域(即免疫球蛋白单个可变结构域独立于其它的可变结构域与抗原结合)。“结构域抗体”或“dAb”与本文所使用的术语，能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”相同。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域，但也包括其它物种如啮齿目动物(如WO 00/29004中揭示的铰口鲨和Camelid VHH dAbs)的单个抗体可变结构域。Camelid VHH是源自骆驼、美洲羊驼、南美羊驼、单峰骆驼和骆马的免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这种VHH结构域可根据本领域的标准技术进行人源化，且这种结构域仍然被认为是本发明的“结构域抗体”。本文所使用的VH包括camelid VHH结构域。
也可以通过在非抗体蛋白支架例如结构域上排列一个或多个CDRs的方式提供抗原结合片段。结构域可以独立于不同的可变区或结构域特异性地连接到抗原或表位上。这可以是上述的结构域抗体，或者是选自CTLA-4、载脂蛋白、SpA、Affibody、avimer、GroEl、转铁蛋白、GroES和纤维连接蛋白/adnectin的支架的衍生物的结构域，其已经进行蛋白工程设计以与抗原而非天然配体结合。
在上下文中，术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其具有独立于余下的蛋白的三级结构。一般地，结构域负责蛋白的离散功能特性，且在很多情况下可能被添加、移除或转移到其它的蛋白中，而不丧失该蛋白和/或结构域的剩余部分的功能。“单个可变结构域”是折叠的多肽结构域，其包含特征是抗体可变结构域的序列。因此，它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被特征不是抗体可变结构域的序列置换，或者被截短或包含N-或C-末端的延伸部分的抗体可变结构域置换，以及“单个可变结构域”是折叠的可变结构域的片段，其保持了全长结构域的至少结合活性和特异性。
1.3异源缀合抗体
异源缀合抗体是一种衍生物，这也构成本发明的一种实施方式。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成，其中连接的方式可以是任何方便的交联方法。参见US 4,676,980。
1.4其它修饰
据信抗体的Fc区与各种Fc受体(FcγR)之间的相互作用可介导抗体的效应子功能，所述的效应子功能包括抗体的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体固定、具有噬菌作用和半衰期/清除作用。可对本发明的抗体的Fc区进行各种修饰，这取决于所需要的效应子特性。具体而言，基本上缺乏a)通过经典路径激活补体，以及b)介导抗体依赖性细胞毒作用的功能的人恒定区包括含有特异性突变的IgG4恒定区、IgG2恒定区和IgG1恒定区，例如，突变为EP0307434(WO8807089)、EP 0629 240(WO9317105)和WO 2004/014953揭示的在234、235、236、237、297、318、320和/或322位置上的发生突变。已单独地描述在重链恒定区的CH2结构域内的残基235或237的突变(Kabat编号；EU指标系统)，以减少与FcγRI、FcγRII和FcγRIII的结合，从而减少抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)(Duncan等人.Nature 1988，332；563-564；Lund等人.J.Immunol.1991，147；2657-2662；Chappel等人.PNAS 1991，88；9036-9040；Burton和Woof，Adv.Immunol.1992，51；1-84；Morgan等人.，Immunology 1995，86；319-324；Hezareh等人.，J.Virol.2001，75(24)；12161-12168)。而且，一些报道也指出了一些这样的残基涉及募集或介导补体依赖的细胞毒作用(CDC)(Morgan等人.，1995；Xu等人.，Cell.Immunol.2000；200：16-26；Hezareh等人.，J.Virol.2001，75(24)；12161-12168)。因此，残基235和237都突变成丙氨酸残基(Brett等人.Immunology 1997，91；346-353；Bartholomew等人.Immunology 1995，85；41-48；和WO9958679)以降低补体介导的和FcγR-介导的效果。含有这些恒定区的抗体可称作“非裂解性”抗体。
技术人员可将结合表位的清道夫受体并入抗体中，以延长血清的半衰期，参见US 5,739,277。
当前，已经识别了以下五种人Fcγ受体：FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生FcRn。Shields等人，(2001)J.Biol.Chem 276，6591-6604指出，普通组的IgG1残基能结合所有的FcγRs，而FcγRII和FcγRIII使用的是该普通组外部的不同位点。当突变成丙氨酸Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239时，一组IgG1残基减少了对所有FcγRs的结合。全部受体都在IgG CH2结构域内并在连接CH1和CH2的铰链的附近聚集成簇。虽然FcγRI仅仅使用普通组的IgG1残基结合，但是FcγRII和FcγRIII除了与普通组的作用之外，还与不同的残基起作用。一些残基的变化仅仅是降低了对FcγRII(如Arg-292)或FcγRIII(如Glu-293)的结合。一些变体表现出对与FcγRII或FcγRIII的结合的改善，但是并不影响与其它受体的结合(如Ser-267Ala对与FcγRII的结合有改善，但是与FcγRIII的结合并未受影响)。其它变体显示出对与FcγRII或FcγRIII的结合的改善，同时对其它受体的结合降低(如Ser-298Ala对与FcγRIII的结合有改善，且与FcγRII的结合有降低)。对于FcγRIIIa，最佳结合IgG1变体已在Ser-298、Glu-333和Lys-334上合并丙氨酸取代。据信新生FcRn受体参与了保护IgG分子免受降解，并因此提高血清的半衰期和穿过组织的转胞吞作用(参见Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29-57 and Ghetie等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766)。确定与人FcRn直接作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。
本发明的治疗性抗体可结合任何的上述恒定区的修饰。
在具体的实施方式中，所述治疗性抗体基本上缺乏以下功能：a)通过经典路径激活补体，以及b)介导抗体依赖性细胞毒作用。在更具体的实施方式中，本发明提供一种本发明的治疗性抗体，所述抗体具有任意的一个(或多个)以上详述的残基变化，以修饰半衰期/清除和/或效应子功能，如ADCC和/或补体依赖的细胞毒性和/或补体裂解。
在本发明的更一步的方面中，所述治疗性抗体具有同种型人IgG1的恒定区，在位置235(如L235A)和237(如G237A)(根据Kabat列出的EU表编号)处具有丙氨酸(或其它打断的)取代。
本发明的其它衍生物包括本发明的抗体的糖基化变体。已知抗体在其恒定区中的保守位置的糖基化作用对抗体功能有深远的影响，尤其是效应子功能，如上述的那些，例如参见Boyd等人(1996)，Mol.Immunol.32，1311-1318。应该理解的是，本发明的治疗性抗体的糖基化变体中，加入、取代、缺失或修饰了一个或多个糖部分。天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的引入给糖部分的酶结合提供了潜在位点，并因此可能用于操纵抗体的糖基化作用。在Raju等人(2001)Biochemistry 40，8868-8876中，通过使用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α，2，3-唾液酸转移酶经再次半乳糖基化和/或再次唾液酸化方法，使TNFR-IgG免疫粘附素的末端的唾液酸化增强。据信增强末端唾液酸化延长了免疫球蛋白的半衰期。抗体，与大多数糖蛋白一样，通常性质上作为糖形式的混合物生成。当在真核细胞中尤其是哺乳动物细胞中产生抗体时，这样的混合物尤为明显。已研发了多种方法来生产限定的糖形式，参见Zhang等人Science(2004)，303，371，Sears等人，Science，(2001)291，2344，Wacker等人(2002)Science，298 1790，Davis等人(2002)Chem.Rev.102，579，Hang等人(2001)Acc.Chem.Res 34，727。因此，本发明涉及多种如本文所述的治疗抗体(其可以是IgG同种型，如IgG1)，其包含确定数量(如7个或更少，例如5个或更少，如2个或单个)的糖形式的所述抗体。
本发明的衍生物还包括与非蛋白性的聚合物(如聚乙二醇PEG、聚丙二醇或聚氧化烯)偶联的本发明的治疗性抗体。蛋白与PEG的缀合是已知的技术，可用于延长蛋白的半衰期，以及降低蛋白的抗原性和免疫原性。使用完整的抗体及Fab′片段研究了有不同分子量和形式(直链或支链)的PEG化的用途，参见Koumenis I.L.等人(2000)Int.J.Pharmaceut.198：83-95。具体的实施方式包括与PEG偶联的不具有以下效应子功能的本发明的抗原结合片段：a)通过经典途径激活补体；以及b)介导抗体依赖性细胞毒作用，如Fab片段或scFv。
2.制备方法
本发明的抗体可以在转基因有机体如山羊(参见Pollock等人(1999)，J.Immunol.Methods 231：147-157)、鸡(参见Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(参见Pollock等人ibid)或植物(参见Doran PM，(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11，199-204，Ma JK-C(1998)，Nat.Med.4；601-606，Baez J等人，BioPharm(2000)13：50-54，Stoger E等人；(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)中制备。也可以通过化学合成的方法制备抗体。然而，本发明的抗体通常使用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术制备。分离编码所述抗体的多核苷酸，并将其插入至可复制的载体(如质粒)中，以进一步在宿主细胞中繁殖或表达。一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(如Lonza Biologics销售的系统)，尤其是宿主细胞为CHO或NS0(见下文)时采用该系统。使用常规方法(如寡核苷酸探针)能容易地分离和测序编码所述抗体的多核苷酸。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微小染色体，其中质粒是通常的实施方式。一般地，这些载体还包括信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和可操作地连接到轻链和/或重链多核苷酸的转录终止序列，以促进表达。编码轻链和重链的多核苷酸可插入单独的载体中，并同时或相继地引入(例如通过转化、转染、电转化或转导)至相同的宿主细胞中，或者，如有需要，重链和轻链都在前述的引入之前插入相同的载体中。
技术人员很快就会理解，由于遗传代码的冗余性，还可获得本文揭示的编码本发明多肽的那些多核苷酸的替代性多核苷酸。
2.1信号序列
本发明的抗原结合蛋白(如抗体)可制成具有异源信号序列的融合蛋白，其中所述的信号序列在成熟蛋白的N末端具有特异性裂解位点。所述信号序列应被宿主细胞识别和加工。对于原核宿主细胞，所述信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定的肠毒素II前导序列。对于酵母分泌物，所述信号序列可以是酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列，参见例如WO90/13646。在哺乳动物细胞系统中，病毒分泌前导序列，如单纯疱疹gD信号和天然免疫球蛋白信号序列(如人Ig重链)是可以获得的。一般地，所述信号序列在阅读框内与编码本发明抗体的多核苷酸连接。
2.2复制起点
复制起点在本领域是熟知的，pBR322适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒适合于大多数酵母，而各种病毒源(如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)适合于大多数哺乳动物细胞。一般地，整合的哺乳动物表达载体不需要SV40复制起点成分。然而，由于含有早期启动子，还是可以包括SV40起点的。
2.3选择标记物
一般的选择性基因编码以下的蛋白：(a)对抗生素或其它毒素有抗性，例如是氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨喋呤或四环素，或者(b)补充营养缺陷型缺乏或补足复合培养基中不存在的养分，或者(c)前面二者的组合。这些选择方案可包括使不含载体的宿主细胞停止生长。由于诸如由共同输传递的选择性标记物所赋予的耐药性，已成功用编码本发明的治疗性抗体的基因转化的细胞会存活。一个例子是DHFR-选择系统，其中转化株在DHFR阴性宿主株中形成(例如，参见Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9：64-68)。在该系统中，DHFR基因与抗原结合蛋白共同传递，例如是本发明的抗体、多核苷酸序列和DHFR阳性细胞，接着，其经核苷撤回(nucleoside withdrawal)的方式进行选择。如有需要，DHFR抑制剂甲氨喋呤也可以用于选择具有DHFR基因扩增的转化株。通过可操作性地使DHFR基因与本发明的抗原结合蛋白(如抗体、编码序列或其功能衍生物)连接，DHFR基因扩增导致所需要的抗原结合蛋白(如抗体、目标序列)的伴随扩增。CHO细胞是用于这种DHFR/甲氨喋呤选择的特别有用的细胞系，使用DHFR系统扩增和选择宿主细胞的方法在本领域熟知，参见Kaufman R.J.等人J.Mol.Biol.(1982)159，601-621，对于综述，参见Werner RG，Noe W，Kopp K，Schluter M，Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”，Arzneimittel-Forschung.48(8)：870-80，1998 Aug。进一步的例子是谷氨酸合成酶表达系统(Bebbington等人Biotechnology 1992 Vol 10 p169)。用于酵母的合适的选择基因是trp1基因，参见Stinchcomb等人Nature 282，38，1979。
2.4启动子
表达本发明的抗原结合蛋白(如抗体)合适的启动子可操作性连接到编码的抗原结合蛋白(如抗体)的DNA/多核苷酸上。原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子如Tac。适合于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它的糖酵解酶，如烯醇酶、3磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡萄糖激酶。可诱导的酵母启动子包括乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖使用的酶。
在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括RNA聚合酶II启动子，其包括病毒启动子，如多瘤病毒、鸡痘和腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒(尤其是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙肝病毒、肌动蛋白、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期的类人猿病毒40，以及非病毒启动子，如EF-1α(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17)：5322)。可基于与用于表达的宿主细胞具有合适的兼容性来选择启动子。
2.5增强子元件
如果可能，例如在较高等的真核细胞中表达，可包括其它的增强子元件，替代或为在前述的启动子中发现的那些。合适的哺乳动物增强子序列包括源自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，也可以使用源自真核细胞病毒如SV40增强子、巨细胞早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠科IgG2a基因座的增强子元件(参见WO04/009823)。尽管这些增强子通常是位于载体上启动子的上游的位点，但是它们也可位于其它的任何地方，如在非翻译区内或多腺苷酸化信号的下游。可基于与表达用的宿主细胞的合适的兼容性来选择和定位增强子。
2.6多腺苷酸化/终止
在真核系统中，多腺苷酸化的信号可操作性地与编码本发明的抗原结合蛋白(如抗体)的多核苷酸连接。这种信号通常位于开放阅读框的3’。在哺乳动物系统中，非限制性例子信号包括源自生长激素、延长因子-1α和病毒(如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复序列的那些。在酵母系统中，多腺苷酸化/终止信号的非限制性的例子包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和乙醇脱氢酶1(ADH)基因的那些。在原核系统中，一般不需要多腺苷酸化信号，且通常被替换以使用更短和更明确限定的终止序列。可基于与表达用的宿主细胞的合适的兼容性来选择多腺苷酸化/终止序列。
2.7提高产量的其它方法/元件
除上述的之外，能用于提高产量的其它特征包括染色质量重塑元件、内含子和素质细胞特异性的密码子修饰。本发明的抗原结合蛋白(如抗体)的密码子的应用可被修饰，以容纳宿主细胞的密码子偏倚，以增加转录和/或产量(例如Hoekema A等人Mol Cell Biol 19877(8)：2914-24)。可基于与表达用的宿主细胞的合适的兼容性来选择密码子。
2.8宿主细胞
克隆或表达编码本发明的抗原结合蛋白(如抗体)载体的合适的宿主细胞是原核、酵母或较高等的真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，如肠杆菌科细菌(如埃希氏菌属，如E.Coli)(例如ATCC 31,446；31,537；27,325)、肠杆菌属、欧文氏菌、克伯雷杆菌(Klebsiella Proteus)、沙门氏菌属如鼠寒沙门氏菌、沙雷氏菌属如Serratia marcescans，和志贺氏菌属以及杆菌如枯草杆菌和地衣芽孢杆菌(参见DD 266 710)、假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌。在酵母宿主细胞中，还预期：酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母(如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母(EP402,226)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)(EP183,070，也参见Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌、瑞氏木菌(Trichoderma reesia)(EP244,234)、青霉素、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
尽管本发明预期原核和酵母宿主细胞在，然而一般地，本发明的宿主细胞是脊椎动物细胞。合适的脊椎动物宿主细胞包括哺乳动物细胞如COS-1(ATCC No.CRL 1650)COS-7(ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞系293、PerC6(Crucell)、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCCNO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(如CHO-K1、ATCC NO：CCL 61)、DHFR minus CHO细胞系如DG44(Urlaub等人，Somat Cell Mol Genet(1986)Vol 12 pp555-566)，尤其是那些适于悬液培养的CHO细胞系、小鼠睾丸支持细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、(ATCCCRL-1587)、HELA细胞、犬科动物肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞如NS0(参见US5,807,715)，Sp2/0，Y0。
因此，在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种稳定转化的宿主细胞，其包括编码本文所述的治疗性抗体的重链和/或轻链的载体。通常，这种宿主细胞包含编码所述轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。
这种宿主细胞还可以进一步地被工程设计或改造以修饰本发明的抗原结合蛋白(如抗体)的质量、功能和/或产量。非限制性的例子包括特异性修饰(如糖基化)酶和蛋白折叠伴侣的表达。
2.9细胞培养方法
可通过本领域的技术人员熟悉的任何方法来培养用编码本发明的治疗性抗原结合蛋白(如抗体)的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以在转瓶、摇瓶、滚瓶、波反应器(wave reactor)(如来自wavebiotech.com的System1000)或中空纤维系统，但当大规模生产，尤其是培养悬液时，优选的是使用搅拌的反应釜或袋反应器(如Wave Biotech，Somerset，New Jersey USA)。一般地，使用诸如分布器、挡板或低速剪切叶轮以使搅拌的反应釜适于通风。对于鼓泡床和气升式反应器，可使用空气或氧气鼓泡的方式直接通风。由于通风步骤，当在不含血清的培养基中培养宿主细胞时，可用细胞保护剂(如普朗尼克F-68)进行补充，以协助防止细胞受损。视宿主细胞的特征而定，微载体可用作锚碇依赖性细胞系的生长基质，或者是该细胞适合于悬液的培养(这是通常的情况)。宿主细胞的培养，尤其是脊椎动物宿主细胞培养可使用多种可操作的模式，如分批工艺、补料分批工艺、重复分批工艺(参见Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103-109)、延伸分批工艺或灌注培养。尽管重组转化的哺乳动物宿主细胞可在含有血清的培养基中培养，其中这种血清包括胎牛血清(FCS)，但是较佳地，这种宿主细胞在无血清的培养基(如Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163公开的)或市售的培养基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)中培养，如有必要，可补充能量源如葡萄糖和合成生长因子如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可要求那些细胞适合于在无血清的条件下生长。一种适合的方式是在含有血清的培养基中培养这种宿主细胞，并以无血清培养基重复交换80％的培养基，以使宿主细胞学会适应无血清的条件(例如参见Scharfenberg K等人(1995)in Animal Cell technology：Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.等人编辑)，pp619-623，Kluwer Academic publishers)。
分泌到培养基的本发明的抗原结合蛋白(如抗体)可使用多种技术恢复和从培养基中提纯以得到适于所需要的用途的一定程度的纯化物。例如，与包含治疗性抗原结合蛋白(如抗体)的培养基相比，本发明的治疗性抗原结合蛋白(如抗体)在治疗人患者的用途通常要求经还原SDS-PAGE以确定的纯度至少是95％，更好的是98％或99％的纯度。在第一种情况下，通常先经过离心过滤，接着使用诸如微孔过滤、超滤和/或滤床过滤等的上清液的清除步骤以从培养基中清除细胞碎片。或者，无需之前的离心，只通过微孔过滤、超滤和/或滤床过滤来收获所述抗原结合蛋白(如抗体)。也可以采用许多的其它技术，例如透析和凝胶电泳以及色谱技术如羟基磷灰石(HA)、亲和色谱(选择性地包括亲和标记系统如多组氨酸)和/或疏水相互作用色谱法(HIC，参见US 5,429,746)。在一个实施方式中，本发明的抗原结合蛋白(如抗体)在经过多个澄清步骤之后，使用蛋白A或G亲和色谱法进行捕获，接着进一步采用色谱步骤，如离子交换和/或HA色谱、阴离子或阳离子交换、尺寸排阻色谱法和硫酸铵沉淀。一般地，也采用各种病毒清除步骤(如，使用例如DV-20过滤器的纳米过滤)。随着这些不同的步骤，得到了包含至少10mg/ml或更多的(如100mg/ml或更多)本发明的抗体的纯的(通常是单克隆)制备物，藉此形成本发明的一个实施方式。通过超速离心法，可得到浓度为100mg/ml或更高的制备物。合适地，这种制备物大体上不含聚集形式的本发明的抗体。
细菌系统特别适合于抗体片段的表达。这些片段位于细胞内或在胞质内。可根据技术人员熟知的方法萃取出不溶的胞质蛋白，并折叠形成活性蛋白，参见Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cupit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol，29，273-277。
3.药物组合物
如前所述的本发明的抗原结合蛋白(如抗体)的纯化的制备物(尤其是单克隆制备物)可并入药物组合物中，以用于治疗人类疾病和病症，如前面列举的那些。一般地，这些组合物进一步包含可接受的药学实践已知和称为药学上可接受(即惰性)的载体，参见Remingtons Pharmaceutical Sciences，16th ed，(1980)，Mack Publishing Co。这些载体的例子包括无菌载体如盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液，其用合适的缓冲液(如醋酸钠三水合物)缓冲至药学上可接受的pH，如pH在5-8的范围内。注射(如通过静脉、腹腔、皮内、皮下、肌肉、门静脉注射或通过局部输送到眼睛，其经局部给药或眼周施用至眼睛或经玻璃体注射到眼睛)或连续输注用的药物组合物适合于不含可见颗粒物，且包含1mg-10g的治疗性抗原结合蛋白，如抗体，通常是5mg-1g，更佳的是5mg-25mg或50mg的抗原结合蛋白，如抗体。制备这些药物组合物的方法对本领域的技术人员来说众所周知。在一个实施方式中，药物组合物包括1mg-10g单位剂量形式的本发明的抗原结合蛋白，如抗体，选择性地包括使用指南。在给药之前，根据熟知的方法或本领域技术人员了解的方法将本发明的药物组合物冻干(冻干的)以重构。当本发明的实施方式包括含IgG1同种型的本发明的抗体时，包含铜的金属离子螯合物，如柠檬酸盐(如柠檬酸钠)或EDTA或组氨酸可添加到所述药物组合物中以降低这种同种型的抗体的金属介导的降解的程度，参见EP0612251。药物组合物也可包含增溶剂如精氨酸碱，洗涤剂/抗聚集剂如聚山梨醇酯80，以及惰性气体如代替小瓶顶部的氧气的氮气。
根据临床经验来确定给予本发明的抗原结合蛋白(如抗体)的有效剂量和治疗方案，并取决于以下因素：患者的年龄、体重和健康状况以及需要治疗的疾病或病症。这些因素都在主治医师的考虑范围内。选择合适的剂量的指引例如，可参考Smith等人(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy，Raven Press，New York，但是一般都为1mg-10mg。在一个实施方式中，治疗人类患者的剂量方案是每周一次或每两周一次皮下给予或每1或2个月静脉注射1mg-1g本发明的治疗性抗体。这样的剂量对应于0.014-140mg/kg，如0.014-14mg/kg。本发明的组合物也可预防使用。
通过局部给药、玻璃体注射或眼周给予，即通过眼球后、眼球周围、结膜或结膜下注射的巩膜下给予的方式可将药物组合物更局部地输送到眼睛内。全身给药可能足以减轻玻璃疣，通过被动，例如静脉给予治疗性抗体。局部给药的其它途径可令治疗性的抗体更容易以低剂量到达眼睛的后部。已记载，在兔子模型中，局部应用可使抗体片段渗透到眼睛的后部(Williams KA，Bereton HM，Farrall A，Standfield SD，Taylor SD，Kirk LA，Coster DJ(2005)Eye 19；910-913)。已有抗体片段或完全单克隆抗体的玻璃体注射的描述，且AMD患者对产品兰尼单抗(ranibizumab)和贝伐单抗(bevacizumab)有较好的耐受性。治疗性抗体也可以通过玻璃体内植入的方法给药。也可以使用特殊的23-26规格的针进行眼球后和眼球周注射，且比玻璃体内注射的侵入性小。结膜注射使组合物与巩膜的接触时间更长，这将有助于渗透到眼睛后部。已在兔子模型中描述了刚好在结膜下的蛋白注射，这使得分子更直接地扩散穿过巩膜到达眼睛的后部。也可以使用持续释放的药物输送系统，其使药物在更长的时间内释放进入眼睛或在眼周，以至于可减少给药频率。这样的系统包括可用治疗性组合物填充或包衣的胶束、凝胶、水凝胶、纳米粒、微胶囊或植入物。通过注射或通过任何其它前述的少侵入性的途径，即通过眼周或巩膜下的途径，可将前述的这些输送进入眼睛的玻璃体内。这种持续释放系统和局部给药途径的例子包括巩膜下给予的热敏缓释水凝胶，或玻璃体内给予的基于靶向后部视网膜和RPE层的制剂的纳米粒(Janoira KG，Gunda S，Boddu SHS，Mitra AK，(2007)Expert Opin Drug Deliv 4：371-388；Birch DG，Liang FQ，(2007)Int J Nanomed 2：65-77)。输送系统和局部给药途径的许多其它组合也是可能的，且可被认为适合于治疗性抗体的组合物。抗体也可以经物理装置如经离子导入器进行输送(Association for Research in Vision and Ophthalmology，2008，Annual meeting，April 27th-May 1st，Posters #98/A125 & #1813/D693 from EyeGate Pharma：Blalock等人.，&Ruiz-Perez等人)。
4.临床使用
应该理解，特征是β淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加的疾病包括阿尔茨海默病、轻微的认知缺陷、唐氏综合征、具有Dutch型β-淀粉样变的遗传性脑出血、脑部β-淀粉样淋巴管病和各种类型的退行性痴呆，如与帕金森病的那些、渐进性核上性麻痹、皮质基底变性和阿尔茨海默病的弥漫路易斯体型、年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼型”疾病和Aβ依赖性白内障的形成。
在本发明的一个实施方式中，特征是β淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加的疾病是阿尔茨海默病。
在本发明的进一步的实施方式中，特征是β淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加的疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、“青光眼型”疾病或Aβ依赖性白内障的形成。
尽管本发明主要描述了人的疾病或病症的治疗，但是本发明也包括非人的哺乳动物的类似疾病或病症的治疗的应用。
实施例
方法
ABi8200  用于FMAT的应用生物系统8200荧光宏观共焦细胞检测系统
BiacoreTM/Biacore  使用SPR可测量分子作用的实时动力学的装置
CM5                具有一般目的表面的BiacoreTM传感器芯片，该表面上涂有羧甲基葡聚糖基质
cSLO     共焦扫描激光眼底镜
ELISA     酶联免疫吸附测试
FMAT      荧光微量测试技术(应用生物系统，Applied Biosystems)
FPLC      快速蛋白液相色谱法
IHC       免疫组织化学
Integra CL1000    IBS Integra Biosciences销售的微型生物反应器
MSD
Figure BPA00001204856700391
Meso Scale Discovery
ProSepA HiTrap    GE卫生保健销售的用于FPLC的蛋白A柱
RU        共振器(在Biacore测定中，量化与传感器芯片结合的
任何装置)
SDS-PAGE  十二烷基硫酸钠-聚丙基酰胺凝胶电泳技术
SPR       (表面等离子共振)-使用Biacore TM 仪器在传感器芯片上测量质量变化的物理现象
SPSS      统计分析软件包
SRU       SRU BINDTM生物传感器技术，使得能监视无标签的生物化学反应
原材料
BSA        牛血清白蛋白
C57/BL6    ″C57黑6″-实验室小鼠的普通的近交系
DAB        3，3′二氨基联苯胺
DAPI       4′，6-二脒基-2-苯基吲哚
DMEM       dulbecco’s modified eagle’s培养基
DMSO       二甲基亚砜
DTT        二硫苏糖醇
EDTA       乙二胺四乙酸
FA         蚁酸
FCS        胎牛血清
FITC       异硫氰酸荧光素
Glutamax   加入到培养基中的稳定形式的谷氨酸盐(二肽L-Ananyl-L-谷氨酸盐补充)
HEK        人胚胎肾293细胞
BS-EP缓冲液  一般目的的BiacoreTM缓冲液，含有0.01M HEPESpH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20
HEPES       N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)
Histoclear    组织清理剂
HRP         辣根过氧化物酶
IMS         工业甲基化酒精
Lipofectamine  基于Invitrogen/Gibco售的细胞转染剂的阳离子脂质
NaCl        氯化钠
Opti-MEM    基于Invitrogen/Gibco的培养基的改良的eagle’s培养基
PBS         磷酸盐缓冲液
PFA         多聚甲醛
PEG         聚乙二醇
PPD         纯化的蛋白衍生物
PRF F12     含营养混合物F-12的不含酚红的培养基
RIBI        基于抗原佐剂的水油乳剂
RT-PCR      逆转录聚合酶链反应
TASTPM      经APP695 Swedish突变小鼠(TAS10)与PS-1M146V株(TPM)杂交形成的双转基因小鼠株
TBS         TRIS缓冲盐水
Transfast   Promega销售的脂质体转染剂
Tris HCl    三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
Tween-20    聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯
Versene     金属离子螯合剂(乙二胺四乙酸)
缩略语
AMD    年龄相关性黄斑变性
APP    淀粉样前体蛋白
BM     Bruch’s膜
CFH    补体因子H
CFI    补体因子I
CHO    中国仓鼠卵巢细胞
CNV    脉络膜新生血管
CPM    每分钟计数
CSF    脑脊髓液
ICV    侧脑室
IgG    免疫球蛋白γ
i.p.   腹腔内
hAPP   人淀粉样前体蛋白
HIER   热诱导的抗原恢复
HVT    健康志愿者
KD     平衡时的离解常数
NDS    正常的驴血清
MO     月龄
MRT    平均残留时间
OS     外节
RPE    视网膜色素上皮细胞
人β淀粉状蛋白特异性小鼠单克隆抗体的生成
最初用N-末端连接PPD的肽CGGGNKGAIIGLMVGG(含有β-淀粉样蛋白的残基27-38)(SEQ ID No：7)使一组小鼠接受免疫。通过提取血清样品并在ELISA中用相同的肽的卵清蛋白缀合物进行测试来评估这些小鼠的免疫应答，以确定免疫小鼠的抗体滴度。仅仅观察到微弱的应答。在另一实验中，通过腹腔内途径，用缀合至在RIBI佐剂中的PPD(纯化的蛋白衍生物；Cambridge Research Biochemicals)的10μg N-末端偶联的CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG肽(含有β-淀粉状蛋白的残基22-38)(SEQID No：73)使一组小鼠接受免疫。在每次加强免疫注射7天后采集血清样品，并在ELISA中进行测试以再次评估这些小鼠的免疫应答，以确定免疫小鼠的抗体滴度。通过用2.5μg肽缀合物加强免疫后，一旦小鼠达到最佳应答(基于最后两个血清样品的抗体滴度的比较分析)，挑出具有最佳抗体滴度的小鼠，并将脾取出，用于生成杂交瘤细胞。通过得到脾细胞并使用PEG(聚乙二醇)方法将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞。将得到的混合细胞群放入96孔细胞培养板中。
接着，在FMAT(荧光微量检测技术)均相免疫测定中筛选每个在培养基上清液中的表达抗体。从这些筛选的级联中识别29种阳性抗体，这些抗体对被动地吸收进入聚苯乙烯珠的卵清蛋白显示阴性，但是对以下的显示阳性：
(i)结合到聚苯乙烯珠的N-末端偶联的CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG(22-38)(SEQ ID No：73)卵清蛋白缀合物；
(ii)结合到包被链霉亲和素的聚苯乙烯珠的N-末端生物素化的β-淀粉样(1-40)肽；
(iii)结合到包被链霉亲和素的聚苯乙烯珠的C-末端生物素化的β-淀粉样(1-40)肽；以及
(iv)结合到包被链霉亲和素的聚苯乙烯珠的N-末端生物素化的β-淀粉样(24-34)肽，其中β-淀粉状蛋白的残基24-34是VGSNKGAIIGL(SEQ IDNo：8)。
分析选择的抗体上清液样品对以下列出的β-淀粉样(1-40)肽的结合动力学。
使用表面等离子共振法测定结合作用的解离率(kd)
使用Biacore A100仪器以得到29个选择的抗体与β-淀粉样肽(1-40)的相互作用的离解动力学。为此，使用低水平的N-末端生物素化的β-淀粉样肽(1-40)对链霉亲和素Biacore传感器芯片流动池进行衍生化。每个抗体样品都生成3根曲线，并与曲率方程拟合，以计算出解离率。对于12个克隆，不可能基于解离率进行排序，这是因为解离率的测定在选择的实验条件下不可能得到。然而，在这些条件下，所有12个克隆的解离率(kd)至少是10-5。
人β-淀粉状蛋白结合的ELISA
对以上识别的在杂交瘤细胞上清液中的29个抗体通过ELISA进行重新试验其对人β-淀粉样肽(1-40)的结合。为得到有效比较，使用IgG量化ELISA测定在培养基上清液中的抗体浓度。为确定功能抗体的同种型，使用一组同种型特异性的检测抗体进行人β-淀粉样蛋白结合ELISA。在此ELISA形式种，所有的29个抗体均与人β-淀粉样肽(1-40)结合。每个结合抗体克隆的同种型可通过对IgG1、IgG2a或IgG2b使用同种型特异性的二级抗体进行识别。在一种情况下观察到功能同种型的混合物。
使用重叠肽经ELISA描绘的表位图
使用包含β-淀粉样1-42肽的全部序列的一组31，12-聚体重叠肽，对从主要筛选和在杂交瘤细胞上清液中选出的29个抗体所识别的表位通过ELISA进行绘图。所有的肽都含有3氨基C-末端连接子(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)和末端生物素化的赖氨酸残基。
在4℃下，用在蒸馏水中的100μl 0.5μg/孔链霉亲和素(Sigma)包被96孔免疫测试板过夜。将板洗涤3次(PBS/0.01％Tween 20)，并在室温下，用在PBS中的3％BSA以250μl/孔将孔封闭1小时。将板洗涤3次，并在室温下，将100μl肽溶液(0.5ug/孔的在PBS中的1％BSA 0.1％Tween 20)内按一式三份加入孔中，孵育3小时。还制得仅仅加入DMSO的对照孔。将板洗涤3次，将100μl 29种杂交瘤细胞上清液(在1％BSA/0.1％Tween 20中以1/20稀释)加入到所有的孔中，并在4℃下孵育过夜。将板洗涤3次，并以100μl/孔将抗-鼠IgG抗体辣根过氧化物酶缀合物(Amersham，在PBS中的1％BSA，0.1％Tween 20以1∶2000稀释)加入孔中。将板在室温下孵育1小时，再洗涤3次，接着在室温下使用100ul/孔四甲基联苯胺(Sigma)底物使检测抗体的结合大约暴露5分钟，持续观察蓝色的变化。停止反应，在450nm下读出每个孔的光密度。
所有的抗体都结合到非常相似的含有基序KGAIIGLM(相当于β-淀粉状蛋白的残基28-35)(SEQ ID No：9)的区。
通过表明等离子共振测试得到结合动力学
使用Biacore 3000技术更详尽地评估从29种抗体中选出的8种单克隆抗体的β-淀粉状蛋白结合亲和力和动力学。在多克隆抗小鼠IgG抗体芯片表面上捕获纯化的小鼠抗体制备物。在HBS-EP缓冲液中稀释新制成的人β-淀粉状蛋白1-40，并以浓度范围为4-500nM使其在5分钟内经过捕获的抗体表面。观察20分钟注射之后的分离现象。通过注入一注100mM H3PO4使其再生。随后的多次抗体捕获和β-淀粉状蛋白结合循环都表明其未受再生的影响。所有的过程都与空白表面和空白缓冲液注射进行双重对照。得到的数据见表2.
表2 8种选定的纯化抗体的Biacore亲和性和动力学数据；示出的KD值来自一个实验
Figure BPA00001204856700431
  2C1   6.63e4   1.29e-4   1.95
  5C9   6.11e4   1.64e-4   2.69
  4D4   7.32e4   8.27e-5   1.13
  5D1   5.7e4   1.47e-4   2.57
  6F6   1.06e5   6.57e-5   0.62
  14B3   7.48e4   7.11e-5   0.95
  2E11   8.45e4   1.7e-4   2.01
  16D4   8.12e4   6.18e-4   7.62
结果表明，尽管16D4的亲和性比其它的克隆至少低12-2.5倍，但是所有8种单克隆抗体的亲和性都是相似的。余下的7种抗体之间的KD值差异在此实验中多达4.4倍。从其中选出两个克隆抗体5D1和6F6进一步按比例增加，并再测试3次。表3所示为得到的数据。
表3-纯化的单克隆抗体6F6和5D1的Biacore动力学和亲和性数据(3次重复实验)
Figure BPA00001204856700441
也使用相同的Biacore方法以研究6F6与人和小鼠β-淀粉样肽1-40)和β-淀粉样肽(1-42)的结合性。6F6与所有的这些肽的结合数值都相似。
结合到细胞表达的淀粉样前体蛋白(APP)
β-淀粉状蛋白由肽组成，所述的肽通过称为淀粉样前体蛋白(APP)的I型跨膜前提体蛋白的蛋白酶切割形成。由于APP具有大的胞外域，与这种蛋白的结合将可能激发抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
基于FMAT TM  ABI8200的测试
荧光微量检测技术(FMAT；Cellular Detection System 8200)用来对在HEK293T细胞上表达的淀粉样前体蛋白与以上选出的8种抗体进行基于细胞的结合测试。在转染的48小时后，收获模拟转染或用编码全长人APP的质粒转染的HEK 293T细胞。用多种杂交瘤细胞上清液的稀释液或者APP的胞外域的纯化的阳性对照抗体LN27(Zymed)小鼠IgG和仅仅识别无N末端的β-淀粉样肽的阴性对照抗体(实验室试剂)来孵育转染的细胞。使用FMAT蓝色标签抗小鼠抗体观察抗体的结合，并用细胞检测系统8200进行检测。从APP转染细胞中减去从模拟转染的细胞获得的背景信号。7种克隆表明，与阳性对照单克隆抗体LN27相比，与HEK293T细胞上表达的APP并没有结合。研究使用模拟转染的HEK293T细胞的结果，一种克隆(5C9)表明与HEK293T细胞没有特异性结合，使得解释这种特殊的克隆的APP结合能力变得比较困难。
与转基因小鼠脑切片中的淀粉样前体蛋白(APP)的结合
通过IHC观察取得2月龄的TASTPM(Howlett等人2008)或12月龄的TAS10小鼠的脑切片。对于全长APP结合，用85％的蚁酸处理这些切片，并染色。在选定的月龄，各小鼠并不显示淀粉样斑块的沉积，尽管一些染色可能是因为使用该技术而接触胞内的淀粉状蛋白。6F6表明在这些切片中没有染色，而全长的APP(Zymed)对照抗体的确表明有染色。
作为Fab片段的人β-淀粉状蛋白结合ELISA
使用固定在珠子(Pierce #20341)上的木瓜蛋白酶，通过标准蛋白酶裂解方法以生成6F6的Fab片段。用纯化的6F6 lgG的Fab片段进行ELISA测试与固定在ELISA板上的人Aβ肽(1-40)结合。单个ELISA实验结果表明6F6的Fab片段仍然能结合到Aβ肽(1-40)。
6F6与在人类志愿者的血浆样品中的天然人淀粉状蛋白的结合
通过静脉抽取的方式将健康志愿者(HVT)的全血收集到K2EDTA试管中，并立即将试管置于冰上。在4℃时，通过以2000xg的速度旋转15分钟在30分钟内处理血液样品，得到血浆。然后根据制造商的指示，将蛋白酶抑制剂(Roche Complete Protease Inhibitor cocktail，Cat No：11973 580001，Roche Applied Science)加入血浆中。分析之前，在低于-70℃下使血浆等分样品冷冻。
该测试将6F6用作在96孔ECL免疫测试形式(Meso Scale Discovery，MSD)中的捕获抗体。简单地说，将6F6以点的形式涂在96孔MSD板上，加入样品(检测校准、阴性对照、QC和测试样品)。接着进行孵育，清洗掉未结合的材料，接着将检测抗体(生物素化的4G8，(对β-淀粉样肽17-24有特异性))用于孵育。洗涤之后，接着加入链霉亲和素-磺基-标签。孵育结束之后，进行洗涤步骤。在板上加入MSD Read Buffer T后，使得能在MSDSector Imager 6000上读取电化学荧光信号。使用已知Aβ1-42的浓度得到的测试标准曲线从MSD信号中反推出被分析物浓度。测试的量化用的较低的限度是78.1pg/mL。
表4总结了上述6F6-4G8抗体试验测定的10个HVT血浆样品的Aβ浓度。所有的样品都测试2次。
表4.6F6-4G8抗体测定的HVT样品中的Aβ浓度
Figure BPA00001204856700461
通过Western Blot检测在天然和变性条件下与Aβ1-42的结合
检测纯化的6F6单克隆抗体与不同形式的Aβ1-42结合，并在天然或变性SDS-PAGE下进行分析。Aβ1-42使用新鲜制备的或在4℃下用PRF F12预处理过夜，在37℃下，在PBS中过夜或37℃下在10mM HCl过夜。使用SDS-PAGE分离制备物并使用6F6抗体或6E10(对人Aβ1-16的抗体有特异性；市售试剂，Eurogentec)和5G5(对Aβ1-42的抗体有特异性；实验室试剂)通过Western blotting进行分析。结果表明，在天然凝胶上，6E10识别更高级形式的淀粉状蛋白，而6F6和5G5仅对这些低聚物和纤维形式表现出相对微弱的信号。在变性条件下，6F6和5G5主要识别单体形式的β淀粉状蛋白，而N末端特异性的6E10仍然能够结合β淀粉状蛋白的更高聚集体，该聚集体不能通过在该实验图1)中使用的变性条件分解。结论是，在这些条件下，使用上述的6F6淀粉状蛋白制备物主要结合Aβ1-42的较低的分子量形式和单体。
通过纯化的单克隆抗体6F6的ELISA对表位作图
通过ELISA，纯化的6F6单克隆抗体用来重复描绘上述的抗原表位图。采用的是相同的过程，除了不加入稀释的杂交瘤细胞培养上清液，而是加入100μl稀释的纯化的抗体溶液(在1％BSA中，0.1ug/ml)。
纯化的6F6单克隆抗结合到基序KGAIIGL(相当于β-淀粉状蛋白的残基28-34)，但是，如果在肽(相当于β-淀粉状蛋白的残基28-35；(SEQ ID No：9))中包括残基35M，则结合性大大增强。采用重叠的表位作图技术不能排除相邻残基的较小作用。
通过单克隆抗体6F6的表面等离子共振而得到的表位图
将8-64nM纯化的6F6单克隆抗体注入C末端生物素化的肽中，所述的肽是指由链霉亲和素包被的传感器芯片捕获的β-淀粉状蛋白的以下序列：24-35(SEQ ID No：10：VGSNKGAIIGLMGSG)，28-39(SEQ ID No：11：KGAIIGLMVGGVGSG)和31-42(SEQ ID No：12：IIGLMVGGVVIAGSG)。使用Biacore 3000仪器进行实验。结果表明6F6能够与β-淀粉状蛋白的肽24-35和28-39结合，而不能与肽31-42结合，藉此确认上述的重叠肽的结果。也可能表明残基31-35不足以结合6F6，而上述35位的残基似乎不参与结合这种抗体。
集中给予淀粉状蛋白之后，静脉给予抗-β淀粉状蛋白单克隆抗体6F6和 5D1对淀粉状蛋白血液水平的效果
本研究的目的是研究在侧脑室(ICV)注入125I(1μCi)β-淀粉样肽1-40后，在预先静脉注射测试抗体的小鼠的血液中的放射性水平。
通过ICV输注将125I(1μCi)β-淀粉样肽1-40注入ICV插管的雄性C57BL6/J小鼠(每个处理组n＝8-10)中。在注入125I(1μCi)β-淀粉样肽1-40的一小时前，给小鼠静脉注入磷酸盐缓冲盐水(PBS)或600μg抗β-淀粉状蛋白单克隆抗体6F6或5D1。在ICV输注之后，将动物放回笼子中，在ICV输注的4小时后挑出动物，采集血液样品并检测每分钟的γ射线计数(CPM)。
外科手术准备
给小鼠吸入异氟烷(3-5％)使其麻醉，并将其置于立体框架中。在进行任何外科手术之前，使小鼠接受0.05mls(从原液中以1∶10稀释)皮下vetergesic
Figure BPA00001204856700481
(Buprenorphine)以镇痛。从小鼠的头皮中线切开，清理出头骨背侧并干燥。通过钻孔将导管插入侧脑室内，所述钻孔以相对于前囟的以下立体定位的坐标穿过颅骨(前后(AP)：-0.5，侧面(L)：+0.7，背/腹(DV)：-2.5)。再穿过脑骨钻出2个孔，在其内放入皮质螺钉。通过氰基丙烯酸盐凝胶帽将导管固定在适当位置，绕着氰基丙烯酸盐凝胶帽缝合切口。手术后给小鼠皮下注射0.3ml的盐水，并将小鼠放在温暖的环境中从麻醉中恢复。将恢复放松状态下的小鼠分开单独圈养，并接受5天标准的术后护理。5天内，5天内或者直到回复到术前的体重不进行其它的步骤。
导管的放置
恢复之后，通过血管紧缩素II吸入反应核实导管放置的情况。每只小鼠都ICV给予100ng血管紧缩素II。给药之后，15分钟内观察水的吸入情况。
结果
大约由于在血液循环中结合放射性标记的β-淀粉状蛋白的能力，给予单克隆抗体6F6和5D1的动物中观察到的放射性比给予载体的动物有显著的增加，因此延长了在标记β-淀粉样1-40肽的血液中的半衰期。单克隆抗体之间的差异并不显著。6F6和5D1的处理导致CPM比注射载体的对照组在统计学上有显著的增加(CPM：载体1280+/-312；5D1 8152+/-2001；6F6 8875+/-2123)单变量ANOVA，F(3，32)＝15.14，p＜0.001(数据进行对数运算)，post-hoc LSD测试***p＜0.001所有的组vs.载体。
在豚鼠中6F6-淀粉状蛋白复合物形成的药代动力学研究
本研究的目的在于确定在豚鼠体内形成的抗体-β-淀粉状蛋白复合物，其中所述的豚鼠β-淀粉状蛋白氨基酸序列与人类相同。该目的是通过在19天内的不同时间点测定3个游离抗体浓度和抗体-β-淀粉状蛋白复合物实现的。
方法
在异氟烷麻醉下，雄性Dunkin-Hartley豚鼠以外科手术进行双侧颈静脉插管。1小时内使插管的豚鼠静脉注射抗体6F6(n＝6)。以0.700和0.625mL/kg/h给予在PBS溶液中的纯化的抗体制剂，以分别达到目标剂量3mg/kg。给予药剂之前从每只豚鼠中取出血液样品(60μl)(0min)，并用EDTA试管在开始输注后的以下时间内(在20天内)收集：15、30、45、60(暂停输液)、90、120、180、360分钟，8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、312、360、408和456小时。
在输注开始后的第0、10、96、216、312和456小时时，取出大的样品(0.5ml)。在第20天取出最后的血液样品后，麻醉动物并抽血。在-80℃下储存血浆样品，直到用ELISA进行分析。使用β-淀粉样肽1-40包被的微孔滴定板通过抗原结合的ELITA来评测游离抗体水平。将取自第0、10h、96h、196h、312h和456h的血浆样品加入至这些孔中，使用抗小鼠IgG-HRP缀合物检测结合的6F6单克隆抗体。通过捕获在包被β-淀粉样肽42C-末端特异性的多克隆抗体的板以检测β-淀粉状蛋白-抗体复合物。捕获的复合物通过6F6单克隆抗体使用抗小鼠IgG生物素缀合物和链霉铕穴进行检测。
结果
在IV(静脉)输入之后，游离抗体水平如期待的那样快速增加，而且在第一个24小时之后，迅速降低。在大约160小时时水平达到稳定的状态。结果表明6F6抗体的血液清除率为1.75ml/h/kg，平均剩余时间(MRT)为49.4小时。
复合物的水平也在注入抗体之后迅速升高，在剩下的研究中，平均复合物水平在此水平保持稳定。然而，不同的动物具有相当大的个体差异。在一些动物中，复合物水平降低，在一些动物中的复合物水平升高，但是在大多数情况下，复合物的水平似乎从第216小时的时间点之后都保持稳定。该实验表明，具有与人等同的淀粉状蛋白的复合物可在体内形成，且在单次剂量给药之后的很长一段时间内，复合物的水平在血浆中几乎不变。
6F6在转基因TASTPM小鼠中的4周给药剂量研究
过量表达人淀粉样前体蛋白(hAPP)的转基因(tg)小鼠提供了淀粉状蛋白病的模型，并适合于研究药物对淀粉状蛋白的生成、螯合(sequestration)和沉积的影响。对于这个研究，我们使用TASTPM转基因小鼠，其过量表达人淀粉样前体蛋白和早老蛋白1的突变体形式(通过使APP695 Swedish突变小鼠株(TAS10)和PS-1M146V株(TPM)杂交得到双转基因小鼠株)(Howlett等人2008)。用大约10周龄的雄性和雌性小鼠进行这个研究。动物分成3个处理组：
处理组：
(A)Tg动物，第一天不接受化合物以确定在研究开始时的淀粉状蛋白水平(n＝16；9只雄性，7只雌性)
(B)Tg动物，通过腹腔注射载体(PBS)，每周2次，持续四周(n＝19；9只雄性，10只雌性)
(C)Tg动物，每只小鼠通过腹腔注射6F6 300μg，每周2次，持续四周(n＝19；9只雄性，10只雌性)
开始给药剂量方案的一周后(one week apart)将动物分成3个处理组。
在第2、4、6、8次给药前，经尾部静脉放血从3只雄性和3只雌性动物中取出血样。在第一天或第一次给药后4周(B和C)从所有的组中制备末梢EDTA血浆样品。取出左和右脑，快速冷冻并在-80℃保存，直到下一次对淀粉状蛋白作生物化学分析。取出尾巴尖，并用来确认基因型。
脑匀浆中的生物化学淀粉状蛋白量的确定
使用ORIGEN技术(Igen Internatioanl Inc)确定在抽取的脑样品中的Aβ1-40和Aβ1-42的水平。简单地说，称取大脑半球的重量，并用手持的杵以150mg/ml w/v在含有Complete TM蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostic)的5M盐酸胍进行提取。在该测定中，将提取物在Igen缓冲液稀释，以及1∶10和1∶40的稀释液使用20000g离心过滤澄清。
ORIGEN测定使用带有固定生物素化的6E10抗体(对人Aβ1-16有特异性；Signet实验室)的链霉亲和素包被的Dynabeads(Dynal)以从样品中捕获Aβ，并用ori-tag标记的G210(Aβ1-40特异性抗体；实验室试剂)或5G5(Aβ1-42特异性抗体；实验室试剂)检测结合的Aβ。
通过实验中使用的分析方法对每一组死后的Aβ1-40和Aβ1-42的量进行分析，显示该研究中大脑淀粉状蛋白的量并没有与6F6处理相关的减少。由于在研究过程中，载体处理的动物的大脑的Aβ的形式增加较少，且在所有动物中也不一致，故不可能得到大脑的淀粉状蛋白的潜在减少的确定性结论。
6F6抗体的血浆水平的测定
通过ELISA评测纵向和末梢EDTA血浆样品的抗体水平。简单地说，将样品按1∶50、1∶500和1∶5000的比例进行稀释，并加入到含有在PBS中稀释的0.5μg/ml固定的Aβ1-40肽的ELISA板中。在4℃下将样品孵育过夜，洗涤并用抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物检测结合的6F6抗体。使用标准曲线测定样品的浓度，其中所述标准曲线是使用范围在0-30μg/ml的8个已知的6F6的浓度得到的。
结果表明，所有的小鼠都用6F6抗体成功地给药，末梢血浆浓度的平均值为约250μg/ml。纵向的血浆样品显示，由于重复给药，在第2次与第4次给药之间，血浆水平有上升，但是保持在至少150μg/ml的水平，直到在所有取样动物研究结束。
通过免疫沉淀和Western Blot测定血浆中的淀粉状蛋白-抗体复合物
为了检验抗体-Aβ复合物是否已在这个体内研究中形成，使用免疫沉淀和随后的western Blot分析研究血浆样品的复合物形成。简单地说，孵育15μl血浆样品，并在4℃，加入10μL蛋白A琼脂糖浆珠摇晃3小时。使珠子在含有蛋白酶抑制剂的1ml冰冻的PBS中洗涤5次。样品每次都在4℃下以2000rpm进行离心2分钟。洗涤之后，将珠子重新悬浮于20μl含有0.1M DTT的电泳样品缓冲液中。使样品煮沸5分钟，并进行上述的离心。在上清液重新沸腾之后，样品被置于10％Bis/tris微型胶上，并用电泳法分离。使凝胶在硝化纤维素膜上留下印迹，封闭，并用6E10抗体(人Aβ1-16特异性；Signet Labs)进行探测。使用IR dye800缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Rockland)对结合的6E10进行检测。使用Odysee红外成像系统可观察到印迹。
结果表明，低分子量的Aβ能在使用免疫沉淀法共纯化的印迹中被检测到。这就得出以下的结论：在体内形成了6F6与Aβ的复合物，并在血浆样品中存在。试验用的雌性动物的带强度比较微弱。总的来说，这核实了6F6能够在体内与Aβ结合，并形成可用Western Blotting检测到的稳定的复合物。
在转基因hAPP小鼠中6F6的16周给药研究
使在鼠科Thy-1启动子的控制下过量表达hAPP(751)的转基因小鼠，其以高水平表达带London(717)和Swedish(670/671)突变体的人APP，结果导致年龄依赖性的淀粉样肽β1-40与淀粉样肽β1-42(Aβ1-40和Aβ1-42)增加。从约4月龄开始，这些小鼠在幼年时发展出由淀粉状蛋白沉积组成的斑块。大脑病况的严重程度与年龄的增加和行为缺陷相关。
该研究是在研究者不知情的情况下完成的，并没有表明给予的化合物的成分。将4月龄的雌性转基因小鼠分成3组(每组中n＝15)，以及一组同窝出生的非转基因小鼠，每周通过腹腔给予的途径处理小鼠，连续进行4个月。非转基因的小组和一接受对照IgG的Tg组用作对照组。处理结束之后，进行行为测试(Morris水迷宫，新目标识别任务)，然后将动物处死。收集大脑、CSF和血浆。处理每个大脑的一个半球进行组织学评价，另一半立即冷冻，以确定在TBS、Triton X-100、SDS和蚁酸(FA)大脑匀浆部分以及CSF中的Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42。使用抗β淀粉状蛋白6E10的免疫组化染色来确定在固定的样品中的大脑斑块的量，且使用计算机化的图像分析软件(Image Pro Plus，version 4.5.1.29)来确定和计算斑块表面区域和斑块的数量。使用突触素特异性的抗体染色(Neomarkers)的抗体来检测突触密度，其中，通过生物素化的二次抗体用VIP检测系统对所述的抗体进行标记。
处理组：3组Tg动物(15/组)和一组非转基因C57BL6动物(n＝15)：
(A)Tg动物，每周接受化合物6F6，17mg/kg bw(n＝15)
(B)Tg动物，接受化合物mIgG2a，17mg/kg bw(n＝15)
(D)Tg动物，接受化合物6F6，33mg/kg bw(n＝15)
(E)非转移因同窝动物；接受mIgG2a 17mg/kg bw(n＝15)
在随后提取的大脑匀浆和CFS中测定生物化学的淀粉状蛋白的量
从处理组A、B和D的动物中收集CSFB，并立即冷冻，直到准备好用ELISA技术进行进一步的分析。对于大脑匀浆，使来自组A、B和D的动物中冷冻的半球在5ml含有蛋白酶抑制剂混合物的TRIS缓冲盐水(TBS)中进行匀化处理。将几乎一半的大脑匀浆立即以等分样品冷冻起来。剩下的一半以74.500g离心1小时，将得到的上清液(＝TBS部分)等分，并在-20℃下保存，直到进行测试。得到的颗粒悬浮于Triton X-100(2.5ml)中，进行离心，将上清液等分，并在-20℃下保存。用SDS(2.5ml)重复这些步骤。SDS部分的颗粒悬浮于70％蚁酸(0.5ml)中，接着再离心。用等分的1M TRIS(9.5ml)中和得到的上清液，并在-20℃下保存。使用市售的试剂盒(Mesoscale Discovery Abeta 3-plex试剂盒#K15148E，用Sector Imager MS2400)，根据生产商的指示，将CSF以及四个大脑部分的样品用来测定Aβ38、Aβ40和Aβ42。以ng Aβ/g湿脑计算大脑值，以pg Aβ/ml计算CSF值。
在TBS部分中，组B的动物的Aβ水平在所有的三个淀粉状蛋白类别中最低。相对于对照组B，在6F6处理组A和D的Aβ42的增加较显著(p＜0.05vs.组A且p＜0.001vs.组D)，但是Aβ38和Aβ40的增加不显著。在Triton X-100部分中，6F6处理组A(p＜0.05)和D(p＜0.01)中的平均Aβ42水平也比对照组B有显著的增加。组B和D的Aβ40的水平没有显著差别，而组A的那些与对照组B(p＜0.05)相比，增加仍然较为显著。尽管不显著，但是相对于对照组B，在6F6处理组A中也能观察到Aβ38有增加，但是6F6处理组D相对于对照组B反而有轻微的下降。如在SDS与FA部分中检测，在6F6处理组A的动物的大脑中的结合且不溶于水的Aβ比对照组B(Aβ38和Aβ42)或D(Aβ38和Aβ40)明显升高。对照组B和6F6处理组D的差别并不显著。
在CSF样品中，在各个组中观察到的Aβ38和Aβ40的水平并无显著组差异。对照组B的动物的Aβ38、Aβ40和Aβ42的水平比6F6处理组A的动物稍低。与对照组B(p＜0.05)相比，6F6处理组D的动物的CSF Aβ42水平有显著的升高，这可能表明可溶的Aβ42的移动穿过隔离部分进入CSF或者间接通过血流。
突触密度的确定
使用抗突触素抗体(1∶200；Neo Markers；Cat# RM9111-SO)和生物素化的二级抗体(1∶200；Vector Laboratories；Cat# PK-6101)将每只动物的三个切片染色，接着进行VIP显色过程(过氧化物酶的底物试剂盒；Cat# SK4600)。为确定个别的平均突触密度，用宏观的测量步骤来评价每个区域(海马CA1的颗粒层、CA3和齿状回内侧叶(dentate gyrus medial blade)(DGmb))的三个图像和切片。在此宏观实验过程中，均等地进行图像对比，在恒定临界值以上计算突触。在使用大小限制的条件下，分别计数单个和连续的突触。连续的突触的总区域除以单个突触的平均尺寸。最终的突触计数根据以下的公式计算：
此外，图像区域根据减少的血管区进行背景修正，且相对于由血管区导致的总图像的减少而考虑突触的总量。
测量取自处理组A、B和D的海马大脑切片的CA1、CA3和GDmb区域的突触计数，结果表明在测试组中，突触密度没有变化。
全部和未结合(游离的)β淀粉状蛋白的纵向血浆水平的确定
在开始处理之前(第0天)取出体内血样，并在第3、6、9和12周通过下颌抽样的方式从面部静脉/动脉重复地取出血样。将血液样品收集入EDTA和未涂层的小瓶中，以得到血浆。将所有的血浆样品冷冻并储存，直到分析。
使用GyrolabTM工作站来测定未结合(游离的)淀粉状蛋白水平和总淀粉状蛋白(未结合Aβ和与抗体复合的)水平。生物素化的6F6鼠科mAb在游离的β-淀粉状蛋白测定中用作捕获剂，以及生物素化的N-末端特异性抗β-淀粉状蛋白抗体(实验室试剂)在总β-淀粉状蛋白测定中用作捕获剂。两种捕获剂都在含有用链霉亲和素包被的基质的Gyros Bioaffy CD捕获柱上被捕获。加入浓度为700nM的捕获抗体。在两个测定中都使用浓度为12.5nM的Alexa 647标记的4G8(β-淀粉样肽表位17-24特异性)进行检测。为量化β-淀粉状蛋白在样品中的量，生成Aβ1-42标准曲线(Innogenetics Aβ1-42)以得到31.25pg/ml-20000pg/ml的动态范围。在β-淀粉状蛋白-耗尽的人血浆中稀释Aβ1-42标准曲线和血浆样品。使用机器固有的软件进行数据分析，并在Excel中作图。
在17mg/kg和33mg/kg 6F6处理组中，总β-淀粉状蛋白水平到第3周(第一时间点)增加超过2000倍。在研究中发现33mg/kg处理组的总β-淀粉状蛋白水平稍高，但其与剂量水平的增加无关，这可能表明该反应趋于饱和。观察到两个6F6处理组的游离β-淀粉状蛋白水平到第一处理后时间点(三周)时为非转基因小鼠所示的背景水平，可能是因为如果不是这个测定检测的全部β-淀粉状蛋白，则是其中的大多数在抗体-β-淀粉状蛋白复合物中被结合。未受处理过程干扰，转基因小鼠的β-淀粉状蛋白的基线水平比非转基因对照小鼠的要几乎高出6倍。
使用6E10染色确定斑块的量
根据18只Tg小鼠(Tg组A；组B和D各6只)的大脑半球，准备每个大脑的足够数量的切片以量化淀粉状蛋白的沉积。在海马和皮质中定量地评价6E10免疫反应性。每层的15个切片(根据Paxinos和Franklin的形态图谱“The Mouse Brain”，第二版，所有5层对应于图104-105、107-108、111-112、115-116以及118-119)，沿矢状线将每片切为5μm厚(Leica SM 2000R)。所有测试的转基因动物组织以确定的相同方式进行处理，以避免由于该步骤的变化而引起的偏差。
使用针对人淀粉样肽的位置1-17的单克隆6E10抗体(Signet
Figure BPA00001204856700551
)来测定淀粉状蛋白沉积和斑块的量。海马和皮质的测量区恒定地穿过所有检测的大脑，其在免疫组织化学染色步骤(如收缩、不同的切割情况等)中排除了对组织的负性影响，并指出没有处理导致的萎缩。斑块量的数据与能够处理伪像、折叠或消失的块的切片中的单个区域的大小相关。采用大剂量的6F6(组D)的处理导致海马和皮质内的斑块区域百分比与低剂量6F6处理(组A；ANOVA：皮质和海马：p＜0.01)和对照组B(图2)相比有显著降低。每mm2的斑块数量也有相同趋势，即与对照组B(t-测试：皮质：p＝0.093)和低剂量6F6处理组A(t-测试：海马：p＝0.051；图3)相比，6F6处理组D的斑块数量也更少。平均斑块大小在所有组中都没有变化。
在缺乏补体因子H的小鼠的眼睛中的淀粉样蛋白病的证明：“干”AMD模 型动物
将10周龄、3个月、6个月、9个月和1岁龄的cfh-/-小鼠(n＝6)(在C57BL/6遗传背景上回交超过10代)和年龄相匹配的正常的C57BL/6小鼠(n＝6)放在温度可控的环境中，以12小时计数的日(160lux)-夜循环，并给予正常的实验室食物(自由进食和水)。将小鼠麻醉(以0.2ml/100g0.75ml氯胺酮、0.5mlDomitor、0.75ml无菌水，必要时，i.p.补充)，并在cSLO成像前10-15分钟，用局部的1％托吡卡胺(tropicamide)和2.5％盐酸去氧肾上腺素放大它们的瞳孔。在每张图像定序之前，将几滴羟丙基甲基纤维素滴入眼睛中，以防干燥。所有的实验程序都遵守1986年颁布的英联邦动物法(科学程序)并根据该法进行。
视网膜成像
根据以下的详述对3个月、6个月和12个月龄的cfh-/-(n＝12)和大小相配的对照小鼠(n＝6)进行成像处理。高分辨率和高对比度的视网膜图像的获得需要下述的共焦扫描激光眼底镜。简而言之，通过使用488-和820-nm的激光来完成反射成像。通过使用488-nm记录小鼠视网膜的自发荧光和荧光素血管造影图像。在498nm处，激发并植入带有阻碍边缘(50％发射值)的标准发射截至滤波器。
将小鼠麻醉(以0.2ml/100g0.75ml氯胺酮、0.5ml Domitor、0.75ml无菌水，必要时，i.p.补充)，并在cSLO成像前10-15分钟，用局部的1％托吡卡胺(tropicamide)和2.5％盐酸去氧肾上腺素放大它们的瞳孔。在每张图像定序之前，将一滴羟丙基甲基纤维素(0.3％)滴入眼睛中，以防止干燥。根据描述的修正方法(Guo L，Salt TE，Maass A，Luong V，Moss SE，Fitzke FW，Cordeiro MF(2006)Invest Ophthalmol Vis Sci 47：626-633)，使用共焦扫描激光眼底镜(Heidelberg Retina Angiograph，Heidelberg Engineering，Heidelberg，德国)在体内得到高分辨率和高对比度的视网膜图像。简而言之，针孔大的直径被缩减到100μm以提高轴向分辨率，并增大激光功率以改善信噪比。测得488nm下，小鼠瞳孔的能量为1400W。给小鼠配上特别设计的平凹隐形眼镜，并使用有超长工作距离的50倍显微透镜提供光学能量，这就改善了光学分辨力，并能够检测直径小到3μm的微毛细管结构。
记录层析图像的叠加，其中轴向平面依次间隔15-μm、玻璃体-至-巩膜和中心-至-四周的方式移动，以从主丛穿过外丛看到视网膜的血管。所有的图像顺序都在8.9Hz、10°视场下捕获，并制成8-bit，768 768-像素的图像文件，得到侧面图像的分辨率为1.2μm/像素。测到的小鼠眼中的轴向分辨率为5-8μm。
使用SPSS(Chicago，IL)对图像数据进行Student非配对t检验，分析cfh-/-与年龄相配的对照组动物在RPE水平时的视网膜下自发荧光沉积数量的差别。
组织学和免疫组织化学
简而言之，用氯胺酮和dormitor将动物深度麻醉，接着给10周龄的cfh-/-小鼠(n＝6)、3个月(n＝3)、6个月(n＝3)、9个月(n＝3)和1岁龄(n＝6)的cfh-/-小鼠灌注0.1M PBS，接着灌注4％多聚甲醛(在0.1M PBS中，pH 7.2)。切除眼睛，并将眼睛放入4％多聚甲醛中，然后在30％蔗糖溶液(在0.1M PBS缓冲液中)中抗冻，并4℃下放置24小时。经角膜的切口取出晶状体，并迅速将眼睛在OCT化合物中冷冻，接着以厚度为10μm切片以进行免疫组织化学分析，详见下述。将选择的动物的视神经网膜和脉络膜分开，并独立地摊平。
用一级抗体孵育cfh-/-小鼠(n＝20)和年龄匹配的对照小鼠(n＝20)的眼睛切片(表5)，接着通过合适的荧光化缀合的二级抗体和DAPI以给核染色，详见以下内容。
在室温下进行免疫组织化学分析，该分析是在固定于4％的多聚甲醛中的眼睛10μm厚的低温切片上进行的。将视网膜切片放入在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4与0.3％Triton X-100的5％正常驴血清中封闭1小时，并用一级抗体孵育过夜，所述一级抗体用在0.1M PBS和0.3％Triton X-100中的1％正常驴血清稀释。各一级抗体的稀释详见下文。一级抗体孵育之后再对其进行洗涤，如有需要，接着将荧光缀合的合适的二级抗体(Santa Cruz，Biotechnology，Inc.，驴抗小鼠sc-2099，在含有0.3％Triton和2％正常血清的PBS中形成(1∶100稀释，与一级抗体的稀释相同)和这些切片孵育2小时(FITC Santa Cruz，Biotechnology，Inc.，驴抗鼠sc-2099)。阴性对照由不相关的同种型匹配的抗体或不含有一级抗体组成。接下来将核用0.5ml 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(1μl DAPI储存溶液：5ml 0.1M PBS；Sigma-Aldrich)染色1分钟。用0.1M PBS将切片洗涤几次，接着在Tris缓冲盐水(pH 7.4)中洗涤4次，最后用VECTASHIELD(Vector Laboratories)放置盖玻片。
观察切片并以8bit/通道和1024x1024px在激光扫描共焦显微镜(Leica SP2；Leitz)上或者Epi-荧光亮场显微镜(Olympus BX50F4，Olympus，Japan)上捕获图像，其中利用Nikon DXM1200(Nikon，Tokyo，Japan)数码相机将数据处理成24位颜色的图像，其分辨率为3840x3072px。
市售的一级抗体
使用C3(FITC-缀合的山羊抗鼠1∶100稀释液；ICN Biomedicals)以指定的稀释倍数用于染色视网膜切片。
在该研究中使用的抗-淀粉状蛋白β抗体：
(1)Covance SIG-39153兔多克隆Ab，其对啮齿动物的淀粉状蛋白β有特异性，推荐用于IHC石蜡包埋切片@1/250稀释；
(2)Calbiochem NE1002(4G8)小鼠单克隆Ab，(IgG2b)，识别人和小鼠的淀粉状蛋白β，推荐用于IHC石蜡包埋切片@1/100-1/1000稀释(需要蚁酸预处理)；
(3)Abcam ab2539兔多克隆Ab，识别人和小鼠的淀粉状蛋白β，推荐用于IHC石蜡包埋切片@1/100稀释(在IHC染色步骤之前，需要热介导的抗原复原)
市售的二级抗体
表5：用于该研究中的市售的二级Abs
Figure BPA00001204856700581
cfh -/- 小鼠中类疣状(Drusenoid)沉积物的检测
自发荧光沉积可在老年cfh-/-小鼠的视网膜中检测到。荧光脂质、类疣状的沉积物首先在约14周龄的cfh-/-小鼠中可被检测到，其沉积量随年龄增大而增多，且都位于视网膜下的空间(RPE的顶侧)。这些沉积物也存在于野生型小鼠中，但是其量明显减少。例如，6个月龄的cfh-/-小鼠的视网膜的cSLO图像呈现出在灰色背景上有一些自发荧光的白色斑点，这些可放大10倍和40倍后在IHC的体外展开的视网膜中看到，因为在绿色(FITC)通道中较容易地识别自发荧光沉积。在自荧光沉积中存在很大变化的荧光发射光谱(数据未示)。
当利用IHC自发荧光检测cfh-/-小鼠的视网膜切片时，能看到类疣状沉积与在RPE细胞的顶侧上的视网膜下的空间的补体C3沉积位点相关。能在12个月龄的cfh-/-小鼠中看到这个现象(数据未示)。
用市售的抗-淀粉状蛋白βAbs的CFH-/-小鼠眼睛的分析
使用核实Aβ染色(Abcam ab4582)阳性的固定的人阿尔茨海默患者的大脑的市售切片，以检查表6中的三种市售的抗-淀粉状蛋白-βAbs的交叉反应性。
此处使用的步骤如下：
对于脑石蜡切片：
1.二甲苯-10分钟
2.100％乙醇-8分钟
3.95％乙醇-5分钟
4.蒸馏水-5分钟
5.抗原复原；
-含柠檬酸盐缓冲液的Ab2539 HIER
-NE1002(4G8)-70％蚁酸
-SIG-39153
对于石蜡和冷冻切片；
6.用PBS洗涤3次，每次5分钟
7.用5％正常驴血清封闭1小时
8.用PBS短暂洗涤
9.以下述稀释倍数使用一级抗体：
-Ab 2539-1∶100
-NE1002(4G8)-1∶200
-SIG-39153-1∶250
孵育过夜
10.用PBS洗涤3次，每次5分钟
11.以下述稀释倍数使用二级抗体
对于ab2539-Ab sc-2090 1/100
对于NE1002-Ab sc-2099 1/100
对于SIG-39153-Ab sc-2090 1/100
孵育1小时
12.用PBS洗涤3次，每次5分钟
13.DAPI 1分钟
12.用PBS洗涤3次
13.用TBS洗涤4次，每次5分钟
14.盖上盖玻片并密封。
正如所预料的那样，只有一级抗体能与人β淀粉状蛋白(NE1002[4G8]，and ab2539)交叉反应，给予阿尔茨海默人患者的脑组织中的人淀粉状蛋白β斑块的阳性检测(数据未示)。
使用市售的Abs检测老年(＞1岁)和10周龄的小鼠CFH-/-的淀粉状蛋白 β
表6：该研究中使用的一级淀粉状蛋白β抗体
Figure BPA00001204856700601
进行以下的步骤：
1.将切片空气干燥几个小时
2.洗涤3次
3.用5％NDS结块1小时
4.从表6中制备以下的一次抗体；
a.SIG39153-1∶250
b.NE1002(4G8)-1∶200
c.Ab25391∶500
5.简单洗涤并用一次抗体培养过夜
6.洗涤3次
7.制备以下的二次抗体；
a.抗兔FITC
b.抗鼠FITC
培养1小时
8.洗涤3次
9.用DAPI 1分钟
10.用PBS洗涤3次
11.用TBS洗涤4次
12.计量、盖玻片并密封
使用上述3种市售的抗淀粉状蛋白β一级抗体(Ab)来检查年龄匹配的cfh-/-小鼠和12-13个月龄的野生型同窝对照小鼠(1C57Bl/6)的初始固定的视网膜眼睛组织。各一级Ab都是用相关的二级荧光标记的二级Ab进行检测。对于Ab SIG39153，根据生产商推荐的方法没有在组织沉积中检测到信号(与上述的大脑样品中一样)(数据未示)。然而，使用两种其它市售的抗淀粉状蛋白β一级抗体可在老年cfh-/-小鼠(但是不是野生型同窝小鼠)中特异性检测到淀粉状蛋白β。这种数据的例子如图4所示，其中，组(A)表示老年野生型小鼠的视网膜组织，组(B)表示老年cfh-/-鼠的组织，其都用Ab(ab2539)作为一级抗体探测得到；以及组(C)表示老年野生型小鼠的视网膜组织，组(D)老年cfh-/-鼠的组织，其都用Ab NE1002(4G8)作为一级抗体探测得到。这些数据表明淀粉状蛋白β在Bruch’s膜周围沉积，尤其是在老的cfh-/-鼠中。可以看到抗体与沉积的淀粉状蛋白β在RPE/Bruch’s膜界面上的交叉反应的阳性信号，如图4的(B)和(D)的白色箭头突出的白条加强的部分。一些淀粉状蛋白沉积也可以在cfh-/-小鼠的眼睛的神经纤维层和神经节细胞区域中看到，例如图4(B)的顶部的白色箭头突出的白色信号。
接下来，使用NE1002(4G8)和ab2539抗淀粉状蛋白β一级抗体检验10周龄、年龄相当的cfh-/-小鼠和野生型小鼠同窝对照组(C57Bl/6)的固定视网膜眼睛组织。又，可在cfh-/-小鼠的视网膜中特别检测到淀粉状蛋白β，但是在野生型小鼠中则没有(数据未示)。该数据表明淀粉状蛋白β沉积发生在10周龄的cfh-/-小鼠(n＝3)的10％的视网膜中(数据未示)。沉积主要是在色素上皮细胞层(RPE)的基底面，且似乎与基底层沉积相关(数据未示)。需要注意的是，10周龄的淀粉状蛋白β沉积与‘类疣’自发荧光沉积的时间相似，以及补体C3沉积首先出现在cfh-/-小鼠中。
在cfh -/- 小鼠眼睛视网膜中的6F6与淀粉状蛋白β的交叉反应性
用于该研究中的一级抗体
(i)6F6小鼠单克隆Ab、IgG2a，
(ii)小鼠IgG2a同种型对照单克隆Ab，(实验室试剂，胞嘧啶脱氨酶抗原特异性)，
(iii)小鼠IgG2a，kappa[MOPC-173]同种型对照单克隆Ab，(ab18413，Abcam)，源自未知特性的克隆的Balb/c骨髓瘤
采用以下的步骤：
1.将切片空气干燥几小时
2.用1XPBS洗涤3次，每次5分钟
3.用在PBS中0.3％Triton X-100中的5％正常驴血清封闭，在室温下孵育1小时
4.用在PBS中的0.3％Triton X-100的1％正常驴血清稀释制备一级抗体
a.小鼠单克隆淀粉状蛋白β6F6 i)-1∶1000、1∶2000和1∶4000
b.小鼠IgG2a对照ii)1∶1000、1∶2000 and 1∶4000
简单洗涤
5.使用一级抗体并在室温下孵育过夜
第二天：
1.用1XPBS洗涤3次，每次5分钟
2.通过在PBS中的0.3％Triton X-100的1％正常驴血清稀释制备二级抗体
a.山羊抗小鼠Alexa Fluor 488(1∶2000)
使用二级抗体并在室温下孵育1小时
3.用1XPBS洗涤3次，每次5分钟
4.使用在PBS中的DAPI(1∶5000)并在暗室孵育1分钟
5.用1XPBS洗涤3次，每次5分钟
6.用1XTBS洗涤4次，每次5分钟
7.用Vectashield盖上盖玻片并密封。
如上述检测年龄匹配的cfh-/-小鼠和12-13个月龄的野生型同窝的对照动物(C57Bl/6)中的初始地固定的视网膜眼组织。尽管6F6在视网膜的相似区域也存在与通过市售的抗淀粉状蛋白βAbs检测的交叉反应，但是对照抗体也具有类似的交叉反应，其中的一些可能是因为二级Ab单独地背景交叉反应。在野生型样品中也能看到一些背景染色。
为了解决上述的背景染色的问题，重复进行实验，但是将二级抗体Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG Ab换成FITC标记的分子。此外，一级对照抗体换成市售的同种型对照(iii)。
用于该实验的步骤如下：
空气干燥切片几小时
用1XPBS洗涤一次，总共5分钟
用在PBS中的在0.3％Triton X-100的5％正常驴血清封闭，室温下孵育1小时
制备一级抗体，用在PBS中的在0.3％Triton X-100的1％正常驴血清进行稀释
a)小鼠IgG2a，Kappa ab18413 1∶100
简单洗涤
使用一级抗体并在室温下孵育过夜
第二天；
用1X PBS，洗涤3次，每次5分钟
通过在PBS中的在0.3％Triton X-100的1％正常驴血清稀释制备二级抗体
b)驴抗小鼠FITC(1∶300)
使用二级抗体并在室温下孵育1小时
用1X PBS洗涤3次，每次5分钟
使用在PBS中的DAPI(1∶5000)并在暗室孵育1分钟
用1X PBS洗涤3次，每次5分钟
用1X TBS洗涤4次，每次5分钟
用Vectashield盖上盖玻片并密封。
图5所示为使用上述的染色步骤得到的数据的例子。组(A)表示使用6F6作为一级抗体以1∶4000的稀释染色老年cfh-/-鼠的视网膜切片而获得的数据；组(B)表示使用同种型对照(iii)作为一级抗体(与6F6类似的w/v稀释)以染色老年cfh-/-鼠(标记有cfh-/-市售的阴性对照)的视网膜切片而获得的数据；组(C)表示使用6F6作为一级抗体以1∶4000的稀释染色老年野生型对照鼠的视网膜切片而获得的数据；以及组(D)表示使用同种型对照(ii)(标记cfh-/-阴性对照)作为一级抗体以1∶4000的稀释染色老年cfh-/-鼠视网膜切片而获得的数据。
这些数据确定了6F6能够特异性地检测沉积在cfh-/-鼠的视网膜上的淀粉状蛋白β(图5A)，其不存在于年龄匹配的野生型小鼠(图5C)。通过使用市售的同种型对照作为一级抗体并以6F6相似的w/v进行稀释得到的完全不存在的染色(图5B)，使6F6的特异性得到核实。使用其它实验室同种型抗体(ii)(1∶4000稀释)(图5D)获得的数据表明cfh-/-鼠的特异性的视网膜染色。然而，这可通过这种同种型匹配的抗体的特异性来解释，因为胞嘧啶脱氨酶是细胞裂解的标记物，这很可能在老年cfh-/-鼠的视网膜中发生。回过头看，对于该实验中的同种型特异性Ab对照而言，这并非是合适的选择。
cfh-/-鼠眼视网膜中的淀粉状蛋白与6F6和4G8的交叉反应时间
对以下年龄的在10周-12个月龄的中间时间点的年龄匹配的C57Bl/6(野生型)和cfh-/-鼠通过免疫组织化学的方式进行类似的分析：3个月龄(n＝3)、6个月龄(n＝3)和9个月龄(n＝3)。使用6F6或Calbiochem NE1002(4G8)作为一级检测抗体进行分析。对于3个月龄的小鼠，野生型和cfh-/-鼠的总体水平只有细微的差别。然而，对于6个月龄的小鼠，在cfh-/-鼠的Bruch’s膜边缘和视网膜色素上皮(RPE)细胞中可清楚地检测到淀粉状蛋白沉积，但是在年龄相当的野生对照鼠中则没有(数据未示出)。在6个月的时间点，使用4G8染色似乎覆盖了RPE与BM之间的整个边界，而使用6F6作为一级抗体的类似染色则更加突出(数据未示出)。6个月的时间点表明：与年龄相当的野生型对照鼠相比，通过IHC看到的cfh-/-鼠中的视网膜的淀粉状蛋白沉积的水平有明显不同。
总的来说，cfh-/-鼠代表眼睛(尤其是视网膜)中淀粉样蛋白病的快速模型，且这与该模型的“干”AMD基因型密切相关。所述小鼠可代表治疗性抗淀粉状蛋白βAbs如6F6对视网膜中的淀粉状蛋白β的效果分析的良好模型。
6F6干扰淀粉状蛋白β与补体因子I结合的能力的证明
最近发表的数据表明，淀粉状蛋白β与补体因子I(CFI)、“伴侣”与补体因子H(CFH)的辅因子之间有直接联系(Wang，J.等人.，2008)，这有助于解释cfh-/-鼠视网膜中的快速淀粉状蛋白β沉积。在不存在CFH的情况下，淀粉状蛋白β将与小鼠视网膜中的任何“未被伴侣结合”的CFI自由结合(Wang，J.等人.，2008，未发表数据)。为证明治疗性抗淀粉状蛋白β抗体、6F6或人源化等同物能通过与淀粉状蛋白β结合以干扰淀粉状蛋白β与CFI之间的相互作用，可参照Wang，J.等人.，2008的记述进行一系列实验。在市售的CFH蛋白(Quidel Corporation)存在或不存在的情况下，6F6与市售的淀粉状β蛋白制备物(如来自Peptide Institute)预孵育对其结合市售的CFI蛋白的能力的效果可如所述(Wang，J.等人.，2008，p716-717)的方法来确定，并通过标准的免疫共沉淀研究和/或通过BiaCore分析进行分析。类似地，在CFH存在或不存在的情况下，6F6与市售的淀粉状β蛋白制备物(如来自Peptide Institute)预孵育对其影响市售的CFI蛋白(Quidel Corporation)的功能的能力的效果可用如所述(Wang，J.等人.，2008，p717)的补体C3b(Quidel Corporation)裂解测定测量，并用标准SDS PAGE分析。类似地，在CFH存在的情况下，6F6抗体打断预先形成的淀粉状蛋白β：CFI复合物并由此恢复C3b对CFI/CFH复合物的裂解功能的能力可如所述(Wang，J.等人.，2008，p717)确定，并用标准SDS PAGE分析。
最近发表的体外研究结果表明支持这样的假设，其中淀粉状蛋白β通过阻止导致视网膜下的组织发生低级和慢性炎症的补体因子I的功能来激活玻璃疣内的补体系统；因此连接与AMD的发展相关的以下四个因素：炎症、补体激活、淀粉状蛋白β沉积和玻璃疣(Wang，J.等人.，2008)。这种淀粉状蛋白β在通过潜在地与补体因子H竞争结合补体因子I以激活替代性的补体路径的影响的直接证据在以前还没有记载(Wang，J.等人.，2008)。通过治疗性地给予抗体(如6F6)以清除激活的补体C3的组分以干扰淀粉状蛋白β的负面影响可在阻止或逆转AMD中形成新的作用机制。
使用硫磺素T染色和6F6交叉反应对老年人的眼睛的淀粉状蛋白β沉积的 检测
从英国伦敦的Moorfields Eye Bank，Moorfields Eye Hospital获得人捐赠的眼组织样品。得到的第一样品来自65岁的高加索人(英国伦敦的Moorfields Eye Bank，Moorfields Eye Hospital)。将眼睛固定，并按照前述的进行处理，接着使用以前公开的方法将切片用硫磺素T(Sigma T3516)染色(Anderson等人.，Exp Eye Res(2004)，78；243-256；Levine，H，Methods in Enzymology(1999)，309；274-284)。用眼组织得到的硫磺素T染色的数据表明，硫磺素T的荧光信号结合到淀粉状蛋白β上，其可看到在眼组织的人外部视网膜的基底层周围沉积和RPE Bruch’s膜界面周围的玻璃疣，呈稀疏的白色污点。
从英国伦敦的Moorfields Eye Bank，Moorfields Eye Hospital得到捐献者的眼组织的其它样品，包括41岁和90岁的捐献者。将这些眼睛再次固定，并经前述方式处理，但如前所述，这次将切片用6F6作为一级抗体进行染色，并用FITC缀合的抗小鼠IgG二级抗体进行可视化处理。尽管90岁人的眼睛样品在处理过程中已失去大部分视网膜，但是在剩余组织中的外段仍能检测到淀粉状蛋白与6F6的交叉反应。这样的染色不在41岁男性的眼的外段或视网膜中存在。眼睛组织的捐赠者不用AMD进行正式的诊断，但是严重的基底层沉积以及它们与淀粉状蛋白β的联系明显说明了硫磺素T染色的65岁男性的眼组织中的早期干AMD的病因。尽管在90岁眼睛的样品中，组织处理失去了大部分的视网膜，而可在剩余组织中检测淀粉状蛋白与6F6的交叉反应，但其并不在41岁男性的眼睛的外段也不在视网膜中(设想太年轻而不具有AMD的症状)的事实，正好预示在老年人的眼睛中发现的在结合淀粉状蛋白的类似6F6抗体的用途。
杂交瘤可变区的克隆
可变区序列
从所有的杂交瘤细胞系中提取RNA，接着通过逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)生成重链和轻链的可变结构域cDNA序列。RT-PCR的正向引物是特异于鼠科动物免疫球蛋白基因前导序列的简并引物的混合物，反向引物特异于抗体恒定区，如重链的6F6鼠科同种型IgG2a和轻链的鼠科kappa。引物是根据Jones和Bendig(Bio/Technology 9：88，1991)记述的策略设计的。对两个V-区序列重复进行RT-PCR，以便随后能核实正确的V-区序列。克隆经RT-PCR得到的V-区产物(Invitrogen TA克隆试剂盒)，并得到序列数据。
6F6VH氨基酸序列(SEQ ID No：19)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETIYTPKFQDKATLTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDAAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
6F6 VH DNA序列(SEQ ID No：20)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAG
TCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTG
GCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTATATATACCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAGT
AGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGA
CGCTGCCGTGTACTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCACAGTCTCCTCA
6F6 VL氨基酸序列(SEQ ID No：21)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQPPQLLIYQMS
NLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
6F6 VL DNA序列(SEQ ID No：22)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAG
CTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCTCAACTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
2C1 VH氨基酸序列(SEQ ID No：31)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETIYAPKFQDKATLTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
2C1 VH DNA序列(SEQ ID No：32)
GAGGTTCAGCTACAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGT
CAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTG
GCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTATATATGCCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAG
TAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTC
TCACAGTCTCCTCA
2C1VL氨基酸序列(SEQ ID No：33)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
2C1 VL DNA序列(SEQ ID No：34)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAG
CTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
2E11 VH氨基酸序列(SEQ ID No：35)
EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFNIKVYYIHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETKYVPKFQGKATLTVDTSSNTAYLHLSSLTSEDTGVYYCVTSGYWGQGTTLTVSS
2E11 VH DNA序列(SEQ ID No：36)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAG
TCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGTCTACTATATCCACTG
GTTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTAGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTAAGTATGTCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTAACAG
TAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGGCGTCTATTACTGTGTTACCTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTC
TCACAGTCTCCTCA
2E11 VL氨基酸序列(SEQ ID No：37)
DIVMTQAAFSNPVALGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
2E11 VL DNA序列(SEQ ID No：38)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCGCTCTTGGAACATCA
GCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
4D4 VH氨基酸序列(SEQ ID No：39)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETLYTPKFQGKATLTVDTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTSLTVSS
4D4 VHDNA序列(SEQ ID No：40)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAG
TCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTTCACTG
GCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AGAATGGTGAAACTCTATACACCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTGACAG
TAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCTCTC
TCACAGTCTCCTCA
4D4 VL氨基酸序列(SEQ ID No：41)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
4D4 VL DNA序列(SEQ ID No：42)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAG
CTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAA GAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
5C9 VH氨基酸序列(SEQ ID No：43)
EVQLQQSGAEFVRPGASVKLSCTASGFNIKTYYIHWLKQRTDQGLEWIGRIDPEDG
ETKFGPKFRGKATLTADTSSNTASLQLSSLTSEDTGVYYCVTSGYWGQGTTLSVSS
5C9 VH DNA序列(SEQ ID No：44)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGTTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT
CAAGTTATCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAACCTACTATATACACTGG
CTGAAACAGAGGACTGACCAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCCG
AGGATGGTGAAACTAAATTTGGCCCGAAATTCCGGGGCAAGGCCACTTTAACAG
CAGACACATCCTCCAACACAGCCTCCCTACAACTCAGCAGTCTGACATCTGAGG
ACACTGGCGTCTATTACTGTGTTACCTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCTCAGTCTCCTCA
5C9 VL氨基酸序列(SEQ ID No：45)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
5C9 VL DNA序列(SEQ ID No：46)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCA
GCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCTTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
5D1 VH氨基酸序列(SEQ ID No：47)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETKYAPKFQDKATLTVDTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
5D1 VH DNA序列(SEQ ID No：48)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGT
CAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTG
GCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAG
TAGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTTCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTC
TCACAGTCTCCTCA
5D1 VL氨基酸序列(SEQ ID No：49)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
5D1 VL DNA序列(SEQ ID No：50)
GACATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCA
GCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACC
TATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATC
AGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCA
GGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTT
TATTATTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTG
GAAATCAAA
14B3 VH氨基酸序列(SEQ ID No：51)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETLYTPKFQGKATFTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
14B3 VH DNA序列(SEQ ID No：52)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAG
TCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTTCACTG
GCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AGAATGGTGAAACTCTATATACCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTTACAG
TAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCACAGTCTCCTCA
14B3 VL氨基酸序列(SEQ ID No：53)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
14B3 VL DNA序列(SEQ ID No：54)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAG
CTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
16D4 VH氨基酸序列(SEQ ID No：55)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENG
ETQYAPKFQGKASLTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
16D4 VH DNA序列(SEQ ID No：56)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGT
CAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGG
TTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTCAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCTCTTTAACAG
CAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTTCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGG
ACACTGCCGTCTATTACTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTC
TCACAGTCTCCTCA
16D4 VL氨基酸序列(SEQ ID No：57)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
16D4 VL DNA序列(SEQ ID No：58)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCA
GCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTT
ATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAG
GAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTT
ATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA
氨基酸序列中划线的部分是互补决定区(CDRs)。
6F6嵌合体的克隆和表达
生成由移植到人IgG1的重链或人C kappa区的轻链的亲本鼠科V区组成的嵌合的6F6抗体(6F6c)，以便表达可用于确认功能性的鼠科V区的正确克隆的重组抗体材料。将编码6F6鼠科重链和轻链V区和鼠科信号序列的DNA(Kabat等人″Sequences of Immunological Interest″，NIH，1991，Fifth edition，p.30 95VNP′CL)在框中克隆至哺乳动物表达的载体RLD-bshe(对于重链)和RLN-bshe(对于轻链)，其已经含有人恒定区(分别是有缺陷的IgG1 Fc或人C kappa)。通过引入合适的克隆位点，VH氨基酸序列的FR4(构架区4(CDR3之后，第一恒定结构域之前的V-区序列))中的氨基酸序列从Seq ID19中所示的TTLTVSS变成TLVTVSS。
对于重链表达的RLD-bshe表达载体的元件：
碱基对                DNA片段描述
0-1014                启动子(SV40/RSV)
1015-2442             抗体重链
2443-2765             Poly A
2766-3142             BG启动子
3239-3802             DHFR
3803-4162             Poly A
4163-6322             总的主链
5077-5937(互补链)     β内酰胺酶
(表中所述的各元件位置和载体的整体大小仅为示例用，并将取决于抗体链插入物的大小)
对于轻链表达的RLN-bshe表达载体的元件：
碱基对               DNA片段的描述
0-1014               启动子(SV40/RSV)
1015-1731            抗体轻链
1732-2051            Poly A
2388-2764            BG启动子
2774-3568            新霉素
3569-3876            Poly A
3877-6063            总的主链
5077-5937(互补链)    β内酰胺酶
(表中所述的各元件的位置和载体的整体大小仅为示例用，并将取决于抗体链插入物的大小)
识别正确地克隆VH和VL序列的克隆，并准备质粒以在CHO细胞中表达。通过在FPLC系统上使用蛋白A色谱法从细胞培养的上清液中纯化表达的6F6c抗体，接着使用BiacoreTM技术通过ELISA和SPR测试其与Aβ的结合。结果表明，正确的6F6小鼠V区被克隆和表达，得到具有与亲本鼠科抗体6F6类似特征的功能性抗体。
重链人源化策略
对于6F6小鼠可变重链序列，选择人种系接受者构架(IGHV1-24，SEQ.I.D.NO：13)，其与小鼠6F6可变重链序列(SEQ ID No：19)和JH4小基因(Kabat：YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No：15))的同一性为85％(包括CDRs)。JH4小基因残基的首四个残基在CDR3区之内，所述的CDR3区被供体抗体引入的CDR所取代。
一组34个人源化的可变重链变体基于序列对比而生成，且可能会影响抗体的功能。将6F6鼠科重链CDRs(使用kabat定义)(SEQ ID Nos：1、2和3)移植到以上选择的人接受者构架上。设计了很多的人源化可变重链变体，其包括从位置1、5、13、24、27、28、29、30、37、40、41、48、66、67、69、71、75、76、93和94(Kabat n编号)(表7)中的选出的2-15个位置置换。紧邻CDRH3的Kabat定义的位置93和94在所有接受研究的变体中都存在。
表7VH回复突变调查表
Figure BPA00001204856700741
轻链人源化策略
对于6F6小鼠可变轻链序列，选择人种系接受者构架(IGKV2-28)，在序列相似性的基础上，其与小鼠6F6可变轻链序列(SEQ ID No：21)和J-区kappa 1(Kabat：WTFGQGTKVEIK)的序列同一性为79％。JK-1小基因残基的首两个残基在CDR3区内，且与小鼠6F6轻链CDR3的最后两个残基相同。
将6F6鼠科轻链DRs(使用Kabat定义)(SEQ ID Nos：4、5和6)移植到以上选择的人接受者构架上，以得到可变的直的移植轻链L0。一组13个人源化可变轻链变体进一步地基于序列比较而生成，且可能影响抗体功能。设计人源化可变轻链变体，其包含从8、11、43、63、64、100和104(Kabat编号)(表8)位置中选出的1-4个位置置换。
表8VL回复突变调查表
Figure BPA00001204856700751
人源化重链和轻链DNA的构建
通过进行重叠寡聚和PCR扩增或者通过使用作为模板的已经存在的变体进行的位点引导突变以重新合成人源化V区。也包括克隆至哺乳动物表达载体RLD-bshe和RLN-bshe以及鼠科动物信号序列的限制性位点(Kabat等人″Sequences of Immunological Interest″，NIH，1991，Fifth edition，p.30 95VNP′CL)。接着在构架中将编码人源化V区和信号序列以及限制性位点的PCR产物克隆至哺乳动物表达载体：重链变体被克隆进入RLD-bshe，形成编码全长人IgG1 Fc突变重链的DNA；轻链变体在框内被克隆至含有编码人kappa恒定区的的DNA的RLN-bshe，以此形成编码全长人kappa轻链的DNA。
人源化重链和轻链抗体组合表达的代表实例
首先将CHOK1细胞进行小规模的短暂转染，以在6孔板中评价人源化的轻链和重链DNA构建体的组合。使在DMEM F12、5％的超低IgG抗体胎牛血清和2mM谷氨酰胺中传代的CHOK1细胞在6孔板中形成合流。用总量为7.5μg DNA：在Optimem Glutamax培养基(Invitrogen)中的30μg转染脂质(合适的脂质参见WO2006/053783)转染合流细胞。在37℃，5％CO2下孵育转染细胞。72小时之后收获上清液，测定抗体浓度，接着经ELISA测试与人Aβ的结合。
通过电穿孔将编码重链和轻链的RLD和RLN质粒共转染进入CHO细胞，也能大规模地表达人源化抗体。使用无核苷的培养基选出表达合适抗体的稳定的多克隆群的细胞。回收抗体，并通过TPLC经ProSepA HiTrap柱从上清液中进行纯化。
在β-淀粉状蛋白结合ELISA中的人源化V H 变体的评价
将34个在小规模的6-孔培养液中表达的人源化VH变体对人Aβ肽(1-40)的结合进行评价。所有34个重链与L2轻链的组合进行测试(见以下的表8)。一些与L2的组合的确是表达了抗体材料，但是不与β-淀粉样肽1-40结合，因此这些组合没有EC50值。即使得出了EC50值，它们也根据不同的实验而变化，但是当与使用在每个实验中含有作为参考的6F6鼠科V-区的嵌合构建体的EC50值相比时，所述的EC50值在与作为参考的EC50值相同--约增加到其30倍的范围之间变化。紧邻CDRH3的Kabat定义的残基93和94都保留在所有的人源化变体中。就结构而言，位置27-30可考虑为CDRH1的一部分(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196(4)：901-917)，当回复突变时，与93和94位上的置换单独相比，位置27-30具有更好的结合。需要残基24和37两处置换的回复突变，以得到更牢固的结合，如果没有这些残基中的任何一个，且与L2轻链组合时，在ELISA中，人源化变体不会有效地与Aβ肽(1-40)结合。表9所示为基于与L2轻链的组合，淀粉状蛋白结合特性最好的人源化VH变体。
表9选出的人源化VH变体
Figure BPA00001204856700761
Figure BPA00001204856700771
“-“表示在IGHV1-24接受者构架序列中未变的残基
在β-淀粉状蛋白结合的ELISA中的人源化V L 变体的评价
对在小规模6-孔培养液中表达的人源化L0和VL变体与人Aβ肽(1-40)的结合进行评价。所有的变体与H11组合测试。表10总结了生成的所有功能性VL变体。
表10选出的人源化VL变体
更细致地检测最好的VH变体H11重链与轻链L2和L9、L10、L12和L13组合的组合。在这些实验中，使用了在悬浮的CHO细胞中生成的纯化的抗体材料。下表11示出了使用两个不同的涂层浓度的Aβ肽(1-40)的两个独立的实验结果。
表11与Aβ肽(1-40)结合的人源化变体的EC50值
Figure BPA00001204856700781
浓度是指用于涂覆微孔板的Aβ--肽；所示的值来自重复的孔，且还示出了每对的SD。
用于结合在溶液中的人β-淀粉样肽1-40的竞争性ELISA
在竞争性ELISA中评价6F6c和人源化抗体H11L2、H11L9、H11L10、H11L12和H11L13与在溶液中与Aβ1-40肽的结合能力以及抑制人Aβ1-40肽与小鼠6F6单克隆抗体相互作用的能力。将恒定浓度的生物素化的β-淀粉样肽1-40与系列稀释量的人源化6F6抗体变体预先孵育。接着将包括复合的和游离的淀粉状蛋白的混合物加入到含有固定小鼠6F6单克隆抗体的孔中，并在室温下孵育15分钟。洗涤板，并使用链霉亲和素-HRP缀合物检测仍然存在的用于结合固定的亲本6F6单克隆抗体的游离的β-淀粉状蛋白的量。
表12所示为使用纯化的抗体材料进行的两个独立的实验的竞争的IC50值。所有的人源化变体都能以相似的IC50值有效地与6F6亲本单克隆抗体竞争性结合。
表12：通过ELISA，人源化变体与6F6单克隆抗体竞争性结合人β-淀粉样肽1-40的IC50值
通过表面等离子共振测试测得的人源化变体的结合动力学
使用Biacore T100仪器测定选择的重链和轻链组合的亲和性。使用通过蛋白A表面Biacore芯片固定的人源化抗体并注射β-淀粉样1-40肽，以完成3个独立的实验。6F6的嵌合分子用作参考分子。为此，根据生产商推荐的方式，通过伯胺偶联将蛋白A固定在CM5芯片上。在该表面上捕获抗-β-淀粉状蛋白抗体，稳定一段时间之后，使人β-淀粉样肽1-40以在二等份的稀释液中浓度为256-2nM流过。根据Biacore的最佳模式在捕获的抗体表面的缓冲注射液用来进行二次校正数据设置。选择温和的酸性再生条件来除去捕获的抗体，但是并不明显地影响蛋白A表面进行其它捕获事件的能力。在25℃下，在HBS-EP中完成上述工作。结果总结于表13中，其为三个实验的平均值。
表13选择的纯化的人源化抗体变体的Biacore亲和性和动力学数据
  抗体结构   平均KD[nM]   SD
  6F6c   3.74   1.20
  H11L2   9.57   2.31
  H11L9   4.91   1.25
  H11L10   5.57   1.66
  H11L12   6.95   2.34
  H11L13   7.41   2.39
数据表示三个独立实验的平均KD和SD
人源化抗体H11L9的表位精细定位图
使用SRU BIND板阅读器(SRU生物系统)，将人源化单克隆抗体H11L9的最小的结合表位精细定位。基于以下的用于精细地对表位作图的18个氨基酸序列组生成3个肽组：a)丙氨酸扫描肽组，其中残基27-37中的10个残基连续被丙氨酸残基取代；b)一组N-末端截短肽，其中从起始于残基23的18聚体肽N-末端连续地除去一个残基；以及c)一组C-末端截短肽，其中从起始于残基40的18聚体肽C-末端中连续地除去一个残基。
所有的肽都以以下的形式生成：生物素SGSG连接子-肽酰胺，如有必要，使连接子变长，以保证所有的肽都是22聚体。
用PBS洗涤链霉亲和素包被的生物传感器板(SRU生物系统)，并将其多次上下翻转以清除缓冲液，接着用PBS、0.1％tween20和0.4％乙腈洗涤，再上下翻转以清除残留的缓冲液。将孔重悬于100μl的PBS、0.1％tween20和0.4％乙腈中，并在SRU板阅读器上读数，以建立基线。接着移除50μl的缓冲液，加入50μl稀释的肽，并使它们结合。然后用PBS洗涤板2次，再将板重悬于100μl的PBS中，从而重新测出基线。一旦定准基线，就移除50μl缓冲液，以终浓度30μg/ml加入H11L9和对照抗体。监测抗体结合。用PBS洗涤板2次，再将板重悬于100μl的PBS中，再次测定所述的板，并反向对照抗体添加，以查看可通过洗涤步骤除去的弱的结合剂。取出洗涤后的板的结合水平，并对抗体与不同肽组的结合进行分析。
当依次删除残基D23-N27时，该区中N-末端的删除对结合没有影响。删除K28使得结合降低超过50％，但是删除残基G29-A30没有进一步降低结合。删除残基I31及其远端使其完全没有结合性。这就定义了N-末端的边界，需要K28以保持完全的结合性。当依次删除V40-L34时，该区中C-末端的删除对结合没有影响。然而，当删除位置G33及远端，结合性就完全消失。这就定义了C-末端的边界，需要至少残基G33以保持结合性。因此，将N-和C-末端的删除数据结合，对在β-淀粉样肽内的H11L9-最小表位KGAIIG、残基28-33进行精细作图。这确认了用单克隆抗体6F6作图的较早重叠肽表位，除了删除残基M35看起来导致与6F6结合的信号减弱。
从N27-G37进行的丙氨酸取代扫描表明用丙氨酸取代氨基酸I32，尤其取代G33对结合性的影响最大。该数据也证明了G33可能对这种抗体的结合性有重要作用的上述删除C-末端的那些数据。结果以示意图的形式示于表14中。
表14 H11L9的表位精细定位的示意图
Figure BPA00001204856700811
人源化抗体H11L9的脱免疫(De-immunisation)
在计算机芯片上完成潜在的Th-细胞表位的评测，并将重链可变结构域和轻链可变结构域(分别是SEQ ID No：24和SEQ ID No：26)的氨基酸序列中选出的残基用替代性的残基取代，以破坏这些表位，而保留其功能。用替代性的氨基酸取代Vh的位置23、30、31、38、42、61和95以及VL的残基11、30、52和53，每个位置上使用的所述氨基酸示于图15和16中。
表15人源化Vh H11中选出的氨基酸取代
Figure BPA00001204856700812
表16人源化VL L9中选出的氨基酸取代
Figure BPA00001204856700813
Figure BPA00001204856700821
通过上述的重新创建重叠的寡聚物和PCR扩增或通过使用作为模板的H11和L9重链和轻链变体的位点引导的突变来合成V区。还包括克隆至哺乳动物表达载体RLD-bshe和RLN-bshe以及鼠科信号序列的限制性位点(Kabat等人″Sequences of Immunological Interest″，NIH，1991，Fifth edition，p.30 95VNP′CL)。接着将编码修饰的V区的产物克隆至哺乳动物表达载体：使用pEF启动子将重链变体克隆至RLD-bshe，以生成编码全长人IgG1 Fc突变重链的DNA；使用含有编码人kappa恒定区的pEF启动子将轻链变体在框内克隆至RLN-bshe，以生成编码全长人kappa轻链的DNA。
首先，表达和评估新的Vh变体H36-H44结合L9轻链，并表达和评估新的VL变体L15-L18结合H11重链。使用表达培养基上清液和ELISA以测试表达的抗体与合成的β-淀粉样肽1-40的结合，并进行Biacore分析。评估完成之后，将最佳地保留结合趋势的单个变化进行组合，生成重链和轻链构建体H45-H51和L19-L22。再次将这些新链变体与上述指出的伴侣链H11和L9组合表达。从这样的第二组变体中，最佳的重链(H48-H51)或轻链(L19-L21)相互组合，以生成第三组，再次表达该第三组并经Biacore分析与β-淀粉样肽1-40的结合动力学。表17所示为这些组合及结合动力学。
表17：选择的一组人源化脱免疫的结构及结合动力学(Biacore)
  构建体   ka   kd   KD(nM)
  H48L19   1.474E+5   4.643E-4   3.15
  H49L19   1.549E+5   4.780E-4   3.09
  H50L19   1.333E+5   3.682E-4   2.76
Figure BPA00001204856700831
用于测定结合动力学的Biacore方法
通过伯胺偶联将抗-人IgG(Biacore BR-1008-39)偶联到CM5生物芯片上。在该表面上捕获抗β-淀粉状蛋白抗体。接着以256、64、16、4和1nM使β-淀粉样肽(1-40)通过，两次对照都使用的是0nM(即只有缓冲液通过捕获的抗体表面)。在每次注射淀粉状蛋白之间，该表面使用3M MgCl2再生，这除去了捕获的抗体，但不明显地影响抗-人表面捕获抗体的能力以进行随后的分析。使用T100固有的1∶1模型分析这些数据。在25℃和37℃下，使用HBS-EP作为运行缓冲液完成上述过程。
从这组中，在生理温度下还评测了一些构建体的结合动力学。表18表示在37℃下，这些构建体的一亚组的结合动力学。
表18：在37℃下，从表17中选出的构建体亚组的结合动力学的评测结果(Biacore)
  构建体   ka   kd   KD(nM)
  H48L20   3.080E+5   1.091E-3   3.54
接受者构架和人源化变体的V-区的氨基酸序列
IGVH1-24重链接受者构架V区，氨基酸序列(SEQ ID No：13)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPE
DGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGVH1-24重链接受者构架V区DNA(SEQ ID No：14)
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGT
GAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACACCCTCACTGAATTATCCATGCACTG
GGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGTTTTGATCCTG
AAGATGGTGAAACAATCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACC
GAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGA
GGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACA
IGKV2-28轻链接受者构架V区氨基酸序列(SEQ ID No：16)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGS
NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP
IGKV2-28轻链接受者构架V区DNA(SEQ ID No：17)
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCG
GCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAAC
TATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT
ATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGA
TCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGG
GTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCT
人源化重链V区变体H11DNA序列
(SEQ ID No：23)
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGGAGCCTGGGGCCTCAG
TGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCCGGATTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACT
GGCTGCGACAGCTTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAGGATTGATCCT
GAAAATGGTGAAACTATATATACCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACCTTGACC
GTAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGA
GGACACGGCCGTGTATTACTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAGGGCACAC
TAGTGACCGTGTCCAGC
人源化重链V区变体H11氨基酸序列
(SEQ ID No：24)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
S
人源化轻链V区变体L9DNA序列
(SEQ ID No：25)
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCAATCCCGTCACCCCTGGAGAGCCG
GCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACC
TATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT
ATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTAGCAGTGGAT
CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGG
GTTTATTACTGCGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA
GGTGGAAATCAAA
人源化轻链V区变体L9氨基酸序列
(SEQ ID No：26)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
成熟的H11重链氨基酸序列(SEQ ID No：27)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP
CPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟的L9轻链氨基酸序列
(SEQ ID No：28)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS
NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIKRT
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE
QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
最适化H11重链DNA(SEQ ID No：29)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCG
TGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCAAAGTGTACTACGTGCAC
TGGCTGAGGCAGCTGCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACC
CCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTG
ACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTC
CGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCT
GGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG
GTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCT
GACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTAC
AGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCT
ACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTG
GAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA
ACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCC
TGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
CGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACA
ACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGT
GTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGT
GCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAG
GCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGG
ACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTAC
CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCA
GCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG
TCCCCCGGCAAG
最适化L9轻链DNA(SEQ ID No：30)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCC
CGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCATCA
CCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATC
TACCAGATGTCCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGG
AAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTG
GGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCAC
CAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCC
CCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA
CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGC
AGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCAC
CTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACA
AGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG
AGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
H48重链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：59)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIHVYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
S
H48重链V区变体DNA序列(SEQ ID No：60)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCG
TGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCCACGTGTACTACGTGCAC
TGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACC
CCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTG
ACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTC
CGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTGACCGTGTCCAGC
H49重链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：61)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKTYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
S
H49重链V区变体DNA序列(SEQ ID No：62)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCG
TGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCAAAACCTACTACGTGCACT
GGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCC
CGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGA
CCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCC
GAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCA
CACTAGTGACCGTGTCCAGC
H50重链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：63)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCTGSGFNIHVYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
S
H50重链V区变体DNA序列(SEQ ID No：64)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCG
TGAAGGTGAGCTGCACCGGCAGCGGCTTCAACATCCACGTGTACTACGTGCAC
TGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACC
CCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTG
ACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTC
CGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTGACCGTGTCCAGC
H51重链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：65)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIHTYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPEN
GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS
S
H51重链V区变体DNA序列(SEQ ID No：66)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCG
TGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCCACACCTACTACGTGCAC
TGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACC
CCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTG
ACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTC
CGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTGACCGTGTCCAGC
L19轻链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：67)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQM
DHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L19轻链V区变体DNA序列(SEQ ID No：68)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCC
CGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCAAGA
CCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATC
TACCAGATGGACCACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCG
GAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGT
GGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCA
CCAAGGTGGAGATCAAA
L20轻链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：69)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYVVYLQKPGQSPQLLIYQMD
HLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L20轻链V区变体DNA序列(SEQ ID No：70)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCC
CGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCATCA
CCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATC
TACCAGATGGACCACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCG
GAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGT
GGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCA
CCAAGGTGGAGATCAAA
L21轻链V区变体氨基酸序列(SEQ ID No：71)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQM
DNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L21轻链V区变体DNA序列(SEQ ID No：72)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCC
CGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCAAGA
CCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATC
TACCAGATGGACAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGG
AAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTG
GGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCAC
CAAGGTGGAGATCAAA

Claims (50)

1.一种治疗性抗原结合蛋白，其识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位。
2.根据权利要求1所述的治疗性抗原结合蛋白，其识别含有β-淀粉状蛋白的残基28-34或28-33的β-淀粉样肽的表位。
3.一种治疗性抗原结合蛋白，其识别在β-淀粉状蛋白的残基28-35的区内β-淀粉样肽的表位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的治疗性抗原结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合蛋白是抗体或者抗原结合片段和/或其衍生物。
5.一种治疗性抗体，其为结合了β-淀粉样肽的抗体或者抗原结合片段和/或其衍生物，并包括以下的CDRs或其CDR变体：
CDRH1：VYYVH(SEQ ID No：1)
CDRH2：RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No：2)
CDRH3：SGY(SEQ ID No：3)
CDRL1：RSSKSLLHRNGITYLY(SEQ ID No：4)
CDRL2：QMSNLAS(SEQ ID No：5)
CDRL3：AQNLELWT(SEQ ID No：6)
6.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，人接受者重链构架源自IGHV1-24(SEQ ID No：13)和构架4。
7.根据权利要求6所述的治疗性抗体，其特征在于，所述构架4的序列由人JH4小基因(Kabat)：
YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No：15)
编码，并且其中整个重链CDR3序列由供体免疫球蛋白提供。
8.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者轻链构架源自IGKV2-28(SEQ ID No：16)和构架4。
9.根据权利要求8所述的治疗性抗体，其特征在于，所述构架4的序列通过人JK-1小基因(Kabat)：
WTFGQGTKVEIK(SEQ ID No：18)编码。
10.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链源自IGHV1-24和JH4小基因，且人接受者轻链构架源自IGKV2-28和JK-1小基因，并基于在具有序列：SEQ ID No：19的供体VH结构域和具有序列SEQ ID No：21的VL结构域中发现的相应残基，所述的IGHV1-24和JH4小基因以及IGKV2-28和JK-1小基因任选含有一个或多个氨基端残基取代，其中所述的VH结构域和VL结构域对β-淀粉样肽的供体抗体保持全部或基本上全部的结合亲和性。
11.根据权利要求10所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链构架具有一个或多个选自下列残基(或其保守性取代)的氨基酸残基取代：
Figure FPA00001204856600021
12.根据权利要求11所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链构架包括以下的残基(或其保守性取代)：
Figure FPA00001204856600031
13.根据权利要求10-12中任一项所述的治疗性抗体，其特征在于，人接受者轻链构架具有一个或多个选自以下残基(或其保守性取代)的氨基酸取代：
  43   S   P
  63   S   T   64   G   S   100   Q(JK-1)   G   104   V(JK-1)   L
14.根据权利要求13所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者轻链构架包括以下的残基(或其保守性取代)：
Figure FPA00001204856600041
15.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：24所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：26所示的序列的VL结构域。
16.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
17.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
18.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
19.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：67所示的序列的VL结构域。
20.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
21.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
22.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
23.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：69所示的序列的VL结构域。
24.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：59所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
25.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：61所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
26.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：63所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
27.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：65所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID No：71所示的序列的VL结构域。
28.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No：27所示的序列的重链和具有SEQ ID No：28所示的序列的轻链。
29.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-4中任一项所述的治疗性抗原结合蛋白或者根据权利要求5-28中任一项所述的治疗性抗体。
30.一种治疗患有与β-淀粉样肽相关的疾病的人类患者的方法，所述的方法包括步骤：给予所述的患者治疗有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的治疗性抗原结合蛋白或者根据权利要求5-28中任一项所述的治疗性抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的疾病是阿尔茨海默病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼或β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其特征在于，所述抗原结合蛋白或抗体与补体路径抑制剂或补体路径激活剂的抑制剂联合给药。
33.一种药物组合物，其特征在于，该组合物包括如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白或者如权利要求5-28中任一项所述的抗体，以及补体路径抑制剂或补体路径激活剂的抑制剂。
34.如权利要求30所述的方法或者如权利要求33所述的药物组合物，其特征在于，所述补体路径抑制剂是补体因子H(CFH)或者可溶的补体受体1(sCR1)。
35.如权利要求30所述的方法或者如权利要求33所述的药物组合物，其特征在于，所述补体路径激活剂的抑制剂是补体因子D(CFD)抑制剂。
36.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白或者如权利要求6-28中任一项所述的治疗性抗体在制备治疗与β-淀粉样肽相关的疾病的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述的疾病是阿尔茨海默病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼或β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成。
38.一种双特异性抗体或其双特异性片段，其具有针对以下的第一特异性：
a)含有β-淀粉状蛋白的残基28-35的β-淀粉样肽的表位；
b)含有β-淀粉状蛋白的残基28-34的β-淀粉样肽的表位；
c)含有β-淀粉状蛋白的残基28-33的β-淀粉样肽的表位；或者
d)在β-淀粉状蛋白的残基28-35的区内的表位；
以及针对补体路径激活剂的第二特异性。
39.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，如权利要求6-28中任一项所述的抗体或者如权利要求38所述的双特异性抗体或其双特异性片段，用于治疗与β-淀粉样肽相关的疾病。
40.如权利要求39所述的抗原结合蛋白、抗体或双特异性抗体或其双特异性片段，其特征在于，所述与β-淀粉样肽相关的疾病是阿尔茨海默病或影响眼睛或视神经的疾病或病症，所述影响眼睛或视神经的疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加。
41.一种抗体或其片段，其特征在于，该抗体或其片段包括具有序列：SEQ ID No：19的VH结构域和具有序列：SEQ ID No：21的VL结构域。
42.一种抗原结合蛋白(抗原结合蛋白A)，其在ELISA测定中与包括具有序列SEQ ID No：27所示的重链和具有序列SEQ ID No：28(抗体B)所示的轻链的抗体竞争结合到β-淀粉状蛋白。
43.根据权利要求42所述的抗原结合蛋白A，其特征在于，所述的抗原结合蛋白A和抗体B以等摩尔量存在。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的抗原结合蛋白A，其特征在于，所述抗原结合蛋白A的存在使抗体B与β-淀粉状蛋白的结合在ELISA测定中降低超过10％、20％、30％、40％或50％。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的抗原结合蛋白A，其特征在于，在ELISA测定中，β-淀粉状蛋白结合到免疫测试板中。
46.根据权利要求45所述的抗原结合蛋白A，其特征在于，所述抗原结合蛋白A使抗体B与固定到板上的β-淀粉状蛋白的结合性降低，而无β-淀粉状蛋白特异性的对照物则没有降低。
47.一种抗体，其包括含有多肽的重链和轻链，所述多肽分别与SEQID No：27和SEQ ID No：28的氨基酸序列同一性至少是90％、95％、96％、97％、98％或99％，其特征在于，所述的抗体与β-淀粉状蛋白结合。
48.一种与C-末端生物素化的β-淀粉样肽结合的抗原结合蛋白，其中，所述的β-淀粉样肽包括由表面等离子体共振确定的β-淀粉状蛋白的残基24-35(SEQ ID No：10)或28-39(SEQ ID No：11)，所述的肽结合到链霉亲和素传感器芯片上。
49.一种抗原结合蛋白，其与β-淀粉状蛋白特异性结合，并且对于结合，需要在β-淀粉状蛋白的28-35区中的至少一个残基。
50.根据权利要求49所述的抗原结合蛋白，其特征在于，对于结合，所述的抗原结合蛋白还需要至少一个残基，该残基在所述的在β-淀粉状蛋白的28-35区中的至少一个残基的一侧或结构上相邻。
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