CN113929748A - 检测bace1酶活性的试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测BACE1酶活性的试剂盒及用途。本发明提供用于检测BACE1酶活性的多肽,其包含下式的结构:(F)‑Trp‑Thr‑Glu‑Pro‑Thr‑Tyr‑Phe‑Tyr‑Val‑Thr‑Asp‑Lys(Q)Arg‑Arg‑NH2,其中F为荧光发射基团,Q为荧光猝灭基团,F连接到色氨酸的氨基上,Q连接到赖氨酸的羧基上。本发明还提供包含所述多肽的组合物或试剂盒,以及所述多肽、组合物或试剂盒的用途。本发明的多肽、组合物或试剂盒可以在诊断二型糖尿病,认知障碍和二型糖尿病共患中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物学领域,是一种基于外周血中BACE1对胰岛素受体(INSR)酶切活性的检测方法及其试剂盒,该方法和试剂盒能用于单纯二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患的诊断并且用于研究二型糖尿病和认知障碍共患的发生机制。
背景技术
随着社会人口老年化进程的发展,衰老相关疾病给家庭和社会带来巨大的经济压力,其中二型糖尿病和认知障碍是较为典型的老年性疾病。流行性病学数据显示二型糖尿病及认知障碍病的全球病患数目巨大且成指数型增长。因此对这两种衰老相关疾病的研究具有重大社会意义。
认知障碍一般由最开始的记忆衰退逐渐发展成对新事物的学习以及日常生活的执行能力的丧失,根据其发展轨迹的不同可分为轻微认知衰退,轻度认知障碍(MCI)以及痴呆。虽然年龄,阿尔兹海默症(AD)以及血管性痴呆被认为是认知衰退的重要风险因子,但目前更多的研究表明认知障碍的发病进程与二型糖尿病高度相关。二型糖尿病是一类最为常见的代谢紊乱疾病,主要表现机体对胰岛素应答机制的丧失所引起的胰岛素抵抗,进而导致糖脂代谢异常以及炎症的发生。值得关注的是,认知障碍被认为是糖尿病的重要并发症,糖尿病与认知障碍共患的发生率远比二者单独发病要高。除此之外,临床研究表明,针对治疗二型糖尿病的药物如二甲双胍的使用能够明显改善病人认知水平。但目前靶向于二型糖尿病与认知障碍共患的潜在机制尚未明确,因此寻找监测二型糖尿病与认知障碍发展的生物标记物的重大意义在于:既为两种疾病在临床预测上提供突破性的连接也为疾病的早期干预及治疗提供方向。
BACE1(β-site APP cleaving enzyme,β分泌酶)因过度剪切β-淀粉样前体蛋白(APP)产生病理性聚集的A-beta进而加剧AD病程的发展而被广泛研究。BACE1蛋白水平及其酶活性在MCI期以及AD病人的脑实质,脑脊液以及血浆中显示异常升高并且与认知水平呈明显的负相关的现象。提示我们可以利用BACE1及其酶活性的变化判断AD发展过程中认知衰退的不同阶段。虽然之前关于BACE1的研究多集中于神经元上,但近年来更多的研究表明BACE1对特定底物的剪切在很多器官组织中发挥了生理与病理的作用。最近研究结果表明BACE1基因坐落于糖尿病相关的高风险基因座中,更有研究发现全身性BACE1敲除的小鼠能够显著提高对胰岛素的敏感性并且抵抗糖尿病的发生,与之相反,BACE1的过表达加剧小鼠的糖脂代谢紊乱以及诱发糖尿病的发生。另外,在高糖或高脂饮食诱发的糖尿病小鼠模型中BACE1的表达有着异常升高的现象。近期的研究发现,在小鼠的肝脏细胞中,BACE1通过剪切INSR的β亚基并且释放可溶性胰岛素受体(sINSR)从而降低细胞膜上的INSR水平,由此加剧胰岛素抵抗的发生。这提示着BACE1蛋白以及酶活性的异常可能直接参与到糖尿病的发病过程。
发明内容
发明人进行了深入的研究,考虑通过BACE1及其酶活性的变化来研究二型糖尿病和认知障碍共患的具体发病机制,由此设计检测血浆中BACE1酶活性和蛋白水平的方法,其可以用于预测二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患,同时也可以用于研究BACE1在不同疾病过程中的作用。
为了更方便地利用BACE1酶活性这一指标,发明人研发了在更易获得的血浆中检测BACE1酶活性的技术。发明人设计了以INSR作为BACE1底物的试剂盒来检测BACE1酶活性的变化。
在一些实施方案中,本发明包含的作为BACE1底物的胰岛素受体合成肽、测定血浆中BACE1酶活的反应体系、测定血浆中BACE1酶活的方法和BACE1蛋白表达的方法及标准化的血浆中BACE1酶活性检测试剂盒等。
在一些实施方案中,本发明基于检测不同病人血浆中的BACE1蛋白水平及其对INSR的酶活性的差异以及与病人具体患病状况的关联性分析,提供了一种用于检测血浆中BACE1对INSR酶活性的方法和试剂盒,其可以为诊断二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患病人提供便捷途径,同时也可以为BACE1在不同疾病状态下的不同作用机制提供理论依据。
在一些实施方案中,本发明涉及以下各项:
1.用于检测BACE1酶活性的多肽(INSR多肽),其包含下式的结构:(F)-Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Lys(Q)Arg-Arg-NH2。
在一些实施方案中,本发明还涉及APPsw多肽(F)-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Arg-Lys(Q)-Arg Arg-NH2。
在一些实施方案中,其中F为荧光发射基团,Q为荧光猝灭基团。
在一些实施方案中,F和Q可以连接到氨基酸的活性基团。例如,在涉及INSR多肽的一些实施方案中,F可以连接到色氨酸的氨基上,Q可以连接到赖氨酸的羧基上。在涉及APPsw多肽一些实施方案中,F可以连接到丝氨酸的氨基上,Q可以连接到赖氨酸的羧基上。
2.项目1所述的多肽,其中F包括具有一个芳环或稠环的化合物,具有多个共轭双键的有机化合物,例如包括罗丹明类化合物、荧光素类化合物、氟硼二吡咯类化合物、EDANS类化合物、香豆素类化合物、对甲氨基酚类化合物、花菁类化合物、吖啶类化合物、异吲哚类化合物、丹酰类化合物、氨基邻苯二甲酸酰肼类化合物、邻氨基苯甲酸类化合物、氨基邻苯二甲酰亚胺类化合物、氨基萘二甲酰亚胺类化合物、氨基苯并呋喃类化合物、氨基喹啉类化合物、二氰基氢醌类化合物,例如F可以为香豆素类化合物,例如MCA。
3.项目1或2所述的多肽,其中Q包括硝基苯基、硝基苄氧基羰基、硝基苯甲酰基等硝基化芳香族化合物、靛兰类化合物、苯并醌类化合物、蒽醌类化合物、偶氮化合物、茚苯胺类化合物、二或三苯基甲烷类化合物,例如Q可以DNP。
4.包含项目1-3中任一项所述的多肽的组合物或试剂盒,其可以用于检测BACE1酶活性,例如来自受试者的样品如血液样品的BACE1酶活性,
任选地所述组合物或试剂盒还可以包含反应缓冲液,例如pH值为4.0-4.5的反应缓冲液,所述缓冲液可以包括醋酸-醋酸盐缓冲液,磷酸-磷酸盐缓冲液,柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液,甘氨酸-盐酸缓冲液,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,醋酸-氯化钠缓冲液,优选缓冲液中可以含有50mM醋酸和100mM氯化钠;
任选地所述组合物或试剂盒还可以包含用于裂解待测样品的裂解液,例如所述裂解液可以含有:Tris-HCl、NaCl、EDTA或其盐、EGTA或其盐、Na3VO4、甘油和Triton X-100,优选所述裂解液可以包含10mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM Na3VO4,10%甘油和0.5%Triton X-100;
任选地所述多肽、裂解液和/或缓冲液可以是独立分隔的各个部分,例如各自独立包装,在检测使用时,用缓冲液将作为底物的所述多肽配成相应的底物反应缓冲液;也可以将底物溶解在缓冲液中形成底物反应缓冲液作为一个包装,裂解液独立为另一个包装;
任选地所述组合物或试剂盒还可以进一步包含APPsw多肽。
5.项目1-3中任一项所述的多肽在制备用于检测来自受试者的样品的BACE1酶活性和/或亲和性的组合物或试剂盒的用途。
6.项目5所述的用途,其中所述组合物或试剂盒进一步包含APPsw多肽,任选地所述样品为血液样品。
7.项目5或6所述的用途,其中所述受试者为患有或怀疑患有二型糖尿病,认知障碍患者,或者二型糖尿病和认知障碍共患的患者。
8.项目5-7任一项所述的用途,其中所述组合物或试剂盒用于鉴别单纯二型糖尿病患者,认知障碍和二型糖尿病共患的患者和在单纯认知障碍患者,其中BACE1对项目1-3中任一项所述的多肽的酶切活性高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于单纯二型糖尿病受试者或二型糖尿病和认知障碍共患的受试者。
9.项目6所述的用途,其中项目1-3中任一项所述的多肽和所述APPsw多肽用于测定BACE1对它们的亲和力,其中BACE1对APPsw的亲和力高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于认知障碍患者,包括单纯认知障碍以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者,其中BACE1对项目1-3中任一项所述的多肽用于测定BACE1对它们的亲和力,其中BACE1对INSR的亲和力高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于二型糖尿病患者,包括单纯二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者。
10.一种检测BACE1底物特异性的方法,包括将权利要求1-3中任一项所述的多肽和任选的APPsw多肽与BACE1特异反应的步骤,任选的所述方法还包括用BACE1抑制剂C3检测权利要求1-3中任一项所述的多肽和任选的APPsw多肽与BACE1反应特异性的步骤。
在一些实施方案中,本发明涉及以下各个方面。
本发明的第一个方面是提供:一种荧光标记的作为BACE1酶切底物的INSR多肽。
根据BACE1酶切INSR的酶切位点以及荧光共振体系原理,本发明设计的INSR的结构式可以为:
(F)-Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Lys(Q)Arg-Arg-NH2,其中F(例如MCA)为荧光发射基团,Q(例如DNP)为荧光猝灭基团;F可以连接到色氨酸的氨基上,Q可以连接到赖氨酸的羧基上。
本发明的第二个方面是提供:一种用于检测血浆中BACE1酶活性的反应体系。
根据本发明,检测血浆中BACE1活性的反应缓冲液的pH值为4.0-4.5,所述pH值可由适当的缓冲液提供。所述缓冲液可以是本领域中已知的各种缓冲液,包括但不限于醋酸-醋酸盐缓冲液,磷酸-磷酸盐缓冲液,柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液,甘氨酸-盐酸缓冲液,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,醋酸-氯化钠缓冲液等。在本发明的一个实施方式中,优选缓冲液中含有50mM醋酸和100mM氯化钠。
根据本发明,用于裂解待测样品的裂解液可以是本领域中已知的各种用于裂解样品的裂解液。在本发明的一个实施方式中,所述裂解液含有:Tris-HCl、NaCl、EDTA或其盐、EGTA或其盐、Na3VO4、甘油和Triton X-100。优选所述裂解液的组成为:10mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM Na3VO4,10%甘油和0.5%Triton X-100。
本发明的第三个方面是提供:一种检测INSR作为BACE1特异性底物的方法。
具体步骤为:使用BACE1抑制剂C3检测血浆中BACE1对合成的INSR多肽剪切的特异性。具体做法为:1)将BACE1抑制剂C3溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配制成20mM的工作液;2)血浆样品用反应液按照1∶5的稀释度稀释成终体积为50uL的溶液;3)同时,BACE1抑制剂C3也在储存浓度下被稀释成适当的工作浓度;4)将12个不同浓度的C3工作液按照相同体积加入到含有血浆反应混合物中,室温孵育20min;5)在此同时,合成的INSR或者APPsw多肽避光稀释在50uL的反应液里,随后与对应的血浆-C3混合体系混匀;6)使用多功能酶标仪(BioTek)检测反应体系的荧光变化,参数设为发射波长405nm,激发波长为320nm;利用ALL-IN-ONE微板阅读器软件(BioTek)分析酶促反应的速度,利用GraphPad Prism 8软件绘制抑制曲线并与四参数logistic方程进行拟合,得到IC50值。
本发明的第四个方面是提供:一种用于检测不同人群血浆中BACE1对合成的INSR酶切活性的方法。
根据本发明,检测血浆中BACE1酶活性的具体操作步骤如上所述:1)取10uL的血浆样品预稀释在40uL的反应液中室温孵育20分钟加入到微孔板中,同时避光将合成的INSR多肽用反应液稀释至40uM;2)多功能酶标仪(BioTek)设置测量参数:激发波长320nm,发射波长405的荧光强度(增益值设为75)后,50uL的底物稀释液加入到50uL含血浆样品的反应液中反应,利用ALL-IN-ONE微板阅读器软件(BioTek)分析酶促反应的速度;3)最后使用GradPad Prism 8(GraphPad Software)进行数据差异性分析。
本发明的第五个方面是提供:分析比较不同疾病状态下BACE1对合成的INSR或APPsw的亲和性差异。
具体步骤:50uL含有血浆的反应液分别与7个50uL的不同浓度梯度的含有合成的INSR或APPsw的荧光多肽底物反应,反应操作如前所述。利用GraphPad Prism 8软件计算分析了酶活性的Michaelis曲线和Vmax、Km值。
本发明的第六个方面是提供:一种血浆BACE1蛋白含量的检测方法。
利用免疫沉淀技术和蛋白免疫印记(Western blot)技术检测血浆样品中BACE1的含量。具体步骤:1)低吸附离心管中加入重悬混匀的免疫磁珠蛋白G,利用磁铁柱去除上清;2)加入溶有5ug BACE1单抗的PBST溶液,在4℃旋转孵育2h;3)取相同体积的血浆样品1∶1加入冷的RIPA裂解液,HEK293细胞裂解液和BACE1敲除细胞裂解液作为阳性和阴性对照;4)用PBST洗数次后,加入上述样品与磁珠蛋白G和抗体混合体系在4℃旋转孵育2h;5)用PBST洗数次后用磁铁移去上清;6)加入甘氨酸洗脱液在室温旋转洗脱抗原;7)最后加入不添加任何变性剂的2×SDSLoading溶液至样品中;8)制样后使用蛋白免疫印迹法,检测血浆内BACE1蛋白。显色检验:膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒进行显色检测。为了更精确的定量BACE1蛋白的水平,使用BACE1的蛋白检测试剂盒(ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay)试剂盒),更灵敏地检测血浆内的BACE1蛋白总含量的差异。
综上,本发明的研究发现,与健康人相比,认知障碍患者,二型糖尿病患者以及两种疾病共患的患者血浆中的BACE1蛋白表达量增高,并具有显著性差异;另外,在不同疾病状态下,BACE1对不同底物具有不同亲和力,在单纯二型糖尿痫患者以及认知障碍和二型糖尿病共患的患者血浆中BACE1对胰岛素受体酶切活性显著增强而在单纯认知障碍患者中BACE1对胰岛素受体的酶切活性与健康人相比无显著差异。这些结果反映血浆中BACE1对胰岛素受体的酶切的活性也许可以作为二型糖尿病的一种标记物,同时可以用于解释认知障碍和二型糖尿病的共患机制。
本发明所提供的试剂盒成份由以下几个部分组成:1)纯度在98%以上的含有BACE1剪切位点的INSR多肽(利用HPLC检测其成份与纯度,并使用标准化的BACE1蛋白以及BACE1抑制剂C3检测合成多肽的质量);2)检测BACE1酶活的裂解体系,主要由10mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM Na3VO4,10%甘油和0.5%Triton X-100组成;3)检测BACE1酶活的反应缓冲液,主要由PH4.0的50mM醋酸和100mM氯化钠组成;4)BACE1抑制剂与BACE1蛋白(利用在HEK293细胞内过表达的人源化的BACE1蛋白作为检测试剂的阳性对照)。
所述底物、裂解液、缓冲液可以是独立分隔的各个部分,有独立的包装,在检测使用时,用缓冲液将底物配成相应的底物反应缓冲液;也可以是底物溶解在缓冲液中形成底物反应缓冲液作为一个包装,裂解液独立为另一个包装。
本发明上述的合成底物、反应体系、检测方法及试剂盒,在诊断二型糖尿病,认知障碍和二型糖尿病共患中的应用。
附图说明
图1:免疫印迹实验检测正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组血浆样品BACE1含量结果图。结果表明:相比于正常组,单纯认知障碍受试者、二型糖尿病受试者、以及二型糖尿病与认知障碍共患受试者血浆中的BACE1蛋白含量上升。
图2:酶联免疫吸附实验检测正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组血浆样品BACE1含量结果图。结果表明:应用ELISA检测受试者血浆样品,相比于正常组,认知障碍受试者、二型糖尿病受试者、以及二型糖尿病与认知障碍共患受试者血浆中的BACE1蛋白含量上升。
图3:正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组中血浆样品BACE1对合成的APPsw多肽的酶活性检测结果图。结果表明:相比于正常组,认知障碍受试者、二型糖尿病受试者、以及二型糖尿病与认知障碍共患受试者血浆中的BACE1针对APPsw的多肽底物的酶活异常升高。说明BACE1可以作为联系认知障碍以及二型糖尿病的共同风险因子。
图4:BACE1的酶活被BACE1抑制剂C3所抑制且成浓度剂量依赖性。结果表明:BACE1对该合成的INSR多肽具有特异性剪切作用。
图5:正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组中血浆样品BACE1对合成的INSR多肽的酶活性检测结果图。实验结果表明单纯二型糖尿病受试者血浆以及二型糖尿病和认知障碍共患组血浆样品中BACE1对INSR的酶切活性较正常组或单纯认知障碍组中升高,提示BACE1对IR的特异性的酶切活性可以用来区分二型糖尿病以及二型糖尿病与认知障碍共患的患者。
图6:不同疾病状态下BACE1酶活动力学研究(左图为不同人群的血浆BACE1对APPsw的酶活曲线,右图为不同人群的血浆BACE1对INSR的酶活曲线)。结果表明BACE1针对于APPsw底物的米氏常数(Km)值在认知障碍患者中(包括单纯认知障碍以及二型糖尿病和认知障碍共患)明显要比正常组或者单纯二型糖尿病患者要小,说明BACE1在认知障碍患者中对APPsw的亲和力要高;而BACE1针对于INSR底物的Km值在二型糖尿病患者(包括单纯二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患)明显要比正常组或者单纯认知障碍患者要小,说明BACE1在二型糖尿病中对INSR底物的亲和力要高。
具体实施方式
本试剂盒是利用BACE1荧光标记多肽底物和荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)技术,直接检测血浆内BACE1的酶活性改变。该荧光标记的多肽底物由多肽氮端标记的荧光供体(Methoxy-coumarin-acetic-acid,MCA)和碳端标记的淬灭受体(2,4-dinitrophenyl,Dnp)这两种荧光基团组成。由于这两个基团在BACE1与底物多肽无相互作用时,淬灭受体Dnp能够消除荧光供体MCA受激发后发出的荧光信号,因此在未被切割情况下,无法检测到荧光信号。这条多肽如果被BACE1特异性切割,两个基团相互分开,这样受激发后的荧光供体释放出的荧光就不会被淬灭基团吸收,从而能够检测荧光信号,不同的荧光的信号强度也反应了这个体系内的BACE1的酶活性差异。
利用BACE1能够特异性的切割IR这一特性,我们设计了有其切割位点的一段多肽(Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Arg-Arg)作为检测BACE1活性的底物多肽。进一步在荧光多肽的氮端我们标记上荧光供体MAC,其激发光和发射光分别是328nm和393nm,带有荧光激发模块的酶标仪都可以用来检测这一信号。由于在碳端不能直接标记上淬灭受体(2,4-dinitrophenyl,Dnp),我们在多肽末端添加一个赖氨酸(K),通过赖氨酸侧链羧基接上Dnp基团。最后设计得到多肽片段:(MCA-Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Lys(Dnp)Arg-Arg-NH2)。
荧光强度的检测可以采用本领域中已知的各种检测方法,例如酶标仪、流式细胞仪等。优选采用多功能酶标仪,该仪器可以灵敏的采集信号,并进行分析,可大大提高检测的灵敏度。此外,该仪器的检测速度快,一般在20分钟内就可以采集样品的荧光信号,进行计算分析,时间短,适合大批量的生物样品检测。
由于荧光效率高,检测灵敏,所需样品量很小,一般取10ul血浆就可进行BACE1酶活性检测;并且非常适宜使用多孔板,例如96孔板,同时进行多份样品样本测定,操作方便、效果高。
在本发明中,“荧光发射基团”是能够发出荧光的分子或化合物或基团,可以是本领域中已知的能够发出荧光的分子或化合物或基团,例如具有一个芳环或稠环的化合物,具有多个共轭双键的有机化合物,包括但不限于罗丹明类化合物、荧光素类化合物、氟硼二吡咯类化合物、EDANS类化合物、香豆素类化合物、对甲氨基酚类化合物、花菁类化合物、吖啶类化合物、异吲哚类化合物、丹酰类化合物、氨基邻苯二甲酸酰肼类化合物、邻氨基苯甲酸类化合物、氨基邻苯二甲酰亚胺类化合物、氨基萘二甲酰亚胺类化合物、氨基苯并呋喃类化合物、氨基喹啉类化合物、二氰基氢醌类化合物。
“荧光猝灭基团”是指能够通过接受荧光发射基团的能量,而降低或者不再发射转移能量的化合物或分子,可以是本领域中已知的各种荧光猝灭基团,包括但不限于硝基苯基、硝基苄氧基羰基、硝基苯甲酰基等硝基化芳香族化合物、靛兰类化合物、苯并醌类化合物、蒽醌类化合物、偶氮化合物、茚苯胺类化合物、二或三苯基甲烷类化合物。
在本发明中,当底物多肽序列的C端的末端氨基酸带有非α氨基的氨基时,例如C端的末端氨基酸为赖氨酸,荧光猝灭基团可以连接到该C端的末端氨基酸的羧基上。为方便和清楚地说明,在本发明酶切多肽底物末端加上“-NH2”代表荧光猝灭基团连接在羧基上,加上“-COOH”代表荧光发射基团连接在非α氨基的氨基上。
本发明为测定血浆内的BACE1对IR的酶切活性提供了方法。
下面结合具体实施例及附图,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外,在阅读了本发明所记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1二型糖尿病患者、二型糖尿病和认知障碍共患的患者以及单纯认知障碍患者血浆中BACE1蛋白水平上调。
1.样品的收集
所有的样本均是在2018年1月至2019年1月由中国科学技术大学第一附属医院收集并经病理确诊为二型糖尿病56例,认知障碍患者61例,二型糖尿病和认知障碍共患97例以及正常健康老年组57例的血浆样本。四组在年龄和性别组成上无差异。所有的血浆样品都通过相同的方式处理,包括编号、离心、取上清血浆部分和相同条件贮存等。本次研究已通过中国科学技术大学第一附属医院伦理委员会得批准,伦理号为(2019#26)。所有参与者均给予知情同意书。
2.实验材料
利用CRISPR-Cas9技术得到BACE1敲除的细胞系
CRISPR-CAS9 BACE1 knockout sgRNA序列:
5-GGATCCGGAGCCCGCTACAT-3,(sgBACE1-1),
5’-CGGGCTCTTCGTCGGTCTCC-3’(sgBACE1-2)
5’-TACTACGTGGAGATGACCGT-3’(sgBACE1-3).
得到的BACE1敲除细胞作为阴性对照;
RIPA裂解液:1M Tris-HCl(PH7.5),1M Nacl,NP-40,5%脱盐胆酸钠,Coktail,2XSDS loading buffer(非还原性):Tris 6.8,10%SDS,甘油,BPB;
BACE1蛋白水平检测的ELISA试剂盒均购买于R&D,康宁酶标板(Costar,42592),免疫沉淀技术所用洗液(1*PBS+0.02%吐温20),磁珠蛋G(Thermo Fisher,10003D),0.45μmPVDF膜(GE Healthcare Life science 10600023),CLINX(chemiscope 5300),ECL反应液(Thermo#34580),抗体:BACE1单抗(CST,D10E5);过氧化物连接的特异性抗兔轻链IgG(Jackson ImmunoResearch,211-032-171)。3.具体操作
(1)利用免疫共沉淀技术(immunoprecipitation)和蛋白免疫印记(Westernblot)技术检测血浆样品中BACE1的含量。免疫沉淀技术原理是利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来,初步分离靶蛋白的一种方法。本发明利用该技术用BACE1单抗作为捕获抗体特异性分离出血浆中BACE1蛋白,随后结合蛋白印迹法检测其含量。具体步骤:低吸附的离心管中加入50uL重悬混匀的免疫磁珠蛋白G,利用磁铁移去上清,加入200uL溶有5ug BACE1单抗的PBST溶液,在4℃旋转孵育2h;同时,取相同体积的血浆样品1∶1加入冷的RIPA裂解液,HEK293细胞裂解液和BACE1敲除细胞裂解液作为阳性和阴性对照。用预冷的PBST洗数次后,将样品加入与到上述磁珠蛋白G和抗体混合体系在4℃旋转孵育2h;用PBST洗数次后用磁铁移去上清,加入20uL 50mM的甘氨酸洗脱液在室温旋转孵育洗脱抗原;最后加入10uL不添加任何变性剂的2×SDS Loading溶液至样品中;制样后使用蛋白免疫印迹法,检测血浆内BACE1蛋白。取15uL的样品加入到10%的SDS-PAGE胶,120V电压90分钟分离样品;在电泳结束后,将蛋白印迹到0.45μm PVDF膜膜上,240mA转膜90分钟;使用BACE1单抗1∶1000 4℃过夜孵育一抗;1∶5000使用过氧化物连接的特异性抗兔轻链IgG二抗室温摇床孵育;显色检验:膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒进行显色检测。
(2)利用酶联免疫吸附试验检测血浆中BACE1蛋白的含量。酶联免疫吸附试验是利用抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。进行检测时,血浆样品中的BACE1与固定的抗体结合。通过洗板除去非特异性结合物,再加入酶标记的抗体,此时,能固定下来的酶量与样品中BACE1的量相关,随后通过加入与酶反应的底物,经过酶反应后显色,根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量,进行定性或定量的分析。具体步骤:实验开始前,各试剂均应恢复至室温;试剂或样品配制时,充分混匀,并尽量避免起泡;每孔加可识别BACE1单抗100uL,并用酶标板覆膜封闭酶标板,4℃摇床孵育16h;弃去液体,甩干,洗板2次,每孔300uL含0.05%吐温20的PBS溶液洗涤,甩干并在吸水纸上将孔内液体拍干;随后每孔加300uL封闭液摇床室温(28℃)孵育1h,用PBST清洗数次;将血浆样品用PBST以1∶6稀释样品以及用PBST连续稀释标准品,上述样品及标曲准备两份在室温孵育20min后将样品加入到酶标板中室温孵育4h;随后加入酶标二抗室温孵育2h;弃去液体,甩干,洗板2次后加入链霉菌-HRP工作液室温孵育30min,最后加入新鲜配置的AB混合显色试剂盒和终止反应液;使用酶标仪检测450nm波长荧光。最后使用GradPad Prism 8(GraphPadSoftware)进行数据分析。
图1是显示免疫沉淀结合免疫印迹实验检测正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组血浆样品中BACE1含量结果图。
图2是显示酶联免疫吸附实验检测正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者组血浆样品中BACE1含量结果图。
实施例2:单纯认知障碍,二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者血浆样品中BACE1剪切APPsw多肽的酶活性增强。
1.实验材料
反应液:50mM醋酸钠(PH4.0),APPsw多肽(MAC-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Arg-Lys(Dnp)-Arg Arg-NH2)由GL biochem合成,二甲基亚砜(Thermo),用于BACE1酶活性检测的细胞裂解液:10mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM Nacl,1mM EDTA,1mMEGTA,1mM Na3VO4,10%甘油,0.5%Triton X-100。
2.具体操作
利用BACE1酶切荧光标记的APPsw多肽底物和荧光共振能量转移(Fluorescenceresonance energy transfer,FRET)技术,直接检测血浆中BACE1的酶活性改变。根据荧光团/猝灭剂对的物理性质和多肽在DMSO溶解要求,合成的APPsw多肽溶解成2mM的储存液。具体步骤:取10uL的血浆样品预稀释在40uL的反应液里在室温孵育20分钟,同时避光将APPsw多肽用反应液稀释至20uM。取50uL的含血浆样品的反应液和50uL的底物稀释液加入到96孔板中,使用多功能酶标仪(BioTek)检测反应体系的荧光变化,参数设为发射波长405nm,激发波长为320nm(增益值设为75);利用ALL-IN-ONE微板阅读器软件(BioTek)分析酶促反应的速度,最后使用GradPad Prism 8进行数据分析并且使用Mann-Whitney test比较不同组酶活性差异。
图3是显示正常组、单纯二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组中血浆样品BACE1对合成的APPsw多肽的酶活性检测结果图。
实施例3:合成的INSR作为BACE1底物的鉴定以及二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者血浆样品中BACE1酶切INSR多肽的酶活性增强。
1.实验材料
BACE1抑制剂C3(565788-1MG,Merck Millipore);INSR或者APPsw多肽由GLbiochem合成;二甲基亚砜(Thermo);用于BACE1酶活性检测的细胞裂解液:10mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM Nacl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM Na3VO4,10%甘油,0.5%Triton X-100;反应液:50mM醋酸钠PH4.0。
2.具体操作
(1)血浆样品中BACE1对合成的INSR多肽的酶切活性被BACE1抑制剂C3所抑制且呈浓度剂量依赖性。利用BACE1剪切荧光标记多肽底物和荧光共振能量转移技术,选择合成的INSR多肽作为BACE1底物直接检测血浆内BACE1的对INSR酶切酶活性改变。根据本发明设计提供合成的INSR多肽(MCA-Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Lys(Dnp)Arg-Arg-NH2)溶解在DMSO得到2mM的储存溶液。具体步骤:将BACE1抑制剂C3溶解在DMSO中配制成20mM的工作液。血浆样品按照1∶5的稀释度用反应液稀释成终体积为50uL的溶液,BACE1抑制剂C3也在储存浓度下被稀释成适当的工作浓度;将12个不同浓度的C3工作液按照相同体积加入到含有血浆反应混合物中,室温孵育20min;在此期间,合成的INSR或APPsw多肽分别避光溶解在50uL的反应液里,随后分别与血浆-C3混合体系混匀;使用多功能酶标仪(BioTek)检测反应体系的荧光变化,参数设为发射波长405nm,激发波长为320nm;利用ALL-IN-ONE微板阅读器软件(BioTek)分析酶促反应的速度,利用GraphPad Prism 8软件绘制抑制曲线并与四参数logistic方程进行拟合,得到IC50值;(2)检测年龄匹配的正常人,单纯认知障碍的患者,单纯二型糖尿病以及二型糖尿病与痴呆共患的患者血浆样品中BACE1对合成的INSR多肽的的酶活性的差异。利用BACE1剪切荧光标记多肽底物和荧光共振能量转移技术,选择合成的INSR多肽作为BACE1底物直接检测血浆内BACE1的对INSR酶切酶活性改变(原理如上文所述)。具体步骤:取10uL的血浆样品在预稀释在40uL的反应液里在室温孵育20分钟,同时避光将合成的INSR多肽用反应液稀释至40uM。取50uL的含血浆样品的反应液和50uL的底物稀释液加入到96孔板中,用多功能酶标仪(具体参数设置如上所述),最后使用GradPad Prism 8(GraphPad Software)进行数据分析,使用Mann-Whitneytest比较不同组酶活性差异。
(3)分析比较不同疾病状态下BACE1对合成的INSR或APPsw的亲和性差异。原理如上文所述。50uL含有血浆的反应液分别与7个50uL的不同浓度梯度的含有合成的INSR或APPsw的荧光多肽底物反应,反应操作如前所述。利用GraphPad Prism 8软件计算分析了酶活性的Michaelis曲线和Vmax、Km值。
图4显示BACE1的酶活性被BACE1抑制剂C3所抑制且呈剂量依赖性。
图5是显示正常组、二型糖尿病组、单纯认知障碍组以及二型糖尿病和认知障碍共患组中血浆样品BACE1对合成的INSR多肽的酶活性检测结果图。
图6显示BACE1酶活动力学研究。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测BACE1酶活性的多肽,其包含下式的结构:(F)-Trp-Thr-Glu-Pro-Thr-Tyr-Phe-Tyr-Val-Thr-Asp-Lys(Q)Arg-Arg-NH2,其中F为荧光发射基团,Q为荧光猝灭基团,F连接到色氨酸的氨基上,Q连接到赖氨酸的羧基上。
2.权利要求1所述的多肽,其中F包括具有一个芳环或稠环的化合物,具有多个共轭双键的有机化合物,例如包括罗丹明类化合物、荧光素类化合物、氟硼二吡咯类化合物、EDANS类化合物、香豆素类化合物、对甲氨基酚类化合物、花菁类化合物、吖啶类化合物、异吲哚类化合物、丹酰类化合物、氨基邻苯二甲酸酰肼类化合物、邻氨基苯甲酸类化合物、氨基邻苯二甲酰亚胺类化合物、氨基萘二甲酰亚胺类化合物、氨基苯并呋喃类化合物、氨基喹啉类化合物、二氰基氢醌类化合物,例如F可以为香豆素类化合物,例如MCA。
3.权利要求1或2所述的多肽,其中Q包括硝基苯基、硝基苄氧基羰基、硝基苯甲酰基等硝基化芳香族化合物、靛兰类化合物、苯并醌类化合物、蒽醌类化合物、偶氮化合物、茚苯胺类化合物、二或三苯基甲烷类化合物,例如Q可以DNP。
4.包含权利要求1-3中任一项所述的多肽的组合物或试剂盒,其可以用于检测BACE1酶活性,例如来自受试者的样品如血液样品的BACE1酶活性,
任选地所述组合物或试剂盒还可以包含反应缓冲液,例如pH值为4.0-4.5的反应缓冲液,所述缓冲液可以包括醋酸-醋酸盐缓冲液,磷酸-磷酸盐缓冲液,柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液,甘氨酸-盐酸缓冲液,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,醋酸-氯化钠缓冲液,优选缓冲液中可以含有50mM醋酸和100mM氯化钠;
任选地所述组合物或试剂盒还可以包含用于裂解待测样品的裂解液,例如所述裂解液可以含有:Tris-HCl、NaCl、EDTA或其盐、EGTA或其盐、Na3VO4、甘油和Triton X-100,优选所述裂解液可以包含10mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM Na3VO4,10%甘油和0.5%Triton X-100;
任选地所述多肽、裂解液和/或缓冲液可以是独立分隔的各个部分,例如各自独立包装,在检测使用时,用缓冲液将作为底物的所述多肽配成相应的底物反应缓冲液;也可以将底物溶解在缓冲液中形成底物反应缓冲液作为一个包装,裂解液独立为另一个包装;
任选地所述组合物或试剂盒还可以进一步包含APPsw多肽。
5.权利要求1-3中任一项所述的多肽在制备用于检测来自受试者的样品的BACE1酶活性和/或亲和性的组合物或试剂盒的用途。
6.权利要求5所述的用途,其中所述组合物或试剂盒进一步包含APPsw多肽,任选地所述样品为血液样品。
7.权利要求5或6所述的用途,其中所述受试者为患有或怀疑患有二型糖尿病,认知障碍患者,或者二型糖尿病和认知障碍共患的患者。
8.权利要求5-7任一项所述的用途,其中所述组合物或试剂盒用于鉴别单纯二型糖尿病患者,认知障碍和二型糖尿病共患的患者和在单纯认知障碍患者,其中BACE1对权利要求1-3中任一项所述的多肽的酶切活性高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于单纯二型糖尿病受试者或二型糖尿病和认知障碍共患的受试者。
9.权利要求6所述的用途,其中权利要求1-3中任一项所述的多肽和所述APPsw多肽用于测定BACE1对它们的亲和力,其中BACE1对APPsw的亲和力高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于认知障碍患者,包括单纯认知障碍以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者,其中BACE1对权利要求1-3中任一项所述的多肽用于测定BACE1对它们的亲和力,其中BACE1对INSR的亲和力高于来自正常对照样品值,表明所述样品来源于二型糖尿病患者,包括单纯二型糖尿病以及二型糖尿病和认知障碍共患的患者。
10.一种检测BACE1底物特异性的方法,包括将权利要求1-3中任一项所述的多肽和任选的APPsw多肽与BACE1特异反应的步骤,任选的所述方法还包括用BACE1抑制剂C3检测权利要求1-3中任一项所述的多肽和任选的APPsw多肽与BACE1反应特异性的步骤。
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