CN104327185B - 4Aβ1‑15衍生的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种4Aβ1‑15衍生的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC C2014173的杂交瘤细胞株产生。本发明的单克隆抗体能清除Aβ沉积，而不引起微出血负担，同时实现较少的小胶质细胞激活以避免炎症因子和T细胞被进一步过度激活，因而可用于预防和治疗阿尔茨海默病的治疗。

Description

4Aβ1-15衍生的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种4Aβ1-15衍生的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤、包含该单克隆抗体的药物组合物、包含该单克隆抗体的试剂盒，以及该单克隆抗体的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种最常见的痴呆和神经退行性疾病的形式，导致老年人逐渐丧失记忆和认知功能。众所周知，AD的神经病理学特征是脑内细胞外蛋白的斑块沉积。家族性和散在的案例都认为Aβ斑块是其常见的病理特征，提示我们治疗的方法应该从抑制其生成，促进其降解以及增强其从脑内清除三方面入手。

现在，刺激AD患者脑内的Aβ清除成为治疗AD最具革新性的药理学手段，免疫疗法通过注射Aβ抗原(主动免疫)或抗Aβ抗体(被动免疫)，已经被证实是治疗AD最先进和最可能成功的手段(可参见：H.J.Fu,B.Liu,J.L.Frost,C.A.Lemere(2010)Amyloid-betaimmunotherapy for Alzheimer's disease.CNS&neurological disorders drug targets9,197.；N.A.Castello et al.(2014)7,8-Dihydroxyflavone,a small molecule TrkBagonist,improves spatial memory and increases thin spine density in a mousemodel of Alzheimer disease-like neuronal loss.PloS one 9,e91453.)。首例人类临床试验研究了一种聚合的Aβ1-42肽段，名为AN1792，发现在小鼠模型中可以安全有效地诱导出有利抗体，但在二期临床被终止，因为人免疫试验导致了副反应——6％试验患者产生了脑膜脑炎。已经证实主动免疫产生的严重副反应显然是由于丰富的T细胞反应，而可以被大多数抗Aβ抗体识别的位点位于Aβ蛋白的氨基末端(Aβ1-15区域)(可参见：X.Guan,J.Zou,H.Gu,Z.Yao(2012)Short amyloid-beta immunogens with spacer-enhancedimmunogenicity without junctional epitopes for Alzheimer's diseaseimmunotherapy.Neuroreport 23,879.)。

由于严重的副反应，主动免疫疗法逐渐减少使用，而直接注射抗Aβ单克隆抗体(被动免疫)作为一种新的方式进行试验(可参见：R.Robert,K.L.Wark(2012)Engineeredantibody approaches for Alzheimer's disease immunotherapy.Archives ofbiochemistry and biophysics 526,132.)。与主动免疫的免疫反应性诱导T细胞产生并伴随严重的副反应相比，被动免疫疗法在APP/PS1转基因小鼠中引起免疫反应不需要生成T细胞，被认为具备适用于人类临床的一些特别的优势(可参见：K.Gasiorowski,J.Leszek(1997)A proposed new strategy of immunotherapy for Alzheimer'sdisease.Medical hypotheses 49,319.)。理论上，抗Aβ的被动免疫疗法被认为拥有更快更安全的免疫应答，并且与主动免疫相比潜伏期更短，成为一种更加直接可控的针对Aβ免疫反应的选择(可参见：F.Panza et al.(2011)Anti-beta-amyloid immunotherapy forAlzheimer's disease:focus on bapineuzumab.Current Alzheimer research 8,808.；B.Solomon,R.Koppel,E.Hanan,T.Katzav(1996)Monoclonal antibodies inhibit invitro fibrillar aggregation of the Alzheimer beta-amyloid peptide.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 93,452.；G.A.Jicha(2009)Is passive immunization for Alzheimer's disease'alive andwell'or'dead and buried'？Expert opinion on biological therapy 9,481.)。

之前的研究表明大多数在人类和动物体内产生的抗Aβ抗体识别的位点位于Aβ蛋白的氮端(Aβ1-15)，而T细胞位点已经被证实在Aβ15-42(可参见：X.Guan,J.Yang,H.Gu,J.Zou,Z.Yao(2013)Immunotherapeutic efficiency of a tetravalent Abeta1-15vaccine in APP/PS1transgenic mice as mouse model for Alzheimer'sdisease.Human vaccines&immunotherapeutics 9,1643.；M.Lee et al.(2005)Abeta42immunization in Alzheimer's disease generates Abeta N-terminalantibodies.Annals of neurology 58,430.)。在发明人的实验室，已经制备了4Aβ1-15(由肽段GPGPG连接的四段Aβ1-15重复序列)，用4Aβ1-15蛋白主动免疫后，在AD转基因模型鼠APP/PS1中可以显著减少Aβ病理变化并且改善认知功能(可参见：X.Guan, J.Zou,H.Gu,Z.Yao(2012)Short amyloid-beta immunogens with spacer-enhanced immunogenicitywithout junctional epitopes for Alzheimer's disease immunotherapy.Neuroreport23,879.；X.Guan,J.Yang,H.Gu,J.Zou,Z.Yao(2013)Immunotherapeutic efficiency of atetravalent Abeta1-15vaccine in APP/PS1transgenic mice as mouse model forAlzheimer's disease.Human vaccines&immunotherapeutics 9,1643.)。但主动免疫仍可能存在着副反应，如T细胞增殖引起的炎症反应，可能会对其进一步应用产生影响。

虽然过去已经产生出抗Aβ1-42的多克隆和单克隆抗体，但无一被证实能在动物和/或人中产生所需的疗效而又不产生严重的副作用。例如，对高龄APP23小鼠接受的持续5个月每周一次的N末端定向性抗Aβ1-42抗体的临床前研究所得的被动免疫结果显示治疗相关性副作用。特别是这些小鼠比用盐水处理的小鼠显示出微出血量和严重程度加剧(Pfeifer et al.,Science2002298:1379)。也有文章描述高龄(>24个月)Tg2576和PDAPP小鼠有类似的出血增加情况(Wilcock et al.,J Neuroscience2005,25:629-636)。在这两种小鼠品系中，注射抗体Aβ1-42都导致微出血的显著增加。

单克隆抗体技术是抗体制备的经典方法，该技术比较成熟，应用广泛。本发明人旨在利用单克隆抗体与Aβ特异性结合，达到清除Aβ沉积，而不引起微出血负担，同时实现较少的小胶质细胞激活以避免炎症因子和T细胞被进一步过度激活，从而实现对老年性痴呆的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供能清除Aβ沉积，而不引起微出血负担，同时实现较少的小胶质细胞激活以避免炎症因子和T细胞被进一步过度激活的单克隆抗体。

本发明的技术方案如下：一种4Aβ1-15衍生的单克隆抗体，所述单克隆抗体由于2014年9月28日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCCC2014173的杂交瘤细胞株5C8H5产生。

在上述技术方案中，4Aβ1-15是由GPGPG连接的四段Aβ1-15重复序列，其中，Aβ1-15氨基酸序列为：DAEFRHDSGYEVHHQ。4Aβ1-15去除了Aβ的T细胞抗原表位保留了Aβ的B细胞抗原表位，并用多个重复B细胞抗原表位增强抗 原的免疫原性，避免了细胞免疫反应保证了强的体液免疫反应。在发明人的实验室中，已经证明用4Aβ1-15蛋白主动免疫后，在阿尔茨海默病(AD)转基因模型鼠APP/PS1中可以显著减少Aβ病理变化并且改善认知功能，但考虑到主动免疫可能存在的副反应，发明人采用杂交瘤细胞株技术，通过大量实验以及丰富技术经验，用4Aβ1-15抗原制备了一种全新的单克隆抗体，命名为5C8H5，接种了AD转基因模型鼠APP/PS1。发明人检测了5C8H5接种和4Aβ1-15接种的小鼠血清和脑内的抗Aβ抗体，可溶性/不可溶性的Aβ40/42，Aβ斑块，神经发生，胶质细胞激活和行为学。这些结果揭示在AD转基因模型鼠APP/PS1中，4Aβ1-15衍生的单克隆抗体与其相应的抗原免疫组相比，拥有更好的免疫治疗效果，能够诱导更多的Aβ消除和行为学的改善同时伴随较少的小胶质细胞激活。5C8H5杂交瘤细胞株已被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2014173，本发明的单克隆抗体被鉴定为IgG1型，效价较高。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述单克隆抗体由以下方法制备获得：

在小鼠体内接种杂交瘤细胞株CCTCC C2014173，生产腹水抗体，取出腹水进行纯化，得到4Aβ1-15衍生的单克隆抗体；或者

体外培养杂交瘤细胞株CCTCC C2014173，分离纯化培养液，获得4Aβ1-15衍生的单克隆抗体。

在上述技术方案中，前一种方法适于大量获取抗体，后一种方法适于获得高纯度的抗体，通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，如盐析、凝胶过滤、亲合色谱层析等方法。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，以保藏号CCTCC C2014173保藏于中国典型培养物保藏中心。

在上述技术方案中，本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌单克隆抗体的能力(例如，C8H5单抗的细胞培养上清液可进行1:1000倍稀释后进行ELISA试验其滴度未明显下降)，能稳定、大量分泌本发明的单克隆抗体。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述的杂交瘤由以下方法制备获得：

4Aβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞按细胞数量5:1至10:1混合，然后在聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，第7天用HT完全培养基换出HAT完全培养基，继续培养，待上清颜色变黄时，吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞， 用有限稀释法克隆至能稳定高效分泌4Aβ1-15单克隆抗体，即获得所述杂交瘤。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述4Aβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠的步骤为：

用弗氏完全佐剂乳化抗原进行第一次免疫，免疫剂量为50μg/只；与第一次免疫间隔两周后，以弗氏不完全佐剂乳化抗原，进行第二次免疫，免疫剂量为50μg/只；与第二次免疫间隔两周后，以弗氏不完全佐剂乳化抗原，进行第三次免疫，免疫剂量为50μg/只；与第三次免疫间隔两周后，进行加强免疫，免疫剂量为100μg/只；加强免疫前，第三次免疫后，用ELISA法测抗体效价，取抗体效价最高的小鼠进行加强免疫。

本发明还提供了一种组合物，包括所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

在上述技术方案中，本发明的组合物可以为多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液剂(例如可注射和可输注溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预定的给药方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液剂形式。优选的给药方式是胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)给药。在一个优选的实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射给予。在另一个优选的实施方案中，抗体通过肌肉内或皮下注射给予。还可将辅助性活性化合物掺入到组合物中，在某些实施方案中，可将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种可用于治疗阿尔茨海默病或相关疾病或病症的另外治疗药剂一起共配制和/或共给予。例如，可将一种本发明抗体或其抗体部分与一种或多种能结合其它靶标的另外抗体一起共配制和/或共给予。

在上述技术方案中，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的容积、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在很多情况下，优选的是将等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠包括在组合物中。药学上可接受的载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的单克隆抗体和能够产生可检测信 号的标记物。

本发明提供的单克隆抗体具有高亲和力，能与阿尔茨海默病病人脑组织特异性结合，而不结合正常脑组织。因此，含有单克隆抗体的试剂盒，可用于诊断阿尔茨海默病，特别是阿尔茨海默病的早期诊断。其中，能够产生可检测信号的标记物包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素；荧光标记，如FITC、罗丹明；酶标记，如辣根过氧化物酶、荧光素酶或碱性磷酸酶；化学发光标志；生物素酰基基团；磁性物质。

本发明还提供了所述的4Aβ1-15衍生的单克隆抗体在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。由于4Aβ1-15衍生的单克隆抗体5C8H5对阿尔茨海默病拥有较好的免疫治疗效果，能够诱导更多的Aβ消除和行为学的改善同时伴随较少的小胶质细胞激活，因而可用于预防或治疗阿尔茨海默病的药物的制备中。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。注射液可通过皮下注射、静脉注射或输注的方式直接进行给药。冻干制剂使用时，先用葡萄糖注射液或灭菌注射用水溶解，加液量可根据临床需要酌定。对于冻干制剂，还可包括抗冻剂，如0-10％蔗糖(最好0.5-1.0％)。其它合适的抗冻剂还有海藻糖和乳糖。在注射液和冻干剂型中都可使用稳定剂，如1-50mM L-甲硫氨酸(最好5-10mM)。

本发明还提供了所述组合物在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。优选地，所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

通过杂交瘤技术，发明人用4Aβ1-15免疫小鼠，生产出一种全新的单克隆抗体，筛选出最好的杂交瘤细胞株5C8H5，并鉴定为IgG1型，杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCC2014173。发明人通过试验比较了相同的免疫程序下，分别利用4Aβ1-15进行主动免疫的小鼠和利用5C8H5进行被动免疫的小鼠后两组小鼠的AD治疗表现效果。结果表明，通过免疫治疗的手段，有效诱导了激活的小胶质细胞吞噬清除Aβ沉积，改变了微环境，进一步促使新增殖细胞向神经元分化，有利于行为学的改善。在相同的免疫程序下，5C8H5接种的被动免疫比4Aβ1-15接种的主动免疫表现出了更好更安全的疗效，突出了持续接种特异性抗体可能成为治疗AD的更好的方法，而小胶质细胞的激活被控制在一个机体适合的范围 可能成为治疗的关键。具体地：

1)与4Aβ1-15组相比，5C8H5需要较少次数的接种，使Aβ抗体达到更高滴度，而且被动免疫不需要潜伏期而直接作用于机体。同时，外周免疫抗Aβ抗体可以穿透血脑屏障进入中枢神经系统。

2)5C8H5显著改善APP/PS1转基因小鼠的活动度，空间学习能力和记忆任务的能力。特别是5C8H5组的小鼠比4Aβ1-15组表现出更多的提高，被动免疫对APP/PS1的改善作用较优于主动免疫。

3)通过脑片的免疫组织化学和定量图像分析，显示出5C8H5的Aβ沉积明显少于4Aβ1-15组。

4)组织切片结果显示，5C8H5在引起APP/PS1小鼠Aβ斑块清除的同时，没有诱发微出血的增加或其他一些病理变化。

5)主动免疫与被动免疫之间Aβ斑块相关的小胶质细胞的激活没有统计学差异，但5C8H5组总的小胶质细胞数显著少于4Aβ1-15组。在与Aβ不相关的区域中，5C8H5组比4Aβ1-15组含有显著较少的小胶质细胞。

6)神经发生的结果显示，5C8H5组诱导了比4Aβ1-15组更多的神经发生，是最接近正常组的。同时，分化成早期神经元的新增殖细胞(BrdU+/DCX+)和分化成成熟神经元的新增殖细胞(BrdU+/NeuN+)也有类似的结果。

附图说明

图1为四组小鼠血清和脑内抗Aβ抗体浓度的变化趋势图，其中，A为血清中抗Aβ抗体的变化趋势图；B为脑中抗Aβ抗体的变化图；

图2为四组小鼠的旷场实验和水迷宫实验结果图，其中，A为水平运动结果图，B为直立运动结果图，C为理毛行为结果图，D为定位航行结果图，E、F为空间探索结果图；

图3为四组小鼠的血清和脑中的Aβ40和Aβ42水平变化图，其中，A为血清中Aβ40的变化趋势图，B为血清中Aβ42的变化趋势图，C为海马中不可溶性Aβ40和Aβ42的水平图，D为海马中可溶性Aβ40和Aβ42的水平图，E为皮质中不可溶性Aβ40和Aβ42的水平图，F为皮质中可溶性Aβ40和Aβ42的水平图；

图4为三组小鼠海马和皮质中Aβ沉积的共聚焦激光显微图像和定量图像分析结果图，其中，A、B、C分别为IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠海马中的Aβ沉积共聚焦激光显微图像，D为三组小鼠海马中的Aβ沉积的定量图像分析结果图，E、F、G分别为IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠皮质中的Aβ沉积共聚焦激光显微图像，H为三组小鼠皮质中的Aβ沉积的定量图像分析结果图；

图5为5C8H5免疫小鼠第三天和第35天的Aβ沉积共聚焦激光显微图像和定量图像分析结果图，其中，A、B分别为第3天和第35天小鼠海马中的Aβ沉积共聚激光焦显微图像，C为海马中Aβ沉积的定量图像分析结果图，D、E分别为第3天和第35天小鼠皮质中的Aβ沉积共聚焦激光显微图像，F为皮质中Aβ沉积的定量图像分析结果图；

图6为四组小鼠的海马和皮质中Aβ斑块和胶质细胞激活的免疫染色共聚焦激光显微图像以及Aβ斑块和胶质细胞激活的定量图像分析结果图，其中，A-D分别为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠海马中Aβ斑块和胶质细胞激活的免疫染色共聚焦激光显微图像，E-F别为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠皮质中Aβ斑块和胶质细胞激活的免疫染色共聚焦激光显微图像，I-L为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠Aβ斑块和胶质细胞激活的免疫染色高倍共聚焦激光显微图像(63×油镜)，M、N为Aβ斑块和胶质细胞激活的定量图像分析结果图；

图7为四组小鼠脑组织免疫组织化学染色共聚焦激光显微图像，其中，A-D分别为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠脑组织经BrdU染色后的共聚焦激光显微图像，E为四组小鼠齿状回BrdU+细胞的定量图像分析结果图，F-I分别为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠脑组织经BrdU+/DCX+染色后的共聚焦激光显微图像，箭头所指部分为BrdU+/DCX+细胞，J为四组小鼠齿状回BrdU+/DCX+细胞的定量图像分析结果图，K-N为C57组、IgG组、5C8H5组、4Aβ1-15组小鼠脑组织经BrdU+/NeuN+染色后的共聚焦激光显微图像，箭头所指部分为BrdU+/NeuN+细胞，O为四组小鼠齿状回BrdU+/NeuN+细胞的定量图像分析结果图。

具体实施方式

本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、 重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人员常用文献中有详细第描述，如Sambrook等人编著的Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第三版等。

在本发明中，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体5C8H5是与从杂交瘤细胞株5C8H5或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。

在本发明中，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结果特征以及特定的电荷特征。

在本发明中，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株5C8H5时，其还指杂交瘤细胞株5C8H5的亚克隆和后代细胞。

在本发明中，术语“主动免疫”是利用抗原刺激，使机体产生抗体的方法。免疫须经几天，几个星期或更长时间才出现，但能长久甚至终生保持。

在本发明中，术语“被动免疫”是机体被动接受抗体、致敏淋巴细胞或其产物所获得的特异性免疫能力。它与主动产生的自动免疫不同，其特点是效应快，不需经过潜伏期，一经输入，立即可获得免疫力。

在本发明中，术语“单克隆抗体”，简称“单抗”，是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体，这种从一株单一细胞株产生的抗体就是单克隆抗体。

实施例1 4Aβ1-15肽的合成

4Aβ1-15肽的制备方法可参考专利号为“ZL 201010163165.2”，名称为“重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法”的发明专利，其中，4Aβ15即本发明的4Aβ1-15。本发明使用的4Aβ1-15多肽抗原由丽珠制药公司提供，蛋白纯度>95％。

此外，还可根据4Aβ1-15的序列人工合成全长的4Aβ1-15肽，其中：

Aβ1-15肽氨基酸序列为：DAEFRHDSGYEVHHQ；

4Aβ1-15肽氨基酸序列为：4段重复的DAEFRHDSGYEVHHQ序列，中间以肽段GPGPG连接，共75个氨基酸。

实施例2 杂交瘤的产生和单抗的制备

动物免疫

将经过纯化的4Aβ1-15抗原(蛋白纯度＞95％)免疫了6周龄的Balb/c小鼠。免疫方式为皮下或腹腔注射。第一次免疫时，用弗氏完全佐剂(FCA；Sigma)乳化抗原，免疫剂量为50μg/只。间隔两周后，以弗氏不完全佐剂(FIA；Sigma)乳化抗原，进行第二次免疫，免疫剂量为50μg/只。第二次免疫两周后，以弗氏不完全佐剂(FIA；Sigma)乳化抗原，进行第三次免疫，免疫剂量为50μg/只。第三次免疫两周后，进行加强免疫，免疫剂量为100μg/只。其中，多肽抗原以1mg/ml溶于PBS，与佐剂按体积比1:1进行免疫。加强免疫前，第三次免疫后，用ELISA法测抗体效价，取抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，制备单克隆抗体。

ELISA最佳抗原包被浓度与最佳阳性血清稀释浓度的确定

阴性对照：取4只8周龄SPF级的Balb/C雌性小鼠，在免疫前对所有小鼠进行断尾采血，置于室温1-2h，待血清充分析出时离心分离血清，4℃保存备用。

阳性对照：第三次免疫后10d，再次使用相同的方法采血，4℃保存备用(同时检测血清中抗体效价)

采用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最佳对照血清浓度：

(1)包被：以合成多肽为抗原，按倍比稀释从第一列为15μg/ml，每孔100μl/孔一直稀释到96孔板中第11列，最后一列只加包被液作为空白对照。振动平板以使抗原分布均匀，4℃过夜。

(2)封闭：第二天，倒掉ELISA板中液体，用吸水纸拍干后，使用多道移液器加入洗涤液200μg/孔，置于摇床中快速洗涤5min，倒掉洗涤液，然后使用吸水纸排干，重复洗涤3次；用0.1％名叫封闭液200μg/孔，37℃封闭30min，洗涤3次，吸水纸拍干。

(3)加一抗：阴、阳性血清用稀释液作1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，加入相应孔中，100μg/孔，设空白对照，37℃孵育60min，洗涤3次，吸水纸拍干。

(4)加二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:5000稀释)，100μg/孔，37℃孵育60min，孵育后洗涤液洗涤3次，吸水纸拍干。

(5)显色：加底物溶液OPD，100μg/孔，室温避光孵育15min，用2M H₂SO₄终止液终止反应，100μg/孔，因为是使用OPD作为显色液，随着时间的推移，颜色会发生变化，所以在加入终止液后应迅速使用酶标仪读取实验结果。在酶标仪中选用450nm的波长，测定实验结果的OD吸光值。

把阳性血清孔的OD值接近1.0，阳性血清孔与阴性血清孔的比值大于2.1的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度，在保证OD值灵敏度的情况下，以最小抗原包被浓度为最佳实验浓度。

细胞融合

1)SP2/0细胞(骨髓瘤细胞)的制备

培养基：RPMI1640完全培养基(1％双抗+10％胎牛血清)+20μg/ml 8-AG；细胞浓度以10⁴～5×10⁵/ml为宜，最大浓度不得超过10⁶/ml。

细胞处于对数生长的中期时，按1：3～1：10的比例传代，每3～5天传代一次。

将细胞吹匀，取出细胞悬液，置于一洁净的离心管中，水平离心机1000r/min离心5min，弃上清，加入1640培养液，使细胞混匀，将细胞悬液移入一洁净的细胞培养瓶中，补加1640至10ml，再将细胞混匀，移出5ml，置于另一洁净的细胞培养瓶中，混匀，置于37℃培养箱培养。

融合当天，将细胞从培养皿中轻轻吹下，使用50ml离心管收集吹下来的细胞，水平离心机1000r/min离心5min，弃上清，加入10ml不完全培养基，离心洗涤，重复洗涤三次，将细胞重悬于10ml不完全培养基内混匀，取SP2/0细胞悬液，加入质量体积比为0.4％台盼蓝染液，做活细胞计数，等体积SP2/0细胞悬液和0.4％台盼蓝染液混匀后，加入血球计数板计数，细胞浓度稀释至106个/ml，置于37℃水浴中备用。

2)免疫脾细胞的制备(融合当天)

加强免疫的Balb/c雌性小鼠摘眼球静脉放血，分离血清，-80℃保存，筛选阳性克隆时做间接ELISA的阳性对照用。

眼球静脉放血后，迅速将小鼠颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5min，小鼠移入超净工作台中，固定于平皿上，灭菌剪刀、镊子小心剪开前左腿下方皮肤 和腹膜，无菌取出脾脏，浸入已盛有基础培养基的平皿和尼龙膜。剥离被膜结缔组织，用注射器针芯研磨充分，悬液转移至离心管，用基础培养基冲洗平皿和尼龙膜数次，并将冲洗液转移至离心管，水平离心机800r/min离心6min，弃上清，低渗法破碎红细胞：加2ml纯水(高压灭菌)，吹打5秒，迅速加入2ml的1.8％的氯化钠溶液(高压灭菌)，水平离心机800r/min离心6min，弃上清，基础培养液重悬细胞沉淀，水平离心机800r/min离心6min，重复2次，弃上清，重悬细胞至10ml，混匀，台盼蓝染色，活细胞计数后备用。

3)饲养细胞的制备(融合前一天)

完全培养基：Hybridoma-SFM培养基+2％HAT+1％双抗；

取8周龄的Balb/c雌性小鼠2只，颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5min，小鼠固定于平皿上，移入超净工作台中，镊子提起小鼠腹部表皮，无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，一次性无菌注射器吸取HAT选择培养基10ml注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左右用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部，反复冲洗，注射器吸出腹腔内的培养基(内含巨噬细胞)，冲洗液放入10ml离心管，1000rpm/分离10min，取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞数至每毫升含4万个活细胞，加入96孔板，0.05ml/孔，放入37℃CO₂孵箱培养。

如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

每只小鼠可得3-5×10⁶个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。

4)细胞融合

取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量5:1至10:1混合(骨髓瘤细胞SP2/0约3000个/孔)，加入无菌离心管内，1000r/min离心10min，弃上清，无菌纸(高压灭菌)充分吸干残余液体(以免影响PEG浓度)，手握离心管垂直轻敲桌面，使两种细胞充分混匀，直至成糊状，离心管置于37℃水浴的烧杯中，吸取预热的50％PEG溶液1ml(过滤器)，60s内缓慢滴入，边滴边转动离心管，静止作用1min(轻轻振荡)，加入37℃预热的不完全培养基以终止PEG作用：每2min内分别缓慢加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，10ml培养基，边滴边转动离心管，轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用，水平离心机1000r/min离心10min，弃上清，2％的HAT选择培养液轻悬细胞沉淀，均匀混合， 用移液器轻轻分装到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μl(一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板)，培养板移至37℃，5％CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养，每天观察杂交瘤生长状况。

筛选和克隆

融合后的细胞隔两天采用半换液的方式更换HAT完全培养基，第7天用HT完全培养基换出HAT完全培养基，继续培养，待上清颜色变黄时，收集上清(一般成功融合的细胞培养基会变黄)，用建立好的间接ELISA方法检测特异性抗体(以免疫PBS的小鼠或SP2/0细胞培养上清液作阴性对照，阳性血清做阳性对照)。对ELISA检测呈阳性的细胞进行有限稀释，并在每次有限稀释后5-6天进行ELISA测试，测定OD450读数。挑去OD450读数最高的阳性细胞克隆进行进一步的有限稀释，直至用ELISA测定96孔板时，整个96孔板的结果均为阳性。从中挑取OD450读数较高的阳性细胞克隆，从而获得产生抗4Aβ1-15单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为5C8H5。

单克隆抗体在小鼠体内诱导腹水产生，抗体用亲和色谱分析进行纯化。

细胞培养上清和腹水通过ELISA检测。我们建立了拥有最高滴度的细胞系5C8H5。根据单克隆抗体表型分析试剂盒及说明书，杂交瘤细胞系的表型为IgG。杂交瘤细胞系冻存和复苏后，杂交瘤分泌抗体的稳定性没有减弱。

实施例3 单克隆抗体接种AD转基因小鼠后免疫学、病理学及行为学观察试验

1、材料与方法

1.1分组和免疫程序

小鼠被分为4组(每组8只)，其中三组是AD转基因模型鼠APP/PS1，由南京大学模式动物研究中心提供，另一组是野生型C57Bl/6J小鼠不作处理。三组转基因小鼠中，其中一组接种单克隆抗体5C8H5(以下简称“5C8H5”)作为实验组。由于5C8H5被鉴定为IgG表型，我们选择小鼠IgG，一种无关同型对照抗体作为阴性对照，也即第二组接种了小鼠IgG。同时，我们建立了一组小鼠接种4Aβ1-15抗原，用于比较在相同的免疫程序下，4Aβ1-15和5C8H5，也就是主动免疫和被动免疫，哪一组能表现出更好的治疗AD的效果。

由于转基因小鼠脑内的Aβ斑块可以从6月龄开始被检测到，而且外周注射抗Aβ抗体可以进入中枢神经系统，发明人计划通过腹腔注射，从6月龄开 始到8.5月龄，每2周一次，一共注射6次。5C8H5和IgG组小鼠每只接种0.1ml(1mg/ml)抗体蛋白，用无菌PBS稀释(pH7.4)。4Aβ1-15抗原处理组用MF59佐剂1:1乳化并通过皮下注射0.1ml(1mg/ml)给小鼠。所有的动物饲养在温度可控、光循环可控的设备中，试验严格根据机构指导方针实施。

1.2酶联免疫反应ELISA检测血清和脑内的抗Aβ抗体

每次免疫后第二天，我们分别通过小鼠尾静脉采血，4℃保存过夜，8000r/min离心10分钟分离血清并储存在–80℃。饲养在标准环境中的34周龄小鼠深度麻醉后处死。小鼠用生理盐水灌注。取脑并沿着正中矢状一切为二。右半脑临时冻存用于生物学分析，左半脑放在4％多聚甲醛中固定用于免疫组织化学分析。血清和脑匀浆Aβ抗体水平采用ELISA方法检测。抗血清稀释后加入96孔板，37℃孵育1小时，洗板3次。HRP共轭的二抗稀释后加入96孔板，37℃孵育30分钟，洗板5次。TMB显色液加入每孔，然后加入终止液，15-30分钟显色，然后读取吸光度值。

1.3旷场行为学实验和水迷宫行为学实验

APP/PS1转基因小鼠第6次接种后一周，我们检测了旷场和水迷宫的行为学。

旷场行为学实验通常用于检测啮齿动物的自发活动和情绪(可参见：A.M.Bronikowski et al.(2001)Open-field behavior of house mice selectivelybred for high voluntary wheel-running.Behavior genetics 31,309.)。我们用60×60厘米长宽和45厘米高的五块黑色塑料板拼成空旷场地，通过管带与外界相连。Polytrack录像系统和相应的Chromotrack软件(PAS2011.exe,PASuse2011.exe,Path View2011.exe,bySan Diego Instruments,Inc.,San Diego,CA)用于收集，数字化和数据分析[可参见：A.M.Bronikowski et al.(2001)Open-field behavior of house mice selectivelybred for high voluntary wheel-running.Behavior genetics 31,309；E.Mikics,B.Barsy,B.Barsvari,J.Haller(2005)Behavioral specificity of non-genomicglucocorticoid effects in rats:effects on risk assessment in the elevatedplus-maze and the open-field.Hormones and behavior 48,152.)。所有实验都在昏暗的红色光照下在暗房中进行。在旷场试验在，小鼠贴壁放下。常规测试间隔60分钟。每组试验后要用水进行试验装置清洁，并且用干毛巾擦拭避免残留影响下一组试验。行为的视频被试验设备上访2米的高架光敏相机 记录下。

水迷宫(MWM)是一个检测啮齿动物海马依赖性的空间学习记忆的实验。它主要是在一个圆周的空旷游泳池中，通过远端信号导航记录动物从起始位置到找到水下潜在的平台(可参见：Y.Ziv et al.(2006)Immune cells contribute to the maintenance ofneurogenesis and spatial learning abilities in adulthood.Nature neuroscience9,268.；C.V.Vorhees,M.T.Williams(2006)Morris water maze:procedures forassessing spatial and related forms of learning and memory.Nature protocols1,848.；O.Butovsky et al.(2006)Glatiramer acetate fights against Alzheimer'sdisease by inducing dendritic-like microglia expressing insulin-like growthfactor1.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 103,11784.)。小鼠在一个直径0.8米的白色无毒的恒温的(23℃)水池中训练找到平台，连续7天训练。定位航行包括了1-4天的采集阶段和6-7天的反转阶段，小鼠每天接受4次训练；第5天是空间探索。第一天，它们要求找到水池中位于水面上访1厘米的可视平台，用于检测APP/PS1转基因小鼠和野生型小鼠是否具有相似的活动能力和视觉。接下来三天，它们要求在每次训练中找到位于水面下1厘米的隐藏平台。逃避潜伏期是每只老鼠在四个象限找到平台并爬上去的平均时间，最多60秒。每只小鼠可以在平台停留30秒，然后从设备移入鼠笼。如果小鼠在60秒内没有找到平台，它将被手动地放到平台上，30秒后移回鼠笼。每次试验的间隔至少300秒。第5天，平台从水中移出，每只小鼠进行60秒的空间探索。最后两天，平台放在前四天的对侧象限，小鼠每天仍进行四组再训练。数据用Etho Vision自动跟踪系统记录。

1.4免疫组织化学染色

饲养在标准环境中的33周龄小鼠腹腔注射Bromodeoxyuridine(BrdU,Sigma-Aldrich；按体重50mg/kg进行注射)，每天一次连续5天。接种完之后它们继续在这种环境下饲养。处理组和对照组的小鼠第一次接种后7天深度麻醉处死检测DCX/BrdU，NeuN/BrdU是在首次免疫BrdU后28天检测。为了确保脑组织适当的固定和免疫染色，小鼠用生理盐水灌注。取脑后按照材料方法沿着正中矢状切面一切为二。

免疫组织化学法分析，左半脑后固定过夜，然后放入30％蔗糖的磷酸盐缓冲 液中平衡。我们用冰冻切片机(Leica SM2000R)收集一系列固定后的半脑的40微米厚度冠状脑切片，每片间间隔240微米，随机开始取片横跨整个齿状回，并在免疫组化之前储存在4℃。

用漂片法进行染色。切片封闭并用一抗孵育4℃过夜，然后加入二抗37℃孵育2小时。切片用PBS洗3遍并裱在载玻片上。所有试验一式三份。

免疫组化的抗体和试剂。一抗:抗Aβ42-Aβ沉积物(1:2000；英杰公司)，大鼠抗BrdU(1:400；牛津生物技术),羊抗-DCX(1:400；圣克鲁斯生物技术)，小鼠抗-NeuN(1:800；Sigma)，兔抗-Iba1(1:1000；Wako Chemicals USA).二抗:Alexa Fluor 555羊抗小鼠,Alexa Fluor 594驴抗大鼠,Alexa Fluor 488驴抗羊,Alexa Fluor 488羊抗小鼠,AlexaFluor 488羊抗兔,(1:400；全部来自英杰公司).

1.5定量图像分析

显微分析采用Zeiss LSM 710共聚焦激光显微镜用于扫描图像。

Aβ斑块和胶质细胞激活的定量图像分析，是每只小鼠6片40微米的冠状脑切片间隔240微米免疫染色评估斑块沉积和Iba-1。选择背侧海马和大脑皮层用于定量分析。切片的解剖学目的区域(海马和皮质)用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件定量，能够获取色彩分割并自动通过可编程指令操作。Aβ免疫反应染色区域用总的脑组织区域的百分数表示，胶质细胞免疫反应性的定量图像分析也用百分数表示。

神经发生(BrdU+,BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+)的定量图像分析，细胞的增殖通过使用体视学细胞计数设备(MicroBrightField,Williston,USA)计算齿状回单边的细胞数来评估。我们检测了真实的厚度，定义切片从顶部到底部的适当的区域，避免了采样过密。测量了间隔240微米的一系列40微米厚度的冠状脑切片。

因此，6张冠状脑切片的分析代表一只小鼠，实验结果是每组有8只小鼠统计得到的。

1.6统计分析

显微图像分析，我们使用了Zeiss LSM 710激光共聚焦扫描显微镜。斑块的定量通过定量图像分析。切片的平均数表示每只小鼠的斑块数量。细胞的增殖通过使用体视学细胞计数设备(MicroBrightField,Williston,USA)计算 齿状回单边的细胞数来评估。

数据采集采用双盲。所有的图片表示平均值±S.D，星号代表统计学差异。数据经双因素方差分析检验。P＜0.05被认为有意义。

2结果

2.1 5C8H5或4Aβ1-15的接种诱导血清和脑内抗Aβ抗体浓度的增加

为了验证免疫原的接种对AD小鼠模型是否有效，用ELISA检测了血清和脑内的抗Aβ抗体。

APP/PS1转基因小鼠血清中Aβ抗体在6次接种后都可以检测到。如图1所示，ELISA检测5C8H5和4Aβ1-15的处理显著增加了小鼠血清和脑内的抗Aβ抗体浓度。图1中的A折线图表示每次接种后一天采血样检测的抗Aβ抗体。第一次接种后，5C8H5处理组的Aβ抗体随后显著上升，显著高于4Aβ1-15处理组(***P<0.001)。同时，5C8H5处理组与4Aβ1-15处理组相比，Aβ抗体进入平台期需要较少的免疫次数，并且在血清内产生了更高的抗体滴度。尽管最后三次5C8H5组和4Aβ1-15组没有显著差异，被动免疫组血清中的抗Aβ抗体仍然高于主动免疫。另一方面，IgG处理组的抗Aβ抗体在每次免疫后可以检测到轻微的波动。

6次免疫结束后，饲养在标准环境下的34周龄小鼠处死取脑用于生物学分析。ELISA检测抗Aβ抗体，图1中的B散点图表示，5C8H5组脑内的抗Aβ抗体显著高于4Aβ1-15处理组，说明被动免疫使更多的抗体进入了中枢神经系统。数据用平均值±SD表示Aβ抗体(n＝8,*P<0.05)。

2.2 5C8H5改善了AD模型的转基因小鼠APP/PS1的行为学

APP/PS1转基因小鼠和C57从6月龄开始，接受了每2周一次，总共6次的免疫接种。最后一次免疫后一周，我们检测了小鼠旷场和水迷宫的行为学。

旷场行为学实验在安静的环境下进行。四组各检测60分钟。通过电脑软件观察不同的指标。通过最后一次免疫后一周的旷场实验(如图2中A-C所示)表明，接种了6次5C8H5的小鼠比IgG组的水平运动(如图2中A所示)、直立(如图2中B所示)、理毛(如图2中C所示)显著增加(*P<0.05,**P<0.01)，然而与4Aβ1-15组没有统计学差异，但是似乎表现得更好，是最接近野生型C57的一组。

旷场实验过后，我们进行了水迷宫实验(MWM)，用于评估海马依赖性的空间学习记忆能力。小鼠连续7天被训练找到平台。定位航行包括了第1-4天的采集阶段和第6-7天的反转阶段，小鼠每天训练4次；而第5天是空间探索。用小鼠在四个象限60秒内找到平台并爬上去的平均时间作为每天的逃避潜伏期，我们比较了这四组的水迷宫表现。第一天，可视平台检测，四组找到可视平台的时间没有差异，表明接种不影响小鼠的运动和视觉。第二天的采集阶段，隐藏平台检测，四组间仍然没有差异。第三天和第四天的采集阶段，野生型C57小鼠表现最好，5C8H5组和4Aβ1-15组找到平台的时间比IgG组显著减少。显然的，5C8H5组的小鼠比4Aβ1-15组在空间学习上表现出更多的改善，但没有统计学差异(P>0.05)(如图2中D所示)。在第五天的空间探索阶段，平台从迷宫中移出，5C8H5组和4Aβ1-15组在之前放置平台的目标象限的游泳时间和距离显著高于IgG组(*P<0.05,**P<0.01)(单向方差分析)。同时，4Aβ1-15组与野生型C57组仍有差异(*P<0.05)(如图2中E所示)。此外，穿平台次数也做了统计，显示出5C8H5组比IgG组有显著改善(如图2中F所示)。在第六天反转阶段，平台放置在之前位置的对侧象限，四组间没有显著差异。但是在第七天，5C8H5组比IgG组的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，与4Aβ1-15组没有统计学差异(如图2中D所示)。四组间的游泳速度没有显著差异。

2.3免疫接种动物的血清中Aβ40和Aβ42水平上升而脑内下降

每2周接种了5C8H5，4Aβ1-15或小鼠IgG共6次的APP/PS1转基因小鼠的Aβ40和Aβ42被检测(n＝8)。

如图3中A、B所示，在血清中，第一次接种过后，5C8H5组的Aβ40和Aβ42水平呈现出一个瞬间的下降过程且显著低于其他两组转基因小鼠。但随着接种次数的增加，血清中Aβ40和Aβ42显示出逐渐增加的趋势，直到在第4次接种前后进入平台期。而4Aβ1-15组的Aβ40和Aβ42显著高于5C8H5组，但没有统计学差异。与IgG组的Aβ40和Aβ42不明显的变化相比，另外两组表现出了极显著的差异性(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

同时，海马和皮质中，去垢剂处理的可溶性(如图3中D、F所示)以及5M盐酸胍提取的非可溶性的(如图3中C、E所示)Aβ40和Aβ42肽用ELISA进行检测.结果显示，与IgG组相比，5C8H5组和4Aβ1-15组的可溶性/非可溶性Aβ40和Aβ42水平有不同程度的显著性下降(如图3中C、F所示)。大部分情 况下，5C8H5组的下降比例高于4Aβ1-15组，有统计学差异(*P<0.05)。数据用平均值±SD表示Aβ40或Aβ42。

2.4在APP/PS1转基因小鼠中，5C8H5组比4Aβ1-15组诱导了更多的脑内斑块的清 除，而不引起微出血的负担

在APP/PS1小鼠右半脑的水平分析后，4％多聚甲醛后固定的左半脑切成40微米厚度的切片进行免疫组织化学分析。免疫组化和图像定量分析用于检测Aβ斑块。

通过免疫组化，对斑块负荷的作用是用每一组小鼠Aβ斑块中间值的脑切片的共聚焦显微图像来显示的，如图4所示，其中，图4中的A-C代表海马，E-G代表皮质。图4显示，相比较另外两组APP/PS1转基因小鼠，5C8H5处理组的许多大斑块和大多数散在的沉积都消失了。如图4中的D、H所示的定量图像分析的结果显示，分别与IgG处理组相比，5C8H5和4Aβ1-15分别减少了海马中66％和41％的斑块，以及皮质中61％和39％的斑块(***P<0.001)。另外，5C8H5处理组小鼠海马和皮质中的Aβ斑块沉积都显著少于4Aβ1-15组(*P<0.05)。

此外，6次免疫后的小鼠脑切片做了组织学实验，研究5C8H5在导致APP/PS1小鼠Aβ斑块减少的同时，会不会引起微出血的增加。这一结果与预期相符，这三组的显微结果显示没有微出血和其他病理变化。

Aβ斑块的减少促使我们展开另一项实验，来研究抗体处理究竟是引起了已形成的蛋白的清除，还是仅仅阻止了新的斑块的形成。9月龄的APP/PS1转基因小鼠分成两组，双周注射5C8H5，然后取脑检测Aβ斑块沉积，其中一组初次接种后3天检测，另一组35天检测。这一部分实验证实了文献中已报导的结果。结果如图5所示，其中A、B代表海马，D、E代表皮质。结果表明，一方面，经过短期处理，大斑块的数量没有明显的改变，但大多数大斑块的面积似乎有所减小；另一方面，第35天的切片显示斑块周围的弥散的蛋白和小的聚集物似乎有所减少。如图5中的C、F所示的定量图像分析结果显示，在间隔32天中，海马蛋白减少了44％，皮质蛋白减少了52％(**P<0.01,***P<0.001)。这一结果证实了抗体处理是激发了已经存在的蛋白的清除作用。

2.5被动免疫引起Aβ斑块清除，比主动免疫激活较少的小胶质细胞，而斑块相关的 胶质细胞增多

通过之前的实验，我们认识到我们制备的单克隆抗体5C8H5确实可以引起 Aβ斑块的清除。同时，根据之前的实验，Aβ清除可能与小胶质细胞的吞噬作用相关，而4Aβ1-15免疫接种后与对照组相比，清除了Aβ斑块却激活了较少的小胶质细胞。这使我们考虑到，被动免疫是否也能引起小胶质细胞的减少，免疫处理后的小鼠激活的小胶质细胞的免疫反应性与Aβ斑块的面积相比(细胞/面积)是上升还是下降？带着这些疑问，我们展开另一项实验。

用免疫组织化学的方法对四组的Aβ斑块和激活的小胶质细胞进行双标。在野生型C57小鼠中，小胶质细胞处于静息状态散布在脑切片的各个区域，而APP/PS1转基因小鼠的小胶质细胞被激活为阿米巴状态并且聚集在Aβ斑块周围，二者间似乎相互作用。与IgG处理组相比，5C8H5和4Aβ1-15小鼠脑区域中，代表小胶质细胞激活的免疫反性的Iba-1阳性细胞(颜色较亮的部位所示)在海马(如图6中A-D所示)和皮质(如图6中E-H所示)中显著减。定量图像分析图(如图6中M所示)显示出5C8H5组和4Aβ1-15的Iba-1免疫反应性减少的百分比分别为，海马中60％和27％，皮质中52％和23％。同时，5C8H5处理组脑区域中的总的小胶质细胞显著少于4Aβ1-15组(*P<0.05)。这一结果促使我们产生疑问，小胶质细胞的免疫反应性或许反应了主动免疫和被动免疫所遵循的不同途径。

为了进一步研究免疫影响的Aβ斑块相关的小胶质细胞，小胶质细胞免疫反应性(％)与Aβ斑块沉积(％)的比值也做了统计，也就是单位面积的斑块所含有的激活的小胶质细胞。为了更清晰地观察Aβ相关的小胶质细胞免疫反应性，我们呈现了63×油镜的显微图像。正如高倍共聚焦显微图像(如图6中I-L所示)所见，5C8H5组和4Aβ1-15组单位面积Aβ周围的激活的小胶质细胞似乎多于IgG组。统计结果证实了我们的预期。

随着Aβ斑块的减少，5C8H5组和4Aβ1-15组中单位面积Aβ斑块平均分布的胶质细胞显著增加(如图6中N所示)，而5C8H5的活化的小胶质细胞显著少于4Aβ1-15组(如图6中M所示)。可以概括为，在Aβ斑块不相关的区域，5C8H5组的小胶质细胞显著少于4Aβ1-15组。

2.6 5C8H5有助于APP/PS1转基因小鼠神经发生的维持

上述实验结果促使我们研究，免疫疗法在正常环境下是否有利于神经发生。

为了解决这个问题，我们用免疫组织化学的方法同时检测了接种了6次5C8H5、4Aβ1-15或mouse IgG的APP/PS1转基因小鼠和同龄的野生型成年C57 小鼠齿状回的神经发生。

6次免疫的小鼠在第1次注射BrdU后2天被处死，取脑进行免疫组织化学染色。如图7中A-E所示，我们观察到5C8H5组和4Aβ1-15齿状回颗粒下区中BrdU+染色的新增殖的细胞显著多于IgG组，而5C8H5组中的BrdU+显著多于4Aβ1-15组(***P<0.001)。

我们然后检测了Aβ抗体是否也能够影响新生神经元的分化，用BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+染色。注射了5天BrdU的小鼠(24小时一次，腹腔)在注射BrdU后第7天和第28天被处死。第7天，分析了齿状回中双标的表达早期分化的神经元(DCX+)的新生细胞(BrdU+)。发现5C8H5组和4Aβ1-15组齿状回中BrdU+/DCX+细胞显著多于IgG组，但少于野生型小鼠(***P<0.001；如图7中F-J所示)，而被动免疫比主动免疫诱导了更多的BrdU+/DCX+细胞。四组间新生神经元(BrdU+/DCX+细胞)和新增殖的细胞(BrdU+)比值似乎没有明显差异(P>0.05，t检验)。第28天，5C8H5组和4Aβ1-15组可以检测到显著多于IgG组的BrdU+/NeuN+双标细胞(***P<0.001；如图7中K-O所示)，结果与BrdU+/DCX+双标细胞类似。偶然地，免疫处理组BrdU+/NeuN+与BrdU+/DCX+的比值似乎要高于IgG组，提示我们，更少的增殖的新生神经元发生凋亡。为了定量图像分析神经发生(BrdU+,BrdU+/DCX+and BrdU+/NeuN+)，我们使用了体视学的方法(MicroBrightField,Williston,USA)对齿状回单边的细胞增殖进行计数。

3.检测结果分析

在本实验中，通过杂交瘤技术，发明人用实验室之前的4Aβ1-15免疫小鼠，生产出一种全新的单克隆抗体，筛选出最好的细胞株5C8H5并鉴定为IgG1型。结果显示，与IgG处理组相比，用5C8H5单抗接种APP/PS1转基因小鼠，导致血清和脑内抗Aβ抗体的上升，认知能力行为的改善，可溶性/不可溶性Aβ的下降，海马和皮质中Aβ沉积的下降，Aβ斑块相关的小胶质细胞激活的改变已经神经发生的增加。同时，在大多数情况下，被动免疫表现出比主动免疫更好的治疗效果。

每次免疫过后用ELISA检测血清中Aβ抗体水平，并且可以在APP/PS1转基因小鼠中检测到。与4Aβ1-15组相比，5C8H5需要较少次数的接种，使Aβ抗体达到更高滴度，在脑中类似，证实了之前的报到，也就是被动免疫不需要 潜伏期而直接作用于机体。同时，它证实了外周免疫抗Aβ抗体可以穿透血脑屏障进入中枢神经系统，认为5C8H5可以被用作更好的治疗策略。

Aβ抗体检测过后，四组动物检测了包括旷场和水迷宫的行为学。结果显示，5C8H5显著改善APP/PS1转基因小鼠的活动度，空间学习能力和记忆任务。特别是5C8H5组的小鼠比4Aβ1-15组表现出更多的提高，但没有统计学差异。可以看出，被动免疫对APP/PS1的改善作用较优于主动免疫相比。

然后发明人检测了血清和脑内的Aβ40/42研究它们的变化过程。结果显示，5C8H5组血清的Aβ40/42第一次接种后出现了一个瞬间的下降，而4Aβ1-15组和IgG组没有明显的改变。随着接下来的接种，免疫处理组的Aβ40/42继续上升直到第四次接种，然后出现下降的趋势。另一方面，海马和皮质中可溶性/不可溶性的Aβ40/42都检测到比对照组有所下降，而5C8H5比4Aβ1-15诱导了更多的Aβ减少。这些结果反应了抗Aβ抗体和Aβ蛋白的免疫反应。我们知道，清除脑内细胞外的Aβ蛋白沉积主要有三种主要途径：直接通过外源性刺激或酶促进Aβ斑块的分解和清除，诱导Aβ沉积从中枢神经系统中转运到外周，激活Fc受体介导的吞噬作用清除体内的Aβ。通过抗原或抗体的注射导致脑内Aβ下降而血清中Aβ上升，与之前的理论相一致，也就是抗体进入中枢神经系统，通过将脑内Aβ沉积转运到外周来降低其病理过程。有趣的是，初次接种5C8H5后，血清中可溶性/不可溶性的Aβ40/42呈现出瞬间的下降。这提示我们，当抗Aβ抗体通过外周注射，一部分进入中枢神经系统，而另一部仍留在血液中立即清除血清中的Aβ40/42，而主动免疫需要一个长时间的潜伏期来完成应答。

通过脑片的免疫组织化学和定量图像分析，显示出5C8H5和4Aβ1-15表现出比IgG组显著的斑块减少作用，而5C8H5的Aβ沉积明显少于4Aβ1-15组。这证明了，抗Aβ抗体的被动免疫可以充分发挥清除APP/PS1转基因小鼠Aβ沉积的作用。有报导显示，外源性抗Aβ抗体产生免疫应答不需要T的产生，而主动免疫会引起T细胞的增殖，与一些严重的副作用相关，并且在Aβ斑块的清除中并不是必需的。这些结果证实了被动免疫是比主动免疫更加安全的清除Aβ斑块的方法。

组织切片结果显示，这种全新的单克隆抗体5C8H5在引起APP/PS1小鼠Aβ斑块清除的同时，没有诱发微出血的增加或其他一些病理变化。第一代AD免疫 药物在临床被终止，因为6％的受试患者出现了脑膜脑炎。如今，一些文献报导，痴呆病人脑MRI显示出小圆点样的损伤，被认为是微出血。副作用成为治疗AD的重要问题。被动免疫的小鼠显微观察到脑切片没有病理学和形态学的变化，表明5C8H5处理的APP/PS1小鼠在减少Aβ沉积的同时，没有引起微出血的增加。

Aβ斑块的减少促使我们展开另一项试验，研究抗体处理究竟是引起已经存在的蛋白的清除，还是仅仅阻止新斑块的形成。我们检测了9月龄的APP/PS1转基因小鼠经过5C8H5处理3天和35天的脑中蛋白沉积。结果显示，大斑块的数量没有明显变化，而35天的脑片中斑块周围的散在的蛋白和小的聚集物似乎有所减少。这验证了抗体免疫刺激了已经存在的蛋白的清除，并且可能通过将大斑块溶解成小聚集物然后清除的途径。

通过免疫组织化学，Aβ斑块和激活的小胶质细胞双标的共聚焦显微图像显示，在野生型C57小鼠脑中，小胶质细胞处于静息状态，散布于整个脑区域，而在APP/PS1转基因小鼠中，小胶质细胞似乎被激活成阿米巴状并围绕在Aβ斑块周围，形成内含Aβ的吞噬囊泡。结果显示，与IgG组相比，5C8H5组和4Aβ1-15组的激活的小胶质细胞显著减少，而单位面积Aβ斑块中所含的激活的小胶质细胞的比例(细胞/斑块)有所增加。随着更多的Aβ斑块的清除和Aβ沉积相关的胶质细胞激活，它揭示了Aβ的清除可能通过小胶质细胞与Aβ斑块之间相互作用，而不仅仅是影响小胶质细胞的数量。

更进一步，在本实验中，主动免疫与被动免疫之间Aβ斑块相关的小胶质细胞的激活没有统计学差异，但5C8H5组总的小胶质细胞数显著少于4Aβ1-15组。可以概括为，在与Aβ不相关的区域中，5C8H5组比4Aβ1-15组含有显著较少的小胶质细胞。我们猜测，当机体接受到外源性抗原的刺激，T细胞激活，一些促炎因子和激素被释放，包括小胶质细胞被大量持续地激活。另一方面，我们知道，小胶质细胞是脑内的宿主巨噬细胞，作为中枢神经系统中主动免疫防御的第一道和最重要的防线。在正常环境下，小胶质细胞不断地清除中枢神经系统中的斑块、有害神经元和传染剂，它也可以识别非己，吞噬异物，呈递抗原T细胞。但是当小胶质细胞持续激活并失去控制，大量的炎症因子如TNF-α、IL-1和氧化应激产物将会被释放并伴随T细胞的产生，对正常机体有害并加重神经损伤。与主动免疫激活大量的小胶质细胞相比，被动免疫处理的小鼠Aβ斑 块可以被周围的小胶质细胞及时清除，并且在非Aβ斑块区域被控制住正常生理水平，避免了炎症因子和T细胞被进一步过度激活，被认为是比主动免疫更安全有效的治疗方法。

神经发生的结果显示，免疫处理组的齿状回颗粒下区BrdU+细胞显著多于IgG组，认为有更多的新生细胞(BrdU+)被标记。此外，5C8H5组诱导了比4Aβ1-15组更多的神经发生，是最接近正常组的。同时，分化成早期神经元的新增殖细胞(BrdU+/DCX+)和分化成成熟神经元的新增殖细胞(BrdU+/NeuN+)也有类似的结果。偶然发现，免疫处理组的BrdU+/NeuN+与BrdU+/DCX+的比值似乎高于IgG组，认为有较少的新生神经元发生凋亡。这些结果证明，齿状回的细胞增殖可能是由于免疫治疗引起的Aβ清除。进一步来说，抗Aβ抗体诱导海马神经发生不是短暂的。在所有检测的时间点，5C8H5诱导了比4Aβ1-15更多的新生神经元数目。由于行为学的改变是由包括神经发生在内的多因素引起，所以被动免疫相对于主动免疫神经发生显著增多，改善了行为学却没有统计学上的差异。

综合看来，发明人的研究表明，通过免疫治疗的手段，有效诱导了激活的小胶质细胞吞噬清除Aβ沉积，改变了微环境，进一步促使新增殖细胞向神经元分化，有利于行为学的改善。在相同的免疫程序下，5C8H5接种的被动免疫比4Aβ1-15接种的主动免疫表现出了更好更安全的疗效，突出了持续接种特异性抗体可能成为治疗AD的更好的方法，而小胶质细胞的激活被控制在一个机体适合的范围可能成为治疗的关键。

实验揭示了，在阿尔茨海默病的免疫治疗中，由本实验室生产的一种全新的单克隆抗体5C8H5，有望成为比其同源的抗原免疫更有前景的免疫治疗方法。

Claims (10)

1.一种4Aβ1-15衍生的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号为CCTCCC2014173的杂交瘤细胞株产生。

2.如权利要求1所述的4Aβ1-15衍生的单克隆抗体，其特征在于：由以下方法制备获得：

在小鼠体内接种杂交瘤细胞株CCTCC C2014173，生产腹水抗体，取出腹水进行纯化，获得所述4Aβ1-15衍生的单克隆抗体；或者

体外培养杂交瘤细胞株CCTCC C2014173，分离纯化培养液，获得所述4Aβ1-15衍生的单克隆抗体。

3.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：以保藏号CCTCC C2014173保藏于中国典型培养物保藏中心。

4.如权利要求3所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，由以下方法制备获得：

1)4Aβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠；

2)取所述BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞，按细胞数量5:1～10:1混合，然后在聚乙二醇作用下进行融合；

3)融合后进行HAT培养，第7天时用HT完全培养基换出HAT完全培养基，继续培养；

4)待上清颜色变黄时，吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞；

5)用有限稀释法克隆至能稳定高效分泌4Aβ1-15单克隆抗体的细胞株，即获得所述杂交瘤细胞株。

5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述4Aβ1-15蛋白免疫BALB/C小鼠的步骤为：

1)用弗氏完全佐剂乳化抗原进行第一次免疫，免疫剂量为50μg/只；

2)与第一次免疫间隔两周后，以弗氏不完全佐剂乳化抗原，进行第二次免疫，免疫剂量为50μg/只；

3)与第二次免疫间隔两周后，以弗氏不完全佐剂乳化抗原，进行第三次免疫，免疫剂量为50μg/只；

4)与第三次免疫间隔两周后，用ELISA法测抗体效价，取抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，免疫剂量为100μg/只。

6.一种组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

7.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的单克隆抗体和能够产生可检测信号的标记物。

8.如权利要求1所述的4Aβ1-15衍生的单克隆抗体在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于：所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。

10.如权利要求6所述的组合物在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。