CN111000985A - 一种降低ad患者脑内淀粉沉积斑块的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降低AD患者脑内淀粉沉积斑块的药物。本发明提供了一种治疗阿尔兹海默症的多肽类药物，所述药物包括VGF蛋白的C端多肽片段TLQP‑21和医学上可用的载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明开发的多肽TLQP‑21具有降低阿尔兹海默症患者脑内的蛋白沉积斑块，增加小胶质细胞吞噬和迁移能力，提高神经元的功能，改善患者的病理发展进程。为治疗阿尔兹海默症提供一种新药。

Description

一种降低AD患者脑内淀粉沉积斑块的药物

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种降低AD患者脑内淀粉沉积斑块的药物。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease，AD)是一种早期难以察觉的神经退行性疾病，具有起病隐匿的特点，病理特征呈现进行性的神经细胞功能衰退，包括大脑内局部尤其是海马和皮层神经元缠结，和细胞外老年斑块沉积。临床上记忆障碍、失语、失用、失认、视空间记忆损害、以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。为了提高AD患者自身的生活质量，以及减轻家庭和社会的负担。本项目的主要目的是降低AD患者脑内已经沉积的老年斑块，提高海马区神经元的活性，以达到改善患者空间、视觉记忆的紊乱，延缓患者的病情发展进程。

神经生长因子诱导蛋白(VGF)在细胞内转录翻译成活性多肽以后，参与许多疾病的发生发展，包括抑郁、肥胖、记忆以及神经的退行性疾病，尤其是阿尔兹海默症(AD)，在AD患者的脑脊液中，发现VGF的含量急剧减少。其现象表明，VGF可能是AD疾病发生发展的潜在原因。最近研究发现AD患者脑内减少VGF水平与平均淀粉斑块密度呈现负相关趋势，即脑脊液中VGF减少的患者检查出脑内淀粉斑块沉积的更多。

发明内容

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种治疗阿尔兹海默症的多肽类药物，所述药物包括VGF蛋白的C端多肽片段TLQP-21和医学上可用的载体。

TLQP-21是VGF的C端的一个活性片段，该片段在中枢和周围神经中发挥重要作用，如调节进食、昼夜行为、体重、神经性疼痛等作用。大脑中小胶质细胞常作为先天免疫细胞，在脑内吞噬受损细胞，或异常物质。基于小胶质细胞这样的特异功能下，发现在治疗AD的病理生理发展中，TLQP-21的主要作用是激活大脑中小胶质细胞的C3AR1受体，从而激活原发性小胶质细胞的吞噬功能。

小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20％。小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿尔兹海默症等。

综上，本发明通过小胶质细胞验证TLQP-21对阿尔兹海默症的治疗效果。本发明验证了鼠源和人源的TLQP-21，经试验验证二者均有提高小胶质细胞迁移和吞噬活性，TLQP-21能提高Trim47、Dusp18、Lmna、Furin、Arl13b和Mtmr10这些与细胞运动和迁移相关的基因的表达，进一步证明TLQP-21可以促进小胶质细胞的迁移能力。

在上述实验中本发明设计了具体的TLQP-21氨基酸序列(该序列属于已被公开)，具体如下：

(1)鼠源TLQP-21(mTLQP-21)：

氨基酸序列：TLQPPASSRRRHFHHALPPAR

(2)人源TLQP-21(hTLQP-21)：

氨基酸序列：TLQPPSALRRRHYHHALPPSR

本发明的有益效果：本发明开发的多肽TLQP-21具有降低阿尔兹海默症患者脑内的蛋白沉积斑块，增加小胶质细胞吞噬和迁移能力，提高神经元的功能，改善患者的病理发展进程。为治疗阿尔兹海默症提供一种新药。

附图说明

图1为TLQP-21提高鼠原代培养小胶质细胞吞噬能力示意图。从图中可以看出，与对照组和mTLQP-R21A(TLQP-21突变)组相比，mTLQP-21(1μM)与C3aSA(1μM)的小胶质细胞吞噬荧光微型球珠(图1a)和小胶质细胞吞噬荧光Aβ(图1b)的含量更高，其中mTLQP-21(1μM)吞噬微球和Aβ的含量最高，说明mTLQP-21对提高小胶质细胞吞噬作用强于C3aSA。

图2为对照组、mTLQP-R21A组、mTLQP-21(1μM)组和C3aSA(1μM)组处理后的BV2小鼠小胶质细胞迁移能力示意图。从图中可以看出6h后mTLQP-21(1μM)组小鼠小胶质细胞明显迁移。

图3为mTLQP-21的AD转基因小鼠中脑组织染色图，从图(a)中可以看出，相较于5xFAD对照组(侧脑室注射aCSF人工脑脊液)，接受mTLQP-21给药的5xFAD小鼠(侧脑室注射mTLQP-21，15μg/天，连续给药28天)染色拍片可观察到脑皮质区(即：脑皮层)、海马CA1、海马齿状回区淀粉斑块(6E10阳性染色)和淀粉斑块周围发育不正常的轴突(LAMP1阳性染色)显著减少；(b)为对染色结果的量化表。

图4为人源hTLQP-21提高小胶质细胞迁移和吞噬能力示意图，从图(a)中可以看出，人源小胶质细胞处理hTLQP-21(1μM)后产生与C3aR1激动剂C3aSA(1μM)相同的基因激活效果，可观察到Trim47、Dusp18、Arl13b、Lmna、Furin和Mtmr10等基因的表达有显注增加；从图(b)中可以看出hTLQP-21激活后的人源小胶质细胞吞噬萤光微珠的能力显著增加。

图5为Y迷宫实验测试小鼠工作记忆结果示意图，从图中可以看出，相较于5xFAD对照组(侧脑室注射aCSF人工脑脊液)，接受mTLQP-21给药的5xFAD小鼠(侧脑室注射mTLQP-21，15μg/天，连续给药28天)在Y迷宫测试中可观察到工作记忆水平的明显改善现象。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

1、药效学实验

为验证TLQP-21在治疗阿尔兹海默症为病理生理基础的疾病的药理作用，为其临床应用提供科学依据，特进行如下药效学实验。本实验采用C57BL/6小鼠和5×FAD转基因小鼠作为在体模型；采用小鼠BV2小胶质细胞系、野生型原代小胶质细胞、人HMC3小胶质细胞系作为体外细胞模型，实验过程中检测TLQP-21用药的相关指标。

1.1动物实验

1.1.1实验对象

小鼠模型：小鼠模型，C57BL/6J小鼠，5xFAD小鼠由Jacksonlaboratory提供。

1.1.2实验条件

清洁级动物房，温度为(22-25℃)，相对湿度40％～60％，12/12h明暗周期，自由进食饮水。实验过程中对动物的饲养及取材均遵守实验动物管理与保护的有关规定。

1.1.3主要实验仪器设备

Olympus BX61荧光显微镜；RWD脑立体定位仪；LEICACM1950冰冻切片机；CFX96touch实时荧光定量PCR仪；电子天平BP12lS型；瑞沃德-77001双目体视显微镜；Centrifuge-5424R台式低速自动平衡离心机；Thermo可调式移液器；EclipseNi-U正置荧光显微镜；OribitalShakerTS-1000移动脱色摇床；HWS-12型电热恒温水浴锅。

1.1.4受试药品

实验实施的药品为鼠源mTLQP-21和人源hTLQP-21(mTLQP-21，hTLQP-21均购自Genscript公司)，其具体信息如下：

(1)鼠源TLQP-21(mTLQP-21)：

氨基酸序列：(N-terminal)-TLQPPASSRRRHFHHALPPAR-(C-terminal)

(2)人源TLQP-21(hTLQP-21)：

氨基酸序列：(N-terminal)-TLQPPSALRRRHYHHALPPSR-(C-terminal)

1.2实验方法

1.2.1细胞模型的建立

鼠小胶质细胞系BV2是由小鼠小胶质细胞与逆转录病毒感染得到，并保持在37℃和5％CO₂条件下培养。鼠原代培养小胶质细胞是直接从刚出生一天的野生型C57BL/6J小鼠的大脑皮层中分离得到，并保持在37℃和5％CO₂条件下培养。人源HMC3小胶质细胞购自ATCC(CRL-3304,批号：70016372)。

1.2.2实验试剂

鼠源和人源VGF多肽(mTLQP-21，hTLQP-21购自Genscript公司)

(1)鼠源TLQP-21(mTLQP-21)：

氨基酸序列：(N-terminal)-TLQPPASSRRRHFHHALPPAR-(C-terminal)

(2)人源TLQP-21(hTLQP-21)：

氨基酸序列：(N-terminal)-TLQPPSALRRRHYHHALPPSR-(C-terminal)

1.2.3细胞实验分组及给药方法

(1)测定的小胶质细胞迁移和吞噬活性

TLQP-21是具有生物活性的C端VGF衍生的神经肽，小胶质细胞膜受体C3AR1是TLQP-21的靶受体。我们先以BV2细胞株筛选出了对小胶质细胞迁移以及吞噬能力影响最佳的用药浓度(1μM)后，拟定采用体外细胞实验来检测TLQP-21的药效研究。在鼠原代培养小胶质细胞含量高达97％的细胞培养实验中发现，与未用药组相比，mTLQP-21用药的小胶质细胞吞噬荧光微型球珠的功能明显增加，达到与受体C3AR1激动剂C3aSA用药相同的效果，mTLQP-21的变异序列TLQP-R21A则不产生任何效果(图1a)。我们在培养物中加入荧光标记人工合成的Aβ蛋白，发现给与mTLQP-21用药的小胶质细胞与未用药组相比，吞噬荧光Aβ含量明显增加(图1b)。

(2)检测TLQP-21诱导细胞运动和迁移的相关基因的表达

由于TLQP-21有诱导细胞内分子基因表达的作用，在鼠原代培养小胶质细胞中给与mTLQP-21用药，对比未给药的鼠原代培养小胶质细胞基因转录图谱后，发现mTLQP-21可以显著提高6种对运动和迁移有关的基因的差异表达，该基因分别是Trim47、Dusp18、Lmna、Furin、Arl13b和Mtmr10(表1)。进一步实验也确认了mTLQP-21的给药可以促进小胶质细胞的迁移能力(图2)。

表1：WT+TLQP 21 vs WT

1.2.4动物在体实验

(1)为评估mTLQP-21在小鼠脑内对沉积的淀粉样斑块的作用疗效，我们选用3月龄雄性的5xFAD转基因AD小鼠。这些转基因的AD小鼠比起正常同龄小鼠的背侧海马区的VGF蛋白水平明显降低。我们将mTLQP-21持续28天注射入5xFAD转基因AD小鼠脑后，对受药物治疗的小鼠大脑研究，发现给予mTLQP-21的AD转基因小鼠的脑皮质区(即：脑皮层)、海马CA1、海马齿状回区可观察到淀粉斑块下降50％。给予mTLQP-21的AD转基因小鼠，脑皮质区淀粉斑块周围发育不正常的轴突(LAMP1阳性染色)显著减少50％(图3)。

(2)为了评估hTLQP-21是否同样对人的小胶质细胞有相同的活化效果，在人源HMC3小胶质细胞中给与hTLQP-21用药，与未给药的人源小胶质细胞，对比前述mTLQP-21促进鼠原代培养小胶质细胞6种对运动和迁移有关的基因表达，发现促进小胶质细胞运动的基因Trim47、Dusp18、Arl13b显著增加约50％，Lmna、Furin和Mtmr10基因也有显著增加(图4a)，hTLQP-21处理后的人源小胶质细胞，也可观察到细胞的吞噬能力显著增加(图4b)，表明hTLQP-21同样对人源的小胶质细胞活化有效。因此，我们的结果显示hTLQP-21可作为适合的候选药物来有效清除人类阿尔兹海默症脑内的淀粉斑块沉积。

1.2.5小鼠空间记忆测试

用Y迷宫实验对AD转基因小鼠进行记忆测试，发现mTLQP-21连续给药28天的AD小鼠比起未用药的AD小鼠，工作记忆有明显改善(图5)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种降低AD患者脑内淀粉沉积斑块的药物

<130> 12.20

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 合成

<400> 1

Thr Leu Gln Pro Pro Ala Ser Ser Arg Arg Arg His Phe His His Ala

1 5 10 15

Leu Pro Pro Ala Arg

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 合成

<400> 2

Thr Leu Gln Pro Pro Ser Ala Leu Arg Arg Arg His Tyr His His Ala

1 5 10 15

Leu Pro Pro Ser Arg

20

Claims (8)

1.一种治疗阿尔兹海默症的多肽类药物，其特征在于，所述药物包括VGF蛋白的C端多肽片段TLQP-21和医学上可用的载体。

2.如权利要求1所述的治疗阿尔兹海默症的多肽类药物，其特征在于，所述多肽片段TLQP-21的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

3.一种VGF蛋白的C端多肽片段TLQP-21，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求3所述的多肽在制备提高小胶质细胞迁移和吞噬能力的制剂或药物中的应用。

5.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高小胶质细胞迁移和吞噬能力具体为提高与迁移和运动相关基因的表达。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述小胶质细胞与迁移和运动相关基因为Trim47、Dusp18、Arl13b、Lmna、Furin或/和Mtmr10。

7.如权利要求3所述的多肽在制备降低阿尔兹海默症患者脑内淀粉样块斑块的制剂或药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述阿尔兹海默症患者脑内为脑皮质区、海马CA1区、海马齿状回区。

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