BR112020016435A2 - Marcadores de doença de farber e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

trata-se de marcadores de fenótipo imunológico para doença de faber e usos dos mesmos, assim como métodos para diagnosticar e tratar a doença de faber com base nesses marcadores.

Description

“MARCADORES DE DOENÇA DE FARBER E USOS DOS MESMOS” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a métodos e biomarcadores para determinar se um indivíduo tem doença de Farber.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A doença de Farber (deficiência de ceramidase ácida, lipogranulomatose) é um distúrbio raro de armazenamento lisossomal causado por mutações no gene da ceramidase ácida lisossomal (ASAH1). A ceramidase ácida é responsável pela degradação da ceramida em esfingosina e em ácido graxo, e uma deficiência na atividade da ceramidase ácida causa o acúmulo de ceramida.

[0003] Os leucócitos exercem uma função na patogênese da doença de Farber. A infiltração de tecido com histiócitos espumosos (macrófagos carregados de lipídios e populações derivadas de monócitos), em conjunto com a inflamação, promove a formação de granulomas característicos da doença. Tanto granulomas quanto um estado inflamatório crônico induzido pela ceramida causam provavelmente danos aos tecidos, em que os tecidos conjuntivos e articulações, pulmões, fígado, sistema nervoso central e órgãos linfoides secundários são os mais afetados. No entanto, a caracterização do desenvolvimento e a ativação de células imunológicas que causam doença de Farber não foi totalmente desenvolvida.

[0004] Demonstrou-se que o tratamento de um modelo murino progressivo knock-in Asah1P361R/P361R da doença de Farber com ceramidase ácida humana recombinante rhAC reduz as ceramidas e a inflamação dos tecidos. As revelações no Pedido Internacional nº PCT/US18/13509, depositado em 12 de janeiro de 2018 e em He et al., “Enzyme replacement therapy for Farber disease: Proof-of-concept studies in cells and mice”, BBA Clin. 13 de fevereiro de 2017; 7: 85 a 96, são incorporadas a título de referência em sua totalidade.

[0005] No entanto, ainda há uma necessidade de aprimorar o diagnóstico e o tratamento da doença de Farber. A avaliação histológica convencional da biópsia tecidual para confirmar a doença de Farber é dispendiosa, invasiva e pode causar dor, hemorragia ou, até mesmo, morte. Um teste simples que use marcadores de fenótipo imunológico da doença de Farber, por exemplo, para diagnosticar a doença de Farber e/ou determinar a eficácia do tratamento da doença de Farber, é altamente desejável. A presente matéria atende a outras necessidades e será discutida no presente documento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] De acordo com a descrição, algumas modalidades se referem a um método para determinar se um indivíduo tem doença de Farber, sendo que o método compreende uma detecção do nível de pelo menos um marcador selecionado a partir de CD11b +Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII- CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ em uma amostra biológica de um indivíduo, em que, caso o nível de CD11b +Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII- CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+ seja superior a um controle, o indivíduo tem doença de Farber; e caso o nível de CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ seja inferior a um controle, o indivíduo tem doença de Farber.

[0007] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o do nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ superior ao nível de controle indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0008] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de MHCII-CD11bhi CD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII-CD11bhi CD86+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0009] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de CD11b+CD38+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+CD38+, que é superior ao nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0010] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de CD11b +CD206+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+CD206+, que é inferior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0011] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de CD11b+Ly6G+ em uma amostra do indivíduo, sendo que um nível de CD11b+Ly6G+, que é superior ao nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0012] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de CD19 +CD38+ em uma amostra do indivíduo, sendo que o um nível de CD19+CD38+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0013] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente detectar o nível de CD19 - CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19-CD3+, que é inferior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0014] Em algumas modalidades, a detecção é realizada detectando-se os níveis de MHCII+CD11b-Ly6C+ e de MHCII- CD11bhiCD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ e/ou MHCII-CD11bhiCD86+ que é superior a um nível de controle indica que o indivíduo tem doença de Farber. Em algumas modalidades, a detecção é realizada detectando-se o nível de CD19+CD38+ em um do indivíduo e detectando-se adicionalmente um nível de CD19-CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19+CD38+ que é superior a um nível de controle e/ou um nível de CD19 -CD3+ inferior a um nível de controle, e a detecção combinada indica que o indivíduo tem doença de Faber. Em outras modalidades, a detecção é realizada detectando-se os níveis de pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez marcadores, selecionados a partir de

CD11b+Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII- CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ para determinar se um indivíduo tem doença Farber.

[0015] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de extrato tecidual ou uma amostra de sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtida do fígado, baço, pulmão ou sangue.

[0016] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica útil no tratamento de doença de Faber. Em algumas modalidades, a composição compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC). Em algumas modalidades, a rhAC é administrada em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.

[0017] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma ceramidase ácida recombinante humana em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, a ceramidase ácida recombinante humana é RVT-801.

[0018] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma ceramidase ácida recombinante humana em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, a ceramidase ácida recombinante humana é RVT-801.

[0019] Outra modalidade é um kit para executar qualquer um dos métodos detalhados acima, junto de instruções para uso no diagnóstico da doença de Farber.

[0020] Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente ao marcador CD11b+Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII- CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ ou CD19-CD3+.

[0021] Outra modalidade é um método para tratar doença de Farber, sendo que o método compreende: detectar um nível de pelo menos um marcador selecionado a partir de CD11b+Ly6G+, SSC midFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ em uma amostra de um indivíduo, em que caso o nível de CD11b +Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+ seja superior a um controle, o indivíduo tem doenças de Farber; e caso o nível de CD11b +CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ seja inferior a um controle, o indivíduo tem doença de Farber; e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica útil no tratamento da doença de Farber.

[0022] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende rhAC em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.

[0023] Objetos e vantagens adicionais serão apresentados em parte na descrição a seguir e, em parte, ficarão óbvios a partir da descrição ou podem ser aprendidos na prática. Os objetos e vantagens serão alcançados e alcançados por meio dos elementos e combinações particularmente apontados nas reivindicações anexas.

[0024] Deve ser entendido que tanto a descrição geral acima quanto a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas e não limitam as reivindicações.

[0025] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte do presente relatório descritivo, ilustram uma modalidade (ou diversas modalidades) e junto da descrição, servem para explicar os princípios descritos no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura 1 mostra um ensaio de citometria de fluxo que identifica subpopulações de leucócitos (contornos pretos que mostram a distribuição de linfócitos, monócitos e granulócitos) no baço de camundongos Farber marcados com live/dead zombie red, conforme descrito no Exemplo 1.

[0027] As Figuras 2A e 2B mostram ensaios de citometria de fluxo para extrato de baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem marcados com live/dead zombie red, conforme descrito no Exemplo 1 (contorno preto, células vivas).

[0028] As Figuras 3A e 3B mostram ensaios de citometria de fluxo para extrato de pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem marcados com live/dead zombie red, conforme descrito no Exemplo 1 (contorno preto, células vivas).

[0029] As Figuras 4A e 4B mostram ensaios de citometria de fluxo para extrato de fígado de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem marcados com live/dead zombie red, conforme descrito no Exemplo 1 (contorno preto, células vivas).

[0030] As Figuras 5A e 5B mostram ensaios de citometria de fluxo para sangue de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem marcados com live/dead zombie red, conforme descrito no Exemplo 1 (contorno preto, células vivas).

[0031] As Figuras 6A e 6B mostram ensaios de citometria de fluxo para baço e sangue, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1. As suspensões celulares foram primeiramente demarcadas (gated) com base na expressão de CD45 (marcador comum de leucócitos) (contornos pretos) e, posteriormente, demarcadas para parâmetros físicos, incluindo dispersão direta (FSC), uma medida de tamanho e dispersão lateral (SSC), uma medida de granularidade celular, para selecionar monócitos (SSC mid/FSCmid). A Figura 6A mostra ensaios de citometria de fluxo para o baço. A Figura 6B mostra ensaios de citometria de fluxo para sangue.

[0032] As Figuras 7A e 7B mostram a frequência de leucócitos (células CD45 +) e monócitos (células SSCmidFSCmid) no baço e no sangue, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem com a mesma idade obtidos do fluxo de ensaios de citometria das Figuras 7A e 7B. A Figura 7A mostra a frequência de leucócitos (células CD45 +) e monócitos (células SSCmidFSCmid) no baço. A Figura 7B mostra a frequência de leucócitos (células CD45+) e monócitos (células SSCmidFSCmid) no sangue. As setas indicam as alterações das populações de monócitos em camundongos Farber.

[0033] As Figuras 8A e 8B mostram ensaios de citometria de fluxo para pulmão e baço, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1. As suspensões celulares foram bloqueadas com base na expressão de CD11b (marcador de linhagem de monócitos/granulócitos) e MHCII (complexo principal de histocompatibilidade classe II; molécula de apresentação de antígeno) para identificar subconjuntos de macrófagos e células dendríticas (DCs): MHCII-CD11b-, MHCII+CD11b-, MHCII+CD11bmid, MHCII-CD11bmid e MHCII-CD11bhi. A Figura 8A mostra ensaios de citometria de fluxo para pulmão. A Figura 8B mostra ensaios de citometria de fluxo para o baço.

[0034] As Figuras 9A e 9B mostram a quantificação da frequência de subconjuntos de macrófagos e células dendríticas (DCs) no pulmão e baço, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem: MHCII-CD11b-, MHCII+CD11b-, MHCII+CD11bmid, MHCII-CD11bmid e MHCII-CD11bhi dos ensaios de citometria de fluxo, conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B. A Figura 9A mostra a quantificação da frequência de subconjuntos de macrófagos e células dendríticas (DCs) no pulmão. A Figura 9B mostra a quantificação da frequência de subconjuntos de macrófagos e células dendríticas (DCs) no baço.

[0035] As Figuras 10A e 10B mostram ensaios de citometria de fluxo para fígado e sangue, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1. As suspensões celulares foram bloqueadas com base na expressão de CD11b (marcador de linhagem de monócitos/granulócitos) e MHCII (complexo principal de histocompatibilidade classe II; molécula de apresentação de antígeno) para identificar subconjuntos de macrófagos e células dendríticas (DCs): MHCII-CD11b-, MHCII+CD11b-, MHCII+CD11bmid, MHCII-CD11bmid e MHCII-CD11bhi. A Figura 10A mostra ensaios de citometria de fluxo para o fígado. A Figura 10B mostra ensaios de citometria de fluxo para sangue.

[0036] A Figura 11 mostra uma comparação da população MHCII-CD11bhi (monócitos ativados) entre pulmão, baço, fígado e sangue dos ensaios de citometria de fluxo, conforme mostrado nas Figuras 8A, 8B, 10A e 10B. As setas indicam um aumento da população de monócitos no pulmão entre os camundongos Farber e do tipo selvagem.

[0037] As Figuras 12A e 12B mostram MHCII+CD11b- população conforme identificada nos ensaios de citometria de fluxo das Figuras 8A e 8B, ainda com base na expressão de Ly6C, para identificar subpopulações de MHCII+CD11b-Ly6C+ (macrófagos pró- inflamatórios e DCs) e MHCII+CD11b-Ly6C, respectivamente. A Figura 12A mostra população de MHCII+CD11b- no pulmão. A Figura 12B mostra a população de MHCII+CD11b- no baço.

[0038] As Figuras 13A e 13B mostram a comparação das células MHCII+CD11b-Ly6C+ (macrófagos pró-inflamatórios e DCs), conforme identificado nas Figuras 12A e 12B, do pulmão e sangue, respectivamente, de camundongos e irmãos de ninhada do tipo selvagem com

4 e 8 semanas de idade. A Figura 13A mostra a comparação das células MHCII+CD11b-Ly6C+ no pulmão. A Figura 13B mostra a comparação das células MHCII+CD11b-Ly6C+ no sangue.

[0039] As Figuras 14A a 14B mostram distribuições e comparações de níveis de expressão de marcadores de células MHCII -CD11b+ dos ensaios de citometria de fluxo das Figuras 8A e 8B. A Figura 14A mostra distribuições dos níveis de expressão dos marcadores das células MHCII - CD11b+ dos ensaios de citometria de fluxo das Figuras 8A e 8B, com base nos níveis de expressão dos marcadores CD23, CD68 e CD86 (macrófagos ativados), em amostras do pulmão de camundongos Farber e irmãos de ninhada do tipo selvagem com de 4 e 8 semanas de idade. A Figura 14B mostra comparações dos níveis de expressão de marcadores, conforme representado pela intensidade média de fluorescência (MFI), para CD23, CD68 e CD86 (macrófagos ativados) obtidos a partir das medições, conforme mostrado na Figura 14A.

[0040] As Figuras 15A a 15B mostram a comparação da contagem total e da frequência de células CD11b +CD38+ (macrófagos pró- inflamatórios e DCs) por 100.000 células sanguíneas de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem. A Figura 15A mostra a comparação da contagem total de células CD11b +CD38+ (macrófagos pró-inflamatórios e DCs) por 100.000 células sanguíneas de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem. A Figura 15B mostra a frequência de células CD45b+CD206+ no pulmão (painel esquerdo) e a frequência de CD11b+CD206+ no sangue (painel direito) de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem.

[0041] A Figura 16 mostra células CD45 + demarcadas (leucócitos) do Exemplo 1, com CD11b + e/ou Ly6G+/- para identificar neutrófilos (CD11b+Ly6G+) e não neutrófilos (CD11b+Ly6G-), do pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem.

[0042] A Figura 17 mostra células CD45 + demarcadas (leucócitos) do Exemplo 1, com CD11b + e/ou Ly6G+/- para identificar neutrófilos (CD11b+Ly6G+) e não neutrófilos (CD11b+Ly6G-), do baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem.

[0043] A Figura 18 mostra células CD45 + demarcadas (leucócitos) do Exemplo 1, com CD11b + e/ou Ly6G+/- para identificar neutrófilos (CD11b+Ly6G+) e não neutrófilos (CD11b+Ly6G-), do fígado de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem.

[0044] A Figura 19 mostra células CD45 + demarcadas (leucócitos) do Exemplo 1, com CD11b + e/ou Ly6G+/- para identificar neutrófilos (CD11b+Ly6G+) e não neutrófilos (CD11b+Ly6G-), do sangue de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem.

[0045] As Figuras 20A a 20D comparam a frequência de neutrófilos (CD11b+Ly6G+) identificados conforme nas Figuras 16 a 19, no pulmão, baço, fígado e sangue, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, de acordo com Exemplo 1. A Figura 20A compara a frequência de neutrófilos (CD11b +Ly6G +) identificados conforme nas Figuras 16 a 19, no pulmão. A Figura 20B compara a frequência de neutrófilos (CD11b+Ly6G+) identificados conforme nas Figuras 16 a 19, no baço. A Figura 20c compara a frequência de neutrófilos (CD11b+Ly6G+) identificados conforme nas Figuras 16 a 19, no fígado. A Figura 20D compara a frequência de neutrófilos (CD11b +Ly6G+) identificados conforme nas Figuras 16 a 19, no sangue.

[0046] A Figura 21 mostra células CD19- (células não B) demarcadas adicionalmente para selecionar células T como duplamente positivas para CD45 e CD3 (contornos pretos), no baço de camundongos

Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1.

[0047] A Figura 22 mostra células CD19- (células não B) demarcadas adicionalmente para selecionar células T como duplamente positivas para CD45 e CD3 (contornos pretos), no pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1.

[0048] A Figura 23 mostra células CD19- (células não B) demarcadas adicionalmente para selecionar células T como duplamente positivas para CD45 e CD3 (contornos pretos), no sangue de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1.

[0049] A Figura 24 compara a frequência da população de células T (CD19-CD3+) identificada, conforme nas Figuras 21 a 23, no baço, pulmão e sangue, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem. A Figura 24A relata a frequência da população de células T (CD19-CD3+) no baço. A Figura 24B mostra a frequência da população de células T (CD19 -CD3+) no pulmão. A Figura 24A mostra a frequência da população de células T (CD19 -CD3+) no sangue.

[0050] A Figura 25 mostra células CD45+, demarcadas adicionalmente com base na expressão de CD19 (marcador de células pan-B) (contornos pretos), do baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1.

[0051] A Figura 26 mostra células CD45+CD19+ (células B), demarcadas adicionalmente com base na expressão de CD38 (linfócitos ativados, marcador de jato de plasma), do baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e camundongos do tipo selvagem, de acordo com o Exemplo 1.

[0052] As Figuras 27A a 27B comparam a frequência de células B e células B ativadas, respectivamente, no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem de acordo com o Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo nas Figuras 25 e 26, respectivamente. A Figura 27A compara a frequência de células B (CD45+CD19+) no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem de acordo com o Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo na Figura 25. A Figura 27B compara a frequência de células B ativadas ou jatos de plasma (CD19 +CD38+) no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem de acordo com o Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo na Figura 26.

[0053] A Figura 28 mostra células CD45+CD19+ (células B), demarcadas adicionalmente com base na expressão de CD38 (linfócitos ativados, marcador de jato de plasma), do sangue de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, de acordo com o Exemplo 1.

[0054] As Figuras 29A a 29B comparam a frequência de células CD45+CD19+ (células B) e CD19+CD38+ (células B ativadas ou jatos de plasma), respectivamente, no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, de acordo com Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo na Figura 28. A Figura 29A compara a frequência de células CD45 +CD19+ (células B) no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem de acordo com o Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo na Figura 28. A Figura 29B compara a frequência das células CD19+CD38+ (células B ativadas ou jatos de plasma) no baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem de acordo com o Exemplo 1, conforme obtido dos ensaios de citometria de fluxo mostrados na Figura 28.

[0055] As Figuras 30A e 30B mostram ensaios de citometria de fluxo para pulmão e fígado, respectivamente, de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1, fechados para células CD45+. Contornos pretos indicam População de CD45 hiSSChi. A Figura 30A mostra ensaios de citometria de fluxo para pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1, fechado para células CD45+. Contornos pretos indicam População de CD45hiSSChi. A Figura 30B mostra ensaios de citometria de fluxo para fígado de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1, demarcadas para células CD45+. Contornos pretos indicam População de CD45hiSSChi.

[0056] A Figura 31 mostra células do MHCII+CD11bmid, demarcadas com CD23+ (células B maduras, macrófagos ativados, eosinófilos, células dendríticas foliculares e plaquetas), do baço de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito em Exemplo 1.

[0057] As Figuras 32A a 32B mostram células MHCII+CD11bmid demarcadas adicionalmente com CD23+ (células B maduras, macrófagos ativados, eosinófilos, células dendríticas foliculares e plaquetas), do pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem e a frequência das mesmas, conforme descrito no Exemplo 1. As Figuras 32A a B mostram células MHCII+CD11bmid, demarcadas adicionalmente com CD23+ (células B maduras, macrófagos ativados, eosinófilos, células dendríticas foliculares e plaquetas), do pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e irmãos de ninhada do tipo selvagem, conforme descrito no Exemplo 1. A Figura 32B mostra a comparação da frequência de células MHCII+CD11bmidCD23+ dos ensaios de citometria de fluxo, conforme mostrado na Figura 32A, entre o pulmão de camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e camundongos do tipo selvagem.

[0058] As Figuras 33A a 33D mostram impressões digitais imunológicas com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo, incluindo pulmão, baço, fígado e sangue. A Figura 33A mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo no pulmão de camundongos Farber de acordo com o Exemplo 1. A Figura 33B mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo no baço de camundongos Farber, de acordo com o Exemplo

1. A Figura 33C mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo no fígado de camundongos Farber de acordo com o Exemplo 1. A Figura 33D mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo no sangue de camundongos Farber de acordo com o Exemplo 1.

[0059] As Figuras 34A a 34E mostram uma estratégia de demarcação de imunofenotipagem representativa dos esplenócitos de camundongos em um camundongo Farber “knock-in” tratado com ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), conforme descrito no Exemplo 2. As populações das Figuras 34A a E foram demarcadas primeiramente no tamanho (SSC x FSC) para remover dejetos celulares do processamento (Figura 34A). Essa população foi demarcada adicionalmente com base em células vivas e mortas para remover a população de células que foi positiva para o corante Zombie red (Figura 34B). Em seguida, as células vivas foram demarcadas para selecionar a população de CD45+ (Figura 34C). Essa população foi demarcada adicionalmente para determinar a porcentagem de células CD45+ que duplamente positivas para Ly6G e CD11b; ou neutrófilos (Figura 34D). A população restante foi selecionada e demarcada para selecionar a população CD11b+MHCII- para determinar a população de monócitos ativados por tipo de amostra (Figura 34E).

[0060] As Figuras 35A a 35C mostram populações de células esplênicas imunológicas em camundongos do tipo selvagem (WT), um camundongo Farber “knock-in” tratado com um veículo (solução salina) ou um camundongo Farber tratado com doses repetidas de ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801). As populações de células imunológicas esplênicas são elevadas nos camundongos Farber de controle quando comparadas às populações de células imunológicas esplênicas WT e diminuem nos camundongos Farber tratados com ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 35A mostra populações celulares de neutrófilos esplênicos CD45 +CD11b+Ly6G+. A Figura 35B mostra populações de células de monócitos esplênicos ativados CD45+CD11bhiMHCII-. A Figura 35C mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo em camundongos Farber com 4 e 8 semanas e camundongos WT com 4 a 8 semanas.

[0061] As Figuras 36A a 36C mostram populações de células imunológicas sistêmicas em camundongos WT, em um camundongo Farber "knock-in" tratado com veículo (solução salina) ou um camundongo Farber tratado com doses repetidas de ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801). As populações de células imunológicas sistêmicas são elevadas em camundongos Farber de controle quando comparadas às populações de células imunológicas sistêmicas WT e são diminuídas em camundongos Farber tratados com ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), conforme descrito no Exemplo 4. A Figura 36A mostra populações celulares de neutrófilos CD45+CD11b+Ly6C+ no sangue. A Figura 36B mostra populações celulares de monócitos CD45 +CD11bhiMHCII- ativados no sangue. A Figura 36C mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo em camundongos Farber de 4 e 8 semanas e camundongos WT de 4 a 8 semanas.

[0062] As Figuras 37A a 37D mostram populações de células pulmonares imunológicas em camundongos WT, um camundongo Farber "knock-in" tratado com veículo (solução salina) ou um camundongo Farber tratado com doses repetidas de ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), sendo que as populações de células pulmonares imunológicas são elevadas em camundongos Farber de controle em comparação a populações de células pulmonares imunológicas WT e são diminuídas nos camundongos Farber tratados com ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), conforme descrito no Exemplo 5. A Figura 37A mostra as populações celulares de neutrófilos CD45+CD11b+Ly6G+ no fígado. A Figura 37B mostra populações celulares de monócitos CD45 +CD11bhiMCHCII- ativados no pulmão. A Figura 37C mostra populações celulares de macrófagos CD45+Ly6C+MHCII+CD11b- ativados no pulmão. A Figura 37D mostra uma impressão digital imunológica com base em todas as subpopulações celulares identificadas a partir dos ensaios de citometria de fluxo em camundongos Farber de 4 e 8 semanas e camundongos WT de 4 a 8 semanas.

[0063] As Figuras 38A a 38B mostram populações de células hepáticas imunológicas em camundongos WT, em um camundongo Farber "knock-in" tratado com solução salina ou um camundongo Farber tratado com doses repetidas de ceramidase ácida humana recombinante (RVT- 801), populações de células hepáticas imunológicas são elevadas em camundongos Farber de controle quando comparadas a populações de células hepáticas imunológicas WT e são diminuídas nos camundongos Farber tratados com ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801), conforme descrito no Exemplo 6. A Figura 38A mostra populações celulares de neutrófilos CD45+CD11b+Ly6G+ no fígado. A Figura 38B mostra população celular de monócitos CD45+CD11bhiMCHCII- ativados no fígado.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0064] A tabela 1 fornece uma listagem de determinadas sequências citadas no presente documento. SEQ ID Descrição Sequência

NO 1 ceramidase ácida MPGRSCVALVLLAAAVSCAVAQHAPPWTEDCRKSTYPPSGPTYRGAVPWYTINLDL humana PPYKRWHELMLDKAPVLKVIVNSLKNMINTFVPSGKIMQVVDEKLPGLLGNFPGPFE recombinante EEMKGIAAVTDIPLGEIISFNIFYELFTICTSIVAEDKKGHLIHGRNMDFGVFLGWNINN (rhAC) DTWVITEQLKPLTVNLDFQRNNKTVFKASSFAGYVGMLTGFKPGLFSLTLNERFSIN (aminoácido) GGYLGILEWILGKKDVMWIGFLTRTVLENSTSYEEAKNLLTKTKILAPAYFILGGNQSG

EGCVITRDRKESLDVYELDAKQGRWYVVQTNYDRWKHPFFLDDRRTPAKMCLNRT

SQENISFETMYDVLSTKPVLNKLTVYTTLIDVTKGQFETYLRDCPDPCIGW 2 rhAC GGCTCGGTCCGACTATTGCCCGCGGTGGGGGAGGGGGATGGATCACGCCACG (DNA) CGCCAAAGGCGATCGCGACTCTCCTTCTGCAGGTAGCCTGGAAGGCTCTCTCTC

TTTCTCTACGCCACCCTTTTCGTGGCACTGAAAAGCCCCGTCCTCTCCTCCCAGT CCCGCCTCCTCCGAGCGTTCCCCCTACTGCCTGGAATGGTGCGGTCCCAGGTC GCGGGTCACGCGGCGGAGGGGGCGTGGCCTGCCCCCGGCCCAGCCGGCTCTT CTTTGCCTCTGCTGGAGTCCGGGGAGTGGCGTTGGCTGCTAGAGCGATGCCGG GCCGGAGTTGCGTCGCCTTAGTCCTCCTGGCTGCCGCCGTCAGCTGTGCCGTC GCGCAGCACGCGCCGCCGTGGACAGAGGACTGCAGAAAATCAACCTATCCTCC TTCAGGACCAACGTACAGAGGTGCAGTTCCATGGTACACCATAAATCTTGACTTA CCACCCTACAAAAGATGGCATGAATTGATGCTTGACAAGGCACCAGTGCTAAAG GTTATAGTGAATTCTCTGAAGAATATGATAAATACATTCGTGCCAAGTGGAAAAAT TATGCAGGTGGTGGATGAAAAATTGCCTGGCCTACTTGGCAACTTTCCTGGCCC TTTTGAAGAGGAAATGAAGGGTATTGCCGCTGTTACTGATATACCTTTAGGAGAG ATTATTTCATTCAATATTTTTTATGAATTATTTACCATTTGTACTTCAATAGTAGCAG AAGACAAAAAAGGTCATCTAATACATGGGAGAAACATGGATTTTGGAGTATTTCT TGGGTGGAACATAAATAATGATACCTGGGTCATAACTGAGCAACTAAAACCTTTA ACAGTGAATTTGGATTTCCAAAGAAACAACAAAACTGTCTTCAAGGCTTCAAGCT TTGCTGGCTATGTGGGCATGTTAACAGGATTCAAACCAGGACTGTTCAGTCTTAC ACTGAATGAACGTTTCAGTATAAATGGTGGTTATCTGGGTATTCTAGAATGGATT CTGGGAAAGAAAGATGTCATGTGGATAGGGTTCCTCACTAGAACAGTTCTGGAA AATAGCACAAGTTATGAAGAAGCCAAGAATTTATTGACCAAGACCAAGATATTGG CCCCAGCCTACTTTATCCTGGGAGGCAACCAGTCTGGGGAAGGTTGTGTGATTA CACGAGACAGAAAGGAATCATTGGATGTATATGAACTCGATGCTAAGCAGGGTA GATGGTATGTGGTACAAACAAATTATGACCGTTGGAAACATCCCTTCTTCCTTGA TGATCGCAGAACGCCTGCAAAGATGTGTCTGAACCGCACCAGCCAAGAGAATAT CTCATTTGAAACCATGTATGATGTCCTGTCAACAAAACCTGTCCTCAACAAGCTG ACCGTATACACAACCTTGATAGATGTTACCAAAGGTCAATTCGAAACTTACCTGC GGGACTGCCCTGACCCTTGTATAGGTTGGTGAGCACACGTCTGGCCTACAGAAT GCGGCCTCTGAGACATGAAGACACCATCTCCATGTGACCGAACACTGCAGCTGT CTGACCTTCCAAAGACTAAGACTCGCGGCAGGTTCTCTTTGAGTCAATAGCTTGT CTTCGTCCATCTGTTGACAAATGACAGATCTTTTTTTTTTCCCCCTATCAGTTGAT TTTTCTTATTTACAGATAACTTCTTTAGGGGAAGTAAAACAGTCATCTAGAATTCA CTGAGTTTTGTTTCACTTTGACATTTGGGGATCTGGTGGGCAGTCGAACCATGGT GAACTCCACCTCCGTGGAATAAATGGAGATTCAGCGTGGGTGTTGAATCCAGCA CGTCTGTGTGAGTAACGGGACAGTAAACACTCCACATTCTTCAGTTTTTCACTTC TACCTACATATTTGTATGTTTTTCTGTATAACAGCCTTTTCCTTCTGGTTCTAACTG CTGTTAAAATTAATATATCATTATCTTTGCTGTTATTGACAGCGATATAATTTTATT ACATATGATTAGAGGGATGAGACAGACATTCACCTGTATATTTCTTTTAATGGGC ACAAAATGGGCCCTTGCCTCTAAATAGCACTTTTTGGGGTTCAAGAAGTAATCAG TATGCAAAGCAATCTTTTATACAATAATTGAAGTGTTCCCTTTTTCATAATTACTCT ACTTCCCAGTAACCCTAAGGAAGTTGCTAACTTAAAAAACTGCATCCCACGTTCT GTTAATTTAGTAAATAAACAAGTCAAAGACTTGTGGAAAATAGGAAGTGAACCCA TATTTTAAATTCTCATAAGTAGCATTCATGTAATAAACAGGTTTTTAGTTTGTTCTT CAGATTGATAGGGAGTTTTAAAGAAATTTTAGTAGTTACTAAAATTATGTTACTGT ATTTTTCAGAAATCAAACTGCTTATGAAAAGTACTAATAGAACTTGTTAACCTTTCT AACCTTCACGATTAACTGTGAAATGTACGTCATTTGTGCAAGACCGTTTGTCCAC TTCATTTTGTATAATCACAGTTGTGTTCCTGACACTCAATAAACAGTCACTGGAAA

GAGTGCCAGTCAGCAGTCATGCACGCTGATTGGGTGTGT 3 rhAC AAGCTTACCGCCACCATGAACTGCTGCATCGGCCTGGGTGAGAAGGCGCGTGG

(DNA) CTCGCACCGCGCCAGCTACCCCTCCCTGAGCGCCCTCTTCACCGAGGCGTCCA TCCTCGGATTCGGGAGCTTCGCCGTCAAGGCACAGTGGACCGAGGATTGCCGC AAGAGTACGTACCCCCCCAGTGGCCCGACGTACCGCGGCGCCGTCCCCTGGTA CACGATCAACCTGGACCTCCCCCCGTACAAGCGCTGGCACGAGTTGATGCTGG ACAAGGCCCCCGTACTGAAGGTCATCGTGAACTCCCTGAAGAACATGATCAACA CCTTCGTCCCCTCGGGCAAGATCATGCAGGTCGTGGACGAGAAGCTGCCCGGG CTCCTCGGCAACTTCCCCGGCCCGTTCGAAGAGGAGATGAAGGGCATCGCGGC CGTCACTGACATCCCCCTGGGCGAGATCATCAGCTTCAACATCTTCTACGAGCT GTTCACCATCTGCACCTCCATCGTAGCCGAGGACAAGAAGGGCCACCTGATCCA CGGTCGCAACATGGACTTCGGCGTCTTCCTGGGCTGGAACATCAACAACGACAC CTGGGTCATCACCGAGCAGCTGAAGCCGCTCACCGTGAACCTCGATTTCCAGCG CAACAACAAGACGGTGTTCAAGGCCAGCTCCTTCGCCGGGTACGTCGGGATGC TCACGGGCTTCAAGCCGGGACTGTTCTCGCTGACCCTCAACGAGCGGTTCTCCA TCAACGGGGGCTACCTCGGCATCCTGGAGTGGATTCTCGGCAAGAAGGACGTG ATGTGGATCGGCTTCCTCACACGGACCGTGCTGGAAAACTCCACTAGTTACGAG GAGGCCAAGAACCTGCTGACCAAGACGAAGATCCTGGCCCCGGCATACTTCATC CTGGGCGGCAACCAGTCGGGCGAGGGGTGCGTCATCACCCGCGACCGGAAGG AGTCCCTGGACGTCTATGAGCTGGACGCCAAGCAGGGCCGCTGGTACGTCGTC CAGACGAACTACGACCGATGGAAGCACCCCTTCTTCCTCGACGACCGGCGCAC GCCCGCCAAGATGTGCCTGAACCGCACCAGCCAGGAGAACATCTCGTTCGAGA CGATGTACGACGTGCTGTCGACCAAGCCCGTGCTCAACAAGCTGACGGTCTACA CCACGCTGATCGACGTGACGAAAGGCCAGTTCGAAACGTACCTGCGGGACTGC

CCGGACCCTTGCATCGGCTGGTGATAATCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCC 4 rhAC AAGCTTACCGCCACCATGAACTGCTGCATCGGGCTGGGAGAGAAAGCTCGCGG (DNA) GTCCCACCGGGCCTCCTACCCAAGTCTCAGCGCGCTTTTCACCGAGGCCTCAAT

TCTGGGATTTGGCAGCTTTGCTGTGAAAGCCCAATGGACAGAGGACTGCAGAAA ATCAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACGTACAGAGGTGCAGTTCCATGGTACAC CATAAATCTTGACTTACCACCCTACAAAAGATGGCATGAATTGATGCTTGACAAG GCACCAGTGCTAAAGGTTATAGTGAATTCTCTGAAGAATATGATAAATACATTCGT GCCAAGTGGAAAAATTATGCAGGTGGTGGATGAAAAATTGCCTGGCCTACTTGG CAACTTTCCTGGCCCTTTTGAAGAGGAAATGAAGGGTATTGCCGCTGTTACTGAT ATACCTTTAGGAGAGATTATTTCATTCAATATTTTTTATGAATTATTTACCATTTGT ACTTCAATAGTAGCAGAAGACAAAAAAGGTCATCTAATACATGGGAGAAACATGG ATTTTGGAGTATTTCTTGGGTGGAACATAAATAATGATACCTGGGTCATAACTGA GCAACTAAAACCTTTAACAGTGAATTTGGATTTCCAAAGAAACAACAAAACTGTCT TCAAGGCTTCCAGCTTTGCTGGCTATGTGGGCATGTTAACAGGATTCAAACCAG GACTGTTCAGTCTTACACTGAATGAACGTTTCAGTATAAATGGTGGTTATCTGGG TATTCTAGAATGGATTCTGGGAAAGAAAGATGTCATGTGGATAGGGTTCCTCACT AGAACAGTTCTGGAAAATAGCACAAGTTATGAAGAAGCCAAGAATTTATTGACCA AGACCAAGATATTGGCCCCAGCCTACTTTATCCTGGGAGGCAACCAGTCTGGGG AAGGTTGTGTGATTACACGAGACAGAAAGGAATCATTGGATGTATATGAACTCGA TGCTAAGCAGGGTAGATGGTATGTGGTACAAACAAATTATGACCGTTGGAAACAT CCCTTCTTCCTTGATGATCGCAGAACGCCTGCAAAGATGTGTCTGAACCGCACC AGCCAAGAGAATATCTCATTTGAAACCATGTATGATGTCCTGTCAACAAAACCTG TCCTCAACAAGCTGACCGTATACACAACCTTGATAGATGTTACCAAAGGTCAATT CGAAACTTACCTGCGGGACTGCCCTGACCCTTGTATAGGTTGGTGATAACCTAG GGTCGGGGCGGCCGGCC

[0065] Em uma modalidade, "RVT-801" é uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) na forma ativada para o tratamento contra doença de Farber. As subunidades alfa e beta da rhAC ativada são unidas por uma ligação de dissulfeto. A molécula é uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) derivada de células CHO-M submetidas à transfecção com um vetor plasmídico de DNA que expressa rhAC. A Rvt-801 se baseia no código UniProt KB: Q13510.

[0066] A RVT-801 compreende uma ceramidase ácida (rhAC) produzida de maneira recombinante purificada até uma pureza de forma ativada de pelo menos 95% por um processo que compreende as etapas submeter a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante a pelo menos duas etapas de cromatografia selecionadas a partir de i) cromatografia de troca catiônica; ii) cromatografia de interação hidrofóbica (HIC); e iii) cromatografia de troca aniônica; e submeter a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante em solução a uma ou mais etapas de inativação viral, em que a solução de rhAC é titulada a um pH de 3,7 ou menos. A sequência de proteínas de RVT-801 corresponde à SEQ ID NO: 1.

[0067] Em uma modalidade, a purificação de rhAC pode ser realizada de acordo com os processos revelados no documento PCT/2018/052463, depositado em 24 de setembro de 2018, que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. O efeito terapêutico do RVT-801 rhAC foi estabelecido em um modelo de murganho com doença de Farber grave (He, et al, 2017) e foi caracterizado em vários estudos com parâmetros que descrevem impactos positivos nos resultados histopatológicos e imunológicos, junto da redução concomitante de ceramidas acumuladas.

[0068] Outras modalidades de ACs ativas e proteínas precursoras de AC inativa que podem ser usadas nesse e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas estabelecidas na Tabela 1 do documento US 2016/0038574, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência.

[0069] Em algumas modalidades, a rhAC é uma proteína que é uma proteína que é um homólogo da SEQ ID NO: 1.

[0070] Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.

[0071] Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3.

[0072] Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.

[0073] Em algumas modalidades, a sequência de rhAC é conforme definido no número de acesso do GenBankNM_177924.3 ou NM_177924.4, dentre os quais cada um é incorporado a título de referência na sua totalidade. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser a sequência completa mostrada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou pode ser simplesmente a região de codificação da sequência. A região de codificação, por exemplo, pode ser os nucleotídeos 313 a 1.500 da SEQ ID NO: 2 ou a região de codificação correspondente encontrada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. No entanto, conforme é bem conhecido pelas pessoas versadas na técnica, o código genético é degenerado e, portanto, outros códons podem ser usados para codificar a mesma proteína sem haver afastamento do conteúdo revelado. Uma vez que a sequência de aminoácidos é conhecida, qualquer sequência de nucleotídeos que codifique a sequência de aminoácidos é aceitável.

[0074] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos compreende um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos codificada pelos nucleotídeos 313 a 375 da SEQ ID NO: 2.

[0075] Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1-21 da SEQ ID NO: 1.

[0076] Em algumas modalidades, a proteína produzida não compreende um peptídeo sinal, como o peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é removido durante um processamento pós-tradução, em que a enzima é processada em suas diferentes subunidades. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é otimizada por códon para a célula que é a proteína que é expressa. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma subunidade alfa, uma subunidade beta e semelhantes. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo dos resíduos de aminoácidos 22 a 142, 45 a 139, 134 a 379, 143 a 395 ou 1 a 395 de SEQ ID NO: 1. O peptídeo pode ser uma única proteína ou um polipeptídeo de diferentes sequências para formar a enzima. Em algumas modalidades, a proteína está livre de resíduos de aminoácidos 1 a 21. Essas regiões podem ser codificadas por uma única sequência de nucleotídeos ou sequências de nucleotídeos separadas ou uma combinação de sequências de nucleotídeos. Conforme discutido no presente documento, qualquer sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser usada e não se limita à sequência descrita no presente documento como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

[0077] Em algumas modalidades, a rhAC tem atividade de ceramidase ácida (AC), porém não tem nenhuma atividade de esfingomielinase ácida detectável, tal como a rhAC produzida nos Exemplos a seguir. A atividade de esfingomielinase ácida pode ser removida, por exemplo, por inativação por calor. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 20160038574, que é incorporada no presente documento em sua totalidade. A inativação por calor também pode remover outras proteínas contaminantes de uma preparação de rhAC.

[0078] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante purificada tem uma pureza de pelo menos 90%, 93%, 95%, 98% ou 99% ou uma pureza de 100%.

[0079] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante purificada não tem atividade de esfingomielinase ácida detectável.

[0080] Em algumas modalidades, a atividade de esfingomielinase ácida da ceramidase ácida produzida de forma recombinante é removida sem o uso de calor.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[0081] O presente pedido inclui marcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e kits para determinar se um indivíduo tem doença de Farber. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar se um indivíduo tem doença de Farber com o uso de um ou mais marcadores. São revelados, também, métodos de tratamento da doença de Farber em indivíduos com os marcadores descritos. A. DEFINIÇÕES

[0082] Salvo quando definido de outro modo, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado geralmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática da invenção, determinados métodos, dispositivos e materiais são descritos no presente documento.

[0083] Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento podem ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não se limita de modo algum aos métodos e materiais descritos.

[0084] Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patentes mencionados no presente documento são incorporados a título de referência na mesma medida em que cada publicação individual, documento de patente publicado ou pedido de patente foi indicado específica e individualmente como sendo incorporado a título de referência.

[0085] Conforme usado no presente documento, os termos “um” ou “uma” significam “pelo menos um(a)” ou “um(a) ou mais”, salvo quando o contexto indicar claramente de outro modo.

[0086] Conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” significa que o valor numérico é aproximado e pequenas variações não afetariam significativamente a prática das modalidades reveladas. Quando uma limitação numérica é usada, salvo quando indicado de outro modo pelo contexto, “cerca de” significa que o valor numérico pode variar em ± 10% e ainda é abrangido pelo escopo das modalidades reveladas.

[0087] Conforme usado no presente documento, o termo "animal" inclui, porém sem limitação, seres humanos e vertebrados não humanos, tais como animais selvagens, domésticos e de fazenda. O animal também pode ser chamado de “indivíduo”.

[0088] Conforme usado no presente documento, “marcador” e “marcador” são usados de maneira alternativa para se referir a uma molécula-alvo que indica ou é um sinal de um processo normal ou anormal em um indivíduo ou de uma doença ou outra afecção em um indivíduo. Mais especificamente, um “marcador” ou “marcador” é um parâmetro anatômico, fisiológico, bioquímico ou molecular associado à presença de um estado ou processo fisiológico específico, normal ou anormal, e, se anormal, crônico ou agudo. Os marcadores são detectáveis e mensuráveis por uma variedade de métodos, incluindo ensaios de laboratório e imagens médicas. Em algumas modalidades, um marcador é uma proteína-alvo.

[0089] Conforme usado no presente documento, “nível de marcador” e “nível” se referem a uma medição que é feita com o uso de qualquer método analítico para detectar o marcador em uma amostra biológica e que indica a presença, ausência, quantidade ou concentração absoluta, quantidade ou concentração relativa, título, um nível, um nível de expressão, uma razão entre níveis medidos ou semelhantes de, para ou correspondentes ao marcador na amostra biológica. A natureza exata do "nível" depende do projeto e componentes específicos do método analítico específico empregado para detectar o marcador.

[0090] Um "nível de controle" ou "controle" de uma molécula-alvo se refere ao nível da molécula-alvo no mesmo tipo de amostra de um indivíduo que não tem a doença ou afecção ou de um indivíduo que não suspeita ter a doença ou afecção. Um "nível de controle" de uma molécula-alvo não precisa ser determinado toda vez que os métodos atuais são executados e pode ser um nível previamente determinado que é usado como referência ou limiar para determinar se o nível em uma amostra específica é maior ou menor do que um nível normal. Em algumas modalidades, um nível de controle em um método descrito no presente documento é o nível que foi observado em um ou mais indivíduos sem a doença de Farber. Em algumas modalidades, um nível de controle em um método descrito no presente documento é o nível médio ou médio, opcionalmente mais ou menos uma variação estatística que foi observada em uma pluralidade de indivíduos normais ou indivíduos sem a doença de Farber.

[0091] Conforme usado no presente documento, o termo "veículo" significa um diluente, adjuvante ou excipiente com o qual um composto é administrado. Os carreadores farmacêuticos podem ser líquidos, tais como água e óleos, incluindo os de origem animal, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Os carreadores farmacêuticos também podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia e semelhantes. Além disso, podem ser usados agentes auxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes.

[0092] Conforme usado no presente documento, os termos “compreender" (e qualquer forma de compreender, tal como “compreendem", “compreende" e “compreendido"), “ter" (e qualquer forma de ter, como “têm" e "tem”), “incluir” (e qualquer forma de incluir, tal como “inclui” e “incluem”) ou “conter” (e qualquer forma de conter, tal como “contém” e “contêm”) são inclusivos ou abertos e não excluem elementos ou etapas adicionais e não citados. Além disso, um termo que for usado em combinação com o termo “compreender" também será entendido como capaz de ser usado em combinação com o termo “consistir em" ou “consistir essencialmente em".

[0093] Conforme usado no presente documento, o termo “em contato" significa reunir dois elementos em um sistema in vitro ou em um sistema in vivo. Por exemplo, “colocar em contato” o polipeptídeo de rhAC com um indivíduo, indivíduo ou célula inclui a administração do polipeptídeo a um indivíduo ou paciente, tal como um ser humano, assim como, por exemplo, a introdução de um composto em uma amostra que contém preparação celular ou purificada que contém o polipeptídeo. Além disso, o contato pode se referir à transfecção ou infecção de uma célula com uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo.

[0094] “Diagnosticar”, “diagnosticando”, “diagnóstico” e variações dos mesmos se referem à detecção, determinação ou reconhecimento de um estado ou afecção de saúde de um indivíduo com base em um ou mais sinais, sintomas, dados ou outras informações pertencentes para esse indivíduo. O estado de saúde de um indivíduo pode ser diagnosticado como saudável/normal (isto é, um diagnóstico da ausência de uma doença ou afecção) ou diagnosticado como doente/anormal (isto é, um diagnóstico da presença ou uma avaliação das características de uma doença ou afecção). Os termos “diagnosticar”, “diagnosticando”, “diagnóstico” etc. abrangem, com relação a uma doença ou afecção específica, a detecção inicial da doença; a caracterização ou classificação da doença; a detecção da progressão, remissão ou recidiva da doença; e a detecção da resposta à doença à administração de um tratamento ou terapia para o indivíduo. O diagnóstico da doença de Farber inclui distinguir indivíduos que têm doença de Farber dos indivíduos que não têm.

[0095] Uma "quantidade eficaz" de uma enzima entregue a um indivíduo é uma quantidade suficiente para melhorar o curso clínico de uma doença de Farber, em que a melhoria clínica é medida por qualquer uma das várias opções de parâmetros bem conhecidas pela pessoa versada na técnica.

[0096] Conforme usado no presente documento, a frase "número inteiro de X a Y" significa qualquer número inteiro que inclua os pontos finais. Por exemplo, o sintagma "número inteiro de X a Y" significa 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0097] Conforme usado no presente documento, o termo "isolado" significa que os compostos descritos no presente documento são separados de outros componentes de (a) uma fonte natural, como uma planta ou célula ou (b) uma mistura de reação química orgânica sintética, tal como por técnicas convencionais.

[0098] Conforme usado no presente documento, o termo “mamífero” significa um roedor (isto é, um rato, um rato ou um porquinho-da-índia), um macaco, um gato, um cachorro, uma vaca, um cavalo, um porco ou um ser humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano

[0099] Conforme usado no presente documento, o sintagma "farmaceuticamente aceitável" significa os compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico adequado, adequados para uso em contato com tecidos de humanos e animais. Em algumas modalidades, "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. Conforme usado no presente documento, a frase “com necessidade do mesmo" significa que o indivíduo foi identificado como tendo necessidade do método ou tratamento específico. Em algumas modalidades, a identificação pode ser por qualquer meio de diagnóstico. Em qualquer um dos métodos e tratamentos descritos no presente documento, o indivíduo pode precisar do mesmo.

[0100] Conforme usado no presente documento, o termo "purificado" significa que, quando isolado, o isolado contém pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de um composto descrito no presente documento em peso do isolado.

[0101] Conforme usado no presente documento, os termos "sujeito", "indivíduo" ou "paciente", usados de forma intercambiável, significam qualquer animal, incluindo mamíferos, como camundongos, camundongos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, gado, ovelha, cavalos ou primatas, como seres humanos.

[0102] Conforme usado no presente documento, o sintagma "substancialmente isolado" significa um composto que é pelo menos parcial ou substancialmente separado do ambiente em que é formado ou detectado.

[0103] Conforme usado no presente documento, o sintagma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que elicita a resposta biológica ou medicinal que é esperada em um tecido, sistema, animal, indivíduo ou ser humano por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. O efeito terapêutico depende do distúrbio a ser tratado ou do efeito biológico desejado. Desse modo, o efeito terapêutico pode ser uma diminuição na gravidade dos sintomas associados ao distúrbio e/ou inibição (parcial ou completa) da progressão do distúrbio, ou tratamento aprimorado, cura, prevenção ou eliminação de um distúrbio ou efeitos colaterais. A quantidade necessária para obter a resposta terapêutica pode ser determinada com base na idade, saúde, tamanho e sexo do indivíduo. As quantidades ideais também podem ser determinadas com base no monitoramento da resposta do paciente ao tratamento. B. MARCADOR

[0104] Em algumas modalidades, um ou mais marcadores são fornecidos para uso sozinho ou em várias combinações para determinar se um indivíduo tem doença de Farber. Conforme descrito detalhadamente abaixo, as modalidades exemplificativas incluem os marcadores fornecidos na Tabela 2.

TABELA 2: PAINEL DE CITOMETRIA DE FLUXO PARA

AVALIAR SUBPOPULAÇÕES CELULARES DERIVADAS DE LEUCÓCITOS Marcador de Clone Função superfície CD45 104 Antígeno comum de leucócito CD11b M1/70 Marcador de linhagem de monócito/granulócito MHCII M5/114.15.2 Apresentação de antígeno (células inflamatórias) Ly6C HK1.4 Marcador de granulócito pró-inflamatório Ly6G 1A8 Marcador de neutrófilo CD86 GL-1 Ativação de macrófagos, células dendríticas, células T, células B CD206 C068C2 Receptor de manose (macrófagos anti- inflamatórios/células dendríticos) CD19 500A2 Marcador de célula Pan-B CD38 90 Linfócitos ativados, jatos de plasma CD3 6D5 Marcador de célula Pan-T CD23 B3B4 Ativação de células B (apresentação em células B maduras, macrófagos ativados, eosinófilos, células dendríticas foliculares e plaquetas).

[0105] A Tabela 2 lista onze marcadores que são úteis para distinguir amostras obtidas de um indivíduo com doença de Farber de amostras de um indivíduo que não tem a doença de Farber.

[0106] Em algumas modalidades, um ou mais marcadores da Tabela 2 são fornecidos para uso sozinho ou em várias combinações para determinar se um indivíduo tem doença de Farber ou para determinar a probabilidade de o indivíduo ter doença de Farber. Em algumas modalidades, um ou mais marcadores da Tabela 2 são úteis para determinar se um indivíduo tem deficiência de ceramidase ácida, lipogranulomatose e/ou estado inflamatório crônico induzido por ceramida.

[0107] Em algumas modalidades, um ou mais dos marcadores listados na Tabela 2 são úteis para identificar indivíduos que correm risco de desenvolver a doença de Farber. Em algumas modalidades, um ou mais dos marcadores listados na Tabela 2 são úteis para identificar indivíduos que correm risco de deficiência de ceramidase ácida, lipogranulomatose e/ou estado inflamatório crônico induzido por ceramida. Em algumas modalidades, um ou mais marcadores listados na Tabela 2 são fornecidos para uso sozinho ou em várias combinações para determinar se um indivíduo tem doença de Farber.

[0108] Em algumas modalidades, um ou mais conjuntos de marcadores são fornecidos para uso sozinho ou em várias combinações para determinar se um indivíduo tem doença de Farber. Conforme descrito detalhadamente abaixo, as modalidades exemplificativas incluem os conjuntos de marcadores fornecidos na Tabela 3. Os conjuntos dos marcadores foram identificados com o uso de a estratégia de demarcação para identificar populações que expressam marcadores específicos listados na Tabela 2 nos ensaios de citometria de fluxo. TABELA 3 Conjunto de marcadores Tipo de célula CD11b+Ly6G+ Neutrófilo SSCmidFSCmid (Tamanho) Monócitos aparentes MHCII-CD11bhi Monócitos ativados CD11b+CD206+ mΦ e DCs anti-inflamatórios MHCII+CD11b-Ly6C+ mΦ e DCs pró-inflamatórios MHCII-CD11bmidCD23+ mΦ e DCs pró-inflamatórios ativados MHCII-CD11bhiCD86+ mΦ e DCs pró-inflamatórios ativados CD11b+CD38+ mΦ e DCs pró-inflamatórios CD19+CD38+ Células B ativadas (PBs) CD19-CD3+ Total de células T

[0109] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos um conjunto de marcadores listados na Tabela 3 em uma amostra de um indivíduo para determinar se um indivíduo tem doença de Farber.

[0110] Em algumas modalidades, um método compreende determinar se um indivíduo tem doença de Farber, compreender formar um painel de marcadores com N conjuntos de marcadores a partir dos conjuntos de marcadores listados na Tabela 3 e detectar o nível de cada conjunto de marcadores do painel em uma amostra de o indivíduo, em que N é pelo menos um. Em algumas modalidades, N é pelo menos 2 ou N é pelo menos 3 ou N é pelo menos 4 ou N é pelo menos 5 ou N é 5 ou N é 5 ou N é 6 ou N é 7 ou N é 8 ou N é 9 ou N é 10. Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez conjuntos de marcadores selecionados a partir de CD11b+Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII- CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ para determinar se um indivíduo tem doença de Farber.

[0111] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b-Ly6C+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0112] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de MHCII-CD11bhiCD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII-CD11bhiCD86+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0113] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de CD11b+CD38+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+CD38+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0114] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de CD11b+CD206+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+CD206+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0115] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de CD11b+Ly6G+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+Ly6G+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0116] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de CD19+CD38+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19+CD38+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0117] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de CD19-CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19-CD3+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0118] Em uma modalidade, um método compreender detectar os níveis de MHCII+CD11b-Ly6C+ e MHCII- CD11bhiCD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ e/ou MHCII-CD11bhiCD86+ que é superior a um nível de controle indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0119] Em algumas modalidades, um método compreende detectar os níveis de CD19+CD38+ e CD19-CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19+CD38+ é superior a um nível de controle e um nível de CD19-CD3+ é superior a um nível de controle indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0120] Os marcadores no presente documento identificados fornecem várias opções para subconjuntos ou painéis de marcadores que podem ser usados para identificar com eficácia a doença de Farber. Os marcadores no presente documento identificados fornecem várias opções para subconjuntos ou painéis de marcadores que podem ser usados para identificar com eficácia deficiência de ceramidase ácida, lipogranulomatose e/ou estado inflamatório crônico induzido por ceramida. A seleção do número apropriado desses marcadores pode depender da combinação específica de marcadores escolhidos. Além disso, em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, com exceção de quando indicado explicitamente, um painel de marcadores pode compreender marcadores adicionais não mostrados na Tabela 2 ou 3.

[0121] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos um marcador listado na Tabela 2 em uma amostra de um indivíduo para determinar se um indivíduo tem doença de Farber.

[0122] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez conjuntos de marcadores listados na Tabela 3 em uma amostra do indivíduo, em que um nível de pelo menos um marcador indica que o indivíduo tem doença de Farber.

[0123] Em algumas modalidades, os marcadores estão presentes em diferentes níveis em indivíduos com deficiência de ceramidase ácida em comparação aos indivíduos sem deficiência de ceramidase ácida. Em algumas modalidades, os marcadores estão presentes em diferentes níveis em indivíduos com lipogranulomatose em comparação a indivíduos sem lipogranulomatose. Em algumas modalidades, os marcadores estão presentes em diferentes níveis em indivíduos com um estado inflamatório crônico induzido por ceramida em comparação a indivíduos sem estado inflamatório crônico induzido por ceramida. A detecção dos níveis diferenciais de um marcador em um indivíduo pode ser usada, por exemplo, para permitir determinar se um indivíduo tem a doença de Farber.

[0124] Em algumas modalidades, devido ao fato de que os métodos com uma amostra de sangue não são invasivos, qualquer um dos marcadores descritos no presente documento pode ser usado para monitorar indivíduos quanto ao desenvolvimento da doença de Farber ou monitorar indivíduos com risco de desenvolver doença de Farber ou deficiência de ceramidase ácida. Detectando-se a deficiência de ceramidase ácida em um estágio anterior, a intervenção ou o tratamento médico pode ser mais eficaz, tal como o tratamento com rhAC.

[0125] Além disso, em algumas modalidades, um nível de expressão diferencial de um ou mais marcadores em um indivíduo ao longo do tempo pode ser indicativo da resposta do indivíduo a um regime terapêutico específico. Desse modo, uma modalidade da presente invenção envolve um método para determinar a eficácia de um regime de tratamento da doença de Farber. Em algumas modalidades, mudanças na expressão de um ou mais marcadores durante o monitoramento de acompanhamento podem indicar que um tratamento específico é eficaz ou sugerir que o regime terapêutico deve ser ajustado. Os níveis de expressão de um ou mais marcadores podem ser determinados antes do início de um regime de tratamento e/ou durante um regime de tratamento.

[0126] Além de testar os níveis de marcador como um teste de diagnóstico independente, os níveis de marcador também podem ser feitos em combinação com outros métodos de diagnóstico ou triagem de doença de Farber. Em alguns casos, os métodos que utilizam os marcadores descritos no presente documento podem facilitar a justificativa médica e econômica para implantar tratamentos mais agressivos contra a doença de Farber, triagem de acompanhamento mais frequente etc. Os marcadores também podem ser usados para iniciar o tratamento em indivíduos com risco de desenvolver Doença de Farber, porém que não foram diagnosticados com a doença de Farber, caso o teste de diagnóstico indique que é provável que a doença se desenvolva. Além de testar os níveis de marcadores em combinação com outros métodos de diagnóstico da doença de Farber, as informações sobre os marcadores também podem ser avaliadas em combinação com outros tipos de dados, particularmente dados que indicam o risco de um indivíduo de desenvolver doença de Farber. C. DETECÇÃO DE MARCADORES

[0127] Um nível de marcador para os marcadores descritos no presente documento pode ser detectado com o uso de qualquer um dentre uma variedade de métodos analíticos conhecidos. Em uma modalidade, um nível de marcador é detectado com o uso de um reagente de captura. Em várias modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao marcador em solução ou pode ser exposto ao marcador, ao passo que o reagente de captura é imobilizado em um suporte sólido. Em outras modalidades, o reagente de captura contém um recurso que é reativo com um recurso secundário em um suporte sólido. O reagente de captura é selecionado com base no tipo de análise a ser realizada. Em algumas modalidades, os reagentes de captura incluem, entre outros, anticorpos, moléculas pequenas, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticorpo de cadeia única, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia única, receptores de ligação a ligantes, receptores de citocinas e receptores sintéticos e modificações e fragmentos dos mesmos. Em algumas modalidades, os reagentes de captura incluem anticorpos.

[0128] Em algumas modalidades, o nível do marcador é detectado diretamente do marcador em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, os marcadores são detectados com o uso de um formato multiplexado que permite a detecção simultânea de dois ou mais marcadores em uma amostra biológica.

[0129] Em algumas dessas modalidades, o método compreende o contato da amostra ou de uma porção da amostra do indivíduo com pelo menos um reagente de captura, em que cada reagente de captura se liga especificamente a um marcador ou a um conjunto de marcadores cujos níveis são detectados.

[0130] Além disso, em algumas modalidades, uma amostra biológica pode ser derivada colhendo-se amostras biológicas de um número de indivíduos e agrupando-se as mesmas ou agrupando-se uma alíquota de cada amostra biológica do indivíduo. A amostra combinada pode ser tratada conforme descrito no presente documento para uma amostra de um único indivíduo e, por exemplo, caso um prognóstico ruim seja estabelecido na amostra combinada, cada amostra biológica individual poderá ser testada novamente para determinar quais indivíduos têm doença de Farber.

[0131] Em algumas modalidades, uma etiqueta fluorescente pode ser usada para marcar um componente do complexo marcador/reagente de captura para permitir a detecção do nível do marcador. Em várias modalidades, o marcador fluorescente pode ser conjugado com um reagente de captura específico para qualquer um dos marcadores descritos no presente documento com o uso de técnicas conhecidas, e o marcador fluorescente pode, então, usado para detectar o nível do marcador correspondente.

[0132] Em algumas modalidades, o rótulo fluorescente é uma molécula de corante fluorescente. Em algumas modalidades, a molécula de corante fluorescente inclui pelo menos um sistema de anel de indol substituído no qual o substituinte no carbono 3 do anel de indol contém um grupo quimicamente reativo ou uma substância conjugada. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui uma molécula de corante AlexFluor (Thermo Fischer Scientific), tal como, por exemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680 ou AlexaFluor 700. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui uma molécula de corante BD Horizon Brilliant™ (BD Sciences), tal como, por exemplo, BV421, BV510, BV605, BV 650 ou BV711. Em algumas modalidades, as moléculas de corante incluem Cy5 ou Cy7. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo de molécula de corante, tal como, por exemplo, duas moléculas AlexaFluor diferentes. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo de molécula de corante, e as duas moléculas de corante têm espectros de emissão diferentes.

[0133] A fluorescência pode ser medida com uma variedade de instrumentação compatível com uma ampla gama de formatos de ensaio. Em algumas modalidades, os níveis de marcador para os marcadores descritos no presente documento podem ser detectados com o uso de quaisquer métodos analíticos, incluindo imunoensaios simples ou multiplexados, métodos histológicos/citológicos etc. Os métodos de imunoensaio se baseiam na reação de um anticorpo ao seu alvo ou analito correspondente e pode detectar o analito em uma amostra, dependendo do formato de ensaio específico. Para melhorar a especificidade e a sensibilidade de um método de ensaio com base em imunorreatividade, anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos são frequentemente usados devido ao seu reconhecimento de epítopo específico. Os anticorpos policlonais também foram usados com sucesso em vários imunoensaios devido à sua maior afinidade com o alvo em comparação aos anticorpos monoclonais. Os imunoensaios foram projetados para uso com uma ampla faixa de matrizes de amostras biológicas. Os formatos de imunoensaio foram projetados para fornecer resultados qualitativos, semiquantitativos e quantitativos.

[0134] Os métodos de citometria de fluxo também podem ser usados para a detecção de marcadores. Os métodos para realizar citometria de fluxo são conhecidos na técnica. De modo geral, as células, de preferência, células sanguíneas, são incubadas com um anticorpo. Em modalidades preferenciais, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. É mais preferencial que o anticorpo monoclonal seja marcado com um marcador fluorescente. Caso o anticorpo não esteja marcado com um marcador fluorescente, um segundo anticorpo é reage ao primeiro anticorpo e contém um marcador fluorescente. Após lavagem suficiente para garantir a remoção de anticorpos em excesso ou não ligados, as células estão prontas para citometria de fluxo. A citometria de fluxo oferece um tempo de resposta curto entre a preparação, aquisição e análise da amostra, permite a enumeração precisa de subconjuntos individuais de células (incluindo subconjuntos muito raros) e oferece uma oportunidade para a fenotipagem molecular detalhada. D. KITS

[0135] Qualquer combinação dos marcadores descritos no presente documento pode ser detectada com o uso de um kit adequado, tal como para uso na execução dos métodos no presente documento revelados. Além disso, qualquer kit pode conter um ou mais rótulos detectáveis, conforme descrito no presente documento, tal como uma fração fluorescente etc. Em algumas modalidades, um kit inclui um ou mais reagentes de captura (tal como, por exemplo, pelo menos um anticorpo) para detectar um ou mais marcadores em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, um kit inclui opcionalmente um ou mais produtos de software ou programa de computador para prever se o indivíduo de quem a amostra biológica foi obtida tem doença de Farber. Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programas de computador, podem ser fornecidas uma ou mais instruções para que as etapas acima sejam realizadas manualmente por um ser humano. O kit também pode incluir instruções para usar os dispositivos e reagentes, manipular a amostra e analisar os dados. Além disso, o kit pode ser usado com um sistema ou software de computador para analisar e relatar o resultado da análise da amostra biológica. Os kits também podem conter um ou mais reagentes (por exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens ou tampões) para processar uma amostra biológica. Qualquer um dos kits descritos no presente documento também pode incluir, por exemplo, tampões, agentes de bloqueio, agentes de captura de anticorpos, amostras de controle positivo, amostras de controle negativo, software e informações como protocolos, dados de orientação e referência. E. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0136] Em algumas modalidades, após uma determinação de que um indivíduo tem doença de Farber (ou deficiência de ceramida ácida), o indivíduo passa por um regime terapêutico para atrasar ou impedir o agravamento da doença. Em algumas modalidades, um indivíduo recebe um agente terapêutico, tal como rhAC. Os métodos exemplificativos de tratamento da doença de Farber com rhAC estão descritos no Pedido Internacional nº PCT/US18/13509 depositado em 12 de janeiro de 2018 e em He et al., “Enzyme replacement therapy for Farber disease: Proof-of-concept studies in cells and mice”, BBA Clin. 13 de fevereiro de 2017; 7:85 a 96 (He et al., 2017), que são incorporados a título de referência em sua totalidade.

[0137] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de monitoramento da doença de Farber. Qualquer método conhecido pelas pessoas versadas na técnica pode ser usado para monitorar o estado da doença e a eficácia da terapia. Os monitores clínicos do estado da doença podem incluir, entre outros, níveis de ceramida, peso, comprimento da articulação, inflamação ou qualquer outro fenótipo clínico conhecido por ser associado à doença de Farber.

[0138] Em algumas modalidades, os presentes métodos para determinar se um indivíduo tem doença de Farber são realizados ao mesmo tempo 0. Em algumas modalidades, o método é realizado novamente no tempo 1 e, opcionalmente, no tempo 2 e, opcionalmente, no tempo 3 etc., para monitorar a progressão da doença no indivíduo. Em algumas modalidades, marcadores diferentes são usados em diferentes momentos, dependendo do estado atual da doença do indivíduo e/ou dependendo da taxa na qual é esperado ou se acredita que a doença progride.

[0139] Conforme usado no presente documento, os termos "tratar", "tratado" ou “tratamento" significam tratamento tanto terapêutico quanto medidas profiláticas em que o objetivo é desacelerar (diminuir) uma afecção, distúrbio ou doença fisiológica indesejada ou significam a obtenção de benefícios ou resultados clínicos desejados. Por exemplo, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitação, alívio dos sintomas; diminuição da extensão da condição, distúrbio ou doença; estado estabilizado (isto é, sem piora) da afecção, distúrbio ou doença; atraso no início ou desaceleração da afecção, distúrbio ou progressão da doença; melhoria da afecção, distúrbio ou estado ou recidiva da doença (parcial ou total), detectável ou indetectável; melhoria de pelo menos um parâmetro físico mensurável, não necessariamente discernível pelo paciente; ou melhoria ou melhoria da afecção, distúrbio ou doença. Desse modo, "tratamento da doença de Farber" ou "tratamento da doença de Farber" significa uma atividade que alivia ou melhora qualquer um dos fenômenos primários ou sintomas secundários associados à doença de Farber ou a outra afecção descrita no presente documento.

[0140] Observa-se, também, que determinados atributos descritos no presente documento, que são descritos no contexto de modalidades separadas a título de objetividade, também podem ser fornecidos combinados uma única modalidade. Em contrapartida, vários atributos que são descritos no contexto de uma única modalidade a título de brevidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

[0141] Várias composições farmacêuticas são descritas no presente documento e podem ser usadas com base nas preferências do paciente e do médico. No entanto, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma solução. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende meios condicionados a células que compreendem a rhAC. Conforme usado no presente documento, o termo “meios condicionados de célula" se refere aos meios de cultura celular que foram usados para cultivar células que expressam a rhAC e em que a proteína é secretada nos meios e, em seguida, a proteína é isolada ou purificada dos meios. Em algumas modalidades, a mídia é usada para tratar o indivíduo. Os meios podem ser aplicados, por exemplo, à pele do indivíduo para tratar qualquer uma das afecções, sintomas ou distúrbios descritos no presente documento.

[0142] Além das rotas de administração descritas no presente documento, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada mediante o contato com a pele do indivíduo. Em algumas modalidades, a administração é administração parentérica. Em algumas modalidades, a administração compreende injetar a composição farmacêutica no indivíduo. Em algumas modalidades, a administração é uma injeção intraperitoneal ou injeção intravenosa.

[0143] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar doença de Farber em um indivíduo com necessidade dos mesmos, sendo que o método compreende expressar ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.

[0144] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida humana recombinante expressa (rhAC) em uma célula compreende transferir um vetor que codifica rhAC para a célula. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica rhAC. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é uma molécula, conforme descrito no presente documento, ou qualquer outra molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de rhAC ou homólogo do mesmo, que é descrito mais detalhadamente no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Por exemplo, o vetor pode ser um vetor retroviral ou um vetor de vírus de DNA, tal como adenovírus, AAV e similares. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor compreende um promotor operacionalmente ligado ao rhAC. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor SV40, o promotor CMV, o promotor alfa EF1 ou qualquer combinação dos mesmos ou qualquer outro promotor que esteja ativo em uma célula de mamífero.

[0145] Em algumas modalidades, o vetor é submetido à transfecção ou infectado na célula. Os métodos de introdução do vetor na célula não são cruciais e qualquer método pode ser usado para fornecer expressão suficiente do polipeptídeo de rhAC na célula.

[0146] Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula não é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de hamster. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula pode ser cultivada em um ambiente livre de soro ou substancialmente livre de soro. Em algumas modalidades, a célula é derivada de uma célula CHO-K1. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de murganho. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mieloma de murganho. Em algumas modalidades, a célula é uma célula NS0. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz que é administrada é conforme descrita no presente documento, acima e abaixo.

[0147] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada conforme descrito no presente documento. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada a um indivíduo por via oral, por inalação, por instilação intranasal, por via tópica, transdérmica, parenteral, subcutânea, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intramuscular, intrapleural, intraperitoneal, intratecal ou por aplicação a uma membrana mucosa.

[0148] Conforme usado no presente documento, o termo "rhAC" se refere à ceramidase ácida humana recombinante. Em algumas modalidades, a rhAC compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0149] Em algumas modalidades, a rhAC é uma proteína que é uma proteína que é um homólogo da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a sequência é conforme definida no número de acesso do GenBank NM_177924.3 ou NM_177924.4, dentre os quais cada um é incorporado a título de referência na sua totalidade. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser a sequência completa mostrada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou pode ser simplesmente a região de codificação da sequência. A região de codificação, por exemplo, pode ser os nucleotídeos 313 a 1.500 da SEQ ID NO: 2 ou a região de codificação correspondente encontrada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. No entanto, conforme é bem conhecido pelas pessoas versadas na técnica, o código genético é degenerado e, portanto, outros códons podem ser usados para codificar a mesma proteína sem haver afastamento do conteúdo revelado. Uma vez que a sequência de aminoácidos é conhecida, qualquer sequência de nucleotídeos que codifique a sequência de aminoácidos é aceitável. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos compreende um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos codificada pelos nucleotídeos 313 a 375 da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1-21 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida não compreende um peptídeo sinal, tal como o peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO:

1. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é removido durante um processo pós-tradução em que a enzima é processada em suas diferentes subunidades. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é otimizada por códon para a célula que é a proteína que é expressa. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma subunidade alfa, uma subunidade beta e semelhantes. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo dos resíduos de aminoácidos 22 a 142, 45 a 139, 134 a 379, 143 a 395 ou 1 a 395 de SEQ ID NO: 1. O peptídeo pode ser uma única proteína ou um polipeptídeo de diferentes sequências para formar a enzima. Em algumas modalidades, a proteína está livre de resíduos de aminoácidos 1 a 21. Essas regiões podem ser codificadas por uma única sequência de nucleotídeos ou sequências de nucleotídeos separadas ou uma combinação de sequências de nucleotídeos. Conforme discutido no presente documento, qualquer sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser usada e não se limita à sequência descrita no presente documento como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

[0150] Em algumas modalidades, a rhAC tem atividade de ceramidase ácida (AC), porém não tem nenhuma atividade de esfingomielinase ácida detectável. A atividade de esfingomielinase ácida pode ser removida, por exemplo, por inativação por calor. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 20160038574, que é incorporada no presente documento em sua totalidade. A inativação por calor também pode remover outras proteínas contaminantes de uma preparação de rhAC.

[0151] O termo "homólogo" se refere a sequências de proteínas que têm entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma sequência de referência. A identidade percentual entre duas cadeias peptídicas pode ser determinada por alinhamento em pares, com o uso das configurações padrão do módulo AlignX do Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, Califórnia). Em algumas modalidades, o homólogo tem pelo menos ou cerca de 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade em relação a uma sequência descrita no presente documento, tal como a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína é entregue às substituições conservativas do indivíduo em comparação a uma sequência descrita no presente documento. As substituições conservativas exemplificativas não limitativas são mostradas na Tabela 4 e estão incluídas no escopo da matéria revelada. Também podem ser feitas substituições para melhorar a função da enzima, por exemplo, estabilidade ou atividade enzimática. As substituições conservativas produzirão moléculas com características funcionais e químicas semelhantes às moléculas nas quais essas modificações são feitas. Exemplos de substituições de aminoácidos são mostrados na Tabela 4 abaixo. TABELA 4: SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS EXEMPLIFICATIVOS: Resíduo Original Substituições Conservativas Exemplificativas Ala Val, Leu, Ile Arg Lys, Gln, Asn Asn Gln Asp Glu Cys Ser, Ala Gln Asn Gly Pro, Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe Leu Ile, Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, Gln, Asn Met Leu, Phe, Ile Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Pro Ala Ser Thr, Ala, Cys Thr Ser Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala

[0152] Conforme usado no presente documento, "ceramidase ácida inativa", "AC inativa" ou "precursor de ceramidase ácida inativa", "precursor de AC inativa" ou (pré-proteína de AC) se refere à proteína precursora de AC que não foi submetida à clivagem autoproteolítica na forma ativa. Os precursores adequados de AC inativa e de ACs ativas para uso na ceramidase ácida recombinante desses e de todos os aspectos da presente invenção podem ser homólogos (isto é, derivados da mesma espécie) ou heterólogos (isto é, derivados de uma espécie diferente) ao tecido, células e/ou indivíduo que é tratado. As proteínas precursoras de ceramidase ácida (por exemplo, AC) sofrem clivagem autoproteolítica na forma ativa (composta pelas subunidades α e β). O mecanismo de clivagem e ativação da CA humana é relatado em (Shtraizent, 2008). Isso é promovido pelo ambiente intracelular e, com base em sequências altamente conservadas no local de clivagem das proteínas precursoras da ceramidase entre as espécies, é esperado que ocorra na maioria dos tipos de células, senão em todas. Desse modo, a ceramidase, conforme usado no presente documento, inclui proteínas precursoras de ceramidase ativa, em que as proteínas precursoras de ceramidase são convertidas em proteínas de ceramidase ativas através de clivagem autoproteolítica. São contempladas tanto modalidades nas quais a proteína precursora é absorvida pela célula de interesse e convertida em ceramidase ativa pela mesma quanto modalidades nas quais a proteína precursora é convertida em ceramidase ativa por uma célula ou agente diferente (presente, por exemplo, em um meio de cultura).

[0153] As proteínas precursoras de ACS ativas e AC inativa que podem ser usadas nesse e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas apresentadas na Tabela 1 do documento nº US 2016/0038574 cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

TABELA 1 DO DOCUMENTO Nº US 2016/0038574 (NO

PRESENTE DOCUMENTO INCORPORADA A TÍTULO DE REFERÊNCIA EM SUA TOTALIDADE) Membros Exemplificativos da Família da Ceramidase Ácida Homo sapiens Caenorhabditis elegans Uni Prol Q1351O, Q9H715. Q96AS2 UniProt 045686 OMIM 228000 IntAct 045686 Gene do NCBI 427 Gene do NCBI 173120 RefSeq do NCBI NP 808592. NP 004306 RefSeq do NCBI NP 493173 RefSeq do NCBI NM_ 177924. NM_004315 RefSeq do NCBI NM 060772 UniGene do NCBI 427 UniGene do NCBI 173120 Acesso do NCBI Q13510.AAC 73009, Acesso do NCBI 045686, CABO5556 AAC50907 Mus musculus Danio rerio Uni Prol Q9WV54. Q3U8A7. Q78P93 UniProt Q5XJR7 Gene do NCBI 11886 Gene DO NCBI 450068 RefSeq do NCBI NP 062708 RefSeq do NCBI NP .001006088 RefSeq do NCBI NM_019734 RefSeq do NCBI NM_001006088 UniGene do NCBI 11886 UniGene do NCBI 450068 Acesso do NCBI AK151208, AK034204 Acesso do NCBI AAH83231. CB360968 Gallus gallus Rattus norvegicus UniProt Q5ZK58 UniProt Q6P7S1.Q9EQJ6 Gene do NCBI 422727 Gene do NCBI 84431 RefSeq do NCBI NP 001006453 RefSeq do NCBI NP 445859 RefSeq do NCBI NM-001006453 RefSeq do NCBI NM 053407 UniGene do NCBI 422727 UniGene do NCBI 84431 Acesso do NCBI CAG31885, AJ720226 Acesso do NCBI AAH6154O.AF214647 Pan troglodytes Gene do NCBI 464022 RefSeq do NCBI XP_519629 RefSeq do NCBI XM_519629 UniGene do NCBI 464022

[0154] As proteínas precursoras de ACS ativas e AC inativa que podem ser usadas nesse e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas apresentadas na Tabela 1 de Schuchman, E. H. (inventor), Icahn School of Medicine em Mount Sinai (Requerente), 11 de fevereiro de 2016, Therapeutic Acid Ceramidase

Compositions And Methods Of Making And Using Them, publicado como Pedido de Patente Publicado nº U.S. 2016/0038574 A1.

[0155] Em uma modalidade, a ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) na forma ativada é usada para o tratamento da doença de Farber. As subunidades alfa e beta da rhAC ativada são unidas por uma ligação de dissulfeto. A molécula é uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) derivada de células CHO-M submetidas à transfecção com um vetor plasmídico de DNA que expressa rhAC. Em uma modalidade, o rhAC se baseia no código UniProtKB: Q13510.

[0156] Em uma modalidade, a ceramidase ácida (rhAC) produzida de maneira recombinante é purificada até uma pureza de forma ativada a pelo menos 95% por um processo que compreende as etapas de submeter a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante a pelo menos duas etapas de cromatografia selecionadas a partir de i) cromatografia de troca catiônica; ii) cromatografia de interação hidrofóbica (HIC); e iii) cromatografia de troca aniônica; e submeter a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante em solução a uma ou mais etapas de inativação viral, em que a solução de rhAC é titulada a um pH de 3,7 ou menos. Em uma modalidade, a sequência de proteínas de rhAC corresponde à SEQ ID NO: 1.

[0157] Em uma modalidade, a purificação de rhAC pode ser realizada de acordo com os processos revelados em PCT/2018/052463, depositado em 24 de setembro de 2018, que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade. O efeito terapêutico do RVT-801rhAC foi estabelecido em um modelo de murganho da doença grave de Farber (He, et al, 2017) e foi caracterizado em múltiplos estudos com parâmetros que descrevem impactos positivos em resultados histopatológicos e imunológicos, junto de redução concomitante de ceramidas acumuladas.

[0158] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante purificada tem uma pureza de pelo menos 90%, 93%, 95%, 98% ou 99% ou uma pureza de 100%.

[0159] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida produzida de maneira recombinante purificada não tem atividade de esfingomielinase ácida detectável.

[0160] Em algumas modalidades, a atividade de esfingomielinase ácida da ceramidase ácida produzida de forma recombinante é removida sem o uso de calor.

[0161] O termo "em combinação com", conforme usado no presente documento, significa que os agentes descritos podem ser administrados a um indivíduo juntos em uma mistura, concomitantemente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem. O termo "em combinação com", conforme usado no presente documento, significa que os agentes descritos podem ser administrados a um indivíduo juntos em uma mistura, concomitantemente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.

[0162] Conforme descrito no presente documento, em algumas modalidades, a proteína é produzida a partir de uma célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de Ovário de Hamster Chinês, "célula CHO". Uma sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas descritas no presente documento pode ser DNA ou cDNA genômico ou RNA (por exemplo, mRNA) que codifica pelo menos uma das proteínas descritas no presente documento. O uso de cDNA exige que os elementos de expressão gênica apropriados para a célula hospedeira sejam combinados com o gene, a fim de alcançar a síntese da proteína desejada. A utilização de sequências de cDNA pode ser vantajosa em relação às sequências genômicas (que contêm íntrons), em que as sequências de cDNA podem ser expressas em bactérias ou outros hospedeiros que não possuem sistemas de splicing de RNA apropriados. Uma pessoa versada na técnica pode determinar o melhor sistema para expressar a proteína.

[0163] Em algumas modalidades, a proteína é produzida de acordo com a Publicação de Pedido de Patente nº U.S.

20160038574, que é incorporada a título de referência em sua totalidade.

[0164] Devido ao fato de que o código genético é degenerado, mais de um códon podem ser usados para codificar um aminoácido específico. Com o uso do código genético, um ou mais oligonucleotídeos diferentes podem ser identificados, dentre os quais cada um pode codificar as sequências de aminoácidos descritas no presente documento.

[0165] A enzima que é administrada ao indivíduo para tratar a doença de Farber, ou uma afecção associada à mesma, pode ser purificada. O termo “purificado(a)" com referência a uma proteína se refere a uma proteína que é substancialmente livre de outro material que está associado à molécula em seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína purificada é substancialmente livre do material celular ou de outras proteínas da célula ou tecido do qual é derivada. O termo se refere a preparações em que a proteína isolada é suficientemente pura para ser analisada ou pelo menos 70% a 80% (em p/p) pura, pelo menos 80% a 90% (em p/p) pura, 90 a 95% pura; e, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em p/p) pura. Em algumas modalidades, a proteína é purificada a partir de uma célula, tal como, porém sem limitação, uma célula de CHO. ADMINISTRAÇÃO, COMPOSIÇÕES E KITS QUE

COMPREENDEM AS PROTEÍNAS

[0166] Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais proteínas descritas no presente documento a um indivíduo com doença de Farber ou com suspeita de ter doença de Farber.

[0167] O tratamento de sujeitos pode compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas descritas no presente documento.

[0168] As proteínas podem ser fornecidas em um kit,

conforme descrito no presente documento.

[0169] As proteínas podem ser usadas ou administradas sozinhas ou em mistura com uma terapêutica adicional. Exemplos de terapêuticos adicionais incluem, porém sem limitação, inibidores da esfingomielinase ácida (por exemplo, amitriptilina (Becker et al., “Acid Sphingomyelinase Inhibitors Normalize Pulmonary Ceramide and Inflammation in Cystic Fibrosis”, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 42: 716 a 724 (2010), que é incorporado no presente documento a título de referência na sua totalidade) e inibidores das ceramidas sintases (por exemplo, Shiffmann et al., “Inhibitors of Specific Ceramide Synthases”, Biochimie, 94:558 a 565 (2012), que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). A terapêutica adicional também pode ser misturas de ceramidase descritas na Publicação de Pedido de Patente nº U.s. 20160038574, que é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.

[0170] Embora as terapias de reposição enzimática (ERTs) possam ser eficazes, conforme mostrado no presente estudo atual para a doença de Farber, no qual foi demonstrada a redução do acúmulo de CA, os anticorpos podem se desenvolver contra o fármaco, isto é, a enzima de reposição que pode reduzir sua eficácia. No presente contexto, foi mostrado que doses repetidas são bem toleradas, o que sustenta um regime de tratamento de administração repetida da enzima de reposição, resultando na redução dos sintomas da doença, particularmente a enzima que é produzida de acordo com os métodos descritos no presente documento e, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente nº U.S. 20160038574.

[0171] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento da doença de Farber em um indivíduo com necessidade do mesmo compreendem administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz cerca de uma vez por semana, uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou uma vez um mês, por cerca de 10, cerca de 20 ou cerca de 30 semanas, 1, 5,

10 ou 25 anos, ou durante a vida de um paciente.

[0172] Os veículos adequados e a formulação e embalagem dos mesmos são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21ª edição, Troy, D. edição, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (2005) Capítulos 40 e 41). Métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregados para controlar a duração da ação. As preparações de liberação controlada podem ser alcançadas com o uso de polímeros para complexar ou absorver os compostos. Outro método possível para controlar a duração da ação por preparações de liberação controlada é incorporar os compostos em partículas de um material polimérico, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, poli(ácido lático) ou copolímeros de etileno-acetato de vinila. Alternativamente, em vez de incorporar esses agentes em partículas poliméricas, é possível aprisionar esses materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente ou em sistemas de entrega de fármacos coloidais, por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas ou em macroemulsões.

[0173] Os dispositivos de entrega exemplificativos incluem, sem limitação, nebulizadores, atomizadores, lipossomas (incluindo técnicas de entrega de fármaco tanto ativas quanto passivas) (Wang et al., 1997, pH-sensitive immunoliposomes mediate target-cell-specific delivery and controlled expression of a foreign gene in mouse, Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 84:7851 a 5); Bangham et al., 1965, Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids, J. Mol. Biol. 13:238 a 52; Hsu C.C. (inventor), Genentech, Inc. (cessionária), 5 de agosto de 1997, Method for preparing liposomes, publicado como Patente nº U.S. 5.653.996; Lee, K.-D., et al. (inventores), Presidente e Parceiros da Faculdade de Harvard e Universidade da Pensilvânia, Intracellular delivery of macromolecules,

publicado como Patente nº U.S. 5.643.599; Holland J.W. (inventor), Universidade da Colúmbia Britânica, Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes, publicado como Patente nº U.S. 5.885.613; Dzau, V. J. e Kaneda, Yasufumi (inventores), Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes, publicado como Patente nº U.S. 5.631.237; e Loughrey, et al. (inventores), The Liposome Company (cessionária), Preparation of targeted liposome systems of a defined size distribution, publicado como Patente nº U.S. 5.059.421; Wolff et al., 1984, The use of monoclonal anti-Thy1 IgG1 for the targeting of liposomes to AKR-A cells in vitro and in vivo, Biochim. Biophys. Acta 802:259 a 73), emplastros transdérmicos, implantes, composições injetáveis de depósito de proteína e seringas. Outros sistemas de entrega que são conhecidos dos especialistas na técnica também podem ser empregados para realizar a entrega desejada de ceramidase ao órgão, tecido ou células desejadas

[0174] De modo geral, caso haja administração de uma dose sistêmica da proteína, é desejável fornecer ao receptor uma dosagem de proteína que esteja na faixa de cerca de 1 ng/kg a 100 ng/kg, 100 ng/kg a 500 ng/kg, 500 ng/kg a 1 µkg, 1 µkg /kg a 100 µkg /kg, 100 µkg /kg a 500 µkg /kg, 500 µkg/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 50 mg/kg, 50 mg/kg a 100 mg/kg, 100 mg/kg a 500 mg/kg (peso corporal do destinatário), embora uma dose mais baixa ou mais alta possa ser administrada.

[0175] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de rhAC que é administrada é de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 30 mg/kg a cerca de 40 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 40 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9 ou 10 mg/kg.

[0176] Em algumas modalidades, a um indivíduo diagnosticado com doença de Farber a rhAC é administrada a cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC ou cerca de 2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC a cada duas semanas. Em uma modalidade, a dosagem aumenta de 1 mg/kg ou 2 mg/kg para 5 mg/kg na semana 4. Caso um nível de dose não seja tolerado por um indivíduo, a dose para esse indivíduo pode ser reduzida de 2 mg/kg para 1 mg/kg ou 5 mg/kg para 2 mg/kg, conforme apropriado. A rhAC pode ser administrada a cada 2 semanas por pelo menos 10, 20 ou 30 semanas ou pela duração da vida do indivíduo. Em uma modalidade exemplificativa, um indivíduo é diagnosticado com doença de Farber e é identificado como tendo: 1) nódulos subcutâneos; e/ou 2) um valor de atividade da ceramidase ácida em glóbulos brancos, fibroblastos de pele cultivados ou outras fontes biológicas (por exemplo, plasma) que é inferior a 30% dos valores de controle; e/ou 3) alterações nucleotídicas nos dois alelos do gene ácido ceramidase (ASAH1) que indicam, através de estudos bioinformáticos, de expressão gênica e/ou outros métodos, uma possível perda de função da proteína ácida ceramidase. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado rhAC a cada duas semanas por 28 semanas. Em algumas modalidades, a entrega de rhAC é por infusão intravenosa (por exemplo, infusão de solução salina). Em algumas modalidades, com início em cerca de 2 mg/kg e aumentado para cerca de 5 mg/kg de rhAC (por exemplo, para 5 mg/kg na semana 4).

[0177] Em modalidades adicionais, são revelados métodos para tratar inflamação associada à doença de Farber em um indivíduo com necessidade do mesmo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg a cerca de 5 mg/kg ou cerca de 2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg em, por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês repetir doses por pelo menos 10 ou pelo menos 20 semanas, por 28 semanas, ou durante a vida do indivíduo. Em algumas modalidades, a administração é por infusão intravenosa. Em uma modalidade, o método de tratamento da doença de Farber em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg a cerca de 5 mg/kg ou cerca de 2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg em, por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês, repita as doses por pelo menos 10 ou 20 semanas, por 28 semanas ou pela duração da vida do indivíduo.

[0178] A dosagem pode ser administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês. Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez por semana. O tratamento também pode ser administrado em um esquema de doses únicas ou em um esquema de doses múltiplas, no qual um curso primário de tratamento pode ser de 1 a 10 doses separadas, seguido por outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e reforçar a resposta, por exemplo, uma vez por semana, durante 1 a 4 meses, para uma segunda dose e, caso necessário, uma dose subsequente (ou várias doses subsequentes) após diversos meses. Exemplos de cronogramas de tratamento adequados incluem: (i) 0,1 mês e 6 meses, (ii) 0,7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses ou outros cronogramas suficientes para elicitar as respostas desejadas esperadas para reduzir os sintomas da doença ou reduzir a gravidade da doença. Outros esquemas de tratamento, tais como, porém sem limitação, os descritos acima, também podem ser usados.

[0179] Em determinados aspectos da revelação, o tratamento é iniciado quando o indivíduo é recém-nascido, com menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos de idade ou entre 1 e 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 60, 70 ou 80 anos (por exemplo, entre 1 e 2, entre 1 e 3 etc.). Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 16 e 61 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 16 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 12 e 69 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 12 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 19 e 74 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 19 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 4 e 62 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 4 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 7 e 42 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 7 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 1 e 6 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento quando recém-nascido. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento com 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 6 e 43 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 6 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 5 e 31 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento aos 5 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 5 e 57 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 5 e 29 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 1 e 3 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento no primeiro ano de vida. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 10 e 70 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo inicia o tratamento com 10 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo tem entre 5 e 80, entre 10 e 70, entre 20 e 75, entre 5 e 60 ou entre 5 e 30 anos de idade.

[0180] Em algumas modalidades, a um indivíduo diagnosticado com doença de Farber a rhAC é administrada a cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC ou cerca de 2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC a cada duas semanas. Em uma modalidade, a dosagem aumenta de 1 mg/kg ou 2 mg/kg para 5 mg/kg na semana 4. Caso um nível de dose não seja tolerado por um indivíduo, a dose para esse indivíduo pode ser reduzida de 2 mg/kg para 1 mg/kg ou 5 mg/kg para 2 mg/kg, conforme apropriado. A rhAC pode ser administrada a cada 2 semanas por pelo menos 10, 20 ou 30 semanas ou pela duração da vida do indivíduo. Em uma modalidade, um indivíduo é diagnosticado com doença de Farber e é identificado como tendo: 1) nódulos subcutâneos; e/ou 2) um valor de atividade da ceramidase ácida em glóbulos brancos, fibroblastos de pele cultivados ou outras fontes biológicas (por exemplo, plasma) que é inferior a 30% dos valores de controle; e/ou 3) alterações nucleotídicas nos dois alelos do gene ácido ceramidase (ASAH1) que indicam, através de estudos bioinformáticos, de expressão gênica e/ou outros métodos, uma possível perda de função da proteína ácida ceramidase. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado rhAC a cada duas semanas por 28 semanas. Em algumas modalidades, a entrega de rhAC é por infusão intravenosa (por exemplo, infusão de solução salina). Em algumas modalidades, com início em cerca de 2 mg/kg e aumentado para cerca de 5 mg/kg de rhAC (por exemplo, para 5 mg/kg na semana 4).

[0181] Por exemplo, a administração sítio-específica pode ser para um compartimento ou cavidade do corpo, tal como intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intraperitoneal, intracardíaco, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

[0182] As composições terapêuticas descritas no presente documento podem ser preparadas para uso para administração parentérica (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outra administração particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas. A formulação também pode ser adequada para uma formulação injetável. Em algumas modalidades, a formulação injetável é estéril. Em algumas modalidades, a formulação injetável é livre de pirogênio. Em algumas modalidades, a formulação está livre de outros anticorpos que se ligam a outros antígenos que não sejam um antígeno descrito no presente documento.

[0183] A composição terapêutica também pode incluir adjuvantes, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis e pode estar na forma sólida ou líquida, tais como comprimidos, cápsulas, pós, soluções, suspensões ou emulsões. Tais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais foram usados em várias composições de terapia de reposição enzimática e incluem, sem limitação, citrato trissódico, ácido cítrico, albumina sérica humana, manitol, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, polissorbato, cloreto de sódio, histidina, sacarose, trealose, glicina e/ou água para injeções. Em algumas modalidades, os sais são hidratos (por exemplo, di-hidratado de citrato trissódico, mono-hidratado de ácido cítrico, mono-hidratado monobásico de fosfato sódico e/ou hepta-hidratado dibásico de fosfato sódico).

[0184] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada conforme descrito no presente documento. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada a um indivíduo por via oral, por inalação, por instilação intranasal, por via tópica, transdérmica, parenteral, subcutânea, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intramuscular, intrapleural, intraperitoneal, intratecal ou por aplicação a uma membrana mucosa.

[0185] As composições terapêuticas descritas no presente documento podem ser preparadas para uso para administração parentérica (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outra administração particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas. A formulação também pode ser adequada para uma formulação injetável. Em algumas modalidades, a formulação injetável é estéril. Em algumas modalidades, a formulação injetável é livre de pirogênio. Em algumas modalidades, a formulação está livre de outros anticorpos que se ligam a outros antígenos que não sejam um antígeno descrito no presente documento.

[0186] Uma proteína de rhAC com capacidade para tratar a doença de Farber ou outra afecção associada à atividade ou ao uso de rhAC para tratar uma patologia relacionada à rhAC deve ser fornecida a indivíduos em uma quantidade suficiente para afetar uma redução, resolução ou melhoria no sintoma relacionado ou patologia. Essa patologia inclui os sintomas da doença de Farber, conforme descrito no presente documento em um indivíduo. Uma quantidade é considerada suficiente ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para "afetar" a redução dos sintomas caso a dosagem, rota de administração e esquema de dosagem do agente sejam suficientes para influenciar tal resposta. As respostas à proteína podem ser medidas por análise dos tecidos, órgãos ou células do indivíduo como por técnicas de imageamento ou por análise ex vivo de amostras teciduais. O anticorpo é fisiologicamente significativo, caso a presença do mesmo resulte em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Em algumas modalidades, uma quantidade é uma quantidade terapeuticamente eficaz caso seja uma quantidade que possa ser usada para tratar, melhorar ou inibir sintomas da doença de Farber a qual um indivíduo é submetido. Exemplos não limitativos de tais quantidades são fornecidos no presente documento, porém não devem ser limitados a essa quantidade, caso o contexto exija outra quantidade.

[0187] As proteínas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que esses materiais, ou derivados funcionais dos mesmos, são combinados em mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável.

[0188] Uma proteína de rhAC com capacidade para tratar a doença de Farber ou outra afecção associada à atividade ou ao uso de rhAC para tratar uma patologia relacionada à rhAC deve ser fornecida a indivíduos em uma quantidade suficiente para afetar uma redução, resolução ou melhoria no sintoma relacionado ou patologia. Essa patologia inclui os sintomas da doença de Farber, conforme descritos no presente documento, em um indivíduo. Uma quantidade é considerada suficiente ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para "afetar" a redução dos sintomas caso a dosagem, rota de administração e esquema de dosagem do agente sejam suficientes para influenciar tal resposta. As respostas à proteína podem ser medidas por análise dos tecidos, órgãos ou células do indivíduo como por técnicas de imageamento ou por análise ex vivo de amostras teciduais. O anticorpo é fisiologicamente significativo, caso a presença do mesmo resulte em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Em algumas modalidades, uma quantidade é uma quantidade terapeuticamente eficaz caso seja uma quantidade que possa ser usada para tratar, melhorar ou inibir sintomas da doença de Farber a qual um indivíduo está submetido. Exemplos não limitativos de tais quantidades são fornecidos no presente documento, porém não devem ser limitados a essa quantidade, caso o contexto exija outra quantidade.

[0189] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada por qualquer um dentre os seguintes meios:

[0190] • Variação percentual da linha basal na contagem líquida de nódulos (≥5 mm) após tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0191] • Variação percentual da linha basal na contagem líquida de nódulos (≥10 mm) e comparação ao placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0192] • Variação percentual da linha basal na contagem total de nódulos (independentemente do tamanho) e comparação ao placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0193] • Alteração e mudança percentual da linha basal da amplitude de movimento articular em articulações selecionadas e comparação com placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0194] • Mudança e mudança percentual da linha basal da distância de caminhada de 6 minutos e comparação ao placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0195] • Alteração e mudança percentual da linha basal dos testes de função pulmonar e comparação ao placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0196] • Mudança e mudança percentual da linha basal do escore FDT e comparação ao placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas;

[0197] • Mudança e mudança percentual da linha basal na pontuação Z do peso corporal e altura para a idade durante o tratamento com rhAC ou placebo por 28 semanas.

[0198] Em algumas modalidades, a farmacocinética de RVT-801 após a administração em camundongos Farber ou camundongos saudáveis em doses diferentes é avaliada com base em métodos não compartimentais. Os métodos farmacocinéticos não compartimentais estimam a exposição a um medicamento estimando-se a área sob a curva de um gráfico de concentração-tempo, entre outros, com as seguintes métricas conhecidas na técnica:

TABELA 5 Características Descrição Dose (D) Quantidade do fármaco administrado Área Sob a A integral da curva concentração-tempo: 𝑡+𝜏 Curva (AUC) AUC0-τ = ∫𝑡 𝐶 𝑑𝑡 Meia-vida de O tempo necessário para a concentração do fármaco atingir eliminação (t1/2) metade do seu valor original: t1/2 = ln(2) 𝑘𝑒 Cmax Concentração máxima observada Tmax Tempo máximo de concentração observada máxima Tlast Tempo de concentração quantificável final AUClast Área sob a curva concentração-tempo do instante 0 até o último instante quantificável Vz/F Volume aparente da distribuição após a administração extravascular CL/F Depuração aparente após administração extravascular

[0199] Em algumas modalidades, a eficácia tecido- específica do tratamento é avaliada determinando-se a farmacocinética tecido- específica de RVT-801 com base nos métodos farmacocinéticos não compartimentais descritos acima.

[0200] Em algumas modalidades, a Dose Equivalente Humana (HED) de RVT-801 correspondente à dose eficaz para camundongos com doença de Farber é estimada. As avaliações não clínicas da HED no presente documento se basearam em dois métodos: 1) orientação da FDA para escalonamento entre espécies não clínicas e seres humanos por área de superfície corporal (BSA) e 2) razões órgão:peso corporal entre espécies de fígado e baço como os principais tecidos para o acúmulo de ceramida e nos quais a captação de RVT-801 predominou.

[0201] Escalonamento por área de superfície corporal: A HED, em comparação à MED de camundongo Farber (dose máxima eficaz) e com base na BSA e no peso corporal de um adulto ou criança humana (em que HED = dose animal * (peso corporal/peso corporal humano), 0,33 indica uma dose de ~ 0,81 mg/kg para um adulto de 60 kg e ~ 1,2 mg/kg para uma criança de 15 kg.

[0202] Escalonamento por razões órgão:peso corporal: os estudos PK demonstraram que o mecanismo de liberação da vasculatura está associado à captação e/ou distribuição nos tecidos, desse modo, a razão entre peso tecidual e peso corporal pode impactar a dose, e o modelo de BSA pode não ser suficientemente preditivo por conta própria. Usando HED = MED * (Tecidohumano/ Bwhumano)/(Tecidodeecamdunongo/ Bwdecamudongo) uma dose de 10 mg/kg no camundongo é equivalente a uma dose de ~ 3 a 5 mg/kg em um ser humano adulto ou a uma dose de ~ 4 a 5 mg/kg em uma criança de 15 kg com base no fígado e no baço em seres humanos adultos e crianças.

[0203] Em algumas modalidades, a HED pode ser determinada combinando-se as duas abordagens de escalonamento acima.

[0204] Além disso, são fornecidos kits, que são descritos no presente documento e a seguir, que são úteis realizar as modalidades descritas no presente documento. Em algumas modalidades, os kits compreendem um primeiro recipiente que contém ou que está embalado em combinação com os polipeptídeos descritos acima. O kit também pode compreender outro recipiente que contém ou que está embalado em soluções de associação necessárias ou convenientes para realizar as modalidades. Os recipientes podem ser produzidos a partir de vidro, plástico ou papel alumínio e podem ser um frasco, garrafa, bolsa, tubo, bolsa etc. O kit também pode conter informações escritas, tais como procedimentos para realizar as modalidades ou informações analíticas, tais como a quantidade de reagente contida no primeiro recipiente significa. O recipiente pode estar em outro aparelho de recipiente, por exemplo, uma caixa ou um saco, junto de as informações escritas.

[0205] Ainda outro aspecto no presente documento previsto é um kit para o tratamento da doença de Farber. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um recipiente que compreende um polipeptídeo de rhAC ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o mesmo. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente que compreende uma célula que está configurada para expressar rhAC. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de CHO. Em algumas modalidades, o kit compreende meios condicionados de uma célula que expressa a rhAC. Em algumas modalidades, os meios condicionados são de uma célula de CHO.

[0206] A matéria será descrita agora com referência aos exemplos a seguir. Esses exemplos são fornecidos apenas a título de ilustração e as reivindicações não devem, de modo algum, ser interpretadas como limitadas a esses exemplos, porém devem ser interpretadas de modo a abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado do ensinamento fornecido no presente documento. As pessoas versadas na técnica reconhecerão prontamente vários parâmetros não cruciais que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS

[0207] Seleção de Animais e Coleta de Amostras

[0208] Os camundongos Farber (Asah1P361R/P361R) e os camundongos CD-1 de tipo selvagem com a mesma idade (cepa parental de Asah1P361R/P361R) foram mantidos, de acordo com He et al., 2017, que é incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0209] O sangue total, fígados, pulmões e baços foram coletados de camundongos Farder e do tipo selvagem de 4 a 8 semanas com mesma idade (n=3) para caracterização por citometria de fluxo.

[0210] As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais por grupo por punção cardíaca ou outros meios aprovados para gerar o volume máximo de amostra de sangue de cada camundongo. As amostras de sangue foram coletadas em frascos de Heparina de Lítio individuais e invertidas suavemente várias vezes para dispersar o anticoagulante. As amostras de sangue foram separadas em duas alíquotas iguais. Uma alíquota foi congelada para perfil lipídico subsequente. A segunda alíquota foi colocada em um tubo de poliestireno adequadamente rotulado e colocada em gelo até o processamento para citometria de fluxo.

[0211] Os tecidos foram coletados na necropsia imediatamente após a coleta da amostra terminal de sangue. Fígados completos, intactos, baço e pulmão foram coletados de até três (3) animais por grupo. Cada tecido foi removido e seco suavemente. Cada tecido foi colocado em um frasco individual pré-marcado que foi massificado (com tampa) antes da coleta tecidual. Foi medida a massa do frasco tampado que inclui o tecido. Nenhum tampão, conservante ou antibiótico foi adicionado aos tecidos. Foram relatadas massas de tecido (isto é, amostra + massa do frasco - massa do frasco). Antes do congelamento do tecido, uma porção do fígado, do baço e do pulmão (aproximadamente 0,025 g) destinada para análise por citometria de fluxo foi removida e colocada em uma placa de Petri de poliestireno de tamanho adequado que contém 3 a 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4; Gibco). As placas de Petri que contêm amostras foram armazenadas em gelo até o processamento em uma suspensão de célula única para fins exploratórios. A massa usada para citometria de fluxo foi registrada. Imediatamente após a determinação da massa de cada peça, todas as amostras de tecido destinadas à análise lipídica foram congeladas para armazenamento a -70 ºC antes do envio para o laboratório de bioanalítica.

[0212] Processamento tecidual para suspensão de célula única

[0213] (a) Sangue

[0214] Um volume igual de PBS foi adicionado a cada amostra de sangue, e 2 ml de Solução de Lise a 1X FACS (BD Bioscience) também foram adicionados. A amostra foi submetida suavemente a vórtice e incubada por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente e lavada por uma centrífuga três vezes. As células foram suspensas novamente a 20 x 106 células/ml em Tampão de Ensaio (Soro de Rato Normal a 5% (NRS) em PBS). As amostras foram armazenadas em gelo até a marcação.

[0215] (b) Baço e Fígado

[0216] Com o uso da porção fosca de duas lâminas de microscópio, o baço ou tecido hepático foi homogeneizado. As lâminas foram com a PBS fornecida na placa de Petri para garantir que todas as células fossem coletadas na PBS. Após a homogeneização, toda a PBS (agora contendo células únicas, assim como pequenos pedaços de tecido) foram colhidos e filtrados homogeneizados através de um tubo Falcon com filtro integrado. Após a centrifugação a 300 x g por 5 minutos e após a remoção do sobrenadante, as células foram suspensas novamente em 100 μl de PBS, seguido pela adição de 2 ml de Solução de Lise a 1X FACS. Em seguida, a suspensão celular foi submetida suavemente à vórtice e incubada por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após lavagem por centrifugação três vezes, as células foram suspensas novamente a 20 x 106 células/ml em Tampão de Ensaio (5% de NRS em PBS). As amostras foram armazenadas em gelo até a marcação.

[0217] (c) Pulmão

[0218] Os meios de digestão foram preparados com Meio RPMI 1640 (Suplemento GlutaMAX™, Thermo Fischer Scientific), 1 mg/ml Collagenase II (Fisher Scientific) e DNAseI a 5 U/ml (Sigma). O pulmão foi cortado em pequenos pedaços e suspenso em 5 ml de meio de digestão por pulmão em uma placa de Petri e foi incubado com agitação a 37 ºC por aproximadamente 1,5 hora (porém não mais de 2 horas). Com o uso da porção fosca de duas lâminas de microscópio, o tecido pulmonar foi homogeneizado. As lâminas estavam com os meios de digestão fornecido na placa de Petri para garantir que todas as células sejam coletadas. Após a homogeneização, todos os meios de digestão (que, agora, contêm células únicas, assim como pequenos pedaços de tecido) foram colhidos e filtrados homogeneizados através de um tubo Falcon com filtro integrado. Após a centrifugação a 300 x g por 5 minutos e após a remoção do sobrenadante, as células foram suspensas novamente em 100 μl de PBS, seguido pela adição de 2 ml de Solução de Lise a 1X FACS. Em seguida, a suspensão celular foi submetida suavemente à vórtice e incubada por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após lavagem por centrifugação três vezes, as células foram suspensas novamente a 20 x 106 células/ml em Tampão de Ensaio (5% de NRS em PBS). As amostras foram armazenadas em gelo até a marcação.

[0219] Marcação de Amostra de Citometria de Fluxo

[0220] O procedimento de coloração foi realizado conforme o seguinte: 1:200 live/dead Zombie red foi adicionado às células após coloração primária de acordo com as instruções do fabricante. Após a marcação de marcadores de superfície e após a identificação de populações vivas/mortas, as células foram suspensas novamente em 300 µl de BD FACS/Fixador de Lise para lisar quaisquer glóbulos vermelhos. Os controles foram usados no estudo de otimização de anticorpos. Um conjunto de anticorpos para a marcação das amostras foi preparado conforme a seguir.

TABELA 6

Painel de citometria de fluxo para avaliar subpopulações celulares derivadas de monócitos Marcador Clone Fluoróforo Empresa Nº de catálogo CCR2 SA203G11 BV421 150605 CD68 FA-11 Alexa647 137004 CDllc N418 BV711 117349 MHCII M5/114.15.2 BV510 107635 CD86 GL-1 BV605 105037 CD206 C068C2 Alexa488 141710 CDllb Ml/70 BV650 BioLegend 101259 CD45 104 PE-Cy7 109830 Ly6G 1A8 APC-Cy7 127624 Lv6C HK1.4 PE-CF594 128044 CX3CR1 SA011F11 PE 149006 F4/80 BM8 PE-Cy5 123112 CD23 B3B4 Alexa700 101632 Marcador Vermelho Thermo NA L34972 live/dead Fixável Fisher

TABELA 7 Painéis de citometria de fluxo para avaliar subpopulações celulares de linfócitos Marcador Clone Fluoróforo Empresa Nº do catálogo CDS 500A2 Alexa700 152316 CD19 6D5 Alexa488 115521 CD4 GK1.5 APC-Cy7 100414 CDS 43-6.7 BV650 100742 CD62L MEL-14 BV605 104438 CD44 IM7 PE 10300S CD45 104 PE-Cy7 BioLegend 109S30 CCR7 4B12 PE-Cy5 120114 CD 127 A7R34 BV711 135035 MHCH M5114.15.2 BV510 107635 CD3S 90 Alexa647 102716 CCR6 BV421 29-2L17 129S1S CXCR3 CXCR3-173 PE-CF594 126534 Marcador Vermelho Thermo NA L34972 live/dead fixável Fisher

[0221] O volume de anticorpos usados foi determinado durante um experimento de titulação. Foram adicionados 100 μl de amostras de células a uma placa de fundo em V de 96 poços. Um conjunto de controles de coloração única (100 μl/poço) foi preparado para compensação e um conjunto de controles de fluorescência menos um (FMO) foi preparado para cada tecido com o uso de amostras reunidas de todos os animais. As placas foram centrifugadas a 500 x g por 5 minutos. O tampão foi removido, e as amostras foram suspensas novamente com 100 μl de Bloco TruStain FcX a

1 μg/ml (BioLegend, 101320)) por aproximadamente 10 minutos em gelo. Após essa incubação, 100 μl do conjunto de anticorpos apropriado foram adicionados a cada amostra e as placas de amostra foram cobertas e incubadas por aproximadamente 30 minutos em gelo. Em seguida, as placas de amostra foram centrifugadas a 500 x g por 5 minutos para remover o sobrenadante. As células foram suspensas novamente em 200 μl de tampão de ensaio (5% de NRS em PBS). As placas de amostra foram centrifugadas a 500 x g por 5 minutos para remover o sobrenadante, e as células foram suspensas novamente em 200 μl de tampão fixador (BD Bioscience, 339860). As amostras foram armazenadas cobertas a 4 ºC.

OBTENÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRAS POR CITOMETRIA DE FLUXO

[0222] As amostras foram obtidas em um instrumento BD Bioscience LSRII com o uso de o software Diva. Amostras marcadas únicas foram usadas para o ajuste apropriado das tensões para garantir relação sinal-ruído ideal, aplicação da matriz de compensação e identificação apropriada de todos os canais de fluoróforo. Um milhão de eventos ou o volume máximo da amostra foram registrados para cada amostra. Os dados da citometria de fluxo obtidos foram analisados com o uso do software FlowJo v10.

RESULTADOS

[0223] Os dados da citometria de fluxo foram analisados para comparar a composição celular e a situação de ativação no sangue e fígado, baço e tecidos pulmonares, coletados de camundongos Farber com 4 a 8 semanas de idade (Asah1 P361R/P361R) e camundongos do tipo selvagem com a mesma idade.

AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE EM TECIDOS

[0224] Os ensaios de citometria de fluxo, conforme mostrado nas Figuras 1 a 5B, mostram informações sobre a distribuição celular aparente e sobre o estado geral da saúde celular nos camundongos do tipo selvagem. Deve-se observar que os monócitos são identificados como SSCmidFSCmid. Quaisquer alterações nessa distribuição podem indicar o estado da doença.

[0225] O baço mostrou diferenças notáveis na viabilidade celular entre camundongos Farber e camundongos do tipo selvagem. A viabilidade reduzida do baço em camundongos Farber, em comparação aos controles do tipo selvagem, pode estar relacionada ao efeito direto da ceramida ou a processos inflamatórios (Figuras 2A e 2B). A viabilidade pulmonar nos camundongos Farber foi semelhante aos controles do tipo selvagem (Figuras 3A e 3B), que podem refletir a capacidade de distinguir apenas um único estágio da morte celular. Foi observada viabilidade hepática e sanguínea semelhantes em camundongos Farber em comparação aos controles do tipo selvagem (Figuras 4A, 4B, 5A e 5B). CD45+

[0226] O aumento da frequência de células de leucócitos (CD45+) ou alterações na distribuição celular são mediadas em grande parte por inflamação ou infecção crônica. Mudanças notáveis foram feitas com relação à % de células CD45+ e à composição do compartimento CD45+ em camundongos Farber e em camundongos do tipo selvagem. As Figuras 6A, 6B, 7A e 7B comparam a população de leucócitos (células CD45 +) e monócitos (SSCmid/FSCmid) no baço e sangue entre camundongos Farber com 4 e 8 semanas de idade e camundongos do tipo selvagem com a mesma idade. A frequência de leucócitos (células CD45+) permaneceu a níveis comparativamente semelhantes no baço. Conforme mostrado nas Figuras 7A e 7B (indicadas por setas), a frequência de monócitos aumentou em camundongos Farber em comparação aos camundongos do tipo selvagem. Além disso, a frequência de monócitos aumentou mais de 5 vezes no baço de camundongos Farber em comparação ao tipo selvagem. Isso se correlaciona com a frequência periférica, o que reflete as mudanças no tecido do baço. MHCII-CD11BHI (MONÓCITOS ATIVADOS)

[0227] Os monócitos/granulócitos são divididos adicionalmente em subpopulações efetoras. (Misharinet al, Am J Respir Cell Mol Biol. Outubro de 2013; 49(4):503 a 10). Entre os subconjuntos, a população de MHCII-CD11bhi indica os monócitos ativados. Conforme mostrado na Figura 9A, o aumento marcado na população de MHCII -CD11bhi com diminuição concomitante de MHCII-CD11bmid foi observado no pulmão de camundongos Farber em comparação ao tipo selvagem. Semelhantemente, conforme mostrado na Figura 9B, foi observado um aumento marcado na população de MHCII-CD11bhi no baço de camundongos Farber em comparação ao tipo selvagem (Figura 9B e 10A). Essa frequência aumentada no tecido também é refletida no sangue (Figura 10B). Essas constatações da frequência aumentada de monócitos ativados (MHCII-CD11bhi) no tecido e na periferia de camundongos Farber (Figura 11) apoiam o MHCII-CD11bhi como um marcador de fenótipo imunológico para a doença de Farber. MHCII+CD11B-LY6C+ (LINHAGEM DE MONÓCITOS PRÓ-INFLAMATÓRIA)

[0228] O MHCII+CD11b- pode ser subdividido adicionalmente em Ly6C+/-. Os monócitos Ly6C+ têm maior probabilidade de se diferenciarem em pró-inflamatórios. Os monócitos Ly6C- estão mais propensos a se diferenciar em macrófagos M2 e a serem anti-inflamatórios. Conforme mostrado na Figura 13A, o subconjunto pró-inflamatório Ly6C+ das populações MHCII+ CD11b- aumentou no pulmão de camundongos Farber em comparação aos camundongos do tipo selvagem. Frequência semelhante de células pró- inflamatórias Ly6C+ no baço e no sangue de camundongos Farber. (Figura 12B e 13B). Essas constatações mostram que o ambiente inflamatório in situ pode promover ainda mais a geração de células pró-inflamatórias. Nos camundongos Farber, esse aumento de macrófagos pró-inflamatórios e células dendríticas também foi detectado no sangue, o que apoia o MHCII - CD11bhiLy6C+ como marcador periférico da doença de Farber. MHCII-CD11BHICD86+ (MACRÓFAGOS PRÓ-

INFLAMATÓRIO ATIVADO E CÉLULAS DENDRÍTICAS)

[0229] As Figuras 14A e 14B mostram marcadores de ativação CD23, CD68 e CD86 na população de CD11b+MHC-DC aumentados no pulmão de camundongos Farber em comparação a camundongos de tipo selvagem. Em particular, a expressão aumentada de CD86 na população de MHC-CD11b+ em camundongos Farber (Figura 14B, painel direito) indica a capacidade de iniciar as células para induzir o recrutamento e ativação de células imunológicas, perpetuando uma resposta inflamatória. Esse resultado apoia o MHCII-CD11bhi CD86+ como um marcador de fenótipo imunológico para a doença de Farber. CD11B+CD38+ E CD11B+CD206+ (POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGOS)

[0230] Os camundongos Farber têm um aumento nos macrófagos pró-inflamatórios e uma diminuição nos macrófagos anti- inflamatórios (Figura 15A e 15B). A polarização dos macrófagos é regulada pelo meio das citocinas e pela fonte de nutrientes. As citocinas/quimiocinas são moléculas de sinalização celular que podem conduzir a quimiotaxia e induzir alterações celulares nas células-alvo. CD11B+LY6G+ (NEUTRÓFILOS)

[0231] Conforme mostrado nas Figuras 16 a 19 e 20A a 20D, todos os pulmões, baço e fígado de camundongos Farber apresentaram frequência aumentada de neutrófilos (CD11b +Ly6G+) às 4 semanas de idade (aumento de 2 a 7 vezes em comparação ao tipo selvagem). O aumento de neutrófilos foi o fator de diferenciação mais notável entre camundongos Farber e camundongos do tipo selvagem nos tecidos (consultar a Tabela 8 abaixo). Um aumento precoce e robusto da infiltração de neutrófilos pode ajudar a impulsionar a resposta imunológica subsequente, incluindo o recrutamento de monócitos contribuindo, assim, para a patologia em camundongos Farber através da produção de citocinas pró-inflamatórias.

[0232] Além disso, conforme mostrado na Figura

20D, o aumento na frequência de neutrófilos residentes nos tecidos também foi refletido no sangue de camundongos Farber, apoiando CD11b +Ly6G+ como um forte marcador de fenótipo para a doença de Farber. CD19B-CD3+ (CÉLULAS T)

[0233] Conforme mostrado nas Figuras 21 a 24, todo o baço, pulmão e sangue de camundongos Farber apresentaram frequência diminuída de células T (CD19b-CD3+) tanto nas 4 semanas quanto nas 8 semanas (Figura 24). Essa constatação é consistente com a observação anterior de destruição substancial da estrutura do timo e diminuição das células T tímicas em camundongos Farber (Dworski et al., 2015) e dependência de esfingosina-1-fosfato na regulação do desenvolvimento de linfócitos e migração para os intestinos. (Kunisawa et al., 2007.) CD19B+CD38+ (CÉLULAS B ATIVADAS)

[0234] Conforme mostrado nas Figuras 25 e 27A, os Camundongos Farber têm uma Frequência Aumentada de Células B no Baço, conforme evidenciado por CD19+. Dentro do compartimento de células B no baço, os camundongos Farber apresentaram uma frequência aumentada de células B ativadas (jato de plasma), conforme evidenciado por CD38 + (Figuras 26 e 27B). A Frequência Aumentada de Células B Ativadas foi refletido na periferia, conforme mostrado nas Figuras 28, 29A e 29B. A diminuição em células T provavelmente está relacionada à destruição do timo, ao passo que o aumento das células B ativadas é provavelmente devido a uma abundância de células apresentadoras de antígenos. A cinética das células T e das células B sugere que a resposta é secundária à infiltração e ativação de monócitos (e subpopulações derivadas) e neutrófilos. CD45HISSHI (EOSINÓFILOS OU BASÓFILOS)

[0235] No pulmão de camundongos Farber, a frequência geral de células imunológicas diminuiu em comparação a camundongos do tipo selvagem em qualquer idade (Figura 30A). Em particular, as células CD45hiSShi (Figura 30A, contornos pretos) desapareceram completamente nos camundongos Farber.

[0236] No fígado de camundongos Farber, a frequência de células imunológicas era geralmente baixa nos camundongos Farber e no tipo selvagem (Figura 30B). O fígado tem uma estrutura histológica complexa que consiste principalmente em hepatócitos (CD45-) 70% do componente celular hepático), com linfócitos intra-hepáticos (IHL) que constitui 16 a 22% das células não parenquimatosas restantes (30%). As células CD45+SShi em camundongos Farber com 8 semanas de idade aumentaram ligeiramente em comparação a camundongos Farber com 4 semanas de idade e camundongos WT em qualquer idade. MHCII+CD11BMIDCD23+

[0237] O CD23 é expresso em células B maduras, macrófagos ativados, eosinófilos, células dendríticas foliculares e plaquetas. A perda de células CD23+ é indicativa de ativação no baço e pulmão de camundongos Farber. Não foi encontrado CD23 na amostra de sangue.

TABELA 8 AS MUDANÇAS AVALIADAS EM CAMUNDONGOS FARBER COM 8 SEMANAS DE IDADE VS. IRMÃOS DE NINHADA DO TIPO SELVAGEM.

Conjunto de Tipo de célula Pulm Baç Fígad Sang Cumul marcadores ão o o ue ativo CD11b+Ly6G+ Neutrófilo 5 5 2a5 5 +++ SSCmidFSCmid Monócitos - 5 5 5 +++ (Tamanho) aparentes MHCII- Monócitos 2a5 5 5 1a2 +++ CD11bhi ativados CD11b+CD20 mΦ e DCs anti- (1 a 2) - - (5) (++) 6+ inflamatórios MHCII+CD11b mΦ e DCs pró- 1a2 - - 2a5 + -Ly6C+ inflamatórios MHCII- mΦ e DCs pró- - (1 a 2) - (+) CD11bmid inflamatórios - CD23+ ativados MHCII- mΦ e DCs pró- 1a2 - - 1a2 + CD11bhi inflamatórios CD86+ ativados CD11b+CD38+ mΦ e DCs pró- 1a2 2a5 - 5 +++ inflamatórios CD19+CD38+ Células B - 2a5 - 2a5 ++ ativadas (PBs) CD19-CD3+ Total de células (5) (2 a - (2 a 5) (+++) T 5)

[0238] A Tabela 8 fornece o resumo dos marcadores identificados para o diagnóstico da doença de Farber. Em comparação às amostras de controle dos camundongos com a mesma idade, “1 a 2” indica uma mudança de 1 a 2 vezes na expressão do marcador, “2 a 5” indica uma mudança de 2 a 5 vezes, “>5” indica uma mudança maior que 5 vezes e “-” indica “não testado ou determinado”. A pontuação “cumulativa” é uma soma da expressão do marcador em todos os quatro tecidos e amostras de sangue, e “+++” indica uma mudança maior que 5 vezes, “++” indica uma mudança de 3 a 4 vezes e “+” indica uma mudança menor que 3 vezes. Os parênteses indicam uma mudança ou diminuição negativa em comparação ao controle de tipo selvagem.

[0239] A caracterização da população de monócitos revelou um aumento acentuado na frequência de células MHCII-CD11bhiLy6C+. Essas células foram altamente ativadas, conforme evidenciado pela expressão de CD86 e inclinadas em direção a um fenótipo pró-inflamatório M1, com base na expressão de CD38. Foi identificada uma diminuição concomitante nos macrófagos M2 anti-inflamatórios CD206+. Além do compartimento de macrófagos, um aumento profundo de neutrófilos no baço, fígado e pulmão foi evidente às 4 semanas de idade (2 a 7 vezes vs. tipo selvagem). Também foram observadas diferenças marcantes no compartimento imunológico adaptativo, com um claro aumento na frequência dos jatos de plasma (precursores das células plasmáticas produtoras de imunoglobulinas), provavelmente secundários ao aumento de monócitos pró-inflamatórios.

IMPRESSÃO DIGITAL IMUNOLÓGICA

[0240] As Figuras 33A a 33D mostram exemplos de impressão digital imunológica com base em todos os subconjuntos identificados no pulmão, baço, fígado e sangue de camundongos Farber.

[0241] Estudos adicionais serão conduzidos para delinear os efeitos do rhAC sobre os fenótipos imunológicos dos tecidos de camundongos Farber tratados com rhAC. Os tecidos podem ser marcados com os marcadores acima identificados usados para diagnosticar a doença de Farber listados nas Tabelas 2, 3 e 7, incluindo marcadores pró-inflamatórios (por exemplo, CD38, Ly6G) e marcadores anti-inflamatórios (por exemplo, CD206) e marcadores de pan-monócitos (por exemplo, CD11b).

[0242] Exemplo 2. O camundongo Farber do tipo selvagem e o camundongo Farber tratado com uma ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801) foram analisados quanto à composição da população de células imunológicas. O modelo de camundongo Farber foi usado, visto que é um modelo de camundongo “knock-in” estabelecido em um segundo plano W4/129Sv/CD-1 com uma mutação missense de nucleotídeo único identificada em um paciente com início grave de FD para criar um animal Asah1P361R/P361R que produziu uma versão não funcional da ceramidase ácida. Este modelo de doença recapitula a infiltração monocítica de múltiplos tecidos e, portanto, é útil para estudar o ambiente imunológico da doença de Farber com o uso de esse modelo de doenças.

[0243] Os camundongos Farber (genótipo confirmado por PCR) foram dosados com doses intraperitoneais (IP) 4 vezes por semana de ceramidase ácida humana recombinante (RVT-801) a 10 mg/kg/dose, começando logo após o desmame (3 a 4 semanas de idade) e foram sacrificados para necropsia após a 4ª e última administração de RVT- 801 (com 7 semanas de idade). Os camundongos do tipo selvagem de controle e Farber não foram dosados com veículo, e três animais de controle de cada genótipo foram submetidos à necrópsia, e as amostras foram coletadas para avaliação às 4 ou 8 semanas de idade. Nos instantes indicados, os camundongos Farber e controles irmãos de ninhada (WT) foram colhidos para avaliar a composição de células imunológicas em tecidos-chave do acúmulo de ceramida (baço, fígado e pulmão). Além disso, foi coletado sangue para correlacionar a inflamação específica do tecido na periferia. As amostras foram processadas em uma suspensão de célula única, marcadas de acordo com a Tabela 9 (Painel 1) e com a Tabela 10 (Painel 2) descritas abaixo e foram executadas em uma citômetro de fluxo BD LSRII. As amostras marcadas únicas (microesferas de compensação) e as amostras de fluorescência menos uma (FMO) serviram como controle para o estudo. Os arquivos de dados brutos foram analisados com o uso de FlowJo v10 e uma estratégia de bloqueio representativa é mostrada nas Figuras 34A a 34E.

[0244] Resultados. As populações das Figuras 34A a 34E foram demarcadas primeiramente no tamanho (SSC x FSC) para remover dejetos celulares do processamento (Figura 34A). Essa população foi demarcada adicionalmente com base nas células vivas e mortas para remover a população de células positiva para o corante vermelho Zombie (Figura 35B). Em seguida, as células vivas foram demarcadas para selecionar a população de CD45+ (Figura 34C). Essa população foi demarcada adicionalmente para determinar a porcentagem de células CD45+ que duplamente positivas para Ly6G e CD11b; ou neutrófilos (Figura 34D). A população restante foi selecionada e demarcada para selecionar a população CD11b+MHCII- para determinar a população de monócitos ativados por tipo de amostra (Figura 34E). Isso foi feito para amostras de sangue total, baço, fígado e pulmão dessa maneira com o uso de FlowJo v10. As amostras de pulmão foram demarcadas posteriormente para seleção de macrófagos ativados. TABELA 9 Painel de Neutrófilos Marcador Clone Fluoróforo CCR2 SA203G11 BV421 CD68 FA-11 Alexa647 CD11c N418 BV711 MHCII M5/114.15.2 BV510 CD86 GL-1 BV605 CD206 C068C2 Alexa488 CD11b M1/70 BV650 CD45 104 PE-Cy7 Ly6G 1A8 APC-Cy7 Ly6C HK1.4 PE-CF594 CX3CR1 SA011F11 PE F4/80 BM8 PE-Cy5 CD23 B3B4 Alexa700

TABELA 10 Painel de Monócitos Marcador Clone Fluoróforo CD3 500A2 Alexa700 CD19 6D5 Alexa488 CD4 GK1.5 APC-Cy7 CD8 43-6.7 BV650 CD62L MEL-14 BV605 CD44 IM7 PE CD45 104 PE-Cy7 CCR7 4B12 PE-Cy5 CD127 A7R34 BV711 MHCII M5/114.15.2 BV510 CD38 90 Alexa647 CCR6 BV421 29-2L17 CXCR3 CXCR3-173 PE-CF594

[0245] Exemplo 3. Populações de células imunológicas esplênicas. Os resultados estão representados nas Figuras 35A e B. As populações de células inflamatórias que são características de um estado inflamatório foram analisadas a partir dos baços de rato selvagem e Farber de controle, com 4 e 8 semanas de idade. A população de neutrófilos CD45+ Ly6GCD11b duplamente positivos e monócitos ativados CD45 + CD11b+MHCII- foi determinada a partir de camundongos Farber com 7 semanas de idade que receberam 10 mg/kg/dose de RVT-801 uma vez por semana, a partir de 3 semanas de idade, durante um total de 4 doses ao longo de 4 semanas. A análise do mapa de calor das diferenças em fold-change na frequência das células imunológicas no baço de camundongos Farber e controles de irmão de ninhada (WT) de idade compatível. Cada coluna representa um animal individual. Fold-change foi calculada ajustando-se o valor médio WT para 1.

[0246] Exemplo 4. Populações de células imunológicas sistêmicas (sangue). Os resultados estão representados nas

Figuras 36A a 36C. As populações de células inflamatórias características de um estado inflamatório foram analisadas a partir de amostras de sangue de rato selvagem e Farber com 4 e 8 semanas de controle. A população de Ly6G, neutrófilos CD45+ duplamente positivos CD11b e monócitos ativados CD11b+MHCII- CD45+ foram determinados de camundongos Farber com 7 semanas de idade que receberam 10 mg/kg/dose de RVT-801 uma vez por semana começando em 3 semanas de idade por um total de 4 doses durante 4 semanas. Análise do mapa de calor das diferenças de mudança de dobra na frequência das células imunológicas no sangue de camundongos Farber e controles de irmão de ninhada (WT) com a mesma idade. Cada coluna representa um animal individual. Fold-change foi calculada ajustando-se o valor médio WT para 1.

[0247] Exemplo 5. Populações de células pulmonares imunológicas. Os resultados estão representados nas Figuras 37A a 37D. As populações de células inflamatórias características de um estado inflamatório foram analisadas a partir do tecido pulmonar de controle e com pulmão de camundongo Farber de 4 e 8 semanas de idade. A população de Ly6G, neutrófilos CD45+ duplamente positivos CD11b e monócitos ativados CD11b+MHCII- CD45+ foram determinados de camundongos Farber com 7 semanas de idade que receberam 10 mg/kg/dose de RVT-801 uma vez por semana começando em 3 semanas de idade por um total de 4 doses durante 4 semanas. A análise de mapa de calor de diferenças de fold-change na frequência de células imunológicas no pulmão de camundongos Farber com mesma idade e controles de irmãos de ninhada (WT). Cada coluna representa um animal individual. Fold-change foi calculada ajustando-se o valor médio WT para 1. Na Figura 37C é relatada, também, uma população de macrófagos adicionais que é CD45+Ly6C-MHCII+CD11b-.

[0248] Exemplo 6. Populações de células imunológicas hepáticas. Os resultados estão representados nas Figuras 38A a 38B. As populações de células inflamatórias características de um estado inflamatório foram analisadas a partir de tecido de fígado de rato selvagem e Farber de controle com 4 e 8 semanas de idade. A população de Ly6G/CD11b, neutrófilos CD45+ duplamente positivos CD11b e monócitos ativados CD11b+ hiMHCII- CD45+ foram determinados de camundongos Farber com 7 semanas de idade que receberam 10 mg/kg/dose de RVT-801 uma vez por semana começando em 3 semanas de idade por um total de 4 doses durante 4 semanas.

[0249] As referências discutidas no presente pedido, que são incorporadas a título de referência em sua totalidade, com o propósito destinado, o que fica claro com base em seu contexto.

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[0285] As revelações de cada patente, pedido de patente, publicação e número de acesso mencionados no presente documento são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.

[0286] Embora a presente revelação tenha sido revelada com referência a várias modalidades, é evidente que outras modalidades e variações da mesma podem ser criadas por outras pessoas versadas na técnica sem haver afastamento do verdadeiro espírito e escopo da revelação. As reivindicações anexas devem incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.

EQUIVALENTES

[0287] O relatório descritivo escrito acima é considerado suficiente para permitir que uma pessoa versada na técnica pratique as modalidades. A descrição e exemplos anteriores detalham certas modalidades e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. No entanto, ficará evidente que não importa o quão detalhado o conteúdo acima possa aparecer no texto, a modalidade pode ser praticada de várias maneiras e deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

[0288] Conforme usado no presente documento, o termo cerca de se refere a um valor numérico, incluindo, por exemplo, números inteiros, frações e porcentagens, independentemente de estarem indicados explicitamente ou não.

O termo cerca de se refere, de modo geral, a uma faixa de valores numéricos (por exemplo, +/- 5 a 10% da faixa citada) que uma pessoa versada na técnica considerar equivalente ao valor citado (por exemplo, tendo a mesma função ou resultado). Quando termos como pelo menos e aproximadamente precedem uma lista de valores ou intervalos numéricos, os termos modificam todos os valores ou intervalos fornecidos na lista.

Em alguns casos, o termo cerca de pode incluir valores numéricos arredondados para a figura significativa mais próxima.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar se um indivíduo tem doença de Faber, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende detectar o nível de pelo menos um marcador selecionado a partir de CD11b+Ly6G+, SSCmid FSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ em uma amostra biológica de um indivíduo, em que caso o nível de CD11b+Ly6G+, SSCmid FSCmid, MHCII- CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+ seja superior a um controle, o indivíduo tem doença de Faber; e caso o nível de CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e de CD19-CD3+ seja inferior a um controle, o indivíduo tem doença de Faber.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar o nível de MHCII+CD11b- Ly6C+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b- Ly6C+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar o nível de MHCII- CD11bhiCD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII- CD11bhiCD86+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar o nível de CD11b+CD38+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+CD38+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o nível de CD11b+CD206+ em uma amostra do indivíduo, sendo que um nível de CD11b+CD206+, que é inferior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar o nível de CD11b+Ly6G+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD11b+Ly6G+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o nível de CD19+CD38+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19+CD38+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar o nível de CD19-CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19-CD3+, que é inferior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é realizada detectando-se os níveis de MHCII+CD11b-Ly6C+ e MHCII-CD11bhiCD86+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de MHCII+CD11b-Ly6C+ e/ou MHCII-CD11bhiCD86+, que é superior a um nível de controle, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é realizada detectando-se o nível de CD19+CD38+ em um do indivíduo e detectando-se adicionalmente um nível de CD19-CD3+ em uma amostra do indivíduo, em que um nível de CD19+CD38+, que é superior a um nível de controle, e/ou um nível de CD19-CD3+ inferior a um nível de controle, e a detecção combinada, indica que o indivíduo tem doença de Faber.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é realizada detectando-se os níveis de pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez marcadores, selecionado a partir de CD11b+Ly6G+, SSCmid FSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-

CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ para determinar se um indivíduo tem doença de Faber.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de extrato tecidual ou uma amostra de sangue.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida do fígado, baço, pulmão ou sangue.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica útil no tratamento de doença de Faber.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC).

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a rhAC está em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.

17. Kit caracterizado pelo fato de que é para realizar o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, junto de instruções para uso no diagnóstico da doença de Faber.

18. Kit, de acordo com a reivindicação 17, sendo que o kit é caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente ao marcador CD11b +Ly6G+, SSCmid FSCmid, MHCII- CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ ou CD19-CD3+.

19. Método para tratar doença de Faber, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: detectar um nível de pelo menos um marcador selecionado a partir de CD11b+Ly6G+, SSCmidFSCmid, MHCII-CD11bhi, MHCII+D11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38++, CD19+CD38+, CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e CD19-CD3+ em uma amostra de um indivíduo, em que caso o nível de CD11b+Ly6G+, SSCmid FSCmid, MHCII- CD11bhi, MHCII+CD11b-Ly6C+, MHCII-CD11bhiCD86+, CD11b+CD38+, CD19+CD38+ seja superior a um controle, o indivíduo tem doença de Faber; e caso o nível de CD11b+CD206+, MHCII+CD11bmidCD23+ e de CD19-CD3+ seja inferior a um controle, o indivíduo tem doença de Faber; e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica útil no tratamento de doença de Faber.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC).

21. Método, de acordo com a reivindicação, 20, caracterizado pelo fato de que a rhAC em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.