CN111971562A - 法伯病标志物及其用途 - Google Patents

Abstract

公开用于法伯病的免疫表型标志物及其用途，以及基于这些标志物诊断和治疗法伯病的方法。

Description

法伯病标志物及其用途

技术领域

用于确定受试者是否患有法伯病的方法和生物标志物。

背景技术

法伯(Farber)病(酸性神经酰胺酶缺乏症、脂肪性肉芽肿)为罕见的溶酶体贮积病症，其由溶酶体酸性神经酰胺酶(ASAH1)基因突变引起。酸性神经酰胺酶负责将神经酰胺降解为鞘氨醇和脂肪酸，而酸性神经酰胺酶活性的缺乏会导致神经酰胺的累积。

白细胞在法伯病的发病机理中起作用。泡沫组织细胞(充满脂质的巨噬细胞和源自单核细胞的群)的组织浸润以及炎症促进形成该疾病所特有的肉芽肿。肉芽肿和神经酰胺诱导的慢性炎性状态都可能导致组织损伤，其中结缔组织和关节、肺、肝、中枢神经系统和次级淋巴器官受到的影响最大。然而，尚未完全开发导致法伯病的免疫细胞发育和活化的表征。

用重组人酸性神经酰胺酶rhAC治疗法伯病的进行性鼠类敲入式Asah1^P361R/P361R模型已经示出减少组织神经酰胺和炎症。2018年1月12日提交的国际申请第PCT/US18/13509号和He等人的《用于法伯病的酶替代疗法：细胞和小鼠中的概念验证研究(Enzymereplacement therapy for Farber disease:Proof-of-concept studies in cells andmice)》《BBA临床(BBA Clin.)》2017年2月13；7:85-96)中的公开内容以全文引用的方式并入。

然而，仍然需要用于法伯病的改善的诊断和治疗。对组织活检进行常规组织学评估以确认法伯病是昂贵的、侵入性的，并且可能导致疼痛、出血甚至死亡。高度期望使用法伯病的免疫表型标志物的简单测试来例如诊断法伯病和/或确定法伯病治疗的功效。本主题满足其它需求，并且将在本文中讨论。

发明内容

根据描述，一些实施方案涉及用于确定受试者是否患有法伯病的方法，该方法包括在来自受试者的生物样品中检测选自以下的至少一种标志物的含量水平：CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺，其中，如果CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照，则受试者患有法伯病；并且如果CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照，则受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺的含量水平，其中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括在检测来自受试者的样品中的MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺CD38⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺CD206⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD206⁺的含量水平低于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平，其中CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺的含量水平，其中CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一个实施方案中，该方法进一步包括检测来自受试者的样品中的CD19^-CD3+的含量水平，其中CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，检测是通过以下来执行：检测来自受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和/或MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。在一些实施方案中，检测是通过以下来执行：检测来自受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺的含量水平，并进一步检测来自受试者的样品中的CD19^-CD3⁺的含量水平，其中CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平和/或CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照含量水平以及组合的检测结果指示受试者患有法伯病。在其它实施方案中，检测是通过以下来执行：检测选自CD11b+Ly6G+、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺中的至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种标志物的含量水平以确定受试者是否患有法伯病。

在一些实施方案中，生物样品是组织提取物样品或血液样品。在一些实施方案中，生物学样品获自肝、脾、肺或血液。

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用治疗有效量的可用于治疗法伯病的药物组合物。在一些实施方案中，该组合物包含重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约50mg/kg的量施用rhAC。

在一些实施方案中，药物组合物包含有效量为约1mg/kg至约10mg/kg的人重组酸性神经酰胺酶。在一些实施方案中，人重组酸性神经酰胺酶是RVT-801。

在一些实施方案中，药物组合物包含有效量为约1mg/kg至约5mg/kg的人重组酸性神经酰胺酶。在一些实施方案中，人重组酸性神经酰胺酶是RVT-801。

另一个实施方案是一种用于执行以上详述的方法中任一个的试剂盒以及用于诊断法伯病的说明。

在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种抗体，所述抗体特异性结合标志物CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺或CD19^-CD3⁺。

另一个实施方案是一种用于治疗法伯病的方法，该方法包括：在来自受试者的样品中检测选自CD11b+Ly6G+、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86+、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII+CD11b^midCD23+和CD19^-CD3⁺的至少一种标志物的含量水平，其中，如果CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86+、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照，则该受试者患有法伯病；并且如果CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照，则受试者患有法伯病；以及施用治疗有效量的可用于治疗法伯病的药物组合物。

在一些实施方案中，该药物组合物包含重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。在一些实施方案中，该药物组合物包含约0.1mg/kg至约50mg/kg的量的rhAC。

另外的目的和优势将在下面的描述中进行部分阐述，并且有些目的和优势将通过描述而变得明显，或可以通过实践而被了解。将借助于所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得所述目的和优势。

应当理解，前述一般描述和下面的详细描述都仅为示例性的和解释性的，并且不限制权利要求。

并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出一个(若干个)实施方案，并且与描述一起用于解释本文所述的原理。

附图说明

图1示出如实施例1中所述的流式细胞术测定，其鉴定用活/死僵尸红(live/deadzombie red)染色的法伯小鼠脾中的白细胞亚群(黑色轮廓示出淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的分布)。

图2A和2B示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的用活/死僵尸红染色的脾提取物的流式细胞术测定(黑色轮廓，活细胞)。

图3A和3B示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的用活/死僵尸红染色的肺提取物的流式细胞术测定(黑色轮廓，活细胞)。

图4A和4B示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的用活/死僵尸红染色的肝提取物的流式细胞术测定(黑色轮廓，活细胞)。

图5A和5B示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的用活/死僵尸红染色的血液的流式细胞术测定(黑色轮廓，活细胞)。

图6A和6B分别示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾和血液的流式细胞术测定。首先基于CD45(常见白细胞标志物)的表达(黑色轮廓)对细胞悬浮液设门，并且针对包括前向散射(FSC)、大小测量和侧向散射(SSC)、细胞粒度测量的物理参数进一步进行设门，以选择单核细胞(SSC^mid/FSC^mid)。图6A示出用于脾的流式细胞术测定。图6B示出用于血液的流式细胞术测定。

图7A和7B分别示出获自图7A和7B的流式细胞术测定的来自4周和8周大的法伯小鼠以及年龄匹配的野生型同窝幼仔的脾和血液中的白细胞(CD45⁺细胞)和单核细胞(SSC^midFSC^mid细胞)的频率。图7A示出脾中的白细胞(CD45⁺细胞)和单核细胞(SSC^midFSC^mid细胞)的频率。图7B示出血液中的白细胞(CD45⁺细胞)和单核细胞(SSC^midFSC^mid细胞)的频率。箭头指示法伯小鼠体内单核细胞群的变化。

图8A和8B分别示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺和脾的流式细胞术测定。基于CD11b(单核细胞/粒细胞系标志物)和MHCII(II类主要组织相容性复合体；抗原呈递分子)的表达对细胞悬浮液设门，以鉴定巨噬细胞和树突细胞(DC)的亚群：MHCII^-CD11b^-、MHCII⁺CD11b^-、MHCII⁺CD11b^mid、MHCII^-CD11b^mid和MHCII^-CD11b^hi。图8A示出用于肺的流式细胞术测定。图8B示出用于脾的流式细胞术测定。

图9A和9B分别示出通过如图8A和8B中所示的流式细胞术测定量化来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺和脾中的巨噬细胞和树突细胞(DC)的以下亚群的频率：MHCII^-CD11b^-、MHCII⁺CD11b^-、MHCII⁺CD11b^mid、MHCII^-CD11b^mid和MHCII^-CD11b^hi。图9A示出肺中巨噬细胞和树突细胞(DC)的亚群的频率的量化。图9B示出脾中巨噬细胞和树突细胞(DC)的亚群的频率的量化。

图10A和10B分别示出如实施例1中所述的用于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肝和血液的流式细胞术测定。基于CD11b(单核细胞/粒细胞系标志物)和MHCII(II类主要组织相容性复合体；抗原呈递分子)的表达对细胞悬浮液设门，以鉴定巨噬细胞和树突细胞(DC)的亚群：MHCII^-CD11b^-、MHCII⁺CD11b^-、MHCII⁺CD11b^mid、MHCII^-CD11b^mid和MHCII^-CD11b^hi。图10A示出用于肝的流式细胞术测定。图10B示出用于血液的流式细胞术测定。

图11示出通过如图8A、8B、10A和10B所示的流式细胞术测定比较肺、脾、肝和血液中MHCII^-CD11b^hi群(活化单核细胞)。箭头指示在法伯小鼠和野生型之间，肺中的单核细胞群增加。

图12A和12B示出如图8A和8B的流式细胞术测定鉴定的MHCII⁺CD11b^-群，基于Ly6C的表达对该群进一步进行设门以分别鉴定MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺(促炎巨噬细胞和DC)和MHCII⁺CD11b^-Ly6C^-。图12A示出肺中的MHCII⁺CD11b^-群。图12B示出脾中的MHCII⁺CD11b^-群。

图13A和13B分别示出来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺和血液的如图12A和12B中鉴定的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺细胞(促炎性巨噬细胞和DC)的比较。图13A示出肺中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺细胞的比较。图13B示出血液中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺细胞的比较。

图14A-B示出来自图8A和8B的流式细胞术测定的MHCII^-CD11b⁺细胞的标志物的表达水平的分布和比较。图14A示出图8A和8B的流式细胞术测定的MHCII^-CD11b⁺细胞的标志物的表达水平的分布，其基于来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺的样品中的标志物(CD23、CD68和CD86(活化巨噬细胞))的表达水平。图14B示出获自如图14A中所示的测量结果的用于CD23、CD68和CD86(活化的巨噬细胞)的如由平均荧光强度(MFI)表示的标志物的表达水平的比较。

图15A-B示出4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的每100,000个血细胞中CD11b⁺CD38⁺细胞(促炎性巨噬细胞和DC)的总计数和频率的比较。图15A示出4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的每100,000个血细胞中CD11b⁺CD38⁺细胞(促炎性巨噬细胞和DC)总计数的比较。图15B示出4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺(左图区)中的CD45b⁺CD206⁺细胞的频率和血液(右图区)中的CD11b⁺CD206⁺的频率。

图16示出对来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺的实施例1的CD45⁺细胞(白细胞)用CD11b⁺和/或Ly6G^+/-进行设门以鉴定中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)和非中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G^-)。

图17示出对来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾的实施例1的CD45⁺细胞(白细胞)用CD11b⁺和/或Ly6G^+/进行设门^-以鉴定中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)和非中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G^-)。

图18示出对来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肝的实施例1的CD45⁺细胞(白细胞)用CD11b⁺和/或Ly6G^+/-进行设门以鉴定中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)和非中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G^-)。

图19示出对来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的血液的实施例1的CD45⁺细胞(白细胞)用CD11b⁺和/或Ly6G^+/-进行设门以鉴定中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)和非中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G^-)。

图20A-20D分别比较根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的如图16-19中所鉴定的在肺、脾、肝和血液中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的频率。图20A比较如图16-19中所鉴定的在肺中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的频率。图20B比较如图16-19中所鉴定的在脾中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的频率。图20c比较如图16-19中所鉴定的在肝中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的频率。图20D比较如图16-19中所鉴定的在血液中的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的频率。

图21示出如实施例1中所述的在4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的CD19^-细胞(非B细胞)，其进一步进行设门以选择CD45和CD3(黑色轮廓)双阳性的T细胞。

图22示出如实施例1中所述的在4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺中的CD19^-细胞(非B细胞)，其进一步进行设门以选择CD45和CD3(黑色轮廓)双阳性的T细胞。

图23示出如实施例1中所述的在4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的血液中的CD19^-细胞(非B细胞)，其进一步进行设门以选择CD45和CD3(黑色轮廓)双阳性的T细胞。

图24比较如图21-23中，在4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝小鼠的脾、肺和血液中分别鉴定的T细胞(CD19^-CD3⁺)群的频率。图24A报告脾中T细胞(CD19^-CD3⁺)群的频率。图24B报告肺中T细胞(CD19^-CD3⁺)群的频率。图24A报告血液中T细胞(CD19^-CD3⁺)群的频率。

图25示出如实施例1中所述的来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾的CD45⁺细胞，基于其中CD19(泛B细胞标志物)(黑色轮廓)的表达而进一步对该CD45⁺细胞进行设门。

图26示出来自根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾的CD45⁺CD19⁺细胞(B细胞)，基于其中CD38(活化的淋巴细胞、浆母细胞标志物)的表达而进一步对该CD45⁺CD19⁺细胞进行设门。

图27A-B分别比较分别如从图25和26的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的B细胞和活化B细胞的频率。图27A比较如从图25中的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的B细胞(CD45⁺CD19⁺)的频率。图27B比较如从图26中的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的活化B细胞或浆母细胞(CD19⁺CD38⁺)的频率。

图28示出来自根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的血液的CD45⁺CD19⁺细胞(B细胞)，基于其中CD38(活化的淋巴细胞、浆母细胞标志物)的表达而进一步对该CD45⁺CD19⁺细胞进行设门。

图29A-B分别比较如从图28中的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的CD45⁺CD19⁺细胞(B细胞)和CD19⁺CD38⁺细胞(活化B细胞或浆母细胞)的频率。图29A比较如从图28中的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的CD45⁺CD19⁺细胞(B细胞)的频率。图29B比较如从图28所示的流式细胞术测定获得的根据实施例1的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾中的CD19⁺CD38⁺细胞(活化的B细胞或浆母细胞)的频率。

图30A和30B分别示出如实施例1中所述的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺和肝的流式细胞术测定，其针对CD45⁺细胞进行设门。黑色轮廓指示CD45^hiSSC^hi群。图30A示出用于如实施例1中所述的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺的流式细胞术测定，其针对CD45⁺细胞进行设门。黑色轮廓指示CD45^hiSSC^hi群。图30B示出用于如实施例1中所述的4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肝的流式细胞术测定，其针对CD45⁺细胞进行设门。黑色轮廓指示CD45^hiSSC^hi群。

图31示出如实施例1中所述的来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的脾的MHCII⁺CD11b^mid细胞，进一步用CD23+(成熟B细胞、活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突细胞和血小板)对该MHCII⁺CD11b^mid细胞进行设门。

图32A-B示出如实施例1中所述的来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺的MHCII⁺CD11b^mid细胞，进一步用CD23+(成熟B细胞、活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突细胞和血小板)对该MHCII⁺CD11b^mid细胞进行设门。图32A示出如实施例1中所述的来自4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺的MHCII⁺CD11b^mid细胞，进一步用CD23+(成熟B细胞、活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突细胞和血小板)对该MHCII⁺CD11b^mid细胞进行设门。图32B示出在4周和8周大的法伯小鼠和野生型同窝幼仔的肺中的来自如图32A中所示的流式细胞术测定的MHCII⁺CD11b^midCD23⁺细胞的频率的比较。

图33A-D示出基于从流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群(包括肺、脾、肝和血液)的免疫指纹。图33A示出基于在根据实施例1的法伯小鼠的肺中的通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。图33B示出基于在根据实施例1的法伯小鼠的脾中的通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。图33C示出基于在根据实施例1的法伯小鼠的肝中的通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。图33D示出基于在根据实施例1的法伯小鼠的血液中的通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。

图34A-E示出如实施例2中所述的用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯“敲入”小鼠中小鼠脾细胞的代表性免疫表型设门策略。图34A-E细胞群，首先基于大小(SSCxFSC)对该细胞群进行设门，以去除来自加工过程的细胞碎片(图34A)。基于活细胞和死细胞进一步对此群进行设门，以去除对僵尸红染料呈阳性的细胞群(图34B)。然后对活细胞进行设门以选择CD45+群(图34C)。进一步对此群进行设门以确定Ly6G和CD11b双阳性的CD45⁺细胞的百分比；或中性粒细胞的百分比(图34D)。剩余群经选择且经设门以针对CD11b⁺MHCII^-群进行选择，以确定每种样品类型的活化单核细胞的群(图34E)。

图35A-C示出野生型(WT)小鼠、(用媒介物(盐水)治疗的法伯“敲入”小鼠或用重复剂量的重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠)的脾免疫细胞群。与野生型脾免疫细胞群相比，对照法伯小鼠的脾免疫细胞数量增加，而在用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠中脾免疫细胞数量减少，如实施例3中所述。图35A示出CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺脾中性粒细胞的细胞群。图35B示出CD45⁺CD11b^hiMHCII^-活化脾单核细胞的细胞群。图35C示出基于在4周和8周的法伯小鼠和4-8周野生型小鼠中通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。

图36A-C示出野生型(WT)小鼠、(用媒介物(盐水)治疗的法伯“敲入”小鼠或用重复剂量的重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠)的全身免疫细胞群。与野生型全身免疫细胞群相比，对照法伯小鼠的全身免疫细胞数量增加，而在用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠中全身免疫细胞数量减少，如实施例4中所述。图36A示出CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺血液中性粒细胞的细胞群。图36B示出CD45⁺CD11b^hiMHCII^-活化血液单核细胞的细胞群。图36C示出基于在4周和8周的法伯小鼠和4-8周野生型小鼠中通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。

图37A-D示出野生型小鼠、用媒介物(盐水)治疗的法伯“敲入”小鼠或用重复剂量的重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠的肺免疫细胞群，与野生型肺免疫细胞群相比，对照法伯小鼠的肺免疫细胞群增加，而在用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠中肺免疫细胞群减少，如实施例5中所述。图37A示出CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺肝中性粒细胞的细胞群。图37B示出CD45⁺CD11b^hiMCHCII^-活化肺单核细胞的细胞群。图37C示出CD45⁺Ly6C⁺MHCII⁺CD11b^-活化肺巨噬细胞的细胞群。图37D示出基于在4周和8周的法伯小鼠和4-8周野生型小鼠中通过流式细胞术测定鉴定的所有细胞亚群的免疫指纹。

图38A-B示出野生型小鼠、用盐水治疗的法伯“敲入”小鼠或用重复剂量的重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠的肝免疫细胞群，与野生型肝免疫细胞群相比，对照法伯小鼠的肝免疫细胞群增加，而在用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠中肝免疫细胞群减少，如实施例6中所述。图38A示出CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺肝中性粒细胞的细胞群。图38B示出CD45⁺CD11b^hiMCHCII^-活化肝单核细胞的细胞群。

序列的描述

表1提供本文引用的某些序列的列表。

在一个实施方案中，“RVT-801”是用于治疗法伯病的呈活化形式的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。活化的rhAC的α和β亚基通过二硫键连接。该分子是重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)，其来源于用表达rhAC的DNA质粒载体转染的CHO-M细胞。Rvt-801基于UniProt KB代码：Q13510。

RVT-801包含通过以下方法纯化至纯度为至少95％的活化形式的重组产生的酸性神经酰胺酶(rhAC)，该方法包括以下步骤：使重组产生的酸性神经酰胺酶经受选自i)阳离子交换色谱；ii)疏水作用色谱(HIC)；和iii)阴离子交换色谱的至少两个色谱步骤；和使溶液中的重组产生的酸性神经酰胺酶经受一个或多个病毒灭活步骤，其中将rhAC溶液滴定至pH为3.7或更小。RVT-801的蛋白质序列对应于SEQ ID NO：1。

在一个实施方案中，rhAC的纯化可以根据2018年9月24日提交的PCT/2018/052463中公开的方法进行，其以全文引用的方式并入本文中。RVT-801rhAC的治疗效果已在重度法伯病的鼠类模型中确认(He等人，2017)，并已在多项研究中被表征，其终点描述对组织病理学和免疫学结果的积极影响以及伴随的累积神经酰胺减少。

可用于本发明的这一方面和所有方面的活性AC和无活性AC前体蛋白质的其它实施方案包括但不限于US 2016/0038574的表1中列出的那些，该申请的内容特此以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，rhAC是蛋白质，该蛋白质是作为SEQ ID NO：1的同源物的蛋白质。

在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：2的核酸分子编码。

在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：3的核酸分子编码。

在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：4的核酸分子编码。

在一些实施方案中，rhAC的序列如GenBank登录号NM_177924.3或NM_177924.4中所定义，其中的每一个均以全文引用的方式并入。编码蛋白质的核苷酸序列可以是SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的完整序列，也可以只是该序列的编码区。举例来说，编码区可以是SEQ ID NO：2的核苷酸313至1500，或在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中发现的相应编码区。然而，如本领域技术人员众所周知的，基因密码是简并的，并且因此可以使用其它密码子来编码相同的蛋白质，而不超出所公开内容的范围。因为氨基酸序列是已知的，所以编码该氨基酸序列的任何核苷酸序列都是可以接受的。

在一些实施方案中，核苷酸序列包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽是由SEQID NO：2的核苷酸313至375编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，产生的蛋白质包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-21的信号肽。

在一些实施方案中，产生的蛋白质不包含信号肽，如SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-21的信号肽。在一些实施方案中，在翻译后加工(其中酶被加工成其不同的亚基)期间去除信号肽。在一些实施方案中，针对从其表达蛋白质的细胞对核苷酸序列进行密码子优化。在一些实施方案中，该蛋白质包含α-亚基、β-亚基等。在一些实施方案中，产生的蛋白质包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸残基22-142、45-139、134-379、143-395或1-395的肽。肽可以是单一蛋白质或具有不同序列以形成酶的多肽。在一些实施方案中，该蛋白质不含氨基酸残基1-21。这些区域可以由单个核苷酸序列或单独的核苷酸序列或核苷酸序列的组合编码。如本文所讨论，编码该蛋白质的任何核苷酸序列可以被使用并且不限于本文描述为SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列。

在一些实施方案中，rhAC具有酸性神经酰胺酶(AC)活性，但是不具有任何可检测的酸性鞘磷脂酶活性，如在以下实施例中产生的rhAC。可以通过例如热灭活来去除酸性鞘磷脂酶活性。参见例如美国专利申请公开第20160038574号，其以全文引用的方式并入本文中。热灭活还可从rhAC制剂中去除其它污染蛋白质。

在一些实施方案中，纯化的重组产生的酸性神经酰胺酶具有至少90％、93％、95％、98％或99％的纯度，或100％的纯度。

在一些实施方案中，纯化的重组产生的酸性神经酰胺酶没有可检测的酸性鞘磷脂酶活性。

在一些实施方案中，在不使用热的情况下去除重组产生的酸性神经酰胺酶的酸性鞘磷脂酶活性。

具体实施方式

本申请包括用于确定受试者是否患有法伯病的标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。在一些实施方案中，提供使用一种或多种标志物确定受试者是否患有法伯病的方法。还公开治疗具有所述标志物的受试者的法伯病的方法。

A.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管在本发明的实践中可使用与本文中描述的方法、装置和材料类似或等效的任何方法、装置和材料，但是本文中描述某些方法、装置和材料。

本领域的技术人员将认识到与本文描述的方法或材料相似或等效的许多方法和材料可以用于实践本发明。本发明决不限制于所描述的方法和材料。

在本文引用的所有公开、公布的专利文件和专利申请特此以引用的方式并入本文中，其引用程度如同每个单独的公开、公布的专利文件或专利申请被具体地和单独地指示为以引用方式并入。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则术语“一个(a/an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。

如本文所用，术语“约”意指该数值是近似的，并且小的变化不会显著影响公开的实施方案的实践。当使用数字限制时，除非上下文另外指出，否则“约”意指数值可以变化±10％并且仍然在所公开的实施方案的范围内。

如本文中所用，术语“动物”包括(但不限于)人类和非人类脊椎动物，如野生动物、家畜和农畜。动物也可以称为“受试者”。

如本文所用，“标志物”和“标志物”可互换使用来指代靶分子，所述靶分子指示或者是个体的正常或异常过程的标志或者个体的疾病或其它状况的标志。更具体地，“标志物”或“标志物”是与特定生理状态或过程(无论是正常的还是异常的，以及如果异常的话，无论是慢性的还是急性的)的存在相关联的解剖、生理、生化或分子参数。标志物可通过包括实验室测定法和医学成像的多种方法来检测和测量。在一些实施方案中，标志物是靶蛋白质。

如本文所用，“标志物含量水平”和“含量水平”是指测量结果，该测量结果使用用于检测生物样品中标志物的任何分析方法来得到，并且指示生物样品中的标志物、用于生物样品中的标志物或与生物样品中的标志物对应的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴定度、含量水平、表达水平、测量含量水平的比率等。“含量水平”的确切属性取决于用于检测标志物的特定分析方法的特定设计和组成。

靶分子的“对照含量水平”或“对照”是指来自未患有疾病或病况的个体或未被怀疑患有疾病或病况的个体的相同样品类型中的靶分子的含量水平。靶分子的“对照含量水平”不需要在每次进行本发明方法时都进行确定，并且可以是先前确定的含量水平，其用作确定特定样品中的含量水平比正常含量水平高或低的参考或阈值。在一些实施方案中，本文描述的方法中的对照含量水平是在一个或多个未患有法伯病的受试者中观察到的含量水平。在一些实施方案中，本文所述方法中的对照含量水平是在多个正常受试者或未患有法伯病的受试者中观察到的平均或均值含量水平，任选地加或减统计变异(statisticalvariation)。

如本文所用，术语“载体”意指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。药学载剂可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学载剂也可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊剂、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。此外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。

如本文所使用，术语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和包含(comprised))、“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或开放性的并且并不排除另外的、未列出的要素或方法步骤。另外，与术语“包含”结合使用的术语也应理解为能够与术语“由……组成”或“基本上由……组成”结合使用。

如本文所用，术语“接触”意指在体外系统或体内系统中使二个要素在一起。例如，使rhAC多肽与个体、受试者或细胞“接触”包括向个体或患者(如人)施用多肽，以及例如将化合物引入到含有细胞或纯化的含多肽制剂的样品中。另外，接触可以指用编码多肽的核酸分子转染或感染细胞。

“诊断(diagnose/diagnosing/diagnosis/)及其变体是指基于一种或多种与个体相关的体征、症状、数据或其它信息来检测、确定或识别个体的健康状况或病况。可以将个体的健康状态诊断为健康/正常(即，诊断为没有疾病或病况)或诊断为不适/异常(即，诊断为疾病或病况存在或评估疾病或病况的特性)。就特定疾病或病况而言,术语“诊断(diagnose/diagnosing/diagnosis)”等涵盖疾病的初始检测；疾病的表征或分类；检测疾病的进展、缓解或复发；以及在对个体施用治疗或疗法后检测疾病反应。法伯病的诊断包括将患有法伯病的个体与未患有法伯病的个体区分开。

递送至受试者的酶的“有效量”是足以改善法伯病的临床病程的量，其中通过所属领域的技术人员众所周知的各种定义的参数中的任一种参数来测量临床改善。

如本文中所用，短语“从X到Y的整数”意指包括端点的任何整数。举例来说，短语“从X到Y的整数”意指1、2、3、4或5。

如本文所用，术语“分离”意指如通过常规技术使本文所述的化合物与(a)天然来源(如植物或细胞)或(b)合成有机化学反应混合物的其它组分分开。

如本文中所用，术语“哺乳动物”意指啮齿动物(即，小鼠、大鼠或豚鼠)、猴、猫、狗、牛、马、猪或人类。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。

如本文所用，短语“药学上可接受的”意指在合理医疗判断范围内适合用于与人和动物的组织接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在一些实施方案中，“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物中，并且更具体用于人类。如本文所使用的，短语“有需要的”意指已将受试者鉴定为需要特定的方法或治疗。在一些实施方案中，鉴定可以通过任何诊断手段来进行。在本文中所述的方法和治疗中的任一者中，受试者可以是有需要的。

如本文所用，术语“纯化的”意指当分离时，分离物含有按分离物的重量计至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的本文描述的化合物。

如本文中所用，可互换地使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”意指任何动物，包括哺乳动物，如小鼠、大鼠、其它啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长类动物，如人类。

如本文所用，短语“基本上分离的”意指化合物与形成或检测到所述化合物的环境至少部分或基本上分开。

如本文中所用，短语“治疗有效量”意指活性化合物或药剂的量，该量引发由研究人员、兽医、医师或其他临床医生在组织、系统、动物、个体或人中所寻求的生物或药物反应。治疗效果取决于有待治疗的病症或所期望的生物效应。因此，治疗效果可以是降低与病症相关的症状的严重程度和/或抑制(部分或完全抑制)病症的进展或改善病症或副作用的治疗，治愈、预防或消除病症或副作用。引发治疗反应需要的量可以基于受试者的年龄、健康状况、身材和性别来确定。最佳的量还可以基于对受试者对治疗的反应进行的监测来确定。

B.标志物

在一些实施方案中，提供一种或多种标志物，以单独使用或以多种组合使用来确定受试者是否患有法伯病。如以下详细描述的，示例性实施方案包括表2中提供的标志物。

表2：评估白细胞衍生的细胞亚群的流式细胞术小组

表2列出十一种标志物，其可用于区分获自患有法伯病的受试者的样品和获自未患有法伯病的受试者的样品。

在一些实施方案中，提供表2中的一种或多种标志物，以单独使用或以多种组合使用来确定受试者是否患有法伯病或确定受试者患有法伯病的可能性。在一些实施方案中，来自表2的一种或多种标志物可用于确定受试者是否患有酸性神经酰胺酶缺乏症、脂肪性肉芽肿和/或神经酰胺诱导的慢性炎性状态。

在一些实施方案中，表2中列出的一种或多种标志物可用于鉴定具有患上法伯病的风险的受试者。在一些实施方案中，表2中列出的一种或多种标志物可用于鉴定具有酸性神经酰胺酶缺乏症、脂肪性肉芽肿和/或神经酰胺诱导的慢性炎性状态的风险的受试者。在一些实施方案中，提供表2中列出的一种或多种标志物，以单独使用或以多种组合使用来确定受试者是否患有法伯病。

在一些实施方案中，提供一组或多组标志物，以单独使用或以多种组合使用来确定受试者是否患有法伯病。如以下详细描述的，示例性实施方案包括表3中提供的标志物组。使用设门策略鉴定标志物组，以鉴定群，该群在流式细胞术测定中表达表2中列出的特定标志物。

表3

标志物组	细胞类型
		CD11b<sup>+</sup>Ly6G<sup>+</sup>	中性粒细胞
SSC<sup>mid</sup>FSC<sup>mid</sup>(大小)	大量单核细胞
		MHCII<sup>-</sup>CD11b<sup>hi</sup>	活化单核细胞
CD11b<sup>+</sup>CD206<sup>+</sup>	抗炎性mΦ&DC
		MHCII<sup>+</sup>CD11b<sup>-</sup>Ly6C<sup>+</sup>	促炎性mΦ&DC
MHCII<sup>-</sup>CD11b<sup>mid</sup>CD23<sup>+</sup>	活化的促炎性mΦ&DC
		MHCII<sup>-</sup>CD11b<sup>hi</sup>CD86<sup>+</sup>	活化的促炎性mΦ&DC
CD11b<sup>+</sup>CD38<sup>+</sup>	促炎性mΦ&DC
		CD19<sup>+</sup>CD38<sup>+</sup>	活化的B细胞(PB)
CD19<sup>-</sup>CD3<sup>+</sup>	总T细胞

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的在表3中列出的至少一组标志物的含量水平，以确定受试者是否患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括确定受试者是否患有法伯病，其包括形成具有来自表3中列出的标志物组的N组标志物的标志物小组，并检测所述小组中的每组标志物在来自受试者的样品中的含量水平，其中N是至少一。在一些实施方案中，N为至少2，或N为至少3，或N为至少4，或N为至少5，或N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10。在一些实施方案中，方法包括检测选自以下项中的至少五组、至少六组、至少七组、至少八组、至少九组或十组标志物的含量水平：CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺，以确定受试者是否患有法伯氏病。

在一些实施方案中，方法包括检测在来自受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺的含量水平，其中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测在来自受试者的样品中的MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺CD38⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD38+的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺CD206⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD206⁺的含量水平低于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平，其中CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺的含量水平，其中CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD19^-CD3⁺的含量水平，其中CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和/或MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺和CD19^-CD3⁺的含量水平，其中CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平并且CD19^-CD3⁺的含量水平高于对照含量水平指示受试者患有法伯病。

本文鉴定的标志物为可用于有效鉴定法伯病的标志物的子集或小组提供多种选项。本文鉴定的标志物为以下标志物的子集或小组提供多种选项，所述标志物可用于有效鉴定酸性神经酰胺酶缺乏症、脂肪性肉芽肿和/或神经酰胺诱导的慢性炎性状态。选择适当数量的这类标志物可以取决于所选标志物的特定组合。另外，在本文所述的任何方法中，除非明确指出，否则标志物小组可以包含未在表2或3中示出的另外标志物。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的在表2中列出的至少一种标志物的含量水平，以确定受试者是否患有法伯病。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的在表3中列出的至少一组，至少两组，至少三组，至少四组，至少五组，至少六组，至少七组，至少八组，至少九组或至少十组标志物的含量水平，其中至少一种标志物的含量水平指示受试者患有法伯病。

在一些实施方案中，与无酸性神经酰胺酶缺乏症的个体相比，标志物在患有酸性神经酰胺酶缺乏症的个体中以不同的含量水平存在。在一些实施方案中，与无脂肪性肉芽肿的个体相比，标志物在患有脂肪性肉芽肿的个体中以不同的含量水平存在。在一些实施方案中，与无神经酰胺诱导的慢性炎性状态的个体相比，标志物在具有神经酰胺诱导的慢性炎性状态的个体中以不同含量水平存在。可以使用对个体中的不同含量水平的标志物进行的检测来例如确定个体是否患有法伯病。

在一些实施方案中，因为使用血液样品的方法是非侵入性的，所以本文所述的标志物中的任一个可用于监测个体是否患上法伯病或监测个体是否具有患上法伯病或酸性神经酰胺酶缺乏症的风险。通过检测到早期阶段的酸性神经酰胺酶缺乏症，医学干预或治疗可更有效，如使用rhAC进行的治疗。

另外，在一些实施方案中，个体中的一种或多种标志物随时间推移的差异表达水平可以指示个体对特定治疗方案的反应。因此，本发明的一个实施方案涉及确定法伯病治疗方案的功效的方法。在一些实施方案中，一种或多种标志物在后续监测期间的表达的变化可以指示特定的治疗有效或可以提出应当调整治疗方案。可以在开始治疗方案之前和/或在治疗方案期间确定一种或多种标志物的表达水平。

除了以独立的诊断测试形式测试标志物含量水平之外，标志物含量水平还可以与其它法伯病筛查或诊断方法结合使用。在一些情况下，使用本文所述的标志物的方法可以有助于医学和经济上调整，以实施针对法伯病的更积极的治疗，更频繁的随访筛查等。标志物还可以用于在以下个体中开始治疗，所述个体具有患上法伯病的风险，但在诊断测试指示他们很可能会出现该疾病的情况下尚未诊断患有法伯病。除了与其它法伯病诊断方法结合测试标志物含量水平外，还可以与其它类型的数据(尤其是指示个体患有法伯病风险的数据)结合评估有关标志物的信息。

C.标志物的检测

可以使用多种已知分析方法中的任何一种来检测本文所述的标志物的标志物含量水平。在一个实施方案中，使用捕获试剂检测标志物含量水平。在各种实施方案中，可以将捕获试剂暴露于溶液中的标志物或可以在将捕获试剂固定在固体负载物上时将所述捕获试剂暴露于标志物。在其它实施方案中，捕获试剂含有与固体负载物上的第二特征具反应性的特征。根据待进行分析的类型选择捕获试剂。在一些实施方案中，捕获试剂包括但不限于抗体、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、配体结合受体、细胞因子受体和合成受体，以及这些的修改和片段。在一些实施方案中，捕获试剂包括抗体。

在一些实施方案中，直接从生物样品中的标志物检测标志物含量水平。在一些实施方案中，使用允许同时检测生物样品中的两种或更多种标志物的多重形式检测标志物。

在一些这类实施方案中，方法包括使来自受试者的样品或样品的一部分与至少一种捕获试剂接触，其中每种捕获试剂特异性结合其含量水平被检测的标志物或标志物组。

此外，在一些实施方案中，可以通过以下方式获得生物样品：从多个个体获取生物样品并将其合并，或者合并每个个体的生物样品的等分试样。可以如本文对来自单个个体的样品所述来处理合并样品，并且例如，如果在合并的样品中已确认不良的预后，则可以对每个单独的生物样品进行重新测试以确定哪个(些)个体患有法伯病。

在一些实施方案中，可以使用荧光标签来标记标志物/捕获试剂复合物的组分以使得能够检测标志物含量水平。在各种实施方案中，可以使用已知技术将荧光标记与对本文所述的标志物中任一种标志物具有特异性的捕获试剂缀合，且然后可以使用荧光标志物检测相应的标志物含量水平。

在一些实施方案中，荧光标记是荧光染料分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鎓环系统，其中在吲哚鎓环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或共轭物质。在一些实施方案中，染料分子包括AlexFluor染料分子(赛默飞世尔科技(Thermo Fischer Scientific))，如AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700。在一些实施方案中，染料分子包括BD HorizonBrilliant^TM染料分子(BD科学(BD Sciences))，例如，BV421、BV510、BV605、BV 650或BV711。在一些实施方案中，染料分子包括Cy5或Cy7。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，例如两种不同的AlexaFluor分子。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，并且两种染料分子具有不同的发射光谱。

可以使用与多种测定形式兼容的多种仪器来测量荧光。在一些实施方案中，可以使用包括单重或多重免疫测定、组织学/细胞学方法等的任何分析方法来检测本文所述的标志物的标志物含量水平。免疫测定方法基于抗体与其对应的靶标或分析物的反应并且可以根据特定的测定形式检测样品中的分析物。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和敏感性，由于单克隆抗体及其片段的特异性表位识别，经常使用单克隆抗体及其片段。多克隆抗体由于与单克隆抗体相比对靶标的亲和力增加，也已成功用于各种免疫测定中。免疫测定已被设计与广泛范围的生物样品基质一起使用。免疫测定格式已被设计成提供定性、半定量和定量结果。

流式细胞术方法也可以用于检测标志物。执行流式细胞术的方法是本领域已知的。通常，将细胞，优选血细胞与抗体一起温育。在优选实施方案中，抗体是单克隆抗体。更优选地，用荧光标志物标记单克隆抗体。如果抗体未用荧光标志物标记，则与第一抗体具免疫反应性并含有荧光标志物的第二抗体。充分洗涤以确保去除过量或未结合的抗体后，即可将细胞用于流式细胞术。流式细胞术可在样品制备、获取和分析之间提供较短的周转时间，允许准确计数单个细胞亚群(包括非常罕见的亚群)并提供详细分子表型鉴定的机会。

D.试剂盒

可以使用如供用于执行本文公开的方法的合适试剂盒检测本文描述的标志物的任何组合。此外，任何试剂盒可含有一种或多种如本文所述的可检测标记，如荧光部分等。在一些实施方案中，试剂盒包括用于检测生物样品中的一种或多种标志物的一种或多种捕获试剂(例如，至少一种抗体)。在一些实施方案中，试剂盒任选地包括一种或多种软件或计算机程序产品，其用于预测从其获得生物样品的个体是否患有法伯病。替代地，代替一种或多种计算机程序产品，可以提供用于由人手动执行以上步骤的一种或多种说明。试剂盒还可以包括用于使用装置和试剂，处理样品以及分析数据的说明。此外，试剂盒可与计算机系统或软件一起使用，以分析和报告生物样品的分析结果。试剂盒还可含有一种或多种用于处理生物样品的试剂(例如，溶解缓冲液、去污剂、洗涤液或缓冲液)。本文所述的试剂盒中的任一个还可以包括例如缓冲液、封闭剂、抗体捕获剂、阳性对照样品、阴性对照样品、软件和信息(如协议)、指南和参考数据。

E.治疗方法

在一些实施方案中，在确定受试者患有法伯病(或酸性神经酰胺缺乏症)之后，受试者经历治疗方案以延迟或预防疾病的恶化。在一些实施方案中，向受试者给予治疗剂，如rhAC。用rhAC治疗法伯病的示例性方法描述于2018年1月12日提交的国际申请PCT/US18/13509，和He等人的《用于法伯病的酶替代疗法：细胞和小鼠中的概念验证研究》，《BBA临床》，2017年2月13日；7:85-96(He等人，2017)，它们以全文引用的方式并入。

在一些实施方案中，提供监测法伯病的方法。所属领域的技术人员已知的任何方法均可用于监测疾病状态和疗法效果。疾病状态的临床监测器可包括但不限于神经酰胺含量水平、体重、关节长度、炎症或已知与法伯病相关的任何其它临床表型。

在一些实施方案中，确定受试者是否患有法伯病的本发明方法在时间0进行。在一些实施方案中，该方法在时间1，并且任选地在时间2，并且任选地在时间3等处再次进行，以监测受试者的疾病的进展。在一些实施方案中，取决于个体疾病的当前状态和/或取决于认为或预测疾病进展的速率，在不同的时间点使用不同的标志物。

如本文所用，术语“治疗”意指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是减慢(减轻)不希望的生理病况、病症或疾病，或获得有益或期望的临床结果。举例来说，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状；减轻病况、病症或疾病的程度；病况、病症或疾病的稳定(即不恶化)状态；延迟病况、病症或疾病的发作或减慢其进展；改善(可检测或不可检测的)病况、病症或疾病或缓解(部分或全部)；改善至少一个可测量的物理参数(患者不一定能分辨出)；或增进或改善病况、病症或疾病。因此，“法伯病的治疗”或“治疗法伯病”意指缓解或改善与法伯病或本文所述的其它病况有关的任何原发现象或继发症状的工作。

还应理解的是，为了清楚起见而在单独实施方案的上下文中描述的在本文所述的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相比之下，为了简洁起见而在单个实施方案的上下文中所描述的各种特征也可以单独地或以任何合适子组合形式提供。

各种药物组合物在本文中描述并且可以基于患者和医生的偏好来使用。然而，在一些实施方案中，药物组合物是溶液。在一些实施方案中，药物组合物包含有包含rhAC的细胞调节培养基。如本文所用，术语“细胞调节培养基”是指以下细胞培养基，该细胞培养基已经用于培养表达rhAC的细胞，并且其中蛋白质被分泌到培养基中并且然后从培养基中分离或纯化蛋白质。在一些实施方案中，培养基用于治疗受试者。可以将例如培养基施用于受试者的皮肤上以治疗本文所述的任何病况、症状或病症中的任一种。

除了本文所述的施用途径外，在一些实施方案中，药物组合物通过接触受试者的皮肤来施用。在一些实施方案中，施用是肠胃外施用。在一些实施方案中，施用包括将药物组合物注射至受试者。在一些实施方案中，施用是腹膜内注射或静脉内注射。

在一些实施方案中，提供治疗有需要的受试者的法伯病的方法，其中该方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离出表达的rhAC；和向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含有效量为约0.1mg/kg至约50mg/kg的所分离的经表达rhAC。

在一些实施方案中，在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)包括将编码rhAC的载体转移到细胞中。在一些实施方案中，载体包含编码rhAC的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是编码rhAC多肽或其同源物的如本文所述的分子或任何其它核酸分子，其在本文中将更详细地描述。在一些实施方案中，载体是病毒载体。举例来说，载体可以是逆转录病毒载体或DNA病毒载体，如腺病毒、AAV等。在一些实施方案中，载体是质粒。在一些实施方案中，载体包含与rhAC可操作连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子或其任何组合，或在哺乳动物细胞中有活性的任何其它启动子。

在一些实施方案中，将载体转染或感染到细胞中。将载体引入细胞中的方法不是关键的，并且任何方法都可用于提供rhAC多肽在细胞中的充分表达。

在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞不是人细胞。在一些实施方案中，细胞是仓鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，细胞可以在无血清或基本上无血清的环境中生长。在一些实施方案中，细胞衍生自CHO-K1细胞。在一些实施方案中，细胞是鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是鼠骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是NS0细胞。在一些实施方案中，所施用的有效量如本文中上文和下文所述。

在一些实施方案中，如本文所述施用药物组合物。举例来说，在一些实施方案中，通过经口、吸入、鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、鼻内、腹膜内、鞘内或通过施用于粘膜将组合物向受试者施用。

如本文所用，术语“rhAC”是指重组人酸性神经酰胺酶。在一些实施方案中，rhAC包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，rhAC是蛋白质，该蛋白质是作为SEQ ID NO：1的同源物的蛋白质。在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：2的核酸分子编码。在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：3的核酸分子编码。在一些实施方案中，rhAC由SEQ ID NO：4的核酸分子编码。在一些实施方案中，序列如GenBank登录号NM_177924.3或NM_177924.4中所定义，其中的每一个均以全文引用的方式并入。编码蛋白质的核苷酸序列可以是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的完整序列，也可以只是该序列的编码区。举例来说，编码区可以是SEQ ID NO：2的核苷酸313至1500，或在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中发现的相应编码区。然而，如本领域技术人员众所周知的，基因密码是简并的，并且因此可以使用其它密码子来编码相同的蛋白质，而不超出所公开内容的范围。因为氨基酸序列是已知的，所以编码氨基酸序列的任何核苷酸序列都是可以接受的。在一些实施方案中，核苷酸序列包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽是由SEQ ID NO：2的核苷酸313至375编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，产生的蛋白质包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-21的信号肽。在一些实施方案中，产生的蛋白质不包含信号肽，如SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-21的信号肽。在一些实施方案中，信号肽在翻译后加工(其中酶被加工成其不同的亚基)期间被去除。在一些实施方案中，针对从其表达蛋白质的细胞对核苷酸序列进行密码子优化。在一些实施方案中，该蛋白质包含α-亚基、β-亚基等。在一些实施方案中，产生的蛋白质包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸残基22-142、45-139、134-379、143-395或1-395的肽。肽可以是单一蛋白质或具有不同序列以形成酶的多肽。在一些实施方案中，该蛋白质不含氨基酸残基1-21。这些区域可以由单个核苷酸序列或单独的核苷酸序列或核苷酸序列的组合编码。如本文所讨论，编码该蛋白质的任何核苷酸序列可以被使用并且不限于本文描述为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列。

在一些实施方案中，rhAC具有酸性神经酰胺酶(AC)活性，但不具有任何可检测的酸性鞘磷脂酶活性。可以通过例如热灭活来去除酸性鞘磷脂酶活性。参见例如美国专利申请公开第20160038574号，其以全文引用的方式并入本文中。热灭活还可从rhAC制剂中去除其它污染蛋白质。

术语“同源物”是指与参考序列具有80％至100％序列同一性的蛋白质序列。两条肽链之间的同一性百分比可以使用Vector NTI v.9.0.0(加利福尼亚州卡尔思巴德的英杰公司(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA))的AlignX模块的默认设置通过逐对比对来确定。在一些实施方案中，同源物与本文描述的序列(如SEQ ID NO:1)具有至少或约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，与本文所述的序列相比，递送至受试者的蛋白质具有保守性取代。表4中所示的非限制性示例性保守性取代包括在所公开主题的范围内。也可以进行取代以改善酶的功能，例如稳定性或酶活性。保守性取代将产生具有与进行这种修饰的那些分子相似的功能和化学特性的分子。示例性的氨基酸取代示出在下表4中。

表4：示例性的保守性取代：

原始残基	示例性保守性取代
		Ala	Val，Leu，Ile
Arg	Lys，Gln，Asn
		Asn	Gln
Asp	Glu
		Cys	Ser，Ala
Gln	Asn
		Gly	Pro，Ala
His	Asn，Gln，Lys，Arg
		Ile	Leu，Val，Met，Ala，Phe
Leu	Ile，Val，Met，Ala，Phe
		Lys	Arg，Gln，Asn
Met	Leu，Phe，Ile
		Phe	Leu，Val，Ile，Ala，Tyr
Pro	Ala
		Ser	Thr，Ala，Cys
Thr	Ser
		Trp	Tyr，Phe
Tyr	Trp，Phe，Thr，Ser
		Val	Ile，Met，Leu，Phe，Ala

如本文所用，“非活性酸性神经酰胺酶”、“非活性AC”或“非活性酸性神经酰胺酶前体”、“非活性AC前体”或(AC前蛋白)是指未经历自身蛋白水解裂解成活性形式的AC前体蛋白质。适用于本发明的这一方面和所有方面的重组酸性神经酰胺酶的无活性AC前体和活性AC可以与正在治疗的组织、细胞和/或对象同源(即，源自相同物种)或异源(即，源自不同物种)。酸性神经酰胺酶(例如，AC)前体蛋白质经历自身蛋白水解裂解为活性形式(由α和β亚基组成)。人AC裂解和活化的机制在(Shtraizent，2008)中报告。这是由细胞内环境促进的，并且基于跨物种的神经酰胺酶前体蛋白质的裂解位点处的高度保守的序列，预计这会在大多数(如果不是全部的话)细胞类型中发生。因此，本文所用的神经酰胺酶包括活性神经酰胺酶和神经酰胺酶前体蛋白质，其中，神经酰胺酶前体蛋白质通过自身蛋白水解裂解被转化为活性神经酰胺酶蛋白质。其中前体蛋白质被所关注的细胞吸收并被所述细胞转化为活性神经酰胺酶的实施方案，以及其中前体蛋白质被不同细胞或药剂(例如，存在于培养基中)转化为活性神经酰胺酶的实施方案均被设想。

可用于本发明的这一方面和所有方面的活性AC和无活性AC前体蛋白质包括但不限于US 2016/0038574的表1中列出的那些，该申请的内容特此以全文引用的方式并入。

US 2016/0038574的表1(以全文引用的方式并入本文)

表1

可用于本发明的这一方面和所有方面的活性AC和非活性AC前体蛋白质包括但不限于以下文献的表1中列出的那些：Schuchman,E.H.(发明人)，西奈山伊坎医学院(IcahnSchool of Medicine at Mount Sinai)(申请人)，2016年2月11日，《治疗性酸性神经酰胺酶组合物及其制备和使用方法(Therapeutic Acid Ceramidase Compositions AndMethods Of Making And Using Them)》，公开为美国公开专利申请第US 2016/0038574 A1号。

在一个实施方案中，活化形式的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)用于治疗法伯病。活化的rhAC的α和β亚基通过二硫键连接。该分子是重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)，其来源于用表达rhAC的DNA质粒载体转染的CHO-M细胞。在一个实施方案中，rhAC基于UniProt知识库代码：Q13510。

在一个实施方案中，通过以下方法将重组产生的酸性神经酰胺酶(rhAC)纯化至至少95％纯度的活化形式，该方法包括以下步骤：使重组产生的酸性神经酰胺酶经受选自i)阳离子交换色谱；ii)疏水作用色谱(HIC)；和iii)阴离子交换色谱的至少两个色谱步骤；和使溶液中的重组产生的酸性神经酰胺酶经受一个或多个病毒灭活步骤，其中将rhAC溶液滴定至pH为3.7或更小。在一个实施方案中，rhAC的蛋白质序列对应于SEQ ID NO：1。

在一个实施方案中，rhAC的纯化可以根据2018年9月24日提交的PCT/2018/052463中公开的方法进行，其以全文引用的方式并入本文中。RVT-801rhAC的治疗效果已在重度法伯病的鼠类模型中确认(He等人，2017)，并已在多项研究中被表征，其终点描述对组织病理学和免疫学结果的积极影响以及伴随的累积神经酰胺减少。

在一些实施方案中，纯化的重组产生的酸性神经酰胺酶具有至少90％、93％、95％、98％或99％的纯度，或100％的纯度。

在一些实施方案中，纯化的重组产生的酸性神经酰胺酶没有可检测的酸性鞘磷脂酶活性。

在一些实施方案中，在不使用热的情况下去除重组产生的酸性神经酰胺酶的酸性鞘磷脂酶活性。

如本文所用，术语“与...组合”意指所描述的药剂可以混合物的形式一起，以单一药剂同时地或以任何次序以单一药剂顺序地向受试者施用。如本文所用，术语“与...组合”意指所描述的药剂可以混合物的形式一起，以单一药剂同时地或以任何次序以单一药剂顺序地向受试者施用。

如本文所述，在一些实施方案中，蛋白质是从细胞产生的。在一些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢细胞(“CHO细胞”)。编码本文描述的蛋白质的核酸序列可以是基因组DNA或cDNA，或编码本文描述的蛋白质中的至少一种的RNA(例如mRNA)。cDNA的使用需要将适合宿主细胞的基因表达元件与基因结合，以实现所期望蛋白质的合成。cDNA序列的使用可以相对于基因组序列(其含有内含子)有利，因为cDNA序列可以在细菌或其它缺乏合适的RNA剪接系统的宿主中表达。本领域技术人员可以确定用于表达蛋白质的最佳系统。

在一些实施方案中，该蛋白质是根据以全文引用的方式并入的美国专利申请公布第20160038574号生产的。

因为基因密码是简并的，所以可以使用超过一种密码子编码特定氨基酸。使用基因密码，可以鉴定一种或多种不同的寡核苷酸，其中的每个将能够编码本文所述的氨基酸序列。

可以纯化酶，该酶被施用于受试者以治疗法伯病或与其相关的病况。涉及蛋白质的术语“纯化的”是指蛋白质基本上不含在其天然环境中与该分子缔合的其它物质。举例来说，纯化的蛋白质基本上不含来自其来源的细胞或组织的细胞物质或其它蛋白质。该术语是指这样的制剂，在其中，分离的蛋白质纯度足够用于分析，或者纯度为至少70％至80％(w/w)，纯度为至少80％-90％(w/w)，纯度为90％至95％；以及纯度为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)。在一些实施方案中，从细胞，如但不限于CHO细胞中纯化蛋白质。

施用、组合物和包含蛋白质的试剂盒

在一些实施方案中，方法包括将治疗或预防有效量的本文所述的一种或多种蛋白质施用于患有法伯病或怀疑患有法伯病的受试者。

受试者的治疗可包括施用治疗有效量的本文所述的蛋白质。

可以在本文所述的试剂盒中提供蛋白质。

蛋白质可以单独或与另外的治疗剂掺合使用或施用。另外的治疗剂的实例包括但不限于酸性鞘磷脂酶的抑制剂(例如阿米替林(Becker等人，《酸性鞘磷脂酶抑制剂使囊性纤维化中的肺神经酰胺和炎症正常化(Acid Sphingomyelinase Inhibitors NormalizePulmonary Ceramide and Inflammation in Cystic Fibrosis)》，《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)》，42:716-724(2010)，其以全文引用的方式并入本文中)和神经酰胺合成酶的抑制剂(例如Shiffmann等人，《特定神经酰胺合成酶的抑制剂(Inhibitors of Specific Ceramide Synthases)》，《生物化学(Biochimie)》，94:558-565(2012)，其以全文引用的方式并入本文中))。另外的治疗剂也可以是在美国专利申请公布第20160038574号中描述的神经酰胺酶混合物，该申请以全文引用的方式并入本文中。

尽管正如我们对法伯病的最新研究(其中证明AC累积的减少)所示，酶替代疗法(ERT)可以有效，但是抗体可能针对该药物发展，即，替代酶可能降低其功效。在此，我们已经示出重复剂量具有良好的耐受性，这支持重复施用替代酶的治疗方案，从而减轻疾病的症状，尤其是根据本文所述的方法产生和例如在美国专利申请公布第20160038574号中所述的方法产生的酶。

在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的法伯病的方法包括每周约一次、每2、3或4周一次或一月一次向受试者施用有效量的包含重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物，持续约10、约20或约30周、1、5、10或25年，或患者的整个生命周期。

合适的媒介物及其配制物和包装描述于例如《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》(第21版，Troy,D.编，马里兰州巴尔的摩利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore)(2005)第40和41章)。可以采用其它药学方法来控制作用的持续时间。控释制剂可通过使用聚合物络合或吸收化合物来实现。通过控释制剂控制作用持续时间的另一种可能的方法是将化合物掺入聚合材料的颗粒中，所述聚合材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。替代地，代替将这些药剂掺入聚合颗粒中，可以将这些材料截留在例如界面聚合反应制备的微胶囊(例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)-微胶囊)中，或胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中。

示例性的递送装置包括但不限于喷雾器、雾化器、脂质体(包括主动和被动药物递送技术)(Wang等，1997，《小鼠中的pH敏感性免疫脂质体介导靶细胞特异性递送和外源基因的受控表达(pH-sensitive immunoliposomes mediate target-cell-specific deliveryand controlled expression of a foreign gene in mouse)》，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)》84:7851-5)；Bangham等人，1965，《单价离子跨越膨胀磷脂薄层的扩散(Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollenphospholipids)》，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，13:238-52；Hsu C.C.(发明人)，Genentech公司(受让人)，1997年8月5日，《用于制备脂质体的方法(Method for preparingliposomes)》，公开为美国专利第5,653,996号；Lee，K.-D.等人(发明人)，哈佛大学和宾夕法尼亚大学的校长和研究员，《大分子的细胞内递送(Intracellular delivery ofmacromolecules)》，公开为美国专利第5,643,599号；Holland J.W.(发明人)，不列颠哥伦比亚大学，《双层稳定化成分及其在形成可编程促融合脂质体中的用途(Bilayerstabilizing components and their use in forming programmable fusogenicliposomes)》，公开为美国专利第5,885,613号；Dzau，V.J和Kaneda，Yasufumi(发明人)，《用于产生经由脂质体在体内递送治疗剂的方法(Method for producing in vivo deliveryof therapeutic agents via liposomes)》，公开为美国专利第5,631,237号；和Loughrey等人(发明人)，脂质体公司(Liposome Company)(受让人)，《具有确定尺寸分布的靶向脂质体系统的制备(Preparation of targeted liposome systems of a defined sizedistribution)》，公开为美国专利第5,059,421号；Wolff等人，1984，《单克隆抗Thy1 IgG1在体外和体内将脂质体靶向到AKR-A细胞的用途(The use of monoclonal anti-Thy1IgG1 for the targeting of liposomes to AKR-A cells in vitro and in vivo)》，《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》802:259-73)、透皮贴剂、植入物、可植入或可注射的蛋白质贮库组合物和注射器。也可以采用本领域技术人员已知的其它递送系统来实现将神经酰胺酶向所期望的器官、组织或细胞的所期望递送。

通常，如果施用全身剂量的蛋白质，则期望向接受者提供在以下范围内的蛋白质剂量：约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μkg、1μkg/kg-100μkg/kg、100μkg/kg-500μkg/kg、500μkg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg，100mg/kg-500mg/kg(接受者的体重)，但是可以施用更低或更高的剂量。

在一些实施方案中，所施用的rhAC的有效量为约0.1mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约10mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约10mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约20mg/kg至约30mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约30mg/kg至约40mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约40mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，有效量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。

在一些实施方案中，每两周以约1mg/kg至约5mg/kg rhAC或约2mg/kg至约5mg/kgrhAC将rhAC施用于诊断患有法伯病的受试者。在一个实施方案中，在第4周，剂量从1mg/kg或2mg/kg逐渐升高至5mg/kg。如果个别受试者不能耐受剂量水平，则该受试者的剂量可以适当地从2mg/kg降低到1mg/kg，或从5mg/kg降低到2mg/kg。rhAC可以每2周施用持续至少10、20或30周，或持续受试者的整个生命周期。在一个示例性的实施方案中，受试者被诊断患有法伯氏病并且被鉴定为具有：1)皮下结节；和/或2)白细胞、培养的皮肤成纤维细胞或其它生物来源(例如血浆)中的酸性神经酰胺酶活性值小于对照值的30％；和/或3)酸性神经酰胺酶基因(ASAH1)的两个等位基因的核苷酸变化，该变化通过生物信息学、基因表达研究和/或其它方法指示酸性神经酰胺酶蛋白质的功能可能丧失。在一些实施方案中，每两周向受试者施用rhAC，持续28周。在一些实施方案中，rhAC的递送是通过静脉内输注(例如，盐水输注)。在一些实施方案中，以约2mg/kg开始并逐渐升高至约5mg/kg rhAC(例如，在第4周时升高至5mg/kg)。

在另外的实施方案中，公开治疗有需要的受试者的与法伯病相关的炎症的方法，所述方法包括例如每周一次、每两周一次或每月一次向受试者施用包含有效量为约1mg至约5mg/kg或约2mg/kg至约5mg/kg的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)的药物组合物，重复剂量持续至少10或至少20周、持续28周、或持续受试者的整个生命周期。在一些实施方案中，施用是通过静脉内输注。在一个实施方案中，治疗有需要的受试者的法伯病的方法包括例如每周一次、每两周一次或每月一次向受试者施用包含有效量为约1mg至约5mg/kg或约2mg/kg至约5mg/kg的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)的药物组合物，重复剂量持续至少10或20周、持续28周或持续受试者的整个生命周期。

该剂量可以每天一次、一天两次、一天三次、一天四次、每周一次、每周两次、每两周一次或每月一次施用。在一些实施方案中，每周一次施用剂量。也可以以单剂量方案或多剂量方案进行治疗，其中主要治疗过程可以用1-10个独立剂量，然后在维持和/或加强反应所需的后续时间间隔内给予其它剂量，例如，对于第二剂量，每周一次，持续1-4个月；并且如果需要，则在若干月后再施用一个或多个后续剂量。合适的治疗时程的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或足以引起预期减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的期望反应的其它方案。也可以使用其它治疗时程，如但不限于上述那些。

在本公开的某些方面，当所述受试者是新生儿，在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10岁以下，或在1岁和2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、60、70或80岁之间(例如，在1岁和2岁之间，在1岁和3岁之间，等等)时开始治疗。在一些实施方案中，受试者在16岁和61岁之间。在一些实施方案中，受试者在16岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在12岁和69岁之间。在一些实施方案中，受试者在12岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在19和74岁之间。在一些实施方案中，受试者在19岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在4岁和62岁之间。在一些实施方案中，受试者在4岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在7岁和42岁之间。在一些实施方案中，受试者在7岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在1个月和6个月之间。在一些实施方案中，受试者在刚初生时开始治疗。在一些实施方案中，受试者在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月大时开始治疗。在一些实施方案中，受试者在6岁和43岁之间。在一些实施方案中，受试者在6岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在5岁和31岁之间。在一些实施方案中，受试者在5岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在5岁和57岁之间。在一些实施方案中，受试者在5岁和29岁之间。在一些实施方案中，受试者在1岁和3岁之间。在一些实施方案中，受试者在1岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在10岁和70岁之间。在一些实施方案中，受试者在10岁开始治疗。在一些实施方案中，受试者在5岁和80岁之间、10岁和70岁之间、20岁和75岁之间、5岁和60岁之间或5岁和30岁之间。

在一些实施方案中，每两周以约1mg/kg至约5mg/kg rhAC或约2mg/kg至约5mg/kgrhAC将rhAC施用于诊断患有法伯病的受试者。在一个实施方案中，在第4周，剂量从1mg/kg或2mg/kg逐渐升高至5mg/kg。如果个别受试者不能耐受剂量水平，则该受试者的剂量可以适当地从2mg/kg降低到1mg/kg，或从5mg/kg降低到2mg/kg。rhAC可以每2周施用持续至少10、20或30周，或持续受试者的整个生命周期。在一个实施方案中，受试者被诊断患有法伯氏病并且被鉴定为具有：1)皮下结节；和/或2)白细胞、培养的皮肤成纤维细胞或其它生物来源(例如血浆)中的酸性神经酰胺酶活性值小于对照值的30％；和/或3)酸性神经酰胺酶基因(ASAH1)的两个等位基因的核苷酸变化，该变化通过生物信息学、基因表达研究和/或其它方法指示酸性神经酰胺酶蛋白质的功能可能丧失。在一些实施方案中，每两周向受试者施用rhAC，持续28周。在一些实施方案中，rhAC的递送是通过静脉内输注(例如，盐水输注)。在一些实施方案中，以约2mg/kg开始并逐渐升高至约5mg/kg rhAC(例如，在第4周时升高至5mg/kg)。

举例来说，部位特异性施用可以到达身体区室或腔室，如关节间、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、病变内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方式。

本文所述的治疗性组合物可以制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用，特别是以液体溶液或悬浮液的形式施用。配制物也可以适合于可注射配制物。在一些实施方案中，可注射配制物是无菌的。在一些实施方案中，可注射配制物是无热原的。在一些实施方案中，配制物不含与本文所述抗原以外的其它抗原结合的其它抗体。

治疗性组合物还可包括药学上可接受的佐剂、赋形剂和/或稳定剂，并且可以呈固体或液体形式，如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液或乳液。这类另外的药学上可接受的成分已用于多种酶替代疗法组合物中并且包括但不限于柠檬酸三钠、柠檬酸、人血清白蛋白、甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、聚山梨酯、氯化钠、组氨酸、蔗糖、海藻糖、甘氨酸和/或注射用水。在一些实施方案中，盐是水合物(例如柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物、磷酸二氢钠一水合物和/或磷酸氢二钠七水合物)。

在一些实施方案中，如本文所述施用药物组合物。举例来说，在一些实施方案中，通过经口、吸入、鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、鼻内、腹膜内、鞘内或通过施用于粘膜将组合物向受试者施用。

本文所述的治疗性组合物可以制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用，特别是以液体溶液或悬浮液的形式施用。配制物也可以适合于可注射配制物。在一些实施方案中，可注射配制物是无菌的。在一些实施方案中，可注射配制物是无热原的。在一些实施方案中，配制物不含与本文所述抗原以外的其它抗原结合的其它抗体。

能够治疗法伯病或与rhAC活性相关联的其它病况或者用于治疗rhAC相关病变的rhAC的蛋白质旨在以足够影响相关症状或病变的减轻、消退或改善的量向受试者提供。这类病变包括受试者的如本文所述的法伯病的症状。如果药剂的剂量、施用途径和给药时程足以影响这类反应，则该量被认为是足以“影响”症状减轻的，或者是“影响”症状减轻的“治疗有效量”。对蛋白质的反应可通过成像技术或通过组织样品的离体分析来分析受试者的受影响组织、器官或细胞来测量。如果药剂的存在引起接受患者的生理的可检测变化，则药剂在生理上具有显著性。在一些实施方案中，如果量是可用于治疗、改善或抑制受试者所经受的法伯病的症状的量，则该量是治疗有效量。本文提供这类量的非限制性实例，但如果上下文指示另一量，则不旨在限于这类量。

可以根据已知方法配制蛋白质，以制备药学上有用的组合物，由此将这些材料或其功能衍生物与药学上可接受的载体媒介物掺合。

能够治疗法伯病或与rhAC活性相关联的其它病况或者用于治疗rhAC相关病变的rhAC的蛋白质旨在以足够影响相关症状或病变的减轻、消退或改善的量向受试者提供。这类病变包括受试者的如本文所述的法伯病的症状。如果药剂的剂量、施用途径和给药时程足以影响这类反应，则该量被认为是足以“影响”症状减轻的，或者是“影响”症状减轻的“治疗有效量”。对蛋白质的反应可通过成像技术或通过组织样品的离体分析来分析受试者的受影响组织、器官或细胞来测量。如果药剂的存在引起接受患者的生理的可检测变化，则药剂在生理上具有显著性。在一些实施方案中，如果量是可用于治疗、改善或抑制受试者所经受的法伯病的症状的量，则该量是治疗有效量。本文提供这类量的非限制性实例，但如果上下文指示另一量，则不旨在限于这类量。

在一些实施方案中，治疗功效通过以下任何一种手段评估：

·用rhAC治疗28周后，净结节(≥5mm)计数相对于基线的变化百分比；

·用rhAC治疗28周后，净结节(≥10mm)计数相对于基线的变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·用rhAC治疗28周后，总结节计数(不论大小)计数相对于基线的变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·用rhAC治疗28周后，所选关节的关节运动范围相对于基线的变化和变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·用rhAC治疗28周后，6分钟步行距离相对于基线的变化和变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·用rhAC治疗28周后，肺功能测试相对于基线的变化和变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·用rhAC治疗28周后，FDT评分相对于基线的变化和变化百分比，以及与安慰剂的比较；

·在用rhAC或安慰剂治疗28周期间，针对年龄的体重和身高的Z评分相对于基线的变化和变化百分比。

在一些实施方案中，基于非房室方法评估在以不同剂量向法伯小鼠或健康小鼠施用后RVT-801的药代动力学。非房室药代动力学方法尤其通过估算浓度-时间图的曲线下面积来估算对药物的暴露，其中以下指标在本领域已知：

表5

在一些实施方案中，通过基于上述非房室药代动力学方法确定RVT-801的组织特异性药代动力学来评估治疗的组织特异性功效。

在一些实施方案中，评估对应于用于法伯病小鼠的有效剂量的RVT-801的人体等效剂量(HED)。本文中HED的非临床评估基于两种方法：1)关于按体表面积(BSA)在非临床物种和人之间按比例调整的FDA指南，以及2)针对作为神经酰胺累积的主要组织并且其中吸收RVT-801占主导的肝和脾的在物种之间的器官:体重比。

按体表面积按比例调整：以法伯小鼠MED(最大有效剂量)为基准且基于成人或儿童的BSA和体重的HED(其中HED＝动物剂量*(动物体重/人体体重)0.33指示针对60kg成人的剂量为～0.81mg/kg，和针对15kg儿童的剂量为～1.2mg/kg。

按器官:体重比按比例调整：PK研究显示，从脉管清除的机制与摄取和/或分布到组织中有关，因此，组织重量与体重比可影响剂量，而BSA模型就其自身而言可能无法充分预测。使用HED＝MED*(人类组织/人类体重)/(小鼠组织/小鼠体重)，基于成人和儿童的肝和脾，小鼠的10mg/kg剂量相当于成年人类的～3-5mg/kg剂量或15kg儿童的～4-5mg/kg剂量。

在一些实施方案中，可以通过组合以上两种按比例调整方法来确定HED。

还提供本文和下文所述的试剂盒，其可用于进行本文所述的实施方案。在一些实施方案中，试剂盒包括第一容器，所述容器含有上述多肽或与上述多肽一起封装。试剂盒还可以包括另一个容器，所述容器含有或封装于进行实施方案所必需或方便的联合溶液中。容器可以由玻璃、塑料或箔片制成，并且可以是小瓶、瓶子、小袋、管、袋等。试剂盒还可以含有书面信息，如进行实施方案的程序或分析信息，如第一容器装置中含有的试剂的量。该容器可以与书面信息一起位于另一个容器设备(例如盒子或袋子)中。

本文提供的又另一方面是用于治疗法伯病的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一个容器，所述容器包含rhAC多肽或编码rhAC多肽的核酸分子。在一些实施方案中，试剂盒包含有包含被配置为表达rhAC的细胞的容器。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含来自表达rhAC的细胞的调节培养基。在一些实施方案中，调节培养基来自CHO细胞。

现在参考以下实施例描述主题。仅出于说明的目的提供这些实施例，并且权利要求绝不应被解释为限于这些实施例，而应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。本领域的技术人员将容易识别出多种可以被改变或修改以产生基本类似结果的非关键参数。

实施例

实施例1

材料与方法

动物选择和样品收集

根据以全文引用的方式并入本文的He等人，2017年，维持法伯小鼠(Asah1P361R/P361R)和大约年龄匹配的野生型CD-1小鼠(Asah1P361R/P361R的亲本品种)。

从4至8周大的年龄匹配的法伯和野生型小鼠(n＝3)收集全血、肝、肺和脾，以通过流式细胞术进行表征。

通过心脏穿刺或其它批准的手段从每组的所有动物收集血液样品，以从每只小鼠中产生最大体积的血液样品。将血液样品收集到单独的肝素锂小瓶中，并轻轻倒置若干次以分散抗凝剂。将血液样品分成两个等分试样。冷冻一个等分试样用于后续脂质解析。将第二等分试样放入适当标记的聚苯乙烯管中，并置于冰上，直到针对流式细胞术进行处理为止。

紧接在收集末端血液样品后，在尸体剖检时收集组织。从每组至多三(3)只动物中收集完整肝、脾和肺。取出每个组织并将其轻轻吸干。将每个组织放入一个单独的、预先标记好的小瓶中，在收集组织之前已对所述小瓶进行质量测量(带盖)。测量包括组织的加盖小瓶的质量。没有将缓冲液、防腐剂或抗生素添加到组织中。报告组织质量(即，样品+小瓶质量-小瓶质量)。在冷冻组织之前，将指定用于经由流式细胞术分析的一部分肝、脾和肺(约0.025g)取出并放置至适当大小的含有3-5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4；吉毕科(Gibco))的聚苯乙烯皮氏培养皿中。将含有样品的皮氏培养皿储存在冰上，直到加工成用于探索终点的单细胞悬浮液。记录用于流式细胞术的质量。紧接在对每块进行质量测定后，立即将旨在用于脂质分析的所有组织样品冷冻，在-70℃下储存，然后再运送到生物分析实验室。

组织处理成单细胞悬浮液

(a)血液

将等体积的PBS添加到每个血液样品中，并且再添加2mL 1X FACS裂解液(碧迪生物科学(BD Bioscience))。将样品轻轻涡动并在室温下在黑暗中温育10分钟，并通过离心洗涤三次。将细胞以20x 106个细胞/毫升再悬浮于测定缓冲液(含5％正常大鼠血清(NRS)的PBS)中。将样品储存在冰上直至染色为止。

(b)脾和肝

使用两个显微镜载玻片的磨砂部分，将脾或肝组织均质化。载玻片具有在皮氏培养皿中提供的PBS，以确保所有细胞都收集在PBS中。均质化后，采集所有PBS(现在含有单一细胞以及小块组织)，并将其通过带有集成滤网的法尔康管过滤匀浆化。在以300×g离心5分钟并去除上清液后，将细胞再悬浮于100μL PBS中，然后添加2mL 1X FACS裂解液。然后，将细胞悬浮液轻轻涡动并在室温下在黑暗中温育10分钟。通过离心洗涤三次后，将细胞以20x 106个细胞/毫升再悬浮于测定缓冲液(含5％NRS的PBS)中。将样品储存在冰上直至染色为止。

(c)肺

用RPMI 1640 Medium(GlutaMAX^TMSupplement，赛默飞世尔科技)、1mg/mL胶原酶II(飞世尔科技(Fisher Scientific))和5U/mL DNAseI(西格玛(Sigma))制备消化培养基。将肺切成小块，并在皮氏培养皿中悬浮于每个肺5ml的消化培养基中，并在37℃下在摇动下温育约1.5小时(但不超过2小时)。使用两个显微镜载玻片的磨砂部分，将肺组织均质化。载玻片具有在皮氏培养皿中提供的分解培养基，以确保所有细胞都被收集。均质化后，采集所有分解培养基(现在含有单一细胞以及小块组织)，并将其通过带有集成滤网的法尔康管过滤匀浆化。在以300×g离心5分钟并去除上清液后，将细胞再悬浮于100μL PBS中，然后添加2mL 1X FACS裂解液。然后，将细胞悬浮液轻轻涡动并在室温下在黑暗中温育10分钟。通过离心洗涤三次后，将细胞以20x 106个细胞/毫升再悬浮于测定缓冲液(含5％NRS的PBS)中。将样品储存在冰上直至染色为止。

流式细胞术样品染色

染色过程执行如下：根据制造商的说明，在初次染色后，将1:200活/死僵尸红添加到细胞中。在对表面标志物进行染色并鉴定活/死群后，将细胞再悬浮于300uL BD FACS/裂解固定剂中以溶解任何红细胞。使用来自抗体优化研究中的对照。如下制备用于染色样品的一组抗体。

表6

表7

在滴定实验期间确定所用抗体的体积。将100μL细胞样品添加到96孔V型底培养板中。准备一组单一染色剂对照(100μL/孔)用于补偿，并使用来自所有动物的合并样品为每种组织准备一组荧光减一(FMO)对照。将培养板以500×g旋转汇集5分钟。去除缓冲液，并在冰上将样品用100μL 1μg/mL TruStain FcX Block(百进生技(BioLegend)，101320))再悬浮约10分钟。温育后，将100μL适当的抗体组添加到每个样品中，并覆盖样品培养板并在冰上温育大约30分钟。然后，将样品培养板以500×g旋转汇集5分钟以去除上清液。将细胞再悬浮于200μL测定缓冲液(含5％NRS的PBS)中。将样品培养板以500×g旋转汇集5分钟以去除上清液，并将细胞再悬浮于200μL固定缓冲液(碧迪生物科学，339860)中。样品在4℃下覆盖储存。

流式细胞术样品获取与分析

使用Diva软件在碧迪生物科学LSRII仪器上获取样品。将单一染色的样品用于电压的适当调整，以确保最佳信噪比，补偿矩阵的应用以及所有荧光团通道的适当标记。为每个样品记录样品的一百万事件或最大体积。使用FlowJo v10软件分析获得的流式细胞术数据。

结果

分析流式细胞术数据以比较从4至8周大的法伯小鼠(Asah1^P361R/P361R)和年龄匹配的野生型小鼠收集的血液以及肝、脾和肺组织中的细胞组成和活化状态。

评估组织间的活力

如图1-5B中所示的流式细胞术测定示出关于野生型小鼠中的大细胞分布和细胞健康的一般状态的信息。请注意，单核细胞被鉴定为SSC^midFSC^mid。此分布的任何更改都可指示疾病状态。

脾示出在法伯小鼠和野生型小鼠之间的细胞活力的显著差异。与野生型对照相比，法伯小鼠脾活力降低可能与神经酰胺的直接作用或通过炎症过程有关(图2A和2B)。法伯小鼠的肺活力与野生型对照相似(图3A和3B)，这可能反映仅区分细胞死亡单一阶段的能力。观察到与野生型对照相比，在法伯小鼠中的肝和血液活力相似(图4A、4B、5A和5B)。

CD45+

白细胞(CD45⁺)细胞的频率增加或细胞分布的变化在很大程度上是由慢性炎症或感染介导。在法伯小鼠和野生型小鼠中，CD45+细胞的百分比和CD45+区室的组成发生显著变化。图6A、6B、7A和7B比较4至8周大的法伯小鼠和年龄匹配的野生型小鼠之间的脾和血液中白细胞(CD45⁺细胞)和单核细胞(SSC^mid/FSC^mid)的群。脾中白细胞(CD45⁺细胞)的频率保持相当相似水平。如图7A和7B(箭头所指示)所示，与野生型小鼠相比，法伯小鼠中单核细胞的频率增加。此外，与野生型相比，法伯小鼠的脾中单核细胞的频率增加5倍以上。这与反映脾组织变化的外周频率相关。

MHCII^-CD11b^hi(活化单核细胞)

单核细胞/粒细胞进一步分为效应子亚群。(Misharinet等人，《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am J Respir Cell Mol Biol.)》,2013年10月；49(4):503-10.)。在亚群中，MHCII^-CD11b^hi群指示活化单核细胞。如图9A所示，与野生型相比，在法伯小鼠肺中观察到MHCII^-CD11b^hi群显著增加，同时MHCII^-CD11b^mid减少。同样，如图9B所示，与野生型相比，在法伯小鼠脾中观察到MHCII^-CD11b^hi群显著增加(图9B和10A)。组织中这种增加的频率也反映在血液中(图10B)。在法伯小鼠的组织和外周中的活化单核细胞(MHCII^-CD11b^hi)频率增加的这些发现(图11)支持MHCII^-CD11b^hi作为法伯病的免疫表型标志物。

MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺(促炎性单核细胞系)

MHCII⁺CD11b^-可以进一步细分为Ly6C^+/-。Ly6C⁺单核细胞更可能分化为促炎性。Ly6C^-单核细胞更可能分化成M2巨噬细胞并具有抗炎性。如图13A所示，相比于野生型小鼠，在法伯小鼠的肺中MHCII⁺CD11b^-群的促炎性Ly6C⁺亚群增加。法伯小鼠的脾和血液中Ly6C+促炎细胞的频率相似。(图12B和13B)。这些发现示出原位炎性环境可以进一步促进促炎性细胞的产生。在法伯小鼠中，在血液中也检测到促炎性巨噬细胞和树突细胞的这种增加，从而支持MHCII^-CD11b^hiLy6C⁺作为法伯病的外周标志物。

MHCII^-CD11b^hiCD86⁺(活化促炎性巨噬细胞和树突细胞)

图14A和14B示出，与野生型小鼠相比，在法伯小鼠的肺中CD11b+MHC-DC群内的CD23、CD68和CD86活化标志物增加。特别是，在法伯小鼠中的MHC-CD11b+群中CD86的表达增加(图14B，右图区)指示引发细胞诱导免疫细胞募集和活化的能力，从而使炎性反应持久。此结果支持MHCII-CD11bhiCD86+作为法伯病的免疫表型标志物。

CD11b⁺CD38⁺和CD11b⁺CD206⁺(巨噬细胞的极化)

法伯小鼠的促炎性巨噬细胞增加，而抗炎性巨噬细胞减少(图15A和15B)。巨噬细胞的极化受细胞因子环境和营养源的调节。细胞因子/趋化因子是细胞信号传导分子，其可以驱动趋化性并诱导靶细胞的细胞变化。

CD11b⁺Ly6G⁺(中性粒细胞)

如图16-19和20A-20D所示，到4周龄时，法伯小鼠的所有肺、脾和肝均示出中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)频率增加(与野生型相比增加2-7倍)。中性粒细胞的增加是法伯小鼠和野生型小鼠之间的组织间最显著差异化因素(参见下表8)。中性粒细胞浸润的早期并且稳健的增加可有助于驱动后续的免疫反应，包括单核细胞募集，并且因而经由产生促炎性细胞因子而促进法伯小鼠的病变。

此外，如图20D所示，在法伯小鼠的血液中也反映出组织滞留中性粒细胞频率的增加，从而支持CD11b⁺Ly6G⁺作为法伯病的强表型标志物。

CD19b^-CD3⁺(T细胞)

如图21-24所示，法伯小鼠的所有脾、肺和血液在4周和8周时均示出T细胞(CD19b-CD3+)的频率降低(图24)。此发现与先前观察到的在法伯小鼠中胸腺结构明显破坏和胸腺T细胞减少(Dworski等人，2015)以及1-磷酸鞘氨醇在调节淋巴细胞发育和向肠道中的迁移方面的相关性一致。(Kunisawa等人,2007.)

CD19b⁺CD38⁺(活化的B细胞)

如图25和27A所示，法伯小鼠脾中B细胞的频率增加，如由CD19+所证明。在脾的B细胞区室内，法伯小鼠的活化B细胞(浆母细胞)的频率增加，如由CD38+所证明(图26和27B)。活化的B细胞的频率增加反映在外周中，如图28、29A和29B所示。T细胞的减少很可能与胸腺的破坏有关，而活化的B细胞的增加则很可能是由于抗原呈递细胞的丰富。T细胞和B细胞动力学都表明反应是继发于单核细胞(和衍生的亚群)以及中性粒细胞浸润和活化。

CD45^hiSS^hi(嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞)

与在任一年龄段的野生型小鼠相比，在法伯小鼠肺中，免疫细胞的总体频率均降低(图30A)。特别是，CD45hiSShi细胞(图30A，黑色轮廓)在法伯小鼠中完全消失。

在法伯小鼠肝中，法伯和野生型小鼠的免疫细胞频率通常都较低(图30B)。肝具有复杂的组织学结构，主要由占肝细胞成分70％的肝细胞(CD45-)组成，而肝内淋巴细胞(IHL)构成其余非实质细胞(30％)的16-22％。与4周大的法伯小鼠和在任一年龄段的野生型小鼠相比，在8周大的法伯小鼠中的CD45+SShi细胞略有增加。

MHCII⁺CD11b^midCD23⁺

CD23在成熟的B细胞、活化的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突细胞和血小板上表达。CD23+细胞的缺失指示法伯小鼠脾和肺中的活化。血液样品中未发现CD23。

表8对8周大的法伯小鼠与野生型同窝幼仔进行评估的变化。

表8提供为诊断法伯病而鉴定的标志物的汇总。与来自年龄匹配的野生型小鼠的对照样品相比，“1-2”指示1-2倍的标志物表达变化，“2-5”指示2-5倍的变化，“>5”指示大于5倍的变化，并且“-”指示“未测试或不确定”。“累积”评分是所有四种组织和血液样品中标志物表达的总和，而“+++”指示大于5倍的变化，“++”指示3至4倍的变化，并且“+”指示变化小于3倍的变化。括号指示与野生型对照相比的负变化或降低。

单核细胞群的表征揭示MHCII^-CD11b^hiLy6C⁺细胞的频率显著增加。这些细胞是高度活化的，如由CD86表达所证明，并且基于CD38表达而偏向促炎性M1表型。鉴定出CD206⁺抗炎性M2巨噬细胞同时减少。除巨噬细胞区室外，到4周龄时，脾、肝和肺中的中性粒细胞极度增加为明显的(相对于野生型为2-7倍)。还注意到适应性免疫区室的显著差异，浆母细胞(产生免疫球蛋白的浆细胞的前体)的频率明显增加，很可能继发于促炎性单核细胞增加。

免疫指纹

图33A-33D示出基于在法伯小鼠的肺、脾、肝和血液中鉴定的所有亚群的免疫指纹的实例。

将进行进一步的研究以描述rhAC对用rhAC治疗的法伯小鼠的组织的免疫表型的影响。可以使用表2、3和7中列出的上述所鉴定的用于诊断法伯病的标志物对组织染色，这些标志物包括促炎性标志物(例如CD38、Ly6G)和抗炎性标志物(例如CD206)以及泛单核细胞标志物(例如CD11b)。

实施例2.分析野生型、法伯小鼠和用重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)治疗的法伯小鼠的免疫细胞群组成。使用法伯小鼠模型，因为它是在W4/129Sv/CD-1背景上建立的“敲入”小鼠模型，其具有在严重发病的FD患者中鉴定的单核苷酸错义突变，以创建产生酸性神经酰胺酶无功能形式的纯合Asah1^P361R/P361R动物。此疾病模型重现多个组织的单核细胞浸润，且因此可用于使用此疾病模型研究法伯病的免疫环境。

在刚断奶(3-4周龄)开始，对法伯小鼠(基因型通过PCR确认)以每周一次共4次腹膜内(IP)给予10mg/kg/剂的重组人酸性神经酰胺酶(RVT-801)给药，且在其第4次和最后的RVT-801施用后(7周龄)将其处死用于尸检。对照野生型和法伯小鼠不用媒介物给药，并且在4或8周龄，对每种基因型的三只对照动物进行尸检，并收集样品以进行评估。在指示的时间点，采集法伯小鼠和同窝幼仔对照(野生型)以评估神经酰胺累积的关键组织(脾、肝和肺)中免疫细胞的组成。另外，收集血液以关联外周中的组织特异性炎症。将样品处理为单细胞悬浮液，根据下文所述的表9(小组1)和表10(小组2)染色，并在BD LSRII流式细胞仪上运行。单一染色的样品(补偿珠)和荧光减一(FMO)样品用作研究的对照。使用FlowJo v10分析原始数据文件，并且代表性设门策略如图34A-E所示。

结果.图34A-E细胞群，首先基于大小(SSCxFSC)对该细胞群进行设门，以去除来自加工过程的细胞碎片(图34A)。基于活细胞和死细胞进一步对此群进行设门，以去除对僵尸红染料呈阳性的细胞群(图35B)。然后对活细胞进行设门以选择CD45+群(图34C)。进一步对此群进行设门以确定Ly6G和CD11b双阳性的CD45⁺细胞的百分比；或中性粒细胞的百分比(图34D)。剩余群经选择且经设门以针对CD11b⁺MHCII^-群进行选择，以确定每种样品类型的活化单核细胞的群(图34E)。使用FlowJo v10以此方式对全血、脾、肝和肺样品进行此操作。进一步对肺样品进行设门以选择活化的巨噬细胞。

表9

表10

实施例3.脾免疫细胞群。结果描绘在图35A和B中。从对照4周和8周大野生型和法伯小鼠脾分析炎性状态所特有的炎性细胞群。从以下7周大的法伯小鼠中确定Ly6GCD11b双阳性CD45⁺中性粒细胞和CD11b⁺MHCII^-CD45⁺活化单核细胞的群，所述法伯小鼠从3周龄开始每周一次施用10mg/kg/剂的RVT-801，在4周内服用总共4剂。热图分析年龄匹配的法伯小鼠和同窝幼仔对照(野生型)的脾中免疫细胞频率的倍数变化差异。每个柱表示单独动物。通过将野生型平均值设置为1计算倍数变化。

实施例4.全身(血液)免疫细胞群。结果描绘在图36A-C中。从对照的4周和8周大野生型和法伯小鼠血液样品中分析炎性状态所特有的炎性细胞群。从以下7周大的法伯小鼠中确定Ly6G、CD11b双阳性CD45⁺中性粒细胞和CD11b⁺MHCII^-CD45⁺活化单核细胞的群，所述法伯小鼠从3周龄开始每周一次施用10mg/kg/剂的RVT-801，在4周内服用总共4剂。热图分析年龄匹配的法伯小鼠和同窝幼仔对照(野生型)的血液中免疫细胞频率的倍数变化差异。每个柱表示单独动物。通过将野生型平均值设置为1计算倍数变化。

实施例5.肺免疫细胞群。结果描述在图37A-D中。从对照的4周和8周大野生型和法伯小鼠肺组织中分析炎性状态所特有的炎性细胞群。从以下7周大的法伯小鼠中确定Ly6G、CD11b双阳性CD45+中性粒细胞和CD11b+MHCII-CD45+活化单核细胞的群，所述法伯小鼠从3周龄开始每周一次施用10mg/kg/剂的RVT-801，在4周内服用总共4剂。热图分析年龄匹配的法伯小鼠和同窝幼仔对照(野生型)的肺中免疫细胞频率的倍数变化差异。每个柱表示单独动物。通过将野生型平均值设置为1计算倍数变化。在图37C中还报告另外的巨噬细胞群，其是CD45+Ly6C-MHCII+CD11b-。

实施例6.肝免疫细胞群。结果描绘在图38A-B中。从对照的4周和8周大野生型和法伯小鼠肝组织中分析炎性状态所特有的炎性细胞群。从以下7周大的法伯小鼠中确定Ly6G/CD11b双阳性CD45+中性粒细胞和CD11b+hiMHCII-CD45+活化单核细胞的群，所述法伯小鼠从3周龄开始每周一次施用10mg/kg/剂的RVT-801，在4周内服用总共4剂。

本申请中所讨论的参考文献，所述参考文献出于其预期目的以全文引用的方式并入，所述目的基于本申请的上下文是清楚的。

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本文所引用的每一个专利、专利申请、公布和登录号的公开内容都特此以全文引用的方式并入本文中。

尽管已经参考各种实施方案公开本公开，但是显而易见的是，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计其它实施方案及其变型。所附权利要求书旨在解释为包括所有这类实施方案和等效变化形式。

等同物

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序列表

<110> 恩真万特诊疗公司

<120> 法伯病标志物及其用途

<130> ENZ-004WO

<140>

<141>

<150> 62/648,775

<151> 2018-03-27

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽（Description of Artificial Sequence:Synthetic polypeptide）

<220>

<221>

<222>

<223> 重组人酸性神经酰胺酶（Recombinant human acid ceramidase）

<400> 1

Met Pro Gly Arg Ser Cys Val Ala Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Ser Cys Ala Val Ala Gln His Ala Pro Pro Trp Thr Glu Asp Cys Arg

20 25 30

Lys Ser Thr Tyr Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr Arg Gly Ala Val Pro

35 40 45

Trp Tyr Thr Ile Asn Leu Asp Leu Pro Pro Tyr Lys Arg Trp His Glu

50 55 60

Leu Met Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Lys Val Ile Val Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Asn Met Ile Asn Thr Phe Val Pro Ser Gly Lys Ile Met Gln Val

85 90 95

Val Asp Glu Lys Leu Pro Gly Leu Leu Gly Asn Phe Pro Gly Pro Phe

100 105 110

Glu Glu Glu Met Lys Gly Ile Ala Ala Val Thr Asp Ile Pro Leu Gly

115 120 125

Glu Ile Ile Ser Phe Asn Ile Phe Tyr Glu Leu Phe Thr Ile Cys Thr

130 135 140

Ser Ile Val Ala Glu Asp Lys Lys Gly His Leu Ile His Gly Arg Asn

145 150 155 160

Met Asp Phe Gly Val Phe Leu Gly Trp Asn Ile Asn Asn Asp Thr Trp

165 170 175

Val Ile Thr Glu Gln Leu Lys Pro Leu Thr Val Asn Leu Asp Phe Gln

180 185 190

Arg Asn Asn Lys Thr Val Phe Lys Ala Ser Ser Phe Ala Gly Tyr Val

195 200 205

Gly Met Leu Thr Gly Phe Lys Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Leu Asn

210 215 220

Glu Arg Phe Ser Ile Asn Gly Gly Tyr Leu Gly Ile Leu Glu Trp Ile

225 230 235 240

Leu Gly Lys Lys Asp Val Met Trp Ile Gly Phe Leu Thr Arg Thr Val

245 250 255

Leu Glu Asn Ser Thr Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Asn Leu Leu Thr Lys

260 265 270

Thr Lys Ile Leu Ala Pro Ala Tyr Phe Ile Leu Gly Gly Asn Gln Ser

275 280 285

Gly Glu Gly Cys Val Ile Thr Arg Asp Arg Lys Glu Ser Leu Asp Val

290 295 300

Tyr Glu Leu Asp Ala Lys Gln Gly Arg Trp Tyr Val Val Gln Thr Asn

305 310 315 320

Tyr Asp Arg Trp Lys His Pro Phe Phe Leu Asp Asp Arg Arg Thr Pro

325 330 335

Ala Lys Met Cys Leu Asn Arg Thr Ser Gln Glu Asn Ile Ser Phe Glu

340 345 350

Thr Met Tyr Asp Val Leu Ser Thr Lys Pro Val Leu Asn Lys Leu Thr

355 360 365

Val Tyr Thr Thr Leu Ile Asp Val Thr Lys Gly Gln Phe Glu Thr Tyr

370 375 380

Leu Arg Asp Cys Pro Asp Pro Cys Ile Gly Trp

385 390 395

<210> 2

<211> 2618

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述: 合成的多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）

<220>

<221>

<222>

<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）

<400> 2

ggctcggtcc gactattgcc cgcggtgggg gagggggatg gatcacgcca cgcgccaaag 60

gcgatcgcga ctctccttct gcaggtagcc tggaaggctc tctctctttc tctacgccac 120

ccttttcgtg gcactgaaaa gccccgtcct ctcctcccag tcccgcctcc tccgagcgtt 180

ccccctactg cctggaatgg tgcggtccca ggtcgcgggt cacgcggcgg agggggcgtg 240

gcctgccccc ggcccagccg gctcttcttt gcctctgctg gagtccgggg agtggcgttg 300

gctgctagag cgatgccggg ccggagttgc gtcgccttag tcctcctggc tgccgccgtc 360

agctgtgccg tcgcgcagca cgcgccgccg tggacagagg actgcagaaa atcaacctat 420

cctccttcag gaccaacgta cagaggtgca gttccatggt acaccataaa tcttgactta 480

ccaccctaca aaagatggca tgaattgatg cttgacaagg caccagtgct aaaggttata 540

gtgaattctc tgaagaatat gataaataca ttcgtgccaa gtggaaaaat tatgcaggtg 600

gtggatgaaa aattgcctgg cctacttggc aactttcctg gcccttttga agaggaaatg 660

aagggtattg ccgctgttac tgatatacct ttaggagaga ttatttcatt caatattttt 720

tatgaattat ttaccatttg tacttcaata gtagcagaag acaaaaaagg tcatctaata 780

catgggagaa acatggattt tggagtattt cttgggtgga acataaataa tgatacctgg 840

gtcataactg agcaactaaa acctttaaca gtgaatttgg atttccaaag aaacaacaaa 900

actgtcttca aggcttcaag ctttgctggc tatgtgggca tgttaacagg attcaaacca 960

ggactgttca gtcttacact gaatgaacgt ttcagtataa atggtggtta tctgggtatt 1020

ctagaatgga ttctgggaaa gaaagatgtc atgtggatag ggttcctcac tagaacagtt 1080

ctggaaaata gcacaagtta tgaagaagcc aagaatttat tgaccaagac caagatattg 1140

gccccagcct actttatcct gggaggcaac cagtctgggg aaggttgtgt gattacacga 1200

gacagaaagg aatcattgga tgtatatgaa ctcgatgcta agcagggtag atggtatgtg 1260

gtacaaacaa attatgaccg ttggaaacat cccttcttcc ttgatgatcg cagaacgcct 1320

gcaaagatgt gtctgaaccg caccagccaa gagaatatct catttgaaac catgtatgat 1380

gtcctgtcaa caaaacctgt cctcaacaag ctgaccgtat acacaacctt gatagatgtt 1440

accaaaggtc aattcgaaac ttacctgcgg gactgccctg acccttgtat aggttggtga 1500

gcacacgtct ggcctacaga atgcggcctc tgagacatga agacaccatc tccatgtgac 1560

cgaacactgc agctgtctga ccttccaaag actaagactc gcggcaggtt ctctttgagt 1620

caatagcttg tcttcgtcca tctgttgaca aatgacagat cttttttttt tccccctatc 1680

agttgatttt tcttatttac agataacttc tttaggggaa gtaaaacagt catctagaat 1740

tcactgagtt ttgtttcact ttgacatttg gggatctggt gggcagtcga accatggtga 1800

actccacctc cgtggaataa atggagattc agcgtgggtg ttgaatccag cacgtctgtg 1860

tgagtaacgg gacagtaaac actccacatt cttcagtttt tcacttctac ctacatattt 1920

gtatgttttt ctgtataaca gccttttcct tctggttcta actgctgtta aaattaatat 1980

atcattatct ttgctgttat tgacagcgat ataattttat tacatatgat tagagggatg 2040

agacagacat tcacctgtat atttctttta atgggcacaa aatgggccct tgcctctaaa 2100

tagcactttt tggggttcaa gaagtaatca gtatgcaaag caatctttta tacaataatt 2160

gaagtgttcc ctttttcata attactctac ttcccagtaa ccctaaggaa gttgctaact 2220

taaaaaactg catcccacgt tctgttaatt tagtaaataa acaagtcaaa gacttgtgga 2280

aaataggaag tgaacccata ttttaaattc tcataagtag cattcatgta ataaacaggt 2340

ttttagtttg ttcttcagat tgatagggag ttttaaagaa attttagtag ttactaaaat 2400

tatgttactg tatttttcag aaatcaaact gcttatgaaa agtactaata gaacttgtta 2460

acctttctaa ccttcacgat taactgtgaa atgtacgtca tttgtgcaag accgtttgtc 2520

cacttcattt tgtataatca cagttgtgtt cctgacactc aataaacagt cactggaaag 2580

agtgccagtc agcagtcatg cacgctgatt gggtgtgt 2618

<210> 3

<211> 1276

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223>人工序列的描述: 合成的多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）

<220>

<221>

<222>

<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）

<400> 3

aagcttaccg ccaccatgaa ctgctgcatc ggcctgggtg agaaggcgcg tggctcgcac 60

cgcgccagct acccctccct gagcgccctc ttcaccgagg cgtccatcct cggattcggg 120

agcttcgccg tcaaggcaca gtggaccgag gattgccgca agagtacgta cccccccagt 180

ggcccgacgt accgcggcgc cgtcccctgg tacacgatca acctggacct ccccccgtac 240

aagcgctggc acgagttgat gctggacaag gcccccgtac tgaaggtcat cgtgaactcc 300

ctgaagaaca tgatcaacac cttcgtcccc tcgggcaaga tcatgcaggt cgtggacgag 360

aagctgcccg ggctcctcgg caacttcccc ggcccgttcg aagaggagat gaagggcatc 420

gcggccgtca ctgacatccc cctgggcgag atcatcagct tcaacatctt ctacgagctg 480

ttcaccatct gcacctccat cgtagccgag gacaagaagg gccacctgat ccacggtcgc 540

aacatggact tcggcgtctt cctgggctgg aacatcaaca acgacacctg ggtcatcacc 600

gagcagctga agccgctcac cgtgaacctc gatttccagc gcaacaacaa gacggtgttc 660

aaggccagct ccttcgccgg gtacgtcggg atgctcacgg gcttcaagcc gggactgttc 720

tcgctgaccc tcaacgagcg gttctccatc aacgggggct acctcggcat cctggagtgg 780

attctcggca agaaggacgt gatgtggatc ggcttcctca cacggaccgt gctggaaaac 840

tccactagtt acgaggaggc caagaacctg ctgaccaaga cgaagatcct ggccccggca 900

tacttcatcc tgggcggcaa ccagtcgggc gaggggtgcg tcatcacccg cgaccggaag 960

gagtccctgg acgtctatga gctggacgcc aagcagggcc gctggtacgt cgtccagacg 1020

aactacgacc gatggaagca ccccttcttc ctcgacgacc ggcgcacgcc cgccaagatg 1080

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accaagcccg tgctcaacaa gctgacggtc tacaccacgc tgatcgacgt gacgaaaggc 1200

cagttcgaaa cgtacctgcg ggactgcccg gacccttgca tcggctggtg ataatctaga 1260

gtcggggcgg ccggcc 1276

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述: 合成的多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）

<220>

<221>

<222>

<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）

<400> 4

aagcttaccg ccaccatgaa ctgctgcatc gggctgggag agaaagctcg cgggtcccac 60

cgggcctcct acccaagtct cagcgcgctt ttcaccgagg cctcaattct gggatttggc 120

agctttgctg tgaaagccca atggacagag gactgcagaa aatcaaccta tcctccttca 180

ggaccaacgt acagaggtgc agttccatgg tacaccataa atcttgactt accaccctac 240

aaaagatggc atgaattgat gcttgacaag gcaccagtgc taaaggttat agtgaattct 300

ctgaagaata tgataaatac attcgtgcca agtggaaaaa ttatgcaggt ggtggatgaa 360

aaattgcctg gcctacttgg caactttcct ggcccttttg aagaggaaat gaagggtatt 420

gccgctgtta ctgatatacc tttaggagag attatttcat tcaatatttt ttatgaatta 480

tttaccattt gtacttcaat agtagcagaa gacaaaaaag gtcatctaat acatgggaga 540

aacatggatt ttggagtatt tcttgggtgg aacataaata atgatacctg ggtcataact 600

gagcaactaa aacctttaac agtgaatttg gatttccaaa gaaacaacaa aactgtcttc 660

aaggcttcca gctttgctgg ctatgtgggc atgttaacag gattcaaacc aggactgttc 720

agtcttacac tgaatgaacg tttcagtata aatggtggtt atctgggtat tctagaatgg 780

attctgggaa agaaagatgt catgtggata gggttcctca ctagaacagt tctggaaaat 840

agcacaagtt atgaagaagc caagaattta ttgaccaaga ccaagatatt ggccccagcc 900

tactttatcc tgggaggcaa ccagtctggg gaaggttgtg tgattacacg agacagaaag 960

gaatcattgg atgtatatga actcgatgct aagcagggta gatggtatgt ggtacaaaca 1020

aattatgacc gttggaaaca tcccttcttc cttgatgatc gcagaacgcc tgcaaagatg 1080

tgtctgaacc gcaccagcca agagaatatc tcatttgaaa ccatgtatga tgtcctgtca 1140

acaaaacctg tcctcaacaa gctgaccgta tacacaacct tgatagatgt taccaaaggt 1200

caattcgaaa cttacctgcg ggactgccct gacccttgta taggttggtg ataacctagg 1260

gtcggggcgg ccggcc 1276

Claims (21)

1.一种用于确定受试者是否患有法伯病的方法，所述方法包括在来自受试者的生物样品中检测选自CD11b⁺Ly6G⁺、SSCmid FSCmid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII+CD11b-Ly6C+、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的至少一种标志物的含量水平，其中，

如果CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^mid FSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照，则所述受试者患有法伯病；并且

如果CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照，则所述受试者患有法伯病。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺的含量水平，其中MHCII+CD11b-Ly6C+的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的CD11b⁺CD38⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的CD11b⁺CD206⁺的含量水平，其中CD11b⁺CD206⁺的含量水平低于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的}CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平，其中}CD11b⁺Ly6G⁺的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺的含量水平，其中CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测来自所述受试者的样品中的CD19^-CD3⁺的含量水平，其中CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测是通过以下来执行：检测来自所述受试者的样品中的MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平，其中MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺和/或MHCII^-CD11b^hiCD86⁺的含量水平高于对照含量水平指示所述受试者患有法伯病。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测是通过以下来执行：检测来自所述受试者的样品中的CD19⁺CD38⁺的含量水平，并进一步检测来自所述受试者的样品中的CD19^-CD3⁺的含量水平，其中CD19+CD38+的含量水平高于对照含量水平和/或CD19^-CD3⁺的含量水平低于对照含量水平以及组合的检测结果指示所述受试者患有法伯病。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测是通过以下来执行：检测选自CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^mid FSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII+CD11b-Ly6C+、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种标志物的含量水平，以确定受试者是否患有法伯病。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是组织提取物样品或血液样品。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物样品获自肝、脾、肺或血液。

14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的可用于治疗法伯病的药物组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述rhAC的量为约0.1mg/kg至约50mg/kg。

17.一种用于执行根据权利要求1至16中任一项所述的方法的试剂盒，以及用于诊断法伯病的说明。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种抗体，所述抗体特异性结合标志物CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^mid FSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺或CD19^-CD3⁺。

19.一种用于治疗法伯病的方法，所述方法包括：

在来自受试者的样品中检测选自CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^midFSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺+、CD19⁺CD38⁺、CD11b⁺CD206⁺、MHCII⁺CD11b^midCD23⁺和CD19^-CD3⁺的至少一种标志物的含量水平，其中

如果CD11b⁺Ly6G⁺、SSC^mid FSC^mid、MHCII^-CD11b^hi、MHCII⁺CD11b^-Ly6C⁺、MHCII^-CD11b^hiCD86⁺、CD11b⁺CD38⁺、CD19⁺CD38⁺的含量水平高于对照，则所述受试者患有法伯病；并且

如果CD11b⁺CD206⁺、MHCII+CD11b^midCD23⁺和CD19-CD3+的含量水平低于对照，则所述受试者患有法伯病；以及

施用治疗有效量的可用于治疗法伯病的药物组合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述药物组合物包含重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述rhAC的量为约0.1mg/kg至约50mg/kg。

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