JP7161401B2 - アミロスフェロイド(aspd)様構造体及び医薬組成物 - Google Patents
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Description
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体を含むワクチンに関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体の能動ワクチンとしての使用に関する。
本開示は、その他の態様において、ワクチン製造における細胞分泌型ASPD様構造体の使用に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体の、ASPD測定における標準物質としての使用に関する。
本開示は、その他の態様において、ASPD、ASPDに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、細胞分泌型ASPD様構造体、前記医薬組成物、又は、前記ワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体と、抗ASPD抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する非ヒト動物に関する。
本開示は、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に分泌される、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つを指標とする、AβのC末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法に関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、簡便でスケールアップ可能な、細胞分泌型ASPD様構造体の提供に関する。
本開示における細胞分泌型ASPD様構造体は、一又は複数の実施形態において、保存安定性に優れる。
本開示における細胞分泌型ASPD様構造体は、一又は複数の実施形態において、Aβモノマーの含有率を極めて低く製造することもできるため、限外ろ過によるAβモノマーの除去が簡単となり、ワクチン等の製造効率の向上が可能となる。
また、本開示における細胞分泌型ASPD様構造体は、一又は複数の実施形態において、Aβモノマーの含有率を低減できるから、生体に投与した場合の安全性を、例えば、ネイティブASPDや合成ASPDよりも、向上しうる。
本開示において、ASPD様構造体とは、ASPDに特異的な抗体が抗原抗体反応する構造体、言い換えれば、ASPDに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体をいう。
なお、本開示において、単にアミロスフェロイド(ASPD)という場合には、ネイティブASPD及び合成ASPDを含みうる。
本開示において、細胞分泌型ASPD様構造体は、本開示にかかる製造方法によって製造されるASPD様構造体をいう。一又は複数の実施形態において、APP又はAβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞の培養液中に見出されたASPD様構造体をいう。本開示に係る細胞分泌型ASPD様構造体は、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する細胞の培養液中に得られるものであるから、細胞分泌型であるといえる。
本開示に係る細胞分泌型ASPD様構造体は、一又は複数の実施形態において、アミロイド前駆体タンパク質(APP)又はアミロイドβタンパク質(Aβ)配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養することで、その培養液中に得ることができる。
したがって、本開示は一態様において、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ASPD様構造体を得る工程を含む、細胞分泌型ASPD様構造体の製造方法に関する。以下、前記製造方法を単に「本開示に係る製造方法」ともいう。
その他の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるAPPは、細胞分泌型ASPD様構造体の形成効率を向上させる点から、Aβの33番目及び37番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、細胞分泌型ASPD様構造体の形成効率を向上する点、及び、培養液中のAβ量を低減する点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、33番目及び37番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるAPPの一部は、N末端が切断された形態であってもよく、さらなる一又は複数の実施形態において、N末端がβシクレターゼの切断部位で切断された形態であってもよい。
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるAPPの一部は、Aβの1~43番目、1~42番目又は1~40番目を含む部分であることが挙げられ、さらなる一又は複数の実施形態において、Aβの1~43番目、1~42番目又は1~40番目を含む部分、及び、APPのシグナル配列を有することが挙げられる。
APP又はその一部の発現系が導入される宿主細胞は、一又は複数の実施形態において、取扱性の点から、細胞株が好ましい。限定されない具体的な細胞株としては、CHO細胞、HEK293細胞、Neuro2a細胞などが挙げられる。
培養液中の細胞分泌型ASPD様構造体の回収は、一又は複数の実施形態において、孔径0.22μmフィルターのろ液を50kDa又は100kDaの限外ろ過をした保持液を回収する工程により行うことができる。但し、ASPDの回収方法はこの方法に限定されなくてもよい。
ASPDを構成するAβそのものを生体内に導入して免疫を付与する試みの結果、Aβの配列の一部(16~33番目の残基)がT細胞を活性化し炎症性反応を引き起こすことが報告された(Monsonego, A. et al. J. Clin. Invest. 112:415-422 (2003), Monsonego, A. et al. PNAS 103:5048-5053 (2006))。したがって、Aβそのものをワクチンとして用いることは難しい。
一方、ASPDは、T細胞を活性化するAβの配列(16~33番目の残基)が球状構造の内部に折り畳まれてほぼ隠され(Ohnishi et al. PNAS 112:E4465-E4474 (2015))、Aβワクチンで問題となる炎症性T細胞応答を惹起しないというデータが得られている。
そして、合成ASPDについては、アジュバントなしでウサギに免疫がつくこと、その免疫量は通常のペプチド抗原の1/5~1/10と少量で充分であることが見出された。さらに、ASPDを用いて老齢カニクイザルの皮下投与で免疫すると、脳の糖代謝(神経活動)が高まることも見出された。
これらの知見から、ASPDは、安全性が高い能動ワクチンとして使用できるといえる。そして、本開示にかかる細胞分泌型ASPD様構造体も、能動ワクチンとして使用でき、また、ワクチンの製造に使用できる。
したがって、本開示は、一態様において、ASPDを有効成分とする医薬組成物に関し、或いは、ASPDを含むワクチンに関する。
本開示に係る細胞分泌型ASPD様構造体を用いたワクチン等の医薬組成物であれば、一又は複数の実施形態において、これらの問題の1つ若しくは一部又はそれ以上を解消しうる。
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ASPDに起因する疾病を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。該対象としては、哺乳類、ヒト、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。
本開示は、その他の態様において、ASPD、ASPDに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、細胞分泌型ASPD様構造体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ASPD様構造体を有効成分とする医薬組成物、又は、細胞分泌型ASPD様構造体を有するワクチンの製造方法であって、本開示に係る製造方法により細胞分泌型ASPD様構造体を製造する工程を含む製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する非ヒト動物に関する。前記細胞は、細胞分泌型ASPD様構造体を分泌するから、前記非ヒト動物は、ASPDに起因する疾病、例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症のモデル動物となり得る。前記細胞としては、該モデル動物とする観点から、脳の細胞が好ましく、或いは、神経細胞が好ましい。前記発現系の導入方法は、特に制限されないが、遺伝子導入技術を用いる方法、ゲノム編集技術を用いる方法などが挙げられる。非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳類、ヒト以外の霊長類が挙げられる。本態様の一又は複数の実施形態は、APP又はAβ配列を含むその一部を発現するように遺伝子改変された細胞を有する遺伝子改変動物である。
本態様のモデル動物において、遺伝子改変された細胞内で発現されるAPPは、例えば、本開示で開示されるような、APPの変異体又はAβの変異体であってもよい。すなわち、前記細胞で発現されるAPPは、上述と同様に、Aβの25番目、29番目、33番目、及び37番目に相当するグリシンからなる群から選択される1又は複数のグリシンの置換変異を有することが好ましく、少なくとも33番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。置換変異としては、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましい。
その他の一又は複数の実施形態において、前記細胞で発現されるAPPは、Aβの33番目及び37番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、33番目及び37番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
細胞分泌型ASPD様構造体は、一又は複数の実施形態において、ASPD測定におけるASPDの標準物質として使用できる。その他の一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ASPD様構造体は、ASPDを測定するキットに使用できる。すなわち、本開示は、一態様において、細胞分泌型ASPD様構造体と抗ASPD抗体を含むキットに関する。抗ASPD抗体としては、上述のASPDに特異的な抗体が挙げられる。また、本開示は、一態様において、細胞分泌型ASPD様構造体と、抗ASPD抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法に関する。これらのキットは、例えば、ASPDの測定に使用できる。
本開示は、一態様において、ASPDの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される、ASPDに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体(すなわち、細胞分泌型ASPD様構造体)の形成効率を指標とすることを含むスクリーニング方法に関する。
前記指標は、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ASPD様構造体の形成量であってもよく、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43又はこれらの合計量に対する相対量であってもよい。この形態のスクリーニング方法は、テスト物質を培養液に添加した場合と添加しない場合とにおける細胞分泌型ASPD様構造体の形成効率を比較して、ASPDの形成に影響を与える物質であるか否かを判断すること含んでもよい。例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に該形成効率が低下すれば、該物質がASPDの形成を阻害する影響があると判断できる。また、例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に該形成効率が亢進すれば、該物質がASPDの形成を促進する影響があると判断できる。
本態様のスクリーニング方法において、培養する細胞内で発現されるAPPは、例えば、本開示で開示されるような、APPの変異体又はAβの変異体であってもよい。
本開示は、一態様において、AβのC末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つのAβを指標とすることを含むスクリーニング方法に関する。
前記指標は、一又は複数の実施形態において、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及びこれらの組合せの分泌量若しくは培養液中の濃度であってもよく、或いは、例えば、Aβ40に対するAβ42の割合(Aβ42/Aβ40)といった相対量であってもよい。この形態のスクリーニング方法は、テスト物質を培養液に添加した場合と添加しない場合とにおける前記指標を比較して、AβのC末端切断に影響を与える物質であるか否か、或いは、γセクレターゼに対する影響を与える物質であるか否かを判断すること含んでもよい。例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に「Aβ42/Aβ40」が低下すれば、該物質がAβ42の産生を抑制する影響があると判断できる。
本態様のスクリーニング方法において、培養する細胞内で発現されるAPPは、例えば、本開示で開示されるような、APPの変異体又はAβの変異体であってもよい。
本開示は、さらにその他の態様において、変異型合成ASPDに関する。本開示において、変異型合成ASPDは、変異型のAβを用いて、合成ASPDの製造方法と同様の製法で合成される合成ASPD様構造体をいう。すなわち、本開示において、変異型合成ASPDは、Aβの25~37番目のアミノ酸配列におけるGXXXGモチーフのグリシンに1又は複数の置換変異を有する変異型Aβを含む液体を撹拌することで形成される合成ASPD様構造体をいう。前記液体には、変異型合成ASPDの形成効率向上の観点から、例えば、フタル酸エステルなどの可塑剤が含まれていてもよい。一又は複数の実施形態において、変異型合成ASPDは、前記変異型Aβを、前記可塑剤を含む有機溶媒に溶解すること、前記変異型Aβの溶液を水性溶液で希釈すること、及び、前記希釈後の溶液を撹拌することを含む製造方法で合成できる。
前記変異型Aβとしては、Aβの25番目、29番目、33番目、及び37番目に相当するグリシンからなる群から選択される1又は複数のグリシンの置換変異を有することが好ましく、少なくとも33番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。置換変異としては、合成ASPDの形成効率向上の観点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、システインへの置換変異が好ましい。
前記変異型Aβとしては、その他の一又は複数の実施形態において、Aβの33番目及び37番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、合成ASPDの形成効率向上の観点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、33番目及び37番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
本開示に係る変異型ASPDは、一又は複数の実施形態において、ASPD特異的抗体に対して抗原性を示す。また、本開示に係る変異型ASPDは、その他の一又は複数の実施形態において、成熟神経細胞に対して細胞毒性を示す。
[1] 細胞分泌型アミロスフェロイド(ASPD)様構造体の製造方法であって、アミロイド前駆体タンパク質(APP)又はアミロイドβタンパク質(Aβ)配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ASPD様構造体を得る工程を含む、製造方法。
[2] さらに、前記培養液中から細胞分泌型ASPD様構造体を回収することを含む、[1]記載の製造方法。
[3] 前記細胞が、APP又はAβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞である、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 前記APPは、野生型、又は、1若しくは複数のアミノ酸変異を有する前記野生型の変異体である、[1]から[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] 前記APPは、Aβアミノ酸配列のGXXXGモチーフにおけるグリシンにアミノ酸変異を有する野生型又は変異体のAPPである、[1]から[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6] APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に得られる構造体であって、ASPDに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ASPD様構造体。
[7] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体を有効成分とする医薬組成物。
[8] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体を含むワクチン。
[9] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体、及び、抗ASPD抗体を含むキット。
[10] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体の能動ワクチンとしての使用。
[11] ワクチン製造における[6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体の使用。
[12] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体の、ASPD測定における標準物質としての使用。
[13] ASPDが起因となる疾病の予防、改善、及び/又は治療の方法であって、[6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体、[7]に記載の医薬組成物、又は、[8]に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
[14] ASPDが起因となる疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、[13]に記載の方法。
[15] ASPD、ASPDに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、[6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体、[7]に記載の医薬組成物、又は、[8]に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
[16] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
[17] [6]に記載の細胞分泌型ASPD様構造体と、抗ASPD抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法。
[18] APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する、非ヒト動物。
[19] APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される構造体であって、ASPDに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体の形成効率を指標とすることを含む、ASPDの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法。
[20] APP又はAβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に分泌される、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つを指標とする、AβのC末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法。
[21] Aβの25~37番目のアミノ酸配列におけるGXXXGモチーフのグリシンに1又は複数の置換変異を有する変異型Aβを含む液体を撹拌することで形成される合成ASPD様構造体。
(1-1)ヒトアミロイド前駆体タンパク質(hAPP)
発現させるアミロイド前駆体タンパク質(APP)として、下記表1及び図1に示す試験例1~14のAPPを用いた。図1の配列(配列番号1)は、ヒトのAβを含むhAPPの部分アミノ酸配列である。
試験例1~7のAPPは、hAPP770野生型、hAPP770Swedish変異型、及びGXXXGモチーフの1又は2個のグリシンが変異したhAPP770Swedish型である。
試験例8~14のAPPは、hAPP695野生型、hAPP695Swedish変異型、及びGXXXGモチーフの1又は2個のグリシンが変異したhAPP695Swedish型である。
上記試験例1~14のhAPPを過剰発現するCHO細胞を以下のように作製した。
CHO/K1細胞を増殖培地にて2.5x104cells/cm2の密度で12ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2で維持した。24時間後、遺伝子導入試薬(FuGENE HD)を用いて発現ベクターをCHO/K1細胞に導入した。導入方法は、1ウェルあたりOpti-MEM 25μL及びプラスミドDNA 0.5μgを混合し、さらに1.5μLのFuGENE HDを加え、室温で10分間反応させた。その間に0.5mL増殖培地を交換しておき反応終了後、反応液を25μL添加した。24時間後、新しい1mL増殖培地に交換してさらに培養した。
増殖培地:10%FBS含有Ham’s F-12培地に、100ユニット/mL penicillin、及び、100μg/mL streptomycinを加えたもの
(2-1)hAPPを過剰発現する培養細胞の培養と上清の回収
遺伝子導入から48時間後、細胞を1xPBS(-)にて2回洗浄したのち1mL無血清培地に交換した。無血清培地に交換24時間後、0.22μmフィルターでろ過した培養上清を回収し、直ちに液体窒素で凍結させて-80℃にて保存した。
無血清培地:DMEM/F-12に1xITS-Xを加えたもの
APP過剰発現細胞を培養した培養液を回収し、培養液中のASPD,Aβ1-40、及びAβ1-42の含有量を下記条件のELISA法で確認した。その結果を図2~4に示す。
[ASPD ELISA]
回収した培養上清について、抗ASPD抗体2種類(rpASD1、MASD3)を用いたサンドイッチELISAで定量した。
詳細には、測定前日に白色96ウェルプレートに抗ASPDポリクローナル抗体(rpASD1)を500ng/ウェルとなるように分注し、4℃で一晩固相化した。翌日、ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後、3%BSAにて30分間ブロッキングを行い、再度3回洗浄した。各ウェルに100μLの標準液またはサンプルを分注し、1時間室温でインキュベーション後、3回洗浄し、100ng/ウェルとなるように抗ASPDモノクローナル抗体(MASD3)を添加し、さらに1時間室温でインキュベーションした。再度3回洗浄を行い、1/10,000希釈した二次抗体(抗マウスIgG-HRP)を100μL/ウェルで分注し、1時間室温でインキュベーションした。3回洗浄した後、100μLの発光基質を添加して1分遮光で反応させ、ルミノメーターで発光を検出した。
[Aβ ELISA]
回収した培養上清について、市販で入手可能なAβ monomer ELISA kitを用いて測定した。使用したKitは、以下の通り。測定は、Kit添付の説明書通り行った。
Aβ1-40:ヒトβアミロイド(1-40)ELISAキットワコー(Wako#292-62301)
Aβ1-42:ヒトβアミロイド(1-42)ELISAキットワコー高感度品(Wako#296-64401)
hAPP770とhAPP695を比較した場合、変異による大きな差は見られなかったが、若干hAPP695の方が、培養上清中のASPD濃度が高い傾向があった。また、変異の場所と数については、2カ所でも1カ所でもG704又はG629のG/L変異がASPD形成には重要であると考えられた。さらに、野生型(wt)に比べ、Swedish(sw)変異ではアミロイドがより多く分泌されるが、さらにGXXXGモチーフに変異を入れることによって、ほとんどのアミロイドがASPDの構成要素として使用されることが示唆された。
hAPP695Swedish変異型の629位(Aβの33位)のグリシンを19種のアミノ酸に変異させたAPPを過剰発現する細胞を上記(1-2)と同様に作製し、上記2.と同様に培養してその培養液中に培養液中のASPD,Aβ1-40、及びAβ1-42の含有量を確認した。その結果を表2及び図5~7に示す。
CHOの他に、HEK293及びNeuro2aの細胞株においても、APP又はAβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞とすることで、細胞内でASPD様構造体が形成されることが認められた。
試験例14のhAPP695-sw-G33Iを発現させて得られた細胞分泌型ASPD構造体を0ヶ月、3ヶ月及び6ヶ月間-80℃保存したサンプルを、2種類のASPD特異的抗体(中和抗体)を用いたサンドイッチELISAで測定して検量線を作成した。
その結果、その検量線の一次回帰直線の傾きは、3つのサンプルでほぼ一定の値を示した。したがって、サンドイッチELISAに使用している中和抗体2種類に対する反応性が安定しており、保存による劣化はないと考えられた。
一方、従来の方法で製造された合成ASPDは、-80℃の保存後では一次回帰直線における傾きのバラツキが大きく、ASPD濃度に対しるシグナルの大きさもバラツキが大きく、保存安定性が低いと考えられる。
ニュージーランドホワイト(各条件3羽)に、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、アジュバントなしで、合成ASPDによる100μg免疫を6回行い、その後、全採血を行い、血清中の合成ASPDに対する反応性をドットブロットで評価を行った。その結果の一例を図8に示す。全てのウサギでアジュバントなしでも充分な反応性が得られることがわかった。
野生型Aβ1-42を用いて製造した合成ASPDの神経細胞毒性と、G33L変異型Aβ1-42を用いて製造した変異型合成ASPD(G33L)の神経細胞毒性とを比較した。
具体的には、一定濃度の合成ASPD(0.58μM)及び変異型合成ASPD(0.53μM)をそれぞれ成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に投与し一晩置いた後、蛍光試薬(Thermo Fisher社製CyQUANT)を添加し、共焦点イメージサイトメーターCQ1を用いて細胞生存率を確認した。その結果を図9の右に示す。同図に示す通り、変異型合成ASPD(G33L型)は、合成ASPD(野生型)と同様に、成熟神経細胞に対して同程度の細胞毒性を示した。
合成ASPDまたは変異型合成ASPD(G33L)をリガンドとしてセンサーチップ上に固相化し、アナライトとして抗ASPDポリクローナル抗体(rpASD1)を流して表面プラズモン共鳴(SPR)により解離定数(KD)を求めた。その結果、抗ASPDポリクローナル抗体(rpASD1)に対する反応性は、合成ASPDと変異型合成ASPD(G33L)とで同等であった。
発現させるアミロイド前駆体タンパク質(APP)として、下記表3及び図1に示す試験例15~36のAPPを用いた。上記1及び2の記載と同様にして、APP過剰発現細胞を培養した培養液を回収し、培養液中のASPD,Aβ1-40、及びAβ1-42の含有量を下記条件のELISA法で確認した。その結果を図10~12に示す。
ロイシンへの1アミノ酸又は2アミノ酸置換変異と、イソロイシンのそれらとで、上清中のASPD,Aβ1-40、及びAβ1-42の含有量に大きな差は見られなかった。しかし、Aβの33番目及び37番目のグリシンが二つともイソロイシンに変異したAPP(試験例30)のASPD形成量は、Aβの33番目及び37番目のグリシンが二つともロイシンに変異したAPP(試験例23)と比べて、著しく増加していた。
また、2か所をロイシンとイソロイシンに変異させたAPP(試験例31-36)では、Aβの33番目及び37番目のグリシンをロイシンとイソロイシンに変異させたAPP(試験例35-36)のASPDの形成量が、Aβの33番目及び37番目のグリシンが二つともイソロイシンに変異したAPP(試験例30)と同程度に増加した。
Claims (14)
- 細胞分泌型アミロスフェロイド(ASPD)様構造体の製造方法であって、
アミロイド前駆体タンパク質(APP)又はアミロイドβタンパク質(Aβ)配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ASPD様構造体を得る工程、及び
前記培養液中から細胞分泌型ASPD様構造体を回収する工程を含む、製造方法。 - 前記細胞分泌型ASPD様構造体は、分子量が100kDa以上である、請求項1記載の製造方法。
- 前記細胞が、APP又はAβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記APPは、野生型、又は、1若しくは複数のアミノ酸変異を有する前記野生型の変異体である、請求項1から3のいずれかに記載の製造方法。
- 前記APPは、Aβアミノ酸配列のGXXXGモチーフにおけるグリシンにアミノ酸変異を有する変異体のAPPである、請求項1から4のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載の製造方法により製造される、ASPDに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ASPD様構造体。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体を有効成分とする医薬組成物。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体を含むワクチン。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体、及び、抗ASPD抗体を含むキット。
- ワクチン製造における請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体の使用。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体の、ASPD測定における標準物質としての使用。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
- 請求項6に記載の細胞分泌型ASPD様構造体と、抗ASPD抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法。
- アミロイド前駆体タンパク質(APP)又はアミロイドβタンパク質(Aβ)配列を含むその一部を発現する細胞を培養する培養液にテスト化合物を添加すること、及び、
ASPD特異的抗体に対して抗原性を示す構造体の形成効率を指標とし、前記テスト化合物を添加した場合と添加しない場合とで前記形成効率を比較することを含む、ASPDの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法。
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