KR20180134373A - 아밀로스페로이드(aspd)형 구조체 및 의약 조성물 - Google Patents

아밀로스페로이드(aspd)형 구조체 및 의약 조성물 Download PDF

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Abstract

세포 분비형 아밀로스페로이드형(樣) 구조체 및 그것을 이용한 의약 및 백신 및 그들의 제법을 제공한다. 한 형태에 있어서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 아밀로이드β 단백질(Aβ) 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 세포 분비형 아밀로스페로이드(ASPD)형 구조체를 얻는 공정을 포함하는 제조 방법에 관한 것이다.

Description

아밀로스페로이드(ASPD)형 구조체 및 의약 조성물
본 개시는, 아밀로스페로이드(ASPD)형(樣) 구조체, 그 제조 방법 및 그 사용, 의약 조성물, 그 제조 방법 및 그 사용, 및, 스크리닝 방법에 관한 것이다.
아밀로스페로이드(amylospheroids(ASPD))는, 아밀로이드β 단백질(Aβ)이 약 30개 모인 직경 약 10㎚의 구형상의 Aβ 집합체로서, 알츠하이머병이 발증하는 불가역적 단계에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 생각되는 구조체이다.
ASPD는, 강한 신경 독성을 나타내는 in vitro로 합성된 Aβ 집합체(즉, 합성 ASPD)로서 단리(單離)되었다(비특허문헌 1). 이 합성 ASPD에 대한 특이적인 항체가 제작되고(특허문헌 1 및 2), 이 항체를 이용하여 알츠하이머병의 인간 환자의 뇌로부터, 실제로, 생체 내에서 형성된 ASPD(즉, 네이티브 ASPD)가 단리되었다(비특허문헌 1).
네이티브 ASPD 및 합성 ASPD는, 마찬가지로, 성숙 신경세포에 대해서 선택적으로 세포사를 유발한다. 이 신경세포사에 있어서의 ASPD의 타겟이, 신경의 생존과 기능에 매우 중요한 역할을 수행하고 있는 시냅스 단백질 「Na+, K+-ATPase 펌프의 α3 서브유닛(이하, NAKα3)」인 것이 발견되고, ASPD의 결합에 의해 NAKα3의 기능이 저하되고, 신경세포가 과잉으로 흥분함으로써 신경세포가 죽음에 이르는 것이 밝혀졌다(특허문헌 3, 비특허문헌 2).
알츠하이머병에 있어서의 임상 증상과 가장 상관되는 것이 신경세포의 탈락이다. 신경세포 탈락이 인정되는 알츠하이머병 환자의 대뇌피질에 있어서의 네이티브 ASPD량은, 알츠하이머병의 중증도와 상관되어 증가하고, 그리고, 신경세포 탈락이 그다지 인정되지 않는 알츠하이머병 환자의 소뇌에 있어서의 네이티브 ASPD량은 미량밖에 존재하지 않는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 3). 따라서 아밀로스페로이드는, 알츠하이머병이 발증하는 불가역적 단계에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 생각된다. 또한, 네이티브 ASPD는, 레비소체형 인지증 환자의 뇌로부터도 검출되고 있고(비특허문헌 3), 레비소체형 인지증에 있어서도 ASPD는 그 발증에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 생각된다.
네이티브 ASPD와 등가라고 생각되는 합성 ASPD는, Aβ를 포함하는 액체를 천천히 교반함으로써 제조될 수 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 4).
WO2006/016644 WO2009/057664 WO2013/099806 WO2013/094614
Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid(amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375 Ohinishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474 Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47):32895-905
상술과 같이, 아밀로스페로이드(ASPD)는 알츠하이머병이나 레비소체형 인지증에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 현 시점에서는, 네이티브 ASPD를 환자 뇌로부터 정제하여 치료약 등의 개발에 사용하는 것은 매우 곤란하다. 따라서, 환자 뇌에 존재하는 네이티브 ASPD와 등가 혹은 부분적으로 등가인 ASPD형 구조체가 제조하기 쉬워지면, 알츠하이머병이나 레비소체형 인지증의 연구, 및, 이들 질병에 대한 예방 방법 및 예방약, 및, 치료 방법 및 예방, 치료약의 개발에 크게 기여하는 것이라고 생각된다.
아밀로이드β 단백질(Aβ)을 포함하는 액체를 천천히 교반함으로써, 네이티브 ASPD와 거의 등가인 합성 ASPD를 in vitro로 제조할 수 있다(비특허문헌 1 및 특허문헌 4). 그리고, 합성 ASPD는, 아쥬반트 없이 토끼에게 면역을 유도할 수 있는 것, 노령 원숭이에서 일정한 백신 효과가 있고 안전하다는 것이 발견되었다. 한편, 합성 ASPD는, 제조 로트마다 ASPD량이 어느 정도 오르내리는 것, 제조된 ASPD의 장기 보관이 어려운 것, 제조량의 스케일업이 곤란한 것 등의 문제도 발견되었다.
그래서, 본 개시는, 한 형태에 있어서, ASPD형 구조체 및 그 제조 방법을 제공한다.
본 개시는, 한 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조 방법으로서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양하고, 그 배양액 중에 세포 분비형 ASPD형 구조체를 얻는 공정을 포함하는 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 얻어지는 구조체로서, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는, 세포 분비형 ASPD형 구조체에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 능동 백신으로서의 사용에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 백신 제조에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체의 사용에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체의, ASPD 측정에 있어서의 표준 물질로서의 사용에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, ASPD가 기인이 되는 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료의 방법으로서, 세포 분비형 ASPD형 구조체, 상기 의약 조성물, 또는, 상기 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, ASPD, ASPD에 기인하는 질병, 또는, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증에 대한 면역을 대상으로 하여금 획득하게 하는 방법으로서, 세포 분비형 ASPD형 구조체, 상기 의약 조성물, 또는, 상기 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 약학적으로 허용되는 부형제를 조합하는 것을 포함하는, 의약 조성물 또는 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체, 및, 항ASPD 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 항ASPD 항체를 조합하는 것을 포함하는, 키트의 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 갖는 비인간 동물에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 형성되는, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체의 형성 효율을 지표로 하는 것을 포함하는, ASPD의 형성에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 개시는, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 분비되는, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 지표로 하는, Aβ의 C 말단 절단에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
도 1은, 발현시킨 APP의 변이 및 그들의 변이체의 변이 개소를 설명하는 개략도이다.
도 2는, 시험예 1~14의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 ASPD 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 시험예 1~14의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-40 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 시험예 1~14의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-42 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, hAPP695sw-G33X를 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 ASPD 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, hAPP695sw-G33X를 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-40 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, hAPP695sw-G33X를 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-42 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 합성 ASPD의 면역원성을 평가한 결과의 일례를 나타내는 그래프이다.
도 9는, 합성 ASPD(야생형) 및 합성 ASPD(G33L형)의 신경세포 독성을 확인한 결과의 일례를 나타내는 그래프이다.
도 10은, 시험예 15~36의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 ASPD 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은, 시험예 15~36의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-40 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 시험예 15~36의 APP의 발현계에서 과잉 발현시킨 세포의 배양액 중의 Aβ1-42 농도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
본 개시는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 발현하는 세포를 배양한 배양액 중에 ASPD형 구조체의 존재가 확인된 것에 기초한다.
본 개시는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 간편하게 스케일업 가능한, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제공에 관한 것이다.
본 개시에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 보존 안정성이 뛰어나다.
본 개시에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ 모노머의 함유율을 매우 낮게 제조할 수도 있기 때문에, 한외 여과에 의한 Aβ 모노머의 제거가 간단해지고, 백신 등의 제조 효율의 향상이 가능해진다.
또, 본 개시에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ 모노머의 함유율을 저감할 수 있기 때문에, 생체에 투여한 경우의 안전성을, 예를 들면, 네이티브 ASPD나 합성 ASPD보다 향상시킬 수 있다.
[아밀로스페로이드(ASPD)형 구조체]
본 개시에 있어서, ASPD형 구조체란, ASPD에 특이적인 항체가 항원 항체 반응하는 구조체, 바꾸어 말하면, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체를 말한다.
또한, 본 개시에 있어서, 단지 아밀로스페로이드(ASPD)라고 하는 경우에는, 네이티브 ASPD 및 합성 ASPD를 포함할 수 있다.
ASPD에 특이적인 항체로서는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, WO2006/016644 및 WO2009/057664에 개시되는 폴리클로널 항ASPD 항체 및 모노클로널 항ASPD 항체를 들 수 있고, 추가의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 토끼 폴리클로널 항ASPD 항체(rpASD1, rpASD2 및 rpASD3), 마우스 모노클로널 항ASPD 항체(MASD1, MASD2 및 MASD3), 햄스터 모노클로널 항ASPD 항체(haASD1, haASD2, haASD3, haASD4 및 haASD5), 및, 인간화 모노클로널 항ASPD 항체(huASD2) 등을 들 수 있다.
[세포 분비형 ASPD형 구조체]
본 개시에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 본 개시에 관련된 제조 방법에 의해 제조되는 ASPD형 구조체를 말한다. 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부의 발현계가 도입된 세포의 배양액 중에 발견된 ASPD형 구조체를 말한다. 본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포의 배양액 중에 얻어지는 것이기 때문에, 세포 분비형이라고 할 수 있다.
따라서, 본 개시는 한 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 얻어지는 구조체로서, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는, 세포 분비형 ASPD형 구조체에 관한 것이다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD와 등가인 것이어도 되고, 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD와 부분적으로 등가인 것이어도 된다. 부분적으로 등가란, 적어도, ASPD에 특이적인 항체가 항원 항체 반응하는 구조체, 바꾸어 말하면, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체인 것을 말한다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ 집합체이다. 본 개시에 있어서, 단지 Aβ라고 할 때는, Aβ40(Aβ1-40), Aβ41(Aβ1-41), Aβ42(Aβ1-42), Aβ43(Aβ1-43), 또는 이들 전부 혹은 일부를 가리킬 수 있다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD와 같은 분자량이어도 되고, 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 100kDa 이상, 또는, 100~700kDa이다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD의 세포 독성, 즉, 기능적으로 성숙한 신경세포에 선택적으로 세포사를 유발하는 특성이, ASPD와 동등해도 되고, 혹은, ASPD보다 약한 독성이어도 되고, 혹은, 세포 독성을 갖고 있지 않아도 되고, 혹은, ASPD와 비교하여 독성이 높아도 된다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD와 같은 형상이어도 되고, 다른 형상이어도 된다. 본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 추가의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 전자현미경 관찰에 있어서 직경 10~15㎚의 구형상이어도 되고, 상기 형상과는 다른 형상이어도 된다.
[세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조 방법]
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 아밀로이드β 단백질(Aβ) 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양함으로써, 그 배양액 중에 얻을 수 있다.
따라서, 본 개시는 한 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 세포 분비형 ASPD형 구조체를 얻는 공정을 포함하는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조 방법에 관한 것이다. 이하, 상기 제조 방법을 단지 「본 개시에 관련된 제조 방법」이라고도 한다.
본 개시에 관련된 제조 방법에 있어서, 배양되는 세포 내에서 발현하는 APP는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 사람 APP여도 되고, 사람 이외의 동물의 APP여도 된다. 사람 APP는, hAPP770, hAPP751, 및 hAPP695 중 어떤 스플라이싱 변이여도 된다. APP 및 Aβ의 서열은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, hAPP770의 NCBI의 액세션 번호는, NP＿000475(VERSION NP_000475.1 GI:4502167)이다. 스플라이싱 변이의 서열은 예를 들면 UniProtKB-P05067(Modified:November 1, 1991 -v3)을 참조할 수 있다.
또, 본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량을 향상시키는 점에서, 상기 세포에 도입된 APP의 발현계로부터 발현시키는 것이 바람직하고, 또한/또는, 상기 세포에 있어서의 과잉 발현인 것이 바람직하다. 본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량을 향상시키는 점에서, APP의 시그널 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, 야생형이어도 되고, 혹은, 변이형의 APP여도 된다. 변이형 APP로서는, 가족성 알츠하이머병에 연쇄하는 변이를 들 수 있고, 예를 들면, Swedish 변이, Italian 변이, Leuven 변이, Icelandic 변이, London 변이, Iranian 변이, Austrian 변이, German 변이, French 변이, Florida 변이, Iberian 변이, Australian 변이, Belgian 변이, Flemish 변이, Icelandic 변이, British 변이, Tottori 변이, Arctic 변이, Osaka 변이, Iowa 변이, Dutch 변이 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량을 향상시키는 점에서는 Swedish 변이를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 향상시키는 점에서, Aβ의 25~37번째의 아미노산 서열에 있어서의 GXXXG 모티프의 글리신에 1 또는 복수의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 즉, Aβ의 25번째, 29번째, 33번째, 및 37번째에 상당하는 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하고, 적어도 33번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 치환 변이로서는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 향상시키는 점, 및, 배양액 중의 Aβ량을 저감하는 점에서, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 또는 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하다. 본 개시에 있어서, 1 또는 복수란, 1, 2, 3 혹은 4, 또는, 1, 2 혹은 3, 또는, 1 혹은 2이다.
그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 향상시키는 점에서, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 본 실시 형태에 있어서, 치환 변이로서는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 향상시키는 점, 및, 배양액 중의 Aβ량을 저감하는 점에서, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 또는 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하고, 33번째 및 37번째 중 적어도 한쪽이, 이소류신으로의 치환 변이인 것이 보다 바람직하다.
본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현되는 APP는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 향상시키는 점에서, Swedish 변이 및 Aβ의 25번째, 29번째, 33번째, 및 37번째에 상당하는 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 글리신의 치환 변이를 갖는 것을 들 수 있다. 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 본 개시에 있어서의 APP는, hAPP770 또는 hAPP695에 있어서 Swedish 변이 및 Aβ의 25번째, 29번째, 33번째, 및 37번째에 상당하는 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 글리신의 치환 변이를 갖는 것을 들 수 있다. 또한 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 본 개시에 있어서의 APP는, hAPP770 또는 hAPP695에 있어서 Swedish 변이 및 Aβ의 33번째에 상당하는 글리신의 치환 변이를 갖는 것을 들 수 있다. 또한 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 본 개시에 있어서의 APP는, hAPP770 또는 hAPP695에 있어서 Swedish 변이 및 Aβ의 33번째 및 37번째에 상당하는 글리신의 치환 변이(바람직하게는 적어도 한쪽이 이소류신으로의 치환 변이)를 갖는 것을 들 수 있다. 본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, ASPD형 구조체의 형성을 현저하게 방해하지 않는 범위에서 그 외의 변이를 가져도 된다. 그 외의 변이로서는, 수식 아미노산, 비천연 아미노산, D-아미노산 등으로의 변이를 포함할 수 있다. 수식 아미노산으로서는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 아미노기 수식, 카르복실기 수식, 티올기 수식, 수산기 수식, 당화 수식, PEG화 수식 등을 들 수 있다.
본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP는, APP의 일부여도 되고 아밀로이드β 단백질(Aβ) 서열을 포함하는 부분 펩티드여도 된다(상기 부분 펩티드를, 이하에서는 단지 「APP의 일부」라고도 한다). ASPD는, APP로부터 잘려나오는 Aβ의 집합체의 한 형태이기 때문이다.
본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP의 일부는, N 말단이 절단된 형태여도 되고, 추가의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, N 말단이 β세크래타제의 절단 부위에서 절단된 형태여도 된다.
본 개시에 관련된 제조 방법의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현시키는 APP의 일부는, Aβ의 1~43번째, 1~42번째 또는 1~40번째를 포함하는 부분인 것을 들 수 있고, 추가의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ의 1~43번째, 1~42번째 또는 1~40번째를 포함하는 부분, 및, APP의 시그널 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
배양하는 세포 내에 있어서의 APP 또는 그 일부의 발현은, APP 또는 그 일부를 발현 가능한 발현계를 도입한 세포로 행할 수 있다. APP 또는 그 일부의 발현은, 일과성 발현계에 의한 것이어도 되고, 안정 발현 세포주에 의한 것이어도 된다. APP 또는 그 일부의 발현은, ASPD형 구조체의 형성을 방해하지 않는 범위에서, 고발현 또는 과잉 발현인 것이 ASPD형 구조체의 형성량 향상의 점에서 바람직하다. APP 또는 그 일부의 발현계는, 제어 가능한 것이어도 된다.
APP 또는 그 일부를 발현 가능한 발현계는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, APP 또는 그 일부를 코딩하는 서열에, 도입하는 숙주 세포에 따른 발현 조절 서열이 작동적으로 연결되어 있는 핵산을 갖는 발현 카세트를 들 수 있다. 발현 조절 서열로서는, 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터 등을 들 수 있고, 그 외에는, 개시 코돈, 인트론의 스플라이싱 시그널, 및 정지 코돈 등을 들 수 있다.
APP 또는 그 일부의 발현계는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 발현시키고 싶은 세포(숙주)에 따른 발현 벡터를 적절히 선택하여 도입할 수 있다. 상기 발현 벡터는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상술의 발현 카세트를 갖는 벡터를 들 수 있다. 발현 벡터로서는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 플라스미드, 코스미드, YACS, 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 에피솜 EBV 등) 벡터 및 파지벡터를 들 수 있다.
본 개시에 관련된 제조 방법에 있어서 배양하는 세포는, APP 또는 그 일부를 발현하는 세포이다. 본 개시에 관련된 제조 방법에 있어서 배양하는 세포는, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량 향상의 점에서, APP 또는 그 일부를 발현 가능한 발현계가 도입된 세포인 것이 바람직하고, APP 또는 그 일부를 고발현 혹은 과잉 발현하거나 또는 하는 것이 가능한 세포인 것이 보다 바람직하다. 본 개시에 관련된 제조 방법의 그 외의 실시 형태에 있어서, APP 또는 그 일부를 발현하는 세포는, 유전자 도입 혹은 게놈 편집에 의해 게놈 APP 유전자가 과잉 발현하게 된 세포여도 된다.
또, 본 개시에 관련된 제조 방법에 있어서 배양되는 세포는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ를 산생 가능한 세포가 바람직하고, γ세크래타제와 β세크래타제의 쌍방이 발현되어 있는 세포인 것이 보다 바람직하다.
APP 또는 그 일부의 발현계가 도입되는 숙주 세포는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 미생물 등, 및 그들의 세포주를 들 수 있다. 동물 세포로서는, 포유류 세포, 인간 세포, 인간 이외의 포유류 세포를 들 수 있다.
APP 또는 그 일부의 발현계가 도입되는 숙주 세포는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 취급성의 점에서, 세포주가 바람직하다. 한정되지 않는 구체적인 세포주로서는, CHO 세포, HEK293 세포, Neuro2a 세포 등을 들 수 있다.
본 개시에 관련된 제조 방법에 있어서의 APP 또는 그 일부를 발현하는 세포의 배양 조건은, 상기 세포의 종류, 상기 세포에 도입되어 있는 발현계의 종류, 및, 그 발현계의 도입 형태(일과성 도입이나 안정 도입) 등에 따라, 당업자라면, 발현계에 넣어진 APP 또는 그 일부가 발현(바람직하게는 과잉 발현)하도록, 배지, 온도, CO2 농도 등을 적절히 설정할 수 있다.
하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 일과성의 APP 발현계를 이용하는 경우의 배양으로서는, 증식 배지에서 배양, 형질 도입하고, 그 후, 무혈청 배지로 교환하여 24시간~48시간 배양하는 것을 들 수 있다. 그리고, 상기 배양 후에 배지 중에 세포 분비형 ASPD형 구조체가 얻어진다.
세포가 동물세포인 경우, 배지로서는, Medium199 배지, Eagle＇s Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco＇s modified Eagle＇s Medium(DMEM) 배지, Ham＇s F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 이들 배지에는, 혈청 또는 혈청 대체물이 함유되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라서, 배지는, 지질, 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등의 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다.
본 개시에 관련된 제조 방법은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 또한, 상기 배양액 중으로부터 세포 분비형 ASPD형 구조체를 회수하는 것을 포함한다.
배양액 중의 세포 분비형 ASPD형 구조체의 회수는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 구멍 지름 0.22㎛ 필터의 여액을 50kDa 또는 100kDa의 한외 여과를 한 유지액을 회수하는 공정에 의해 행할 수 있다. 단, ASPD의 회수 방법은 이 방법으로 한정되지 않아도 된다.
본 개시에 관련된 제조 방법이면, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조가 용이해지기 때문에, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체 그 자체를 항원으로 한 능동 백신 요법의 개발이나, 능동 백신으로서 기능하는 의약 조성물의 개발, 신경세포사 저지약의 개발이 용이해진다
[백신]
ASPD를 구성하는 Aβ 그 자체를 생체 내에 도입하여 면역을 부여하는 시도의 결과, Aβ의 서열의 일부(16~33번째의 잔기)가 T 세포를 활성화하고 염증성 반응을 일으키는 것이 보고되었다(Monsonego, A. et al. J. Clin. Invest. 112:415-422 (2003), Monsonego, A. et al. PNAS 103:5048-5053(2006)). 따라서, Aβ 그 자체를 백신으로서 이용하는 것은 어렵다.
한편, ASPD는, T 세포를 활성화하는 Aβ의 서열(16~33번째의 잔기)이 구형상 구조의 내부에 접혀 들어가 거의 숨겨지고(Ohnishi et al. PNAS 112:E4465-E4474(2015)), Aβ 백신에서 문제가 되는 염증성 T 세포 응답을 야기하지 않는다는 데이터가 얻어져 있다.
그리고, 합성 ASPD에 대해서는, 아쥬반트 없이 토끼에 면역이 생기는 것, 그 면역량은 통상의 펩티드 항원의 1/5~1/10로 소량으로 충분한 것이 발견되었다. 또한, ASPD를 이용하여 노령 게잡이원숭이의 피하 투여로 면역하면, 뇌의 당대사(신경 활동)가 높아지는 것도 발견되었다.
이들 지견으로부터, ASPD는, 안전성이 높은 능동 백신으로서 사용할 수 있다고 할 수 있다. 그리고, 본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체도, 능동 백신으로서 사용할 수 있고, 또, 백신의 제조에 사용할 수 있다.
따라서, 본 개시는, 한 형태에 있어서, ASPD를 유효 성분으로 하는 의약 조성물에 관한 것이며, 혹은, ASPD를 포함하는 백신에 관한 것이다.
합성 ASPD를 이용하여, 예를 들면 백신 등과 같은 의약 조성물을 제조하고자 하는 경우, 이하의 문제점이 발견되었다. 즉, 합성 ASPD의 종래의 제조법에서는, 제조 로트마다 ASPD량이 어느 정도 오르내리고, 또, 제조된 ASPD의 장기 보관이 어렵고, 그리고, 제조량의 스케일업이 곤란하고, 또한, 합성 ASPD를 제조한 후에 잔존하는 Aβ의 제거가 필요하고, 제조 효율이 떨어지는 등의 문제가 발견되었다.
본 개시에 관련된 세포 분비형 ASPD형 구조체를 이용한 백신 등의 의약 조성물이면, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 이들 문제의 하나 혹은 일부 또는 그 이상을 해소할 수 있다.
따라서, 본 개시는, 한 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 의약 조성물의 하나 또는 복수의 실시 형태로서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 포함하는 백신을 들 수 있다. 본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신은, 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 아쥬반트를 포함해도 된다.
본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD에 기인하는 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료를 위해서 사용될 수 있다. 본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증의 예방, 개선, 및/또는 치료를 위해서 사용될 수 있다.
본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD에 기인하는 질병을 이환할 우려가 있는 대상, 이환한 우려가 있는 대상, 또는, 이환한 대상에게 투여될 수 있다. 본 개시에 관련된 의약 조성물은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증을 이환할 우려가 있는 대상, 이환한 우려가 있는 대상, 또는, 이환한 대상에게 투여될 수 있다. 상기 대상으로서는, 포유류, 인간, 인간 이외의 포유류를 들 수 있다.
본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신을 ASPD, ASPD에 기인하는 질병, 또는, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증에 대한 면역을 대상으로 하여금 획득하게 하는 하나 또는 복수의 실시 형태에 대해 설명한다. 본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신의 투여법은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 근내, 복강내, 피내 혹은 피하에의 주사, 또는, 구도, 소화관, 기도, 요생식로에의 경점막 투여가 포함될 수 있다. 본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체의 투여량으로서는, 투여 대상에 현저한 부작용을 미치지 않고 면역 방어 응답을 유발하는 양을 들 수 있다. 본 개시에 관련된 의약 조성물 및 백신의 투여량은, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 0.01㎍~10㎎, 0.1~1000㎍, 1~100㎍, 5~50㎍, 또는 5~25㎍의 범위로 포함하게 되는 양으로 예상된다. 초기 투여에 이어서, 충분한 간격을 두고 1회 또는 수회의 부스터 투여를 해도 된다.
따라서, 본 개시는 한 형태에 있어서, ASPD에 기인하는 질병(예를 들면, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증)의 예방, 개선, 및/또는 치료의 방법으로서, 세포 분비형 ASPD형 구조체 또는 본 개시에 관련된 의약 조성물 혹은 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, ASPD, ASPD에 기인하는 질병, 또는, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증에 대한 면역을 대상으로 하여금 획득하게 하는 방법으로서, 세포 분비형 ASPD형 구조체 또는 본 개시에 관련된 의약 조성물 혹은 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 개시는, 한 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 부형제 및/또는 아쥬반트를 조합시키는 것을 포함하는, 의약 조성물 또는 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 또는, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 갖는 백신의 제조 방법으로서, 본 개시에 관련된 제조 방법에 의해 세포 분비형 ASPD형 구조체를 제조하는 공정을 포함하는 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, 본 개시에 관련된 제조 방법에 이용하는 키트로서, APP 또는 그 일부의 발현계가 도입된 세포주를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 키트에 의하면, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조가 용이해진다. 본 개시에 관련된 키트에는, 또한, 배양 용기, 배지, 및 설명서 중 적어도 1개가 포함되어도 된다. 본 개시에 관련된 제조 방법에 이용하는 키트는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, APP 또는 그 일부의 발현계가 도입된 세포주 대신에, APP 또는 그 일부의 발현계를 갖는 벡터여도 된다.
[모델 동물]
본 개시는, 그 외의 형태에 있어서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 갖는 비인간 동물에 관한 것이다. 상기 세포는, 세포 분비형 ASPD형 구조체를 분비하기 때문에, 상기 비인간 동물은, ASPD에 기인하는 질병, 예를 들면, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증의 모델 동물이 될 수 있다. 상기 세포로서는, 상기 모델 동물로 하는 관점에서, 뇌의 세포가 바람직하고, 혹은, 신경세포가 바람직하다. 상기 발현계의 도입 방법은, 특별히 제한되지 않지만, 유전자 도입 기술을 이용하는 방법, 게놈 편집 기술을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 비인간 동물로서는, 사람 이외의 포유류, 사람 이외의 영장류를 들 수 있다. 본 형태의 하나 또는 복수의 실시 형태는, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하도록 유전자 개변된 세포를 갖는 유전자 개변 동물이다.
본 형태의 모델 동물에 있어서, 유전자 개변된 세포 내에서 발현되는 APP는, 예를 들면, 본 개시에서 개시되는, APP의 변이체 또는 Aβ의 변이체여도 된다. 즉, 상기 세포에서 발현되는 APP는, 상술과 같이, Aβ의 25번째, 29번째, 33번째, 및 37번째에 상당하는 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하고, 적어도 33번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 치환 변이로서는, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 또는 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하다.
그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 세포에서 발현되는 APP는, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 본 실시 형태에 있어서, 치환 변이로서는, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 또는 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하고, 33번째 및 37번째 중 적어도 한쪽이, 이소류신으로의 치환 변이인 것이 보다 바람직하다.
[표준 물질]
세포 분비형 ASPD형 구조체는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD 측정에 있어서의 ASPD의 표준 물질로서 사용할 수 있다. 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체는, ASPD를 측정하는 키트에 사용할 수 있다. 즉, 본 개시는, 한 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체와 항ASPD 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 항ASPD 항체로서는, 상술의 ASPD에 특이적인 항체를 들 수 있다. 또, 본 개시는, 한 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 항ASPD 항체를 조합하는 것을 포함하는, 키트의 제조 방법에 관한 것이다. 이들 키트는 예를 들면, ASPD의 측정에 사용할 수 있다.
[스크리닝 방법 1]
본 개시는, 한 형태에 있어서, ASPD의 형성에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 형성되는, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체(즉, 세포 분비형 ASPD형 구조체)의 형성 효율을 지표로 하는 것을 포함하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 지표는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량이어도 되고, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 또는 이들의 합계량에 대한 상대량이어도 된다. 이 형태의 스크리닝 방법은, 테스트 물질을 배양액에 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우에 있어서의 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성 효율을 비교하여, ASPD의 형성에 영향을 주는 물질인지의 여부를 판단하는 것을 포함해도 된다. 예를 들면, 테스트 물질을 배양액에 첨가한 경우에 상기 형성 효율이 저하하면, 상기 물질이 ASPD의 형성을 저해하는 영향이 있다고 판단할 수 있다. 또, 예를 들면, 테스트 물질을 배양액에 첨가한 경우에 상기 형성 효율이 항진하면, 상기 물질이 ASPD의 형성을 촉진하는 영향이 있다고 판단할 수 있다.
본 형태의 스크리닝 방법에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현되는 APP는, 예를 들면, 본 개시에서 개시되는, APP의 변이체 또는 Aβ의 변이체여도 된다.
[스크리닝 방법 2]
본 개시는, 한 형태에 있어서, Aβ의 C 말단 절단에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 형성되는, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 Aβ를 지표로 하는 것을 포함하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 지표는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 및 이들의 조합의 분비량 혹은 배양액 중의 농도여도 되고, 혹은, 예를 들면, Aβ40에 대한 Aβ42의 비율(Aβ42/Aβ40)과 같은 상대량이어도 된다. 이 형태의 스크리닝 방법은, 테스트 물질을 배양액에 첨가한 경우와 첨가하지 않는 경우에 있어서의 상기 지표를 비교하여, Aβ의 C 말단 절단에 영향을 주는 물질인지의 여부, 혹은, γ세크레타제에 대한 영향을 주는 물질인지의 여부를 판단하는 것을 포함해도 된다. 예를 들면, 테스트 물질을 배양액에 첨가한 경우에 「Aβ42/Aβ40」이 저하하면, 상기 물질이 Aβ42의 산생을 억제하는 영향이 있다고 판단할 수 있다.
본 형태의 스크리닝 방법에 있어서, 배양하는 세포 내에서 발현되는 APP는, 예를 들면, 본 개시에서 개시되는, APP의 변이체 또는 Aβ의 변이체여도 된다.
[변이형 합성 ASPD]
본 개시는, 또한 그 외의 형태에 있어서, 변이형 합성 ASPD에 관한 것이다. 본 개시에 있어서, 변이형 합성 ASPD는, 변이형의 Aβ를 이용하여, 합성 ASPD의 제조 방법과 같은 제법으로 합성되는 합성 ASPD형 구조체를 말한다. 즉, 본 개시에 있어서, 변이형 합성 ASPD는, Aβ의 25~37번째의 아미노산 서열에 있어서의 GXXXG 모티프의 글리신에 1 또는 복수의 치환 변이를 갖는 변이형 Aβ를 포함하는 액체를 교반함으로써 형성되는 합성 ASPD형 구조체를 말한다. 상기 액체에는, 변이형 합성 ASPD의 형성 효율 향상의 관점에서, 예를 들면, 프탈산 에스테르 등의 가소제가 포함되어 있어도 된다. 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 변이형 합성 ASPD는, 상기 변이형 Aβ를, 상기 가소제를 포함하는 유기 용매에 용해하는 것, 상기 변이형 Aβ의 용액을 수성 용액으로 희석하는 것, 및, 상기 희석 후의 용액을 교반하는 것을 포함하는 제조 방법으로 합성할 수 있다.
상기 변이형 Aβ로서는, Aβ의 25번째, 29번째, 33번째, 및 37번째에 상당하는 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하고, 적어도 33번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 치환 변이로서는, 합성 ASPD의 형성 효율 향상의 관점에서, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하다.
상기 변이형 Aβ로서는, 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신의 치환 변이를 갖는 것이 바람직하다. 본 실시 형태에 있어서, 치환 변이로서는, 합성 ASPD의 형성 효율 향상의 관점에서, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 메티오닌, 타이로신, 또는 시스테인으로의 치환 변이가 바람직하고, 33번째 및 37번째 중 적어도 한쪽이, 이소류신으로의 치환 변이인 것이 보다 바람직하다.
본 개시에 관련된 변이형 ASPD는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, ASPD 특이적 항체에 대해서 항원성을 나타낸다. 또, 본 개시에 관련된 변이형 ASPD는, 그 외의 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 성숙 신경세포에 대해서 세포 독성을 나타낸다.
본 개시는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 이하에 관한 것일 수 있다；
[1] 세포 분비형 아밀로스페로이드(ASPD)형 구조체의 제조 방법으로서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 아밀로이드β 단백질(Aβ) 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 세포 분비형 ASPD형 구조체를 얻는 공정을 포함하는, 제조 방법.
[2] 또한, 상기 배양액 중에서 세포 분비형 ASPD형 구조체를 회수하는 것을 포함하는, [1]에 기재된 제조 방법.
[3] 상기 세포가, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부의 발현계가 도입된 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[4] 상기 APP는, 야생형, 또는, 1 혹은 복수의 아미노산 변이를 갖는 상기 야생형의 변이체인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[5] 상기 APP는, Aβ 아미노산 서열의 GXXXG 모티프에 있어서의 글리신에 아미노산 변이를 갖는 야생형 또는 변이체의 APP인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[6] APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 얻어지는 구조체로서, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는, 세포 분비형 ASPD형 구조체.
[7] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물.
[8] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체를 포함하는 백신.
[9] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, 및, 항ASPD 항체를 포함하는 키트.
[10] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의 능동 백신으로서의 사용.
[11] 백신 제조에 있어서의 [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의 사용.
[12] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의, ASPD 측정에 있어서의 표준 물질로서의 사용.
[13] ASPD가 기인이 되는 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료의 방법으로서, [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, [7]에 기재된 의약 조성물, 또는, [8]에 기재된 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
[14] ASPD가 기인이 되는 질병이, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증인, [13]에 기재된 방법.
[15] ASPD, ASPD에 기인하는 질병, 또는, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증에 대한 면역을 대상으로 하여금 획득하게 하는 방법으로서, [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, [7]에 기재된 의약 조성물, 또는, [8]에 기재된 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
[16] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 약학적으로 허용되는 부형제를 조합하는 것을 포함하는, 의약 조성물 또는 백신의 제조 방법.
[17] [6]에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 항ASPD 항체를 조합하는 것을 포함하는, 키트의 제조 방법.
[18] APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 갖는, 비인간 동물.
[19] APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 형성되는 구조체로서, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체의 형성 효율을 지표로 하는 것을 포함하는, ASPD의 형성에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법.
[20] APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 분비되는, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 지표로 하는, Aβ의 C 말단 절단에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법.
[21] Aβ의 25~37번째의 아미노산 서열에 있어서의 GXXXG 모티프의 글리신에 1 또는 복수의 치환 변이를 갖는 변이형 Aβ를 포함하는 액체를 교반함으로써 형성되는 합성 ASPD형 구조체.
이하에, 실시예를 이용하여 본 발명의 하나 또는 복수의 실시 형태를 더 설명한다.
[실시예]
1. hAPP를 발현하는 배양 세포의 구성
(1-1) 인간 아밀로이드 전구체 단백질(hAPP)
발현시키는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로서, 하기 표 1 및 도 1에 나타내는 시험예 1~14의 APP를 이용했다. 도 1의 서열(서열 번호 1)은, 인간의 Aβ를 포함하는 hAPP의 부분 아미노산 서열이다.
시험예 1~7의 APP는, hAPP770 야생형, hAPP770 Swedish 변이형, 및 GXXXG 모티프의 1 또는 2개의 글리신이 변이한 hAPP770 Swedish형이다.
시험예 8~14의 APP는, hAPP695 야생형, hAPP695 Swedish 변이형, 및 GXXXG 모티프의 1 또는 2개의 글리신이 변이한 hAPP695 Swedish형이다.
Figure pct00001
(1-2) hAPP를 과잉 발현하는 배양 세포
상기 시험예 1~14의 hAPP를 과잉 발현하는 CHO 세포를 이하와 같이 제작했다.
CHO/K1 세포를 증식 배지에서 2.5×104cells/㎠의 밀도로 12웰플레이트에 파종하고, 37℃, 5% CO2로 유지했다. 24시간 후, 유전자 도입 시약(FuGENE HD)을 이용하여 발현 벡터를 CHO/K1 세포에 도입했다. 도입 방법은, 1웰당 Opti-MEM 25μL 및 플라스미드 DNA 0.5㎍을 혼합하고, 또한 1.5μL의 FuGENE HD를 더하고, 실온에서 10분간 반응시켰다. 그 사이에 0.5mL 증식 배지를 교환해 두고 반응 종료후, 반응액을 25μL 첨가했다. 24시간 후, 새로운 1mL 증식 배지로 교환하여 더 배양했다.
증식 배지:10% FBS 함유 Ham＇s F-12 배지에, 100유닛/mL penicillin, 및, 100㎍/mL streptomycin를 더한 것
2. ASPD의 형성과 회수
(2-1) hAPP를 과잉 발현하는 배양 세포의 배양과 상청의 회수
유전자 도입으로부터 48시간 후, 세포를 1xPBS(-)로 2회 세정한 후 1mL 무혈청 배지로 교환했다. 무혈청 배지로 교환 24시간 후, 0.22㎛ 필터로 여과한 배양 상청을 회수하고, 즉시 액체 질소로 동결시켜 -80℃에서 보존했다.
무혈청 배지:DMEM/F-12에 1xITS-X를 더한 것
(2-2) 분석
APP 과잉 발현 세포를 배양한 배양액을 회수하고, 배양액 중의 ASPD, Aβ1-40, 및 Aβ1-42의 함유량을 하기 조건의 ELISA법으로 확인했다. 그 결과를 도 2~4에 나타낸다.
[ASPD ELISA]
회수한 배양 상청에 대해서, 항ASPD 항체 2종류(rpASD1, MASD3)를 이용한 샌드위치 ELISA로 정량했다.
상세히는, 측정 전날에 백색 96웰플레이트에 항ASPD 폴리클로널 항체(rpASD1)를 500ng/웰이 되도록 분주하고, 4℃에서 하룻밤 고상화했다. 다음 날, 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, 3% BSA로 30분간 블로킹을 행하고, 다시 3회 세정했다. 각 웰에 100μL의 표준액 또는 샘플을 분주하고, 1시간 실온에서 인큐베이션 후, 3회 세정하고, 100ng/웰이 되도록 항ASPD 모노클로널 항체(MASD3)를 첨가하고, 또한 1시간 실온에서 인큐베이션했다. 다시 3회 세정을 행하고, 1/10,000 희석한 2차 항체(항마우스 IgG-HRP)를 100μL/웰로 분주하고, 1시간 실온에서 인큐베이션했다. 3회 세정한 후, 100μL의 발광 기질을 첨가하여 1분 차광으로 반응시키고, 루미노미터로 발광을 검출했다.
[Aβ ELISA]
회수한 배양 상청에 대해서, 시판에서 입수 가능한 Aβ monomer ELISA kit를 이용하여 측정했다. 사용한 Kit는 이하와 같다. 측정은, Kit 첨부의 설명서대로 행했다.
Aβ1-40:인간 β아밀로이드(1-40) ELISA 키트 와코(Wako＃292-62301)
Aβ1-42:인간 β아밀로이드(1-42) ELISA 키트 와코 고감도품(Wako＃296-64401)
도 2~4에 나타내는 바와 같이, 시험예 1~14의 APP를 과잉 발현시킨 어떤 경우도 배양액 중에 ASPD의 형성이 인정되었다.
hAPP770과 hAPP695를 비교한 경우, 변이에 따른 큰 차는 보이지 않았지만, 약간 hAPP695의 쪽이, 배양 상청 중의 ASPD 농도가 높은 경향이 있었다. 또, 변이의 장소와 수에 대해서는, 2개소라도 1개소라도 G704 또는 G629의 G/L 변이가 ASPD 형성에는 중요하다고 생각되었다. 또한, 야생형(wt)에 비해, Swedish(sw) 변이에서는 아밀로이드가 보다 많이 분비되지만, 또한 GXXXG 모티프에 변이를 넣음으로써, 대부분의 아밀로이드가 ASPD의 구성 요소로서 사용되는 것이 시사되었다.
3. hAPP695sw-G33X의 과잉 발현
hAPP695 Swedish 변이형의 629위치(Aβ의 33위치)의 글리신을 19종의 아미노산으로 변이시킨 APP를 과잉 발현하는 세포를 상기 (1-2)와 같이 제작하고, 상기 2.와 같이 배양하여 그 배양액 중에 배양액 중의 ASPD, Aβ1-40, 및 Aβ1-42의 함유량을 확인했다. 그 결과를 표 2 및 도 5~7에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2 및 도 5~7에 나타내는 바와 같이, hAPP695 Swedish 변이형의 629위치(Aβ의 33위치)의 글리신을 소정의 아미노산, 예를 들면, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 발린, 타이로신, 시스테인으로의 치환을 함으로써, 배양액 중의 Aβ량을 현저하게 저감함과 더불어, 세포 분비형 ASPD형 구조체의 형성량을 향상시킬 수 있는 것이 확인되었다. 한편, 프롤린(또는 트레오닌)으로의 치환을 함으로써, Aβ1-40, Aβ1-42 및 ASPD형 구조체 중 어느 것에 대해서도 배양액 중 농도의 저하가 확인되었다. 이 결과로부터, 이들 아미노산에 의한 629위치(Aβ의 33위치)의 변이에 따라서는, APP로부터의 Aβ의 절단이 저해되고, 또한 ASPD형 구조체의 형성이 억제되는 것이 시사되었다. 이상으로부터, 아밀로이드β 산생 및 ASPD 형성의 쌍방에 대한 저해제 스크리닝에의 변이체의 이용도 가능하다고 생각되었다.
3. 다른 숙주 세포를 이용한 세포 분비형 ASPD형 구조체의 제조
CHO 외에, HEK293 및 Neuro2a의 세포주에 있어서도, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부의 발현계가 도입된 세포로 함으로써, 세포 내에서 ASPD형 구조체가 형성되는 것이 인정되었다.
4. 세포 분비형 ASPD형 구조체의 안정성 확인:-80℃의 보존 안정성
시험예 14의 hAPP695-sw-G33I를 발현시켜 얻어진 세포 분비형 ASPD 구조체를 0개월, 3개월 및 6개월간 -80℃ 보존한 샘플을, 2종류의 ASPD 특이적 항체(중화 항체)를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정하여 검량선을 작성했다.
그 결과, 그 검량선의 일차 회귀 직선의 기울기는, 3개의 샘플에서 거의 일정한 값을 나타냈다. 따라서, 샌드위치 ELISA에 사용하고 있는 중화 항체 2종류에 대한 반응성이 안정되어 있고, 보존에 의한 열화는 없다고 생각되었다.
한편, 종래의 방법으로 제조된 합성 ASPD는, -80℃의 보존 후에서는 일차 회귀 직선에 있어서의 기울기의 편차가 크고, ASPD 농도에 대한 시그널의 크기도 편차가 크고, 보존 안정성이 낮다고 생각된다.
5. 합성 ASPD의 면역원성
뉴질랜드 화이트(각 조건 3마리)에, 프로인트 아쥬반트, 수산화 알루미늄 아쥬반트, 아쥬반트 없이, 합성 ASPD에 의한 100㎍ 면역을 6회 행하고, 그 후, 전체 채혈을 행하고, 혈청 중의 합성 ASPD에 대한 반응성을 점적으로 평가를 행했다. 그 결과의 일례를 도 8에 나타낸다. 모든 토끼에서 아쥬반트 없이도 충분한 반응성이 얻어지는 것을 알 수 있었다.
6. 합성 ASPD 및 변이형 합성 ASPD(G33L)의 신경 세포 독성
야생형 Aβ1-42를 이용하여 제조한 합성 ASPD의 신경세포 독성과, G33L 변이형 Aβ1-42를 이용하여 제조한 변이형 합성 ASPD(G33L)의 신경세포 독성을 비교했다.
구체적으로는, 일정 농도의 합성 ASPD(0.58μM) 및 변이형 합성 ASPD(0.53μM)를 각각 성숙 쥐 해마 유래 초대 배양 신경세포에 투여하여 하룻밤 둔 후, 형광 시약(Thermo Fisher사제 CyQUANT)을 첨가하고, 공초점 이미지 사이토미터 CQ1을 이용하여 세포 생존율을 확인했다. 그 결과를 도 9의 오른쪽에 나타낸다. 이 도면에 나타내는 바와 같이, 변이형 합성 ASPD(G33L형)는, 합성 ASPD(야생형)와 같이, 성숙 신경 세포에 대해서 동일한 정도의 세포 독성을 나타냈다.
7. 변이형 합성 ASPD와 rpASD1 항체의 해리 상수
합성 ASPD 또는 변이형 합성 ASPD(G33L)를 리간드로서 센서칩 상에 고상화하고, 애널라이트로서 항ASPD 폴리클로널 항체(rpASD1)를 흘려보내 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 해리 상수(KD)를 구했다. 그 결과, 항ASPD 폴리클로널 항체(rpASD1)에 대한 반응성은, 합성 ASPD와 변이형 합성 ASPD(G33L)에서 동등했다.
8. hAPP695sw의 1 및 2 아미노산 변이체의 과잉 발현
발현시키는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로서, 하기 표 3 및 도 1에 나타내는 시험예 15~36의 APP를 이용했다. 상기 1 및 2의 기재와 같이 하여, APP 과잉 발현 세포를 배양한 배양액을 회수하고, 배양액 중의 ASPD, Aβ1-40, 및 Aβ1-42의 함유량을 하기 조건의 ELISA법으로 확인했다. 그 결과를 도 10~12에 나타낸다.
Figure pct00003
도 10~12에 나타내는 바와 같이, 시험예 15~36의 APP를 과잉 발현시킨 어떤 경우도 배양액 중에 ASPD의 형성이 인정되었다.
류신에의 1아미노산 또는 2아미노산 치환 변이와, 이소류신의 그들에서, 상청 중의 ASPD, Aβ1-40, 및 Aβ1-42의 함유량에 큰 차는 보이지 않았다. 그러나, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신이 두 개 모두 이소류신으로 변이한 APP(시험예 30)의 ASPD 형성량은, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신이 두 개 모두 류신으로 변이한 APP(시험예 23)와 비교하여, 현저하게 증가되어 있었다.
또, 2개소를 류신과 이소류신으로 변이시킨 APP(시험예 31-36)에서는, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신을 류신과 이소류신으로 변이시킨 APP(시험예 35-36)의 ASPD의 형성량이, Aβ의 33번째 및 37번째의 글리신이 두 개 모두 이소류신으로 변이한 APP(시험예 30)와 동일한 정도로 증가했다.
SEQUENCE LISTING <110> TAO Health Life Pharma Co. Ltd. <120> Amylospheroids (ASPD)-like Structure and Pharmaceutical composition <130> H4478-01 <150> JP 2016-81030 <151> 2016-04-14 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 10 15 Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn 20 25 30 Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 45 Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr 50 55 60

Claims (21)

  1. 세포 분비형 아밀로스페로이드(ASPD)형(樣) 구조체의 제조 방법으로서,
    아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 아밀로이드β 단백질(Aβ) 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 세포를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 세포 분비형 ASPD형 구조체를 얻는 공정을 포함하는, 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    또한, 상기 배양액 중에서 세포 분비형 ASPD형 구조체를 회수하는 것을 포함하는, 제조 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 세포가, APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부의 발현계가 도입된 세포인, 제조 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 APP는, 야생형, 또는, 1 혹은 복수의 아미노산 변이를 갖는 상기 야생형의 변이체인, 제조 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 APP는, Aβ 아미노산 서열의 GXXXG 모티프에 있어서의 글리신에 아미노산 변이를 갖는 변이체의 APP인, 제조 방법.
  6. APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 얻어지는 구조체로서, ASPD에 특이적인 항체에 대해서 항원성을 나타내는, 세포 분비형 ASPD형 구조체.
  7. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물.
  8. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체를 포함하는 백신.
  9. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, 및, 항ASPD 항체를 포함하는 키트.
  10. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의 능동 백신으로서의 사용.
  11. 백신 제조에 있어서의 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의 사용.
  12. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체의, ASPD 측정에 있어서의 표준 물질로서의 사용.
  13. ASPD가 기인이 되는 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료의 방법으로서, 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, 청구항 7에 기재된 의약 조성물, 또는, 청구항 8에 기재된 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    ASPD가 기인이 되는 질병이, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증인, 방법.
  15. ASPD, ASPD에 기인하는 질병, 또는, 알츠하이머병 및/또는 레비소체형 인지증에 대한 면역을 대상으로 하여금 획득하게 하는 방법으로서, 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체, 청구항 7에 기재된 의약 조성물, 또는, 청구항 8에 기재된 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 약학적으로 허용되는 부형제를 조합하는 것을 포함하는, 의약 조성물 또는 백신의 제조 방법.
  17. 청구항 6에 기재된 세포 분비형 ASPD형 구조체와, 항ASPD 항체를 조합하는 것을 포함하는, 키트의 제조 방법.
  18. APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 갖는, 비인간 동물.
  19. APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 형성되는 구조체로서, ASPD 특이적 항체에 대해서 항원성을 나타내는 구조체의 형성 효율을 지표로 하는 것을 포함하는, ASPD의 형성에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법.
  20. APP 또는 Aβ 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 발현계가 도입된 세포를 배양한 배양액 중에 분비되는, Aβ40, Aβ41, Aβ42, Aβ43 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 지표로 하는, Aβ의 C 말단 절단에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법.
  21. Aβ의 25~37번째의 아미노산 서열에 있어서의 GXXXG 모티프의 글리신에 1 또는 복수의 치환 변이를 갖는 변이형 Aβ를 포함하는 액체를 교반함으로써 형성되는 합성 ASPD형 구조체.
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