TW201410705A

TW201410705A - 失智症治療劑或預防劑

Info

Publication number: TW201410705A
Application number: TW102119176A
Authority: TW
Inventors: Hiroshi Mori; Takami Tomiyama; Yoichi Matsumoto; Hiroshi Eguchi; Yuichi Kunori
Original assignee: Univ Osaka City; Teijin Pharma Ltd
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2014-03-16
Also published as: EP2857039A4; WO2013180238A1; US20200148753A1; HRP20192267T1; JP6620829B2; RU2657438C2; HK1210031A1; KR102208283B1; JPWO2013180238A1; CA2875205A1; SG11201407878VA; AU2013268364B2; TW202041532A; AU2013268364A1; KR20150027098A; EP3662931A1; BR112014029566A2; IL235899A0; ES2763361T3; CA2875205C

Abstract

本發明係提供一種新穎的失智症治療劑或預防劑。本發明係提供一種含有對於序列編號1之Ser413周邊經磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體、或Ser413周邊經磷酸化之胜肽作為有效成分的失智症治療劑或預防劑等。

Description

失智症治療劑或預防劑

本發明係關於失智症治療劑或預防劑。具體而言，本發明係關於一種失智症治療劑或預防劑，其係含有具有優異的改善認知功能之效果的新穎之抗磷酸化蛋白質或胜肽抗體、及抗磷酸化Tau抗體或能夠誘導抗磷酸化Tau抗體的抗原。

失智症係指一度發達的智能因某種後天的理由降低，而呈現社會性之適應困難的狀態。失智症性的疾病係分類為神經變性(neurodegenerative)疾病、血管性失智症、普利昂疾病(prion disease)、感染性疾病、代謝/內分泌疾病、外傷及腦外科疾病、中毒性疾病等(非專利文獻1)。在日本，2010年現約存在210萬名左右的失智症患者，於65歲以上之高齡者中患病率可說高達8~10%左右甚至10%以上，在世界性之高齡化的趨勢當中被認為是一大問題(非專利文獻2)。若端看失智症中之基礎疾病，則約35%為阿茲海默症(AD)、約15%為AD與腦血管性之混合型、5%為額顳葉退化症(FTLD)，作為變性疾病之AD或FTLD等之神經變性疾病係佔多數比例(非專利文獻2)。因神經變性疾病所導致之失智症，係依據經過至少6個月以上的期間演變之記憶障礙及/或人格變化的潛在性之病症而定義特徵的疾病。與認知功能之障礙的程度具有高度相關性之於神經變性的過程中的一貫之特點係神經原纖維變化(NFT)(非專利文獻3)。

Tau(蛋白質)係指人類中藉由存在於第17號染色體(17q21)的MAPT基因所編碼之蛋白質，且大多在中樞神經系統表現的微小管結合蛋白質之一。Tau被發現是構成作為神經變性疾病之代表的AD中之NFT的paired helical filament與straight filament之主要構成蛋白質，進而於各種的神經疾病中累積於細胞內一事逐漸明朗。如此之Tau之細胞內累積所造成的疾病被統稱為Tau蛋白疾病(非專利文獻4)。Tau蛋白疾病所包含的神經變性疾病雖具有：阿茲海默症(AD)、皮質基底核退化症(CBD或CBS)、進行性核上性麻痺、匹克氏症、嗜銀顆粒性失智症(嗜銀性顆粒病)、Multiple system tauopathy with dementia(MSTD)、伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)、神經原纖維變化型失智症、伴隨石灰沉積之瀰漫性神經原纖維變化症(DNTC)、伴隨球狀神經膠包涵體之蛋白質Tau蛋白疾病(WMT-GGI)、伴隨Tau陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-tau)等，但神經變性疾病以外，因埃科諾莫氏腦炎後遺症或亞急性硬化性全腦炎等之傳染病所導致者、因拳擊手腦炎等之外傷所導致者亦包含於Tau蛋白疾病中(非專利文獻4)。

在MAPT基因之基因組上的結構係由13個外顯子所構成，藉由選擇性剪接而表現作為複數之同型異構體(isoform)的蛋白質(非專利文獻4)。此外，Tau之結構的特徵，係由依據外顯子2與外顯子3之選擇性剪接的29胺基酸重複序列(N)成為0~2個(N0~N2)之N末端的酸性域、多數含有脯胺酸的中間域、及包含3個(3R)或4個(4R)參與微小管結合的重複序列(R)之C末端的微小管結合域(藉由外顯子9至12所編碼)所構成(非專利文獻3及4)。因而，Tau係藉由包含29胺基酸重複序列(N)和參與微小管結合之重複序列(R)的數目，而成為以3R0N(352胺基酸)、3R1N(381胺基酸)、3R2N(410胺基酸)、4R0N(383胺基酸)、4R1N(412胺基酸)及4R2N(441胺基酸)之6種類為代表的同型異構體。如此之同型異構體當中，於胎生期的腦部係僅有3R0N存在，相對於此，於成年人的腦部雖6個同型異構體皆存在，但多數存在4R型(非專利文獻3)。同型異構體之3R型與4R型的差異係取決於外顯子10藉由選擇性剪接而去除(3R)或包含(4R)。如上所述，於Tau雖存在幾個同型異構體，但由於將其所對應的位置之胺基酸編號進行特定，因此以作為最長的同型異構體之4R2N(序列編號1)中的胺基酸之編號(1~441)來表示。例如，於記載為Ser413時，雖於4R2N(序列編號1)中表示作為第413號的胺基酸殘基之絲胺酸，但於4R1N(序列編號2)中係表示作為第384號的胺基酸殘基之絲胺酸，於4R0N(序列編號3)中係表示作為第355號的胺基酸殘基之絲胺酸，於3R2N(序列編號4)中係表示作為第382號的胺基酸殘基之絲胺酸，於3R1N(序列編號5)中係表示作為第353號的胺基酸殘基之絲胺酸，於3R0N(序列編號6)中係表示作為第324號的胺基酸殘基之絲胺酸。

針對神經變性疾病中之Tau的參與，其過程為：最初是在伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)中，根據MAPT基因的變異與Tau的累積間之關係所得以明瞭，而在FTDP-17中係報告有於MAPT基因中之40種以上的基因變異(非專利文獻4)。如此之基因變異會引起Tau同型異構體的比率之變化或對變異Tau之微小管的相互作用之變化，而教示參與病態形成的可能性。然而，與家族性之神經變性疾病不同，於AD等孤立性之神經變性疾病中，未觀察到MAPT的變異之情況居多。此外，在神經變性疾病所累積的Tau之特徵係具有高度受到以磷酸化所致之修飾的特徵。此外，於顯示輕度認知功能障礙的患者(MCI)中，在脊髓液中之磷酸化的Tau之量與腦下垂體萎縮之間係觀察到相關性，磷酸化Tau被認為是針對在Tau蛋白疾病之患者的神經變性之可靠性高的生物指標(非專利文獻5)。因而，為了抑制Tau的磷酸之過度的磷酸化，而進行將作為與磷酸化有關的酵素之激酶，其中特別是對於GSK-3 β之酵素抑制劑使用於治療中的嘗試，並進行開發(非專利文獻5)。然而，GSK-3 β等之激酶係被認為不僅是對於病態，即使於正常的生理作用中亦與功能抑制有所關連的酵素，因此有副作用等之疑慮。事實上，藉由GSK-3 β而使Tau磷酸化之部位當中的某些部位會與在胎兒或正常的人腦所見的Tau之磷酸化部位一致(非專利文獻3)，因此亦被認為有影響正常的Tau之功能的可能性。

此外，於以往之觀念中，一般認為存在於細胞外的Tau會藉由經變性的神經細胞之細胞壞死而漏出至細胞外，但依據最近的研究則認為Tau會在細胞內過度地磷酸化之後，經一定加工而主動地分泌至細胞外。一般認為分泌至細胞外的磷酸化Tau係在一部分的磷酸化部位受到脫磷酸化之後，作用於周邊的細胞之蕈毒鹼受體之M1及M3，而參與細胞內的Tau磷酸化之亢進或細胞壞死的誘導等之作用(非專利文獻6、非專利文獻7)。如上所述，由於一般認為Tau會發揮作為在細胞外作用的因子之功效，因此將難以在細胞內作用的抗體等之高分子作為藥效成分的治療藥之可能性亦逐漸受到重視。然而，如上所述，分泌至細胞外的Tau一部分會受到加工，且受到脫磷酸化等，依據目前設為標的之經過度磷酸化的Tau之結構資訊，具有進一步受到變化的可能性。進而亦認為對於經脫磷酸化之Tau的部分作用之藥劑亦有對於正常之Tau的功能造成影響的可能性。以抗體等將於病態中之Tau設為標的的情況中，雖選擇作用於怎樣的病態特異部位，也就是Tau磷酸化抗原決定位置者為重要，但可說依據如此之複雜的資訊不同，選擇如此之抗原決定位置一事會變得更加困難的狀況。

以對於Tau之特異性的作用為目標之嘗試，報告有關於將Tau蛋白質作為目標的Tau蛋白疾病之免疫學性治療的發明(非專利文獻5、專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3)。免疫學性治療係指藉由投予胜肽疫苗等，以進行誘導特異性的抗體之產生為目的者，可期待來自標的蛋白質或對於胜肽之特異性的高度之副作用減低。如此之研究，報告有藉由使動物模式免疫而改善該動物模式之運動功能改善等，該動物模式係藉由使用經磷酸化的Tau之部分胜肽(相當於Ser396及Ser404之胺基酸殘基經磷酸化者，以及相當於Ser262之胺基酸殘基經磷酸化者)的疫苗而表現變異Tau。但，於該等報告中係使用導入有P301L(使Tau之第301號的胺基酸殘基之脯胺酸變化成白胺酸的變異)等之基因變異的基因轉殖小鼠(tg小鼠)之探討，該tg小鼠雖為相關於作為家族性的神經性疾病之一的FTDP-17之基因變異模式，但並不表示非伴隨於Tau蛋白疾病中所含有的Tau基因變異的神經變性疾病之多數者，特別是孤立性之神經變性疾病的病態。此外，P301Ltg小鼠係運動功能障礙之模式，並非表示在人類之失智症等存在問題的認知功能之障礙的模式(非專利文獻8)，因此依據在該動物模式之結果而獲知是否能適應於人類之失智症的治療一事係有困難。於專利文獻4中，係投予與Ser409經磷酸化的Tau胜肽產生抗原抗體反應的抗體，而看見關於Tau蛋白疾病之治療的效果。然而，高價的胜肽疫苗係全投予量多，且直至展現效果的期間長。此外，胜肽疫苗的效果係所投予的人類或動物之免疫應答的反應性會依據遺傳性背景而異，未必在所有的個體皆能有效地誘導抗體產生。因而，雖認為可使用抗體之被動免疫所致之免疫療法，但於Tau之受到磷酸化的部位係存在非常多數，使用對於其中哪個磷酸化部位之抗體為有效的資訊幾乎不存在。此外，即使在現存的抗體之動物模式中看見效果，但仍不認為具有充分用於治療的功能。

進而，使用抗體作為治療劑或預防劑之主劑的情況中，基於副作用之迴避或醫療經濟性的問題針對治療中所使用的抗體量亦需要留意，特別是在慢性疾病或遺傳性疾病等中關於投予量係成為重要的課題。例如，在作為人類抗IL-6R抗體之ACTEMRA(註冊商標)(tocilizumab)的治療之用量係體重每1kg以8mg間隔1~4週進行投予，於作為擬人化抗補體C5抗體之SOLIRIS(註冊商標)(eculizumab)之治療中用量係1次每一位成人以600~900mg每2週至4週進行投予。此乃雖從多數的抗體當中選擇已開發之優秀的抗體，但用量係於目前所使用的抗體醫藥品之中為多。因而，即使於今後所開發的抗體醫藥品中亦需要以與此等同等以下之用量的效果。進而，在AD等失智症之成為治療對象的臟器雖存在於腦部，但於進行在靜脈內或皮下之投予等全身投予的情況中，由於因血腦障壁的存在而從血液中往腦部的抗體之移行率低，因此於失智症治療中所使用的抗體與以其他臟器之疾病為對象的情況相比難以期待藥理效果，而存在較大的課題。

於人類之失智症中，主要的症狀係記憶障礙與認知功能之障礙，尤其，認知功能係用來根據記憶而發揮判斷、溝通、遂行功能之重要的功能，基於此，於失智症中之症狀居重要的位置。另一方面，針對運動功能，雖為伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)或末期之阿茲海默症中所認定的症狀，但未必是失智症中所顯示之主要的症狀。因而，於考量失智症之治療的情況中，改善認知功能一事便成為主要的課題。然而，目前用來解決上述課題所需要之可取得使用以Tau蛋白疾病所致之認知功能障礙之適當的動物模式而顯示優異的認知機能改善效果之失智症治療劑或預防劑的方針尚未揭示，此外，對於失智症顯示特異性且優異的效果之失智症治療劑或預防劑並不存在。

因而，基於以上所述的狀況，特別是對於認知功能之改善謀求一種具有強力效果的治療劑或預防劑。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]US8012936

[專利文獻2]WO2010/142423

[專利文獻3]WO2010/144711

[非專利文獻]

[非專利文獻1]岸本年史、高橋茂樹編、STEP Series精神科第2版、P103~104、海馬書房、2008年

[非專利文獻2]淺田隆、別冊醫學的腳步「失智症」、p5~10、醫齒藥出版、2011年

[非專利文獻3]Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P408~464、2005年

[非專利文獻4]新井哲明、神經內科、72卷特別增刊號(Suppl.6)、p46~51、2010年

[非專利文獻5]Wendy Noble等、Expert Opin. Drug Discov.、6卷8號、P797~810、2011年

[非專利文獻6]Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry、285卷、P32539-32548、2010年

[非專利文獻7]Venessa Plouffe等、PLoS ONE、7卷、P36873、2012年

[非專利文獻8]Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P459、2005年

本發明之目的係著目於在Tau蛋白疾病之Tau 磷酸化，而提供一種失智症治療劑或預防劑。

此外，本發明之目的係提供一種含有對於相當於Ser413周邊之胺基酸殘基經磷酸化的Tau產生特異性抗原抗體反應之抗體、或具有至少1個Ser413周邊之胺基酸序列的胺基酸殘基經磷酸化之胜肽作為有效成分的失智症治療劑或預防劑。

進而，本發明之目的係提供具有高認知功能改善效果之單株抗體，進一步由該單株抗體之結構的解析提供擬人化抗體等之進一步適用於失智症治療的抗體之製作方法。

本發明係如下所述者。另外，於本發明之Tau蛋白質並非僅為4R2N，而是包含全部6種之同型異構體的意思。此外，於本發明之胺基酸殘基的位置，雖為了方便陳述，以於序列編號1所示者為基礎進行特定，但例如，於表現成相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基時，係意味著序列編號1(4R2N)之第413號的絲胺酸，序列編號2(4R1N)之第384號、序列編號3(4R0N)之第355號、序列編號4(3R2N)之第382號、序列編號5(3R1N)之第353號、或序列編號6(3R0N)之第324號的胺基酸殘基之絲胺酸。

(1)一種失智症治療劑或預防劑，其係含有與相當於序列編號1所示的Tau蛋白質之410位至421位中的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應之抗體作為有效成分。

(2)如(1)之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與受到於失智症中特徵性的磷酸化之Tau蛋白質產生抗原抗體反應的抗體。

(3)如(1)或(2)之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與由Ser412、Ser413、Thr414、及Ser416中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應。

(4)如(1)~(3)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係於對於Tau蛋白質之結合中，與含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體進行結合競爭之抗體。

(5)如(1)~(3)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體。

(6)如(1)~(4)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與相當於Ser413之部位的胺基酸殘基經磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應之抗體。

(7)如(1)~(6)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係具有：序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列、序列編號7至13至少1者所表示的H鏈之CDR序列、或與序列編號7至13所表示的H鏈之 CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的H鏈之CDR序列；及/或序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列、序列編號14至17至少1者所表示的L鏈之CDR序列、或與序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的L鏈之CDR序列的抗體。

(8)如(1)~(7)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係具有：序列編號18至24中任一者所表示的H鏈可變區域、或與序列編號18至24中任一者具有85%以上的相同性之序列的H鏈可變區域；及/或序列編號25至30中任一者所表示的L鏈可變區域、或與序列編號25至30中任一者具有85%以上的相同性之序列的L鏈可變區域之抗體。

(9)如(1)~(8)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係擬人化抗體或嵌合抗體。

(10)一種失智症治療劑或預防劑，其係含有下述胜肽作為有效成分：由相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列當中，至少含有連續之8個胺基酸序列的胜肽，且該胜肽中所含有之至少1個胺基酸殘基經磷酸化的胜肽。

(11)如(10)之失智症治療劑或預防劑，其中該胜肽中所含有之經磷酸化的至少一個胺基酸殘基係相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、或Ser416之胺基酸殘基的胜肽。

(12)如(10)或(11)之失智症治療劑或預防劑，其中該胜肽中所含有之經磷酸化的胺基酸殘基係至少相當於序列編號1之Ser413之胺基酸殘基。

(13)如(1)~(12)中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中失智症係Tau蛋白疾病(tauopathy)。

(14)如(13)之失智症治療劑或預防劑，其中Tau蛋白疾病係阿茲海默症、皮質基底核退化症、進行性核上性麻痺(progressive supranuclear palsy,PSP)、匹克氏症、嗜銀顆粒性失智症(嗜銀性顆粒病)、Multiple system tauopathy with dementia(MSTD)、伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)、神經原纖維變化型失智症、伴隨石灰沉積之瀰漫性神經原纖維變化症(DNTC)、伴隨球狀神經膠包涵體之蛋白質Tau蛋白疾病(WMT-GGI)、或伴隨Tau陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-tau)。

(15)一種單株抗體，其係與由序列編號1之胺基酸編號410~421所構成的胺基酸序列當中，至少具有連續之8個胺基酸序列的胜肽，且相當於該胜肽中所含有之序列編號1之Ser413的胺基酸殘基經磷酸化的胜肽產生抗原抗體反應。

(16)一種抗體，其係對於經磷酸化的Tau蛋白質之抗體，且該抗體係在與含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體之間對於抗原之結合為競爭性。

(17)一種抗體，其係對於經磷酸化的Tau蛋白質之抗體，且該抗體係含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL。

(18)一種單株抗體，其係具有：序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列、序列編號7至13至少1者所表示的H鏈之CDR序列、或於CDR序列中具有與序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的序列之H鏈；及/或序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列、序列編號14至17至少1者所表示的L鏈之CDR序列、或於CDR序列中具有與序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的序列之L鏈。

(19)一種單株抗體，其係具有：序列編號18至24中任一者所表示的H鏈可變區域、或與序列編號18至24中任一者具有85%以上之相同性的H鏈可變區域；及/或序列編號25至30中任一者所表示的L鏈可變區域、或與序列編號25至30中任一者具有85%以上之相同性的L鏈可變區域。

(20)如(15)~(19)中任一項之單株抗體，其中抗體係擬人化抗體或嵌合抗體。

(21)一種胜肽，其係由相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列當中，至少由連續之8個胺基酸序列所構成之胜肽，且該胜肽中所含有之至少1個胺基酸殘基係經磷酸化。

(22)如(21)之胜肽，其中相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、或Ser416之胺基酸的至少一個胺基酸殘基係經磷酸化。

(23)如(21)或(22)之胜肽，其中經磷酸化的胺基酸殘基係相當於序列編號1之Ser413之胺基酸殘基。

本發明係藉由含有對於相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基周邊經磷酸化的Tau產生特異性抗原抗體反應之抗體、或具有至少1個序列編號1之Ser413周邊之胺基酸序列的胺基酸殘基經磷酸化之胜肽作為有效成分，而可提供失智症治療劑或預防劑。

此外，本發明係提供具有高認知功能改善效果之單株抗體，進一步由該單株抗體之結構的解析提供擬人化抗體等之進一步適用於失智症治療的抗體之製作方法。

[第1圖]係顯示以ClustalW排列人類Tau蛋白質之同型異構體的前半之胺基酸序列的圖。

[第2圖]係顯示以ClustalW排列人類Tau蛋白質之同型異構體的後半之胺基酸序列的圖。

[第3圖]係顯示兔多株抗體對於pSer413胜肽之特異性的圖。

[第4圖]係顯示經投予pSer413識別兔多株抗體的模式小鼠之Tria1試驗之結果的圖。

[第5圖]係顯示經投予pSer413識別兔多株抗體的模式小鼠之Probe試驗之結果的圖。

[第6圖]係顯示經投予pSer413識別兔多株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的線圖。

[第7圖]係顯示經投予pSer413識別兔多株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的長條圖。

[第8圖]係顯示經投予pSer413識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Trial試驗之結果的圖(Ta1505)。

[第9圖]係顯示經投予pSer413識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Probe試驗之結果的圖(Ta1505)。

[第10圖]係顯示經投予pSer413識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的線圖(Ta1505)。

[第11圖]係顯示經投予pSer413識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的長條圖(Ta1505)。

[第12圖]係顯示經投予pSer396識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Trial試驗之結果的圖(Ta9)。

[第13圖]係顯示經投予pSer396識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Probe試驗之結果的圖(Ta9)。

[第14圖]係顯示經投予pSer396識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的線圖(Ta9)。

[第15圖]係顯示經投予pSer396識別小鼠單株抗體的模式小鼠之Open Field試驗之結果的長條圖(Ta9)。

[第16圖]係顯示經投予Ta1505的模式小鼠之海馬突觸素量的圖。

[第17圖]係表示Tau基因所包含之基因片段的圖。

[第18圖]係顯示經投予Ta1505抗體的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)之水迷宮Trial試驗之結果的圖表。

[第19圖]係顯示經投予Ta1505抗體的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)之水迷宮Probe試驗之結果的圖表。

[第20圖]係顯示經投予Ta9抗體的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)之水迷宮Trial試驗之結果的圖表。

[第21圖]係顯示經投予Ta9抗體的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)之水迷宮Probe試驗之結果的圖表。

[第22圖]係顯示經投予對照IgG(1mg/隻)或Ta1505抗體(1mg/隻)的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)之以Ta1505抗體所致之海馬CA3區域及CA23區域的免疫組織染色之照片。

[第23圖]係顯示經投予對照IgG(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之以Ta1505抗體所致之海馬迴區域的免疫組織染色之照片。

[第24圖]係顯示經投予Ta1505抗體(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之以Ta1505抗體所致之海馬迴區域的免疫組織染色之照片。

[第25圖]係顯示經投予對照IgG(1mg/隻)或Ta1505抗體(1mg/隻)的記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg) 之以AT8所致之海馬CA3區域及CA23區域的免疫組織染色之照片。

[第26圖]係顯示經投予對照抗體(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之以AT8所致之海馬迴區域的免疫組織染色之照片。

[第27圖]係顯示經投予Ta1505抗體(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之以AT8所致之海馬迴區域的免疫組織染色之照片。

[第28圖]係顯示經投予Ta1505(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之TBS可溶性腦分劃中之G2、AT8、PHF1及Ta1505的反應性Tau量之圖表。

[第29圖]係顯示經投予Ta1505(1mg/隻)的記憶學習損傷小鼠(Tau-Tg)之十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)可溶性腦分劃中之G2、AT8、PHF1及Ta1505的反應性Tau量之圖表。

本發明者們發現，製作與在AD作為經特異性磷酸化的部位之相當於序列編號1的Ser413之胺基酸殘基經磷酸化的Tau產生特異性的抗原抗體反應之抗體，而對伴隨成熟而認知功能障礙發症的tg小鼠投予後，認知功能可恢復至與對象群約略相同程度。另一方面，對於同等的抗原以同樣的濃度使用對於比本發明的抗體更具有親和性之相當於序列編號1之Ser396的胺基酸殘基經磷酸化之Tau的抗體來進行比較後，觀察到充分的認知功能之改善。相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之周邊的部分，係於Tau結構與功能之關係中並無特別資訊的區域，與此部分產生特異性的抗原抗體反應之抗體具有如此強的認知功能之改善效果一事完全為預料外的結果。因而，迄今尚未受到注目之相當於此序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之周邊的部位，係於Tau蛋白疾病中對於認知功能障礙的發症為重要的部位一事乃因本發明而初步明瞭，因而完成本發明。

[抗磷酸化Tau抗體]

於本發明之Tau(蛋白質)係指除序列編號1~6所示之人類Tau蛋白質以外，還包含此等之基因變異體。如在上述之先前技術所示般，在與失智症有關的家族性神經變性疾病之FTDP-17中，雖已知有40處以上之變異，但關於變異的部位並非限定於此。此外，變異的數目係具有相對於序列編號1~6為1至50處，較佳為1至30處，更佳為1至10處之胺基酸的變異者亦作為本發明之Tau所使用。進而，對於序列編號1所示之人類Tau蛋白質亦包含在BLAST法(NCBI之PBLAST的預設條件)中顯示80%以上的相同性(Identities)之蛋白質及其同型異構體。於如上所述者中係包含黑猩猩、恆河獼猴、馬、豬、狗、小鼠、兔、大鼠等人類以外之物種的Tau，在如此之動物的認知功能改善之目的下亦能夠製作將如此之Tau作為標的的治療劑或預防劑。

此外，於本發明之胺基酸編號，亦即胺基酸殘基的位置，為了方便陳述而以序列編號1所示者為基礎進行特定。因而，例如於表現為相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基時，係意味著序列編號1(4R2N)之第413號、序列編號2(4R1N)之第384號、序列編號3(4R0N)之第355號、序列編號4(3R2N)之第382號、序列編號5(3R1N)之第353號、或序列編號6(3R0N)之第324號的胺基酸殘基之絲胺酸。於表1中，顯示於各同型異構體中彼此位於相同位置之胺基酸殘基的位置。另外，於表1中，雖顯示在相當於序列編號1之410~421的各同型異構體之胺基酸殘基的位置，但針對存在此以外的位置之胺基酸殘基的彼此之位置關係，例如，可根據第1圖及第2圖而容易理解。

抗磷酸化Tau抗體，係指會與於如上所示之Tau中之胺基酸序列當中1處以上的胺基酸殘基經磷酸化的Tau產生抗原抗體反應之抗體。經磷酸化之胺基酸殘基係可列舉：絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺酸(Tyr)等。此外，本發明之抗磷酸化Tau抗體產生抗原抗體反應之磷酸化Tau的部位，係以在AD等之神經變性疾病所特異性磷酸化的部位較為理想。此外，在本發明之抗磷酸化Tau抗體產生抗原抗體反應的磷酸化Tau之部位的其他較理想形態，係與由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau產生抗原抗體反應之抗體，較佳為與相當於序列編號1之Ser412、Ser413之胺基酸殘基、或兩者之部位經磷酸化的Tau產生抗原抗體反應之抗體，更佳為與相當於序列編號1之Ser413之胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau產生抗原抗體反應之抗體。在此，相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基，雖意指相當於在人類之4R2NTau(序列編號1)之胺基酸編號的部位，但即使針對如上述之先前技術所記載般與同型異構體相對應的部位，此外與人類以外之同系物相對應的部位，無關於由該胺基酸序列所標示之胺基酸編號，皆同樣地處理。為了理解在如此之同型異構體或同系物之對應部位，係只要是該業者則可依據以Needleman-Wunsch法或Smith-Waterman法等之Pairwise Sequence Alignment所進行的方法、或ClustalW法或PRRP法等之Multiple Sequence Alignment，並經適當解析而理解。作為對應部位之解析方法的1例係於第1圖及第2圖中顯示以ClustalW排列人類之6種的同型異構體之胺基酸序列(1文字表示)者。若觀察此則於6個同型異構體中相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基周邊的結構係保守的(conserved)，而可容易理解相對應的胺基酸為何者。

能夠在本發明之治療劑或預防劑使用的抗磷酸化Tau抗體，係指與存在於序列編號1的Tau蛋白質之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體，且會與由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體，較理想為與VH之胺基酸序列為序列編號20、VL之胺基酸序列為序列編號26的抗體(以下，亦稱為「1505抗體」)進行結合競爭之抗體，更理想為與Ser413之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體。相當於序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質、由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質、或相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau蛋白質，雖如前述般表示包含在人類或其他物種之同型異構體所相對應的部位經磷酸化的Tau蛋白質，但較佳為人類之Tau蛋白質，更佳為在人類之6個同型異構體當中的任一者。

此外，本發明之相當於序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質、由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質、或相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau蛋白質，係與相當於Tau蛋白質之410位至421位的胺基酸殘基之胺基酸序列的一部分完全相同或具有80%以上之序列的相同性之胜肽，該胺基酸殘基經磷酸化的胜肽亦包含於如此之磷酸化的Tau蛋白質，且與如此之胜肽產生特異性抗原抗體反應之抗體亦為本發明之抗磷酸化Tau抗體。

於本發明中，「產生抗原抗體反應」係指對於相當於序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質、由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質；及/或相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau蛋白質，以平衡解離常數(KD)為1×10^-6M以上之親和性進行結合，較理想為以平衡解離常數為1×10^-7M以上之親和性進行結合，更理想為以平衡解離常數為1×10^-8M以上之親和性進行結合。

此外，「特異性」係指對於相當於序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質、由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質；及/或相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau蛋白質之結合，比對於該部位未經磷酸化的Tau蛋白質(包含與Tau蛋白質之胺基酸序列的一部分完全相同或具有80%以上之序列的相同性之胜肽)之結合更強10倍以上，較理想為強30倍以上，更理想為強100倍以上的狀態。

進而，與VH序列之胺基酸序列為序列編號20、VL之胺基酸序列為序列編號26的抗體(1505抗體)「進行結合競爭」，係意味著於該單株抗體結合於抗原之際有其他抗體共存時，該單株抗體的結合受到阻礙之現象，一般而言，可藉由對於一定量(濃度)之該單株抗體，於改變量(濃度)而添加其他抗體之際，測量使該單株抗體對抗原之結合量降低的添加量(濃度)而測量，該阻礙的程度係可以IC₅₀或Ki之值來表示。在本發明之與VH的胺基酸序列為序列編號20，且VL之序列為序列編號26的抗體(1505抗體)進行結合競爭之抗體，係指於使用該單株抗體10nM而檢測出抗原抗體結合之際，IC₅₀比1μM更低的值者，進而較理想為比100nM更低的值者，更理想為比10nM更低的值者。

如此之抗體與磷酸化Tau蛋白質之抗體抗原結合，係只要是該業者便可適當選擇以固相或液相之系的結合測量而進行，如此之方法雖可列舉：ELISA法、EIA法、表面電漿子共振法、FRET法、LRET法等，但並不限定於此等。此外，亦可於測量如此之抗原抗體結合之際，對於抗體及/或抗原(磷酸化Tau蛋白質或Tau蛋白質)以酵素、螢光物質、發光物質、放射性同位素等進行標識，使用適於該經標識的物質之物理性及/或化學性特性的測量方法來檢測抗原抗體反應。

此外，本發明之抗磷酸化Tau抗體亦包含：H鏈可變區域包含由CDR-H1之胺基酸序列為序列編號7或8、CDRH-H2之胺基酸序列為序列編號9、10、11及12當中所選出之任一者與CDRH-H3之胺基酸序列為序列編號13的組合所構成之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之胺基酸序列；L鏈可變區域包含由CDR-L1之胺基酸序列為序列編號14或15、CDR-L2之胺基酸序列為序列編號 16、及CDR-L3之胺基酸序列為序列編號17的組合所構成之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列的抗體。較佳為，H鏈可變區域中所包含的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之組為由序列編號7、序列編號9及序列編號13；序列編號8、序列編號9及序列編號13；序列編號7、序列編號10及序列編號13；序列編號8、序列編號12及序列編號13；以及序列編號7、序列編號11及序列編號13之組合中所選出的任一者、L鏈可變區域中所包含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之組為序列編號14、序列編號16及序列編號17；或序列編號15、序列編號16及序列編號17之抗體，較佳為H鏈可變區域所包含的CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3之組，以及L鏈可變區域中所包含的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之組的組合為由序列編號7、序列編號9、序列編號13、序列編號14、序列編號16及序列編號17；序列編號8、序列編號9、序列編號13、序列編號14、序列編號16及序列編號17；序列編號7、序列編號10、序列編號13、序列編號14、序列編號16及序列編號17；序列編號8、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號16及序列編號17；以及序列編號7、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號16及序列編號17的組合中所選出之任一者的抗體。在此，此等之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3之胺基酸序列當中，所對應的至少1個CDR序列係於BLAST法(NCBI之 PBLAST的預設條件)中與序列編號7至17中任一者顯示85%以上之相同性(Identities)，較佳為90%以上之相同性的序列者，亦包含於本發明之抗體。

在此，鑑定抗體中之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3之序列的方法，例如，藉由使用Kabat之方法或Chothia之方法，該業者係可鑑定與各CDR相對應的部分之序列，且Kabat(Kabat,E.A.and Wu,T.T.、J.Immunol.,147,1709-1719、1991年)或Chothia(Al-Lazikani,B.,Lesk,A.M.and Chothia,C.、J.Mol.Biol.,273，927-948、1997年)之方法，乃身為此領域之該業者所具有的技術常識，但亦可由例如Dr.Andrew C.R.Martin’s Group的網頁(http：//www.bioinf.org.uk/abs/)而得知概要。

本發明之抗體的其他形態係H鏈可變區域(VH)之胺基酸序列為由序列編號18至24中所選出的任一者、L鏈可變區域(VL)之胺基酸序列為由序列編號25至30中所選出的任一者之抗體，較佳為VH與VL之胺基酸序列的組合為由序列編號18與序列編號25、序列編號19與序列編號26、序列編號20與序列編號26、序列編號21與序列編號27、序列編號22與序列編號28、序列編號23與序列編號29、及序列編號24與序列編號30之組合所選出之任一者的抗體。在此，VH及VL之至少一方的胺基酸序列為以序列編號18至24所表示的任一者之VH的胺基酸序列或以序列編號25至30所表示之VL的任一者之胺基酸序列、及於BLAST法(NCBI之PBLAST的預設條件)中與序列編號18至30顯示85%以上之相同性(Identities)的序列，較佳為90%以上之相同性的序列者，亦包含於本發明之抗體。

於此抗體中，定常區域的胺基酸序列係由哺乳類之IgG、IgA、IgM、IgE、IgD之各次型或其變異體中所選出。

以上述之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之胺基酸序列、及/或將此編碼的基因之鹼基序列、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3之胺基酸序列、及/或將此編碼的基因之鹼基序列的資訊為基礎，只要是該業者則可將擬人化抗體等適於目的之種類在治療目的下進行投予的重組體抗體進行設計，以H鏈可變區域之胺基酸序列及/或將此編碼的基因之鹼基序列、L鏈可變區域之胺基酸序列及/或將此編碼的基因之鹼基序列的資訊為基礎，只要是該業者則可將因應目的之嵌合抗體等進行設計。此外，進而以CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之胺基酸序列、及/或將此編碼的基因之鹼基序列、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3之胺基酸序列、及/或將此編碼的基因之鹼基序列的資訊，或以H鏈可變區域之胺基酸序列及/或將此編碼的基因之鹼基序列、L鏈可變區域之胺基酸序列及/或將此編碼的基因之鹼基序列的資訊為基礎，而製作低分子抗體或支架抗體，係藉由使用周知的技術，只要是該業者皆可適當實施。

本發明之抗體係可藉由各2條H鏈及L鏈所構成的抗體，亦可僅以2條H鏈所構成的抗體。此外，本發明之抗體係可為抗體的片段，如此之抗體的片段係可例示F(ab’)2、Fab、Fv等的結構。

本發明之抗體係可使用該業者所周知的技法而得到。本發明之抗體，係可為多株抗體、或單株抗體(米爾斯坦(Milstein)等、自然(Nature)(England)1983年10月6日發行，305卷5934號、p.537~540)。例如，多株抗體係相當於序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質、由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414及Ser416中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質、相當於序列編號1之Ser413之部位經磷酸化的Tau蛋白質，或與序列編號1的Tau蛋白質之410位至421位的胺基酸序列的一部分完全相同或具有80%以上之序列的相同性之胜肽，將該胺基酸經磷酸化的胜肽作為抗原使哺乳動物致敏，而可由該動物的血清等回收。此外，將胜肽作為抗原使用的情況中，可使用在結合於BSA或KLH等之載體蛋白質或聚離胺酸的狀態之抗原。又，作為抗原使用的胜肽之具體例，雖如實施例1及2所記載般，使用相當於序列編號1之Ser413的部位經磷酸化的序列編號31或32之胜肽，但並不限定於此。於該發明之單株抗體，係可將藉由從經抗原致敏的哺乳動物取出免疫細胞而與骨髓腫細胞等細胞融合所得到的融合瘤進行選殖，而由該培養物回收。如此之單株抗體的取得方法，係於實施例2中所記載，藉此所得到的單株抗體雖可列舉具有序列編號18至24之VH胺基酸序列、序列編號25至30之VL序列的單株抗體(Ta1501、1502、1505~1509)，但並不限定於此等。

所得到的單株抗體，亦可得到具有編碼該抗體之蛋白質的胺基酸之基因序列的核酸分子，而可使用如此之核酸份而製作基因工程性抗體。該抗體之基因資訊係H鏈、L鏈、此等之可變區域係使用CDR序列等之資訊而進行用以提昇抗體之結合性或特異性的改變等、或藉由由小鼠等之動物的抗體改變為人型抗體而製作適合使用於治療劑的結構之抗體，此乃在此領域之該業者所熟知的技術。此外，抗原致敏的動物係藉由使用導入有人類抗體基因的非人類-基因轉殖動物，而可取得人型之單株抗體。除此之外，不需使動物致敏的方法，係使用人類抗體之抗原結合區域或表現其一部分之噬菌體庫(人類抗體噬菌體顯示)，取得與相對應的抗原特異性結合之抗體或由特定之胺基酸序列所構成的噬菌體殖株，依據該資訊來製作人類抗體的技術亦只要是該業者皆可適當進行。(例如，參照Taketo Tanaka等、Keio J.Med.,60卷、p37-46之評論等)。

此外，製造前述之單株抗體的方法，係可分別將產生所欲取得的抗體之融合瘤進行培養，由所得到的培養上清液藉由常法將抗體予以純化而取得。此外，其他的製造方法，亦可取得來自產生所欲取得的抗體之融合瘤或利用人類抗體噬菌體顯示所得到的噬菌體殖株等編碼抗體的基因，更具體而言，係編碼免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈的基因，而製作用以表現該基因的媒介，導入宿主細胞(哺乳類細胞、昆蟲細胞、微生物等)，而產生該抗體。此時，針對編碼免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈的基因，進行用以導入所需的特徵之基因改變，或使用免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈之可變區域或CDR區域的結構資訊而製作擬人化抗體、抗體嵌合蛋白質、低分子抗體或支架抗體一事，係藉由周知的技術只要該業者皆可進行實施。此外，以抗體的性能之提昇或副作用之迴避為目的，對於抗體之定常區域的結構施加改變，或進行在糖鏈的部分之改變一事，亦可藉由該業者所熟知的技術而適當進行。

[具有來自Tau之胺基酸序列的磷酸化胜肽]

於本發明中，係包含Tau之胺基酸序列的一部分，亦包含其之1個以上的胺基酸殘基經磷酸化的胜肽。胺基酸殘基經磷酸化，係指對於胺基酸殘基的側鏈磷酸基經酯鍵結的狀態，經磷酸化的胺基酸殘基之代表性者係可列舉：絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸等。該磷酸化胜肽係由相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列當中，至少含有連續之3個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽，較佳為至少含有連續之5個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽，更佳為至少含有連續之8個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽。進而，於該磷酸化胜肽中經磷酸化的胺基酸殘基，係相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘基中任一者，較佳為相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、Ser416之胺基酸的胺基酸殘基中任一者，更佳為相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基。如此之磷酸化胜肽之代表性者雖可列舉實施例1抗體製作中所使用的磷酸化胜肽(序列編號31)，但並不限定於此。

本發明之具有來自Tau之胺基酸序列的磷酸化胜肽，係可使用於以含有於本發明之抗磷酸化Tau抗體的製作中之抗原或該胜肽為特徵之失智症治療劑或預防劑。該磷酸化胜肽亦可於其序列的N末端及/或C末端因應目的以具有其他功能的物質加以修飾。例如，亦可為於該磷酸化胜肽的N末端，以附加有甲硫胺酸殘基、乙醯基或焦麩胺酸者或螢光物質等加以修飾而成的形態。此外，將該磷酸化胜肽的N末端及/或C末端進行修飾的物質，係可為胜肽或蛋白質，如此之物質的例子係可列舉：附加有用以藉由適於N末端或C末端的Tag序列(典型而言係組胺酸Tag或FLAG Tag)、T細胞受體(TCR)或主要組織適合性抗原(MHC)所識別的胺基酸序列之胜肽、病毒或細菌之蛋白質或由其而來之序列的胜肽等者。此外，於本發明之磷酸化胜肽中，亦包含N末端及C末端以外之至少一個胺基酸殘基經化合物或胜肽加以修飾者。如此之磷酸化胜肽的修飾，係只要是該業者則可使用周知的方法，例如於Hermanson等著之Bioconjugate techniques、USA、1996年發行、Academic Press中記載的方法等而進行實施。

本發明之磷酸化胜肽，係只要是該業者則可使用適當合成法或基因工程性方法等來進行製造。藉由合成磷酸化胜肽進行製造的方法，雖可例示以Boc法所進行的方法(Wakamiya T.等、Chemistry Letters、Vol.22 P1401,1993年)、以Fmoc法所進行的方法(PERICH,J.W.,International Journal of Peptide and Protein Research,vol.40,P134-140,1992年)、或日本專利第3587390號所記載的方法等，但只要是該業者則即使是其他適當的方法亦可實施。此外，以基因工程性方法所進行的製造方法，係可藉由調製具有編碼所製造的胜肽或其前驅物之鹼基序列的遺傳物質(DNA、RNA)，並進行於適當表現用之胜肽的組入或啟動子序列的加成等，以導入適當的宿主來表現或使用無細胞細蛋白質合成系等之方法進行製造。於此情況中，為了得到所欲部位經磷酸化的磷酸化胜肽，可適當藉由下述磷酸化反應而製造：藉由宿主所有或者基因工程上誘導表現的激酶類在宿主內進行磷酸化反應、或於暫時回收目的之胜肽後於體外(in vitro)使激酶等反應而進行磷酸化反應。為了進行在該體外之磷酸化反應，可利用已知有使目的之胜肽以GSK3或CDK5等Tau之磷酸化反應的功能之酵素。如上所述，在宿主內、或體外經磷酸化的磷酸化胜肽當中，為了取得目的之胺基酸殘基經磷酸化者，亦可使用下述方法等：使用以對於上述抗磷酸化Tau的抗體所致之抗體抗原反應而將與特異性抗體結合的磷酸化胜肽回收。

[含有抗磷酸化Tau抗體或磷酸化Tau胜肽之失智症治療劑或預防劑]

人類之失智症係指一度發達或者已獲得的智能功能降低之狀態，雖為智能障礙的一種(上島國利、丹羽真一編，NANKODO’s ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES New精神醫學、p69-70、2008年)，但於廣義中係被認為是呈現智能障礙及/或記憶障礙的疾病。於AD等之神經變性疾病中，為了確定「神經變性」係可藉由死後進行組織學性的解析來確認神經原纖維變化(NFT)之存在等而進行，但神經變性疾病之診斷方面，醫師係基於在作為神經心理學性檢查之以提問所致者/長谷川式簡易智能評估標度改訂版(HDS-R)或Mini-Mental State Examination(MMSE)等、以觀察所致者之Clinical Dementia Rating(CDR)或Functinal Assessment Staging(FAST)等、作為生化學檢查之在腦脊髓液中的Tau或磷酸化Tau之存在量的上昇或A β之存在量的上昇、作為影像檢查之在頭部CT、頭部MRI、SPECT或PET等所得到的資訊，診斷失智症，特別是作為神經變性疾病之失智症。因而，本發明之失智症治療劑或預防劑，係醫師對於診斷出失智症的患者所投予，且於上述之神經變性疾病中之診斷的項目之1個以上，相較於投予前具有改善的效果，或具有藉由投予而抑制病狀發展的程度或者維持或恢復至投予前之狀態的效果者。

被投予本發明之失智症治療劑或預防劑的患者係失智症之患者，且其中亦為Tau蛋白疾病之患者，其中亦為阿茲海默症(AD)、皮質基底核退化症(CBD或CBS)、進行性核上性麻痺、匹克氏症、嗜銀顆粒性失智症(嗜銀性顆粒病)、Multiple system tauopathy with dementia(MSTD)、伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)、神經原纖維變化型失智症、伴隨石灰沉積之瀰漫性神經原纖維變化症(DNTC)、伴隨球狀神經膠包涵體之蛋白質Tau蛋白疾病(WMT-GGI)、或伴隨Tau陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-tau)、埃科諾莫氏腦炎後遺症、亞急性硬化性全腦炎或拳擊手腦炎當中之任一者的患者。因而，本發明之失智症治療劑係Tau蛋白疾病之治療劑或預防劑，就其他的觀點而言，亦可說為阿茲海默症(AD)、皮質基底核退化症(CBD或CBS)、進行性核上性麻痺、匹克氏症、嗜銀顆粒性失智症(嗜銀性顆粒病)、Multiple system tauopathy with dementia(MSTD)、伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)、神經原纖維變化型失智症、伴隨石灰沉積之瀰漫性神經原纖維變化症(DNTC)、伴隨球狀神經膠包涵體之蛋白質Tau蛋白疾病(WMT-GGI)、或伴隨Tau陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-tau)、埃科諾莫氏腦炎後遺症、亞急性硬化性全腦炎或拳擊手腦炎等之治療劑或預防劑。

此外，本發明之失智症治療劑或預防劑，亦可說是改善非人類動物之認知功能、或具有抑制或維持認知功能之降低的效果者。作為該非人類動物雖包含表現與人類之Tau具有高相同性的Tau之動物、黑猩猩、恆河獼猴、馬、豬、狗、小鼠、兔、大鼠、貓等，但並不限定於此。

[失智症之模式動物]

用以研究本發明之失智症治療劑或預防劑的動物，係可列舉失智症之模式動物，其中特別是可列舉Tau蛋白疾病之模式動物。此外，Tau蛋白疾病之動物模式係為在腦部表現正常型或基因變異型之Tau的動物，特別是引發認知功能之障礙的動物模式。如此之在腦部表現正常型或基因變異型之Tau的動物係可藉由基因工程而製作，其代表性者係可列舉基因轉殖小鼠(Tg小鼠)。表現基因變異型之Tau的Tg小鼠等之動物模式，雖作為遺傳性的家族性之Tau蛋白疾病的模式為有用，但為了看到治療劑或預防劑對於人類之佔大多數的孤立性之Tau蛋白疾病的效果，以在表現正常型之Tau的Tg小鼠展現效果較為理想。如此之表現正常型之Tau的Tg小鼠，雖在本發明之製造例所製作的小鼠最為適合，但其他係可使用神戶等(Neurobiology of Disease,Vol.42,P404-414,2011年)或木村等(The EMBO J.vol.26.P5143-5152,2007年)所報告的Tg小鼠等。然而，於神戶等之小鼠及木村等之小鼠中，雖認定為認知功能障礙，但分別在14個月大及20個月大以後，成為邁入相當高齡後之發症，而具有亦包含因年紀增長所致之影響的可能性、或因長期飼育所致之影響或耗費時間的問題。相對於此，在本發明之製造例所製作的小鼠，係表現人類之正常型的Tau，且於比6個月大左右更早期使認知功能障礙發症的小鼠，因此最適合作為可排除年齡增長等之要因的失智症模式者，藉由使用如此之模式而可更明確地評估具有認知功能之改善效果的失智症治療劑或預防劑。

以動物模式調查本發明之失智症治療劑或預防劑的作用之方法，係以試驗記憶學習試驗等之認知功能的方法較為理想。如此之方法，雖可使用Morris水迷宮試驗、避暗型學習試驗、新奇物質認識試驗等之方法，但為了證實行動量或動物之不安等的條件，以組合曠場實驗(Open Field Test)等之行動測量試驗的方法較為理想。

此外，調查本發明之失智症治療劑或預防劑的作用之方法，亦可於對失智症之模式動物投予後，使用調查腦組織中之Tau蛋白質或磷酸化Tau的增減之方法。一般認為於AD或其他神經變性疾病中，Tau蛋白質之表現量或異常磷酸化Tau之增加與病態有所關聯(Khalid Iqbal等、Curr.Alzheimer Res.,7卷、p654-664、2010年)。接著，於某些病態模式動物中，藉由減低Tau之表現或異常磷酸化Tau之量，而於認知功能或運動功能方面看見改善亦為大眾所周知(K.SantaCruz等、Science,309 卷、p476-481、2005年；Sylvie Le Corre等、Porc.Nat.Acad.Sci.USA,103卷p9673-9678、2006年)。調查Tau蛋白質或磷酸化Tau之增減的方法，雖可使用如同實施例所記載之類的腦組織之均質物，以西方墨點法(Western blotting)等之方法來實施，但其他ELISA法(Xiyun Chai等、J.Biol.Chem.,286卷、p34457-34467、2011年)或組織免疫化學法(David J.Irwin等、BRAIN，135卷、p807-818、2012年)等，只要是該業者則可選擇適當的方法來實施。

本發明之失智症治療劑或預防劑之在模式動物的效果，係作為在人類等之治療劑或預防劑的開發之藥理效果的資料使用。

[失智症治療劑或預防劑]

本發明之失智症治療劑或預防劑的形態，係含有抗磷酸化Tau抗體者，較佳為與相當於Tau蛋白質之序列編號1之410位至421位的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體，且會與由相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、及Ser416之胺基酸殘基中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體，較理想為與VH之胺基酸序列為序列編號20、VL之胺基酸序列為序列編號26(1505)的抗體進行結合競爭之抗體，更理想為與相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生特異性抗原抗體反應之抗體。關於如此之抗體的說明係記載於上述之[抗磷酸化Tau抗體]的部分。

本發明之失智症治療劑或預防劑之其他的形態，係包含Tau之序列的一部分，且含有其1個以上之胺基酸殘基經磷酸化之胜肽者，該胜肽方面，磷酸化胜肽係由相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列當中，至少含有連續之3個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽，較佳為至少含有連續之5個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽，更佳為至少含有連續之8個胺基酸的長度為8個胺基酸長以上之胜肽。進而，於該磷酸化胜肽中經磷酸化的胺基酸殘基，係相當於序列編號1之胺基酸編號410~421的胺基酸殘中任一者，較佳為相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、Ser416之胺基酸的胺基酸殘基中任一者，更佳為相當於序列編號1之Ser413的胺基酸殘基。關於如此之抗體的說明係記載於上述之[具有來自Tau之磷酸化序列的磷酸化胜肽]的部分。

本發明之失智症治療劑或預防劑亦可含有醫學上所容許之任何添加劑。使用醫學上所容許之添加劑的製劑，係亦可利用在「REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION、費城科學大學(University of the Sciences in Philadelphia)著、Williams & Wilkins公司、2000年12月15日發行」中記載的方法進行實施。如此之治療劑或預防劑之一個形態，係供作為藉由於無菌之水性液或油性液中溶解、懸浮、或乳化而加以調製的液劑。如此之溶劑係可列舉作為水性液之注射用蒸餾水、生理食鹽水等，除此之外，亦有添加滲透壓調節劑(例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化鈉等)、或併用適當的溶解輔助劑，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子界面活性劑(例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油50)等的情況。此外，溶劑方面亦有使用油性液的情況，該油性液的例子係可列舉：芝麻油、大豆油等，溶解輔助劑方面亦有併用苯甲酸苄酯、苄醇等的情況。於如此之液劑中，係有適當使用緩衝劑(例如：磷酸鹽類緩衝劑、乙酸鹽類緩衝劑)、無痛化劑(例如：殺藻胺、普羅卡因鹽酸鹽等)、安定劑(例如：人類血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如：抗壞血酸、異抗壞血酸及此等之鹽等)、著色劑(例如：銅葉綠素、β-胡蘿蔔素、紅色2號、藍色1號等)、防腐劑(例如：p-羥基苯甲酸酯、酚、苄索氯銨、殺藻胺等)、增黏劑(例如：羥丙基纖維素、羧甲基纖維素及此等之鹽等)、安定化劑(例如：人類血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇等)、矯味劑(例如：薄菏醇、柑橘香料等)之添加劑的情況。此外，其他的治療劑或預防劑之形態係可列舉：散劑、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、片劑等之固體劑。以經口用製劑的形態進行投予的固體劑之情況中，添加劑方面係使用賦形劑(例如：結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、潤滑劑(例如：硬脂酸鎂、滑石等)、黏合劑(羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇等)、崩解劑(例如：澱粉、羧甲基纖維素鈣等)等。此外，可因應需要而使用防腐劑(例如：苄醇、氯丁醇、p-羥基苯甲酸甲酯、p-羥基苯甲酸丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等之添加劑。進而，其他的形態，亦可列舉適合黏膜用治療劑或預防劑，於此製劑中係以賦予對黏膜之吸著性、滯留性等為主要目的，添加劑方面亦有含有黏著劑、增黏劑、黏稠劑、黏稠化劑等(例如：黏液素、瓊脂、明膠、果膠、鹿角菜膠、海藻酸鈉、刺槐豆膠、黃原膠、紫雲英樹膠、阿拉伯膠、幾丁聚醣、支鏈澱粉、蠟狀澱粉、硫糖鋁(sucralfate)、纖維素、及其之衍生物(例如：羥丙基甲基纖維素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷酯共聚物、或其之鹽、聚甘油脂肪酸酯等)的情況。然而，供給生物體之治療劑或預防劑的形態及溶劑或添加劑並不限於此等，只要是該業者皆可適當選擇。

於本發明之失智症治療劑或預防劑中，除上述抗磷酸化Tau抗體或磷酸化胜肽以外亦包含調配有具抑制既存的失智症之進展的效果之物質的治療劑或預防劑。此外，於本發明之失智症治療劑或預防劑中，亦包含用以併用含有含上述抗磷酸化抗體或磷酸化胜肽之治療劑或預防劑與具抑制既存的失智症之進展的效果之物質的Kit。抑制失智症之進展的物質雖可列舉例如：多奈哌齊 (Donepezil)、加蘭他敏(Galantamine)、美金剛(Memantine)或利佛斯狄明(Rivastigmine)等，但並不限定於此。含有具抑制所調配之失智症的進展之效果的物質或具抑制失智症的進展之效果的物質之治療劑或預防劑的用量，雖可以一般治療中所使用的用量來進行，但亦可因應狀況而進行增減。

此外，本發明之實施例所使用的抗體，雖依據實施例的結果證明：即使藉由腹腔內投予之來自末梢的投予也會通過血腦障壁而在腦部發揮作用而顯示藥效，但亦能製作用以將於本發明之失智症治療劑或預防劑中使用的抗磷酸化Tau抗體有效率地供給至腦部組織之製劑，如此之製劑亦包含於本發明之失智症治療劑或預防劑。使抗體或胜肽等有效率地通過血腦障壁而供給至腦部組織的方法，已知有附加標靶用的物質之方法、或封入微脂粒或奈米粒子內之方法等。標靶用之物質係可使用藉由與抗體結合而改變全體或部分的電荷特性者，或使用具有與特異性受體或轉運蛋白等結合之特性的胜肽或蛋白質或者化合物。具有與特異性受體或膜蛋白等結合之特性的胜肽或蛋白質或者化合物之例子係可列舉：結合於受體之配位子或膜蛋白質的配位子或其類似物、結合於受體之配位子或膜蛋白質的抗體、促效劑化合物/拮抗劑化合物/別構調節劑或此等之類似化合物等。具有與特異性受體或轉運蛋白等結合之特性的胜肽或蛋白質或者成為化合物之標靶的受體之配位子或膜蛋白質的例子，雖可列舉：運鐵蛋白受體 (TfR)、胰島素受體(IR)、胰島素樣成長因子受體(IGFR)、LDL受體相關蛋白質(LRP)或肝素結合毒素受體(HB-EGF)等，但並不限定於此(Angela R.Jones等、Pharm.Res.,24卷、p1759-1771、2007年)。標靶用之物質係可化學性附加於本發明之失智症治療劑或預防劑中所使用的抗體，其方法係參照周知的方法，例如於Hermanson等生物交聯技術(Bioconjugate techniques)(USA)1996年發行Academic Press)中記載的方法，只要是該業者皆可適當進行。此外，標靶用之物質，亦可與包含抗體或胜肽之微脂粒或奈米粒子結合(Sonu Bhaskar等、Particle and Fibre Toxicology，7卷3號、2010年)。進而，於標靶用物質為胜肽或蛋白質的情況中，藉由製造為以胜肽化學合成所致之融合胜肽，或使由編碼胜肽或蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列所構成之核酸與由編碼所使用之抗體或胜肽之胺基酸序列的鹼基序列所構成之核酸組合，只要是該業者皆可作為適當融合蛋白質而使用基因工程的技術來進行製造。

本發明之治療劑或預防劑，係可將症狀之改善作為目的，而進行經口或非經口投予。於經口投予的情況中係可選擇顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、液劑、糖漿劑、乳劑或懸浮劑、酏劑等之劑型。於非經口投予的情況中，例如可製成經鼻劑，可選擇液劑、懸浮劑、固體製劑等。此外，其他非經口投予的形態係可製成注射劑，注射劑方面係可選擇：皮下注射劑、靜脈注射劑、點滴注射劑、肌肉注射劑、腦室內注射劑或腹腔內注射劑等。此外，其他非經口投予所使用的製劑亦可列舉：栓劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外之經黏膜投予劑等。進而，在血管支架或血管內栓塞劑中含有或進行塗佈的樣態下，亦可進行血管內局部投予。

本發明之治療劑或預防劑的投予量，雖依據患者的年齡、性別、體重、症狀、治療效果、投予方法、處理時間、或該醫藥組成物所含有的活性成分之種類等而有所不同，但一般成人每1人，每1次可在0.1mg至1g之範圍內，較佳為0.5mg至200mg之範圍內投予主劑。但，投予量係依據各種的條件而有所變動，因此亦有比上述投予量更少的量便足夠的情況，此外，亦有需要超過上述範圍之投予量的情況。

此外，本發明之治療劑或預防劑係可在短的投予時間內得到效果。

[實施例]

以下，雖以實施例更詳細地說明本發明，但此等實施例並不限定本發明。實驗係依據大阪市立大學阿倍野地區動物實驗委員會之承認而進行。

[實施例1]對於pSer413胜肽之兔多株抗體的製作

為了製作對於pSer413胜肽之抗體，抗原方面，使用有在相當於人類蛋白質之序列編號1的胺基酸序列之第 413號的Ser經磷酸化之相當於第410號的Asn至第416號的Ser之胺基酸序列的C末端部位，附有Cys的合成胜肽(序列編號31.醫學生物學研究所股份有限公司[MBL]合成)(以下，將該胜肽稱為pSer413(S)胜肽)。

pSer413(S)胜肽：N-AsnValSer(pSer)ThrGlySerCys-C(序列編號31)

pSer413(S)胜肽係於合成後，以HPLC進行純化，與KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)進行共價結合。所得到的接合物(conjugate)係對於1隻兔子，1次之免疫中使用0.1mg。第一次的免疫係將0.2mL之接合物溶液(接合物濃度0.5mg/mL)與等量的佛朗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)進行混合，於經剃毛的日本白色種之兔子的背部，在8個部位各進行50μL之皮內注射。第二次以後的免疫係使用佛朗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)，每隔2週再進行2次相同的免疫。距最後的免疫2週後採取一部分血液，以使用有經免疫之胜肽接合物的ELISA法確認其血清中之抗體價，於其之1週後將動物屠殺而採取全部血液。由所得到的血液製作血清，由該血清使用pSer413(Af)胜肽(序列編號32)之親和性管柱來將抗體純化。

另外，血清抗體值之確認係依據以下的方法。將pSer413(S)胜肽以PBS稀釋為5μg/mL之後，以100μL/well分注於盤，在4℃下靜置一夜。將溶液去除後，以250μL/well分注阻斷液(Blocking Buffer；MBL 公司製)，在4℃下靜置一夜。將免疫前兔血清與免疫後兔血清之稀釋系列設為100、500、2,500、12,500、62,500倍、空白，以100μL/well添加經PBS稀釋者，以25℃使其反應60分鐘。洗淨後，將抗兔IgG-過氧化酶標識(MBL公司製)，以100μL/well添加經稀釋Buffer(MBL公司製)8,000倍稀釋者，以25℃使其反應60分鐘。洗淨後，以100μL/well添加發色液(MBL公司製)，經3~10分鐘使其發色，以100μL/well添加2N硫酸，使反應停止。反應停止後，以測量波長450nm、參照波長620nm測量出吸光度。

此外，純化抗體之抗體反應性的確認係依據以下的方法。將pSer413(L)胜肽[將pSer413(S)胜肽(底線部分)於N端、C端方向進一步延長的胜肽(序列編號33.Biosynthesis公司所合成)：N-ProArgHisLeuSerAsnValSer(pSer)ThrGlySerIleAspMetValAsp-C]、或雖具有相同胺基酸序列但相當於Ser413的部位未經磷酸化的NonP(L)胜肽(序列編號34.Biosynthesis公司所合成)以PBS稀釋為1μg/mL之後，以50μL/well分注於板，在4℃下靜置一夜。將溶液去除後，以250μL/well分注阻斷液(3%BSA-PBS)，在37℃下靜置1小時以上。將純化抗體以PBS進行稀釋，以50μL/well添加經系列化者，以25℃使其反應90分鐘。洗淨後，將羊抗兔IgG-鹼性磷酸酶標識(Bioscience公司製)，以50μL/well添加經稀釋Buffer(3%BSA-PBS) 2,000倍稀釋者，並以25℃使其反應60分鐘。洗淨後，以100μL/well添加發色液(於2.5mM含有MgCl₂之0.1M Diethanolamine buffer，pH9.8中添加1mg/mL PNPP[p-硝‧苯基磷酸酯]的溶液)，經30分鐘使其發色，以測量波長405nm、參照波長550nm測量出吸光度。

<結果>

經純化之抗體係如第3圖所示般，判斷出對於pSer413(L)胜肽特異性高，對於nonP(L)胜肽幾乎無反應。因而，該抗體係與pSer413(L)胜肽產生特異性抗原抗體反應之抗體(於本說明書中，亦有記載為「pSer413識別兔多株抗體」或「pS413AB」的情況)。

[實施例2]對於pSer413胜肽之單株抗體(Ta15系列)的製作

抗原方面，係使用有在相當於序列編號1所示之人類蛋白質的胺基酸序列之第413號的Ser之胺基酸殘基經磷酸化之相當於第403號的Thr至第423號的Pro之序列的N末端部位，附有GlyCysSerGly的合成胜肽pSer413(Im)胜肽(序列編號35)。pSer413(Im)胜肽係於合成後，以HPLC進行純化，與KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)進行共價結合。所得到的接合物係對於1隻小鼠，1次之免疫中使用0.04mg。免疫係將0.4ml(以胜肽換算為1.1mg/ml)之接合物溶液與0.7mL之Saline及 1.1mL之佛朗氏完全佐劑進行混合，對於10隻分別進行200μL之腹腔內注射。每隔2週再進行3次相同的免疫(免疫部位、抗原量皆相同，且使用佛朗氏不完全佐劑)。10隻當中，對於對抗原之血清抗體價唯一上昇的1隻，於距最後的免疫1個月後，進行尾靜脈注射以胜肽換算為0.5mg/mL之抗原溶液(溶解於Saline)100μL，3日後屠殺動物而採取脾臟。使用18G注射針2支切取脾臟之後，以橡皮塞面，將已切取的脾臟緩緩壓碎。經壓碎的脾臟細胞，係以冷RPMI 1640培養基10mL左右進行懸浮，將其上澄液以40μm細胞過濾器進行過濾，將濾液採取至50mL離心管。將脾臟細胞之碎塊(Debris)進一步以橡膠塞面壓碎，同樣地以冷RPMI 1640培養基進行懸浮、過濾，並採取濾液。以使最終脾臟細胞懸浮液成為40mL的方式添加冷RPMI 1640培養基(或冷PBS)。以血球計算盤，測量懸浮液中之淋巴球濃度，將最終相當於2×10⁷Cells之淋巴球移至50mL之離心管。在此，添加在培養液B(RPMI 1640+10%胎兒牛血清+2mM麩胺酸+100μg/mL鏈黴素+100單位/mL青黴素)所培養之相當於4×10⁷Cells的對數增值期之小鼠/骨髓瘤細胞P3X63Ag8．U1株(簡稱為P3．U1)，以1500rpm進行離心5分鐘，捨去上清液。藉由輕敲試驗管而使細胞胜肽均勻分散。於此中添加0.5mL之聚乙二醇液(由RPMI1640(2.3mL)+聚乙二醇2000(1.4mL)+二甲基亞碸(0.3mL)所構成：以下簡稱為「PEG液」)，使細胞緩緩地浮游。1分鐘後，耗費1分鐘緩緩滴下0.5mL之PEG液，進一步耗費1分鐘緩緩滴下1.0mL之RPMI 1640，更進一步耗費2分鐘緩緩滴下2mL之RPMI 1640。然後，耗費2分鐘滴下4mL之HAT/GIT培養液(GIT培養基[日本製藥]+5%胎兒牛血清+100μg/mL鏈黴素+100單位/mL青黴素+95μM次黃嘌呤+0.4μM胺喋呤+16μM胸苷)，進一步耗費2分鐘滴下4mL之HAT/GIT培養液。最後，添加HAT/GIT培養液而製成40-50mL之細胞浮游液。在37℃、30分鐘恆溫槽進行培養之後，將此播種於7片培養h盤(96孔)。另外，培養盤方面，使用經數日培養小鼠(ICR系)之腹腔巨噬細胞(餵養細胞feeder cells)(>1×10⁵/well)96well盤(餵養盤)。然後，將此盤在37℃、5%CO₂下進行培養7~10日。

每1週以新的HT培養液(從HAT/GIT培養液去除胺喋呤者)更換半量的培養液，而得到融合瘤。

抗體之篩選係依據以下的方法。將pSer413(L)胜肽以PBS稀釋為1μg/mL之後，以50μL/well分注於96well盤，在4℃下靜置一夜。將溶液去除後，以250μL/well分注阻斷液(3%BSA-PBS)，在室溫下放置1小時以上。將阻斷液(3%BSA-PBS)進行吸引，以30~50μL/well添加融合瘤之上清液，在25℃下使其反應60分鐘。以含有0.05%Tween20之磷酸緩衝生理食鹽水(PBS-Tween)洗淨之後，以100μL/well添加2次抗體(阻斷液中添加有經2000倍稀釋的鹼性磷酸酶標識羊抗小鼠IgG-Fc抗體[SouthernBiotech公司]之溶液)，在25℃下使其反應60分鐘。洗淨後，以100μL/well添加基質溶液(於2.5mM含有MgCl₂之0.1M Diethanolamine buffer，pH9.8中添加0.7~1.2mg/mL PNPP[p-硝‧苯基磷酸酯]的溶液)，在25℃下使其發色60分鐘之後，以測量波長405nm測量吸光度。

利用此篩選，由顯示陽性的Well中取出細胞，並以血球計算盤計數細胞數目之後，以1~3個/well播種於96well盤(前述之餵養板)，進行以極限稀釋法所致之選殖(Ta1501、Ta1502、Ta1505~1509)。為了以後之解析用，大量培養殖株後，以蛋白G管柱，將抗體純化。Ta1505係與Ta1505-2相同。同型之決定，係使用AbD serotec公司之Kit來進行。

使經純化的抗體於塗佈有對於Tau之各種磷酸化部位的部分胜肽之ELISA盤進行反應，調查磷酸基特異性。方法如下。

將各種Tau胜肽(pS46[序列編號36]、pS199[序列編號37]、pS202[序列編號38]、pT212[序列編號39]、pS214[序列編號40]、pT212/pS214[序列編號41]、pT217[序列編號42]、pS413[序列編號33]、non pS413[序列編號34])的10%DMSO溶液、或者經將胜肽BSA接合者(pS400[序列編號43]-BSA、pS412[序列編號44]-BSA)之PBS溶液，以PBS(pH7)稀釋為1μg/mL，以50μL/well添加於96well盤(MaxiSorp：Nunc公司)，在 4℃下進行整夜培養而予以固定化。然後，去除胜肽溶液，以含有0.05% Tween20的TBS進行洗淨3次之後，以280μL/well添加3%BSA/PBS，在37℃下、1小時進行阻斷(blocking)。

吸引去除阻斷液，以含有0.05% Tween20的TBS進行洗淨3次之後，以50μL/well添加各種Ta15系列的單株抗體溶液1μg/mL in 3%BSA/PBS，在室溫下1小時使其反應。以含有0.05% Tween20的TBS進行洗淨3次之後，添加50μL之以含有3%BSA的PBS 2000倍稀釋之鹼性磷酸酶標識羊抗小鼠IgG抗體(ThermoScience公司)，在室溫下1小時使其反應。以含有0.05% Tween20的TBS進行洗淨3次之後，添加100μL之溶解於0.1M的二乙醇胺(pH10)之1mg/mLPNPP(對硝苯基磷酸酯)溶液，在室溫下1小時使其反應，而測量出於405nm之吸光度。將各抗體對於各種胜肽的反應性評估結果顯示於表2。反應性係分為3階段進行評估。+：有反應性、-無反應性、±：認為有些許反應性但非常微弱

此等抗體(以下，稱為「Ta15系列」)，經探討的胜肽當中，僅與pSer413產生反應，磷酸基特異性極高。

[實施例3]Ta15系列抗體之結合親和性測量

為了評估Ta15系列抗體與抗原胜肽(pSer413胜肽(Im)：參照實施例2)之結合親和性，使用表面電漿子共振法(SPR)系統Biacore(GE Healthcare Japan股份有限公司、BIACORE3000、code#BR-1100-45)及各Biacore製品，依據操作說明書來測量。測量的其中一個方法，係將抗小鼠抗體(code#BR-1008-38)，藉由以胺偶合反應所致之共價結合固定化(code#BR-1006-33)於CM5晶片(羧甲基葡聚糖層形成完畢的晶片，code#BR-1100-14)，將Ta15系列抗體結合於經固定化的抗小鼠抗體，對於經結合的Ta15系列抗體，測量抗原胜肽的結合動態之方法。

將特異性結合的反應溶液作為HBS-EP緩衝液(code#BR-T-1001-88)，並藉由N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二醯亞胺鹽酸(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之混合溶液，而使CM5晶片活性化。使經藉由10mM乙酸鈉緩衝液pH5.0將抗小鼠抗體稀釋為0.001mg/mL的溶液，於晶片上的4個流量槽進行反應，使抗小鼠抗體共價結合於CM5晶片之後，以乙醇胺進行阻斷。固定有抗小鼠抗體的4個流量槽當中，於其中一個係以各1000RU左右的密度捕捉陰性抗體(小鼠IgG2a同型對照，R & D Systems公司，code#MAB003)，於其他的流量槽係捕捉Ta15系列抗體。使附加有1M NaCl的HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% v/v Surfactant P20)反應3分鐘，去除非特異性吸附的抗體，以流速50uL/分鐘使HBS-EP緩衝液反應10分鐘，使基線安定。將胜肽使用HBS-EP緩衝液，在從100pM至5mM的濃度之間(概算結合解離常數[KD]附近)進行階段性稀釋，使所得到的胜肽溶液(5濃度)從低濃度側連續性地隔著各6分的間隔(一律)反應4分鐘~6分鐘，而測量出結合動態。

抗原胜肽之特異性結合動態資料方面，為了排除因操作所造成之雜訊的影響，得到以非磷酸化胜肽(non pSer413胜肽)所致之結合動態資料作為陰性胜肽，而從抗原胜肽之結合動態資料中扣除。另外，關於測量濃度，對非磷酸化胜肽之抗體的結合並不被認可。使特異性結合動態資料使用Biacore解析軟體(BIAevaluation：單循環動力學解析，code#AP-4000-01)，並適合Single cycle kinetics 1：1 binding with drift model，同時得到動力學性結合速度(Ka)及解離速度(Kd)(Karlsson.R.,Katsamba,P.S.,Nordin,H.,Pol,E.and Myszka,D.G.(2006).“Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.”Anal.Biochem.349(1)：136-47)。作為Ta15系列抗體的親和性測量值之平衡解離常數(KD)值係由Kd/Ka計算出。

<結果>

Ta15系列抗體當中，將對抗原胜肽之親和性最強的Ta1505抗體用於使用有記憶障礙小鼠的行動試驗中。

[實施例4]識別pSer396及/或pSer404胜肽之單株抗體的製作

抗原方面，係使用有在相當於序列編號1所示之人類蛋白質的胺基酸序列之第396號、第404號之Ser的胺基酸殘基經磷酸化之第379號的Arg至第408號的Leu之序列的N末端部位，附有GlyCys的合成胜肽(序列編號47：Biosynthesis公司所合成)(以下，將該胜肽稱為pSer396/pSer404胜肽)。

pSer396/pSer404胜肽：N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C(序列編號47)

pSer396/pSer404胜肽係於合成後，以HPLC 進行純化，而與Maleimide activated KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)(Thermo Scientific公司)共價結合所得到的接合物，係對於Balb/c小鼠1隻，每1次的免疫約使用0.04mg。免疫係將0.3mL(以胜肽換算為0.77mg/ml)之接合物溶液與0.3mL之佛朗氏完全佐劑進行混合，對於4隻分別進行100μL之腹腔內注射。對於其中2隻，分別間隔2週，進一步進行2次腹腔內免疫(抗原量相同，且使用佛朗氏不完全佐劑)及足底免疫(使用抗原+Titer Max之佐劑)，對於剩下的2隻則僅進行腹腔內免疫。對於進行了對抗原之血清抗體價高的腹腔內免疫及足底免疫之小鼠，離最後的免疫15日後，進行尾靜脈內注射抗原溶液(溶解於Saline)，於3日後屠殺動物而採取脾臟。使用18G注射針2支，切取脾臟之後，以橡皮塞面，將已切取的脾臟緩緩壓碎。經壓碎的脾臟細胞，係以冷RPMI 1640培養基10mL左右進行懸浮，將其上澄液以40μm細胞過濾器進行過濾，將濾液採取至50mL離心管。將脾臟細胞之碎塊(Debris)進一步以橡膠塞面壓碎，同樣地以冷RPMI 1640培養基進行懸浮、過濾，並採取濾液。以使最終脾臟細胞懸浮液成為40mL的方式添加冷RPMI 1640培養基(或冷PBS)。以血球計算盤，測量懸浮液中之淋巴球濃度，將最終相當於2×10⁷Cells之淋巴球移至50mL之離心管。在此，添加在培養液B(RPMI 1640+10%胎兒牛血清+2mM麩胺酸+100μg/mL鏈黴素+100單位/mL青黴素)所培養之相當於4×10⁷Cells的對數增值期之小鼠/骨髓瘤細胞P3．U1，以1500rpm進行離心5分鐘，捨去上清液。藉由輕敲試驗管而使細胞胜肽均勻分散。於其中添加0.5mL之PEG液，使細胞緩緩浮游。1分鐘後，耗費1分鐘緩緩滴下0.5mL之PEG液，進一步耗費1分鐘緩緩滴下1.0mL之RPMI 1640，更進一步耗費2分鐘緩緩滴下2mL之RPMI 1640。然後，耗費2分鐘滴下4mL之HAT/GIT培養液(GIT培養基[日本製藥]+5%胎兒牛血清+100μg/mL鏈黴素+100單位/mL青黴素+95μM次黃嘌呤+0.4μM胺喋呤+16μM胸苷)，進一步耗費2分鐘滴下4mL之HAT/GIT培養液。最後，添加HAT/GIT培養液而製成40-50mL之細胞浮游液。在37℃、30分鐘恆溫槽進行培養之後，將此播種於7片培養盤(96well)。另外，培養盤方面，使用經數日培養小鼠(ICR系)之腹腔巨噬細胞(餵養細胞)(>1×10⁵/well)96well盤(餵養盤)。然後，將此盤在37℃、5%CO₂下進行培養7~10日。

單株抗體之篩選係依據以下的方法進行。篩選用抗原方面，係使用有於pSer396/pSer404胜肽(N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C)(序列編號47)之N端的Cys接合BSA之pSer396/pSer404胜肽- BSA、及於非磷酸胜肽(N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeu-C)(序列編號48)之N端的Cys接合BSA之非磷酸化胜肽-BSA。將非磷酸化胜肽-BSA或pSer396/pSer404胜肽-BSA以PBS稀釋為1μg/mL之後，以50μL/well分注於96well盤，在4℃下靜置一夜。將溶液去除後，以250μL/well分注阻斷液(3%BSA-PBS)，在室溫下放置1小時以上。將阻斷液(3%BSA-PBS)進行吸引，以30~50μL/well添加融合瘤之上清液，在25℃下使其反應60分鐘。以含有0.05% Tween20之磷酸緩衝生理食鹽水(PBS-Tween)洗淨之後，以100μL/well添加檢測用試劑(阻斷液中添加有經2000倍稀釋的鹼性磷酸酶標識Protein A之溶液)，在25℃下使其反應60分鐘。洗淨後，以100μL/well添加基質溶液(於2.5mM含有MgCl₂之0.1M Diethanolamine buffer，pH9.8中添加0.7~1.2mg/mL PNPP[p-硝‧苯基磷酸酯]的溶液)，在25℃下使其發色60分鐘之後，以測量波長405nm測量出吸光度。

從於非磷酸胜肽-BSA中反應性低，且於pSer396/pSer404胜肽-BSA中反應性高的Well取出細胞，以1-3細胞/well播種於96well盤(先前的餵養盤)，進行以極限稀釋法所致之選殖。由其中篩選出產生Ta9抗體(IgG3/κ)的殖株。為了以後之解析用，大量培養殖株後，以蛋白G管柱，將抗體純化。

依據實施例3所記載的方法測量出Ta9抗體對於pSer396/pSer404胜肽的KD值為1.08×10^-10，對胜肽之親和性係高於Ta15系列抗體。

[實施例5]行動試驗取得抗體對記憶學習障礙小鼠所造成的影響

調查以下3種抗體的投予對記憶學習障礙小鼠(Tau-Tg)所造成的影響。

(1)pSer413辨別兔多株抗體：使用9-11個月大之Tau-Tg(line609)小鼠或non-Tg小鼠(正常對照)、n=9-10/群

(2)Ta1505(pSer413辨別單株抗體)：使用14個月大之Tau-Tg(line784)小鼠或non-Tg小鼠、n=9-10/群

(3)Ta9(pSer396辨別單株抗體)、使用14個月大之Tau-Tg(line609)小鼠或non-Tg小鼠、n=9-10/群

實驗中係使用9-14個月大之公的異型組合Tau-Tg小鼠(line 609或line 784)、及其之non-Tg同窩出生者(littermates)。群組間以平均體重無差異的方式進行群組區分。對於異型組合Tau-Tg小鼠，每1週1次，共計5次，每隻每次進行腹腔投予1mg之經PBS或檸檬酸緩衝液(pH5)稀釋的抗體。陰性對照群方面，係將調製抗體時所使用的緩衝液或對Tau不具有反應性的小鼠IgG單株抗體，以同用量進行腹腔投予。陽性對照方面，對於non-Tg同窩出生者(littermates)，將調製抗體時所使用的緩衝液，以同用量進行腹腔投予。

以下顯示(1)~(3)之群構成。

(1)<使用小鼠>：變異Tau-Tg(line 609)，9-11mo(9-11個月大)

<群構成>

評估抗體群：Anti-tau pSer413兔多株抗體1.6mg/mL in PBS(n=10)

Control抗體群：PBS(n=9)

non-Tg群：PBS(n=9)

(2)<使用小鼠>：變異Tau-Tg(line 784)，14mo(14個月大)

<群構成>

評估抗體群：Anti-tau pSer413小鼠單株抗體Ta1505 in 0.1M citrate buffer(pH5)3.84mg/ml(n=10)

Control抗體群：Anti-Pseudomonas Aeruginosa小鼠單株抗體4C10F4 in 0.1M citrate buffer(pH5)4.28mg/ml(n=9)

non-Tg群：0.1M citrate buffer(pH5)(n=9)

(3)<使用小鼠>：變異Tau-Tg(line 609)，14mo(14個月大)

<群構成>

評估抗體群：Anti-tau pSer396小鼠單株抗體Ta9 in 0.02M citrate buffer(pH6)(n=10)2.66mg/ml

Control抗體群：Anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibody 6F11 in 0.02M citrate buffer(pH6)(n=9)4.50mg/ml

non-Tg群：0.02M citrate buffer(pH6)(n=9)

從最終投予的隔週星期一起使用Morris水迷宮進行空間參考記憶(spatial reference memory)試驗(水迷宮試驗)。從水迷宮試驗結束次日起使用曠場裝置來測量出小鼠的自發運動量(曠場(Open Field)試驗)。

<水迷宮試驗；(1)~(3)共通>

準備：於內徑100cm、高度45cm的黑色液槽內注入16cm深的水。水溫調整至21~23度，並不進行以氧化鈦等所致之著色而保持無色透明。亦不添加氯，而於每試驗日(trial day)後進行糞便排除、與每次約10L之替換水。Trial(獲得)試驗：使15cm高之透明的平台沉入離壁20cm(距中心30cm)的位置。包括使平台沉入的場所區分為4象限，小鼠係僅隨機投入沒有平台的3象限中任一者。以1試行60秒鐘為限，每日進行5試行。1試行的間隔約5分鐘。記錄到達平台為止的逃脫時間(escape time)作為數據。針對於60秒內不逃避的小鼠，係利用操作員的手誘導至平台，逃脫時間係記為60秒鐘。平台上的小鼠係於10秒後從液槽取出，至接下來的試行之前進行自由活動，使身體乾燥。關於每日之小鼠的成績係使用5試行的逃脫時間之平均秒數。

在Control抗體群(nonTg)的成績安定之時點結束獲得試驗，隔日進行probe試驗。

probe試驗：最終日的隔日，將平台從液槽取出，以視頻攝像機拍攝60秒鐘之自由游泳。觀察所拍攝的視頻，測量自由游泳中的小鼠在4象限當中，於存在平台的象限(target quadrant)內游泳之時間，以60秒鐘之百分率表示。此時，針對液槽投入後30秒鐘為止的游泳亦進行相同的解析。

Trial(獲得)試驗之顯著性(significance)檢測係藉由repeated measure,Fisher’s PLSD來進行、Probe test之顯著性檢測係藉由Fisher’s PLSD來進行。

<曠場(Open Field)試驗；(1)~(3)共通>

裝置：使用5mm厚的透明丙烯酸板而製作30×30×30cm之正方形的箱子，存放於防音環境中。於存放環境上部設置40w的白熾燈，以照度110lux照射地面。

行動量：(i)於丙烯酸箱子的側面外側，距離地面1.5cm的位置，以10cm間隔設置紅外線光束。於小鼠連續遮斷2個光束時，作為移動(locomotion)而進行檢測、計數。

(ii)於相對向的2側面之距離地面3.5cm的位置設置紅外線光束面。於小鼠遮斷光束面的一部分時，作為站立(rearing)而進行檢測、計數。

試驗：給予小鼠1次20分鐘的試驗期間。將小鼠投入丙烯酸箱中央部，迅速地關門而成為防音環境後，開始試驗期間。

對於試驗期間的前半10分鐘係在明條件下之自由活動，後半10分鐘係關閉照明在暗條件下之自由行動進行測量。

解析：分別針對移動(locomotion)、站立(rearing)以線圖顯示小鼠之每1分鐘的行動量。

於可確認出對於試驗期間開始10至分鐘後的暗條件之環境變化產生反應，而小鼠的行動量展現變化的情況，視覺係定義為正常。

以長條圖顯示明條件、暗條件各自的總行動量、及20分鐘的總行動量。

針對移動(locomotion)、站立(rearing)的總行動量進行群間之顯著性檢測。

移動(locomotion)雖主要解釋為自發行動量，站立(rearing)主要解釋為探查行動量，但實際上兩者的指標會互相影響(例如，即使觀察到移動(locomotion)降低，其時間方面實際上只要站立(rearing)上昇，則不能說是行動量降低)。

<免疫組織化學試驗；僅實施(2)>

行動試驗結束後，從各群當中各選擇5隻，以甲醛水溶液回流固定。石蠟包埋後，以切片機製成從腦部薄切切片，以二甲苯、乙醇各進行10分鐘、4次處理，而進行脫蠟處理。以檸檬酸阻斷液(pH6)進行30分鐘煮沸處理 (抗原賦活化處理)，返回室溫後，以Tris-緩衝生理食鹽水(TS)進行10分鐘、2次洗淨。以含20%牛血清之TS在室溫、60分鐘阻斷後，將小鼠抗人類突觸素抗體(以含10%牛血清之TS將SIGMA公司SVP-38進行200倍稀釋者)進行安裝，以4℃進行處理一夜。以TS進行10分鐘、2次洗淨之後，將FITC標識抗小鼠IgG抗體(以含10%牛血清之TS將VECTOR公司之該抗體進行20倍稀釋者)進行安裝，在室溫下進行處理60分鐘。以TS進行10分鐘、2次洗淨之後，將VECTASHIELD(VECTOR公司)進行安裝，而進行顯微鏡觀察。以NIH imageJ將螢光強度進行定量、數值化，以任意單位(arbitrary unit)表示。

<結果> 1.各抗體之投予對於記憶障礙的影響

(1)pSer413兔多株抗體

將(1-1)~(1-3)之結果顯示於第4圖~第7圖。若綜合而言，則藉由抗pSer413多株抗體的受動免疫，在模式小鼠(Tau-Tg)之記憶障礙會顯著改善至與non-Tg相同水準。另外，於(1-3)中，於各群間之自發運動、視覺並未觀察出顯著性。

(2)將pSer413小鼠單株抗體(1505抗體)(2-1)~(2-3)之結果顯示於第8圖~第11圖。若綜合而言，則藉由抗pSer413單株抗體的受動免疫，在模式小鼠之記憶障礙會顯著改善至與non-Tg相同水準。另外，於(2-3)中，於各群間之自發運動、視覺並未觀察出顯著性。

依據(2-1)及(2-2)之結果，pSer413抗原決定位置係針對多株抗體、單株抗體中任一者，皆被認為是作為受動免疫療法之標的而為良好的抗原決定位置。

(3)pSer396小鼠單株抗體(Ta9抗體)

將(3-1)~(3-3)之結果顯示於第12圖~第15圖。若綜合而言，則藉由Ta9投予記憶障礙為顯著而改善至與non-Tg相同水準。另外，於(3-3)中，於各群間之自發運動、視覺並未觀察出顯著性。

然而，Ta9若相較於Ta1505，則藥效較弱。抗原親和性係無關於作為Ta9>Ta1505之(參照實施例2、3)，藥效係基於作為Ta9<Ta1505之(實施例5)，而教示因磷酸化抗原決定位置的差異所導致之藥效的差異。

[實施例6]對於以Ta1505抗體投予所致之神經功能的影響

藉由作為記憶的中樞之海馬CA3區域的抗突觸素抗體之免疫染色，來調查Ta1505抗體投予對於作為反映神經功能之指標所得知的突觸素量造成之影響。螢光強度係以NIH-Image J進行定量化。

將結果顯示於第16圖。藉由Ta1505抗體投予，雖非為顯著，但觀察到海馬突觸素量之恢復。

[實施例7]Ta15系列單株抗體cDNA之鹼基序列決定

(1)融合瘤全RNA之純化

培養各種單株抗體產生融合瘤，6孔盤之每1well使用1mL之ISOGEN，將細胞溶解。於此溶解液中添加0.2mL之氯仿，以渦流進行混合，在室溫下放置2~3分鐘。以12000rpm並以10分鐘4℃進行離心，將上層移至新的管中。此溶解液中添加0.5mL之異丙醇，進行混合，在室溫下放置10分鐘。將此以15000rpm、4℃進行離心15分鐘而使全RNA沉澱。於錠中添加1mL之75%乙醇，充分混合之後，以10000rpm、4℃進行離心5分鐘。將錠風乾，並溶解於DNase、RNase活水中，在-80℃下加以保存。

(2)以5’-RACE、3’-RACE所致之H鏈、L鏈cDNA之取得及該cDNA之鹼基序列決定

與已知之小鼠IgG2a及IgG2b之H鏈的常數(Constant)區域之cDNA序列一起，將5’-RACE(Rapid Amplified of cDNA Ends)及3’-RACE用之引子(primer)合成。相同地與小鼠L鏈的常數(Constant)區域之cDNA序列一起，將5’-RACE(Rapid Amplified of cDNA Ends)及3’-RACE用之引子(primer)合成。

另一方面，使用1μg之從融合瘤所採取的Total RNA，使用SMART-RACE Kit(Clonetech公司製)，施行不引起5’-RACE、3’-RACE用cDNA之合成的5’-RACE及3’-RACE。PCR反應係使用Advantage 2 Polymerase Mix(Clonetech公司製)，依據添附之實驗指南(protocol)進行。將藉由5’-RACE、3’-RACE所得到的PCR產物進行瓊脂膠體電泳，由瓊脂膠體切出主要放大DNA片段，插入TA選殖載體(Invitrogen公司製)，形質轉換為大腸菌而分別得到數殖株。由此等之形質轉換體依據常法來調製質體，而決定出插入DNA片段之鹼基序列。

(3)H鏈、L鏈全長cDNA之取得及該cDNA之鹼基序列決定

以鹼基序列資訊為基礎，決定編碼H鏈及L鏈的N末端、及C末端的cDNA序列，設計出用以將全長之序列擴大的Forward及Reverse Primer。使用此Primer，藉由Prime STAR MaxPCR(TaKaRa公司製)而將H鏈、L鏈之全長擴大，將其之PCR片段於pEF4載體進行選殖。使用其，決定最終全長之cDNA的序列。

根據所得到的鹼基序列資訊，翻譯成胺基酸序列，進而使用IgBLAST(NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，以KABAT之方法(Kabat,E.A.and Wu,T.T.、J.Immunol.,147,1709-1719、1991年)進行CDR區域之鑑定。

將所得到的CDR區域之序列顯示於序列編號14~。

根據此等序列之相同性，而得到與用以特異性識別pSer413的抗體之CDR序列相關的資訊(表4~表6)。

[實施例8]行動試驗取得抗體對記憶學習障礙小鼠所造成的影響

調查以下2種抗體的投予於投予0.1mg時對記憶學習障礙小鼠所造成的影響。

(4)Ta1505(pSer413辨別單株抗體)：使用10個月大之Tau Tg(line784)小鼠或non-Tg小鼠、n=9-10/群

(5)Ta9(pSer396辨別單株抗體)：使用11個月大之Tau Tg(line784)小鼠或non-Tg小鼠、n=8-10/群

實驗中係使用10-11個月大之公的異型組合Tau-Tg小鼠(line 784)、及其non-Tg同窩出生者(littermates)。群組間以平均體重無差異的方式進行群組區分。對於異型組合Tau-Tg小鼠，每1週1次，共計5次，每隻每次進行腹腔投予0.1mg之經PBS稀釋的抗體。陰性對照群方面，係將調製抗體時所使用的PBS或對Tau不具有反應性的小鼠IgG單株抗體，以同用量進行腹腔投予。陽性對照方面，對於non-Tg同窩出生者(littermates)，將調製抗體時所使用的PBS，以同用量進行腹腔投予。

以下顯示(4)~(5)之群構成。

(4)<使用小鼠>：變異Tau-Tg(line 784)，10mo

<群構成>

評估抗體群：Anti-tau pSer413小鼠單株抗體Ta1505 in PBS 0.25mg/ml(n=10)

Control抗體群：Anti-Pseudomonas Aeruginosa小鼠單株抗體4C10F4 in PBS 0.25mg/ml(n=10)non-Tg群：PBS(n=9)

(5)<使用小鼠>：變異Tau-Tg(line 784)，11mo

<群構成>

評估抗體群：Anti-tau pSer396小鼠單株抗體Ta9 in PBS(n=10)0.25mg/ml

Control抗體群：Anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibody 6F11 in PBS(n=8)0.25mg/ml non-Tg群：PBS(n=8)

從最終投予的隔週星期一起使用Morris水迷宮進行空間參考記憶(spatial reference memory)試驗(水迷宮試驗)。水迷宮試驗係與實施例5相同地進行。

<結果> 1.各抗體之投予對於記憶障礙的影響

(4)pSer413小鼠單株抗體(1505抗體)

將Trial試驗(4-1)、Probe試驗(4-2)之結果顯示於第18圖及第19圖。若綜合而言，則藉由抗pSer413單株抗體的受動免疫，在模式小鼠之記憶障礙較non-Tg改善50%以上之水準。

依據(4-1)及(4-2)之結果，可確認出投予0.1mg之pSer413抗原決定位置單株抗體的藥效。

(5)pSer396小鼠單株抗體(Ta9抗體)

將Trial試驗(5-1)、Probe試驗(5-2)之結果顯示於第20圖及第21圖。若綜合而言，則於Ta9投予中係於投予0.1mg時記憶障礙並未得到改善。

基於此等試驗，進一步明確教示：因磷酸化抗原決定位置的差異所到致之藥效的差異為0.1mg投予。

另外，每1隻小鼠投予0.1mg之抗體，係相當於約2.5mg/kg之用量的投予。

[實施例9]以Ta1505抗體投予所致之腦內磷酸化Tau量的變化

將Ta1505抗體投予對於Tau-Tg小鼠之腦內的磷酸化Tau量所造成之影響，關於作為記憶的中樞之海馬區域，藉由pSer413辨別Ta1505抗體及AT8抗體(PHF識別pSer202/pThr205抗原決定位置)之免疫組織染色進行調查。

行動試驗結束後，從各群當中各選擇5隻，以4%三聚甲醛/PBS回流固定。將腦部取出進行石蠟包埋，以切片機製成5μm薄切切片。以二甲苯及乙醇各進行10分鐘、4次處理，而進行脫蠟處理，將切片以pH2並在室溫進行10分鐘煮沸處理(抗原賦活化處理)。返回室溫後，以Tris-緩衝生理食鹽水(TS)進行10分鐘、2次洗淨。以含20%牛血清之TS，在室溫進行阻斷60分鐘。

將經含10%牛血清之TS稀釋為1ug/mL的抗Tau抗體(Ta1505、AT8)進行安裝，以4℃進行處理一夜。以TS進行10分鐘、2次洗淨之後，將經含10%牛血清之TS 500倍稀釋的生物素標識抗小鼠抗體(VECTOR公司)進行安裝，以室溫進行處理60分鐘。

以TS進行10分鐘、2次洗淨之後，將HRP標識ABC液(VECTOR公司)進行安裝，在室溫反應30分鐘，再次洗淨之後，以二胺基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)使其發色。以Entellan(Merck)進行密封、觀察、並拍攝。

將以Ta1505所致之免疫組織染色結果顯示於第22圖~第24圖。

於第22圖中，雖於對照IgG投予群5個體的海馬CA3區域(從左起第1列)及海馬CA23區域(從左起第2列)中Ta1505陽性Tau之染色被確認，但Ta1505投予群5個體的海馬CA3區域(從左起第3列)及海馬CA23區域(從左起第4列)之染色水準，係確認出明顯低於對照IgG投予群。基於此可確認出：藉由Ta1505投予，於海馬CA3區域及海馬CA23區域中，Ta1505陽性Tau，也就是說Ser413磷酸化Tau之減少。進一步詳細而言，ControlIgG群係聚集茶色的細點，於CA3中從左朝右呈粗線狀染色。於CA23中從右上往左橫向呈粗曲線狀染色。Ta1505投予群，係聚集非常淡的茶色細點，於CA3中從左上朝右下呈粗線狀染色。於CA23中從右上往左橫向呈粗曲線狀染色。於CA3之4個體與CA23之3個體中，染色幾乎無法確認。

於第23及24圖中，係於對照IgG投予群5個體之皮質(Cortex)區域(Perirhinal Cortex(第23圖從左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(第23圖從左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(第23圖從左起第3列))中確認出AT8陽性Tau之染色。(於第23圖中呈茶色斑點般染色)

於Ta1505投予群5個體之皮質(Cortex)區域(Perirhinal Cortex(第24圖從左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(第24圖從左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(第24圖從左起第3列))中之染色水準，係明顯低於對照IgG投予群，確認出染色為無法確認的水準。

基於此可確認出：藉由Ta1505投予，皮質(Cortex)區域(Perirhinal Cortex、Lateral Entrhinal Cortex、Medial Entrhinal Cortex)中，Ta1505陽性Tau，也就是說Ser413磷酸化Tau之減少。

於第23圖中，雖呈茶色之斑點狀染色，但於第24圖中幾乎無法確認茶色之斑點狀的染色。

確認出：於腦內(=海馬CA3區域、海馬CA23區域、PRh、Ent(Lateral、Medial))中，藉由Ta1505抗體投予，Ser413磷酸化Tau量之減少。

PRh=Perirhinal Cortex

Ent=Entrhinal Cortex

將以AT8所致之免疫組織染色結果顯示於第25圖~第27圖。

於第25圖中，雖於對照IgG投予群5個體的海馬CA3區域(從左起第1列)及海馬CA23區域(從左起第2列)中AT8陽性Tau之染色被確認，但Ta1505投予群5個體的海馬CA3區域(從左起第3列)及海馬CA23區域(從左起第4列)之染色水準，係確認出明顯低於對照IgG投予群。基於此可確認出：藉由Ta1505投予，於海馬CA3區域及海馬CA23區域中，AT8陽性Tau，也就是說Ser202/Thr205磷酸化Tau之減少。具體而言，於第25圖中，ControlIgG群係聚集茶色的細點，於CA3中從左上朝右下呈粗線狀染色。於CA23中從右上往左橫向呈粗曲線狀染色。Ta1505投予群，係聚集非常淡的茶色細點，於CA3中從左上朝右下呈粗線狀染色。於CA23中從右上往左橫向呈粗曲線狀染色。

於第26圖中，係於對照IgG投予群5個體之皮質 (Cortex)區域(Perirhinal Cortex(第26圖從左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(第26圖從左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(第26圖從左起第3列))中確認出AT8陽性Tau之染色。(於第26圖中呈茶色斑點般染色)

於第27圖中，於Ta1505投予群5個體之皮質(Cortex)區域(Perirhinal Cortex(第27圖從左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(第27圖從左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(第27圖從左起第3列))中之染色水準，係確認出明顯低於對照IgG投予群。(於第27圖中呈淡茶色斑點般染色)

基於此可確認出：藉由Ta1505投予，皮質(Cortex)區域(Perirhinal Cortex、Lateral Entrhinal Cortex、Medial Entrhinal Cortex)中，AT8陽性Tau，也就是說Ser202/Thr205磷酸化Tau之減少。確認出：於腦內(=海馬CA3區域、海馬CA23區域、PRh、Ent(Lateral、Medial))中，藉由Ta1505抗體投予，AT8辨識之Ser202/Thr205磷酸化Tau量之減少傾向。

結果，顯示藉由抗體之投予而改善在腦內之病態者，證實上述之記憶障礙的改善效果。此外，其結果係顯示投予至腹腔內的抗體會在腦內發揮作用。

[實施例10]以Ta1505抗體投予所致之腦內Tau量的影響

使用被認為是辨別構成PHF的過磷酸化Tau之AT8 抗體(pSer202/pThr205辨別小鼠單株抗體，INNAX公司製)、G2(抗人類特異性N末端區域辨別抗體：兔多株抗體)、PHF1(被認為是辨別構成PHF的過磷酸化Tau之pSer396/pSer404辨別小鼠多株抗體)及Ta1505，使用抗體投予1505抗體投予對於腦均質物中之Tau及過磷酸化Tau量所造成的影響後之Tau-Tg小鼠腦均質物，而藉由西方墨點法進行調查。

將小鼠大腦半球100-200mg以5倍量的TBS(含有蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)、磷酸抑制劑混合物酶)進行超音波處理(sonication)。將此以100,000g，以4℃進行離心分離15分鐘，回收上清液作為TBS可溶性劃分。

進而，將沉澱懸浮於1%sarkosyl/TBS(含有蛋白酶抑制劑混合物、磷酸抑制劑混合物酶)，在室溫下進行培養1小時。將此以100,000g，在室溫下進行離心分離15分鐘，回收上清液作為十二烷基肌氨酸鈉可溶性劃分。

將此TBS可溶性劃分、十二烷基肌氨酸鈉可溶性劃分藉由7%Tris-Acetate Gel進行電泳而分離，並於PVDF膜進行轉印，以1%BSA/3%SkimMilk/0.05%Tween20/TBS在室溫下整夜進行阻斷。然後，使抗體溶液反應，使用HRP接合物抗體作2次抗體，以ECL法進行反應，以LAS3000影像分析儀進行解析而定量化。

將結果顯示於第28圖及第29圖。

於TBS可溶性劃分中，係確認出：藉由Ta1505抗體投予，Tau-Tg小鼠腦內之人類Tau(以G2抗體辨別)及過磷酸Tau(以AT8(pS202/pT205抗原決定位置)、PHF1(pS396/pS404抗原決定位置)辨別)、pS413 Tau(Ta1505辨別)為顯著減少。

於十二烷基肌氨酸鈉可溶性劃分中，係確認出：藉由Ta1505抗體投予，Tau-Tg小鼠腦內之過磷酸Tau(以AT8辨別)為顯著減少。

[製造例1]表現作為認知功能障礙模式之人類正常型Tau的Tg小鼠(Tau-Tg小鼠)

本發明之以抗體所致之認知功能改善的藥理效果之探討，係使用Tg小鼠，其係顯示與人類之正常型Tau，特別是於胎生期時係僅表現3R型之Tau，且伴隨著成長表現3R型與4R型兩者之Tau的人類之個體發生相同的表現圖型，且具有在出生後6個月大左右認知功能障礙發病的特徵。該Tg小鼠係以下述的方法製作。

用以製作Tg小鼠的基因之結構係使用具有構成為：於α攜鈣蛋白激酶II α(CaMKII)啟動子(8.5kb)的下游，以Simian virus 40(SV40)之5’內含子、(0.3kb)、Tau基因(Tau；7.3kb)、SV40之3’內含子(0.8kb)、SV40 polyA信號(0.3kb)的順序所排列的形態之如第17圖所示的結構之Tau基因供予核酸。其內所使用的Tau基因，係與Yamashita T.等(FEBS Letter,Vol.579,P241-244,2005年)所記載的方法相同地取得者，且為依序包含：相當於來自編碼人類Tau的cDNA之外顯子1至9的部分之鹼基序列、內含子9之最初的18鹼基與最後之3kb的部分之鹼基序列、外顯子10之鹼基序列、內含子10之最初的3kb與最後的38鹼基之部分(但，將從內含子10之5’端方向起第16號的鹼基胞嘧啶取代為胸腺嘧啶)、相當於外顯子11至13的cDNA之鹼基序列的長度7.3kb之基因。將此Tau基因於作為具有SV40之5’內含子、3’內含子及poly(A)信號序列的胜肽之pNN265(Choi T等、Mol.Cell.Biol.vol.11、pp3070-3074、1991年)的限制酵素EcoRV側，進行選殖。從所得到的質體以限制酵素XhoI與NotI切出包含SV40之5’內含子、Tau基因、SV40之3’內含子與poly(A)信號序列的DNA片段，將該DNA片段於具有CaMKII啟動子的pMM403載體(Mayford M等、Cell vol.81 pp891-904 1995年)進行選殖。接著，從所得到的質體以限制酵素SfiI切出含有Tau基因之如第17圖所示的結構之基因片段(17.2kb)，以瓊脂膠體電泳進行分離，從相對應的膠體之部位使用QIAGEN(R)QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704)進行純化。所得到的基因(DNA)片段係依據周知的方法[Hogan,B等、“Manipulating the mouse embryo.A LaboratoryManual” Cold Spring Harbor Laboratory(1986)]，注射於使C57BL/6系小鼠的雌雄進行交配所得到的前核期胚。注入進行了注射的假懷孕之母C57BL小鼠的卵管。針對所生出的幼鼠切斷一部分尾巴，確認是否編入有藉由PCR法所導入的基因，藉由使編入有所導入之基因的雄或雌小鼠與正常的雌或雄交配，藉此而作為以異型具有所導入的Tau基因之Tg小鼠而被維持，以供實驗使用。另外，實施例中所記載之line 609及line 784所記載的Tau-Tg小鼠係以相同的方法製作，且為顯示同等之形質的小鼠(或者於實施例中line之記載係消除)。

<110> 大阪市立大學&帝人製藥股份有限公司

<120> 失智症治療劑

<130> AB606

<150> JP2012-124336

<151> 2012-05-31

<160> 48

<170> PatentIn version 3.1

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<212> PRT

<213> 智人

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<221> MOD_RES

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<223> 磷酸化

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<221> MOD_RES

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<221> MOD_RES

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<223> 磷酸化

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<223> 合成胜肽

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<223> 合成胜肽

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<223> 磷酸化

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<223> 合成胜肽

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<221> MOD_RES

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<223> 磷酸化

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Claims

一種失智症治療劑或預防劑，其係含有與存在於序列編號1所示的Tau蛋白質之410位至421位中的至少一個胺基酸殘基受到磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應之抗體作為有效成分。
如申請專利範圍第1項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與受到於失智症中特徵性的磷酸化之Tau蛋白質產生抗原抗體反應的抗體。
如申請專利範圍第1項或第2項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與由Ser412、Ser413、Thr414、及Ser416中所選出的1個以上之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應。
如申請專利範圍第1項~第3項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係於對於Tau蛋白質之結合中，與含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體進行結合競爭之抗體。
如申請專利範圍第1項~第3項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體。
如申請專利範圍第1項~第4項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係與Ser413之部位經磷酸化的Tau蛋白質產生抗原抗體反應之抗體。
如申請專利範圍第1項~第6項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係具有：序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列、序列編號7至13至少1者所表示的H鏈之CDR序列、或與序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的H鏈之CDR序列；及/或序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列、序列編號14至17至少1者所表示的L鏈之CDR序列、或與序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的L鏈之CDR序列的抗體。
如申請專利範圍第1項~第7項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係具有：序列編號18至24中任一者所表示的H鏈可變區域、或與序列編號18至24中任一者具有85%以上的相同性之序列的H鏈可變區域；及/或序列編號25至30中任一者所表示的L鏈可變區域、或與序列編號25至30中任一者具有85%以上的相同性之序列的L鏈可變區域之抗體。
如申請專利範圍第1項~第8項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中該抗體係擬人化抗體或嵌合抗體。
一種失智症治療劑或預防劑，其係含有下述胜肽作為有效成分：由序列編號1之胺基酸編號410~421所構成的胺基酸序列當中，至少含有連續之8個胺基酸序列的胜肽，且該胜肽中所含有之至少1個胺基酸殘基經磷酸化的胜肽。
如申請專利範圍第10項之失智症治療劑或預防劑，其中該胜肽中所含有之經磷酸化的至少一個胺基酸殘基係相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、或Ser416之胺基酸殘基的胜肽。
如申請專利範圍第10項或第11項之失智症治療劑或預防劑，其中該胜肽中所含有之經磷酸化的胺基酸殘基係至少相當於序列編號1之Ser413之胺基酸殘基。
如申請專利範圍第1項~第12項中任一項之失智症治療劑或預防劑，其中失智症係Tau蛋白疾病(tauopathy)。
如申請專利範圍第13項之失智症治療劑或預防劑，其中Tau蛋白疾病係阿茲海默症、皮質基底核退化症、進行性核上性麻痺、匹克氏症、嗜銀顆粒性失智症(嗜銀性顆粒病)、Multiple system tauopathy with dementia(MSTD)、伴隨與17號染色體連鎖的帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)、神經原纖維變化型失智症、伴隨石灰沉積之瀰漫性神經原纖維變化症(DNTC)、伴隨球狀神經膠包涵體之蛋白質Tau蛋白疾病(WMT-GGI)、或伴隨Tau陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-tau)。
一種單株抗體，其係與由序列編號1之胺基酸編號410~421所構成的胺基酸序列當中，至少具有連續之8個胺基酸序列的胜肽，且相當於該胜肽中所含有之序列編號1之Ser413的胺基酸殘基經磷酸化的胜肽產生抗原抗體反應。
一種抗體，其係對於經磷酸化的Tau蛋白質之抗體，且該抗體係在與含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL的抗體之間對於抗原之結合為競爭性。
一種抗體，其係對於經磷酸化的Tau蛋白質之抗體，且該抗體係含有由序列編號20中記載的胺基酸所構成之VH及由序列編號26中記載的胺基酸序列所構成之VL。
一種單株抗體，其係具有：序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列、序列編號7至13至少1者所表示的H鏈之CDR序列、或於CDR序列中具有與序列編號7至13所表示的H鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的序列之H鏈；及/或序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列、序列編號14至17至少1者所表示的L鏈之CDR序列、或於CDR序列中具有與序列編號14至17所表示的L鏈之CDR序列中至少1者具有85%以上之相同性的序列之L鏈。
一種單株抗體，其係具有：序列編號18至24中任一者所表示的H鏈可變區域、或與序列編號18至24中任一者具有85%以上之相同性的H鏈可變區域；及/或序列編號25至30中任一者所表示的L鏈可變區域、或與序列編號25至30中任一者具有85%以上之相同性的L鏈可變區域。
如申請專利範圍第15項~第19項中任一項之單株抗體，其中抗體係擬人化抗體或嵌合抗體。
一種胜肽，其係由序列編號1之胺基酸編號410~421所構成的胺基酸序列當中，至少由連續之8個胺基酸序列所構成之胜肽，且該胜肽中所含有之至少1個胺基酸殘基係經磷酸化。
如申請專利範圍第21項之胜肽，其中相當於序列編號1之Ser412、Ser413、Thr414、或Ser416之至少一個胺基酸殘基係經磷酸化。
如申請專利範圍第21項或第22項之胜肽，其中經磷酸化的胺基酸殘基係相當於序列編號1之Ser413之胺基酸殘基。