KR102208283B1 - 인지증 치료제 또는 예방제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 인지증 치료제 또는 예방제를 제공하는 것이다.
본 발명은 배열 번호 1 의 Ser413 주변이 인산화된 타우 단백질에 대해 특이적으로 항원 항체 반응을 하는 항체나, Ser413 주변이 인산화된 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제 등을 제공한다.

Description

인지증 치료제 또는 예방제 {THERAPEUTIC AGENT OR PROPHYLACTIC AGENT FOR DEMENTIA}

본 발명은 인지증 치료제 또는 예방제에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 우수한 인지 기능을 개선하는 효과를 갖는 신규 항인산화 단백질 또는 펩티드 항체, 및 항인산화 타우 항체 또는 항인산화 타우 항체를 유도할 수 있는 항원을 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제에 관한 것이다.

인지증이란, 일단 발달한 지능이 어떤 후천적 이유에 의해 저하되어, 사회적인 적응 곤란을 나타내는 상태를 말한다. 인지증성 질환은 신경 변성 질환, 혈관성 인지증, 프리온병, 감염성 질환, 대사·내분비 질환, 외상 및 뇌외과 질환, 중독성 질환 등으로 분류된다 (비특허문헌 1). 일본에 있어서는 2010년 현재 약 210 만명 정도의 인지증 환자가 존재하고, 65 세 이상의 고령자에 있어서의 유병률은 8 ∼ 10 ％ 정도라고도 10 ％ 이상이라고도 알려져, 세계적인 고령화의 흐름 중에서 큰 문제로 인식되고 있다 (비특허문헌 2). 인지증에 있어서의 기초 질환을 보면, 약 35 ％ 가 알츠하이머병 (AD), 약 15 ％ 가 AD 와 뇌혈관성의 혼합형, 5 ％ 가 전두엽 측두엽 변성증 (FTLD) 과 변성 질환인 AD 나 FTLD 등의 신경 변성 질환이 많은 비율을 차지하고 있다 (비특허문헌 2). 신경 변성 질환에 의한 인지증은 적어도 6 개월 이상의 기간을 걸쳐 진행되는 기억 장애 및/또는 인격 변화의 잠행성의 발증에 의해 특징지어지는 질환이다. 인지 기능 장애의 정도에 높은 상관성이 있는 신경 변성 과정에 있어서의 일관된 특장은 신경원섬유 변화 (NFT) 이다 (비특허문헌 3).

타우 (단백질) 란, 인간에서는 제 17 번 염색체 (17q21) 에 존재하는 MAPT 유전자에 의해 코드되는 단백질로, 중추계에서 많이 발현하고 있는 미소관 결합 단백질의 하나이다. 타우는 신경 변성 질환의 대표인 AD 에 있어서의 NFT 를 구성하는 paired helical filament 와 straight filament 의 주요 구성 단백질인 것이 발견되었고, 또한 각종 신경 질환에 있어서 세포 내에 축적하는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 타우의 세포 내 축적이 발생하는 질환은 타우오패시라고 총칭된다 (비특허문헌 4). 타우오패시에 포함되는 신경 변성 질환으로는, 알츠하이머병 (AD), 피질 기저핵 변성증 (CBD 또는 CBS), 진행성 핵상성 마비, 피크병, 기은 (嗜銀) 과립성 인지증 (기은성 과립병), Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17), 신경원섬유 변화형 인지증, 석회 침착을 수반하는 미만성 신경원섬유 변화병 (DNTC), 구상 글리아 봉입체를 수반하는 백질 타우오패시 (WMT-GGI) 타우 양성 봉입체를 수반하는 전두측두엽 변성증 (FTLD-tau) 등이 있지만, 신경 변성 질환 이외에도 에코노모 뇌염 후유증이나 아급성 경화성 전뇌증 등의 감염증에 의한 것, 권투선수 뇌증 등의 외상에 의한 것도 타우오패시에 포함된다 (비특허문헌 4).

MAPT 유전자의 게놈 상에서의 구조는 13 개의 엑손으로 이루어지고, 선택적 스플라이싱에 의해 복수의 아이소폼으로서의 단백질이 발현된다 (비특허문헌 4). 또, 타우 구조의 특징으로는, 엑손 2 와 엑손 3 의 선택적 스플라이싱에 의거하는 29 아미노산 반복 배열 (N) 이 0 ∼ 2 개 (N0 ∼ N2) 가 되는 N 말단의 산성 도메인, 프롤린을 많이 포함하는 중간 도메인, 및 미소관 결합에 관여하는 반복 배열 (R) 을 3 개 (3R) 또는 4 개 (4R) 를 포함하는 C 말단의 미소관 결합 도메인 (엑손 9 내지 12 에 의해 코드된다) 으로 이루어진다 (비특허문헌 3 및 4). 그 때문에, 타우는, 29 아미노산 반복 배열 (N) 과 미소관 결합에 관여하는 반복 배열 (R) 을 포함하는 수에 의해, 3R0N (352 아미노산)·3R1N (381 아미노산)·3R2N (410 아미노산)·4R0N (383 아미노산)·4R1N (412 아미노산) 및 4R2N (441 아미노산) 의 6 종류가 대표적인 아이소폼으로 되어 있다. 그와 같은 아이소 타입 중, 태생기의 뇌에 있어서는 3R0N 만이 존재하는 데 반해, 성인 인간의 뇌에 있어서는 6 개 모든 아이소 타입이 존재하는데, 4R 형이 많이 존재한다 (비특허문헌 3). 아이소 타입의 3R 형과 4R 형의 차이는 엑손 10 이 선택적 스플라이싱에 의해 제거되는 (3R) 이거나 포함되는 (4R) 에 의해 정해진다. 이와 같이 타우에는 몇 가지 아이소폼이 존재하는데, 그 대응하는 위치의 아미노산 번호를 특정하기 위해서, 가장 긴 아이소폼인 4R2N (배열 번호 1) 에 있어서의 아미노산의 번호 (1 ∼ 441) 로 나타낸다. 예를 들어, Ser413 이라고 기재한 경우에는, 4R2N (배열 번호 1) 에서는 413 번째의 아미노산 잔기인 세린을 나타내지만, 4R1N (배열 번호 2) 에서는 384 번째, 4R0N (배열 번호 3) 에서는 355 번째, 3R2N (배열 번호 4) 에서는 382 번째, 3R1N (배열 번호 5) 에서는 353 번째, 3R0N (배열 번호 6) 에서는 324 번째의 아미노산 잔기인 세린을 나타낸다.

신경 변성 질환에 있어서의 타우의 관여는, 최초 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17) 에 있어서, MAPT 유전자의 변이와 타우 축적의 관계로부터 해명된 경위가 있으며, FTDP-17 에서는 MAPT 유전자에 있어서의 40 종류 이상의 유전자 변이가 보고되어 있다 (비특허문헌 4). 이와 같은 유전자 변이는, 타우 아이소폼의 비율 변화나 변이 타우의 미소관으로의 상호 작용의 변화가 일어나, 병태 형성에 관여하고 있을 가능성이 시사되고 있다. 그러나, 가족성의 신경 변성 질환과 달리, AD 등 고발성 (孤發性) 의 신경 변성 질환에서는 MAPT 의 변이가 보이지 않는 경우가 많다. 또, 신경 변성 질환에서 축적되는 타우의 특징으로는 고도로 인산화에 의한 수식을 받고 있다는 특징이 있다. 또, 경도의 인지 기능 장애를 나타내는 환자 (MCI) 에 있어서 골수액 중의 인산화 타우의 양과 하수체 위축 사이에는 상관이 보여져, 인산화 타우는 타우오패시의 환자에서의 신경 변성에 대한 신뢰성이 높은 바이오 마커인 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 5). 그 때문에, 타우의 인산의 과잉 인산화를 억제하기 위해서 인산화에 관계된 효소인 키나아제, 그 중에서도 특히 GSK-3β 에 대한 효소 저해제를 치료에 사용하는 시도가 이루어져, 개발이 실시되고 있다 (비특허문헌 5). 그러나 GSK-3β 등의 키나아제는 병태뿐만 아니라, 정상적인 생리 작용에 있어서도 기능 제어에 관련하는 효소라고 생각되기 때문에, 부작용 등이 염려된다. 사실, GSK-3β 에 의해 타우가 인산화되는 부위 중 몇 개는, 태아나 정상적인 인간의 뇌에서 보이는 타우의 인산화 부위와 일치하기 때문에 (비특허문헌 3), 정상적인 타우의 기능에 영향을 미칠 가능성도 생각할 수 있다.

또, 종래의 생각으로는 세포 외에 존재하는 타우는 변성한 신경 세포의 세포사에 의해 세포 외로 누출되는 것으로 생각되고 있었지만, 최근 연구에 의하면, 타우는 세포 내에서 과잉으로 인산화된 후, 프로세스를 받아 세포 외로 능동적으로 분비되는 것으로 생각되고 있다. 세포 외로 분비된 인산화 타우는 일부의 인산화 부위에서 탈인산화를 받은 다음에, 주변 세포의 무스카린 수용체의 M1 및 M3 에 작용하여, 세포 내의 타우린 산화의 항진이나 세포사의 유도 등의 작용에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7). 이와 같이, 타우가 세포 외에서 작용하는 인자로서 작용하는 것으로 생각되게 되었기 때문에, 세포 내에서 작용시키는 것이 어려운 항체 등의 고분자를 약효 성분으로 하는 치료약의 가능성도 중시되게 되었다. 그러나, 상기 서술한 바와 같이 세포 외로 분비되는 타우는 일부 프로세스를 받거나, 또 탈인산화를 받는 등, 지금까지 표적으로 여겨져 온 과잉으로 인산화된 타우의 구조 정보로부터 더욱 변화를 받고 있을 가능성이 있다. 또한 탈인산화된 타우의 부분에 대해 작용하는 약제는 정상 타우의 기능에도 영향을 미칠 가능성도 생각할 수 있다. 항체 등으로 병태에 있어서의 타우를 표적으로 하는 경우, 어떠한 병태 특이적인 부위, 즉 타우의 인산화 에피토프에 작용하는 것을 선택할지가 중요해지만, 이와 같은 복잡한 정보가 있음으로써, 그와 같은 에피토프를 선택하는 것은 더욱 곤란해져 있는 상황이라고 할 수 있다.

타우에 대한 특이적인 작용을 목표로 한 시도로서, 타우 단백질을 타겟으로 한 타우오패시의 면역학적 치료에 관한 발명이 보고되어 있다 (비특허문헌 5, 특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3). 면역학적 치료란, 펩티드 백신 등을 투여함으로써, 특이적인 항체의 산생을 유도하는 것을 목적으로 실시되는 것으로, 표적 단백질 또는 펩티드에 대한 특이성의 높이로부터 부작용의 저감이 기대된다. 이와 같은 대처로서, 인산화된 타우의 부분 펩티드 (Ser396 및 Ser404 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 것, 그리고 Ser262 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 것) 를 사용한 백신에 의해 변이 타우를 발현하는 동물 모델을 면역함으로써, 당해 모델 동물의 운동 기능 개선 등을 개선한 것을 보고하고 있다. 그러나, 이들 보고에서는 P301L (타우의 301 번째의 아미노산 잔기인 프롤린이 류신으로 변화하는 변이) 등의 유전자 변이를 도입한 트랜스제닉 마우스 (tg 마우스) 를 사용한 검토이며, 당해 tg 마우스는 가족성의 신경 변성 질환의 하나인 FTDP-17 에 대한 유전자 변이 모델이기는 하지만, 타우오패시에 포함되는 타우 유전자 변이를 수반하지 않는 신경 변성 질환의 많은 것, 특히 고발성의 신경 변성 질환의 병태를 나타내고 있는 것은 아니다. 또, P301L tg 마우스는 운동 기능 장애의 모델이며, 인간의 인지증 등에서 문제가 되는 인지 기능의 장애를 나타내는 모델은 아니기 때문에 (비특허문헌 8), 이 동물 모델에서의 결과에 의해 인간의 인지증의 치료에 적응할 수 있을지를 아는 것은 곤란하다. 특허문헌 4 에서는, Ser409 가 인산화된 타우 펩티드에 항원 항체 반응하는 항체를 투여하여, 타우오패시의 치료에 관한 효과를 보고 있다. 그러나, 고가인 펩티드 백신으로는 전체 투여량이 많고, 또 효과가 나타날 때까지의 기간이 길다. 또, 펩티드 백신의 효과는 투여된 인간이나 동물의 면역 응답의 반응성이 유전적 배경에 따라 달라, 모든 개체에서 유효하게 항체 산생을 유도할 수 있다고는 할 수 없다. 그 때문에, 항체에 의한 수동 면역에 의한 면역 요법을 사용하는 것을 생각할 수 있지만, 타우에 있어서의 인산화를 받는 부위는 매우 다수 존재하고, 그 중의 어느 인산화 부위에 대한 항체를 사용하는 것이 유효할지의 정보는 거의 존재하지 않는다. 또, 현재 존재하는 항체에 의한 동물 모델에서의 효과를 봐도, 치료에 사용하기 위해서 충분한 기능을 갖고 있다고는 생각할 수 없다.

또한, 항체를 치료제 또는 예방제의 주제로서 사용하는 경우, 부작용의 회피나 의료 경제적인 문제로부터 치료에 사용되는 항체량에 대해서도 유의가 필요하고, 특히 만성 질환이나 유전 질환 등에서는 투여량에 대해서는 중요한 과제가 된다. 예를 들어, 인간 항 IL-6R 항체인 악템라 (등록상표) (토실리주맙) 의 치료에서의 용량은 체중 1 ㎏ 당 8 ㎎ 으로 1 ∼ 4 주 간격으로 투여되고, 인간화 항보체 C5 항체인 솔리리스 (등록상표) (에쿨리주맙) 의 치료에 용량은 1 회에 성인 1 인당 600 ∼ 900 ㎎ 으로 2 주 내지 4 주마다 투여된다. 이들은 많은 항체 중에서 선택되어 개발된 우수한 항체이지만, 용량으로는 현상황 사용되고 있는 항체 의약품 중에서는 많은 편이다. 따라서, 향후 개발되는 항체 의약품에 있어서도 이들과 동등 이하의 용량에 의한 효과가 필요해진다. 또한, AD 등 인지증에서의 치료 대상이 되는 장기는 뇌가 되지만, 정맥내나 피하에 의한 투여 등 전신 투여를 실시하는 경우에는, 뇌혈관 관문의 존재에 의해 혈중으로부터 뇌로의 항체의 이행율은 낮다고 일컬어지기 때문에, 인지증 치료에 사용되는 항체는 다른 장기의 질환을 대상으로 하는 경우와 비교하여 약리 효과가 기대되기 어렵고, 큰 과제가 존재한다.

인간의 인지증에 있어서는, 중심이 되는 증상은 기억 장애와 인지 기능의 장애이며, 특히 인지 기능은 기억에 기초하여 판단, 커뮤니케이션, 수행 기능을 발휘하기 위해서 중요한 기능이기 때문에, 인지증에 있어서의 증상으로서 중요한 위치를 차지하고 있다. 한편, 운동 기능에 대해서는, 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17) 이나 말기의 알츠하이머병에 있어서 확인되는 증상이기는 하지만, 반드시 인지증에 있어서 나타내는 중심이 되는 증상은 아니다. 따라서, 인지증의 치료를 생각하는 경우에 있어서는, 인지 기능을 개선하는 것이 중심 과제가 된다. 그러나, 현상황에 있어서는 그와 같은 과제를 해결하기 위해서 필요한, 타우오패시에 의한 인지 기능 장애의 적절한 동물 모델을 사용하여 우수한 인지 기능 개선 효과를 나타내는 인지증 치료제 또는 예방제를 취득할 수 있는 방책은 나타나 있지 않고, 또, 인지증에 특이적으로 우수한 효과를 나타내는 인지증 치료제 또는 예방제는 존재하지 않는다.

따라서, 이상과 같은 상황에서, 특히 인지 기능의 개선에 대해 강한 효과를 갖는 치료제 또는 예방제가 요구되고 있다.

미국특허 제8012936호 WO2010/142423 WO2010/144711

키시모토 토시후미, 타카하시 시게키 편, STEP Series 정신과 제 2 판, P 103 ∼ 104, 카이바 쇼보, 2008년 아사다 타카시, 별책 의학의 발자취 「인지증」, p 5 ∼ 10, 의치약 출판, 2011년 Alistair Burns, John O'Brien and David Ames 편, Dementia. 3rd Edition, P 408 ∼ 464, 2005년 아라이 테츠아키, 신경 내과, 72 권 특별 증간호 (Suppl. 6), P 46 ∼ 51, 2010년 Wendy Noble 등, Expert Opin. Drug Discov., 6 권 8 호, P 797 ∼ 810, 2011년 Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry, 285 권, P 32539-32548, 2010년 Venessa Plouffe 등, PLoS ONE, 7 권, P36873, 2012년 Alistair Burns, John O'Brien and David Ames 편, Dementia. 3rd Edition, P 459, 2005년

본 발명의 목적은 타우오패시에서의 타우린 산화에 주목하여 인지증 치료제 또는 예방제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 Ser413 주변에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 타우에 대해 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체나, Ser413 주변의 아미노산 배열을 갖고 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 높은 인지 기능 개선 효과를 갖는 모노클로날 항체를 제공하고, 또한 그 모노클로날 항체의 구조의 해석으로부터 인간화 항체 등의, 또한 인지증 치료에 적합한 항체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이하에 나타내는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서의 타우 단백질은, 4R2N 뿐만 아니라, 전체 6 종류의 아이소폼를 포함하는 의미이다. 또, 본 발명에 있어서의 아미노산 잔기의 위치는 편의상, 배열 번호 1 에 나타내는 것을 기초로 특정하고 있지만, 예를 들어, 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기라고 표현한 경우에는, 배열 번호 1 (4R2N) 의 413 번째의 세린, 배열 번호 2 (4R1N) 의 384 번째, 배열 번호 3 (4R0N) 의 355 번째, 배열 번호 4 (3R2N) 의 382 번째, 배열 번호 5 (3R1N) 의 353 번째, 또는 배열 번호 6 (3R0N) 의 324 번째의 아미노산 잔기인 세린을 의미한다.

(1) 배열 번호 1 로 나타내는 타우 단백질의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질과 항원 항체 반응하는 항체를 유효 성분으로서 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제.

(2) 그 항체가 인지증에 특징적인 인산화를 받은 타우 단백질에 항원 항체 반응하는 항체인 (1) 에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(3) 그 항체가 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질에 항원 항체 반응하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(4) 그 항체가, 타우 단백질에 대한 결합에 있어서, 배열 번호 20 에 기재된 아미노산으로 이루어지는 VH 및 배열 번호 26 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 VL 을 포함하는 항체와 결합 경합하는 항체인 (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(5) 그 항체가 배열 번호 20 에 기재된 아미노산으로 이루어지는 VH 및 배열 번호 26 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 VL 을 포함하는 항체인 (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(6) 그 항체가 Ser413 의 부위에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 타우 단백질에 항원 항체 반응하는 항체인 (1) ∼ (4) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(7) 그 항체가 배열 번호 7 내지 13 으로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열, 배열 번호 7 내지 13 중 적어도 1 개로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열, 또는 배열 번호 7 내지 13 으로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열 중 적어도 1 개와 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 H 사슬의 CDR 배열, 및/혹은, 배열 번호 14 내지 17 로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열, 배열 번호 14 내지 17 중 적어도 1 개로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열, 또는 배열 번호 14 내지 17 로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열 중 적어도 1 개와 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 L 사슬의 CDR 배열을 갖는 항체인 (1) ∼ (6) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(8) 그 항체가 배열 번호 18 내지 24 중 어느 것으로 나타내는 H 사슬 가변 영역, 혹은 배열 번호 18 내지 24 중 어느 것과 85 ％ 이상의 상동성의 배열을 갖는 H 사슬 가변 영역, 및/또는 배열 번호 25 내지 30 중 어느 것으로 나타내는 L 사슬 가변 영역, 혹은 배열 번호 25 내지 30 중 어느 것과 85 ％ 이상의 상동성의 배열을 갖는 L 사슬 가변 영역을 갖는 항체인 (1) ∼ (7) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(9) 그 항체가 인간화 항체 또는 키메라 항체인 (1) ∼ (8) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(10) 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중, 적어도 연속하는 8 개의 아미노산 배열을 포함하는 펩티드이며, 당해 펩티드에 포함되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제.

(11) 그 펩티드에 포함되는 인산화된 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 또는 Ser416 의 아미노산 잔기에 상당하는 펩티드인 (10) 에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(12) 그 펩티드에 포함되는 인산화된 아미노산 잔기가 적어도 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기인 (10) 또는 (11) 에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(13) 인지증이 타우오패시인 (1) 내지 (12) 중 어느 한 항에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(14) 타우오패시가 알츠하이머병, 피질 기저핵 변성증, 진행성 핵상성 마비, 피크병, 기은 과립성 인지증 (기은성 과립병), Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17), 신경원섬유 변화형 인지증, 석회 침착을 수반하는 미만성 신경원섬유 변화병 (DNTC), 구상 글리아 봉입체를 수반하는 단백질 타우오패시 (WMT-GGI), 또는 타우 양성 봉입체를 수반하는 전두측두엽 변성증 (FTLD-tau) 인 (13) 에 기재된 인지증 치료제 또는 예방제.

(15) 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 로 이루어지는 아미노산 배열 중, 적어도 연속하는 8 개의 아미노산 배열을 갖는 펩티드이며, 당해 펩티드에 포함되는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드에, 항원 항체 반응하는 모노클로날 항체.

(16) 인산화된 타우 단백질에 대한 항체로서, 당해 항체가 배열 번호 20 에 기재된 아미노산으로 이루어지는 VH 및 배열 번호 26 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 VL 을 포함하는 항체와의 사이에서 항원으로의 결합이 경합적인 항체.

(17) 인산화된 타우 단백질에 대한 항체로서, 당해 항체가 배열 번호 20 에 기재된 아미노산으로 이루어지는 VH 및 배열 번호 26 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 VL 을 포함하는 항체.

(18) 배열 번호 7 내지 13 으로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열, 배열 번호 7 내지 13 중 적어도 1 개로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열, 또는 배열 번호 7 내지 13 으로 나타내는 H 사슬의 CDR 배열 중 적어도 1 개와 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 배열을 CDR 배열에 갖는 H 사슬, 및/혹은, 배열 번호 14 내지 17 로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열, 배열 번호 14 내지 17 중 적어도 1 개로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열, 또는 배열 번호 14 내지 17 로 나타내는 L 사슬의 CDR 배열 중 적어도 1 개와 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 배열을 CDR 배열에 갖는 L 사슬을 갖는 모노클로날 항체.

(19) 배열 번호 18 내지 24 중 어느 것으로 나타내는 H 사슬 가변 영역, 혹은 배열 번호 18 내지 24 중 어느 것과 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 H 사슬 가변 영역, 및/또는 배열 번호 25 내지 30 중 어느 것으로 나타내는 L 사슬 가변 영역, 혹은 배열 번호 25 내지 30 중 어느 것과 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 L 사슬 가변 영역을 갖는 모노클로날 항체.

(20) 항체가 인간화 항체 또는 키메라 항체인 (15) 내지 (19) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체.

(21) 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중, 적어도 연속하는 8 개의 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드이며, 당해 펩티드에 포함되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드.

(22) 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 의 아미노산에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화된 것을 특징으로 하는 (21) 에 기재된 펩티드.

(23) 인산화된 아미노산 잔기가 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기인 (21) 또는 (22) 에 기재된 펩티드.

본 발명은 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기 주변이 인산화된 타우에 대해 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체나, 배열 번호 1 의 Ser413 주변의 아미노산 배열을 갖고 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드를 유효 성분으로서 함유함으로써, 인지증 치료제 또는 예방제를 제공할 수 있다.

또, 본 발명은 높은 인지 기능 개선 효과를 갖는 모노클로날 항체를 제공하고, 또한 그 모노클로날 항체의 구조의 해석으로부터 인간화 항체 등의 또한 인지증 치료에 적합한 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

도 1 은 인간 타우 단백질의 아이소폼의 전반 (前半) 의 아미노산 배열을 ClustalW 로 늘어놓은 것을 나타내는 도면이다.
도 2 는 인간 타우 단백질의 아이소폼의 후반 (後半) 의 아미노산 배열을 ClustalW 로 늘어놓은 것을 나타내는 도면이다.
도 3 은 pSer413 펩티드에 대한 토끼 폴리클로날 항체의 특이성을 나타내는 도면이다.
도 4 는 pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Trial 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Probe 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 꺾은선 그래프이다.
도 7 은 pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8 은 pSer413 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Trial 시험의 결과를 나타내는 도면이다 (Ta1505).
도 9 는 pSer413 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Probe 시험의 결과를 나타내는 도면이다 (Ta1505).
도 10 은 pSer413 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 꺾은선 그래프이다 (Ta1505).
도 11 은 pSer413 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 막대 그래프이다 (Ta1505).
도 12 는 pSer396 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Trial 시험의 결과를 나타내는 도면이다 (Ta9).
도 13 은 pSer396 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Probe 시험의 결과를 나타내는 도면이다 (Ta9).
도 14 는 pSer396 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 꺾은선 그래프이다 (Ta9).
도 15 는 pSer396 인식 마우스 모노클로날 항체를 투여한 모델 마우스의 Open Field 시험의 결과를 나타내는 막대 그래프이다 (Ta9).
도 16 은 Ta1505 항체를 투여한 모델 마우스의 해마 시냅토파이신 양을 나타내는 도면이다.
도 17 은 타우 유전자가 포함되는 유전자 단편을 나타내는 도면이다.
도 18 은 Ta1505 항체를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의 수미로 Trial 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19 는 Ta1505 항체를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의 수미로 Probe 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20 은 Ta9 항체를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의 수미로 Trial 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21 은 Ta9 항체를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의 수미로 Probe 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22 는 컨트롤 IgG (1 ㎎/마리) 또는 Ta1505 항체 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의, Ta1505 항체에 의한 해마 CA3 영역 및 CA23 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 23 은 컨트롤 IgG (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, Ta1505 항체에 의한 해마방회 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 24 는 Ta1505 항체 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, Ta1505 항체에 의한 해마방회 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 25 는 컨트롤 IgG (1 ㎎/마리) 또는 Ta1505 항체 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 의, AT8 에 의한 해마 CA3 영역 및 CA23 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 26 은 컨트롤 항체 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, AT8 에 의한 해마방회 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 27 은 Ta1505 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, AT8 에 의한 해마방회 영역의 면역 조직 염색을 나타내는 사진이다.
도 28 은 Ta1505 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, TBS 가용성 뇌 분획 중의 G2, AT8, PHF1 및 Ta1505 의 반응성 Tau 량을 나타내는 그래프이다.
도 29 는 Ta1505 (1 ㎎/마리) 를 투여한 기억 학습 손상 마우스 (Tau-Tg) 의, 사르코실 가용성 뇌 분획 중의 G2, AT8, PHF1 및 Ta1505 의 반응성 Tau 량을 나타내는 그래프이다.

본 발명자들은, AD 에서 특이적으로 인산화되는 부위인 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 타우에 특이적으로 항원 항체 반응을 하는 항체를 제조하고, 성숙에 수반하여 인지 기능 장애를 발병하는 tg 마우스에 투여한 결과, 대상군과 거의 동일한 정도까지 인지 기능을 회복할 수 있는 것을 알아내었다. 한편, 동등한 항원에 대해 본 발명의 항체보다 강한 친화성을 갖는 배열 번호 1 의 Ser396 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 타우에 대한 항체를 동일한 농도로 사용하여 비교한 결과, 충분한 인지 기능의 개선이 보이지 않았다. 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 주변 부분은 타우의 구조와 기능의 관계에 있어서는 특별히 정보가 없는 영역이며, 이 부분에 대해 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체가 이와 같은 강한 인지 기능의 개선 효과를 갖는 것은 전혀 예상 밖의 결과였다. 따라서, 지금까지 주목을 받고 있지 않았던, 이 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 주변 부위는 타우오패시에 있어서 인지 기능 장애의 발증에 중요한 부위인 것이 본 발명에 의해 처음으로 해명되어, 본 발명에 이르렀다.

[항인산화 타우 항체]

본 발명에 있어서의 타우 (단백질) 란, 배열 번호 1 ∼ 6 에 나타낸 인간 타우 단백질에 더하여, 그들의 유전자 변이체를 포함한다. 상기 배경 기술에서 나타낸 바와 같이, 인지증에 관련하는 가족성 신경 변성 질환인 FTDP-17 에서는, 40 개 지점 이상의 변이가 알려져 있지만, 변이 부위에 있어서는 그것에 한정되는 것은 아니다. 또, 변이의 수는 배열 번호 1 ∼ 6 에 대해 1 내지 50 개 지점, 바람직하게는 1 내지 30 개 지점, 보다 바람직하게는 1 내지 10 개 지점의 아미노산의 변이가 있는 것도 본 발명에서의 타우로서 취급된다. 또한, 배열 번호 1 에 나타낸 인간의 타우 단백질에 대해 BLAST 법 (NCBI 의 PBLAST 의 디폴트 조건) 으로 80 ％ 이상의 상동성 (Identities) 을 나타내는 단백질 및 그 아이소폼도 포함된다. 그와 같은 것에는, 침팬지, 붉은털 원숭이, 말, 돼지, 개, 마우스, 토끼, 래트 등 인간 이외의 종에 있어서의 타우가 포함되며, 그와 같은 동물의 인지 기능 개선의 목적으로 그와 같은 타우를 표적으로 한 치료제 또는 예방제의 제조도 가능하다.

또, 본 발명에 있어서의 아미노산 번호, 즉 아미노산 잔기의 위치는, 편의상, 배열 번호 1 에 나타내는 것을 기초로 특정한다. 따라서, 예를 들어, 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기라고 표현한 경우에는, 배열 번호 1 (4R2N) 의 413 번째, 배열 번호 2 (4R1N) 의 384 번째, 배열 번호 3 (4R0N) 의 355 번째, 배열 번호 4 (3R2N) 의 382 번째, 배열 번호 5 (3R1N) 의 353 번째, 또는 배열 번호 6 (3R0N) 의 324 번째의 아미노산 잔기인 세린을 의미한다. 표 1 에, 각 아이소폼에 있어서 서로 동 (同) 위치에 있는 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 또한, 표 1 에서는, 배열 번호 1 의 410 ∼ 421 에 상당하는 각 아이소폼에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고 있지만, 이것 이외의 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 서로의 위치 관계에 대해서는, 예를 들어, 도 1 및 도 2 에 기초하여 용이하게 이해할 수 있다.

항인산화 타우 항체란, 위에 나타낸 타우에 있어서의 아미노산 배열 중 1 개 지점 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 타우와 항원 항체 반응하는 항체를 말한다. 인산화되는 아미노산 잔기로는, 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 티로신 (Tyr) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 항인산화 타우 항체가 항원 항체 반응하는 인산화 타우의 부위로는, AD 등의 신경 변성 질환에서 특이적으로 인산화되는 부위가 바람직하다. 또, 본 발명의 항인산화 타우 항체가 항원 항체 반응하는 인산화 타우에서의 부위의 다른 바람직한 형태로는, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우의 항원 항체 반응하는 항체이고, 보다 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기, 또는 양방의 부위가 인산화된 타우와 항원 항체 반응하는 항체이며, 보다 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우와 항원 항체 반응하는 항체이다. 여기서, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기란, 인간의 4R2N 타우 (배열 번호 1) 에서의 아미노산 번호에 상당하는 부위를 가르키지만, 상기 서술한 배경 기술에 기재한 바와 같이 아이소폼에 있어서의 대응하는 부위, 또 인간 이외의 상동체에 대응하는 부위에 대해서도, 그 아미노산 배열로부터 붙여지는 아미노산 번호에 상관없이, 동일하게 취급되는 것으로 한다. 그와 같은 아이소폼이나 상동체에서의 대응 부위를 이해하기 위해서는, 당업자이면 Needleman-Wunsch 법이나 Smith-Waterman 법 등의 Pairwise Sequence Alignment 에 의한 방법이나, ClustalW 법이나 PRRP 법 등의 Multiple Sequence Alignment 에 의해, 적절히 해석하여 이해할 수 있다. 대응 부위의 해석 방법의 일례로서 도 1 및 도 2 에 인간에서의 6 종류의 아이소폼의 아미노산 배열 (1 문자 표시) 을 ClustalW 로 늘어놓은 것을 나타낸다. 이것을 보면 6 개의 아이소폼에 있어서 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기 주변의 구조가 보존되어 있어, 대응하는 아미노산이 어느 것인가를 용이하게 이해할 수 있다.

본 발명의 치료제 또는 예방제에서 사용할 수 있는 항인산화 타우 항체란, 배열 번호 1 의 타우 단백질의 410 위치로부터 421 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질과 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체이고, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질에 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체이고, 보다 바람직하게는 VH 의 아미노산 배열이 배열 번호 20, VL 의 아미노산 배열이 배열 번호 26 인 항체 (이하, 「1505 항체」 라고도 한다) 와 경합 결합하는 항체이며, 더욱 바람직하게는 Ser413 의 부위가 인산화된 타우 단백질에 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체이다. 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질, 또는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우 단백질이란, 전술한 바와 같이 인간 또는 다른 종에서의 아이소 타입를 포함하여 대응하는 부위가 인산화된 타우 단백질을 나타내지만, 보다 바람직하게는 인간의 타우 단백질이고, 보다 바람직하게는 인간에서의 6 개의 아이소폼 중 어느 것이다.

또, 본 발명에 있어서의 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질, 또는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우 단백질에는, 타우 단백질의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기의 아미노산 배열의 일부분과 완전히 상동 또는 80 ％ 이상의 배열의 상동성을 갖는 펩티드로서, 해당하는 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드도 그와 같은 인산화 타우 단백질에 포함되고, 그와 같은 펩티드와 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체도 본 발명에서의 항인산화 타우 항체이다.

본 발명에 있어서 「항원 항체 반응한다」 란, 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질, 및/또는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우 단백질에 대해, 평형 해리 상수 (KD) 가 1 × 10^-6 M 이상의 친화성으로 결합하는 것, 바람직하게는 평형 해리 상수 1 × 10^-7 M 이상의 친화성으로 결합하는 것, 더욱 바람직하게는 평형 해리 상수 1 × 10^-8 M 이상의 친화성으로 결합하는 것을 말한다.

또, 「특이적으로」 란, 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질, 및/또는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우 단백질에 대한 결합이, 당해 부위가 인산화되어 있지 않은 타우 단백질 (타우 단백질의 아미노산 배열의 일부분과 완전히 상동 또는 80 ％ 이상의 배열의 상동성을 갖는 펩티드를 포함한다) 에 대한 결합보다 10 배 이상 강한, 바람직하게는 30 배 이상 강한, 더욱 바람직하게는 100 배 이상 강한 상태를 말한다.

또한, VH 배열의 아미노산 배열이 배열 번호 20, VL 의 아미노산 배열이 배열 번호 26 인 항체 (1505 항체) 와 「경합 결합한다」 란, 당해 모노클로날 항체가 항원에 결합할 때에 다른 항체를 공존시켰을 때에, 당해 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 현상을 의미하며, 일반적으로는 일정량 (농도) 의 당해 모노클로날 항체에 대해, 양 (농도) 을 바꾸어 다른 항체를 첨가해 갔을 때에, 당해 모노클로날 항체의 항원으로의 결합량이 저하되는 첨가량 (농도) 을 측정함으로써 측정이 가능하고, 그 저해의 정도는 IC₅₀ 또는 Ki 라고 하는 값으로 나타낼 수 있다. 본 발명에서의 VH 의 아미노산 배열이 배열 번호 20 이고, VL 의 배열이 배열 번호 26 인 항체 (1505 항체) 와 경합 결합하는 항체란, 당해 모노클로날 항체 10 nM 으로 사용하여 항원 항체 결합을 검출했을 때에, IC₅₀ 이 1 μM 보다 낮은 값의 것을 말하고, 더욱 바람직하게는 100 nM 보다 낮은 값의 것을 말하며, 더욱 바람직하게는 10 nM 보다 낮은 것을 말한다.

이와 같은 항체의 인산화 타우 단백질로의 항체 항원 결합은 당업자이면 고상 또는 액상의 계에서의 결합 측정을 적절히 선택하여 실시하는 것이 가능하고, 그와 같은 방법으로는 ELISA 법, EIA 법, 표면 플라즈몬 공명법, FRET 법, LRET 법 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다. 또, 그와 같은 항원 항체 결합을 측정할 때에, 항체 및/또는 항원 (인산화 타우 단백질 또는 타우 단백질) 을 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 등으로 표지를 실시하고, 그 표지한 물질의 물리적 및/또는 화학적 특성에 적합한 측정 방법을 이용하여 항원 항체 반응을 검출하는 것도 가능하다.

또, 본 발명의 항인산화 타우 항체로는, H 사슬 가변 영역이 CDR-H1 의 아미노산 배열이 배열 번호 7 또는 8, CDRH-H2 의 아미노산 배열이 배열 번호 9, 10, 11 및 12 중에서 선택되는 어느 것과 CDRH-H3 의 아미노산 배열이 배열 번호 13 의 조합으로 이루어지는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 의 아미노산 배열을 포함하고, L 사슬 가변 영역이 CDR-L1 의 아미노산 배열이 배열 번호 14 또는 15, CDR-L2 의 아미노산 배열이 배열 번호 16, 및 CDR-L3 의 아미노산 배열이 배열 번호 17 의 조합으로 이루어지는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 의 아미노산 배열을 포함하는 항체도 포함된다. 바람직하게는, H 사슬 가변 영역에 포함되는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 의 세트가 배열 번호 7, 배열 번호 9 및 배열 번호 13；배열 번호 8, 배열 번호 9 및 배열 번호 13；배열 번호 7, 배열 번호 10 및 배열 번호 13；배열 번호 8, 배열 번호 12 및 배열 번호 13；그리고 배열 번호 7, 배열 번호 11 및 배열 번호 13 의 조합에서 선택되는 어느 것이고, L 사슬 가변 영역에 포함되는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 세트가 배열 번호 14, 배열 번호 16 및 배열 번호 17；또는 배열 번호 15, 배열 번호 16 및 배열 번호 17 인 항체, 보다 바람직하게는 H 사슬 가변 영역에 포함되는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 세트, 그리고 L 사슬 가변 영역에 포함되는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 세트의 조합이 배열 번호 7, 배열 번호 9, 배열 번호 13, 배열 번호 14, 배열 번호 16 및 배열 번호 17；배열 번호 8, 배열 번호 9, 배열 번호 13, 배열 번호 14, 배열 번호 16 및 배열 번호 17；배열 번호 7, 배열 번호 10, 배열 번호 13, 배열 번호 14, 배열 번호 16 및 배열 번호 17；배열 번호 8, 배열 번호 12, 배열 번호 13, 배열 번호 14, 배열 번호 16 및 배열 번호 17；그리고, 배열 번호 7, 배열 번호 11, 배열 번호 13, 배열 번호 15, 배열 번호 16 및 배열 번호 17 의 조합에서 선택되는 어느 것인 항체이다. 여기서, 이들의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3 의 아미노산 배열 중, 대응하는 CDR 배열의 적어도 1 개가 BLAST 법 (NCBI 의 PBLAST 의 디폴트 조건) 으로 배열 번호 7 내지 17 중 어느 것과 85 ％ 이상의 상동성 (Identities), 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성을 나타내는 배열인 것도 본 발명의 항체에 포함된다.

여기서, 항체에 있어서의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3 의 배열을 동정하는 방법으로는, 예를 들어 Kabat 의 방법이나 Chothia 의 방법을 이용함으로써, 당업자는 각 CDR 에 대응하는 부분의 배열을 동정하는 것이 가능하고, Kabat (Kabat, E. A. and Wu, T. T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991년) 나 Chothia (Al-Lazikani, B., Lesk, A. M. and Chothia, C., J. Mol. Biol., 273, 927-948, 1997년) 방법은 이 영역의 당업자에게 있어서는 기술 상식이지만, 예를 들어 Dr. Andrew C. R. Martin's Group 의 홈페이지 (http://www.bioinf.org.uk/abs/) 로부터 개요를 아는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 항체의 다른 형태로는, H 사슬 가변 영역 (VH) 의 아미노산 배열이 배열 번호 18 내지 24 에서 선택되는 어느 것, L 사슬 가변 영역 (VL) 의 아미노산 배열이 배열 번호 25 내지 30 에서 선택되는 어느 것인 항체이며, 바람직하게는 VH 와 VL 의 아미노산 배열의 조합이 배열 번호 18 과 배열 번호 25, 배열 번호 19 와 배열 번호 26, 배열 번호 20 과 배열 번호 26, 배열 번호 21 과 배열 번호 27, 배열 번호 22 와 배열 번호 28, 배열 번호 23 과 배열 번호 29, 및 배열 번호 24 와 배열 번호 30 의 조합에서 선택되는 어느 것인 항체이다. 여기서, VH 및 VL 의 아미노산 배열의 적어도 편방이 배열 번호 18 내지 24 에 나타내고자 하는 어느 것의 VH 의 아미노산 배열 또는 배열 번호 25 내지 30 에 나타낸 VL 중 어느 것의 아미노산 배열, 및 BLAST 법 (NCBI 의 PBLAST 의 디폴트 조건) 으로 배열 번호 18 내지 30 과 85 ％ 이상의 상동성 (Identities), 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성을 나타내는 배열인 것도 본 발명의 항체에 포함된다.

이 항체에 있어서, 정상 영역의 아미노산 배열은 포유류의 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 의 각 서브 타입 또는 그 변이체에서 선택된다.

상기 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 의 아미노산 배열, 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 의 아미노산 배열, 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열의 정보를 기초로, 당업자이면 인간화 항체 등, 목적으로 하는 종에 치료 목적으로 투여하는 데에 적합한 재조합체 항체를 디자인하는 것이 가능하고, H 사슬 가변 영역의 아미노산 배열 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열, L 사슬 가변 영역의 아미노산 배열 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열의 정보를 기초로, 당업자이면 목적에 따른 키메라 항체 등을 디자인할 수 있다. 또, 추가로 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 의 아미노산 배열, 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 의 아미노산 배열, 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열의 정보나, H 사슬 가변 영역의 아미노산 배열 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열, L 사슬 가변 영역의 아미노산 배열 및/또는 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열의 정보를 기초로, 저분자 항체나 스캐폴드 항체를 제조하는 것은, 공지된 기술을 이용함으로써, 당업자이면 적절히 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체는 H 사슬 및 L 사슬이 각 2 개에 의해 구성되는 항체이어도 되고, H 사슬이 2 개만으로 구성되는 항체이어도 된다. 또, 본 발명의 항체는 항체의 단편이어도 되며, 그와 같은 항체의 단편으로는, F(ab')2, Fab, Fv 등의 구조를 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체는 당업자에게 주지의 기법을 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체는 폴리클로날 항체, 또는 모노클로날 항체 (밀 스테인 (Milstein) 등, 네이처 (Nature) (England) 1983년 10월 6일 발행, 305 권 5934 호, p. 537 ∼ 540) 일 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질, 배열 번호 1 의 Ser413 의 부위가 인산화된 타우 단백질, 또는 배열 번호 1 의 타우 단백질의 410 위치로부터 421 위치의 아미노산 배열의 적어도 일부분과 완전히 상동 또는 80 ％ 이상의 배열의 상동성을 갖는 펩티드로서, 해당하는 아미노산이 인산화된 펩티드를 항원으로하여 포유 동물에 감작하고, 당해 동물의 혈청 등으로부터 회수할 수 있다. 또, 펩티드를 항원으로서 사용하는 경우에는, BSA 나 KLH 등의 캐리어 단백질이나 폴리리신 등에 결합시킨 형태에서의 항원을 이용할 수 있다. 또 항원으로서 사용하는 펩티드의 구체적 예로는, 실시예 1 및 2 에 기재된 바와 같이, 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 부위가 인산화된 배열 번호 31 또는 32 의 펩티드를 사용할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 당해 발명에 있어서의 모노클로날 항체는, 항원을 감작한 포유 동물로부터 면역 세포를 취출하여 골수종 세포 등과 세포 융합시킴으로써 얻어진 하이브리도마를 클로닝하여, 그 배양물로부터 회수할 수 있다. 그와 같은 모노클로날 항체의 취득 방법으로는, 실시예 2 에 기재되어 있으며, 그에 따라 얻어진 모노클로날 항체로는 배열 번호 18 내지 24 의 VH 아미노산 배열, 배열 번호 25 내지 30 의 VL 배열을 갖는 모노클로날 항체 (Ta1501, 1502, 1505 ∼ 1509) 를 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다.

얻어진 모노클로날 항체는 그 항체의 단백질의 아미노산을 코드하는 유전자 배열을 갖는 핵산 분자를 얻는 것도 가능하고, 그와 같은 핵산분을 이용하여 유전자 공학적으로 항체를 제조하는 것도 가능하다. 당해 항체의 유전자 정보는 H 사슬, L 사슬, 그들의 가변 영역은 CDR 배열 등의 정보를 이용하여 항체의 결합성이나 특이성의 향상을 위한 개변 등을 실시하는 것이나, 마우스 등의 동물의 항체로부터 인간형 항체로 개변함으로써 치료제에 사용하기 위해서 적합한 구조의 항체를 제조하는 것은 이 분야에서의 당업자에게는 잘 알려진 기술이다. 또, 항원을 감작하는 동물로서 인간 항체 유전자가 도입된 비인간-트랜스제닉 동물을 사용함으로써, 인간형의 모노클로날 항체를 취득하는 것도 가능하다. 그 이외에도, 동물로의 감작을 필요로 하지 않는 방법으로서, 인간 항체의 항원 결합 영역 또는 그 일부를 발현하는 파지 라이브러리 (인간 항체 파지 디스플레이) 를 이용하여, 대응하는 항원과 특이적으로 결합하는 항체나 특정한 아미노산 배열로 이루어지는 파지 클론을 취득하고, 그 정보로부터 인간 항체를 제조하는 기술도 당업자이면 적절히 실시할 수 있다. (예를 들어, Taketo Tanaka 등, Keio J. Med., 60 권, p 37-46 의 리뷰 등을 참조.)

또, 전술한 모노클로날 항체를 제조하는 방법으로는, 각각 취득하고자 하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 배양하고, 얻어진 배양 상청액으로부터 통상적인 방법에 의해 항체를 정제하여 취득할 수 있다. 또, 다른 제조 방법으로는, 취득하고자 하는 항체를 산생하는 하이브리도마나 인간 항체 파지 디스플레이로 얻어진 파지 클론 등으로부터 항체를 코드하는 유전자, 보다 상세하게는 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 코드하는 유전자를 취득하여, 그 유전자를 발현하기 위한 벡터를 제조하고, 숙주 세포 (포유류 세포, 곤충 세포, 미생물 등) 에 도입하여, 그 항체를 산생시키는 것도 가능하다. 이 때, 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 코드하는 유전자에 대해, 원하는 형질을 도입하기 위한 유전자 개변을 실시하거나, 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 또는 CDR 영역의 구조 정보를 이용하여 인간형화 항체, 항체 키메라 단백질, 저분자 항체나 스캐폴드 항체를 제조하는 것은 공지된 기술을 이용함으로써 당업자이면 실시할 수 있다. 또, 항체의 성능의 향상이나 부작용의 회피를 목적으로, 항체의 정상 영역의 구조에 개변을 넣는 것이나, 당 사슬의 부분에서의 개변을 실시하는 것도 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 적절히 실시할 수 있다.

[타우에서 유래하는 아미노산 배열을 갖는 인산화 펩티드]

본 발명에는, 타우의 아미노산 배열의 일부를 포함하고, 그 1 개 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드도 포함된다. 아미노산 잔기가 인산화되었다라는 것은, 아미노산 잔기의 측사슬에 대해 인산기가 에스테르 결합한 상태를 말하며, 인산화되는 아미노산 잔기의 대표적인 것으로는, 세린, 트레오닌, 티로신 등을 들 수 있다. 당해 인산화 펩티드는 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중, 적어도 연속하는 3 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드, 바람직하게는 적어도 연속하는 5 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드, 보다 바람직하게는 적어도 연속하는 8 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드이다. 또한, 당해 인산화 펩티드에 있어서 인산화되는 아미노산 잔기는, 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기 중 어느 것, 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, Ser416 의 아미노산에 상당하는 아미노산 잔기 중 어느 것, 보다 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기이다. 이와 같은 인산화 펩티드의 대표적인 것으로는, 실시예 1 에서 항체 제조에 이용하고 있는 인산화 펩티드 (배열 번호 31) 를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 타우에서 유래하는 아미노산 배열을 갖는 인산화 펩티드는 본 발명에 있어서의 항인산화 타우 항체의 제조에 있어서의 항원이나 당해 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 인지증 치료제 또는 예방제에 사용할 수 있다. 당해 인산화 펩티드는 그 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에 목적에 따라 다른 기능을 갖는 물질로 수식하는 것도 가능하다. 예를 들어, 당해 인산화 펩티드의 N 말단에, 메티오닌 잔기, 아세틸기 또는 피로글루타민산 등이 부가된 것이나 형광 물질 등으로 수식된 형태이어도 된다. 또, 당해 인산화 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단을 수식하는 물질은 펩티드나 단백질이어도 되고, 그와 같은 것의 예로는 N 말단 또는 C 말단에 적당한 태그 배열 (전형적으로는 히스티딘 태그 또는 FLAG 태그), T 세포 수용체 (TCR) 나 주요 조직 적합성 항원 (MHC) 에 의해 인식되기 위한 아미노산 배열의 펩티드, 바이러스나 세균의 단백질이나 그것에서 유래하는 배열의 펩티드 등이 부가된 것을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서의 인산화 펩티드에는, N 말단 및 C 말단 이외의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 화합물 또는 펩티드로 수식된 것도 포함된다. 이와 같은 인산화 펩티드의 수식은, 당업자이면 공지된 방법, 예를 들어 허만손 (Hermanson) 등 저술의 바이오콘쥬게이트·테크닉스 (Bioconjugate techniques, USA, 1996년 발행, Academic Press) 에 기재된 방법 등을 이용하여 실시하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서의 인산화 펩티드는 당업자이면 적절히 합성법이나 유전자 공학적 방법 등을 이용하여 제조할 수 있다. 인산화 펩티드를 합성에 의해 제조하는 방법으로는, Boc 법에 의한 방법 (Wakamiya T. 등, Chemistry Letters, Vol. 22 P1401, 1993년), Fmoc 법에 의한 방법 (PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 40, P 134-140, 1992년), 또는 일본 특허공보 제3587390호에 기재된 방법 등을 예시할 수 있지만, 당업자이면 적절히 다른 방법으로도 실시 가능하다. 또, 유전자 공학적 방법에 의한 제조 방법은, 제조하는 펩티드 또는 그 전구체를 코드하는 염기 배열을 갖는 유전 물질 (DNA, RNA) 을 조제하고, 적절히 발현용 벡터로의 삽입이나 프로모터 배열의 부가 등을 실시함으로써, 적당한 숙주에 도입하여 발현시키거나 무세포계 단백질 합성계를 이용하는 등의 방법으로 제조할 수 있다. 이 경우, 원하는 부위가 인산화된 인산화 펩티드를 얻기 위해서는, 적절히, 숙주가 갖는 또는 유전자 공학적으로 발현이 유도된 키나아제류에 의해 숙주 내에서 인산화 반응을 실시시키거나, 목적으로 하는 펩티드를 한 번 회수한 후에 in vitro 에 있어서 키나아제 등을 반응시킴으로써 인산화 반응을 실시하는 것에 의해 제조하는 것이 가능하다. 이 in vitro 에서의 인산화 반응을 실시하기 위해서는, 목적으로 하는 펩티드를 GSK3 이나 CDK5 등 타우의 인산화 반응에서의 기능이 알려져 있는 효소를 이용할 수 있다. 이와 같이 숙주 내, 또는 in vitro 로 인산화된 인산화 펩티드 중, 목적으로 하는 아미노산 잔기가 인산화된 것을 취득하기 위해서는, 상기의 항인산화 타우에 대한 항체에 의한 항체 항원 반응을 이용하여 특이적으로 항체와 결합한 인산화 펩티드를 회수하는 방법 등을 이용해도 된다.

[항인산화 타우 항체 또는 인산화 타우 펩티드를 함유하는 인지증 치료제 또는 예방제]

인간에게 있어서의 인지증이란, 일단 발달한, 혹은 획득된 지적 기능이 저하되는 상태를 말하며, 지능 장애의 하나로 여겨지지만 (카미지마 쿠니토시, 니와 신이치 편, NANKODO's ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES New 정신 의학, p 69-70, 2008년), 넓은 의미에 있어서는 지능 장애 및/또는 기억 장애를 나타내는 질환인 것으로 생각된다. AD 등의 신경 변성 질환에 있어서는, 「신경 변성」 을 확정하려면 사후에 조직학적인 해석을 실시함으로써 신경원섬유 변화 (NFT) 의 존재를 확인하는 것 등으로 실시할 수 있지만, 의사는 신경 변성 질환의 진단으로서, 신경 심리학적 검사로서 질문에 의한 것/하세가와식 간이 지능 평가 스케일 개정판 (HDS-R) 이나 Mini-Mental State Examination (MMSE) 등, 관찰에 의한 것 Clinical Dementia Rating (CDR) 이나 Functinal Assessment Staging (FAST) 등, 생화학 검사로서 뇌척수액 중에서의 타우나 인산화 타우의 존재량의 상승이나 Aβ 의 존재량의 상승, 화상 검사로서 두부 CT, 두부 MRI, SPECT 나 PET 등에서의 얻어진 정보를 기초로, 인지증, 특히 신경 변성 질환으로서의 인지증을 진단한다. 따라서, 본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제는 의사가 인지증으로서 진단한 환자에게 투여되고, 상기 신경 변성 질환에 있어서의 진단 항목의 1 이상에 있어서, 투여 전과 비교하여 개선되는 효과, 또는 병상이 진행되는 정도를 투여에 의해 억제 또는 투여 전 상태로 유지 또는 회복시키는 효과를 갖는 것이다.

본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제가 투여되는 환자로는, 인지증 환자인, 그 중에서도 타우오패시 환자로서, 그 중에서도 알츠하이머병 (AD), 피질 기저핵 변성증 (CBD 또는 CBS), 진행성 핵상성 마비, 피크병, 기은 과립성 인지증 (기은성 과립병), Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17), 신경원섬유 변화형 인지증, 석회 침착을 수반하는 미만성 신경원섬유 변화병 (DNTC), 구상 글리아 봉입체를 수반하는 백질 타우오패시 (WMT-GGI) 타우 양성 봉입체를 수반하는 전두측두엽 변성증 (FTLD-tau), 에코노모 뇌염 후유증, 아급성 경화성 전뇌증이나 권투선수 뇌증 중 어느 것의 환자이다. 따라서, 본 발명의 인지증 치료제는 타우오패시 치료제 또는 예방제이기도 하며, 다른 관점에서는 알츠하이머병 (AD), 피질 기저핵 변성증 (CBD 또는 CBS), 진행성 핵상성 마비, 피크병, 기은 과립성 인지증 (기은성 과립병), Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17), 신경원섬유 변화형 인지증, 석회 침착을 수반하는 미만성 신경원섬유 변화병 (DNTC), 구상 글리아 봉입체를 수반하는 백질 타우오패시 (WMT-GGI) 타우 양성 봉입체를 수반하는 전두측두엽 변성증 (FTLD-tau), 에코노모 뇌염 후유증, 아급성 경화성 전뇌증이나 권투선수 뇌증 등의 치료제 또는 예방제라고도 할 수 있다.

또, 본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제는 비인간 동물에서의 인지 기능을 개선, 또는 인지 기능의 저하를 억제 또는 유지하는 효과를 갖는 것이라고도 말할 수 있다. 당해 비인간 동물로서 인간의 타우를 높은 상동성을 갖는 타우를 발현하는 동물, 침팬지, 붉은털 원숭이, 말, 돼지, 개, 마우스, 토끼, 래트, 고양이 등이 포함되지만, 그것에 한정되는 것은 아니다.

[인지증의 모델 동물]

본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제를 연구하기 위한 동물로는, 인지증의 모델 동물을 들 수 있으며, 그 중에서도 특히 타우오패시의 모델 동물을 들 수 있다. 또, 타우오패시의 동물 모델로는, 정상형 또는 유전자 변이형의 타우를 뇌에서 발현하는 동물이며, 특히 인지 기능의 장애를 일으키는 동물 모델이다. 이와 같은 정상형 또는 유전자 변이형의 타우를 뇌에서 발현하는 동물은 유전자 조작에 의해 제조하는 것이 가능하고, 그 대표적인 것으로는 트랜스제닉 마우스 (Tg 마우스) 를 들 수 있다. 유전자 변이형의 타우를 발현하는 Tg 마우스 등의 동물 모델은, 유전적인 가족성의 타우오패시의 모델로는 유용하지만, 인간에서의 대다수를 차지하는 고발성의 타우오패시에 대해 치료제 또는 예방제의 효과를 보기 위해서는 정상형의 타우를 발현하는 Tg 마우스에서 효과를 나타내는 것이 바람직하다. 그와 같은 정상형의 타우를 발현하는 Tg 마우스로는, 본 발명의 제조예에서 제조하고 있는 마우스가 가장 적합하지만, 그 외에는 캄베 등 (Neurobiology of Disease, Vol. 42, P 404-414, 2011년) 이나 키무라 등 (The EMBO J. vol. 26. P 5143-5152, 2007년) 이 보고하고 있는 Tg 마우스 등을 사용할 수 있다. 그러나, 캄베 등의 마우스 및 키무라 등의 마우스에 있어서는, 인지 기능 장애가 확인되는 것이 각각 14 개월령 및 20 개월령 이후이기 때문에, 꽤 노령이 되고 나서의 발증이 되어, 가령에 의한 영향도 포함하고 있을 가능성이나, 장기 사육에 의한 영향이나 수고의 문제가 있다. 그에 반해, 본 발명의 제조예에서 제조하고 있는 마우스는 인간의 정상형 타우를 발현하고, 6 개월령 정도로 비교적 조기에 인지 기능 장애를 발병하는 마우스이기 때문에, 가령 등의 요인을 배제할 수 있는 인지증 모델로서 가장 적합한 것이며, 이와 같은 모델을 사용함으로써 보다 명확하게 인지 기능의 개선 효과를 갖는 인지증 치료제 또는 예방제를 평가하는 것이 가능하다.

동물 모델에서 본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제의 작용을 조사하는 방법으로는, 기억 학습 시험 등의 인지 기능을 시험하는 방법이 바람직하다. 그와 같은 방법으로는, Morris 수미로 시험, 스텝스루형 학습 시험, 신기 물질 인식 시험 등의 방법을 이용하는 것이 가능하지만, 행동량이나 동물의 불안 등의 조건을 뒷받침하기 위해서 Open Field Test 등의 행동 측정 시험의 방법을 조합하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제의 작용을 조사하는 방법으로는, 인지증의 모델 동물에 투여했을 때에, 뇌 조직에 있어서의 타우 단백질 또는 인산화 타우의 증감을 조사하는 방법도 이용할 수 있다. AD 나 다른 신경 변성 질환에 있어서, 타우 단백질의 발현량이나 이상 인산화 타우의 증가가 병태와 관련하고 있는 것으로 알려져 있다 (Khalid Iqbal 등, Curr. Alzheimer Res., 7 권, p 654-664, 2010년). 그리고, 몇가지 병태 모델 동물에 있어서 타우의 발현이나 이상 인산화 타우의 양을 저감함으로써, 인지 기능이나 운동 기능에 개선이 보이는 경우도 공지이다 (K. SantaCruz 등, Science, 309 권, p 476-481, 2005년；Sylvie Le Corre 등, Porc. Nat. Acad. Sci. USA, 103 권, p 9673-9678, 2006년). 타우 단백질 또는 인산화 타우의 증감을 조사하는 방법으로는, 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 뇌 조직의 호모제네이트를 사용하여 웨스턴 블로팅 등의 방법으로 실시할 수 있지만, 그 외 ELISA 법 (Xiyun Chai 등, J. Biol. Chem., 286 권, p 34457-34467, 2011년) 이나 조직 면역 화학법 (David J. Irwin 등, BRAIN, 135 권, p 807-818, 2012년) 등, 당업자이면 적절히 방법을 선택하여 실시하는 것이 가능하다.

본 발명에서의 인지증 치료제 또는 예방제의 모델 동물에서의 효과는 인간 등에서의 치료제 또는 예방제의 개발에 있어서의 약리 효과의 데이터로서 사용된다.

[인지증 치료제 또는 예방제]

본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제의 형태로는, 항인산화 타우 항체를 함유하는 것이며, 바람직하게는 타우 단백질의 배열 번호 1 의 410 위치로부터 421 위치에 상당하는 아미노산 잔기 중 적어도 1 개가 인산화를 받은 타우 단백질과 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체이고, 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, 및 Ser416 에 상당하는 아미노산 잔기에서 선택되는 1 개 이상의 부위가 인산화된 타우 단백질과 항원 항체 반응하는 항체이고, 보다 바람직하게는 VH 의 아미노산 배열이 배열 번호 20 이고, VL 의 아미노산 배열이 배열 번호 26 인 (1505) 항체와 경합 결합하는 항체이며, 더욱 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기의 부위가 인산화된 타우 단백질에 항원 항체 반응하는 항체이다. 그와 같은 항체에 대한 설명은 상기 서술한 [항인산화 타우 항체] 의 부분에 기재되어 있다.

본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제의 다른 형태로는, 타우의 배열 일부를 포함하고, 그 1 개 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드를 함유하는 것이며, 그 펩티드로는 인산화 펩티드는 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 중, 적어도 연속하는 3 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드, 바람직하게는 적어도 연속하는 5 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드, 보다 바람직하게는 적어도 연속하는 8 아미노산을 포함하는 길이가 8 아미노산 길이 이상인 펩티드이다. 또한, 당해 인산화 펩티드에 있어서 인산화되는 아미노산 잔기는, 배열 번호 1 의 아미노산 번호 410 ∼ 421 에 상당하는 아미노산 잔기 중 어느 것, 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser412, Ser413, Thr414, Ser416 의 아미노산에 상당하는 아미노산 잔기 중 어느 것, 보다 바람직하게는 배열 번호 1 의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기이다. 그와 같은 펩티드에 대한 설명은 상기 서술한 [타우에서 유래하는 아미노산 배열을 갖는 인산화 펩티드] 의 부분에 기재되어 있다.

본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제는 약학적으로 허용되는 어느 첨가제를 함유해도 된다. 약학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 제제는 「REMINGTON : THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION, 필라델피아 과학 대학 (University of the Sciences in Philadelphia) 저, Williams & Wilkins 사, 2000년 12월 15일 발행」 에 기재된 방법으로 실시하는 것도 가능하다. 이와 같은 치료제 또는 예방제의 하나의 형태로는, 무균의 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁, 또는 유화함으로써 조제된 액제로서 제공된다. 이와 같은 용제로서, 수성액으로는 주사용 증류수, 생리 식염수 등을 들 수 있으며, 그것에 더하여 삼투압 조절제 (예를 들어, D-글루코오스, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 가 첨가되거나, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올 (예를 들어 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면 활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50) 등이 병용되는 경우도 있다. 또, 용제로는 유성액이 사용되는 경우도 있으며, 그 유성액의 예로는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등이 병용되는 경우도 있다. 이와 같은 액제에 있어서는, 적절히, 완충제 (예를 들어, 인산염류 완충제, 아세트산염류 완충제), 무통화제 (예를 들어, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들어, 아스코르브산, 에리소르빈산 및 그들의 염 등), 착색제 (예를 들어, 구리클로로필, β-카로틴, 적색 2 호, 청색 1 호 등), 방부제 (예를 들어 파라옥시벤조산에스테르, 페놀, 염화벤제토늄, 염화벤잘코늄 등), 증점제 (예를 들어 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그들의 염 등), 안정화제 (예를 들어 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨 등), 교취제 (예를 들어 멘톨, 감귤 향료 등) 의 첨가제가 사용되는 경우가 있다. 또 다른 치료제 또는 예방제의 형태로는, 산제, 정제, 과립제, 캡슐제, 환제, 좌제, 트로키제 등의 고형제를 들 수 있다. 경구용 제제의 형태로 투여하는 고형제의 경우에는, 첨가제로서, 부형제 (예를 들어, 결정성 셀룰로오스, 락토오스, 전분 등), 활택제 (예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탤크 등), 결합제 (하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 매크로골 등), 붕괴제 (예를 들어, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등) 등이 사용된다. 또, 필요에 따라, 방부제 (예를 들어, 벤질알코올, 클로로부탄올, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필 등), 항산화제, 착색제, 감미제 등의 첨가제를 사용할 수 있다. 또한 다른 형태로서, 점막 적용용 치료제 또는 예방제도 들 수 있으며, 이 제제에 있어서는 점막에 대한 흡착성, 체류성 등을 부여하는 것을 주된 목적으로 하여, 첨가제로서 점착제, 점착 증강제, 점조제, 점조화제 등 (예를 들어, 무틴, 한천, 젤라틴, 펙틴, 카리기난, 알긴산나트륨, 로커스트빈 검, 잔탄 검, 트래거캔스 검, 아라비아 고무, 키토산, 풀루란, 왁시 스타치, 수크랄페이트, 셀룰로오스, 및 그 유도체 (예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 아크릴산(메트)아크릴산알킬 공중합체, 또는 그 염, 폴리글리세린 지방산 에스테르 등) 가 함유되는 경우도 있다. 그러나, 생체에 공여되는 치료제 또는 예방제의 형태 및 용제나 첨가제는 이들에 한정되는 것은 아니고, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서의 인지증 치료제 또는 예방제에는, 상기 항인산화 타우 항체 또는 인산화 펩티드 외에 기존의 인지증의 진전을 억제하는 효과를 갖는 물질을 배합한 치료제 또는 예방제도 포함된다. 또, 본 발명에 있어서의 인지증 치료제 또는 예방제에는, 상기 항인산화 항체 또는 인산화 펩티드를 포함하는 치료제 또는 예방제와 기존의 인지증의 진전을 억제하는 효과를 갖는 물질을 함유하는 치료제 또는 예방제를 병용하기 위한 키트도 포함된다. 인지증의 진전을 억제하는 물질로는, 예를 들어 도네페질 (Donepezil), 갈란타민 (Galantamine), 메만틴 (Memantine) 이나 리바스티그민 (Rivastigmine) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 배합되는 인지증의 진전을 억제하는 효과를 갖는 물질이나 인지증의 진전을 억제하는 효과를 갖는 물질을 함유하는 치료제 또는 예방제의 용량으로는, 통상적인 치료에 사용되는 용량으로 실시할 수 있지만, 상황에 따라 증감하는 것도 가능하다.

또, 본 발명의 실시예에서 사용하고 있는 항체는, 복강내 투여라고 하는 말초로부터의 투여에 의해서도 뇌혈관 관문을 통과하여 뇌에서 작용하여 약효를 나타내는 것이 실시예의 결과로부터 증명되고 있지만, 본 발명에 있어서의 인지증 치료제 또는 예방제에도 사용하는 항인산화 타우 항체를 뇌 조직에 효율적으로 공급하기 위한 제제도 제조 가능하고, 그와 같은 제제도 본 발명의 인지증 치료제 또는 예방제에 포함된다. 항체나 펩티드 등을 효율적으로 뇌 조직에 뇌혈관 관문을 통과시켜 공급하는 방법으로는, 타겟팅용의 물질을 부가하는 방법이나, 리포솜이나 나노 파티클 내에 봉입하는 방법 등이 알려져 있다. 타겟팅을 위한 물질로는, 항체와 결합시킴으로써 전체 또는 부분적인 전하적 특성을 변화시키는 것을 사용하거나, 특이적 수용체나 트랜스포터 등과 결합하는 특성을 갖는 펩티드나 단백질 또는 화합물을 사용하는 것이 가능하다. 특이적인 수용체나 막 단백질 등과 결합하는 특성을 갖는 펩티드나 단백질 또는 화합물의 예로는, 수용체의 리간드나 막 단백질에 결합하는 리간드나 그 유연체, 수용체의 리간드나 막 단백질에 결합하는 항체, 아고니스트 화합물/안타고니스트 화합물/알로스테릭 모듈레이터나 그들의 유연 화합물 등을 들 수 있다. 특이적 수용체나 트랜스포터 등과 결합하는 특성을 갖는 펩티드나 단백질 또는 화합물의 표적이 되는 수용체의 리간드나 막 단백질의 예로는, 트랜스페린 수용체 (TfR), 인슐린 수용체 (IR), 인슐린형 성장 인자 수용체 (IGFR), LDL 수용체 관련 단백질 (LRP) 이나 디프테리아 독소 수용체 (HB-EGF) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다 (Angela R. Jones 등, Pharm. Res., 24 권, p 1759-1771, 2007년). 타겟팅을 위한 물질은 본 발명의 인증 치료제 또는 예방제에 사용하는 항체에 화학적으로 부가하는 것이 가능하며, 그 방법으로는, 공지된 방법, 예를 들어 허만손 (Hermanson) 등 바이오콘쥬게이트·테크닉스 (Bioconjugate techniques) (USA) 1996년 발행 Academic Press) 에 기재된 방법을 참조하여 당업자이면 적절히 실시할 수 있다. 또, 타겟팅을 위한 물질은 항체나 펩티드를 포함시키는 리포솜이나 나노 파티클에 결합시켜도 된다 (Sonu Bhaskar 등, Particle and Fibre Toxicology, 7 권 3 호, 2010년). 또한, 타겟팅을 위한 물질이 펩티드나 단백질인 경우에는, 펩티드 화학 합성에 의한 융합 펩티드로서 제조하거나, 펩티드나 단백질의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열로 이루어지는 핵산을, 사용하는 항체나 펩티드의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열로 이루어지는 핵산과 조합시키거나 함으로써, 당업자이면 적절히 융합 단백질로서 유전자 공학적인 기술을 이용하여 제조하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서의 치료제 또는 예방제는 증상의 개선을 목적으로 하여 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 경구 투여의 경우에는, 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 시럽제, 유제 또는 현탁제, 엘릭시르제 등의 제형을 선택할 수 있다. 비경구 투여의 경우에는, 예를 들어 경비제로 할 수 있고, 액제, 현탁제, 고형 제제 등을 선택할 수 있다. 또 다른 비경구 투여의 형태로는, 주사제로 할 수 있고, 주사제로는, 피하 주사제, 정맥 주사제, 점액 주사제, 근육 주사제, 뇌실내 주사제 또는 복강내 주사제 등을 선택할 수 있다. 또 그 밖의 비경구 투여에 사용하는 제제로는, 좌제, 설하제, 경피제, 경비제 이외의 경점막 투여제 등도 들 수 있다. 또한, 스텐트나 혈관내 전색제에 함유 혹은 도포하는 양태로, 혈관내 국소 투여할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 치료제 또는 예방제의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 또는 그 의약 조성물에 함유되는 활성 성분의 종류 등에 따라 다르지만, 통상적으로 성인 1 인당 1 회에 대해 주제를 0.1 ㎎ 내지 1 g 의 범위로, 바람직하게는 0.5 ㎎ 내지 200 ㎎ 의 범위로 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 가지 조건에 의해 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또 상기 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.

또 본 발명에 있어서의 치료제 또는 예방제는 짧은 투여 기간에 효과를 얻는 것이 가능하다.

실시예

이하, 실시예로써 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 실험은, 오사카 시립 대학 아베노 지구 동물 실험 위원회의 승인하에서 실시되었다.

[실시예 1] pSer413 펩티드에 대한 토끼 폴리클로날 항체의 제조

pSer413 펩티드에 대한 항체 제조를 위해서, 항원으로서, 인간 타우 단백질의 배열 번호 1 의 아미노산 배열의 413 번째에 상당하는 Ser 이 인산화된 410 번째의 Asn 으로부터 416 번째의 Ser 까지에 상당하는 아미노산 배열의 C 말단 부위에 Cys 를 붙인 합성 펩티드 (배열 번호 31. 주식회사 의학 생물학 연구소 [MBL] 에서 합성) 를 사용하였다 (이하, 그 펩티드를 pSer413(S) 펩티드라고 부른다).

pSer413(S) 펩티드：N-AsnValSer(pSer)ThrGlySerCys-C (배열 번호 31)

pSer413(S) 펩티드는 합성 후, HPLC 로 정제하고, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 와 공유 결합시켰다. 얻어진 콘쥬게이트는 토끼 1 마리에 대해 0.1 ㎎ 을 1 회분 면역에 사용하였다. 1 회째의 면역은 콘쥬게이트 용액 0.2 ㎖ (콘쥬게이트 농도 0.5 ㎎/㎖) 와 등량의 프로인트의 컴플리트 애주번트를 혼합하고, 털을 깎은 일본 백색종 토끼의 배부에, 50 ㎕ 씩 8 개 지점에 피내 주사함으로써 실시하였다. 2 회째 이후의 면역은 프로인트의 인컴플리트 애주번트를 사용하여, 동일한 면역을 2 주간 간격으로, 추가로 2 회 실시하였다. 마지막 면역으로부터 2 주일 후에 혈액을 일부 채취하여, 그 혈청 중의 항체가를, 면역한 펩티드 콘쥬게이트를 사용한 ELISA 법으로 확인하고, 그 1 주일 후에 동물을 도살하여 전혈을 채취하였다. 얻어진 혈액으로부터 혈청을 제조하고, 그 혈청으로부터 pSer413 (Af) 펩티드 (배열 번호 32) 의 어피니티 칼럼을 사용하여 항체를 정제하였다.

또한, 혈청 항체값의 확인은 이하의 방법에 따랐다. pSer413(S) 펩티드를 PBS 로 5 ㎍/㎖ 에 희석 후, 플레이트에 100 ㎕/well 로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 용액을 제거 후, 블로킹 버퍼 (MBL 사 제조) 를 250 ㎕/well 로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 면역 전 토끼 혈청과 면역 후의 토끼 혈청의 희석 계열을 100, 500, 2,500, 12,500, 62,500 배, 블랭크로 하고, PBS 로 희석한 것을 100 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 세정 후, 항토끼 IgG-퍼옥시다아제 표지 (MBL 사 제조) 를 희석 Buffer (MBL 사 제조) 로 8,000 배 희석한 것을 100 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 세정 후, 발색액 (MBL 사 제조) 을 100 ㎕/well 첨가하고, 3 ∼ 10 분간 발색시켜, 2 N 황산을 100 ㎕/well 로 첨가하고, 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후, 측정 파장 450 ㎚, 참조 파장 620 ㎚ 로 흡광도를 측정하였다.

또, 정제 항체의 항체 반응성의 확인은 이하의 방법에 따랐다. pSer413(L) 펩티드 [pSer413(S) 펩티드 (하선부) 를 N 단, C 단 방향으로 더욱 연장한 펩티드 (배열 번호 33. Biosynthesis 사에서 합성)：N-ProArgHisLeuSerAsnValSer(pSer)ThrGlySerIleAspMetValAsp-C], 혹은 동일한 아미노산 배열을 갖지만 Ser413 에 상당하는 부위가 인산화되어 있지 않은 NonP(L) 펩티드 (배열 번호 34. Biosynthesis 사에서 합성) 를 PBS 로 1 ㎍/㎖ 에 희석 후, 플레이트에 50 ㎕/well 로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 용액을 제거 후, 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA-PBS) 를 250 ㎕/well 로 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 정치하였다. 정제 항체를 PBS 로 희석하고, 계열화한 것을 50 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 90 분간 반응시켰다. 세정 후, 염소 항토끼 IgG-알칼리 포스파타아제 표지 (Bioscience 사 제조) 를, 희석 Buffer (3 ％ BSA-PBS) 로 2,000 배 희석한 것을, 50 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 세정 후, 발색액 (2.5 mM MgCl₂ 함유 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8 에 1 ㎎/㎖ PNPP [파라니트로·페닐포스페이트] 를 첨가한 용액) 을 100 ㎕/well 첨가하고, 30 분간 발색시켜, 측정 파장 405 ㎚, 참조 파장 550 ㎚ 로 흡광도를 측정하였다.

＜결과＞

정제한 항체는 도 3 에 나타내는 바와 같이, pSer413(L) 펩티드에 특이성이 높고, nonP(L) 펩티드에는 거의 반응하지 않는 것을 알 수 있었다. 따라서, 당해 항체는 pSer413(L) 에 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체이다 (본 명세서에서는, 「pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체」 또는 「pS413AB」 라고 기재하는 경우도 있다).

[실시예 2] pSer413 펩티드에 대한 모노클로날 항체 (Ta15 시리즈) 의 제조

항원으로서, 배열 번호 1 에 나타내는 인간 타우 단백질의 아미노산 배열의 413 번째의 Ser 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 403 번째 Thr 로부터 423 번째의 Pro 까지 상당하는 배열의 N 말단 부위에, GlyCysSerGly 를 붙인 합성 펩티드 pSer413(Im) 펩티드 (배열 번호 35) 를 사용하였다. pSer413(Im) 펩티드는 합성 후, HPLC 로 정제하고, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 와 공유 결합시켰다. 얻어진 콘쥬게이트는 마우스 1 마리에 대해 0.04 ㎎ 을 1 회분 면역에 사용하였다. 면역은 콘쥬게이트 용액 0.4 ㎖ (펩티드 환산으로 1.1 ㎎/㎖) 와 Saline 0.7 ㎖ 및 1.1 ㎖ 의 프로인트의 컴플리트 애주번트를 혼합하고, 200 ㎕ 씩 10 마리에 복강내 주사함으로써 실시하였다. 동일한 면역 (면역 지점, 항원량은 동일하고, 프로인트의 인컴플리트 애주번트를 사용하였다) 을 2 주간 간격으로, 추가로 3 회 실시하였다. 10 마리 중, 항원에 대한 혈청 항체가가 유일하게 상승한 1 마리에 대해, 마지막 면역으로부터 1 개월 후에, 펩티드 환산으로 0.5 ㎎/㎖ 의 항원 용액 (Saline 에 용해) 100 ㎕ 를 꼬리 정맥내 주사하고, 3 일 후에 동물을 도살하여 비장을 채취하였다. 18 G 주사바늘 2 개를 사용하여 비장을 잘라 푼 후, 고무 마개면으로 잘라 푼 비장을 부드럽게 으깨었다. 으깬 비 (脾) 세포는, 냉 (冷) RPMI1640 배지 10 ㎖ 정도에서 현탁하고, 그 상청액을 40 ㎛ 셀 스트레이너로 여과하고, 여과액을 50 ㎖ 원심관에 채취하였다. 비장 세포의 Debris 를 또한 고무마개면으로 으깨고, 냉 RPMI1640 배지에서 동일하게 현탁, 여과하여, 여과액을 채취하였다. 최종적으로 비장 세포 현탁액을 40 ㎖ 가 되도록 냉 RPMI1640 배지 (또는 냉 PBS) 를 첨가하였다. 혈구 계산반으로 현탁액 중의 임파구 농도를 측정하고, 최종적으로 2 × 10⁷ Cells 에 상당하는 임파구를 50 ㎖ 의 원심 튜브로 옮겼다. 여기에, 배양액 B (RPMI1640 ＋ 10 ％ 우태아혈청 ＋ 2 mM 글루타민 ＋ 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 ＋ 100 단위/㎖ 페니실린) 에서 배양해 둔 4 × 10⁷ Cells 에 상당하는 대수 증식기의 마우스·마이엘로마 세포 P3X63Ag8·U1 주 (P3·U1 로 약기한다) 를 첨가하고, 1500 rpm 으로 5 분간 원심하고, 상청액을 버렸다. 세포 펠릿을 시험관을 두드림으로써 잘 분산시켰다. 이것에 0.5 ㎖ 의 폴리에틸렌글리콜액 (RPMI1640 (2.3 ㎖) ＋ 폴리에틸렌글리콜 2000 (1.4 ㎖) ＋ 디메틸술폭사이드 (0.3 ㎖) 로 구성：이하 「PEG 액」 으로 약기한다) 를 첨가하여, 세포를 부드럽게 부유시켰다. 1 분 후에 0.5 ㎖ 의 PEG 액을 1 분 걸쳐 천천히 적하하고, 추가로 1.0 ㎖ 의 RPMI1640 을 1 분 걸쳐 천천히 적하하고, 추가로 RPMI1640 을 2 ㎖, 2 분 걸쳐 천천히 적하하였다. 그 후, 4 ㎖ 의 HAT/GIT 배양액 (GIT 배지 [니혼 제약] ＋ 5 ％ 우태아혈청 ＋ 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 ＋ 100 단위/㎖ 페니실린 ＋ 95 μM 하이포잔틴 ＋ 0.4 μM 아미노프테린 ＋ 16 μM 티미딘) 을 2 분 걸쳐 적하하고, 추가로 4 ㎖ 의 HAT/GIT 배양액을 2 분 걸쳐 적하하였다. 마지막으로, HAT/GIT 배양액을 첨가하고 40 - 50 ㎖ 의 세포 부유액으로 하였다. 37 ℃, 30 분간 항온조에서 인큐베이션한 후, 이것을 배양 플레이트 (96 구멍) 7 매에 뿌렸다. 또한, 배양 플레이트로서, 마우스 (ICR 계) 의 복강 매크로파지 (피더 세포) 를 수일 간 배양한 (＞ 1 × 10⁵/well) 96 well 플레이트 (피더 플레이트) 를 사용하였다. 그 후, 이 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO₂ 하에서 7 ∼ 10 일간 배양하였다.

1 주일마다 절반량의 배양액을 새로운 HT 배양액 (HAT/GIT 배양액에서 아미노프테린을 제거한 것) 으로 교환해 나가, 하이브리도마를 얻었다.

항체의 스크리닝은 이하의 방법에 따랐다. pSer413(L) 펩티드를 PBS 로 1 ㎍/㎖ 에 희석 후, 96 well 플레이트에 50 ㎕/well 로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 용액을 제거 후, 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA-PBS) 를 250 ㎕/well 로 분주하고, 실온에서 1 시간 이상 방치하였다. 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA-PBS) 를 흡인하고, 하이브리도마의 상청액을 30 ∼ 50 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 0.05 ％ Tween20 을 함유하는 인산 완충 생리 식염수 (PBS-Tween) 로 세정 후, 2 차 항체 (블로킹 버퍼에 2000 배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 염소 항마우스 IgG-Fc 항체 [SouthernBiotech 사] 를 첨가한 용액) 를 100 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 세정 후, 기질 용액 (2.5 mM MgCl₂ 함유 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8 에 0.7 ∼ 1.2 ㎎/㎖ PNPP [파라니트로·페닐포스페이트] 를 첨가한 용액) 100 ㎕/well 을 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 발색시킨 후, 측정 파장 405 ㎚ 로 흡광도를 측정하였다.

이 스크리닝에서, 양성을 나타낸 well 로부터 세포를 취출하고, 혈구 계산반으로 세포수를 센 후, 1 ∼ 3 개/well 로 96 well 플레이트 (앞의 피더 플레이트) 에 뿌리고, 한계 희석법에 의한 클로닝을 실시하였다 (Ta1501, Ta1502, Ta1505 ∼ 1509). 이후의 해석용으로, 클론을 대량 배양 후, 프로테인 G 칼럼으로 항체를 정제하였다. Ta1505 는 Ta1505-2 와 동일하다. 아이소 타입의 결정은 AbD serotec 사의 키트를 사용하여 실시하였다.

정제한 항체를 타우의 다양한 인산화 부위에 대한 부분 펩티드를 코팅한 ELISA 플레이트에 반응시키고, 인산기 특이성을 조사하였다. 방법은 이하에 따랐다.

각종 타우 펩티드 (pS46 [배열 번호 36], pS199 [배열 번호 37], pS202 [배열 번호 38], pT212 [배열 번호 39], pS214 [배열 번호 40], pT212/pS214 [배열 번호 41], pT217 [배열 번호 42], pS413 [배열 번호 33], non pS413 [배열 번호 34]) 의 10 ％ DMSO 용액 혹은 펩티드를 BSA 콘쥬게이트한 것 (pS400 [배열 번호 43]-BSA, pS412 [배열 번호 44]-BSA) 의 PBS 용액을 PBS (pH 7) 로 1 ㎍/㎖ 에 희석하여 50 ㎕/well 로 96 well 플레이트 (MaxiSorp：Nunc 사) 에 첨가하고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이트하고 고정화하였다. 그 후, 펩티드 용액을 제거하여 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 TBS 로 3 회 세정 후, 3 ％ BSA/PBS 를 280 ㎕/well 로 첨가하고, 37 ℃, 1 시간 블로킹을 실시하였다.

블로킹액을 흡인 제거하여, 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 TBS 로 3 회 세정 후, 각종 Ta15 시리즈의 모노클로날 항체 용액 1 ㎍/㎖ in 3 ％ BSA-PBS 를 50 ㎕/well 로 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 TBS 로 3 회 세정 후, 3 ％ BSA 를 포함하는 PBS 로 2000 배로 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 염소 항마우스 IgG 항체 (Thermo Science 사) 를 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 TBS 로 3 회 세정 후, 0.1 M 의 디에탄올아민 (pH 10) 에 녹인 1 ㎎/㎖ PNPP (파라니트로·페닐포스페이트) 용액을 100 ㎕ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시키고, 405 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 각 항체의 각종 펩티드에 대한 반응성 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 반응성은 3 단계로 나누어 평가하였다. ＋：반응성 있음, －：반응성 없음, ±：약간의 반응성이 확인되지만 매우 약함

이들 항체 (이후, 「Ta15 시리즈」 라고 칭한다) 는, 검토한 펩티드 중, pSer413 에만 반응하고, 매우 인산기 특이성이 높았다.

[실시예 3] Ta15 시리즈 항체의 결합 친화성 측정

Ta15 시리즈 항체와 항원 펩티드 (pSer413 펩티드 (Im)：실시예 2 참조) 의 결합 친화성을 평가하기 위해서, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 비아코어 (GE 헬스케어·재팬 주식회사, BIACORE3000, code＃ BR-1100-45) 및 각 비아코어 제품을 사용하고, 취급 설명서에 준거하여 측정하였다. 측정의 하나의 방법은 CM5 칩 (카르복시메틸 덱스트란층 형성이 끝난 칩, code＃ BR-1100-14) 에 항마우스 항체 (code＃ BR-1008-38) 를 아민 커플링 반응에 의한 공유 결합에 의해 고정화 (code＃ BR-1006-33) 하고, 고정화된 항마우스 항체에 Ta15 시리즈 항체를 결합하고, 결합한 Ta15 시리즈 항체에 대해, 항원 펩티드의 결합 동태를 측정하는 방법이었다.

특이적 결합의 반응 용액을 HBS-EP 완충액 (code＃ BR-T-1001-88) 으로 하고, CM5 칩을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 의 혼합 용액에 의해 활성화시켰다. 항마우스 항체를 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0 에 의해 0.001 ㎎/㎖ 에 희석한 용액을 칩 상의 4 개의 플로우 셀에 반응시키고, 항마우스 항체를 CM5 칩에 공유 결합시킨 후, 에탄올아민으로 블로킹하였다. 항마우스 항체를 고정한 4 개의 플로우 셀 중, 하나에는 음성 항체 (마우스 IgG2a 아이소 타입 컨트롤, R＆D Systems 사, code＃ MAB003) 를, 그 밖의 플로우 셀에는 Ta15 시리즈 항체를, 각 1000 RU 정도의 밀도로 포착하였다. 1 M NaCl 을 부가한 HBS-EP 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 ％ v/v Surfactant P20) 을 3 분간 반응시켜, 비특이적으로 흡착한 항체를 제거하고, HBS-EP 완충액을 유속 50 ㎕/분으로 10 분간 반응시켜, 베이스라인을 안정되게 하였다. 펩티드를 HBS-EP 완충액을 사용하여, 100 pM 내지 5 mM 농도의 사이 (개산 결합 해리 상수 [KD] 근방) 에서 단계 희석하고, 얻어진 펩티드 용액 (5 농도) 을 저농도측으로부터 연속적으로 각 6 분의 간격을 두고 4 분간 ∼ 6 분간 (일률) 반응시켜, 결합 동태를 측정하였다.

항원 펩티드의 특이적 결합 동태 데이터로서, 조작에 의해 발생하는 노이즈의 영향을 제거하기 위해서, 음성 펩티드로서 비인산화 펩티드 (non pSer413 펩티드) 에 의한 결합 동태 데이터를 얻어, 항원 펩티드의 결합 동태 데이터에서 뺐다. 또한, 측정 농도에 있어서, 비인산화 펩티드의 항체로의 결합은 확인되지 않는다. 특이적 결합 동태 데이터를 비아코어 해석 소프트 (BIAevaluation：싱글 사이클 키네틱스 해석, code# AP-4000-01) 를 이용하여, Single cycle kinetics 1:1 binding with drift model 로 적합시켜, 동역학적 회합 속도 (Ka) 및 해리 속도 (Kd) 를 동시에 얻었다 (Karlsson. R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006). “Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.” Anal. Biochem. 349 (1) : 136-47). Ta15 시리즈 항체의 친화성 측정값인 평형 해리 상수 (KD) 값은 Kd/Ka 로부터 산출하였다.

＜결과＞

Ta15 시리즈 항체 중, 항원 펩티드에 대한 친화성이 가장 강한 Ta1505 항체를 기억 장애 마우스를 사용한 행동 시험에 사용하였다.

[실시예 4] pSer396 및/또는 pSer404 펩티드를 인식하는 모노클로날 항체의 제조

항원으로서, 배열 번호 1 로 나타내는 인간 타우 단백질의 아미노산 배열의 396 번째, 404 번째의 Ser 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 379 번째 Arg 로부터 408 번째의 Leu 까지의 배열의 N 말단 부위에 GlyCys 를 붙인 합성 펩티드 (배열 번호 47：Biosynthesis 사에서 합성) 를 사용하였다 (이하, 그 펩티드를 pSer396/pSer404 펩티드라고 부른다).

pSer396/pSer404 펩티드：N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAla GluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C (배열 번호 47)

pSer396/pSer404 펩티드는 합성 후, HPLC 로 정제하고, Maleimide activated KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) (Thermo Scientific 사) 와 공유 결합시킨 얻어진 콘쥬게이트는 Balb/c 마우스 1 마리에 대해 약 0.04 ㎎ 을 1 회분의 면역에 사용하였다. 면역은 콘쥬게이트 용액 0.3 ㎖ (펩티드 환산으로 0.77 ㎎/㎖) 와 0.3 ㎖ 의 프로인트의 컴플리트 애주번트를 혼합하고, 100 ㎕ 씩 4 마리에 복강내 주사함으로써 실시하였다. 그 중 2 마리에는, 복강내 면역 (항원량은 동일하고, 프로인트의 인컴플리트 애주번트를 사용하였다) 및 발바닥 면역 (항원 ＋ Titer Max 의 애주번트를 사용하였다) 을, 나머지 2 마리에는 복강내 면역만을 각각 2 주일 간격으로 추가로 2 회 실시하였다. 항원에 대한 혈청 항체가가 높았던, 복강내 면역 및 발바닥 면역을 실시한 마우스에 대해, 마지막 면역으로부터 15 일 후에, 항원 용액 (Saline 에 용해) 을 꼬리 정맥내 주사하고, 3 일 후에 동물을 도살하여 비장을 채취하였다. 18 G 주사바늘 2 개를 사용하고, 비장을 잘라 푼 후, 고무마개면으로 잘라 푼 비장을 부드럽게 으깨었다. 으깬 비세포는 냉 RPMI1640 배지 10 ㎖ 정도에서 현탁하고, 그 상청액을 40 ㎛ 셀 스트레이너로 여과하고, 여과액을 50 ㎖ 원심관에 채취하였다. 비장 세포의 Debris 를 또한 고무마개면으로 으깨고, 냉 RPMI1640 배지에서 동일하게 현탁, 여과하고, 여과액을 채취하였다. 최종적으로 비장 세포 현탁액을 40 ㎖ 가 되도록, 냉 RPMI1640 배지 (또는 냉 PBS) 를 첨가하였다. 혈구 계산반으로, 현탁액 중의 임파구 농도를 측정하고, 최종적으로 2 × 10⁷ Cells 에 상당하는 임파구를 50 ㎖ 의 원심 튜브로 옮겼다. 여기에, 배양액 B (RPMI1640 ＋ 10 ％ 우태아혈청 ＋ 2 mM 글루타민 ＋ 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 ＋ 100 단위/㎖ 페니실린) 에서 배양해 둔 4 × 10⁷ Cells 에 상당하는 대수 증식기의 마우스·마이엘로마 세포 P3·U1 을 첨가하고, 1500 rpm 으로 5 분간 원심하고, 상청액을 버렸다. 세포 펠릿을 시험관을 두드림으로써 잘 분산시켰다. 이것에 0.5 ㎖ 의 PEG 액을 첨가하여, 세포를 부드럽게 부유시켰다. 1 분 후에 0.5 ㎖ 의 PEG 액을 1 분 걸쳐 천천히 적하하고, 또한 1.0 ㎖ 의 RPMI1640 을 1 분 걸쳐 천천히 적하하고, 또한 RPMI1640 을 2 ㎖, 2 분 걸쳐 천천히 적하하였다. 그 후, 4 ㎖ 의 HAT/GIT 배양액 (GIT 배지 [니혼 제약] ＋ 5 ％ 우태아혈청 ＋ 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 ＋ 100 단위/㎖ 페니실린 ＋ 95 μM 하이포잔틴 ＋ 0.4 μM 아미노프테린 ＋ 16 μM 티미딘) 을 2 분 걸쳐 적하하고, 추가로 4 ㎖ 의 HAT/GIT 배양액을 2 분 걸쳐 적하하였다. 마지막으로, HAT/GIT 배양액을 첨가하고, 40 - 50 ㎖ 의 세포 부유액으로 하였다. 37 ℃, 30 분간 항온조에서 인큐베이션한 후, 이것을 배양 플레이트 (96 well) 7 매에 뿌렸다. 또한, 배양 플레이트로서, 마우스 (ICR 계) 의 복강 매크로파지 (피더 세포) 를 수일 간 배양한 (＞ 1 × 10⁵/well) 96 well 플레이트 (피더 플레이트) 를 사용하였다. 그 후, 이 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO₂ 하에서 7 ∼ 10 일간 배양하였다.

1 주일 마다 절반량의 배양액을 새로운 HT 배양액 (HAT/GIT 배양액에서 아미노프테린을 제거한 것) 으로 교환해 나가, 하이브리도마를 얻었다.

모노클로날 항체의 스크리닝은 이하와 같이 실시하였다. 스크리닝용 항원으로서, pSer396/pSer404 펩티드 (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGly AlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C) (배열 번호 47) 의 N 단의 Cys 에 BSA 를 콘쥬게이트한 pSer396/pSer404 펩티드-BSA, 및 비인산화 펩티드 (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSer ProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeu-C) (배열 번호 48) 의 N 단의 Cys 에 BSA 를 콘쥬게이트한 비인산화 펩티드-BSA 를 사용하였다. 비인산화 펩티드-BSA 혹은 pSer396/pSer404 펩티드-BSA 를 PBS 로 1 ㎍/㎖ 에 희석 후, 96 well 플레이트에 50 ㎕/well 로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 용액을 제거 후, 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA-PBS) 를 250 ㎕/well 로 분주하고, 실온에서 1 시간 이상 방치하였다. 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA-PBS) 를 흡인하고, 하이브리도마의 상청액을 30 ∼ 50 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 0.05 ％ Tween20 을 함유하는 인산 완충 생리 식염수 (PBS-Tween) 로 세정 후, 검출용 시약 (블로킹 버퍼에 2,000 배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 Protein A 를 첨가한 용액) 을 100 ㎕/well 로 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 세정 후, 기질 용액 (2.5 mM MgCl₂ 함유 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8 에 0.7 ∼ 1.2 ㎎/㎖ PNPP [파라니트로·페닐포스페이트] 를 첨가한 용액) 100 ㎕/well 을 첨가하고, 25 ℃ 에서 60 분간 발색시킨 후, 측정 파장 405 ㎚ 로 흡광도를 측정하였다.

비인산화 펩티드-BSA 에 반응성이 낮고, pSer396/pSer404 펩티드-BSA 에 반응성이 높은 well 로부터 세포를 취출하고, 1 - 3 세포/well 로 96 well 플레이트 (앞의 피더 플레이트) 에 뿌리고, 한계 희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 그 중에서, Ta9 항체 (IgG3/κ) 를 산생하는 클론을 선별하였다. 이후의 해석용으로, 클론을 대량 배양 후, 프로테인 G 칼럼으로 항체를 정제하였다.

Ta9 항체의 pSer396/pSer404 펩티드에 대한 KD 값을 실시예 3 에 기재한 방법에 준하여 측정한 결과, 1.08 × 10^-10 이고, 펩티드에 대한 친화성은 Ta15 시리즈 항체보다 높았다.

[실시예 5] 행동 시험 취득 항체의 기억 학습 장애 마우스에 미치는 영향

이하 3 종류의 항체 투여가 기억 학습 장애 마우스 (Tau-Tg) 에 미치는 영향을 조사하였다.

(1) pSer413 인식 토끼 폴리클로날 항체：Tau-Tg (line 609) 마우스 혹은 non-Tg 마우스 (정상 컨트롤) 9 - 11 개월령을 사용, n = 9 - 10/군

(2) Ta1505 (pSer413 인식 모노클로날 항체)：Tau-Tg (line 784) 마우스 혹은 non-Tg 마우스 14 개월령을 사용, n = 9 - 10/군

(3) Ta9 (pSer396 인식 모노클로날 항체), Tau-Tg (line 609) 마우스 혹은 non-Tg 마우스 14 개월령을 사용, n = 9 - 10/군

실험에는 9 - 14 개월령의 수컷의 헤테로 변이 Tau-Tg 마우스 (line 609 또는 line 784), 및 그 non-Tg littermates 를 사용하였다. 그룹 사이에서 평균 체중에 차가 없도록 그룹을 나누었다. 헤테로 변이 Tau-Tg 마우스에 대해, PBS 또는 시트르산 완충액 (pH 5) 으로 희석된 항체를 1 주일에 1 회, 합계 5 회, 매회 1 마리당 1 ㎎ 을 복강에 투여하였다. 음성 대조군으로서, 항체를 조제할 때에 사용한 완충액 혹은 타우에 반응성을 갖지 않는 마우스 IgG 모노클로날 항체를 동 용량, 복강에 투여하였다. 양성 대조로서, non-Tg littermates 에 대해, 항체를 조제할 때에 사용한 완충액을 동 용량, 복강에 투여하였다.

(1) ∼ (3) 의 군 구성을 이하에 나타낸다.

(1) ＜사용 마우스＞：변이 Tau-Tg (line 609), 9 - 11 mo (9 - 11 개월령)

＜군 구성＞

평가 항체군：Anti-tau pSer413 토끼 폴리클로날 항체

1.6 ㎎/㎖ in PBS (n = 10)

Control 항체군：PBS (n = 9)

non-Tg 군：PBS (n = 9)

(2) ＜사용 마우스＞：변이 Tau-Tg (line 784), 14 mo (14 개월령)

＜군 구성＞

평가 항체군：Anti-tau pSer413 마우스 모노클로날 항체

Ta1505 in 0.1 M citrate buffer (pH 5) 3.84 ㎎/㎖ (n = 10)

Control 항체군：Anti-Pseudomonas Aeruginosa 마우스 모노클로날 항체 4 C10F4 in 0.1 M citrate buffer (pH 5) 4.28 ㎎/㎖ (n = 9)

non-Tg 군：0.1 M citrate buffer (pH 5) (n = 9)

(3) ＜사용 마우스＞：변이 Tau-Tg (line 609), 14 mo (14 개월령)

＜군 구성＞

평가 항체군：Anti-tau pSer396 마우스 모노클로날 항체

Ta9 in 0.02 M citrate buffer (pH 6) (n = 10) 2.66 ㎎/㎖

Control 항체군：Anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibody 6F11 in 0.02 M citrate buffer (pH 6) (n = 9) 4.50 ㎎/㎖

non-Tg 군：0.02 M citrate buffer (pH 6) (n = 9)

최종 투여의 다음주 월요일부터 모리스 수미로를 이용하여 공간 참조 기억 (spatial reference memory) 시험을 실시하였다 (수미로 시험). 수미로 시험 종료 다음날부터 오픈 필드 장치를 사용하여 마우스의 자발 운동량을 측정하였다 (Open Field 시험).

＜수미로 시험；(1) ∼ (3) 공통＞

준비：내경 100 ㎝, 높이 45 ㎝ 의 흑색 풀 내에 16 ㎝ 깊이의 물을 채웠다. 수온 21 ∼ 23 도로 조정하고, 산화티탄 등에 의한 착색은 실시하지 않고 무색 투명하게 유지하였다. 염소 첨가도 실시하지 않고, 매 trial day 후에 분비물 배제와, 물 교체를 약 10 ℓ 씩 실시하였다. Trial (획득) 시험：15 ㎝ 높이의 투명한 플랫폼을 벽으로부터 20 ㎝ (중심으로부터 30 ㎝) 의 위치에 가라앉혔다. 플랫폼을 가라앉힌 장소를 포함하여 4 상한 (象限) 으로 나누고, 마우스는 플랫폼이 없는 3 상한 중 어느 것으로부터만 랜덤하게 투입하였다. 1 시행 60 초를 한도로 하여, 5 시행/일로 실시하였다. 1 시행의 간격은 약 5 분. 플랫폼에 다다를 때까지의 escape time 을 데이터로서 기록하였다. 60 초 이내에 도피하지 않는 마우스에 대해서는, 오퍼레이터의 손에 의해 플랫폼으로 유도하고, escape time 은 60 초로서 처리하였다. 플랫폼 상의 마우스는 10 초 후에 풀로부터 제거하고, 다음 시행까지 자유롭게 행동시켜, 몸을 건조시켰다. 날마다의 마우스의 성적에는, 5 시행의 escape time 의 평균 초 수를 사용하였다.

Control 군 (non Tg) 의 성적이 안정된 시점에서 획득 시험을 종료하고, 다음날 probe 시험을 실시하였다.

Probe 시험：최종일의 다음날, 플랫폼을 풀로부터 제거하고, 60 초간의 자유 유영을 비디오 카메라로 촬영하였다. 촬영된 비디오를 관찰하고, 자유 유영 중의 마우스가 4 상한 중, 플랫폼이 존재한 상한 (target quadrant) 내를 헤엄치고 있는 시간을 측정하고, 60 초간에 있어서의 퍼센티지로 나타내었다. 이 때, 풀 투입 후 30 초까지의 헤엄에 대해서도 동일하게 해석하였다.

Trial (획득) 시험의 유의차 검정은 repeated measure, Fisher's PLSD, Probe test 의 유의차 검정은 Fisher's PLSD 에 의해 실시하였다.

＜Open Field 시험；(1) ∼ (3) 공통＞

장치：5 ㎜ 두께의 투명 아크릴판을 사용하여 30 × 30 × 30 ㎝ 의 정방형의 상자를 제조하고, 방음 환경에 격납하였다. 격납 환경 상부에는 40 w 의 백열등을 설치하고, 플로어면을 조도 110 lux 로 비추었다.

행동량：(i) 아크릴 상자의 측면 외측, 플로어면으로부터 1.5 ㎝ 의 위치에, 적외선 빔을 10 ㎝ 간격으로 설치하였다. 마우스가 2 개의 빔을 연속해서 차단했을 때에, locomotion 으로서 검출하고, 카운트하였다.

(ii) 마주 보는 2 측면의, 플로어면으로부터 3.5 ㎝ 의 위치에 적외선 빔면을 형성하였다. 마우스가 빔면의 일부를 차단했을 때에, rearing 으로서 검출하고 카운트하였다.

시험：마우스에는 20 분간의 세션을 1 회 부여하였다. 마우스를 아크릴 상자 중앙부에 투입하고, 신속하게 문을 닫고 방음 환경으로 한 다음에, 세션을 개시하였다.

세션의 전반 10 분은 명조건에서의 자유 행동, 후반 10 분은 조명을 끄고 암조건에서의 자유 행동을 측정하였다.

해석：마우스의 1 분 마다의 행동량을 locomotion, rearing 각각에 대해 꺾은선 그래프로 나타낸다.

세션 개시부터 10 분 후의 암조건으로의 환경 변화에 반응하여, 마우스의 행동량에 변화가 나타나 있는 것을 확인할 수 있었던 경우, 시각은 정상이었다고 정의한다.

명조건, 암조건 각각의 총 행동량, 및 20 분간의 총 행동량을 막대 그래프로 나타내었다.

Locomotion, rearing 의 총 행동량에 대해 군간의 유의차 검정을 실시하였다.

Locomotion 은 주로 자발 행동량, rearing 은 주로 탐사 행동량이라고 해석되지만, 실제로는 양방의 지표가 서로 영향을 준다 (예：locomotion 이 저하되어 있는 것처럼 보여도, 그 시간에는 실제로는 rearing 이 상승하고 있으면, 행동량이 저하되어 있다고는 말할 수 없다).

＜면역 조직 화학 시험；(2) 만 실시＞

행동 시험 종료 후, 각 그룹으로부터 5 마리씩 선택하여, 포르말린으로 환류 고정하였다. 파라핀 포매 후, 뇌로부터 박절 절편을 마이크로톰으로 작성하고, 자일렌, 에탄올로 각 10 분간, 4 회 처리하고, 탈파라핀 처리하였다. 시트르산 버퍼 (pH 6) 로 30 분간 자비 처리하고 (항원 부활화 처리), 실온으로 되돌린 후, 트리스 완충 생리 식염수 (TS) 로 10 분간, 2 회 세정하였다. 20 ％ 우혈청 함유 TS 로 실온, 60 분간 블로킹 후, 마우스 항인간 시냅토파이신 항체 (SIGMA 사 SVP-38 을 10 ％ 우혈청 함유 TS 로 200 배 희석한 것) 를 마운트하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 처리하였다. TS 로 10 분간, 2 회 세정한 후, FITC 표지 항마우스 IgG 항체 (VECTOR 사의 당해 항체를 10 ％ 우혈청 함유 TS 로 20 배 희석한 것) 를 마운트하고, 실온에서 60 분간 처리하였다. TS 로 10 분간, 2 회 세정한 후, VECTASHIELD (VECTOR 사) 를 마운트하고, 현미경 관찰하였다. 형광 강도를 NIH image J 로 정량·수치화하고, arbitrary unit 으로 나타내었다.

＜결과＞

1. 각 항체의 투여에 의한 기억 장애로의 영향

(1) pSer413 토끼 폴리클로날 항체

(1-1) ∼ (1-3) 의 결과를 도 4 ∼ 도 7 에 나타낸다. 종합하면, 항 pSer413 폴리클로날 항체의 수동 면역에 의해, 모델 마우스 (Tau-Tg) 에서의 기억 장애가 non-Tg 와 동 레벨에까지 현저하게 개선되었다. 또한, (1-3) 에서는, 각 군간의 자발 운동·시각에 유의차는 발견되지 않았다.

(2) pSer413 마우스 모노클로날 항체 (1505 항체) (2-1) ∼ (2-3) 의 결과를 도 8 ∼ 도 11 에 나타낸다. 종합하면, 항 pSer413 모노클로날 항체의 수동 면역에 의해, 모델 마우스에서의 기억 장애가 non Tg 와 동 레벨에까지 현저하게 개선되었다. 또한, (2-3) 에서는, 각 군간의 자발 운동·시각에 유의차는 발견되지 않았다.

(2-1) 및 (2-2) 의 결과로부터, pSer413 에피토프는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것에 대해서도, 수동 면역 요법의 표적으로서 양호한 에피토프인 것으로 생각되었다.

(3) pSer396 마우스 모노클로날 항체 (Ta9 항체)

(3-1) ∼ (3-3) 의 결과를 도 12 ∼ 도 15 에 나타낸다. 종합하면, Ta9 투여에 의해 기억 장애가 유의하게, non-Tg 와 동일한 레벨에까지 개선되었다. 또한, (3-3) 에서는, 각 군간의 자발 운동·시각에 유의차는 발견되지 않았다.

그러나, Ta9 는 Ta1505 에 비하면, 약효가 약하였다. 항원 친화성은 Ta9 ＞ Ta1505 임 (실시예 2, 3 참조) 에도 불구하고, 약효는 Ta9 ＜ Ta1505 이기 (실시예 5) 때문에, 인산화 에피토프의 차이에 의한 약효의 차이가 시사되었다.

[실시예 6] Ta1505 항체 투여에 의한 신경 기능으로의 영향

신경 기능을 반영하는 마커로서 알려져 있는 시냅토파이신 양에 미치는 Ta1505 항체 투여의 영향을 기억의 중추인 해마 CA3 영역의 항시냅토파이신 항체의 면역 염색에 의해 조사하였다. 형광 강도는 NIH-Image J 로 정량화하였다.

결과를 도 16 에 나타낸다. Ta1505 항체 투여에 의해, 유의하지는 않지만, 해마 시냅토파이신 양의 회복이 보였다.

[실시예 7] Ta15 시리즈 모노클로날 항체 cDNA 의 염기 배열 결정

(1) 하이브리도마 전체 RNA 의 정제

각종 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 배양하고, 6 웰 플레이트의 1 well 당 1 ㎖ 의 ISOGEN 을 사용하여, 세포를 용해하였다. 이 용해액에 0.2 ㎖ 의 클로로포름을 첨가하고, 보텍스로 혼화하고, 실온에서 2 ∼ 3 분간 방치하였다. 12000 rpm 으로 10 분간 4 ℃ 에서 원심하고, 상층을 새로운 튜브로 옮겼다. 이것에 0.5 ㎖ 의 이소프로필알코올을 첨가하여 혼합하고, 실온에서 10 분간 방치하였다. 이것을 15000 rpm, 4 ℃ 에서 15 분간 원심하여 전체 RNA 를 침전시켰다. 펠릿에 75 ％ 에탄올을 1 ㎖ 첨가하고, 잘 혼화한 후, 10000 rpm, 5 분간 4 ℃ 에서 원심하였다. 펠릿을 바람 건조시키고, DNase, RNase 프리의 물에 용해하고, －80 ℃ 에서 보존하였다.

(2) 5'-RACE, 3'-RACE 에 의한 H 사슬, L 사슬 cDNA 의 취득 및 그 cDNA 의 염기 배열 결정

이미 알려진 마우스 IgG2a 및 IgG2b 의 H 사슬의 Constant 영역의 cDNA 배열을 기초로 5'-RACE (Rapid Amplified of cDNA Ends) 및 3'-RACE 용의 프라이머를 합성하였다. 마찬가지로, 마우스 L 사슬의 Constant 영역의 cDNA 배열을 기초로 5'-RACE (Rapid Amplified of cDNA Ends) 및 3'-RACE 용의 프라이머를 합성하였다.

한편, 하이브리도마로부터 채취한 Total RNA 를 1 ㎍ 사용하고, SMART-RACE Kit (Clonetech 사 제조) 를 사용하여, 5'-RACE, 3'-RACE 용 cDNA 의 합성을 실시하고, 5'-RACE 및 3'-RACE 를 실시하였다. PCR 반응은 AD vantage 2 Polymerase Mix (Clonetech 사 제조) 를 사용하고, 첨부한 프로토콜에 따라 실시하였다. 5'-RACE, 3'-RACE 에 의해 얻어진 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동하고, 메인의 증폭 DNA 프래그먼트를 아가로오스 겔로부터 잘라내어, TA 클로닝 벡터 (Invitrogen 사 제조) 에 삽입하고, 대장균으로 형질 전환하여 각각 수 클론을 얻었다. 이들 형질 전환체로부터 플라스미드를 정법에 따라 조제하고, 삽입 DNA 프래그먼트의 염기 배열을 결정하였다.

(3) H 사슬, L 사슬 전체 길이 cDNA 의 취득 및 그 cDNA 의 염기 배열 결정

염기 배열 정보를 기초로, H 사슬 및 L 사슬의 N 말단, 및 C 말단을 코드하는 cDNA 배열을 결정하여, 전체 길이의 배열을 증폭하기 위한 Forward 및 Reverse Primer 를 설계하였다. 이 Primer 를 사용하여, Prime STAR MaxPCR (TaKaRa 사 제조) 에 의해 H 사슬, L 사슬의 전체 길이를 증폭하고, 그 PCR 프래그먼트를 pEF4 벡터에 클로닝하였다. 이것을 사용하여, 전체 길이의 cDNA 의 배열을 최종적으로 결정하였다.

얻어진 염기 배열 정보로부터, 아미노산 배열로 번역하고, 또한 IgBLAST (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 를 사용하여, KABAT 의 방법 (Kabat, E. A. and Wu, T. T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991년) 으로 CDR 영역의 동정을 실시하였다.

얻어진 CDR 영역의 배열을 배열 번호 14 ∼ 에 나타내었다.

이들 배열의 상동성으로부터, pSer413 을 특이적으로 인식하기 위한 항체의 CDR 배열에 관한 정보를 얻었다 (표 4 ∼ 표 6).

[실시예 8] 행동 시험 취득 항체의 기억 학습 장애 마우스에 미치는 영향

이하의 2 항체의 투여가 기억 학습 장애 마우스에 미치는 영향을 0.1 ㎎ 투여에 있어서 조사하였다.

(4) Ta1505 (pSer413 인식 모노클로날 항체)：Tau Tg (line 784) 마우스 혹은 non-Tg 마우스 10 개월령을 사용, n = 9 - 10/군

(5) Ta9 (pSer396 인식 모노클로날 항체), Tau Tg (line 784) 마우스 혹은 non-Tg 마우스 11 개월령을 사용, n = 8 - 10/군

실험에는 10 - 11 개월령의 수컷의 헤테로 변이 Tau-Tg 마우스 (line 784), 및 그 non-Tg littermates 를 사용하였다. 그룹 사이에서 평균 체중에 차가 없도록 그룹을 나누었다. 헤테로 변이 Tau-Tg 마우스에 대해, PBS 로 희석된 항체를 1 주일에 1 회, 합계 5 회, 매회 1 마리당 0.1 ㎎ 을 복강에 투여하였다. 음성 대조군으로서, 항체를 조제할 때에 사용한 PBS 혹은 타우에 반응성을 갖지 않는 마우스 IgG 모노클로날 항체를 동 용량, 복강에 투여하였다. 양성 대조로서, non-Tg littermates 에 대해, 항체를 조제할 때에 사용한 PBS 를 동 용량, 복강에 투여하였다.

(4) ∼ (5) 의 군 구성을 이하에 나타낸다.

(4) ＜사용 마우스＞：변이 Tau-Tg (line 784), 10 mo

＜군 구성＞

평가 항체군：Anti-tau pSer413 마우스 모노클로날 항체

Ta1505 in PBS 0.25 ㎎/㎖ (n = 10)

Control 항체군：Anti-Pseudomonas Aeruginosa 마우스 모노클로날 항체 4 C10F4 in PBS 0.25 ㎎/㎖ (n = 10)

non-Tg 군：PBS (n = 9)

(5) ＜사용 마우스＞：변이 Tau-Tg (line 784), 11 mo

＜군 구성＞

평가 항체군：Anti-tau pSer396 마우스 모노클로날 항체

Ta9 in PBS (n = 10) 0.25 ㎎/㎖

Control 항체군：Anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibody 6F11 in PBS (n = 8) 0.25 ㎎/㎖ non-Tg 군：PBS (n = 8)

최종 투여의 다음주 월요일부터 모리스 수미로를 이용하여 공간 참조 기억 (spatial reference memory) 시험을 실시하였다 (수미로 시험). 수미로 시험은 실시예 5 와 동일하게 실시하였다.

＜결과＞

1. 각 항체의 투여에 의한 기억 장애에 대한 영향

(4) pSer413 마우스 모노클로날 항체 (1505 항체)

Trial 시험 (4-1), Probe 시험 (4-2) 의 결과를 도 18 및 도 19 에 나타낸다. 종합하면, 항 pSer413 모노클로날 항체의 수동 면역에 의해, 모델 마우스에서의 기억 장애가 non Tg 와 비교하여 50 ％ 이상의 레벨로 개선되었다.

(4-1) 및 (4-2) 의 결과로부터, pSer413 에피토프 모노크로날 항체의 약효가 0.1 ㎎ 투여에 있어서도 확인되었다.

(5) pSer396 마우스 모노클로날 항체 (Ta9 항체)

Trial 시험 (5-1), Probe 시험 (5-2) 의 결과를 도 20 및 도 21 에 나타낸다. 종합하면, Ta9 투여에 있어서는 0.1 ㎎ 투여에 있어서 기억 장애는 개선되지 않았다.

이들 시험으로부터, 인산화 에피토프의 차이에 의한 약효의 차이가 0.1 ㎎ 투여에 있어서 더욱 명확하게 시사되었다.

또한, 마우스 1 마리당 0.1 ㎎ 의 항체 투여는 약 2.5 ㎎/㎏ 용량의 투여에 상당한다.

[실시예 9] Ta1505 항체 투여에 의한 뇌내 인산화 Tau 량의 변화

Tau-Tg 마우스의 뇌내에 있어서의 인산화 Tau 의 양에 미치는 Ta1505 항체 투여의 영향을 기억의 중추인 해마 영역에 관해서, pSer413 인식 Ta1505 항체 및 AT8 항체 (PHF 인식 pSer202/pThr205 에피토프) 의 면역 조직 염색에 의해 조사하였다.

행동 시험 종료 후, 각 그룹으로부터 5 마리씩 선택하여, 4 ％ 파라포름알데히드/PBS 로 환류 고정하였다. 뇌를 취출하여 파라핀 포매하고, 5 ㎛ 박절 절편을 마이크로톰으로 작성하였다. 자일렌 및 에탄올로 각 10 분간, 4 회 처리하고, 탈파라핀 처리하고, 절편을 pH 2 에서 실온 10 분간 자비 처리 (항원 부활화 처리) 하였다. 실온으로 되돌린 후, 트리스 완충 생리 식염수 (TS) 로 10 분간 2 회 세정하였다. 20 ％ 우혈청 함유 TS 로 실온, 60 분간 블로킹하였다.

10 ％ 우혈청 함유 TS 로 1 ug/㎖ 에 희석한 항타우 항체 (Ta1505, AT8) 를 마운트하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 처리하였다. TS 로 10 분간, 2 회 세정한 후, 10 ％ 우혈청 함유 TS 로 500 배 희석한 비오틴 표지 항마우스 항체 (VECTOR 사) 를 마운트하고, 실온에서 60 분간 처리하였다.

TS 로 10 분간, 2 회 세정한 후, HRP 표지 ABC 액 (VECTOR 사) 을 마운트하고, 실온에서 30 분간 반응시키고, 다시 세정 후, 디아미노벤지딘 (DAB) 으로 발색시켰다. 엔텔란 (Merck) 으로 봉입하고, 관찰, 촬영하였다.

Ta1505 에 의한 면역 조직 염색 결과를 도 22 ∼ 도 24 에 나타낸다.

도 22 에서는, 컨트롤 IgG 투여군 5 개체의 해마 CA3 영역 (왼쪽으로부터 1 열째) 및 해마 CA23 영역 (왼쪽으로부터 2 열째) 에 있어서 Ta1505 양성 Tau 의 염색이 확인되었지만, Ta1505 투여군 5 개체의 해마 CA3 영역 (왼쪽으로부터 3 열째) 및 해마 CA23 영역 (왼쪽으로부터 4 열째) 의 염색 레벨은 컨트롤 IgG 투여군보다 분명하게 저하되어 있는 것이 확인되었다. 이로부터 Ta1505 투여에 의해, 해마 CA3 영역 및 해마 CA23 영역에 있어서 Ta1505 양성 Tau 즉 Ser413 인산화 Tau 의 감소가 확인되었다. 더욱 상세하게는, ControlIgG 군은 갈색의 미세한 점이 모여 CA3 에서는 왼쪽에서 오른쪽으로 굵은 선상으로 염색되어 있다. CA23 에서는 오른쪽 위로부터 왼쪽 옆으로 굵은 곡선상으로 물들어 있다. Ta1505 투여군은 매우 옅은 갈색의 미세한 점이 모여 CA3 에서는 왼쪽 위로부터 오른쪽 아래로 굵은 선상으로 염색되어 있다. CA23 에서는 오른쪽 위로부터 왼쪽 옆으로 굵은 곡선상으로 물들어 있다. CA3 의 4 개체와 CA23 의 3 개체에서는 염색이 거의 확인되지 않는다.

도 23 및 24 에서는, 컨트롤 IgG 투여군 5 개체의 Cortex 영역 (Perirhinal Cortex (도 23 왼쪽으로부터 1 열째), Lateral Entrhinal Cortex (도 23 왼쪽으로부터 2 열째), Medial Entrhinal Cortex (도 23 왼쪽으로부터 3 열째)) 에 있어서 AT8 양성 Tau 의 염색이 확인되었다. (도 23 에 있어서 갈색 반점처럼 물들어 있다)

Ta1505 투여군 5 개체의 Cortex 영역 (Perirhinal Cortex (도 24 왼쪽으로부터 1 열째), Lateral Entrhinal Cortex (도 24 왼쪽으로부터 2 열째), Medial Entrhinal Cortex (도 24 왼쪽으로부터 3 열째)) 에 있어서의 염색 레벨은 컨트롤 IgG 투여군보다 분명하게 저하되어 있으며 염색은 확인되지 않는 레벨인 것이 확인되었다.

이로부터 Ta1505 투여에 의해, Cortex 영역 (Perirhinal Cortex, Lateral Entrhinal Cortex, Medial Entrhinal Cortex) 에 있어서 Ta1505 양성 Tau 즉 Ser413 인산화 Tau 의 감소가 확인되었다.

도 23 에서는, 갈색 반점상으로 물들어 있지만, 도 24 에서는, 거의 갈색 반점상의 염색을 확인할 수 없었다.

뇌내 (= 해마 CA3 영역, 해마 CA23 영역, PRh, Ent (Lateral, Medial)) 에 있어서, Ta1505 항체 투여에 의해, Ser413 인산화 Tau 량의 감소가 확인되었다.

PRh = Perirhinal Cortex

Ent = Entrhinal Cortex

AT8 에 의한 면역 조직 염색 결과를 도 25 ∼ 도 27 에 나타낸다.

도 25 에서는, 컨트롤 IgG 투여군 5 개체의 해마 CA3 영역 (왼쪽으로부터 1 열째) 및 해마 CA23 영역 (왼쪽으로부터 2 열째) 에 있어서 AT8 양성 Tau 의 염색이 확인되었지만, Ta1505 투여군 5 개체의 해마 CA3 영역 (왼쪽으로부터 3 열째) 및 해마 CA23 영역 (왼쪽으로부터 4 열째) 의 염색 레벨은 컨트롤 IgG 투여군보다 분명하게 저하되어 있는 것이 확인되었다. 이로부터 Ta1505 투여에 의해, 해마 CA3 영역 및 해마 CA23 영역에 있어서 AT8 양성 Tau 즉 Ser202/Thr205 인산화 Tau 의 감소가 확인되었다. 구체적으로는, 도 25 에서는, ControlIgG 군은 갈색의 미세한 점이 모여 CA3 에서는 왼쪽 위로부터 오른쪽 아래로 굵은 선상으로 염색되어 있다. CA23 에서는 오른쪽 위로부터 왼쪽 옆으로 굵은 곡선상으로 물들어 있다. Ta1505 투여군은 매우 옅은 갈색의 미세한 점이 모여 CA3 에서는 왼쪽 위로부터 오른쪽 아래로 굵은 선상으로 염색되어 있다. CA23 에서는 오른쪽 위로부터 왼쪽 옆으로 굵은 곡선상으로 물들어 있다.

도 26 에서는, 컨트롤 IgG 투여군 5 개체의 Cortex 영역 (Perirhinal Cortex (도 26 왼쪽으로부터 1 열째), Lateral Entrhinal Cortex (도 26 왼쪽으로부터 2 열째), Medial Entrhinal Cortex (도 26 왼쪽으로부터 3 열째)) 에 있어서 AT8 양성 Tau 의 염색이 확인되었다. (도 26 에 있어서 갈색 반점처럼 물들어 있다)

도 27 에서는, Ta1505 투여군 5 개체의 Cortex 영역 (Perirhinal Cortex (도 27 왼쪽으로부터 1 번째), Lateral Entrhinal Cortex (도 27 왼쪽으로부터 2 열째), Medial Entrhinal Cortex (도 27 왼쪽으로부터 3 열째)) 에 있어서의 염색 레벨은 컨트롤 IgG 투여군보다 분명하게 저하되어 있는 것이 확인되었다. (도 27 에 있어서 옅은 갈색 반점처럼 물들어 있다)

이로부터 Ta1505 투여에 의해, Cortex 영역 (Perirhinal Cortex, Lateral Entrhinal Cortex, Medial Entrhinal Cortex) 에 있어서 AT8 양성 Tau 즉 Ser202/Thr205 인산화 Tau 의 감소가 확인되었다. 뇌내 (= 해마 CA3 영역, 해마 CA23 영역, PRh, Ent (Lateral, Medial)) 에 있어서, Ta1505 항체 투여에 의해, AT8 인식의 Ser202/Thr205 인산화 Tau 량의 감소 경향이 확인되었다.

이 결과는 항체의 투여에 의해 뇌내에서의 병태의 개선을 나타내는 것이며, 상기 기억 장애의 개선 효과를 뒷받침하는 것이다. 또, 이 결과는 복강내에 투여한 항체가 뇌내에서 작용하는 것을 나타내고 있다.

[실시예 10] Ta1505 항체 투여에 의한 뇌내 Tau 량의 영향

PHF 를 구성하는 과인산화 Tau 를 인식하는 것으로 생각되고 있는 AT8 항체 (pSer202/pThr205 인식 마우스 모노클로날 항체, INNAX 사 제조), G2 (항인간 특이적 N 말단 영역 인식 항체：토끼 폴리클로날 항체), PHF1 (PHF 를 구성하는 과인산화 Tau 를 인식하는 것으로 생각되고 있는 pSer396/pSer404 인식 마우스 모노클로날 항체) 및 Ta1505 를 사용하여, 뇌 호모제네이트에 있어서의 Tau 및 과인산화 Tau 량에 미치는 1505 항체 투여의 영향을 항체 투여 후의 Tau-Tg 마우스 뇌 호모제네이트를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 조사하였다.

마우스 대뇌 반구 100 - 200 ㎎ 을 5 배량의 TBS (프로테아제 저해제 칵테일, 포스파타아제 저해제 칵테일을 함유) 로 소니케이션을 실시하였다. 이것을 100,000 g 으로 15 분간 4 ℃ 에서 원심 분리하여 상청액을 TBS 가용성 획분으로서 회수하였다.

또한 침전을 1 ％ sarkosyl/TBS (프로테아제 저해제 칵테일, 포스파타아제 저해제 칵테일을 함유) 에 현탁하여, 1 시간, 실온에서 인큐베이트하였다. 이것을 100,000 g 으로 15 분간, 실온에서 원심 분리하고, 상청액을 사르코실 가용성 획분으로 하였다.

이 TBS 가용성 획분, 사르코실 가용성 획분을 7 ％ Tris―Acetate Gel 에 의해 전기 영동을 실시하여 분리하고, PVDF 막에 전사를 실시하고, 1 ％ BSA/3 ％ SkimMilk/0.05 ％ Tween20/TBS 로 실온에서 밤새 블로킹을 실시하였다. 그 후, 항체 용액을 반응시키고, 2 차 항체로서 HRP 콘쥬게이트 항체를 사용하여, ECL 법으로 반응을 실시하고, LAS3000 이미지 애널라이저로 해석을 실시하여 정량화하였다.

결과를 도 28 및 도 29 에 나타낸다.

TBS 가용성 획분에 있어서는, Ta1505 항체 투여에 의해, Tau-Tg 마우스 뇌내의 인간 Tau (G2 항체로 인식) 및 과인산화 Tau (AT8 (pS202/pT205 에피토프), PHF1 (pS396/pS404 에피토프) 로 인식), pS413Tau (Ta1505 인식) 가 유의하게 감소하고 있는 것이 확인되었다.

사르코실 가용성 획분에 있어서는, Ta1505 항체 투여에 의해, Tau-Tg 마우스 뇌내의 과인산화 Tau (AT8 로 인식) 가 유의하게 감소하고 있는 것이 확인되었다.

이 결과는 항체의 투여에 의해 뇌내에서의 병태의 개선을 나타내는 것이며, 상기 기억 장애의 개선의 효과를 뒷받침하는 것이다. 또, 이 결과는 복강내에 투여한 항체가 뇌내에서 작용하는 것을 나타내고 있다.

[제조예 1] 인지 기능 장애 모델로서의 인간 정상형 타우를 발현하는 Tg 마우스 (Tau-Tg 마우스)

본 발명에서의 항체에 의한 인지 기능 개선의 약리 효과의 검토는, 인간의 정상형 타우, 특히 태생기에 있어서는 3R 형 타우만을 발현하고, 성장에 수반하여 3R 형과 4R 형 양방의 타우가 발현한다는 인간에서의 개체 발생과 동일한 발현 패턴을 나타내고, 생후 6 개월령 정도로 인지 기능 장애를 발병하는 특징을 갖는 Tg 마우스를 사용하였다. 당해 Tg 마우스는 이하와 같은 방법으로 제조하였다.

Tg 마우스 제조를 위한 유전자의 구조는, α 칼모듈린 키나아제 IIα (CaMKII) 프로모터 (8.5 kb) 의 하류에, Simian virus 40 (SV40) 의 5' 인트론, (0.3 kb), 타우 유전자 (Tau；7.3 kb), SV40 의 3' 인트론 (0.8 kb), SV40 polyA 시그널 (0.3 kb) 의 순번으로 늘어서는 형태로 구성한 도 17 에 나타내는 구조를 갖는 타우 유전자 공여 핵산을 사용하였다. 그 중에서 사용한 타우 유전자는 Yamashita T. 등 (FEBS Letter, Vol. 579, P241-244, 2005년) 에 기재된 방법과 동일하게 취득한 것이며, 인간 타우를 코드하는 cDNA 로부터 엑손 1 내지 9 에 상당하는 부분의 염기 배열, 인트론 9 의 최초 18 염기와 마지막 3 kb 의 부분의 염기 배열, 엑손 10 의 염기 배열, 인트론 10 의 최초 3 kb 와 마지막 38 염기의 부분 (단, 인트론 10 의 5' 단 방향으로부터 16 번째의 염기 시토신을 티민으로 치환하고 있다), 엑손 11 내지 13 에 상당하는 cDNA 의 염기 배열을 순번으로 포함하는 7.3 kb 의 길이의 유전자이다. 이 타우 유전자를 SV40 의 5' 인트론, 3' 인트론 및 poly (A) 시그널 배열을 갖는 벡터인 pNN265 (Choi T 등, Mol. Cell. Biol. vol. 11, pp 3070-3074, 1991년) 의 제한 효소 EcoRV 사이트에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드로부터 제한 효소 XhoI 와 NotI 로 SV40 의 5' 인트론, 타우 유전자, SV40 의 3' 인트론과 poly (A) 시그널 배열을 포함하는 DNA 단편을 잘라내고, 그 DNA 단편을 CaMKII 프로모터를 갖는 pMM403 벡터 (Mayford M 등, Cell vol. 81 pp 891-904 1995년) 에 클로닝하였다. 그리고, 얻어진 플라스미드로부터 제한 효소 SfiI 로 타우 유전자가 포함되는 도 17 에 나타낸 구조의 유전자 단편 (17.2 kb) 을 잘라 내어 아가로스 전기 영동으로 분리하고, 대응하는 겔의 부위로부터 QIAGEN (R) QIAquick Gel Extraction Kit (Cat. No. 28704) 를 사용하여 정제하였다. 얻어진 유전자 (DNA) 단편은 공지된 방법 [Hogan, B 등, “Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory (1986)] 에 따라, C57BL/6 계 마우스의 자웅을 교배시켜 얻어진 전핵기 배아에 인젝션하였다. 인젝션을 실시한 가짜 임신시킨 암컷의 C57BL 마우스의 난관에 주입하였다. 태어난 새끼 마우스에 대해 꼬리를 일부 절단하여, PCR 법에 의해 도입한 유전자가 삽입되어 있지를 확인하고, 도입한 유전자가 삽입된 암컷 또는 수컷의 마우스를 정상의 암컷 또는 수컷과 교배시킴으로써, 도입된 타우 유전자를 헤테로로 갖는 Tg 마우스로서 유지하여, 실험에 사용하였다. 또한, 실시예 중에 기재가 있는 line 609 및 line 784 라고 기재되어 있는 Tau-Tg 마우스는 동일한 방법으로 제조되어, 동등한 형질을 나타내는 마우스이다 (또는 실시예에서 line 의 기재는 삭제한다).

SEQUENCE LISTING <110> Osaka City Univercity & Teijin Pharma Limited <120> Therapeutic agents for demetia <130> AB606 <150> JP2012-124336 <151> 2012-05-31 <160> 48 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly 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Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 32 Gly Cys His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp 1 5 10 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 33 Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val 1 5 10 15 Asp <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val 1 5 10 15 Asp <210> 35 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> PHOSPHORYLATION <400> 35 Gly Cys Ser Gly Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr 1 5 10 15 Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro 20 25 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 36 Gly Leu Lys Glu Ser Pro 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 37 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 38 Ser Ser Pro Gly Ser Ser Pro Gly Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 39 Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 40 Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 41 Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 42 Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic pepide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 43 Gly Cys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <400> 44 Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Cys 1 5 <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 45 Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val 1 5 10 15 Asp Ser Pro <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val 1 5 10 15 Asp Ser Pro <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> PHOSPHORYLATION <400> 47 Gly Cys Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 1 5 10 15 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Gly Cys Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 1 5 10 15 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30

Claims (23)

1. 배열 번호 1 의 타우 단백질의 아미노산 잔기 410 ~ 421 로 이루어지는 펩티드로서, 펩티드에서 배열 번호 1 의 타우 단백질의 Ser413 에 상당하는 아미노산 잔기가 인산화된 펩티드.
2. 제 1 항에 따른 펩티드를 포함하는 타우오패시를 치료하거나 예방하기 위한 치료제 또는 예방제.
3. 제 2 항에 있어서,
   타우오패시 질환은 알츠하이머병, 피질 기저핵 변성증, 진행성 핵상성 마비, 피크병, 기은 (嗜銀) 과립성 인지증 (기은성 과립병), Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), 17 번 염색체에 연쇄하는 파킨소니즘을 수반하는 전두측두형 인지증 (FTDP-17), 신경원섬유 변화형 인지증, 석회 침착을 수반하는 미만성 신경원섬유 변화병 (DNTC), 구상 글리아 봉입체를 수반하는 단백질 타우오패시 (WMT-GGI) 및 타우 양성 봉입체를 수반하는 전두측두엽 변성증 (FTLD-tau)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제 또는 예방제.
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