JP2024026071A - ヒト化コンホメーション特異的リン酸化タウ抗体の作製および使用のための方法および組成物 - Google Patents
ヒト化コンホメーション特異的リン酸化タウ抗体の作製および使用のための方法および組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ADにおけるタウオパチーおよび記憶喪失につながる早期病原性事象をもっぱら標的とする免疫療法を提供する。【解決手段】本開示は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)と結合し、その活性を中和し得るコンホメーション特異的抗体に関する。本技術の抗体は、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/583,850号の利益および優先権を主張し、その開示内容は、ありとあらゆる目的のために参照により全文が本明細書に組み込まれる。
本技術は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)と特異的に結合するコンホメーション特異的抗体の調製およびその使用に関する。特に、本技術は、シス-pT231-タウ中和抗体およびシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置におけるその使用に関する。
本出願は、2017年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/583,850号の利益および優先権を主張し、その開示内容は、ありとあらゆる目的のために参照により全文が本明細書に組み込まれる。
本技術は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)と特異的に結合するコンホメーション特異的抗体の調製およびその使用に関する。特に、本技術は、シス-pT231-タウ中和抗体およびシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置におけるその使用に関する。
以下の説明は、読者の理解を補助するために提供される。提供される情報または引用される参照文献のうち、本方法の先行技術であると承認されるものはない。
アルツハイマー病(AD)およびいくつかのその他の中枢神経系障害、例えば、前頭側頭型認知症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、外傷性脳損傷(TBI)、慢性外傷性脳症(CTE)および進行性核上性麻痺を有する患者の脳は、タウタンパク質を含む神経原線維タングル(NFT)を含有する。この共通の病理学的特徴は、「タウオパチー」と呼ばれるこれらの種々の神経変性性疾患をもたらしている。タウ関連病理学は、ADにおけるニューロンおよび記憶の進行性の喪失とよく相関している。ADのタウオパチーにおける極めて早期の事象は、特に、Ser/Thr-Proモチーフでのタウ過剰リン酸化であり、これは、微小管破壊および神経毒性を引き起こす。タウ(pT231-タウ)中のリン酸化Thr231-Proモチーフは、2つの別個のシスおよびトランスコンホメーションで存在することがわかっている。pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーションは、AD患者の脳において主に発現される。
ニューロン機能不全はタングル形成のかなり前に起こるので、主要な課題は、ADにおけるタウオパチーおよび記憶喪失につながる早期病原性事象をもっぱら標的とする免疫療法の開発である。
アルツハイマー病(AD)およびいくつかのその他の中枢神経系障害、例えば、前頭側頭型認知症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、外傷性脳損傷(TBI)、慢性外傷性脳症(CTE)および進行性核上性麻痺を有する患者の脳は、タウタンパク質を含む神経原線維タングル(NFT)を含有する。この共通の病理学的特徴は、「タウオパチー」と呼ばれるこれらの種々の神経変性性疾患をもたらしている。タウ関連病理学は、ADにおけるニューロンおよび記憶の進行性の喪失とよく相関している。ADのタウオパチーにおける極めて早期の事象は、特に、Ser/Thr-Proモチーフでのタウ過剰リン酸化であり、これは、微小管破壊および神経毒性を引き起こす。タウ(pT231-タウ)中のリン酸化Thr231-Proモチーフは、2つの別個のシスおよびトランスコンホメーションで存在することがわかっている。pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーションは、AD患者の脳において主に発現される。
ニューロン機能不全はタングル形成のかなり前に起こるので、主要な課題は、ADにおけるタウオパチーおよび記憶喪失につながる早期病原性事象をもっぱら標的とする免疫療法の開発である。
本技術は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)活性と特異的に結合して中和するコンホメーション特異的抗体に関する。本技術の抗体は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。
一態様では、本技術は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
別の態様では、本技術は、抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFvおよびFvからなる群から選択される。
上記の実施形態のいずれにおいても、抗体は、アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)を含むリン酸化トレオニン231-タウタンパク質のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)のシス-コンホメーションと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびIgMからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
一態様では、本技術は、本明細書において開示される抗シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え核酸配列を提供する。さらに別の態様では、本技術は、本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞またはベクターを提供する。
一態様では、本技術は、抗シス-pT231-タウ抗体および医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含んでもよい抗シス-pT231-タウ抗体を含む。
一態様では、本技術は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
別の態様では、本技術は、抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFvおよびFvからなる群から選択される。
上記の実施形態のいずれにおいても、抗体は、アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)を含むリン酸化トレオニン231-タウタンパク質のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)のシス-コンホメーションと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびIgMからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
一態様では、本技術は、本明細書において開示される抗シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え核酸配列を提供する。さらに別の態様では、本技術は、本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞またはベクターを提供する。
一態様では、本技術は、抗シス-pT231-タウ抗体および医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含んでもよい抗シス-pT231-タウ抗体を含む。
別の態様では、本技術は、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法であって、対象に、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。
方法の特定の実施形態では、抗体は、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
方法のいくつかの実施形態では、神経疾患は、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)または卒中である。さらなる実施形態では、タウオパチーは、進行性核上性麻痺(PSP)、慢性外傷性脳症(CTE)、前頭側頭型認知症(FTD)、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病(AD)からなる群から選択される。
方法の特定の実施形態では、抗体は、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
方法のいくつかの実施形態では、神経疾患は、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)または卒中である。さらなる実施形態では、タウオパチーは、進行性核上性麻痺(PSP)、慢性外傷性脳症(CTE)、前頭側頭型認知症(FTD)、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病(AD)からなる群から選択される。
特定の実施形態では、対象は、前記タウオパチーの初期段階である。一実施形態では、前記タウオパチーの初期段階は、対象から得られたサンプルにおける、シスpT231-タウのレベルの上昇またはシス:トランスpT231-タウ比の増大によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られたサンプルにおけるCSF t-タウのレベル、pT181-タウ、Αβ42またはApoE4レベルを決定することをさらに含む。特定の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液(CSF)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、脳外傷の反復の病歴を有する。
さらにまたはあるいは、方法のいくつかの実施形態では、抗体は、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムのうち1種以上である。
いくつかの実施形態では、対象は、脳外傷の反復の病歴を有する。
さらにまたはあるいは、方法のいくつかの実施形態では、抗体は、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムのうち1種以上である。
一態様では、本技術は、本明細書において開示される抗シス-pT231-タウ抗体を用いる処置のために対象を選択する方法であって、(a)参照サンプルにおいて観察されたものに対する、前記対象から得られたサンプルにおける、シスpT231-タウタンパク質のレベルの増大またはシス:トランスpT231-タウタンパク質比の増大を検出することと、(b)本明細書において開示される抗シス-pT231-タウ抗体を用いる処置のために前記対象を選択することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象から得られるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液(CSF)からなる群から選択される。
特定の実施形態では、参照サンプルは、健常な対照対象から得られる。
別の態様では、本技術は、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するためのキットであって、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含むキットを提供し、抗体は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。キットのいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
特定の実施形態では、参照サンプルは、健常な対照対象から得られる。
別の態様では、本技術は、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するためのキットであって、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含むキットを提供し、抗体は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。キットのいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
一態様では、本技術は、サンプルにおいてシス-pT231-タウタンパク質を検出するためのキットであって、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含むキットを提供し、抗体は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。キットのいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
特定の実施形態では、抗体は、1つ以上の検出可能な標識にカップリングされている。一実施形態では、1つ以上の検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む。
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、キットは、シス-pT231-タウタンパク質抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、二次抗体は、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも1つの検出可能な標識にカップリングされている。
特定の実施形態では、抗体は、1つ以上の検出可能な標識にカップリングされている。一実施形態では、1つ以上の検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む。
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、キットは、シス-pT231-タウタンパク質抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、二次抗体は、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも1つの検出可能な標識にカップリングされている。
当然のことではあるが、本技術の実質的な理解を提供するために、本方法の特定の態様、様式、実施形態、変法および特徴がさまざまな詳細レベルで以下に説明される。
本開示は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)と特異的に結合し、その活性を中和するコンホメーション特異的抗体を提供する。本技術の抗体は、それを必要とする対象においてシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。したがって、本方法の種々の態様は、抗シス-pT231-タウ抗体の調製、特性決定および製造に関する。本技術の抗体は、単独で、またはタウオパチーを処置するためのさらなる治療薬と組み合わせて有用である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識にカップリングされている。その他の実施形態では、キットは、検出可能な標識にカップリングされた二次抗体を含む。
本開示は、概して、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-タウ)と特異的に結合し、その活性を中和するコンホメーション特異的抗体を提供する。本技術の抗体は、それを必要とする対象においてシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。したがって、本方法の種々の態様は、抗シス-pT231-タウ抗体の調製、特性決定および製造に関する。本技術の抗体は、単独で、またはタウオパチーを処置するためのさらなる治療薬と組み合わせて有用である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識にカップリングされている。その他の実施形態では、キットは、検出可能な標識にカップリングされた二次抗体を含む。
本方法の実施では、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えDNAにおける多数の従来技術が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照のこと。ポリペプチド遺伝子発現産物(すなわち、遺伝子翻訳レベル)のレベルを検出および測定する方法は、本技術分野において周知であり、抗体検出および定量化技術などのポリペプチド検出法の使用を含む。(Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)も参照のこと)
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、この技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、内容が明らかに別のものを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」への言及は、2つ以上の細胞の組合せなどを含む。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、および核酸化学における実験手順および以下に記載されるハイブリダイゼーションは、周知であり、当技術分野で一般に使用されている。本明細書に引用されたすべての参考文献は、個々の刊行物、特許、または特許出願があらゆる目的で参照によりその全体が具体的かつ個別に組み込まれた場合と同じ程度に、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において、数に関連して用語「約」は、一般に、別に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、数のいずれかの方向(より多いまたはより少ない)で1%、5%または10%の範囲内に入る数を含むように解釈される(このような数が、あり得る値の0%より少ないまたは100%を超える場合を除く)。
本明細書において、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図される機能を発揮するために対象へ化合物を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に(静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に)、直腸性に、または局所的に含む任意の適した経路によって実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。
「アジュバント」とは、免疫系の刺激を引き起こす1つ以上の物質を指す。これに関連して、アジュバントは、1つ以上のワクチン抗原または抗体に対する免疫応答を増強するために使用される。アジュバントは、対象に、ワクチンの投与の前、それと組み合わせて、またはその後に投与され得る。アジュバントとして使用される化学化合物の例として、アルミニウム化合物、オイル、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよびミネラル(例えば、ビタミンE、ビタミンA、セレンおよびビタミンB12)、Quil A(サポニン)、細菌および真菌細胞壁構成成分(例えば、リポ多糖、リポタンパク質および糖タンパク質)、ホルモン、サイトカインおよび同時刺激因子が挙げられる。
本明細書において、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図される機能を発揮するために対象へ化合物を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に(静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に)、直腸性に、または局所的に含む任意の適した経路によって実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。
「アジュバント」とは、免疫系の刺激を引き起こす1つ以上の物質を指す。これに関連して、アジュバントは、1つ以上のワクチン抗原または抗体に対する免疫応答を増強するために使用される。アジュバントは、対象に、ワクチンの投与の前、それと組み合わせて、またはその後に投与され得る。アジュバントとして使用される化学化合物の例として、アルミニウム化合物、オイル、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよびミネラル(例えば、ビタミンE、ビタミンA、セレンおよびビタミンB12)、Quil A(サポニン)、細菌および真菌細胞壁構成成分(例えば、リポ多糖、リポタンパク質および糖タンパク質)、ホルモン、サイトカインおよび同時刺激因子が挙げられる。
本明細書において、用語「抗体」とは、例として、制限するものではないが、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、それらの組合せおよび任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物において、ならびにサメ免疫グロブリンなどの非哺乳動物種において免疫応答の際に産生される同様の分子を含む免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。用語「抗体」は、その他の分子との結合を実質的に排除するほど、対象の分子(または対象の高度に同様の分子の群)と特異的に結合する無傷の免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合断片」を含む(例えば、生物学的サンプル中のその他の分子に対する結合よりも、少なくとも103M-1より大きい、少なくとも104M-1より大きいまたは少なくとも105M-1より大きい、対象の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片)。用語「抗体」とはまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異性抗体)などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997Pierce Catalog and Handbook、1994-1995 (Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.);Kuby, J., Immunology,3rd Ed.、W.H. Freeman & Co.、New York、1997.も参照のこと。
より詳しくは、抗体は、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合するポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖から構成され、その各々が重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめて、VH領域およびVL領域は、抗体によって認識される抗原に結合することに関与している。通常、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重(H)鎖および軽(L)鎖を有する。軽鎖、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)の2つの種類がある。抗体分子の機能活性を決定する5種の主な重鎖クラス(またはアイソタイプ):IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する(領域はまた、「ドメイン」としても知られる)。組合せでは、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、3つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有し、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる。フレームワーク領域およびCDRの程度は、定義されている(参照により本明細書に組み込まれるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと)。Kabatデータベースは、現在オンラインで維持されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。成分軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、主にβシートコンホメーションを採用し、CDRは、βシート構造と接続する、いくつかの場合には、βシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有結合相互作用によって正しい配向にCDRを位置させるようにするスキャフォールドを形成するよう働く。
CDRは、主に、抗原のエピトープとの結合に関与する。各鎖のCDRは、通常、N末端から出発して逐次番号づけられたCDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれ、また通常、個々のCDRが位置している鎖によって同定される。したがって、VH CDR3は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VL CDR1は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。シス-pT231-タウタンパク質と結合する抗体は、特定のVH領域およびVL領域配列、したがって、特定のCDR配列を有する。異なる特異性(すなわち、異なる抗原のための異なる組合せ部位)を有する抗体は、異なるCDRを有する。抗体毎に異なるCDRであるが、CDR内の制限された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。CDR内のこれらの位置は、特異性決定残基(SDR)と呼ばれる。
抗体の例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体および抗体断片が挙げられる。抗体は、例えば、コンホメーション特異的抗体(例えば、Xaaがアミノ酸である、Xaa-Proモチーフのシスまたはトランスコンホメーションと結合する抗体)であり得る。抗体は、抗原と特異的に結合する。
抗体の例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体および抗体断片が挙げられる。抗体は、例えば、コンホメーション特異的抗体(例えば、Xaaがアミノ酸である、Xaa-Proモチーフのシスまたはトランスコンホメーションと結合する抗体)であり得る。抗体は、抗原と特異的に結合する。
本明細書において、用語「抗体関連ポリペプチド」とは、可変領域を単独で、または以下のポリペプチド要素:抗体分子のヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインのすべてもしくは一部と組み合わせて含み得る一本鎖抗体を含む、抗原結合性抗体断片を意味する。また、可変領域ならびにヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの任意の組合せも本技術に含まれる。本方法において有用な抗体関連分子、例えば、それだけには限らないが、Fab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合されたFv(sdFv)およびVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片。例として、(i)Fab断片、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片、(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片、(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。そのようなものとして、「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合性または可変領域を含み得る。「抗体断片」の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFv断片、ダイアボディー、線形抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書において、用語「ダイアボディー」とは、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、断片は、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)含む(VHVL)。同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対形成させられ、2つの抗原結合部位が生成する。ダイアボディーは、例えば、EP404,097、WO93/11161および30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
本明細書において、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Fv(scFv)」とは、Fv断片、VLおよびVHの2つのドメインの抗体融合分子を指す。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子を有するポリマー、例えば、二量体、三量体またはその他のポリマーを含み得る。さらに、Fv断片、VLおよびVHの2つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、VLおよびVH領域が対形成して一価分子(一本鎖Fv(scFv)として知られる)を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用してつなげられ得る。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883。このような一本鎖抗体は、組換え技術または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製され得る。
上記の抗体断片のいずれも、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同一方法で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
本明細書において、「抗原」とは、抗体が選択的に結合し得る分子を指す。標的抗原は、タンパク質(例えば、抗原性ペプチド)、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在するもしくは合成化合物であり得る。標的抗原は、ポリペプチド(例えば、Xaa-Proモチーフ(例えば、リン酸化または非リン酸化Ser/Thr-Proモチーフ)を含有するポリペプチド)またはペプチド模倣物(例えば、Xaa-ホモプロリンモチーフ(例えば、リン酸化または非リン酸化Ser/Thrホモプロリンモチーフ)を含有するポリペプチド)であり得る。抗原は、動物において免疫応答を生成するために動物に投与され得る。
上記の抗体断片のいずれも、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同一方法で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
本明細書において、「抗原」とは、抗体が選択的に結合し得る分子を指す。標的抗原は、タンパク質(例えば、抗原性ペプチド)、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在するもしくは合成化合物であり得る。標的抗原は、ポリペプチド(例えば、Xaa-Proモチーフ(例えば、リン酸化または非リン酸化Ser/Thr-Proモチーフ)を含有するポリペプチド)またはペプチド模倣物(例えば、Xaa-ホモプロリンモチーフ(例えば、リン酸化または非リン酸化Ser/Thrホモプロリンモチーフ)を含有するポリペプチド)であり得る。抗原は、動物において免疫応答を生成するために動物に投与され得る。
「結合親和性」は、分子(例えば、抗体)およびその結合パートナー(例えば、抗原または抗原性ペプチド)の単一結合部位間の総合非共有結合相互作用の強度を意味する。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数(Kd)によって表され得る。親和性は、本明細書において記載されるものを含む当技術分野で公知の標準方法によって測定され得る。低親和性複合体は、一般に抗原から容易に解離する傾向がある抗体を含有するのに対し、高親和性複合体は、一般に抗原と長期間結合したままである傾向がある抗体を含有する。
本明細書において、用語「生物学的サンプル」とは、生存細胞に由来するサンプル材料を意味する。生物学的サンプルは、対象から単離された、組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物および生物学的流体(例えば、腹水または脳脊髄液(CSF))ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含み得る。本技術の生物学的サンプルとして、それだけには限らないが、乳房組織、腎組織、子宮頸部、子宮内膜、頭部または頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体腺、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、胸腺、血液、毛髪、頬側、皮膚、血清、血漿、CSF、精液、前立腺液、精液、尿、糞便、汗、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパおよび涙から採取されたサンプルが挙げられる。生物学的サンプルはまた、内臓の、または癌からの生検から得ることができる。生物学的サンプルは、診断もしくは研究のために対象から得ることができ、または対照として、もしくは基礎研究のために非罹患個体から得ることができる。サンプルは、例えば、静脈穿刺および外科的生検を含む標準方法によって得ることができる。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、ニードル生検によって得られた乳房、肺、結腸または前立腺組織サンプルである。
本明細書において、用語「CDRグラフト抗体」とは、「アクセプター」抗体の少なくとも1つのCDRが、望ましい抗原特異性を有する「ドナー」抗体に由来するCDR「グラフト」によって置き換えられている抗体を意味する。
本明細書において、用語「CDRグラフト抗体」とは、「アクセプター」抗体の少なくとも1つのCDRが、望ましい抗原特異性を有する「ドナー」抗体に由来するCDR「グラフト」によって置き換えられている抗体を意味する。
本明細書において、用語「キメラ抗体」とは、ある種に由来するモノクローナル抗体のFc定常領域(例えば、マウスFc定常領域)が、組換えDNA技術を使用して、別の種の抗体に由来する Fc定常領域(例えば、ヒトFc定常領域)と置き換えられている抗体を意味する。全般的に、Robinson et al.、PCT/US86/02269; Akira et al.、欧州特許出願第184,187号; Taniguchi、欧州特許出願第171,496号; Morrison et al.、欧州特許出願第173,494号; Neuberger et al.、WO86/01533; Cabilly et al.米国特許第4,816,567号;Cabilly et al.、欧州特許出願第125,023号; Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et al., Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood et al.、Nature 314: 446-449, 1885;およびShaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988を参照のこと。
「コンホメーション特異的抗体」は、その相補性抗原の特定のコンホメーション(例えば、コンホメーション異性体または立体配座異性体)を認識し、特異的に結合する抗体またはその断片である。例えば、本明細書において記載されるように、コンホメーション特異的抗体は、Xaa-Proモチーフのシスコンホメーション(例えば、シスpT231-タウ)と特異的に結合し得るが、XaaがセリンまたはトレオニンであるXaa-Proモチーフのトランスコンホメーション(例えば、トランスpT231-タウ)とは特異的に結合しない。特定の実施形態では、Ser/Thr-Proモチーフは、リン酸化され得る(すなわち、pSer/Thr-Pro)。この場合には、コンホメーション特異的抗体は、Xaa-Proモチーフのトランスコンホメーションに対してよりも、シスコンホメーションに対して例えば、少なくとも10~100倍大きい親和性を有する。
「コンホメーション特異的抗体」は、その相補性抗原の特定のコンホメーション(例えば、コンホメーション異性体または立体配座異性体)を認識し、特異的に結合する抗体またはその断片である。例えば、本明細書において記載されるように、コンホメーション特異的抗体は、Xaa-Proモチーフのシスコンホメーション(例えば、シスpT231-タウ)と特異的に結合し得るが、XaaがセリンまたはトレオニンであるXaa-Proモチーフのトランスコンホメーション(例えば、トランスpT231-タウ)とは特異的に結合しない。特定の実施形態では、Ser/Thr-Proモチーフは、リン酸化され得る(すなわち、pSer/Thr-Pro)。この場合には、コンホメーション特異的抗体は、Xaa-Proモチーフのトランスコンホメーションに対してよりも、シスコンホメーションに対して例えば、少なくとも10~100倍大きい親和性を有する。
本明細書において、用語「コンセンサスFR」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク(FR)抗体領域を意味する。抗体のFR領域は、抗原と接触しない。
本明細書において、組成物の用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、所望の治療効果を達成するのに十分な量、例えば、処置されている疾病、例えば、標的ポリペプチドと関連する疾患または医学的状態(例えば、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)、卒中)と関連している症状の減少をもたらす量である。対象に投与される本技術の組成物の量は、疾患の種類および重症度ならびに個体の特徴、例えば、全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に応じて変わる。疾患の程度、重症度および種類に応じて変わる。当業者ならば、これらおよびその他の因子に応じて適当な投与量を決定できる。本技術の組成物はまた、1つ以上のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量とは、シス-pT231-タウタンパク質の活性の中和において部分的または十分に有効である本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の量を指す。
本明細書において、組成物の用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、所望の治療効果を達成するのに十分な量、例えば、処置されている疾病、例えば、標的ポリペプチドと関連する疾患または医学的状態(例えば、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)、卒中)と関連している症状の減少をもたらす量である。対象に投与される本技術の組成物の量は、疾患の種類および重症度ならびに個体の特徴、例えば、全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に応じて変わる。疾患の程度、重症度および種類に応じて変わる。当業者ならば、これらおよびその他の因子に応じて適当な投与量を決定できる。本技術の組成物はまた、1つ以上のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量とは、シス-pT231-タウタンパク質の活性の中和において部分的または十分に有効である本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の量を指す。
本明細書において、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知および活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。例示的免疫細胞として、骨髄またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球(例えば、細胞溶解性T細胞(CTL)を含むB細胞およびT細胞)、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は、特定のFc受容体を発現し、特定の免疫機能を保持する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を誘導し得る、例えば、ADCCを誘導可能な好中球。例えば、FcαRを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅、免疫系のその他の構成成分に対する抗原を提示することまたは抗原を提示する細胞と結合することに関与している。
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体との特異的結合を可能にするタンパク質決定基を意味する。エピトープは、普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、普通、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。コンホメーションおよび非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われない点で区別される。いくつかの実施形態では、シス-コンホメーションpT231-タウタンパク質の「エピトープ」は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体が特異的に結合するタンパク質の領域である。
エピトープと結合する抗シス-pT231-タウ抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを実施してもよい。このアッセイを使用して、抗タウ抗体が本技術の抗シス-pT231-タウ抗体と同一の部位またはエピトープと結合するか否かを決定できる。あるいは、またはさらに、当技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを実施してもよい。例えば、接触残基を同定するために、抗体配列をアラニンスキャニングなどによって突然変異させてもよい。異なる方法では、試験抗体を用いる、または試験抗体および特性決定されたもしくは公知のエピトープを有する抗体を用いる競合アッセイにおいてpT231-タウタンパク質の異なる領域に対応するペプチドを使用してもよい。
本明細書において、「発現」は、適切な発現および機能のために必要な場合には以下のうち1つ以上を含む:遺伝子の前駆体mRNAへの転写、成熟mRNAを生成するための前駆体mRNAのスプライシングおよびその他のプロセシング、mRNA安定性;成熟mRNAのタンパク質への翻訳(コドン使用およびtRNA利用能を含む)ならびに翻訳産物のグリコシル化および/またはその他の修飾。
エピトープと結合する抗シス-pT231-タウ抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを実施してもよい。このアッセイを使用して、抗タウ抗体が本技術の抗シス-pT231-タウ抗体と同一の部位またはエピトープと結合するか否かを決定できる。あるいは、またはさらに、当技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを実施してもよい。例えば、接触残基を同定するために、抗体配列をアラニンスキャニングなどによって突然変異させてもよい。異なる方法では、試験抗体を用いる、または試験抗体および特性決定されたもしくは公知のエピトープを有する抗体を用いる競合アッセイにおいてpT231-タウタンパク質の異なる領域に対応するペプチドを使用してもよい。
本明細書において、「発現」は、適切な発現および機能のために必要な場合には以下のうち1つ以上を含む:遺伝子の前駆体mRNAへの転写、成熟mRNAを生成するための前駆体mRNAのスプライシングおよびその他のプロセシング、mRNA安定性;成熟mRNAのタンパク質への翻訳(コドン使用およびtRNA利用能を含む)ならびに翻訳産物のグリコシル化および/またはその他の修飾。
本明細書において、「発現の上昇」は、対照または参照サンプルと比較した遺伝子発現またはタンパク質発現の増大(例えば、対照または正常参照サンプルと比較した、少なくとも2倍、約2倍~約150倍、5倍~150倍、5倍~100倍、10倍~150倍、10倍~100倍、50倍~150倍、50倍~100倍、75倍~150倍または75倍~100倍の増大)を指す。「発現の減少」とは、対照または参照サンプルと比較した遺伝子発現またはタンパク質発現の全体的な低減(例えば、20%もしくはそれより多い、50%もしくはそれより多い、または75%、80%、85%、90%、95%またはそれより多い)を指す。遺伝子発現またはタンパク質発現の増大または減少は、当技術分野で公知のまたは本明細書において記載される任意の有用な方法(例えば、ELISA)を使用して決定できる。治療的適用のために、「減少する」ことは、障害(例えば、タウオパチー、TBIまたは卒中)と関連するポリペプチドまたはタンパク質のレベルの低減を指し得る。診断的またはモニタリング適用のために、「減少させる」こととは、診断的またはモニタリングアッセイによって検出されるタンパク質または核酸のレベルの減少を指す。
本明細書において、用語「遺伝子」とは、プロモーター、エキソン、イントロンおよび発現を制御するその他の非翻訳領域を含む、RNA産物の調節された生合成についてのすべての情報を含有するDNAのセグメントを意味する。
本明細書において、用語、非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)由来の超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体では、またはドナー抗体では見られない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、通常、2つの可変ドメイン(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2またはFv)の実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサスFR配列のものであるが、FR領域は、結合親和性を改善する1つ以上のアミノ酸置換を含み得る。FR中のこれらのアミノ酸置換の数は、通常、H鎖において6以下であり、L鎖において3以下である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
本明細書において、用語、非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)由来の超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体では、またはドナー抗体では見られない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、通常、2つの可変ドメイン(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2またはFv)の実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサスFR配列のものであるが、FR領域は、結合親和性を改善する1つ以上のアミノ酸置換を含み得る。FR中のこれらのアミノ酸置換の数は、通常、H鎖において6以下であり、L鎖において3以下である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
本明細書において、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基(例えば、VL中のおよそ残基24~34(L1)、50~56(L2)および89~97(L3)ならびにVH中のおよそ31~35B(H1)、50~65(H2)および95~102(H3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))ならびに/または「超可変ループ」由来のそれらの残基(例えば、VL中の残基26~32(L1)、50~52(L2)および91~96(L3)ならびにVH中の26~32(H1)、52A~55(H2)および96~101(H3)(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
本明細書において、用語「同一」または「同一性」パーセントは、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてBLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業によるアラインメントおよび目視検査、例えば、NCBIウェブサイトによって測定されるような)、2個以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して使用される場合、(比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大対応を求めて比較され、アラインされた場合に、指定の領域(例えば、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書において記載される抗体のアミノ酸配列)にわたって、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定のパーセンテージ(すなわち、約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはより高い同一性)を有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列は、次いで、「実質的に同一」であるといわれる。この用語はまた、試験配列の相補体を指す、またはそれに当てはまり得る。用語はまた、欠失および/または付加を有する配列ならびに置換を有するものを含む。いくつかの実施形態では、同一性は、少なくとも約25個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長または50~100個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長を有する領域にわたって存在する。
本明細書において、用語「免疫学的に交差反応性」とは、異なる抗原を使用して生じた抗体と反応する抗原を意味する。
本明細書において、用語「無傷の抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖ポリペプチドおよび2つの軽(L)鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてHCVRまたはVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてLCVRまたはVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が散剤する超可変性の領域にさらに細分できる。各VHおよびVLは、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシル末端に配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的な相補系の第1の構成成分(Clq)を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介し得る。
本明細書において、用語「無傷の抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖ポリペプチドおよび2つの軽(L)鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてHCVRまたはVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてLCVRまたはVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が散剤する超可変性の領域にさらに細分できる。各VHおよびVLは、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシル末端に配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的な相補系の第1の構成成分(Clq)を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介し得る。
抗原性ペプチドに関して、用語「模倣物」とは、抗原性ペプチドKVAVVRTPPKSPS(配列番号56)の実質的に同一の構造的および/または機能的特徴を有する合成化学化合物を指す。模倣物は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成され得るか、または天然アミノ酸およびアミノ酸の非天然類似体のキメラ分子であり得る。模倣物はまた、任意の量の保存的置換を、このような置換が、模倣物の構造または活性を実質的にしない限り組み込んでもよい。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。例えば、モノクローナル抗体は、任意の真核細胞の、原核生物の、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体であり得るのであって、それが製造される方法に由来しない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常、種々の決定基(エピトープ)に対する種々の抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法に織る抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。モノクローナル抗体は、例えば、それだけには限らないが、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術を含む当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製され得る。例えば、本方法に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得る、または組換えDNA方法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号)を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。例えば、モノクローナル抗体は、任意の真核細胞の、原核生物の、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体であり得るのであって、それが製造される方法に由来しない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常、種々の決定基(エピトープ)に対する種々の抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法に織る抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。モノクローナル抗体は、例えば、それだけには限らないが、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術を含む当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製され得る。例えば、本方法に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得る、または組換えDNA方法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号)を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
本明細書において、「神経疾患」とは、軽度認知障害(MCI)、パーキンソン病(PD)、外傷性脳損傷、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症(CTE)、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病などの、発達異常、障害、傷害または毒物に起因する神経系の構造または機能の撹乱を指す。
本明細書において、用語「医薬上許容される担体」は、医薬的投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬化合物、等張性および吸収遅延化合物などを含むように意図される。医薬上許容される担体およびその製剤化は、当業者に公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に記載されている。
本明細書において、用語「医薬上許容される担体」は、医薬的投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬化合物、等張性および吸収遅延化合物などを含むように意図される。医薬上許容される担体およびその製剤化は、当業者に公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に記載されている。
本明細書において、用語「ポリクローナル抗体」は、少なくとも2種(2)の異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を意味する。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域と特異的に結合する抗体を含有する少なくとも2種(2)の抗体の調製物を含む。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意のRNAまたはDNAを意味し、非修飾または修飾RNAまたはDNAであり得る。ポリヌクレオチドとして、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNAならびに一本鎖またはより通常は、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、ポリヌクレオチドとは、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、1つ以上の修飾された塩基を含有するDNAまたはRNAおよび安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含む。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意のRNAまたはDNAを意味し、非修飾または修飾RNAまたはDNAであり得る。ポリヌクレオチドとして、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNAならびに一本鎖またはより通常は、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、ポリヌクレオチドとは、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、1つ以上の修飾された塩基を含有するDNAまたはRNAおよび安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含む。
本明細書において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用されて、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いにつながれた2個以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。ポリペプチドとは、一般に、ペプチド、グリコペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖および一般に、タンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、20種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、または当技術分野で周知である化学的修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本におよびより詳細な研究所に、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。
ポリペプチドまたはペプチドは、細胞性構成成分からポリペプチドを除去するために物理的、機械的または化学的方法が使用されている場合には、「単離された」または「実質的に純粋」であるといわれることがある。「単離されたポリペプチド」(例えば、単離された抗体)、「実質的に純粋なポリペプチド」または「実質的に純粋な、単離されたポリペプチド」は、通常、天然においてそれが付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも60質量%含まない場合に細胞性構成成分から取り出され、実質的に純粋である。ポリペプチドは、少なくとも75質量%、80質量%、85質量%、90質量%、95質量%または99質量%純粋であり得る。実質的に純粋なポリペプチド(例えば、実質的に純粋な抗体またはその断片)は、標準技術によって、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはポリペプチドを化学的に合成することによって得ることができる。純度は、任意の適当な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC解析によって測定できる。
本明細書において、用語「組換え体」は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって修飾されていること、または材料がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然(非組換え)形態内で見られない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異常に発現される、発現不足である、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
本明細書において、治療的使用を用語「分離する」とは、異なる経路による同時のまたは実質的に同時の少なくとも2種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「逐次」治療的使用とは、異なる時間での少なくとも2種の有効成分の投与を指し、投与経路は、同一であるか、または異なっている。より詳しくは、逐次使用とは、有効成分のうち1種の、別のもの(単数または複数)の投与開始の前の全投与を指す。したがって、有効成分のうち1種を数分、数時間または数日かけて投与し、その後、その他の有効成分(単数または複数)を投与することが可能である。この場合には、同時処置はない。
本明細書において、用語「同時の」治療的使用とは、同時のまたは実質的に同時の同一経路による少なくとも2種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、治療的使用を用語「分離する」とは、異なる経路による同時のまたは実質的に同時の少なくとも2種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「逐次」治療的使用とは、異なる時間での少なくとも2種の有効成分の投与を指し、投与経路は、同一であるか、または異なっている。より詳しくは、逐次使用とは、有効成分のうち1種の、別のもの(単数または複数)の投与開始の前の全投与を指す。したがって、有効成分のうち1種を数分、数時間または数日かけて投与し、その後、その他の有効成分(単数または複数)を投与することが可能である。この場合には、同時処置はない。
本明細書において、用語「同時の」治療的使用とは、同時のまたは実質的に同時の同一経路による少なくとも2種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「対象」、「個体」および「患者」は、同義的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、飼育動物(例えば、イヌ、ネコなど)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど)、野生動物(コウモリ、アライグマ、キツネ、スカンク、リス、シマリス、マウス、ウサギなど)および実験動物(サル、ラット、マウスなど)ウサギ、モルモットなど)を指す。
本明細書において、用語「治療薬」は、有効量で存在する場合に、それを必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するように意図される。
本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体のアミノ酸配列修飾が考慮される。例えば、抗体の結合親和性および/またはその他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗シス-pT231-タウ抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および/またはそれへの挿入および/またはその置換が挙げられる。得られた抗体が所望の特性を有する限り、対象の抗体を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行われる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化も含む。置換的突然変異誘発のための最大の対象の部位として、超可変領域が挙げられるが、FR変更も考慮される。「保存的置換」は以下の表に示される。
本明細書において、用語「治療薬」は、有効量で存在する場合に、それを必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するように意図される。
本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体のアミノ酸配列修飾が考慮される。例えば、抗体の結合親和性および/またはその他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗シス-pT231-タウ抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および/またはそれへの挿入および/またはその置換が挙げられる。得られた抗体が所望の特性を有する限り、対象の抗体を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行われる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化も含む。置換的突然変異誘発のための最大の対象の部位として、超可変領域が挙げられるが、FR変更も考慮される。「保存的置換」は以下の表に示される。
置換的バリアントのうち1種類は、親抗体の1つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。このような置換的バリアントを作製するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。具体的には、各部位ですべての可能性あるアミノ酸置換を作製するためにいくつかの超可変領域部位(例えば、6~7部位)が突然変異される。このように作製された抗体バリアントは、各粒子内でパッケージングされたM13の遺伝子III産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価様式で提示される。ファージに提示されたバリアントは、次いで、本明細書において開示されるようなその生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定してもよい。ひとたびこのようなバリアントを作製すれば、バリアントのパネルを本明細書において記載されるようなスクリーニングに付し、さらなる開発のために、1つ以上の関連アッセイにおいて同様のまたは優れた特性を有する抗体を選択してもよい。
本明細書において、「参照サンプル」とは、比較目的で使用される任意のサンプルを指す。「正常な参照サンプル」は、障害(例えば、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)または卒中)の発症の前に同一対象から採取された事前サンプル、障害について成功裏に処置されている障害を有さない対象から得たサンプルまたは既知正常濃度の精製参照ポリペプチドのサンプルであり得る。用語「参照標準」または「参照レベル」とは、参照サンプルに由来する1つ以上の遺伝子またはタンパク質の値、数また発現パターンを指す。正常参照標準またはレベルは、以下の判定基準:年齢、体重、疾患ステージおよび全体的な健康のうち少なくとも1つによって対象のサンプルに対応されている正常対象に由来する値、数または発現パターンである場合もある。一例では、例えば、障害を示すポリペプチドまたは障害を示すポリペプチドのコンホメーションの正常参照レベルは、血清サンプルにおいて5ng/ml未満、血清サンプルにおいて4ng/ml未満、3ng/ml未満、2ng/ml未満または1ng/ml未満である。「陽性参照」サンプル、標準または値は、以下の判定基準:年齢、体重、疾患ステージおよび全体的な健康のうち少なくとも1つによって対象のサンプルに対応されている、障害(例えば、タウオパチー、TBIまたは卒中)を有するとわかっている対象に由来するサンプル、標準、値または数である。例えば、障害を示すポリペプチドの例えば、陽性参照値は、5ng/ml血清より大きい、10ng/ml血清より大きい、20ng/mlより大きい、30ng/mlより大きい、40ng/mlより大きいまたは50ng/ml血清より大きい。
本明細書において、「特異的に結合する」とは、別の分子(例えば、抗原)を認識し、結合するが、その他の分子を実質的に認識しない、結合しない分子(例えば、抗体)を指す。一例では、pT231-タウのシスコンホメーションと特異的に結合する抗体は、pT231-タウのトランスコンホメーションと特異的に結合しない。特定の分子(例えば、ポリペプチド、ポリペプチド上のエピトープまたはポリペプチドのコンホメーション)に、用語「特異的に結合する」、「と特異的に結合する」または「にとって特異的である」は、本明細書において、例えば、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12Mまたはそれより大きいものという、結合する分子のKdを有する分子によって示すことができる。用語「特異的に結合する」はまた、分子(例えば、抗体)が、特定のポリペプチド(例えば、Xaa-Proモチーフ(ここで、Xaaは、セリンまたはトレオニンである)を含有するポリペプチド)、特定のポリペプチド上のエピトープまたは特定のポリペプチドのコンホメーション(例えば、Xaa-Proモチーフのシスコンホメーション、例えば、シスpT231-タウ)と結合し、任意のその他のポリペプチド、ポリペプチドエピトープまたはポリペプチドコンホメーション(例えば、Xaa-Proモチーフのトランスコンホメーション、例えば、トランスpT231-タウ)と実質的に結合しない結合を指す場合もある。例えば、コンホメーション特異的抗体は、例えば、Ser/Thr-Proモチーフの1種のコンホメーション(例えば、シスコンホメーション)に対して、別のコンホメーション(例えば、トランスコンホメーション)に対してよりも、例えば、少なくとも10~100倍より大きい親和性(例えば、101-、102-、103-、104-、105-、106-、107-、108-、109-または 1010-倍大きい親和性)を有し得る。
本明細書において、「試験サンプル」とは、対象の対象から得られた生物学的サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生物学的流体(例えば、血清)、細胞または組織サンプル、培養物または成長培地から得られたサンプルまたはそれらに由来する単離された核酸もしくはポリペプチドであり得る。
「処置すること」または「処置」は、本明細書において、ヒトなどの対象における本明細書において記載される疾患または障害の処置を対象とし、(i)疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、(ii)疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと、(iii)障害の進行を減速することおよび/または(iv)疾患もしくは障害の1つ以上の症状の進行を阻害、軽減もしくは減速することを含む。「タウオパチー、TBIまたは卒中を処置すること」とは、タウオパチー、TBIまたは卒中と関連する症状が、例えば、緩和される、低減される、治癒されるまたは緩解の状態に置かれることを意味する。
本明細書において記載されるような神経疾患の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。処置は、慢性疾患のための連続する長期の処置または急性状態の処置のための単回のもしくは2、3回の投与であり得る。
「処置すること」または「処置」は、本明細書において、ヒトなどの対象における本明細書において記載される疾患または障害の処置を対象とし、(i)疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、(ii)疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと、(iii)障害の進行を減速することおよび/または(iv)疾患もしくは障害の1つ以上の症状の進行を阻害、軽減もしくは減速することを含む。「タウオパチー、TBIまたは卒中を処置すること」とは、タウオパチー、TBIまたは卒中と関連する症状が、例えば、緩和される、低減される、治癒されるまたは緩解の状態に置かれることを意味する。
本明細書において記載されるような神経疾患の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。処置は、慢性疾患のための連続する長期の処置または急性状態の処置のための単回のもしくは2、3回の投与であり得る。
I.本技術の組成物
本技術は、コンホメーション特異的抗体またはその断片の作製および使用のための方法および組成物を説明する。コンホメーション特異的抗体は、例えば、特定のポリペプチドのシス-またはトランス-コンホメーションと特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本技術のコンホメーション特異的抗体は、ポリペプチドのリン酸化Ser/Thr-Proモチーフのシス-コンホメーション(例えば、シスpT231-タウ)と結合する。コンホメーション特異的抗体のその抗原(例えば、pT231-タウ)との結合は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の進行の処置、診断またはモニタリングにおいて有用であり得る。
本技術は、コンホメーション特異的抗体またはその断片の作製および使用のための方法および組成物を説明する。コンホメーション特異的抗体は、例えば、特定のポリペプチドのシス-またはトランス-コンホメーションと特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本技術のコンホメーション特異的抗体は、ポリペプチドのリン酸化Ser/Thr-Proモチーフのシス-コンホメーション(例えば、シスpT231-タウ)と結合する。コンホメーション特異的抗体のその抗原(例えば、pT231-タウ)との結合は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の進行の処置、診断またはモニタリングにおいて有用であり得る。
本技術のコンホメーション特異的抗体は、例えば、特定のコンホメーション(例えば、シス-またはトランス-コンホメーション)において、または混合シス-およびトランス-コンホメーションにおいて、固定されたリン酸化Xaa-Proモチーフ(ここで、Xaaは、セリンまたはトレオニンである)を含有する免疫原性抗原を使用して作製できる。
例えば、リン酸化Ser/Thr-Proを含有する本技術の抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、Still-WittigおよびIreland-Claisen再編成(参照により本明細書に組み込まれる、J. Org. Chem. 68: 2343-2349 (2003))による、(Z)-および(E)-アルケン模倣物の立体選択的合成によって固定され得る。あるいは、本技術のリン酸化Ser/Thr-Pro含有抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、プロリンアミノ酸残基を、プロリン類似体と置換することによって増大または固定され得る。プロリン類似体として、制限するものではないが、ホモプロリン、ピペコリン酸(Pip)、ジメチルプロリン(Dmp)、アゼチジン-2-カルボン酸(Aze)、t-ブチル-L-プロリン(TBP)、トランス-4-フルオロ-L-プロリン(t-4F-Pro)およびシス-4-フルオロ-L-プロリン(c-4F-Pro)が挙げられる。所与の抗原のシスまたはトランス含量は、例えば、核磁気共鳴(NMR)解析によって解析され得る。
例えば、リン酸化Ser/Thr-Proを含有する本技術の抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、Still-WittigおよびIreland-Claisen再編成(参照により本明細書に組み込まれる、J. Org. Chem. 68: 2343-2349 (2003))による、(Z)-および(E)-アルケン模倣物の立体選択的合成によって固定され得る。あるいは、本技術のリン酸化Ser/Thr-Pro含有抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、プロリンアミノ酸残基を、プロリン類似体と置換することによって増大または固定され得る。プロリン類似体として、制限するものではないが、ホモプロリン、ピペコリン酸(Pip)、ジメチルプロリン(Dmp)、アゼチジン-2-カルボン酸(Aze)、t-ブチル-L-プロリン(TBP)、トランス-4-フルオロ-L-プロリン(t-4F-Pro)およびシス-4-フルオロ-L-プロリン(c-4F-Pro)が挙げられる。所与の抗原のシスまたはトランス含量は、例えば、核磁気共鳴(NMR)解析によって解析され得る。
本技術の抗原性ペプチドは、シス/トランス異性化可能である、リン酸化または非リン酸化Xaa-Proモチーフ(式中、Xaaは、セリンまたはトレオニンである)を含有し得る。いくつかの実施形態では、抗原性ペプチドは、プロリン残基がプロリン類似体に置換された、タウタンパク質のSer/Thr-Proモチーフのアミノ酸残基を含有し得る。抗原性ペプチドはまた、全長タウポリペプチドのSer/Thr-Proモチーフのアミノ酸残基を含有し得る。抗原性ペプチドは、全長タウポリペプチドのSer/Thr-Proモチーフを囲むさらなる残基をさらに含み得る。例えば、抗原性ペプチドは、全長タウポリペプチドのSer/Thr残基のN末端に3~10個のアミノ酸残基および全長タウポリペプチドのプロリンのC末端に3~10個のアミノ酸残基を含み得る。本技術の抗原性ペプチドは、例えば、少なくとも4、5、6、7または8個のアミノ酸残基の長さであり得る。抗原性ペプチドは、8から20個のアミノ酸残基の長さ(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸残基の長さ)であり得るが、20個を超えるアミノ酸残基の長さである場合もある。
このような抗原は、当業者に公知の種々の方法にいずれによっても製造および精製され得る。抗原性ペプチドは、例えば、固相化学合成、in vitro転写/翻訳によって、または組換え技術によって製造および精製され得る。抗原性ペプチドは、担体タンパク質に化学的にカップリングされてもよく、またはペプチドは、抗原性を増大するために融合タンパク質として作製されてもよい。抗原性ペプチドは、コンホメーション特異的抗体の産生を誘導するその能力に基づいてスクリーニングされ得る。この点において、このようなスクリーニング技術は、それだけには限らないが、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降またはその他のイムノアッセイを含む。
コンホメーション特異的抗体の産生において有用な例示的抗原として、リン酸化または非リン酸化Ser/Thr-ホモプロリン、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-Dmp、Ser/Thr-Aze、Ser/Thr-TBP、Ser/Thr-t-4F-ProまたはSer/Thr-c-4F-Proモチーフを含有する抗原が挙げられる。このような抗原の具体例として、例えば、pT231-PipタウペプチドおよびpT231-Dmpタウペプチド(KVAVVR-pT231-Pro-PKSPS)が挙げられる。このようなペプチドは、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体(例えば、ウサギまたはマウスモノクローナル抗体)を作製するための抗原として使用され得る。
コンホメーション特異的抗体の産生において有用な例示的抗原として、リン酸化または非リン酸化Ser/Thr-ホモプロリン、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-Dmp、Ser/Thr-Aze、Ser/Thr-TBP、Ser/Thr-t-4F-ProまたはSer/Thr-c-4F-Proモチーフを含有する抗原が挙げられる。このような抗原の具体例として、例えば、pT231-PipタウペプチドおよびpT231-Dmpタウペプチド(KVAVVR-pT231-Pro-PKSPS)が挙げられる。このようなペプチドは、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体(例えば、ウサギまたはマウスモノクローナル抗体)を作製するための抗原として使用され得る。
一態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、以下のアミノ酸配列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号3);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号4);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号3);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号4);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
別の態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、本明細書において記載されるシグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、MRWSCIILFLVATATGVNS(配列番号5)またはMEWSWVFLFFLSVTTGVHS(配列番号6)である。
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、シグナル配列(下線が引かれた)を含み、以下から選択されるアミノ酸配列:
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号7);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号8);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号9);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号10);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号7);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号8);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号9);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号10);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号11);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号12);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号13);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号14);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号12);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号13);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSS(配列番号14);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書において記載される重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体を提供する。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列:
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号15);および
PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号16)
を有する。
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号15);および
PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号16)
を有する。
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび重鎖免疫グロブリン定常ドメイン(太字フォント)を含む離された抗体は、以下から選択されるアミノ酸配列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号17);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号18);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号17);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号18);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号19);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号20);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号21);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号22);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号22);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号23);
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号24);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
別の態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含み、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列(シグナル配列は下線が引かれ、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である):
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号25);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号25);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号26);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号27);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号28);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号29);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号29);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号30);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号31);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号32);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号33);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号34);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号35);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号36);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号36);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号37);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRATMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号38);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号39);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号40);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(配列番号40);
MRWSCIILFLVATATGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号132)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTTWEVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号133)
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、以下のアミノ酸配列:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号41)、
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号42)、
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、MKLPVRLLVLMFWIPASNS(配列番号43)またはMSVPTQVLGLLLLWLTDARC(配列番号44)である。
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号41)、
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号42)、
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、MKLPVRLLVLMFWIPASNS(配列番号43)またはMSVPTQVLGLLLLWLTDARC(配列番号44)である。
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、シグナル配列を含み、以下から選択されるアミノ酸配列(シグナル配列は下線が引かれている):
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号45);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号46);
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号47);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号48);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号45);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(配列番号46);
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号47);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRT(配列番号48);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体を提供する。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは、
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号49)
のアミノ酸配列を有する。
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号49)
のアミノ酸配列を有する。
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体は、以下から選択されるアミノ酸配列(軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である):
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号50)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号51);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号50)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号51);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含み、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列(シグナル配列は下線が引かれており、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である):
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号52);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号53);
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号52);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号53);
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号54);
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号55);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号55);
または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号1-4、7~14、17~40および132~133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号41~42、45~48、50~54および55からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号1-4、7~14、17~40および132~133からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖ならびに配列番号41~42、45~48、50~54および55からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)またはその模倣物を含むヒトシス-pT231-タウタンパク質のエピトープと結合する抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)またはその模倣物を含むヒトシス-pT231-タウタンパク質のエピトープと結合する抗原結合部位を形成する。
抗体のいくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、同一ポリペプチド鎖の構成成分である。抗体のいくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成成分である。特定の実施形態では、抗体は、全長抗体である。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示される抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Fab、F(ab)’2、Fab’、scFvおよびFvからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、シス-pT231-タウタンパク質と10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11Mまたは10-12M未満の解離定数(KD)で結合する。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示される抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Fab、F(ab)’2、Fab’、scFvおよびFvからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、シス-pT231-タウタンパク質と10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11Mまたは10-12M未満の解離定数(KD)で結合する。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
本技術の範囲内の抗シス-pT231-タウ抗体として、例えば、それだけには限らないが、標的ポリペプチド、その相同体、誘導体または断片と特異的に結合するモノクローナル、キメラ、ヒト化およびダイアボディーが挙げられる。本明細書において開示される方法にとって有用な抗体は、任意のアイソタイプのFcドメイン、例えば、それだけには限らないが、IgG(IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む)、IgA(IgA1およびIgA2を含む)、IgD、IgEまたはIgMおよびIgYを含み得る。定常領域配列の限定されない例として、以下が挙げられる:
ヒトIgD定常領域、Uniprot:P01880配列番号134
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
ヒトIgG1定常領域、Uniprot:P01857配列番号135
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ヒトIgG2定常領域、Uniprot:P01859配列番号136
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
ヒトIgG1定常領域、Uniprot:P01857配列番号135
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ヒトIgG2定常領域、Uniprot:P01859配列番号136
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ヒトIgG3定常領域、Uniprot:P01860配列番号137
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
ヒトIgM定常領域、Uniprot:P01871配列番号138
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
ヒトIgG4定常領域、Uniprot:P01861配列番号139
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
ヒトIgA1定常領域、Uniprot:P01876配列番号140
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
ヒトIgA1定常領域、Uniprot:P01876配列番号140
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
ヒトIgA2定常領域、Uniprot:P01877配列番号141
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
ヒトIgカッパ定常領域、Uniprot:P01834配列番号142
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、配列番号134~140または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同一である重鎖定常領域を含む。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、配列番号142に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同一である軽鎖定常領域を含む。
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
ヒトIgカッパ定常領域、Uniprot:P01834配列番号142
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、配列番号134~140または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同一である重鎖定常領域を含む。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、配列番号142に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同一である軽鎖定常領域を含む。
HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)抗体の重鎖(HC)および軽鎖(LC)免疫グロブリン配列が以下に提供されている。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Aの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Aの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Bの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Bの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Bの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Bの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Cの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Cの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Dの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Dの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、HC可変ドメイン配列は、HuPT-113Dの可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、HuPT-113Dの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgMからなる群から選択されるHC定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置234および235でLeuからAlaへのアミノ酸置換を含むIgG1定常領域を含有する。
特定の実施形態では、単離された抗体は、以下の特徴のうち1つ以上を含む:(a)軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号45に対して少なくとも85%同一であるおよび/または(b)重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号7~10のいずれか1つに対して少なくとも85%同一である。別の態様では、本明細書において提供される抗体中の1つ以上のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換されている。置換は、本明細書において定義されるような「保存的置換」であり得る。
本明細書において提供される抗体のいくつかの態様では、抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するための構造的修飾を含有する。いくつかの態様では、シス-pT231-タウ抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、抗体のCH2定常抗体重鎖領域中に欠失を含有する。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、Fab断片が使用される。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、F(ab)’2断片が使用される。
いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス-pT231-タウ中和抗体をコードする核酸配列またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス-pT231-タウ中和抗体をコードする核酸配列を発現する宿主細胞を提供する。
本明細書において提供される抗体のいくつかの態様では、抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するための構造的修飾を含有する。いくつかの態様では、シス-pT231-タウ抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、抗体のCH2定常抗体重鎖領域中に欠失を含有する。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、Fab断片が使用される。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび/または持続放出を促進するために、F(ab)’2断片が使用される。
いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス-pT231-タウ中和抗体をコードする核酸配列またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス-pT231-タウ中和抗体をコードする核酸配列を発現する宿主細胞を提供する。
本技術の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれより多い多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、本技術のシス-pT231-タウタンパク質の異なるエピトープに特異的であり得る、またはシス-pT231-タウタンパク質ならびに異種組成物、例えば、異種ポリペプチドまたは固相支持体材料の両方に特異的であり得る。例えば、WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793、Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991)、米国特許第5,573,920号、同4,474,893号、同5,601,819号、同4,714,681号、同4,925,648号、同6,106,835号、Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照のこと。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化である。
本技術の抗体は、さらに、N末端またはC末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合されてもよく、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的にコンジュゲートされてもよい(共有結合によるおよび非共有結合によるコンジュゲーションを含む)。例えば、本技術の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用である分子およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物または毒素に組換えによって融合されても、コンジュゲートされてもよい。例えば、WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、米国特許第5,314,995号およびEP0396387を参照のこと。
本技術の抗体は、さらに、N末端またはC末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合されてもよく、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的にコンジュゲートされてもよい(共有結合によるおよび非共有結合によるコンジュゲーションを含む)。例えば、本技術の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用である分子およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物または毒素に組換えによって融合されても、コンジュゲートされてもよい。例えば、WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、米国特許第5,314,995号およびEP0396387を参照のこと。
A.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を調製する方法
一般的な概要。最初に、本技術の抗体が作製され得る標的ポリペプチドが選択される。例えば、抗体は、全長タウタンパク質に対して、または位置231のリン酸化トレオニン(pT231)を含有するタウタンパク質の一部に対して作製され得る。このような標的ポリペプチドに対する抗体を作製するための技術は、当業者に周知である。このような技術の例として、例えば、それだけには限らないが、ディスプレイライブラリー、異種またはヒトマウス、ハイブリドーマなどを含むものが挙げられる。本技術の範囲内の標的ポリペプチドは、pT231を含有するタウタンパク質に由来する任意のポリペプチドを含み、免疫応答を誘発可能である。シス-pT231-タウタンパク質に特異的な抗体の調製は、実施例2~8に例示されている。
シス-pT231-タウタンパク質およびその断片に向けられた、組換えによって遺伝子操作された抗体および抗体断片、例えば、抗体関連ポリペプチドは、本開示に従って使用するのに適しているということは理解されなくてはならない。
一般的な概要。最初に、本技術の抗体が作製され得る標的ポリペプチドが選択される。例えば、抗体は、全長タウタンパク質に対して、または位置231のリン酸化トレオニン(pT231)を含有するタウタンパク質の一部に対して作製され得る。このような標的ポリペプチドに対する抗体を作製するための技術は、当業者に周知である。このような技術の例として、例えば、それだけには限らないが、ディスプレイライブラリー、異種またはヒトマウス、ハイブリドーマなどを含むものが挙げられる。本技術の範囲内の標的ポリペプチドは、pT231を含有するタウタンパク質に由来する任意のポリペプチドを含み、免疫応答を誘発可能である。シス-pT231-タウタンパク質に特異的な抗体の調製は、実施例2~8に例示されている。
シス-pT231-タウタンパク質およびその断片に向けられた、組換えによって遺伝子操作された抗体および抗体断片、例えば、抗体関連ポリペプチドは、本開示に従って使用するのに適しているということは理解されなくてはならない。
本明細書において示される技術に付され得る抗シス-pT231-タウ抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗体断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、ダイアボディー、抗体軽鎖、抗体重鎖および/または抗体断片が挙げられる。抗体Fv含有ポリペプチド、例えば、Fab’およびF(ab’)2抗体断片の高収率製造にとって有用な方法は、記載されている。米国特許第5,648,237を参照のこと。
一般に、抗体は、元来の種から得られる。より詳しくは、標的ポリペプチド抗原に対して特異性を有する元来の種の抗体の軽鎖、重鎖または両方の可変部分の核酸またはアミノ酸配列が得られる。元来の種は、本技術の抗体または抗体のライブラリーを作製するのに有用であった任意の種、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
ファージまたはファージミドディスプレイ技術は、本技術の抗体を導くための有用な技術である。モノクローナル抗体を作製し、クローニングするための技術は、当業者に周知である。本技術の抗体をコードする配列の発現は、大腸菌(E.coli)で実施され得る。
一般に、抗体は、元来の種から得られる。より詳しくは、標的ポリペプチド抗原に対して特異性を有する元来の種の抗体の軽鎖、重鎖または両方の可変部分の核酸またはアミノ酸配列が得られる。元来の種は、本技術の抗体または抗体のライブラリーを作製するのに有用であった任意の種、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
ファージまたはファージミドディスプレイ技術は、本技術の抗体を導くための有用な技術である。モノクローナル抗体を作製し、クローニングするための技術は、当業者に周知である。本技術の抗体をコードする配列の発現は、大腸菌(E.coli)で実施され得る。
配列をコードする核酸の縮重のために、本技術の実施において、天然に存在するタンパク質のものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするその他の配列が使用されてもよい。これらとして、それだけには限らないが、配列内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、したがって、サイレント変化をもたらす、上記のポリペプチドをコードする核酸配列のすべてまたは一部を含む核酸配列が挙げられる。本技術の免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、このようなバリアントがシス-pT231-タウタンパク質を認識する作動抗体を形成する限り、標準方法(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.)によって算出されるような最大25%の配列相同性変動を許容することは理解される。例えば、ポリペプチド配列内の1つ以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として働く同様の極性の別のアミノ酸によって置換されてもよく、その結果、サイレント変化が得られる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する(塩基性)アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する(酸性)アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。例えば、グリコシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドとの連結などによって、翻訳の間または翻訳後に異なって修飾されるタンパク質またはその断片または誘導体も本技術の範囲内に含まれる。さらに、免疫グロブリンをコードする核酸配列は、翻訳、開始および/または終止配列を作出および/または破壊して、コーディング領域の変動を作出する、および/または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、または既存のものを破壊するために、in vitro修飾をさらに促進するために、in vitroまたはin vivoで突然変異され得る。それだけには限らないが、in vitro部位特異的突然変異誘発、J. Biol. Chem. 253:6551、use of Tab linkers (Pharmacia)などを含む、当技術分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術が使用されてもよい。
ポリクローナル抗血清および免疫原の調製。本技術の抗体または抗体断片を作製する方法は、対象(全般的に、マウスまたはウサギなどの非ヒト対象)を、精製シス-pT231-タウタンパク質もしくはその断片を用いて、またはシス-pT231-タウタンパク質もしくはその断片を発現する細胞を用いて免疫処置することを含む。適当な免疫原性調製物は、組換え発現されたシス-pT231-タウタンパク質または化学合成されたシス-pT231-タウペプチドを含有し得る。pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーションまたはその一部または断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技術を使用してシス-pT231-タウタンパク質またはその一部または断片と結合する抗シス-pT231-タウ抗体を作製するための免疫原として使用され得る。
全長pT231-タウタンパク質またはその断片は、免疫原としての断片として有用である。いくつかの実施形態では、pT231-タウ断片は、アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)またはその模倣物の少なくとも8個のアミノ酸残基を含み、pT231-タウタンパク質のエピトープを包含し、その結果、ペプチドに対して作製された抗体は、シス-pT231-タウタンパク質と特異的免疫複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、pT231を含有する抗原性タウペプチドは、少なくとも5、8、10、15、20または30個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは、使用に応じて、当業者に周知の方法に従って、時には、より短い抗原性ペプチドを上回って望ましいものである。所与のエピトープの多量体は、時には、モノマーよりも有効である。
いくつかの実施形態では、pT231を含有する抗原性タウペプチドは、少なくとも5、8、10、15、20または30個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは、使用に応じて、当業者に周知の方法に従って、時には、より短い抗原性ペプチドを上回って望ましいものである。所与のエピトープの多量体は、時には、モノマーよりも有効である。
必要に応じて、シス-pT231-タウタンパク質(またはその断片)の免疫原性は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)またはオボアルブミン (OVA)などのハプテンとの融合またはコンジュゲーションによって増大され得る。多数のこのようなハプテンは、当技術分野で公知である。ポリペプチドに対する対象の免疫反応を増大するために、シス-pT231-タウタンパク質を、従来のアジュバント、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバントと組み合わせてもよい。免疫学的反応を増大するために使用される種々のアジュバントとして、それだけには限らないが、フロイントのもの(完全および不完全)、無機ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドまたはオイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど)、ヒトアジュバント、例えば、カルメット・ゲラン桿菌およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)または同様の免疫賦活性化合物が挙げられる。これらの技術は、当技術分野で標準である。
本技術の説明において、免疫応答は、「一次」または「二次」免疫応答として記載され得る。一次免疫応答は、「防御的」免疫応答とも記載され、特定の抗原、例えば、シス-pT231-タウタンパク質に対するいくつかの最初の曝露(例えば、最初の「免疫処置」)の結果として個体において生じた免疫応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫処置は、抗原を含有するワクチンを用いる個体のワクチン接種の結果として生じ得る。例えば、ワクチンは、1つ以上のシス-pT231-タウタンパク質由来抗原を含むシス-pT231-タウ ワクチンであり得る。一次免疫応答は、継時的に減弱または弱毒化になり得る、さらに消失し得る、または少なくとも検出され得ないように弱毒化になり得る。したがって、本技術はまた、本明細書において「記憶免疫応答」とも記載される「二次」免疫応答に関する。用語二次免疫応答は、一次免疫応答がすでに生成された後に個体において誘発される免疫応答を指す。
したがって、減弱または弱毒化になった既存の免疫応答を増強するために、または消失してしまった、またはもはや検出され得ないこれまでの免疫応答を再構築するために、二次免疫応答が誘発され得る。二次または記憶免疫応答は、体液性(抗体)応答または細胞性応答のいずれかであり得る。二次または記憶体液性応答は、抗原の最初の提示で生じた記憶B細胞の刺激の際に生じる。遅延型過敏症(DTH)応答は、CD4+T細胞によって媒介される細胞性二次または記憶免疫応答の種類である。抗原に対する最初の曝露は、免疫系を抗原刺激し、さらなる曝露は、DTHをもたらす。
したがって、減弱または弱毒化になった既存の免疫応答を増強するために、または消失してしまった、またはもはや検出され得ないこれまでの免疫応答を再構築するために、二次免疫応答が誘発され得る。二次または記憶免疫応答は、体液性(抗体)応答または細胞性応答のいずれかであり得る。二次または記憶体液性応答は、抗原の最初の提示で生じた記憶B細胞の刺激の際に生じる。遅延型過敏症(DTH)応答は、CD4+T細胞によって媒介される細胞性二次または記憶免疫応答の種類である。抗原に対する最初の曝露は、免疫系を抗原刺激し、さらなる曝露は、DTHをもたらす。
適当な免疫処置後、抗シス-pT231-タウ抗体は、対象の血清から調製され得る。必要に応じて、シス-pT231-タウタンパク質に向けられた抗体分子は、IgG画分を得るために周知の技術、例えば、ポリペプチドAクロマトグラフィーによって、哺乳動物から(例えば、血液から)単離され、さらに精製され得る。
モノクローナル抗体。本技術の一実施形態では、抗体は、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体は、ヒトまたはマウス抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体であり得る。pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーションまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養による抗体分子の製造を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術として、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術(例えば、Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497を参照のこと)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72を参照のこと)およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術(例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が挙げられる。本技術の実施では、ヒトモノクローナル抗体が利用されてもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって(例えば、Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030を参照のこと)またはin vitroでEpstein Barrウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによって(例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと)製造されてもよい。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団が単離され得る。集団に由来する抗体の一部をコードする配列を増幅するために、抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するPCRが使用され、次いで、抗体またはその断片、例えば、可変ドメインをコードするDNAが、増幅された配列から再構築される。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌での融合ポリペプチドの発現およびディスプレイのために、その他のタンパク質、例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質をコードするDNAと融合され得る。次いで、増幅された配列は発現され、例えば、pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーション上に存在する抗原またはエピトープに対する発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、さらに選択され得るまたは単離され得る。あるいは、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫処置し、次いで、日常的な方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製され得る。例えば、Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46)を参照のこと。標準方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることは、変動する特異性(すなわち、種々のエピトープに対する)および親和性のモノクローナル抗体をもたらす。所望の特性、例えば、シス-pT231-タウ結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現されたように使用されてもよく、その特性を変更するためにポリエチレングリコール(PEG)などの分子に結合されてもよく、またはそれをコードするcDNAは、種々の方法で単離されてもよく、シーケンシングされてもよく、操作されてもよい。シス-pT231-タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、合成デンドロマーツリーが反応性アミノ酸側鎖、例えば、リシンに付加されてもよい。また、シス-pT231-タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、CPG-ジヌクレオチド技術が使用され得る。その他の操作として、貯蔵の際または対象への投与後の抗体の不安定性に寄与する特定のアミノアシル残基を置換または欠失することおよびシス-pT231-タウタンパク質の抗体の親和性を改善するための親和性成熟技術が挙げられる。
モノクローナル抗体。本技術の一実施形態では、抗体は、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体は、ヒトまたはマウス抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体であり得る。pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーションまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養による抗体分子の製造を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術として、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術(例えば、Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497を参照のこと)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72を参照のこと)およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術(例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が挙げられる。本技術の実施では、ヒトモノクローナル抗体が利用されてもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって(例えば、Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030を参照のこと)またはin vitroでEpstein Barrウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによって(例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと)製造されてもよい。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団が単離され得る。集団に由来する抗体の一部をコードする配列を増幅するために、抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するPCRが使用され、次いで、抗体またはその断片、例えば、可変ドメインをコードするDNAが、増幅された配列から再構築される。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌での融合ポリペプチドの発現およびディスプレイのために、その他のタンパク質、例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質をコードするDNAと融合され得る。次いで、増幅された配列は発現され、例えば、pT231-タウタンパク質のシス-コンホメーション上に存在する抗原またはエピトープに対する発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、さらに選択され得るまたは単離され得る。あるいは、抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫処置し、次いで、日常的な方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製され得る。例えば、Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46)を参照のこと。標準方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることは、変動する特異性(すなわち、種々のエピトープに対する)および親和性のモノクローナル抗体をもたらす。所望の特性、例えば、シス-pT231-タウ結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現されたように使用されてもよく、その特性を変更するためにポリエチレングリコール(PEG)などの分子に結合されてもよく、またはそれをコードするcDNAは、種々の方法で単離されてもよく、シーケンシングされてもよく、操作されてもよい。シス-pT231-タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、合成デンドロマーツリーが反応性アミノ酸側鎖、例えば、リシンに付加されてもよい。また、シス-pT231-タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、CPG-ジヌクレオチド技術が使用され得る。その他の操作として、貯蔵の際または対象への投与後の抗体の不安定性に寄与する特定のアミノアシル残基を置換または欠失することおよびシス-pT231-タウタンパク質の抗体の親和性を改善するための親和性成熟技術が挙げられる。
ハイブリドーマ技術。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたB細胞を含むハイブリドーマによって生成される抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術は、当技術分野で公知の、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)において教示されたものを含む。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を製造するためのその他の方法は、当業者には周知である。
ファージディスプレイ技術。上記で記載したように、本技術の抗体は、組換えDNAおよびファージディスプレイ技術の適用によって製造され得る。例えば、抗シス-pT231-タウ抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を使用して調製され得る。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面にディスプレイされる。所望の結合特性を有するファージは、抗原、通常、固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から選択される。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するfdおよびM13を含む繊維状ファージである。さらに、シス-pT231-タウポリペプチド、例えば、ポリペプチドまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速な有効な同定を可能にするために、方法が、Fab発現ライブラリーの構築のために適用され得る(例えば、Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989を参照のこと)。本技術の抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ方法のその他の例として、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994、PCT/GB91/01134、WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401、WO96/06213、WO92/01047(Medical Research Council et al.)、WO97/08320(Morphosys)、WO92/01047(CAT/MRC)、WO91/17271(Affymax)および米国特許第5,698,426号、同5,223,409号、同5,403,484号、同5,580,717号、同5,427,908号、同5,750,753号、同5,821,047号、同5,571,698号、同5,427,908号、同5,516,637号、同5,780,225号、同5,658,727号および同5,733,743号に開示されるものが挙げられる。ジスルフィド結合によってポリペプチドを引きつけることによるバクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドをディスプレイするのに有用な方法は、Lohning、米国特許第6,753,136号によって記載されている。上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから得た抗体コーディング領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体または任意のその他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む所望の宿主において発現され得る。例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片を組換え製造するための技術もまた、WO92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992;およびSawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; およびBetter et al., Science 240: 1041-1043, 1988に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して使用され得る。
一般に、ディスプレイベクター中にクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面に存在するからであるので、良好な結合活性を維持するバリアントを同定するために適当な抗原に対して選択され得る。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)を参照のこと。しかし、選択および/またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーの溶解性ファージベクターへのクローニングなどのその他のベクターフォーマットが、このプロセスに使用され得る(修飾されたT7またはラムダZap系)。
組換え抗シス-pT231-タウ抗体の発現。上記で記載されたように、本技術の抗体は、組換えDNA技術の適用によって製造され得る。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、通常、天然において付随するまたは異種のプロモーター領域を含む、抗シス-pT231-タウ抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。そのようなものとして、本技術の別の態様は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体をコードする1つ以上の核酸配列を含有するベクターを含む。本技術の1つ以上のポリペプチドの組換え発現のために、抗シス-pT231-タウ抗体をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸は、当技術分野で周知の、以下に詳述されるような組換えDNA技術によって、適当なクローニングベクターまたは発現ベクター(すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター)に挿入される。ベクターの多様な集団を製造する方法は、Lerner et al.,米国特許第6,291,160号および同6,680,192号によって記載されている。
一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターがプラスミドの形態であることが多い。本開示では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な形態であるので同義的に使用され得る。しかし、本技術は、同等の機能を果たす技術的にプラスミドではない発現ベクターのこのようなその他の形態、例えば、ウイルスベクター(例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むように意図される。このようなウイルスベクターは、対象の感染およびその対象における構築物の発現を可能にする。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、真核細胞の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクターにおける真核細胞プロモーター系である。ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主は、抗シス-pT231-タウ抗体をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに抗シス-pT231-タウ抗体、例えば、交差反応性抗シス-pT231-タウ抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。全般的に、米国特許出願公開第2002/0199213号を参照のこと。これらの発現ベクターは、通常、エピソームとして、または宿主染色体DNAの不可欠な部分としてのいずれかで宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。ベクターはまた、細胞外抗体断片の分泌に向けるのに有用なシグナルペプチド、例えば、ペクチン酸リアーゼをコードしてもよい。米国特許第5,576,195号を参照のこと。
本技術の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で、シス-pT231-タウ結合特性を有するタンパク質をコードする核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された1つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内に、「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で(例えば、in vitro転写/翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合宿主細胞において)、対象のヌクレオチド配列が、調節配列に連結されていることを意味することを意図される。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むように意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得るということは当業者によって理解されよう。組換えポリペプチド発現(例えば、抗シス-pT231-タウ抗体)のプロモーターとして有用である通常の調節配列として、例えば、それだけには限らないが、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとして、中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームCならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターが挙げられる。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体をコードするポリヌクレオチドは、ara Bプロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞において発現可能である。米国特許第5,028,530号を参照のこと。本技術の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書において記載されるような核酸によってコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド(例えば、抗シス-pT231-タウ抗体など)を産生できる。
本技術の別の態様は、1つ以上の抗シス-pT231-タウ抗体をコードする核酸を含有する、抗シス-pT231-タウ抗体を発現する宿主細胞に関する。本技術の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における抗シス-pT231-タウ抗体の発現のために設計され得る。例えば、抗シス-pT231-タウ抗体は、大腸菌、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用する)、真菌細胞、例えば、酵母、酵母細胞または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。適した宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに論じられる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用して転写され、翻訳され得る。確率論的に作製されるポリヌクレオチド配列の発現による、所定の特性を有するポリペプチド、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体の調製およびスクリーニングにとって有用な方法は、これまでに記載されている。米国特許第5,763,192号、同5,723,323号、同5,814,476号、同5,817,483号、同5,824,514号、同5,976,862号、同6,492,107号、同6,569,641号を参照のこと。
原核生物におけるポリペプチドの発現は、大腸菌(E.coli)で融合または非融合ポリペプチドいずれかの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸を、本明細書においてコードされるポリペプチドに普通、組換えポリペプチドのアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、通常、3つの目的:(i)組換えポリペプチドの発現を増大するため、(ii)組換えポリペプチドの溶解度を増大するため、および(iii)アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を補助するためを果たす。融合発現ベクターでは、融合ポリペプチドの精製後に融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にするために、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解による切断部位が導入されることが多い。このような酵素およびその同族認識配列として、第X因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。通常の融合発現ベクターとして、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合ポリペプチドまたはポリペプチドAをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合する、pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、pMAL(New England Biolabs、マサチューセッツ州、ビバリー)およびpRIT5(Pharmacia、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)が挙げられる。
適した誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、pTrc(Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315)およびpET 11d(Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego、Calif. (1990) 60-89)が挙げられる。ポリペプチド融合によって多機能ポリペプチドを得るための、別個の活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的化されたアセンブリーの方法は、Pack et al.,米国特許第6,294,353号、同6,692,935号によって記載されている。大腸菌における組換えポリペプチド発現、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体を最大化するための1つの戦略は、組換えポリペプチドをタンパク質分解性に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現することである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照のこと。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、発現宿主、例えば、大腸菌において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照のこと)。本技術の核酸配列のこのような変更は、標準DNA合成技術によって実施され得る。
別の実施形態では、抗シス-pT231-タウ抗体発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためのベクターの例として、pYepSec1(Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz、Cell 30: 933-943, 1982)、pJRY88(Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987)、pYES2(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州、サンディエゴ)およびpicZ(Invitrogen Corp、カリフォルニア州、サンディエゴ)が挙げられる。あるいは、抗シス-pT231-タウ抗体は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現されてもよい。培養昆虫細胞(例えば、SF9細胞)における、ポリペプチド、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとして、pAcシリーズ(Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983)およびpVLシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、例えば、それだけには限らないが、pCDM8(Seed, Nature 329: 840, 1987)およびpMT2PC(Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987)が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス40に由来する。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の発現に適している原核細胞および真核細胞両方のためのその他の適した発現系については、例えば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989のChapter 16および17を参照のこと。
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において核酸の発現を指示可能である(例えば、組織特異的調節エレメント)。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。適した組織特異的プロモーターの限定されない例として、アルブミンプロモーター(肝臓特異的; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987)、リンパ球特異的プロモーター(Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988)、T細胞受容体のプロモーター(Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989)および免疫グロブリン(Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740;Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター;米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開第264,166号)が挙げられる。発達によって調節されるプロモーターも包含される、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990)およびα-胎児タンパク質プロモーター(Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989)。
本方法の別の態様は、本技術の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことは理解される。特定の修飾は突然変異または環境影響いずれかのために続く世代において生じ得るので、このような後代は、親細胞と実際同一ではない場合もあるが、本明細書における用語の範囲内に依然として含まれる。
本方法の別の態様は、本技術の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことは理解される。特定の修飾は突然変異または環境影響いずれかのために続く世代において生じ得るので、このような後代は、親細胞と実際同一ではない場合もあるが、本明細書における用語の範囲内に依然として含まれる。
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、抗シス-pT231-タウ抗体は、大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための適した宿主である。Winnacker, From Genes To Clones(VCH Publishers, NY, 1987)を参照のこと。無傷の異種タンパク質を分泌可能ないくつかの適した宿主細胞株が当技術分野で開発されており、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、種々のCOS細胞株、HeLa細胞、L細胞および骨髄腫細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒトである。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986。例示的発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992。その他の適した宿主細胞は、当業者に公知である。
ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞中に導入され得る。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃またはウイルスベーストランスフェクションを含む、外来核酸(例えば、DNA)を宿主細胞中に導入するための種々の技術分野で認識された技術を指すように意図される。哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるその他の方法として、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる(全般的には、Sambrook et al.,Molecular Cloningを参照のこと)。宿主細胞に形質導入するまたはトランスフェクトするための適した方法は、Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)およびその他の実験室マニュアルに見出すことができる。対象のDNAセグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて周知の方法によって宿主細胞中に移行され得る。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小画分のみが外来DNAをそのゲノム中に組み込み得るということがわかっている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般に、選択マーカー(例えば、抗生物質に対する耐性)をコードする遺伝子が、対象の遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。種々の選択マーカーとして、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、抗シス-pT231-タウ抗体をコードするものと同一ベクターで宿主細胞中に導入され得る、または別個のベクターで導入され得る。導入される核酸を用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る(例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、その他の細胞は死滅する)。
培養中の原核細胞または真核細胞の宿主細胞などの本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を含む宿主細胞は、組換え抗シス-pT231-タウ抗体を製造(すなわち、発現)するために使用され得る。一実施形態では、方法は、宿主細胞(シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え発現ベクターが導入されている)を、抗シス-pT231-タウ抗体が産生されるような適した培地中で培養することを含む。別の実施形態では、方法は、抗シス-pT231-タウ抗体を、培地または宿主細胞から単離するステップをさらに含む。ひとたび発現されると、抗シス-pT231-タウ抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体または抗シス-pT231-タウ抗体関連ポリペプチドの収集物は、培養培地および宿主細胞から精製される。抗シス-pT231-タウ抗体は、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順に従って精製され得る。一実施形態では、抗シス-pT231-タウ抗体は、Boss et al.米国特許第4,816,397号の方法によって宿主生物において産生される。普通、抗シス-pT231-タウ抗体鎖は、シグナル配列とともに発現され、したがって、培養培地中に放出される。しかし、抗シス-pT231-タウ抗体鎖が、宿主細胞によって自然に分泌されない場合には、抗シス-pT231-タウ抗体鎖は、穏やかな洗浄剤を用いる処置によって放出され得る。組換えポリペプチドの精製は、当技術分野で周知であり、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが挙げられる(全般的には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag、N.Y.、1982)を参照のこと。
培養中の原核細胞または真核細胞の宿主細胞などの本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を含む宿主細胞は、組換え抗シス-pT231-タウ抗体を製造(すなわち、発現)するために使用され得る。一実施形態では、方法は、宿主細胞(シス-pT231-タウ抗体をコードする組換え発現ベクターが導入されている)を、抗シス-pT231-タウ抗体が産生されるような適した培地中で培養することを含む。別の実施形態では、方法は、抗シス-pT231-タウ抗体を、培地または宿主細胞から単離するステップをさらに含む。ひとたび発現されると、抗シス-pT231-タウ抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体または抗シス-pT231-タウ抗体関連ポリペプチドの収集物は、培養培地および宿主細胞から精製される。抗シス-pT231-タウ抗体は、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順に従って精製され得る。一実施形態では、抗シス-pT231-タウ抗体は、Boss et al.米国特許第4,816,397号の方法によって宿主生物において産生される。普通、抗シス-pT231-タウ抗体鎖は、シグナル配列とともに発現され、したがって、培養培地中に放出される。しかし、抗シス-pT231-タウ抗体鎖が、宿主細胞によって自然に分泌されない場合には、抗シス-pT231-タウ抗体鎖は、穏やかな洗浄剤を用いる処置によって放出され得る。組換えポリペプチドの精製は、当技術分野で周知であり、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが挙げられる(全般的には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag、N.Y.、1982)を参照のこと。
抗シス-pT231-タウ抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳におけるその後の発現のために導入遺伝子に組み込まれ得る。例えば、米国特許第5,741,957号、同5,304,489号および同5,849,992号を参照のこと。適した導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子、例えば、カゼインまたはβ-ラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にある軽鎖および/または重鎖のコード配列を含む。トランスジェニック動物の製造のためには、導入遺伝子は、受精した卵母細胞中にマイクロインジェクションされてもよい、または胚幹細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、このような細胞の核は、除核された卵母細胞に移される。
一本鎖抗体。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、一本鎖抗シス-pT231-タウ抗体である。本技術によれば、技術は、シス-pT231-タウタンパク質に特異的な一本鎖抗体の製造のために採用され得る(例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと)。一本鎖Fvおよび本技術の抗体を製造するために使用され得る技術の例として、米国特許第4,946,778号および同5,258,498号; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993;およびSkerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988に記載されるものが挙げられる。
キメラおよびヒト化抗体。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、キメラ抗シス-pT231-タウ抗体である。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、ヒト化抗シス-pT231-タウ抗体である。本技術の一実施形態では、ドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり(ヒトにおけるその抗原性を最小化するために)、その場合には、得られたCDR移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。
組換え抗シス-pT231-タウ抗体、例えば、ヒトおよび非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準組換えDNA技術を使用して作製され得、本技術の範囲内である。ヒトにおける本技術の抗シス-pT231-タウ抗体のin vivo使用ならびにin vitro検出アッセイにおけるこれらの物質の使用を含むいくつかの使用のために、キメラまたはヒト化抗シス-pT231-タウ抗体を使用することがあり得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技術によって製造され得る。このような有用な方法として、例えば、それだけには限らないが、国際出願番号PCT/US86/02269、米国特許第5,225,539号、欧州特許第184187号、欧州特許第171496号、欧州特許第173494号、PCT国際公開番号WO86/01533、米国特許第4,816,567号、同5,225,539号、欧州特許第125023号、Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988に記載される方法が挙げられる。例えば、抗体は、CDR移植(EP0239400、WO91/09967、米国特許第5,530,101号、同5,585,089号、同5,859,205号、同6,248,516号、EP460167)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(EP0592106、EP0519596、Padlan E. A., Molecular Immunology、28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994)およびチェーンシャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)を含む種々の技術を使用してヒト化され得る。一実施形態では、マウス抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体をコードするcDNAは、Fc定常領域をコードする配列を除去するように特別に選択された制限酵素を用いて消化され、ヒトFc定常領域をコードするcDNAの同等部分が置換される(Robinson et al.、PCT/US86/02269;Akira et al.、欧州特許出願第184,187号; Taniguchi、欧州特許出願第171,496号; Morrison et al.、欧州特許出願第173,494号; Neuberger et al.、WO86/01533; Cabilly et al.、米国特許第4,816,567号; Cabilly et al.、欧州特許出願第125,023号; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559;米国特許第6,180,370号;米国特許第6,300,064号;同6,696,248号;同6,706,484号;同6,828,422号。
組換え抗シス-pT231-タウ抗体、例えば、ヒトおよび非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準組換えDNA技術を使用して作製され得、本技術の範囲内である。ヒトにおける本技術の抗シス-pT231-タウ抗体のin vivo使用ならびにin vitro検出アッセイにおけるこれらの物質の使用を含むいくつかの使用のために、キメラまたはヒト化抗シス-pT231-タウ抗体を使用することがあり得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技術によって製造され得る。このような有用な方法として、例えば、それだけには限らないが、国際出願番号PCT/US86/02269、米国特許第5,225,539号、欧州特許第184187号、欧州特許第171496号、欧州特許第173494号、PCT国際公開番号WO86/01533、米国特許第4,816,567号、同5,225,539号、欧州特許第125023号、Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988に記載される方法が挙げられる。例えば、抗体は、CDR移植(EP0239400、WO91/09967、米国特許第5,530,101号、同5,585,089号、同5,859,205号、同6,248,516号、EP460167)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(EP0592106、EP0519596、Padlan E. A., Molecular Immunology、28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994)およびチェーンシャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)を含む種々の技術を使用してヒト化され得る。一実施形態では、マウス抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体をコードするcDNAは、Fc定常領域をコードする配列を除去するように特別に選択された制限酵素を用いて消化され、ヒトFc定常領域をコードするcDNAの同等部分が置換される(Robinson et al.、PCT/US86/02269;Akira et al.、欧州特許出願第184,187号; Taniguchi、欧州特許出願第171,496号; Morrison et al.、欧州特許出願第173,494号; Neuberger et al.、WO86/01533; Cabilly et al.、米国特許第4,816,567号; Cabilly et al.、欧州特許出願第125,023号; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559;米国特許第6,180,370号;米国特許第6,300,064号;同6,696,248号;同6,706,484号;同6,828,422号。
一実施形態では、本技術は、ヒト抗マウス抗体(本明細書において以下、「HAMA」と呼ばれる)応答を誘導する可能性が低く、一方で、有効な抗体エフェクター機能は依然として有するヒト化抗シス-pT231-タウ抗体の構築を提供する。本明細書において、抗体に関連して、用語「ヒト」および「ヒト化」は、ヒト対象において治療上許容される弱い免疫原性応答を誘発するように予測される任意の抗体に関する。一実施形態では、本技術は、ヒト化抗シス-pT231-タウ抗体、重鎖および軽鎖免疫グロブリンを提供する。
CDR抗体。いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、抗シス-pT231-タウCDR抗体である。全般的に、抗シス-pT231-タウCDR抗体を作製するために使用されるドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体であり、通常、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり(ヒトにおける抗原性を最小化するために)、その場合には、得られたCDR移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。移植は、アクセプター抗体の単一VHまたはVL内の単一CDR(またはさらに単一CDRの一部)のものであり得る、またはVHおよびVLの一方または両方内の複数のCDR(またはその一部)のものであり得る。得られたCDR移植抗体のシス-pT231-タウタンパク質との適切な結合を可能にするのに必要な数だけを置き換えることを必要とするが、アクセプター抗体のすべての可変ドメインの3つのCDRすべてが置き換えられることが多い。CDR移植およびヒト化抗体を作製する方法は、Queen et al.米国特許第5,585,089号;米国特許第5,693,761号;米国特許第5,693,762号;およびWinter 米国特許第5,225,539号;およびEP0682040によって教示される。VHおよびVLポリペプチドを調製するのに有用な方法は、Winter et al.米国特許第4,816,397号;同6,291,158号;同6,291,159号;同6,291,161号;同6,545,142号;EP0368684;EP0451216;およびEP0120694によって教示される。
同一ファミリーおよび/または同一ファミリーメンバーから適したフレームワーク領域候補を選択した後、元の種からハイブリッドフレームワーク領域中にCDRを移植することによって、重鎖および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方が製造される。上記の態様のいずれかに関して、当業者に公知の従来の方法を使用して、ハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片のアセンブリーが達成され得る。例えば、本明細書において記載されるハイブリッド可変ドメイン(すなわち、標的種および元の種に由来するCDRをベースとするフレームワーク)をコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成および/またはPCRによって製造され得る。CDR領域をコードする核酸はまた、適した制限酵素を使用して元の種の抗体から単離され、適したライゲーション酵素を用いてライゲーションすることによって標的種フレームワーク中にライゲーションされ得る。あるいは、元の種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的突然変異誘発によって変更され得る。
各フレームワーク領域に対応する複数の候補の中から選択してハイブリッドが構築されるので、本明細書において記載される原理に従う構築を受け入れる配列の多数の組合せが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の異なる組合せを有するメンバーを有するハイブリッドのライブラリーがアセンブルされ得る。このようなライブラリーは、ハイブリッドの、配列の電子データベース収集物または物理的収集物であり得る。
このプロセスは、通常、移植CDRをフランキングするアクセプター抗体のFRを変更しない。しかし、当業者ならば、時には、ドナー抗体の対応するFRにより同様のFRを作製するために、所与のFRの特定の残基を置き換えることによって、得られた抗シス-pT231-タウCDR移植抗体の抗原結合親和性を改善できる。置換の適した位置は、CDRに隣接する、またはCDRと相互作用可能なアミノ酸残基を含む(例えば、US5,585,089、特に列12~16を参照のこと)。または当業者ならば、ドナーFRを用いて開始し、アクセプターFRまたはヒトコンセンサスFRとより同様であるように修飾できる。これらの修飾を行う技術は、当技術分野で公知である。特に、得られたFRが、その位置のヒトコンセンサスFRと適合する、またはこのようなコンセンサスFRに対して少なくとも90%またはそれ以上同一である場合には、そのようにすることは、得られた修飾された抗シス-pT231-タウCDR移植抗体の抗原性を、完全ヒトFRを有する同一抗体と比較して有意に増大しない可能性がある。
このプロセスは、通常、移植CDRをフランキングするアクセプター抗体のFRを変更しない。しかし、当業者ならば、時には、ドナー抗体の対応するFRにより同様のFRを作製するために、所与のFRの特定の残基を置き換えることによって、得られた抗シス-pT231-タウCDR移植抗体の抗原結合親和性を改善できる。置換の適した位置は、CDRに隣接する、またはCDRと相互作用可能なアミノ酸残基を含む(例えば、US5,585,089、特に列12~16を参照のこと)。または当業者ならば、ドナーFRを用いて開始し、アクセプターFRまたはヒトコンセンサスFRとより同様であるように修飾できる。これらの修飾を行う技術は、当技術分野で公知である。特に、得られたFRが、その位置のヒトコンセンサスFRと適合する、またはこのようなコンセンサスFRに対して少なくとも90%またはそれ以上同一である場合には、そのようにすることは、得られた修飾された抗シス-pT231-タウCDR移植抗体の抗原性を、完全ヒトFRを有する同一抗体と比較して有意に増大しない可能性がある。
融合タンパク質。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、融合タンパク質である。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、第2のタンパク質に融合された場合、抗原性タグとして使用され得る。ポリペプチドに融合され得るドメインの例として、異種シグナル配列だけでなく、その他の異種機能性領域も挙げられる。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こる場合もある。さらに、本技術の融合タンパク質はまた、抗シス-pT231-タウ抗体の特徴を改善するように遺伝子操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域は、宿主細胞からの精製またはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改善するために、抗シス-pT231-タウ抗体のN末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を促進するために抗シス-pT231-タウ抗体に付加され得る。このような領域は、抗シス-pT231-タウ抗体の最終調製に先立って除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを促進するためのペプチド部分の付加は、当技術分野ではよく知られており、日常的な技術である。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、ペプチドなどのマーカー配列に融合されてもよく、これは、融合されたポリペプチドの精製を促進する。選択実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、中でも、その多くが市販されているpQEベクター(QIAGEN、Inc.、カリフォルニア州、チャッツワース)において提供されるタグである。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグ、「HA」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。Wilson et al., Cell 37: 767, 1984。
したがって、これらの上記の融合タンパク質のいずれも、本技術のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して遺伝子操作され得る。また、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される融合タンパク質は、in vivoで半減期の増大を示す。
ジスルフィド結合された二量体構造(IgGによる)を有する融合タンパク質は、単量体で分泌されるタンパク質またはタンパク質断片単独と比較して、その他の分子に結合および中和することにおいてより有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
ジスルフィド結合された二量体構造(IgGによる)を有する融合タンパク質は、単量体で分泌されるタンパク質またはタンパク質断片単独と比較して、その他の分子に結合および中和することにおいてより有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
同様に、EP-A-O 464533(カナダ対応物2045869)には、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質が、別のヒトタンパク質またはその断片と一緒に開示されている。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、療法および診断において有益であり、したがって、例えば、薬物動態特性の改善をもたらし得る。EP-A0232262を参照のこと。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後にFc部分を欠失することが望まれることもある。例えば、融合タンパク質が免疫処置の抗原として使用される場合には、Fc部分が、療法および診断を妨げることもある。創薬では、例えば、hIL-5などのヒトタンパク質が、hIL-5のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを目的としてFc部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995。
標識された抗シス-pT231-タウ抗体。一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、標識部分、すなわち、検出可能な基とカップリングされている。抗シス-pT231-タウ抗体にコンジュゲートされた特定の標識または検出可能な基は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体のシス-pT231-タウタンパク質との特異的結合を大幅に干渉しない限り、技術の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイおよびイメージングの分野では十分に開発されている。一般に、このような方法において有用なほとんどあらゆる標識が、本技術に適用され得る。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本技術の実施において有用な標識として、磁性ビーズ(例えば、Dynabeads(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど)、放射標識(例えば、3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、マイクロバブルなどのその他の造影剤(超音波イメージングのための)、18F、11C、15O(陽電子放射型断層撮影のための)、99mTC、111In(単一光子放出型コンピュータ断層撮影のための)、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびELISAにおいて一般に使用されるその他のもの)およびコロイド金などの熱量測定標識または着色ガラスまたはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズが挙げられる。このような標識の使用を記載する特許として、米国特許第3,817,837号、同3,850,752号、同3,939,350号、同3,996,345号、同4,277,437号、同4,275,149号および同4,366,241号が挙げられ、各々、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。またHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)も参照のこと。
標識は、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的にまたは間接的にカップリングされている。上記で示されたように、広範な標識が使用されてもよく、標識の選択は、必要な感受性、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性必要条件、入手可能な計測手段および廃棄規定などの因子に応じて変わる。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。一般に、リガンド分子(例えば、ビオチン)は、分子に共有結合によって結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合によって結合された抗リガンド(例えば、ストレプトアビジン)分子と結合する。いくつかのリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンドが、中性抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾールを有する場合には、標識された天然に存在する抗リガンドとともに使用され得る。あるいは、任意のハプテン性または抗原性化合物が、抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体と組み合わせて使用され得る。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。一般に、リガンド分子(例えば、ビオチン)は、分子に共有結合によって結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合によって結合された抗リガンド(例えば、ストレプトアビジン)分子と結合する。いくつかのリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンドが、中性抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾールを有する場合には、標識された天然に存在する抗リガンドとともに使用され得る。あるいは、任意のハプテン性または抗原性化合物が、抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体と組み合わせて使用され得る。
分子はまた、シグナル生成化合物に直接的に、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションによってコンジュゲートされ得る。標識として対象の酵素は、主に、ヒドロラーゼ、特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたは酸化還元酵素、特に、ペルオキシダーゼとなる。標識部分として有用である蛍光化合物として、それだけには限らないが、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。標識部分として有用である化学発光化合物として、それだけには限らないが、例えば、ルシフェリンおよび2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。使用され得る、種々の標識またはシグナル生成系の概要については、米国特許第4,391,904を参照のこと。
標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合には、検出のための手段として、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合には、光の適当な波長を用いて蛍光色素を励起することおよび得られた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子(CCD)または光電子増倍管などのような電子検出器を使用することによって視覚的に検出され得る。同様に、酵素的標識は、酵素に適当な物質を提供することおよび得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、簡単な比色標識は、標識と関連する色を観察することによって簡単に検出され得る。したがって、種々の尿試験紙アッセイにおいて、コンジュゲートされた金はピンク色に見え、一方で、種々のコンジュゲートされたビーズは、ビーズの色に見える。
いくつかのアッセイ形式は、標識された構成成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標識抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合には、抗原によってコーティングされた粒子が、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、標識されることを必要とする構成成分はなく、標識抗体の存在は、簡単な目視検査によって検出される。
いくつかのアッセイ形式は、標識された構成成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標識抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合には、抗原によってコーティングされた粒子が、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、標識されることを必要とする構成成分はなく、標識抗体の存在は、簡単な目視検査によって検出される。
B.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の同定および特性決定
本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を同定および/またはスクリーニングする方法。シス-pT231-タウタンパク質に対して所望の特異性を有するものについて、シス-pT231-タウポリペプチドに対する抗体を同定およびスクリーニングするために有用な方法は、当技術分野で公知の任意の免疫学的に媒介される技術を含む。免疫応答の構成成分は、当業者に周知である種々の方法によってin vitroで検出され得る。例えば、(1)細胞傷害性Tリンパ球は、放射活性標識された標的細胞とともにインキュベートされ、これらの標的細胞の溶解は、放射活性の放出によって検出され得る、(2)ヘルパーTリンパ球は、抗原および抗原提示細胞とともにインキュベートされ、サイトカインの合成および分泌は、標準方法によって測定され得る(Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995)、(3)抗原提示細胞は、全タンパク質抗原とともにインキュベートされ、MHC上のその抗原の提示は、Tリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによって検出され得る(Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989)、(4)肥満細胞は、そのFc-イプシロン受容体と架橋結合する試薬とともにインキュベートされ、ヒスタミン放出は、酵素イムノアッセイによって測定され得る(Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983)および(5)酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)。
本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を同定および/またはスクリーニングする方法。シス-pT231-タウタンパク質に対して所望の特異性を有するものについて、シス-pT231-タウポリペプチドに対する抗体を同定およびスクリーニングするために有用な方法は、当技術分野で公知の任意の免疫学的に媒介される技術を含む。免疫応答の構成成分は、当業者に周知である種々の方法によってin vitroで検出され得る。例えば、(1)細胞傷害性Tリンパ球は、放射活性標識された標的細胞とともにインキュベートされ、これらの標的細胞の溶解は、放射活性の放出によって検出され得る、(2)ヘルパーTリンパ球は、抗原および抗原提示細胞とともにインキュベートされ、サイトカインの合成および分泌は、標準方法によって測定され得る(Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995)、(3)抗原提示細胞は、全タンパク質抗原とともにインキュベートされ、MHC上のその抗原の提示は、Tリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによって検出され得る(Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989)、(4)肥満細胞は、そのFc-イプシロン受容体と架橋結合する試薬とともにインキュベートされ、ヒスタミン放出は、酵素イムノアッセイによって測定され得る(Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983)および(5)酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)。
同様に、モデル生物(例えば、マウス)またはヒト対象いずれかにおける免疫応答の生成物はまた、当業者に周知である種々の方法によって検出され得る。例えば、(1)ワクチン接種に応じた抗体の製造は、臨床検査室において現在使用される標準方法、例えば、ELISAによって容易に検出され得る、(2)免疫細胞の炎症の部位への遊走は、皮膚の表面を引っ掻くことおよび引っ掻き部位にわたって遊走細胞を捕捉するために滅菌容器を置くことによって検出され得る(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988)、(3)マイトジェンまたは混合リンパ球反応物に応じた末梢血単核細胞(PBMC)の増殖は、3H-チミジンを使用して測定され得る、(4)PBMC中の顆粒球、マクロファージおよびその他の貪食細胞の食作用は、PBMCを標識された粒子と一緒にウェル中に入れることによって測定され得る(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988)および(5)免疫系細胞の分化は、PBMCをCD4およびCD8などのCD分子に対する抗体を用いて標識することおよびこれらのマーカーを発現するPBMCの画分を測定することによって測定され得る。
一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、複製可能な遺伝子パッケージの表面でのシス-pT231-タウペプチドのディスプレイを使用して選択される。例えば、米国特許第5,514,548号、同5,837,500号、同5,871,907号、同5,885,793号、同5,969,108号、同6,225,447号、同6,291,650号、同6,492,160号、EP585287、EP605522、EP616640、EP1024191、EP589877、EP774511、EP844306を参照のこと。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する繊維状バクテリオファージ粒子を製造/選択するのに有用な方法は、記載されている。例えば、EP774511、US5871907、US5969108、US6225447、US6291650、US6492160を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、酵母宿主細胞の表面上のシス-pT231-タウペプチドのディスプレイを使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるFvポリペプチドの単離に有用な方法は、Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10によって記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリー中でリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994およびHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997によって記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、酵母宿主細胞の表面上のシス-pT231-タウペプチドのディスプレイを使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるFvポリペプチドの単離に有用な方法は、Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10によって記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリー中でリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994およびHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997によって記載されている。
特定の実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウペプチドのtRNAディスプレイを使用して選択される。tRNAディスプレイを使用するリガンドのin vitro選択に有用な方法は、Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002によって記載されている。
一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、RNAディスプレイを使用して選択される。RNAディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するために有用な方法は、Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94: 12297-302, 1997およびNemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997によって記載されている。非天然RNAディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するのに有用な方法は、Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003に記載されている。
一実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、RNAディスプレイを使用して選択される。RNAディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するために有用な方法は、Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94: 12297-302, 1997およびNemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997によって記載されている。非天然RNAディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するのに有用な方法は、Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003に記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、グラム陰性菌の周辺質において発現され、標識されたシス-pT231-タウタンパク質と混合される。WO02/34886を参照のこと。Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004および米国特許公開第2004/0058403号に記載されるように、シス-pT231-タウタンパク質に対して親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンでは、抗シス-pT231-タウ抗体に結合された標識されたシス-pT231-タウタンパク質の濃度が増大され、細胞が、ライブラリーの残部から単離されることを可能にする。
所望の抗シス-pT231-タウ抗体の選択後、当業者に公知の任意の技術、例えば、原核細胞または真核細胞発現などによって前記抗体が大容量で製造され得ることが考慮される。例えば、それだけには限らないが、抗シス-pT231-タウハイブリッド抗体または断片である抗シス-pT231-タウ抗体は、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来技術を使用して製造されてもよく、CDRおよび必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持するために必要である可変領域フレームワークの最小部分(本明細書において記載される技術に従って遺伝子操作されるので)が、元の種の抗体に由来し、抗体の残部が、本明細書において記載されるように操作される標的種免疫グロブリンに由来し、それによって、ハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターが生成する。
所望の抗シス-pT231-タウ抗体の選択後、当業者に公知の任意の技術、例えば、原核細胞または真核細胞発現などによって前記抗体が大容量で製造され得ることが考慮される。例えば、それだけには限らないが、抗シス-pT231-タウハイブリッド抗体または断片である抗シス-pT231-タウ抗体は、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来技術を使用して製造されてもよく、CDRおよび必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持するために必要である可変領域フレームワークの最小部分(本明細書において記載される技術に従って遺伝子操作されるので)が、元の種の抗体に由来し、抗体の残部が、本明細書において記載されるように操作される標的種免疫グロブリンに由来し、それによって、ハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターが生成する。
シス-pT231-タウ結合の測定。いくつかの実施形態では、シス-pT231-タウ結合アッセイとは、シス-pT231-タウタンパク質および抗シス-pT231-タウ抗体が、シス-pT231-タウタンパク質と抗シス-pT231-タウ抗体間の結合に適した条件下で混合され、シス-pT231-タウタンパク質と抗シス-pT231-タウ抗体間の結合の量を評価するアッセイ形式を指す。結合の量は、シス-pT231-タウタンパク質の非存在下での結合の量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合の量または両方であり得る適した対照と比較される。結合の量は、任意の適した方法によって評価され得る。結合アッセイ法として、例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜濾過アッセイなどが挙げられる。抗シス-pT231-タウ抗体とのシス-pT231-タウタンパク質結合の直接測定のための生物物理学的アッセイとして、例えば、核磁気共鳴、蛍光、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴(BIACOREチップ)などがある。特異的結合は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ELISA、FRET、免疫沈降、SPR、NMR(2D-NMR)、質量分析などによって決定される。候補抗シス-pT231-タウ抗体の特異的結合が、候補抗シス-pT231-タウ抗体の非存在下で観察される結合よりも少なくとも1パーセント多い場合には、候補抗シス-pT231-タウ抗体は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体として有用である。
シス-pT231-タウ中和の測定。本明細書において使用されるように、「シス-pT231-タウ中和」とは、抗シス-pT231-タウ抗体の結合によるシス-pT231-タウタンパク質の活性および/または発現の低減を指す。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の、シス-pT231-タウ活性/発現を中和する能力は、当技術分野で公知の方法を使用してin vitroまたはin vivoで評価され得る。例えば、WO2014152157; Yanamandra et al., Ann Clin Transl Neurol. 2(3): 278-288 (2015)を参照のこと。
シス-pT231-タウ中和の測定。本明細書において使用されるように、「シス-pT231-タウ中和」とは、抗シス-pT231-タウ抗体の結合によるシス-pT231-タウタンパク質の活性および/または発現の低減を指す。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の、シス-pT231-タウ活性/発現を中和する能力は、当技術分野で公知の方法を使用してin vitroまたはin vivoで評価され得る。例えば、WO2014152157; Yanamandra et al., Ann Clin Transl Neurol. 2(3): 278-288 (2015)を参照のこと。
II.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の使用
全般。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質の局在性および/または定量化に関する当技術分野で公知の方法において有用である(例えば、適当なものなどの範囲内のシス-pT231-タウタンパク質のレベルの測定において使用するための)。本技術の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準技術によってシス-pT231-タウタンパク質を単離するために有用である。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、生物学的サンプル、例えば、哺乳動物血清または細胞からの天然免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の精製、ならびに宿主系において発現された組換えによって製造された免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の精製を促進し得る。さらに、抗シス-pT231-タウ抗体は、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質(例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清において)を検出して、免疫反応性ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために使用され得る。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、臨床試験手順の一部として組織における免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質レベルをモニタリングするために、例えば、所与の治療計画の有効性を調べるために診断的に使用され得る。上記で記載されるように、検出は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を、検出可能な物質にカップリングすること(すなわち、物理的に連結すること)によって促進され得る。
全般。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質の局在性および/または定量化に関する当技術分野で公知の方法において有用である(例えば、適当なものなどの範囲内のシス-pT231-タウタンパク質のレベルの測定において使用するための)。本技術の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準技術によってシス-pT231-タウタンパク質を単離するために有用である。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、生物学的サンプル、例えば、哺乳動物血清または細胞からの天然免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の精製、ならびに宿主系において発現された組換えによって製造された免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の精製を促進し得る。さらに、抗シス-pT231-タウ抗体は、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質(例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清において)を検出して、免疫反応性ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために使用され得る。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、臨床試験手順の一部として組織における免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質レベルをモニタリングするために、例えば、所与の治療計画の有効性を調べるために診断的に使用され得る。上記で記載されるように、検出は、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体を、検出可能な物質にカップリングすること(すなわち、物理的に連結すること)によって促進され得る。
シス-pT231-タウタンパク質の検出。生物学的サンプル中の免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の有無を検出するための例示的方法は、試験対象から生物学的サンプルを得ることおよび生物学的サンプルを、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出可能な本技術の抗シス-pT231-タウ抗体と接触させ、その結果、生物学的サンプルにおいて免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の存在が検出されることを含む。検出は、抗体に付着された検出可能な標識によって達成され得る。
用語「標識された」は、抗シス-pT231-タウ抗体に関して、検出可能な物質を、抗体にカップリングすること(すなわち、物理的に連結すること)による抗体の直接標識ならびに二次抗体などの直接標識される別の化合物との反応性による抗体の間接標識を包含するように意図される。間接標識の例として、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンを用いるDNAプローブの末端標識が挙げられる。
用語「標識された」は、抗シス-pT231-タウ抗体に関して、検出可能な物質を、抗体にカップリングすること(すなわち、物理的に連結すること)による抗体の直接標識ならびに二次抗体などの直接標識される別の化合物との反応性による抗体の間接標識を包含するように意図される。間接標識の例として、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンを用いるDNAプローブの末端標識が挙げられる。
本技術の検出方法は、生物学的サンプルにおいてin vitroならびにin vivoで免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出するために使用され得る。免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出するためのin vitro技術として、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ウエスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイおよび免疫蛍光が挙げられる。さらに、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の検出のためのin vivo技術は、標識された抗シス-pT231-タウ抗体を対象へ導入することを含む。例えば、抗シス-pT231-タウ抗体は、標準イメージング技術によって対象におけるその存在および位置が検出され得る放射活性マーカーを用いて標識されてもよい。一実施形態では、生物学的サンプルは、試験対象から得たシス-pT231-タウタンパク質分子を含有する。
イムノアッセイおよびイメージング。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、抗体ベース技術を使用して生物学的サンプル(例えば、ヒト血漿)において免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織におけるタンパク質発現が、古典的免疫組織学的方法を用いて研究され得る。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用なその他の抗体ベース方法として、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)などのイムノアッセイが挙げられる。適した抗体アッセイ標識は、当技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識および放射性同位元素またはその他の放射活性物質、例えば、ヨウ素(125I、121I、131I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc)ならびに蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)ならびにビオチンが挙げられる。
生物学的サンプルにおいて免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウのin vivoイメージングに使用され得る。この方法にとって有用な抗体として、X-X線撮影、NMRまたはESRによって検出可能なものが挙げられる。X-X線撮影のために、適した標識として、検出可能な放射線を発するが、対象にとって明白に有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。NMRおよびESRにとって適したマーカーとして、重水素などの検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられ、これは、関連scFv クローンの栄養分を標識することによって、抗シス-pT231-タウ抗体中に組み込まれ得る。
適当な検出可能なイメージング部分、例えば、放射性同位元素(例えば、131I、112In、99mTc)、放射性不透過性物質または核磁気共鳴によって検出可能な材料を用いて標識されている抗シス-pT231-タウ抗体が、対象中に導入される(例えば、非経口的に、皮下にまたは腹膜内に)。対象の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像を作成するのに必要なイメージング部分の量を左右するということは、当技術分野では理解されよう。放射性同位元素部分の場合には、ヒト対象のためには、注入される放射能の量は、普通、約5~20ミリキュリーの99mTcの範囲となる。標識された抗シス-pT231-タウ抗体は次いで、特異的標的ポリペプチドを含有する細胞の位置に蓄積する。例えば、標識された本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質が局在した細胞および組織において対象内に蓄積する。
適当な検出可能なイメージング部分、例えば、放射性同位元素(例えば、131I、112In、99mTc)、放射性不透過性物質または核磁気共鳴によって検出可能な材料を用いて標識されている抗シス-pT231-タウ抗体が、対象中に導入される(例えば、非経口的に、皮下にまたは腹膜内に)。対象の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像を作成するのに必要なイメージング部分の量を左右するということは、当技術分野では理解されよう。放射性同位元素部分の場合には、ヒト対象のためには、注入される放射能の量は、普通、約5~20ミリキュリーの99mTcの範囲となる。標識された抗シス-pT231-タウ抗体は次いで、特異的標的ポリペプチドを含有する細胞の位置に蓄積する。例えば、標識された本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、シス-pT231-タウタンパク質が局在した細胞および組織において対象内に蓄積する。
したがって、本技術は、医学的状態の診断方法であって、(a)個体の細胞または体液において本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の結合を測定することによって、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の発現をアッセイすることと、(b)サンプル中に存在する免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の量を、標準参照と比較することとを含み、標準と比較した免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質レベルの増大または減少が、医学的状態を示す方法を提供する。
アフィニティー精製。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質をサンプルから精製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、固相支持体上に固定化されている。このような固相支持体の例として、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合糖質、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が挙げられる。抗体をこのような固相支持体にカップリングする技術は、当技術分野で周知である(Weir et al., “Handbook of Experimental Immunology” 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974))。
抗原を抗体-支持体マトリックスに結合させる最も簡単な方法は、カラム中にビーズを集め、抗原溶液をカラムに流すことである。この方法の効率は、固定化抗体と抗原の間の接触時間に応じて変わり、これは低流速を使用することによって延長され得る。固定化抗体は、抗原を、それが流れ過ぎるときに捕捉する。あるいは、抗原は、抗原溶液を支持体(例えば、ビーズ)と混合することおよびスラリーを回転または振盪することによって抗体-支持体マトリックスと接触されてもよく、これによって、抗原と固定化抗体の間の最大接触が可能となる。結合反応が完了した後、ビーズの回収のために、スラリーはカラムに通される。適した洗浄バッファーを使用してビーズが洗浄され、次いで。純粋なまたは実質的に純粋な抗原が溶出される。
アフィニティー精製。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質をサンプルから精製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、固相支持体上に固定化されている。このような固相支持体の例として、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合糖質、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が挙げられる。抗体をこのような固相支持体にカップリングする技術は、当技術分野で周知である(Weir et al., “Handbook of Experimental Immunology” 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974))。
抗原を抗体-支持体マトリックスに結合させる最も簡単な方法は、カラム中にビーズを集め、抗原溶液をカラムに流すことである。この方法の効率は、固定化抗体と抗原の間の接触時間に応じて変わり、これは低流速を使用することによって延長され得る。固定化抗体は、抗原を、それが流れ過ぎるときに捕捉する。あるいは、抗原は、抗原溶液を支持体(例えば、ビーズ)と混合することおよびスラリーを回転または振盪することによって抗体-支持体マトリックスと接触されてもよく、これによって、抗原と固定化抗体の間の最大接触が可能となる。結合反応が完了した後、ビーズの回収のために、スラリーはカラムに通される。適した洗浄バッファーを使用してビーズが洗浄され、次いで。純粋なまたは実質的に純粋な抗原が溶出される。
対象の抗体またはポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体にコンジュゲートされ得る。さらに、第1のビーズなどの固相支持体はまた、必要に応じて、ポリペプチドの支持体とのコンジュゲーションのための本明細書において開示されるものを含む任意の適した手段によって、第2のビーズまたは支持体であり得る第2の固相支持体にコンジュゲートされてもよい。したがって、ポリペプチドの固相支持体とのコンジュゲーションに関して本明細書において開示されるコンジュゲーション方法および手段のいずれも、第1の支持体の第2の支持体とのコンジュゲーションに適用されてもよく、第1および第2の固相支持体は、同一である場合も異なっている場合もある。
ポリペプチドを固相支持体とコンジュゲートさせるために使用するための架橋結合剤であり得る適当なリンカーとして、支持体の表面上に存在する官能基と、またはポリペプチドとまたは両方と反応し得る種々の物質が挙げられる。架橋結合物質として有用である試薬として、ホモ二機能性、特に、ヘテロ二機能性試薬が挙げられる。有用な二機能性架橋結合物質として、それだけには限らないが、N-SIAB、ジマレイミド、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCCおよび6-HYNICが挙げられる。架橋結合物質は、ポリペプチドと固相支持体の間の選択的に切断可能な結合を提供するように選択され得る。例えば、感光性架橋剤、例えば、3-アミノ-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸が、固相支持体からポリペプチドを切断するための手段として使用され得る(Brown et al., Mol. Divers, pp, 4-12 (1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res., 24:351-66 (1996)および米国特許第5,643,722号)。その他の架橋結合試薬は当技術分野で周知である(例えば、Wong (1991)、前掲;およびHermanson (1996)、前掲を参照のこと)。
抗体またはポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体上に、カルボキシル基官能基付与されたビーズと、ポリペプチドのアミノ末端の間で形成された共有結合アミド結合によって、または逆に、アミノ基官能基付与されたビーズと、ポリペプチドのカルボキシル末端の間で形成された共有結合アミド結合によって固定化され得る。さらに、二機能性トリチルリンカーは、支持体、例えば、Wang樹脂などの樹脂上の4-ニトロフェニル活性エステルに、アミノ樹脂による樹脂上のアミノ基またはカルボキシル基によって付着され得る。二機能性トリチルアプローチを使用すると、固相支持体は、ポリペプチドが切断され、除去され得ることを確実にするために、ギ酸またはトリフルオロ酢酸などの揮発性酸を用いる処置を必要とし得る。このような場合には、ポリペプチドは、固相支持体のウェルの底に、または固相支持体の平坦な表面上にビーズのないパッチとして堆積されてもよい。マトリックス溶液を加えた後、ポリペプチドはMS中に放出され得る。
ポリペプチドからアミノ連結されたトリチル基を切断するために、揮発性酸または適当なマトリックス溶液、例えば、3-HPAを含有するマトリックス溶液を使用することによって、酸不安定性リンカーとして疎水性トリチルリンカーも利用され得る。酸不安定性はまた、変更され得る。例えば、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメトキシトリチルは、ポリペプチドの適当なp-置換された、またはより酸不安定性のトリチルアミン誘導体に変更されてもよい、すなわち、トリチルエーテルおよびトリチルアミン結合がポリペプチドに行われる。したがって、ポリペプチドは、例えば、疎水性引力を破壊することによって、または必要に応じて、3-HPAなどのマトリックスが酸として作用する通常のMS条件下を含む酸性条件下でトリチルエーテルもしくはトリチルアミン結合を切断することによって、疎水性リンカーから除去され得る。
ポリペプチドからアミノ連結されたトリチル基を切断するために、揮発性酸または適当なマトリックス溶液、例えば、3-HPAを含有するマトリックス溶液を使用することによって、酸不安定性リンカーとして疎水性トリチルリンカーも利用され得る。酸不安定性はまた、変更され得る。例えば、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメトキシトリチルは、ポリペプチドの適当なp-置換された、またはより酸不安定性のトリチルアミン誘導体に変更されてもよい、すなわち、トリチルエーテルおよびトリチルアミン結合がポリペプチドに行われる。したがって、ポリペプチドは、例えば、疎水性引力を破壊することによって、または必要に応じて、3-HPAなどのマトリックスが酸として作用する通常のMS条件下を含む酸性条件下でトリチルエーテルもしくはトリチルアミン結合を切断することによって、疎水性リンカーから除去され得る。
直交性に切断可能なリンカーもまた、第1の固相支持体、例えば、ビーズの第2の固相支持体への結合にとって、または対象のポリペプチドの固相支持体への結合にとって有用であり得る。このようなリンカーを使用すると、第1の固相支持体、例えば、ビーズが第2の固相支持体から、ポリペプチドを支持体から切断することなく選択的に切断され得、次いで、後の時間にポリペプチドがビーズから切断され得る。例えば、DTTなどの還元剤を使用して切断され得るジスルフィドリンカーが、ビーズを第2の固相支持体に結合するために使用されてもよく、ポリペプチドを支持体に固定化するために酸切断可能な二機能性トリチル基が使用されてもよい。必要に応じて、例えば、第1および第2の支持体間の連結は無傷なままで、ポリペプチドの固相支持体との連結が、最初に切断され得る。トリチルリンカーは、共有結合または疎水性コンジュゲーションを提供し得るが、コンジュゲーションの性質に関わらず、トリチル基は、酸性条件において容易に切断される。
例えば、ビーズは、ビーズの固相支持体との高密度結合、またはポリペプチドのビーズとの高密度結合が促進されるような、長さおよび科学的性質を有するように選択され得る連結基によって第2の支持体に結合され得る。このような連結基は、例えば、「ツリー状」構造を有し、それによって、固相支持体上の付着部位あたりに多様な官能基を提供し得る。このような連結基の例として、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ペンタエリスロールおよびトリス-ヒドロキシ-アミノメタンが挙げられる。
非共有結合関連。非共有結合相互作用によって、抗体またはポリペプチドは、固相支持体にコンジュゲートされ得る、または第1の固相支持体はまた、第2の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、磁化されることが可能である強磁性材料で作製された磁性ビーズは、磁性固相支持体に引き寄せられ得る、また磁場の除去によって支持体から放出され得る。あるいは、固相支持体は、イオン性または疎水性部分を提供されてもよく、これは、それぞれ、イオン性または疎水性部分の、ポリペプチド、例えば、付着されたトリチル基を含有するポリペプチドとの、または疎水性を有する第2の固相支持体との相互作用を可能にし得る。
非共有結合関連。非共有結合相互作用によって、抗体またはポリペプチドは、固相支持体にコンジュゲートされ得る、または第1の固相支持体はまた、第2の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、磁化されることが可能である強磁性材料で作製された磁性ビーズは、磁性固相支持体に引き寄せられ得る、また磁場の除去によって支持体から放出され得る。あるいは、固相支持体は、イオン性または疎水性部分を提供されてもよく、これは、それぞれ、イオン性または疎水性部分の、ポリペプチド、例えば、付着されたトリチル基を含有するポリペプチドとの、または疎水性を有する第2の固相支持体との相互作用を可能にし得る。
固相支持体はまた、特異的結合対のメンバーを提供されてもよく、したがって、相補性結合部分を含有するポリペプチドまたは第2の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、アビジンでまたはストレプトアビジンでコーティングされたビーズは、ビオチン部分が組み込まれたポリペプチドに、またはビオチンもしくはビオチンの誘導体、例えば、イミノビオチンでコーティングされた第2の固相支持体に結合され得る。
本明細書において開示される、そうでなければ当技術分野で公知の結合メンバーのいずれも逆転されてもよいということは理解されなくてはならない。したがって、ビオチンは、例えば、ポリペプチドまたは固相支持体のいずれかに組み込まれてもよく、逆に、アビジンまたはその他のビオチン結合部分がそれぞれ支持体またはポリペプチドに組み込まれる。本明細書において使用するために考慮されるその他の特異的結合対として、それだけには限らないが、ホルモンおよびその受容体、酵素およびその基質、ヌクレオチド配列およびその相補性配列、抗体および特異的に相互作用する抗原および当業者に公知のその他のこのような対が挙げられる。
A.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の診断的使用
全般。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、診断方法において有用である。そのようなものとして、本技術は、対象におけるシス-pT231-タウ活性の診断において抗体を使用する方法を提供する。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、任意のレベルのエピトープ結合特異性およびシス-pT231-タウタンパク質に対する極めて高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、イムノアッセイでは標的ポリペプチドを除去することなく非特異的に結合した材料を除去するために、抗体の結合親和性が高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件が実施され得る。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、普通、少なくとも108、109、1010、1011または1012M-1の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として使用される抗シス-pT231-タウは、少なくとも12時間、少なくとも5(5)時間または少なくとも1(1)時間で標準条件下で平衡に達するための十分な動力学的結合速度(on-rate)を有することが望ましい。
本明細書において開示される、そうでなければ当技術分野で公知の結合メンバーのいずれも逆転されてもよいということは理解されなくてはならない。したがって、ビオチンは、例えば、ポリペプチドまたは固相支持体のいずれかに組み込まれてもよく、逆に、アビジンまたはその他のビオチン結合部分がそれぞれ支持体またはポリペプチドに組み込まれる。本明細書において使用するために考慮されるその他の特異的結合対として、それだけには限らないが、ホルモンおよびその受容体、酵素およびその基質、ヌクレオチド配列およびその相補性配列、抗体および特異的に相互作用する抗原および当業者に公知のその他のこのような対が挙げられる。
A.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の診断的使用
全般。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、診断方法において有用である。そのようなものとして、本技術は、対象におけるシス-pT231-タウ活性の診断において抗体を使用する方法を提供する。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、任意のレベルのエピトープ結合特異性およびシス-pT231-タウタンパク質に対する極めて高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、イムノアッセイでは標的ポリペプチドを除去することなく非特異的に結合した材料を除去するために、抗体の結合親和性が高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件が実施され得る。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術の抗シス-pT231-タウ抗体は、普通、少なくとも108、109、1010、1011または1012M-1の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として使用される抗シス-pT231-タウは、少なくとも12時間、少なくとも5(5)時間または少なくとも1(1)時間で標準条件下で平衡に達するための十分な動力学的結合速度(on-rate)を有することが望ましい。
抗シス-pT231-タウ抗体は、種々の標準アッセイ形式で免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出するために使用され得る。このような形式として、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ELISA、ラジオイムノアッセイおよび免疫測定アッセイが挙げられる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)、米国特許第3,791,932号、同3,839,153号、同3,850,752号、同3,879,262号、同4,034,074号、同3,791,932号、同3,817,837号、同3,839,153号、同3,850,752号、同3,850,578号、同3,853,987号、同3,867,517号、同3,879,262号、同3,901,654号、同3,935,074号、同3,984,533号、同3,996,345号、同4,034,074号および同4,098,876号を参照のこと。生物学的サンプルは、対象の任意の組織または体液から得ることができる。特定の実施形態では、対象は、前記タウオパチーの初期段階である。一実施形態では、前記タウオパチーの初期段階は、対象から得られたサンプルにおけるシスpT231-タウのレベルの上昇またはシス:トランスpT231-タウ比の増大によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られたサンプルにおけるCSF t-タウのレベル、pT181-タウ、Αβ42またはApoE4レベルを決定することをさらに含む。特定の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液(CSF)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象は、脳外傷の反復の病歴を有する。
免疫測定またはサンドイッチアッセイは、本技術の診断方法のための1つの形式である。米国特許第4,376,110号、同4,486,530号、同5,914,241号および同5,965,375号を参照のこと。このようなアッセイは、1種の抗体、例えば、抗シス-pT231-タウ抗体または固相に固定化された抗シス-pT231-タウ抗体の集団および別の抗シス-pT231-タウ抗体または溶液中の抗シス-pT231-タウ抗体の集団を使用する。通常、溶液抗シス-pT231-タウ抗体または抗シス-pT231-タウ抗体の集団は標識される。抗体集団が使用される場合には、集団は、標的ポリペプチド内の異なるエピトープ特異性と結合する抗体を含有し得る。したがって、固相および溶液抗体の両方に同一集団が使用され得る。抗シス-pT231-タウモノクローナル抗体が使用される場合には、固体および溶液相に対して、異なる結合特異性を有する第1および第2のシス-pT231-タウモノクローナル抗体が使用される。固相(「捕捉」とも呼ばれる)および溶液(「検出」とも呼ばれる)抗体は標的抗原と、いずれかの順序でまたは同時に接触され得る。固相抗体が第1に接触される場合には、アッセイは、フォワードアッセイであると呼ばれる。逆に、溶液抗体が第1に接触される場合には、アッセイは、リバースアッセイであると呼ばれる。標的が両抗体に同時に接触される場合には、アッセイは、同時アッセイと呼ばれる。シス-pT231-タウタンパク質を、抗シス-pT231-タウ抗体と接触させた後、サンプルは、普通、約10分~約24時間で変わる期間、普通、約1時間である期間の間インキュベートされる。次いで、洗浄ステップが実施されて、診断試薬として使用されている抗シス-pT231-タウ抗体に特異的に結合していないサンプルの構成成分が除去される。固相および溶液抗体が別個のステップで結合される場合には、洗浄は、いずれかまたは両方の結合ステップの後に実施されてもよい。洗浄後、結合は、通常、標識された溶液抗体の結合によって固相に連結された標識を検出することによって定量化される。普通、抗体または抗体の集団の所与の対および所与の反応条件について、既知濃度の標的抗原を含有するサンプルから較正曲線が準備される。試験されているサンプル中の免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の濃度が次いで、較正曲線(すなわち、標準曲線)からの補間から読み取られる。解析物は、平衡で結合した標識された溶液抗体の量から、または平衡が到達される前の一連の時点での結合した標識された溶液抗体の動力学的測定によって測定され得る。このような曲線の傾斜は、サンプル中のシス-pT231-タウタンパク質の濃度の尺度である。
上記の方法において使用するための適した支持体として、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレンおよび誘導体化ナイロンメンブレンならびにまたアガロースなどの粒子、デキストランベースゲル、尿試験紙、微粒子、ミクロスフェア、磁性粒子、試験管、マイクロタイターウェル、SEPHADEX(商標)(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)などが挙げられる。固定化は、吸収によってでも、共有結合的付着によってでもよい。抗シス-pT231-タウ抗体が、アビジンなどの表面に結合されたリンカーへの付着のためにビオチンなどのリンカー分子につながれてもよい。
B.本技術の抗シス-pT231-タウ抗体の治療的使用
本技術の抗体は、病的に高レベルのリン酸化タウタンパク質のシス-コンホメーションを特徴とする神経疾患の処置にとって有用である。このような処置は、病的に高レベルのリン酸化タウのシス-コンホメーションを有すると同定された患者(例えば、本明細書において記載される方法によって診断されたもの)において、またはこのような病的レベルと関連するとわかっている疾患を有すると診断された患者において使用され得る。本技術の抗体によって処置され得る神経疾患の例として、アルツハイマー病(AD)、軽度認知障害(MCI)、パーキンソン病(PD)、大脳皮質基底核変性症、ピック病、卒中、外傷性脳損傷(TBI)、慢性外傷性脳症(CTE)、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症および亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
本技術の抗体は、病的に高レベルのリン酸化タウタンパク質のシス-コンホメーションを特徴とする神経疾患の処置にとって有用である。このような処置は、病的に高レベルのリン酸化タウのシス-コンホメーションを有すると同定された患者(例えば、本明細書において記載される方法によって診断されたもの)において、またはこのような病的レベルと関連するとわかっている疾患を有すると診断された患者において使用され得る。本技術の抗体によって処置され得る神経疾患の例として、アルツハイマー病(AD)、軽度認知障害(MCI)、パーキンソン病(PD)、大脳皮質基底核変性症、ピック病、卒中、外傷性脳損傷(TBI)、慢性外傷性脳症(CTE)、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症および亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
本技術の組成物は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇と関連している神経疾患の処置において有用なその他の治療薬とともに使用され得る。例えば、本技術の抗体は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムからなる群から選択される少なくとも1種のさらなる治療薬とともに別個に、逐次または同時に投与され得る。
本技術の組成物は、単回ボーラスとしてそれを必要とする対象に投与されてもよい。あるいは、投薬計画は、タウNFTの出現後種々の時間で実施される複数回投与を含んでもよい。
投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に(静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に)、直腸性に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、または局所的にを含む任意の適した経路で実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。記載されるような医学的状態の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、1回または複数回用量でそれを必要とする対象に投与され得る医薬製剤を含む。投与計画は、所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するように調整され得る。
本技術の組成物は、単回ボーラスとしてそれを必要とする対象に投与されてもよい。あるいは、投薬計画は、タウNFTの出現後種々の時間で実施される複数回投与を含んでもよい。
投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に(静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に)、直腸性に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、または局所的にを含む任意の適した経路で実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。記載されるような医学的状態の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、1回または複数回用量でそれを必要とする対象に投与され得る医薬製剤を含む。投与計画は、所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するように調整され得る。
通常、治療効果を達成するのに十分な本技術の抗体組成物の有効量は、約0.000001mg/体重1キログラム/日~約10,000mg/体重1キログラム/日の範囲である。通常、投与量範囲は、約0.0001mg/体重1キログラム/日~約100mg/体重1キログラム/日である。抗シス-pT231-タウ抗体の投与については、投与量は、対象の体重の約0.0001~100mg/kg、より普通は、0.01~5mg/kg毎週、2週毎または3週毎の範囲である。例えば、投与量は、1mg/体重1kgまたは10mg/体重1kg毎週、2週毎もしくは3週毎または1~10mg/kg毎週、2週毎もしくは3週毎の範囲内であり得る。一実施形態では、抗体の単回投与量は、0.1~10,000マイクログラム/体重1kgの範囲である。一実施形態では、担体中の抗体濃度は、送達されるミリリットルあたり0.2~2000マイクログラムの範囲である。例示的処置投与計画は、2週に1回または1カ月に1回または3~6カ月毎に1回の投与を伴う。抗シス-pT231-タウ抗体は、複数回投与され得る。単回投与量の間の間隔は、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔は、対象における抗体の血液レベルを測定することによって示されるので、不定期である場合もある。いくつかの方法では、投与量は、約75μg/mL~約125μg/mL、100μg/mL~約150μg/mL、約125μg/mL~約175μg/mLまたは約150μg/mL~約200μg/mLの対象における血清抗体濃度を達成するように調整される。あるいは、抗シス-pT231-タウ抗体は、徐放製剤として投与されることがあり、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変わる。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変わる。予防的適用では、比較的低い投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。治療的適用では、疾患の進行が低減もしくは終結されるまで、または対象が、疾患の症状の部分的もしくは完全寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が時には必要とされる。その後、患者は、予防的投与計画を投与され得る。
毒性。最適には、本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体の有効量(例えば、用量)は、対象に実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供する。本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体の毒性は、細胞培養または実験動物における標準製薬手順によって、例えば、LD50(集団の50%に対する致死用量)またはLD100(集団の100%に対する致死用量)を決定することによって決定され得る。毒性および治療効果の間の用量比が治療係数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータが、ヒトにおいて使用するための毒性ではない投与量範囲の策定において使用され得る。本明細書において記載される抗シス-pT231-タウ抗体の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形および利用される投与経路に従ってこの範囲内で変わり得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、対象の状態を鑑みて個々の医師によって選択され得る。例えば、Fingl et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975)を参照のこと。
医薬組成物の製剤化。本技術の方法に従って、抗シス-pT231-タウ抗体は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。医薬組成物は、一般に、組換えまたは実質的に精製された天然抗体および医薬上許容される担体を、対象への投与に適した形態で含む。医薬上許容される担体は、投与される個々の組成物の一部において、ならびに組成物を投与するために使用される個々の方法によって決定される。したがって、抗体組成物を投与するための医薬組成物のさまざまな適した製剤化がある(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990を参照のこと)。医薬組成物は、一般に、無菌で、実質的に等張性として、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準(GMP)規制に完全準拠して製剤化される。
用語「医薬上許容される」、「生理学的に許容される」およびそれらの文法的変形は、それらが、組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合、同義的に使用され、材料が組成物の投与を妨げる程度に、望ましくない生理学的効果をもたらすことなく、対象に投与可能であることを表す。例えば、「医薬上許容される賦形剤」とは、一般に、安全な、非毒性の、望ましい医薬組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用に、ならびにヒト医薬的使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であり得る。「医薬上許容される塩およびエステル」とは、医薬上許容される、所望の薬理学的特性を有する塩およびエステルを意味する。このような塩として、組成物中に存在する酸性プロトンが、無機または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩が挙げられる。適した無機塩として、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムと形成されたものが挙げられる。適した有機塩として、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどといった有機塩基と形成されたものが挙げられる。このような塩としてまた、無機酸(例えば、塩酸および臭化水素酸)および有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸およびアルカン-およびアレン-スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸)と形成された酸付加塩が挙げられる。医薬上許容されるエステルとして、抗シス-pT231-タウ抗体中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシおよびホスホンオキシ基から形成されたエステル、例えば、C1-6 アルキルエステルが挙げられる。2つの酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルは、モノ-酸-モノ-塩またはエステルまたはジ-塩またはエステルである場合があり、同様に、2つ以上の酸性基が存在する場合には、このような基のうちいくつかまたはすべてが塩化またはエステル化され得る。この技術において名付けられた抗シス-pT231-タウ抗体は、非塩化もしくは非エステル化形態で、または塩化および/もしくはエステル化形態で存在する可能性があり、このような抗シス-pT231-タウ抗体の命名は、元の(非塩化および非エステル化)化合物およびその医薬上許容される塩およびエステルの両方を含むように意図される。また、本技術の特定の実施形態は、2つ以上の立体異性形で存在する可能性があり、このような抗シス-pT231-タウ抗体の命名は、このような立体異性体のすべての単一立体異性体およびすべての混合物(ラセミか否かに関わらず)を含むように意図される。当業者ならば、特定の薬物および本技術の組成物の投与の適当なタイミング、順序および投与量を決定するのに困難はないであろう。
このような担体または希釈剤の例として、それだけには限らないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および5%ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび硬化油などの非水性ビヒクルも使用され得る。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および化合物の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来媒体または化合物が、抗シス-pT231-タウ抗体不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補足的活性化合物も組成物中に組み込まれる。
本技術の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。本技術の抗シス-pT231-タウ抗体組成物は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内経路によって、または吸入剤として投与され得る。抗シス-pT231-タウ抗体は、種々のアクチン-または微小繊維-関連疾患を含む種々の疾患の処置において少なくとも部分的に有効であるその他の物質と組み合わせて投与されてもよい。
非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液として、以下の構成成分を挙げることができる:注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート化化合物、酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースなおの張力の調整のための化合物。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数可用量バイアルに封入され得る。
非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液として、以下の構成成分を挙げることができる:注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート化化合物、酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースなおの張力の調整のための化合物。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数可用量バイアルに封入され得る。
注射用使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために、適した担体として、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL(商標)(BASF、ニュージャージー州、パーシッパニー)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。すべての場合において、組成物は、無菌でなくてはならず、容易な注射性(syringeability)が存在する程度に流動性でなくてはならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張性化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に吸収を遅延する化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、抗シス-pT231-タウ抗体を、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち1種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量で組み込むことと、それに続く、濾過滅菌によって調製され得る。一般に、分散物は、抗シス-pT231-タウ抗体を、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製する方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分および任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。本技術の抗体は、有効成分の持続性または拍動性放出を可能にするような方法で製剤化され得る、デポー注射液または留置調製物の形態で投与され得る。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されてもよく、錠剤に打錠されてもよい。経口治療的投与目的で、抗シス-pT231-タウ抗体は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用されてもよい。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するために流体担体を使用して調製されてもよく、流体担体中の化合物は経口的に適用され、素早く動かされ(swish)、吐出されるか飲み込まれる。医薬上適合する結合化合物および/またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または同様の性質の化合物のうちいずれも含有し得る:微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogelまたはコーンスターチなどの崩壊化合物、ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味化合物またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーなどの矯味化合物。
吸入による投与のために、抗シス-pT231-タウ抗体は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
吸入による投与のために、抗シス-pT231-タウ抗体は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与のために、製剤中で浸透されるべき障壁に適当な浸透剤が使用される。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のための、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のためには、抗シス-pT231-タウ抗体は、当技術分野で一般に知られるような、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲルまたはクリーム中に製剤化される。
抗シス-pT231-タウ抗体はまた、坐剤(例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて)または直腸送達のための保留浣腸の形態で医薬組成物として調製され得る。
抗シス-pT231-タウ抗体はまた、坐剤(例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて)または直腸送達のための保留浣腸の形態で医薬組成物として調製され得る。
一実施形態では、抗シス-pT231-タウ抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの抗シス-pT231-タウ抗体を身体からの迅速な排出から保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかとなろう。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals、Incから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む)も、医薬上許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるような方法に従って調製され得る。
1.C.キット
本技術は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および/または処置のためのキットであって、本技術の少なくとも1種の抗体またはその機能的バリアント(例えば、置換バリアント)を含むキットを提供する。本技術のキットの上記の構成成分は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および/または処置のために、適した容器に詰められ、ラベルが付けられてもよい。上記の構成成分は、水性の、任意に無菌の溶液として、または復元のための凍結乾燥された、任意に無菌の製剤として、単位または複数回用量容器、例えば、密閉されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジおよび試験管中で貯蔵され得る。キットは、医薬組成物をより大きな容量にするために希釈するのに適した希釈剤を保持する第2の容器をさらに含み得る。適した希釈剤として、それだけには限らないが、医薬組成物の医薬上許容される賦形剤および生理食塩水溶液が挙げられる。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書および/または希釈されるか否かに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよく、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの医薬上許容されるバッファーを含むより多くの容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、適した宿主のうち1種以上のための培養培地を含む、商業的およびユーザー観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。キットは、治療薬または診断薬の市販のパッケージ中に習慣的に含まれる説明書を含んでもよく、これは、このような治療薬または診断薬の、例えば、適応症、用法、投与量、製造、投与、禁忌症に関する情報および/または使用に関わる警告を含有する。
キットは、生物学的サンプル、例えば、それだけには限らないが、例えば、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水または血液を含む、および身体組織の生検サンプルを含む任意の体液における免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生物学的サンプル中のシス-pT231-タウタンパク質と結合可能な1種以上の本技術の抗シス-pT231-タウ抗体(またはその抗原結合断片)、サンプル中のシス-pT231-タウタンパク質の量を決定する手段およびサンプル中の免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の量を標準と比較する手段を含み得る。抗シス-pT231-タウ抗体の1種以上は標識され得る。キット構成成分(例えば、試薬)は、適した容器中に詰められ得る。キットは、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出するためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。
本技術は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および/または処置のためのキットであって、本技術の少なくとも1種の抗体またはその機能的バリアント(例えば、置換バリアント)を含むキットを提供する。本技術のキットの上記の構成成分は、シス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および/または処置のために、適した容器に詰められ、ラベルが付けられてもよい。上記の構成成分は、水性の、任意に無菌の溶液として、または復元のための凍結乾燥された、任意に無菌の製剤として、単位または複数回用量容器、例えば、密閉されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジおよび試験管中で貯蔵され得る。キットは、医薬組成物をより大きな容量にするために希釈するのに適した希釈剤を保持する第2の容器をさらに含み得る。適した希釈剤として、それだけには限らないが、医薬組成物の医薬上許容される賦形剤および生理食塩水溶液が挙げられる。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書および/または希釈されるか否かに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよく、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの医薬上許容されるバッファーを含むより多くの容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、適した宿主のうち1種以上のための培養培地を含む、商業的およびユーザー観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。キットは、治療薬または診断薬の市販のパッケージ中に習慣的に含まれる説明書を含んでもよく、これは、このような治療薬または診断薬の、例えば、適応症、用法、投与量、製造、投与、禁忌症に関する情報および/または使用に関わる警告を含有する。
キットは、生物学的サンプル、例えば、それだけには限らないが、例えば、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水または血液を含む、および身体組織の生検サンプルを含む任意の体液における免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生物学的サンプル中のシス-pT231-タウタンパク質と結合可能な1種以上の本技術の抗シス-pT231-タウ抗体(またはその抗原結合断片)、サンプル中のシス-pT231-タウタンパク質の量を決定する手段およびサンプル中の免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質の量を標準と比較する手段を含み得る。抗シス-pT231-タウ抗体の1種以上は標識され得る。キット構成成分(例えば、試薬)は、適した容器中に詰められ得る。キットは、免疫反応性シス-pT231-タウタンパク質を検出するためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。
抗体ベースのキットについては、キットは、例えば、1)第1の抗体、例えば、シス-pT231-タウタンパク質と結合する、固相支持体に付着された本技術のシス-pT231-タウ抗体と、任意に、2)シス-pT231-タウタンパク質または第1の抗体のいずれかと結合する、検出可能な標識にコンジュゲートされる第2の異なる抗体とを含み得る。
キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な構成成分、例えば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイされ、試験サンプルと比較され得る、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含有し得る。キットの各成分は、個々の容器内に封入されてもよく、種々の容器のすべては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに単一パッケージ内にあり得る。本技術のキットは、キット容器上または中に書面の製品を含有し得る。書面の製品には、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置のための、例えば、in vitroまたはin vivoでシス-pT231-タウタンパク質の検出のための、キット中に含有される試薬の使用方法が記載されている。特定の実施形態では、試薬の使用は、本技術の方法に従い得る。
キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な構成成分、例えば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイされ、試験サンプルと比較され得る、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含有し得る。キットの各成分は、個々の容器内に封入されてもよく、種々の容器のすべては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに単一パッケージ内にあり得る。本技術のキットは、キット容器上または中に書面の製品を含有し得る。書面の製品には、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置のための、例えば、in vitroまたはin vivoでシス-pT231-タウタンパク質の検出のための、キット中に含有される試薬の使用方法が記載されている。特定の実施形態では、試薬の使用は、本技術の方法に従い得る。
本技術は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは決して制限と解釈されてはならない。以下の実施例は、本技術の例示的コンホメーション特異的リン酸化タウ(pT231-タウ)抗体の調製、特性決定および使用を実証する。実施例1~12は、本技術のキメラおよびヒト化抗体の製造およびその結合特異性の特性決定を実証する。
(実施例1)
マウスPT-113モノクローナル抗体の可変領域の配列
TRIzol試薬(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド)を供給業者のプロトコールに従って使用して、およそ106個のマウスPT-113ハイブリドーマ細胞(WO2014152157を参照のこと)から全RNAを抽出した。5’-RACEのためのオリゴdTプライミングcDNAを、SMARTer RACE cDNA増幅キット(Clontech、カリフォルニア州、マウンテンビュー)を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。重鎖および軽鎖の可変ドメインcDNAを、マウス重鎖および軽鎖定常領域と特異的にアニーリングする3’プライマーおよびSMARTer RACE cDNA増幅キットにおいて提供された5’-RACEプライマーを使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。VHの増幅のための遺伝子特異的3’プライマーとしてMCG2b(5’-GCCAGTGGATAGACTGATGG-3’)を使用した。VL増幅のためには、MCK(5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’)を使用した。
増幅されたVHおよびVL cDNAを、配列決定のために pJet1.2ベクター(Thermo Fisher Scientific)にサブクローニングした。DNAシーケンシングを、Eurofins Genomics (ケンタッキー州、ルイビル)でプライマーとしてJetRev(5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’)を用いて実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンをシーケンシングし、通常のマウス重鎖および軽鎖可変領域に対して相同なユニーク配列を同定した。それぞれ、図1および2に、マウスPT-113 IgG2b/カッパモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域(VHおよびVL、それぞれ)のヌクレオチド配列が、その推定されるアミノ酸配列と並んで示されている。
マウスPT-113モノクローナル抗体の可変領域の配列
TRIzol試薬(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド)を供給業者のプロトコールに従って使用して、およそ106個のマウスPT-113ハイブリドーマ細胞(WO2014152157を参照のこと)から全RNAを抽出した。5’-RACEのためのオリゴdTプライミングcDNAを、SMARTer RACE cDNA増幅キット(Clontech、カリフォルニア州、マウンテンビュー)を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。重鎖および軽鎖の可変ドメインcDNAを、マウス重鎖および軽鎖定常領域と特異的にアニーリングする3’プライマーおよびSMARTer RACE cDNA増幅キットにおいて提供された5’-RACEプライマーを使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。VHの増幅のための遺伝子特異的3’プライマーとしてMCG2b(5’-GCCAGTGGATAGACTGATGG-3’)を使用した。VL増幅のためには、MCK(5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’)を使用した。
増幅されたVHおよびVL cDNAを、配列決定のために pJet1.2ベクター(Thermo Fisher Scientific)にサブクローニングした。DNAシーケンシングを、Eurofins Genomics (ケンタッキー州、ルイビル)でプライマーとしてJetRev(5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’)を用いて実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンをシーケンシングし、通常のマウス重鎖および軽鎖可変領域に対して相同なユニーク配列を同定した。それぞれ、図1および2に、マウスPT-113 IgG2b/カッパモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域(VHおよびVL、それぞれ)のヌクレオチド配列が、その推定されるアミノ酸配列と並んで示されている。
図3は、Kabat定義に基づく、マウスPT-113 VHドメインの各アミノ酸残基の位置および相補性決定領域(CDR)の配置を示す。図3はまた、PT-113 VHドメインとその予測されるマウス親の生殖系列VセグメントIGHV1S127*01およびそのJH2セグメントの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、PT-113VHとIGHV1S127*01アミノ酸配列の間の相違を示し、これは、体細胞高頻度変異による可能性が最も高い。
図4は、Kabat定義に基づく、マウスPT-113 VLドメインの各アミノ酸残基の位置およびCDRの配置を示す。図4はまた、PT-113 VLドメインとその予測されるマウス親の生殖系列VセグメントIGKV1-110*02(2)およびそのJκ1セグメントの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、PT-113 VLとIGKV1-110*02アミノ酸配列の間の相違を示し、これは、体細胞高頻度変異による可能性が最も高い。
図4は、Kabat定義に基づく、マウスPT-113 VLドメインの各アミノ酸残基の位置およびCDRの配置を示す。図4はまた、PT-113 VLドメインとその予測されるマウス親の生殖系列VセグメントIGKV1-110*02(2)およびそのJκ1セグメントの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、PT-113 VLとIGKV1-110*02アミノ酸配列の間の相違を示し、これは、体細胞高頻度変異による可能性が最も高い。
(実施例2)
キメラPT-113 IgG1抗体の構築
マウスPT-113抗体のVHドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、5’末端のSpeI部位および3’末端のHindIII部位を含むエキソンとして設計した(図5)。同様に、マウスPT-113抗体のVLドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、5’末端のNheI部位および3’末端のEcoRI部位を含むエキソンとして設計した(図6)。PT-113VHおよびVLエキソンにおいて、哺乳動物において稀に使用されるコドンを、頻繁に使用される対応するコドンによって置き換えた。
PT-113 VHおよびVL遺伝子をEurofins MWG Operon(アラバマ州、ハンツビル)によって合成した。SpeIおよびHindIII(VH遺伝子のために)またはNheIおよびEcoRI(VL遺伝子のために)を用いる消化後、得られたPT-113 VHおよびVL断片を、キメラPT-113(ChPT-113)IgG1/カッパ抗体の製造のためにヒトガンマ-1およびカッパ定常領域を保持する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られた発現ベクター、pChPT-113の模式的構造が図7に示されている。
キメラPT-113 IgG1抗体の構築
マウスPT-113抗体のVHドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、5’末端のSpeI部位および3’末端のHindIII部位を含むエキソンとして設計した(図5)。同様に、マウスPT-113抗体のVLドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、5’末端のNheI部位および3’末端のEcoRI部位を含むエキソンとして設計した(図6)。PT-113VHおよびVLエキソンにおいて、哺乳動物において稀に使用されるコドンを、頻繁に使用される対応するコドンによって置き換えた。
PT-113 VHおよびVL遺伝子をEurofins MWG Operon(アラバマ州、ハンツビル)によって合成した。SpeIおよびHindIII(VH遺伝子のために)またはNheIおよびEcoRI(VL遺伝子のために)を用いる消化後、得られたPT-113 VHおよびVL断片を、キメラPT-113(ChPT-113)IgG1/カッパ抗体の製造のためにヒトガンマ-1およびカッパ定常領域を保持する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られた発現ベクター、pChPT-113の模式的構造が図7に示されている。
(実施例3)
ヒト化PT-113 VHおよびVL遺伝子の設計
ヒト化PT-113 VHおよびVLアミノ酸配列の設計を、以下に記載されるように実施した。
マウスPT-113 VHフレームワークに相同なヒトVH配列をGenBankデータベース内で照会し、ヒトAF174092 cDNA(GenBank受託番号:AF174092、Wang & Stollar, Clin. Immunol. 93:132-142 (1999)において記載される)によってコードされるVH配列をヒト化のためのアクセプターとして選択した。PT-113 VHのCDR配列をまずAF174092 VHの対応する位置に移した。次いで、PT-113可変ドメインの三次元モデルが、CDRと大幅な接触を示したフレームワーク位置48、67、69、71、93および94で、AF174092 VHのアミノ酸残基を、マウスPT-113 VHの対応する残基によって置き換えた。得られたヒト化VHドメインのアミノ酸配列、HuPT-113 VH1が、マウスPT-113およびヒトAF174092 VH配列とともに図8に示されている。
ヒト化PT-113 VHおよびVL遺伝子の設計
ヒト化PT-113 VHおよびVLアミノ酸配列の設計を、以下に記載されるように実施した。
マウスPT-113 VHフレームワークに相同なヒトVH配列をGenBankデータベース内で照会し、ヒトAF174092 cDNA(GenBank受託番号:AF174092、Wang & Stollar, Clin. Immunol. 93:132-142 (1999)において記載される)によってコードされるVH配列をヒト化のためのアクセプターとして選択した。PT-113 VHのCDR配列をまずAF174092 VHの対応する位置に移した。次いで、PT-113可変ドメインの三次元モデルが、CDRと大幅な接触を示したフレームワーク位置48、67、69、71、93および94で、AF174092 VHのアミノ酸残基を、マウスPT-113 VHの対応する残基によって置き換えた。得られたヒト化VHドメインのアミノ酸配列、HuPT-113 VH1が、マウスPT-113およびヒトAF174092 VH配列とともに図8に示されている。
マウスPT-113 VHにおける位置67のAlaおよび位置69のLeuは、CDRに近接して配置され、CDR構造の形成にとって重要であると予測される一方で、PT-113 CDRの構造の詳細解析は、HuPT-113 VH1中の位置67および69の2個のアミノ酸残基のいずれか一方またはおそらくは両方が、ヒトアクセプターAF174092 VH配列の対応する残基によって置き換えられ得る可能性を示唆した。免疫原性の可能性をさらに低減するために、3つのさらなるヒト化VHドメイン(HuPT-113 VH2、HuPT-113 VH3およびHuPT-113 VH4)を設計した。HuPT-113 VH2では、HuPT-113 VH1中の位置67のAlaが、Valに変更された。HuPT-113 VH3では、HuPT-113 VH1中の位置69のLeuが、Metに変更された。HuPT-113 VH4では、HuPT-113 VH1中の位置67のAlaおよび位置69のLeuが、それぞれValおよびMetに変更された。HuPT-113 VH2、VH3およびVH4のアミノ酸配列は、図8に示されている。
マウスPT-113 VLフレームワーク配列を用いる相同性検索に基づいて、M99608 cDNA(GenBank受託番号:M99608、Weng et al. J. Immuno. 149:2518-2529 (1992)に記載される)によってコードされるヒトVκ領域を、ヒト化のためのアクセプターとして選択した。PT-113 VLのCDR配列をまずM99608 VLの対応する位置に移した。フレームワーク領域において、マウス残基とのアミノ酸置換は必要ではなかった。得られたヒト化VL、HuPT-113 VL1のアミノ酸配列は、マウスPT-113およびヒトM99608 VL配列とともに図9に示されている。
マウスPT-113 VLフレームワーク配列を用いる相同性検索に基づいて、M99608 cDNA(GenBank受託番号:M99608、Weng et al. J. Immuno. 149:2518-2529 (1992)に記載される)によってコードされるヒトVκ領域を、ヒト化のためのアクセプターとして選択した。PT-113 VLのCDR配列をまずM99608 VLの対応する位置に移した。フレームワーク領域において、マウス残基とのアミノ酸置換は必要ではなかった。得られたヒト化VL、HuPT-113 VL1のアミノ酸配列は、マウスPT-113およびヒトM99608 VL配列とともに図9に示されている。
(実施例4)
ヒト化PT-113 VHおよびVL遺伝子の構築
HuPT-113 VH1をコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、5’末端のSpeI部位および3’末端のHindIII部位を含むエキソンとして設計した(図10)。マウスPT-113 VHエキソン(図5)中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、HuPT-113 VH1のために使用した。
HuPT-113 VL1をコードする遺伝子を同様に、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、5’末端のNheI部位および3’末端のEcoRI部位を含むエキソンとして設計した(図14)。マウスPT-113 VLエキソン(図6)中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、HuPT-113 VL1のために使用した。
ヒト化PT-113 VHおよびVL遺伝子の構築
HuPT-113 VH1をコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、5’末端のSpeI部位および3’末端のHindIII部位を含むエキソンとして設計した(図10)。マウスPT-113 VHエキソン(図5)中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、HuPT-113 VH1のために使用した。
HuPT-113 VL1をコードする遺伝子を同様に、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、5’末端のNheI部位および3’末端のEcoRI部位を含むエキソンとして設計した(図14)。マウスPT-113 VLエキソン(図6)中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、HuPT-113 VL1のために使用した。
HuPT-113 VH1およびVL1遺伝子を、Eurofins MWG Operonによって合成した。SpeIおよびHindIII(VHのために)またはNheIおよびEcoRI(VLのために)を用いる消化後、HuPT-113 VH1およびHuPT-113 VL1遺伝子を、ヒトIgG1/カッパ形態での製造のために哺乳動物発現ベクター中の対応する部位にサブクローニングした。得られた発現ベクターpHuPT-113Aは、HuPT-113 VH1およびVL1(HuPT-113A)を含有するヒト化PT-113 IgG1/カッパ抗体を発現する。
HuPT-113 VH2、VH3およびVH4エキソンをコードする遺伝子(図8)を、Higuchi, R., Using PCR to Engineer DNA. In PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. 61-67 (H. A. Erlich, ed., New York, NY (1989))に記載される重複伸長PCR法を使用して、HuPT-113 VH1遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって作製した。HuPT-113 VH2、VH3およびVH4のヌクレオチド配列は、その推定されるアミノ酸配列とともに、それぞれ、図11、12および13に示されている。pHuPT-113A発現ベクター中のHuPT-113 VH1遺伝子を、HuPT-113 VH2、VH3およびVH4によって置き換えて、それぞれpHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dを作製した。HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体は、それぞれpHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dベクターから発現される。
HuPT-113 VH2、VH3およびVH4エキソンをコードする遺伝子(図8)を、Higuchi, R., Using PCR to Engineer DNA. In PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. 61-67 (H. A. Erlich, ed., New York, NY (1989))に記載される重複伸長PCR法を使用して、HuPT-113 VH1遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって作製した。HuPT-113 VH2、VH3およびVH4のヌクレオチド配列は、その推定されるアミノ酸配列とともに、それぞれ、図11、12および13に示されている。pHuPT-113A発現ベクター中のHuPT-113 VH1遺伝子を、HuPT-113 VH2、VH3およびVH4によって置き換えて、それぞれpHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dを作製した。HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体は、それぞれpHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dベクターから発現される。
(実施例5)
抗原結合についてのChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の特性決定
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の、pThr-Dmpペプチド(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH、X=5,5-ジメチル-L-プロリン)との結合を、ELISAによって特性決定した。これら5種の抗体の製造のために、pChPT-113、pHuPT-113A、pHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dベクターを、Lipofectamine2000試薬(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド)を供給業者のプロトコールに従って使用して、ヒト胚性腎臓細胞株、HEK293に個別にトランスフェクトした。HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、ユタ州、ローガン)を含有するDME培地において、7.5% CO2インキュベーター中、37℃で増殖させた。
抗原結合についてのChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の特性決定
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の、pThr-Dmpペプチド(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH、X=5,5-ジメチル-L-プロリン)との結合を、ELISAによって特性決定した。これら5種の抗体の製造のために、pChPT-113、pHuPT-113A、pHuPT-113B、pHuPT-113CおよびpHuPT-113Dベクターを、Lipofectamine2000試薬(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド)を供給業者のプロトコールに従って使用して、ヒト胚性腎臓細胞株、HEK293に個別にトランスフェクトした。HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、ユタ州、ローガン)を含有するDME培地において、7.5% CO2インキュベーター中、37℃で増殖させた。
一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞の培養上清における抗体発現を、ELISAによって解析した。ELISAプレートを、PBS中、100μl/ウェルの1/2,000希釈したヤギ抗ヒトIgG、Fcγ特異的ポリクローナル抗体(Sigma-Aldrich、ミズーリ州、セントルイス)とともに4℃で一晩コーティングし、洗浄バッファー(0.05% Tween 20を含有するPBS)を用いて洗浄し、300μl/ウェルのブロッキングバッファー(2%スキムミルクおよび0.05% Tween 20を含有するPBS)を用いてブロッキングした。洗浄バッファーを用いる洗浄後、結合バッファー(1%スキムミルクおよび0.025% Tween 20を含有するPBS)で適宜希釈された100μl/ウェルの試験サンプルを、ELISAプレートに適用した。適当なヒト化IgG1/カッパ抗体を、標準として使用した。ELISAプレートを1時間室温でインキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、結合した抗体を100μl/ウェルの1/2,000希釈されたHRPがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトカッパ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム)を使用して検出した。0.5時間室温でインキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、100μl/ウェルのABTS基質(Sigma-Aldrich)を添加することによって発色を開始し、100μl/ウェルの2%シュウ酸を用いて停止した。吸光度は、405nmで読み取った。
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の、pThr-Dmpとの結合を、ELISAによって試験した。MaxiSorp ELISAプレート(Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム)のコーティングのために、2,2,2-トリフルオロエタノール中、50μlの1μg/mlのpThr-Dmp(ロット番号1556880、AnaSpec、Fremont、CA)を、各ウェルに適用した。37℃で一晩ペプチド溶液を乾燥させた後、ELISAバッファー(150mM NaCl、5%スキムミルク、0.4%ウシ血清アルブミンおよび0.05% Tween 20を含有する10mM TrisHCl(pH 7.6))を用いてウェルをブロッキングした。ELISAバッファー中、種々の濃度の試験抗体(50μl/ウェル)をロードし、室温で2時間インキュベートした。洗浄バッファー(150mM NaCl、0.4%ウシ血清アルブミンおよび0.05% Tween 20を含有する10mM TrisHCl(pH 7.6))を用いてウェルを洗浄した後、50μl/ウェルのHRPがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体(ELISAバッファーで 1/2,000希釈された)を各ウェルに適用した。室温で1時間インキュベートした後、洗浄バッファーを用いてウェルを洗浄した。50μl/ウェルのTMB基質(1-Step Ultra TMB-ELISA、カタログ番号34028、Thermo Fisher Scientific)を用いて発色を開始し、50μl/ウェルの2N H2SO4を用いて停止した。吸光度は、450nmで測定した。
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113CおよびHuPT-113D IgG1(I)抗体の、pThr-Dmpペプチドとの結合パターンが、図15に示されている。これら5種の抗体の間でpThr-Dmp結合パターンに有意な相違は観察されなかった。さらなる解析のために、4種のヒト化PT-113抗体の中でも最小数のマウスフレームワーク残基を保持するHuPT-113D IgG1(I)を選択した。
(実施例6)
HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の構築
HuPT-113D IgG1(I)抗体の潜在的な細胞破壊的活性を排除するために、IgG抗体のエフェクター機能を排除するとわかっている(Xu et al., Cell Immunol. 200:16-26 (2000); Hezareh et al.,J. Virol. 75:12161-12168 (2001))位置234および235での(KabatのEu番号付け)LeuからAlaへのアミノ酸置換を、重複伸長PCR法(Higuchi,R(1989)、前掲を参照のこと)を使用して部位特異的突然変異誘発によってpHuPT-113D中のCH2定常領域に導入した。得られたプラスミドpHuPT-113D-AAは、HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体を発現する。
HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の構築
HuPT-113D IgG1(I)抗体の潜在的な細胞破壊的活性を排除するために、IgG抗体のエフェクター機能を排除するとわかっている(Xu et al., Cell Immunol. 200:16-26 (2000); Hezareh et al.,J. Virol. 75:12161-12168 (2001))位置234および235での(KabatのEu番号付け)LeuからAlaへのアミノ酸置換を、重複伸長PCR法(Higuchi,R(1989)、前掲を参照のこと)を使用して部位特異的突然変異誘発によってpHuPT-113D中のCH2定常領域に導入した。得られたプラスミドpHuPT-113D-AAは、HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体を発現する。
(実施例7)
ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体をもたらすCHO-K1安定なトランスフェクションの作製
ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA (I)抗体を安定に産生する細胞株を得るために、発現ベクターpChPT-113、pHuPT-113DおよびpHuPT-113D-AAを、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC、バージニア州、マナサス)の染色体中にそれぞれ導入した。CHO-K1細胞をSFM4CHO培地(HyClone、ユタ州、ローガン)において、7.5% CO2インキュベーター中37℃で増殖させた。CHO-K1への安定なトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクションの前に、各発現ベクターをFspIを使用して直線化した。およそ2.5×106個の細胞を、20μgの直線化されたプラスミドを用いてトランスフェクトし、SFM4CHO培地に懸濁し、細胞の適当な希釈後、いくつかの96ウェルプレートにプレーティングした。48時間後、安定な形質導入体の単離のために10μg/mlのピューロマイシンを添加した。選択の開始のおよそ10日後、上記のようにサンドイッチELISAによって、形質導入体の培養上清を抗体産生についてアッセイした。
高レベルのChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D-AA(I)抗体を産生するCHO-K1安定形質導入体(それぞれ、CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2)を、PCRマイコプラズマ検出セット(Takara Bio USA、ウィスコンシン州、マディソン)を用いて試験し、マイコプラズマの存在について陰性とわかった。
ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体をもたらすCHO-K1安定なトランスフェクションの作製
ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA (I)抗体を安定に産生する細胞株を得るために、発現ベクターpChPT-113、pHuPT-113DおよびpHuPT-113D-AAを、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC、バージニア州、マナサス)の染色体中にそれぞれ導入した。CHO-K1細胞をSFM4CHO培地(HyClone、ユタ州、ローガン)において、7.5% CO2インキュベーター中37℃で増殖させた。CHO-K1への安定なトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクションの前に、各発現ベクターをFspIを使用して直線化した。およそ2.5×106個の細胞を、20μgの直線化されたプラスミドを用いてトランスフェクトし、SFM4CHO培地に懸濁し、細胞の適当な希釈後、いくつかの96ウェルプレートにプレーティングした。48時間後、安定な形質導入体の単離のために10μg/mlのピューロマイシンを添加した。選択の開始のおよそ10日後、上記のようにサンドイッチELISAによって、形質導入体の培養上清を抗体産生についてアッセイした。
高レベルのChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D-AA(I)抗体を産生するCHO-K1安定形質導入体(それぞれ、CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2)を、PCRマイコプラズマ検出セット(Takara Bio USA、ウィスコンシン州、マディソン)を用いて試験し、マイコプラズマの存在について陰性とわかった。
(実施例8)
ChPT-113およびHuPT-113D IgG1/カッパ(I)抗体の精製
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞の各々を、ローラーボトル中でSFM4CHO中で約106個/mlの密度まで増殖させ、1/10容量の35mg/mlのCell Boost 4(HyClone、ユタ州、ローガン)を与え、細胞生存力が50%未満になるまでさらに増殖させた。遠心分離および濾過後、培養上清をプロテインAセファロースカラム(HiTrap MabSelect SuRe,GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)上にロードした。カラムをPBSを用いて洗浄し、その後、0.1Mグリシン-HCl(pH3.0)を用いて抗体を溶出した。1M Tris-HCl(pH8)を用いる中和後、溶出された抗体のバッファーを透析によってPBSに変更した。抗体濃度を、280nmでの吸光度(1.4OD=1mg/ml)を測定することによって決定した。500mlの培養上清からの収量は、ChPT-113 IgG1について20mg、HuPT-113D IgG1(I)について38mgおよびHuPT-113D IgG1-AA(I)について16mgであった。
ChPT-113およびHuPT-113D IgG1/カッパ(I)抗体の精製
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞の各々を、ローラーボトル中でSFM4CHO中で約106個/mlの密度まで増殖させ、1/10容量の35mg/mlのCell Boost 4(HyClone、ユタ州、ローガン)を与え、細胞生存力が50%未満になるまでさらに増殖させた。遠心分離および濾過後、培養上清をプロテインAセファロースカラム(HiTrap MabSelect SuRe,GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)上にロードした。カラムをPBSを用いて洗浄し、その後、0.1Mグリシン-HCl(pH3.0)を用いて抗体を溶出した。1M Tris-HCl(pH8)を用いる中和後、溶出された抗体のバッファーを透析によってPBSに変更した。抗体濃度を、280nmでの吸光度(1.4OD=1mg/ml)を測定することによって決定した。500mlの培養上清からの収量は、ChPT-113 IgG1について20mg、HuPT-113D IgG1(I)について38mgおよびHuPT-113D IgG1-AA(I)について16mgであった。
精製されたChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体を、標準手順に従ってSDS-PAGEによって特性決定した。還元条件下での解析は、これらの抗体の各々は、およそ50kDaの分子量を有する重鎖およびおよそ25kDaの分子量を有する軽鎖からなることを示した(図16)。各抗体の純度は、95%より高いと思われた。
(実施例9)
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞から単離された重鎖および軽鎖mRNA配列のcDNA解析
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞によって産生された重鎖および軽鎖が正しいものであることを、cDNAシーケンシングによって確認した。これらの細胞から、TRIzol試薬を使用して全RNAを抽出し、オリゴdTプライミングcDNAは、ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA合成キット(New England Biolabs、マサチューセッツ州、イプスウィッチ)を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。ガンマ重鎖のコーディング領域を、プライマーとしてCMV2およびJNT098ならびにPhusion DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)を使用するPCRによって増幅した。PCR断片をゲル精製し、プライマーとしてCMV2およびJNT098を用いるシーケンシングに付した。同様に、カッパ軽鎖のコーディング領域を、CMV2およびJNT026を使用して増幅した(図17)。ゲル精製DNA断片は、プライマーとしてCMV2およびJNT026を用いるシーケンシングに付した。
ChPT-113 IgG1重鎖、ChPT-113 IgG1軽鎖、HuPT-113D IgG1(I)重鎖、HuPT-113D IgG1(I)軽鎖、HuPT-113D IgG1-AA(I)重鎖およびHuPT-113D IgG1-AA(I)軽鎖のコーディング領域の得られたヌクレオチド配列は、pChPT-113、pHuPT-113DおよびpHuPT-113D-AAベクター中の対応する配列とすべて完全に対応していた(図18~22)。
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞から単離された重鎖および軽鎖mRNA配列のcDNA解析
CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6およびCHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2細胞によって産生された重鎖および軽鎖が正しいものであることを、cDNAシーケンシングによって確認した。これらの細胞から、TRIzol試薬を使用して全RNAを抽出し、オリゴdTプライミングcDNAは、ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA合成キット(New England Biolabs、マサチューセッツ州、イプスウィッチ)を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。ガンマ重鎖のコーディング領域を、プライマーとしてCMV2およびJNT098ならびにPhusion DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)を使用するPCRによって増幅した。PCR断片をゲル精製し、プライマーとしてCMV2およびJNT098を用いるシーケンシングに付した。同様に、カッパ軽鎖のコーディング領域を、CMV2およびJNT026を使用して増幅した(図17)。ゲル精製DNA断片は、プライマーとしてCMV2およびJNT026を用いるシーケンシングに付した。
ChPT-113 IgG1重鎖、ChPT-113 IgG1軽鎖、HuPT-113D IgG1(I)重鎖、HuPT-113D IgG1(I)軽鎖、HuPT-113D IgG1-AA(I)重鎖およびHuPT-113D IgG1-AA(I)軽鎖のコーディング領域の得られたヌクレオチド配列は、pChPT-113、pHuPT-113DおよびpHuPT-113D-AAベクター中の対応する配列とすべて完全に対応していた(図18~22)。
(実施例10)
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体の抗原結合
精製されたマウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体の、以下の4種のThr231-タウペプチド(AnaSpec(カリフォルニア州、フリーモント)によって合成された)との結合を、ELISAによって解析した:
pThr-Dmp(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH、X=5,5-ジメチル-L-プロリン)(ロット番号1556880)
pThr-Pro(H-KVAVVRT(PO3H2)PPKSPS-OH)(ロット番号1556878)
pThr-Ala(H-KVAVVRT(PO3H2)APKSPS-OH)(ロット番号1556881)
np-Thr-Pro(H-KVAVVRTPPKSPS-OH)(ロット番号1556879)
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体の抗原結合
精製されたマウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体の、以下の4種のThr231-タウペプチド(AnaSpec(カリフォルニア州、フリーモント)によって合成された)との結合を、ELISAによって解析した:
pThr-Dmp(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH、X=5,5-ジメチル-L-プロリン)(ロット番号1556880)
pThr-Pro(H-KVAVVRT(PO3H2)PPKSPS-OH)(ロット番号1556878)
pThr-Ala(H-KVAVVRT(PO3H2)APKSPS-OH)(ロット番号1556881)
np-Thr-Pro(H-KVAVVRTPPKSPS-OH)(ロット番号1556879)
MaxiSorpプレートのウェルを、50μl/ウェルの、1μg/mlで2,2,2-トリフルオロエタノールに溶解された各ペプチドを用いてコーティングした。ELISAのその後の手順は、マウスPT-113 IgG2bの検出を、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスカッパ鎖抗体(SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム)を用いて実施した点を除いて実施例5に記載されている。
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1の、4種のペプチドとの結合パターンは、それぞれ図23および24に示されている。4種の試験されたT231-タウペプチドとの結合の全体的な傾向は、これら2種の抗体の間で同様であった。特に、マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1は両方とも、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)と強力に結合し、pThr-Ala-タウペプチド(トランス-コンホメーションでロックされた)とは不十分に結合した。さらに、図23および24は、ChPT-113 IgG1のnp-Thr-Pro-タウペプチド(すなわち、非リン酸化T231-タウペプチド)との結合は、マウスPT-113のものよりも弱かったことを示す。この結果は、ChPT-113 IgG1抗体が、マウスPT-113抗体を用いた場合に観察されるものと比較して、非リン酸化T231-タウペプチドと免疫学的交差反応性をあまり示さないことを実証する。
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1の、4種のペプチドとの結合パターンは、それぞれ図23および24に示されている。4種の試験されたT231-タウペプチドとの結合の全体的な傾向は、これら2種の抗体の間で同様であった。特に、マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1は両方とも、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)と強力に結合し、pThr-Ala-タウペプチド(トランス-コンホメーションでロックされた)とは不十分に結合した。さらに、図23および24は、ChPT-113 IgG1のnp-Thr-Pro-タウペプチド(すなわち、非リン酸化T231-タウペプチド)との結合は、マウスPT-113のものよりも弱かったことを示す。この結果は、ChPT-113 IgG1抗体が、マウスPT-113抗体を用いた場合に観察されるものと比較して、非リン酸化T231-タウペプチドと免疫学的交差反応性をあまり示さないことを実証する。
(実施例11)
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体を用いる競合結合アッセイ
マウスおよびキメラPT-113抗体の親和性を、競合結合アッセイによって評価した。MaxiSorpプレートのウェルを、pThr-Dmp-タウペプチドを用いてコーティングし、実施例5に記載されるようなELISAバッファーを用いてブロッキングした。ウェルを洗浄した後、ELISAバッファー中の、2μg/mlのビオチン化マウスPT-113 IgG2b抗体と種々の濃度の競合抗体(10μg/mlおよび段階3倍希釈)の混合物の50μlを各ウェルに適用した。室温で2時間インキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、室温で1時間のインキュベーションのために、各ウェルに50μlのHRPがコンジュゲートされたストレプトアビジン(ELISAバッファーで 1/2,000希釈された;SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム)を適用した。洗浄バッファーを用いて洗浄した後、50μl/ウェルのTMB基質を用いて発色を開始し、50μl/ウェルの2N H2SO4を用いて停止した。吸光度は、450nmで読み取った。
競合結合ELISAの結果が、図25に示されている。マウスPT-113 IgG2bを用いた場合の競合パターンは、ChPT-113 IgG1を用いた場合と同様であり、これは、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)との結合の親和性が、これら2種の抗体間で極めて同様であることを示す。しかし、ビオチン化PT-113の結合の完全なブロッキングは、使用された最高濃度(10μg/ml)でさえ観察されなかった。
マウスPT-113 IgG2bおよびChPT-113 IgG1抗体を用いる競合結合アッセイ
マウスおよびキメラPT-113抗体の親和性を、競合結合アッセイによって評価した。MaxiSorpプレートのウェルを、pThr-Dmp-タウペプチドを用いてコーティングし、実施例5に記載されるようなELISAバッファーを用いてブロッキングした。ウェルを洗浄した後、ELISAバッファー中の、2μg/mlのビオチン化マウスPT-113 IgG2b抗体と種々の濃度の競合抗体(10μg/mlおよび段階3倍希釈)の混合物の50μlを各ウェルに適用した。室温で2時間インキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、室温で1時間のインキュベーションのために、各ウェルに50μlのHRPがコンジュゲートされたストレプトアビジン(ELISAバッファーで 1/2,000希釈された;SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム)を適用した。洗浄バッファーを用いて洗浄した後、50μl/ウェルのTMB基質を用いて発色を開始し、50μl/ウェルの2N H2SO4を用いて停止した。吸光度は、450nmで読み取った。
競合結合ELISAの結果が、図25に示されている。マウスPT-113 IgG2bを用いた場合の競合パターンは、ChPT-113 IgG1を用いた場合と同様であり、これは、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)との結合の親和性が、これら2種の抗体間で極めて同様であることを示す。しかし、ビオチン化PT-113の結合の完全なブロッキングは、使用された最高濃度(10μg/ml)でさえ観察されなかった。
(実施例12)
抗原結合についてのHuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の解析
実施例5および10に記載される手順に従ってELISAによって、精製HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の、4種のT231-タウペプチド、pThr-Dmp、pThr-Pro、pThr-Alaおよびnp-Thr-Proの各々との抗原結合を、ChPT-113 IgG1のものと比較した。図26に示されるように、これら3種の抗体は、4種のT231-タウペプチドの各々を用いた場合に同様の結合パターンを示した。特に、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)との結合は、ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の間でほとんど区別できなかった。
これらの結果は、本技術の抗体は、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(シス-pT231-タウ)のシス-コンホメーションに特異的に結合し、したがって、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置する方法において有用であることを示す。
抗原結合についてのHuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の解析
実施例5および10に記載される手順に従ってELISAによって、精製HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の、4種のT231-タウペプチド、pThr-Dmp、pThr-Pro、pThr-Alaおよびnp-Thr-Proの各々との抗原結合を、ChPT-113 IgG1のものと比較した。図26に示されるように、これら3種の抗体は、4種のT231-タウペプチドの各々を用いた場合に同様の結合パターンを示した。特に、pThr-Dmp-タウペプチド(シス-コンホメーションでロックされた)との結合は、ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)およびHuPT-113D IgG1-AA(I)抗体の間でほとんど区別できなかった。
これらの結果は、本技術の抗体は、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(シス-pT231-タウ)のシス-コンホメーションに特異的に結合し、したがって、それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置する方法において有用であることを示す。
(実施例13)
HuPT-113D(II)抗体
一過性トランスフェクション。12mgの精製二重遺伝子ベクターを使用して、2×109個のGS-KO CHO細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、(II)の独自のフィードおよび1mMグルタミンを補給した培地中、3×106個細胞/mlで播種し、5L(Generon、931116)振盪フラスコ中、31℃、5% CO2、85%湿度および140rpmで培養した。
一次回収。2L培養物を8000rpmでの遠心分離によって回収し、0.22μm濾過によって濾過滅菌し、その後プロテインA精製した。
Octet QKeによるプロテインAアッセイ。清澄化した細胞培養上清のサンプルをプロテインA Biosensors(ForteBio、18-5010)を使用してOctet QKeで解析した。0.22μmフィルターを用いて濾過された上清サンプルの200μLのアリコートを、96ウェルプレート中にロードし、8点標準曲線に対して定量化した。標準曲線の範囲の外側の濃度を有するサンプルを、希釈後に再解析した。
HuPT-113D(II)抗体
一過性トランスフェクション。12mgの精製二重遺伝子ベクターを使用して、2×109個のGS-KO CHO細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、(II)の独自のフィードおよび1mMグルタミンを補給した培地中、3×106個細胞/mlで播種し、5L(Generon、931116)振盪フラスコ中、31℃、5% CO2、85%湿度および140rpmで培養した。
一次回収。2L培養物を8000rpmでの遠心分離によって回収し、0.22μm濾過によって濾過滅菌し、その後プロテインA精製した。
Octet QKeによるプロテインAアッセイ。清澄化した細胞培養上清のサンプルをプロテインA Biosensors(ForteBio、18-5010)を使用してOctet QKeで解析した。0.22μmフィルターを用いて濾過された上清サンプルの200μLのアリコートを、96ウェルプレート中にロードし、8点標準曲線に対して定量化した。標準曲線の範囲の外側の濃度を有するサンプルを、希釈後に再解析した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー。一過性の培養のために、AKT A精製装置(10mL/分で実行)上の4つの5mL HiTrap MabSelect SuREカラムのうち1つを使用して清澄化された上清を精製した。すべての場合において、50mMリン酸ナトリウム、125mM塩化ナトリウム、pH7.0を用いてカラムを平衡化し、50mMリン酸ナトリウムおよび1M塩化ナトリウムpH7.0を用いて洗浄し、続いて、平衡を再導入し、その後、溶出した。分子は、10mMギ酸ナトリウム、pH3.5を用いて溶出した。溶出され画分を、2×PBSバッファー、pH7.4を用いて中和することによって直ちにpH調整し、希水酸化ナトリウム溶液の添加によっておよそpH7.2まで滴定した。
SE-HPLC。Zorbax GF-250 9.4mm ID×25cmカラム(Agilent)を使用しAgilent 1200シリーズHPLCシステムでSE-HPLCによって2連サンプルを解析した。1mg/mlサンプル(またはサンプルが<1mg/mLである場合にはストック濃度)の80μlのアリコートを、注入し、50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、500mMアルギニン、pH6.0中、1mL/分で15分間で実行した。Chemstationソフトウェアを使用して可溶性凝集体レベルを解析した。バッファー成分から生じるシグナルを、ブランクバッファー注入によって解析し、別に示されない限り、データ解析において省いた。
SE-HPLC。Zorbax GF-250 9.4mm ID×25cmカラム(Agilent)を使用しAgilent 1200シリーズHPLCシステムでSE-HPLCによって2連サンプルを解析した。1mg/mlサンプル(またはサンプルが<1mg/mLである場合にはストック濃度)の80μlのアリコートを、注入し、50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、500mMアルギニン、pH6.0中、1mL/分で15分間で実行した。Chemstationソフトウェアを使用して可溶性凝集体レベルを解析した。バッファー成分から生じるシグナルを、ブランクバッファー注入によって解析し、別に示されない限り、データ解析において省いた。
SDS-PAGE解析。NuPage 4x LOSサンプルバッファー(Life Technologies、NP0007)およびNuPage I Oxサンプル還元剤(Life Technologies、NP0009)と混合することによって、解析のために還元サンプルを調製し、70℃で10分間インキュベートした。非還元サンプルのためには、還元剤および加熱インキュベーションは省いた。サンプルを、NuPage MES SOSランニングバッファーを用いて変性条件下で1.5mm NuPage4~12% Bis-Tris Novexプレキャストゲル(Life Technologies、NP0315/6)で電気泳動した。SeeBlue Plus 2事前染色分子量標準(Life Technologies、LC5925)の10μlのアリコートおよび1mg/mlの対照抗体をゲルに含めた。各サンプルの1μgをゲルにロードした。電気泳動すると、InstantBlue(TripleRed、ISBO 1L)を用いて室温で30分間ゲルを染色した。染色されたゲルのイメージを、BioSpectrum Imaging System(UVP)で解析した。
プロテインA精製結果。単一の5mLカラムを使用して最初の精製を実施した。これは、Octet測定に従っておよそ25%に相当する60.8mgの材料の回収および樹脂1グラムあたりおよそ12mgの抗体の結合能をもたらした。
プロテインA精製結果。単一の5mLカラムを使用して最初の精製を実施した。これは、Octet測定に従っておよそ25%に相当する60.8mgの材料の回収および樹脂1グラムあたりおよそ12mgの抗体の結合能をもたらした。
4つのタンデム5mL MabSelect SUREカラムを使用してその後の精製を実施し、3種の抗体すべて(すなわち、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))の製品力価を超える結合能をもたらす。3種の抗体製品すべての精製は、単一の明確に定義されたピークの溶出をもたらした。結合していない画分のOctet解析は、すべての製品が回収されたことを示した。
図47によって、良好なレベルの純度を有する抗体製品の存在が確認される。抗体製品は、対照lgG1抗体(レーン10および11)と十分に比較される。すべての製品について、還元条件下で重鎖(>49kDa)および軽鎖(<28kDa)の大きさと一致する2つのバンドが観察され(レーン5、7および9)、対照抗体(レーン11)について見られたバンドと匹敵する。アッセイ間対照lgG1抗体(レーン10および11)の結果は、予測された通りであった。非還元条件下では、すべての製品(レーン2、4、6および8)について、同一条件下で実行された対照IgG1抗体(レーン10)と匹敵する98kDaおよび198kDaの間のタンパク質種バンドが見られ、全長抗体の予測分子量と一致する。HuPT-113D IgG1-AA(II)のバッチ455-030417-01については、非還元サンプルにおいておよそ198kDaのバンドが見られ、これは、凝集体の存在を示し、SE-HPLCの結果と一致する。
図47によって、良好なレベルの純度を有する抗体製品の存在が確認される。抗体製品は、対照lgG1抗体(レーン10および11)と十分に比較される。すべての製品について、還元条件下で重鎖(>49kDa)および軽鎖(<28kDa)の大きさと一致する2つのバンドが観察され(レーン5、7および9)、対照抗体(レーン11)について見られたバンドと匹敵する。アッセイ間対照lgG1抗体(レーン10および11)の結果は、予測された通りであった。非還元条件下では、すべての製品(レーン2、4、6および8)について、同一条件下で実行された対照IgG1抗体(レーン10)と匹敵する98kDaおよび198kDaの間のタンパク質種バンドが見られ、全長抗体の予測分子量と一致する。HuPT-113D IgG1-AA(II)のバッチ455-030417-01については、非還元サンプルにおいておよそ198kDaのバンドが見られ、これは、凝集体の存在を示し、SE-HPLCの結果と一致する。
(実施例14)
HuPT-113D抗体によるFcR活性化
この研究は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)は、FcRを活性化しない(すなわち、本技術の抗体は、異なるFc受容体を発現する免疫細胞の活性化を誘導しない)ことを示す。
方法および材料
オボアルブミンは、Sigma-Aldrichから購入し、使用まで+2~8℃で貯蔵した。抗オボアルブミン(ウサギポリクローナル)は、Sigma-Aldrichから購入し、使用まで-20℃で貯蔵した。抗オボアルブミン(マウスモノクローナルIgG2a)は、Biolegendから購入し、使用まで+2~8℃で貯蔵した。
以下のHuPT-113D抗体:HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)を使用した。
HuPT-113D抗体によるFcR活性化
この研究は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)は、FcRを活性化しない(すなわち、本技術の抗体は、異なるFc受容体を発現する免疫細胞の活性化を誘導しない)ことを示す。
方法および材料
オボアルブミンは、Sigma-Aldrichから購入し、使用まで+2~8℃で貯蔵した。抗オボアルブミン(ウサギポリクローナル)は、Sigma-Aldrichから購入し、使用まで-20℃で貯蔵した。抗オボアルブミン(マウスモノクローナルIgG2a)は、Biolegendから購入し、使用まで+2~8℃で貯蔵した。
以下のHuPT-113D抗体:HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)を使用した。
ヒトタウタンパク質に由来する以下のペプチドを使用した:
1)WT-pThr-Pro (KVAVVRpTPPKSPS)、ヒトタウ由来の10アミノ酸配列。
2)pThr-Dmp(KVAVVRpT(5,5-ジメチル-L-プロリン)PKSPS)、WTペプチドに類似した10アミノ酸「シスロックされた」配列。
両ペプチド(ペプチドあたり≧10mg)を凍結乾燥し、復元まで-80℃で貯蔵した。ペプチドは、2,2,2-トリフルオロエタノール(Fisher Scientific)中、1mg/mLの濃度で復元し、複数アリコート中、-80℃で貯蔵し、凍結-解凍サイクル数を最小化した。pThr-Dmpペプチドはまた、Lightening-Link(登録商標)Rapidビオチンキット(Innova Biosciences)を使用してビオチン化し、使用まで-20℃で貯蔵した。
1)WT-pThr-Pro (KVAVVRpTPPKSPS)、ヒトタウ由来の10アミノ酸配列。
2)pThr-Dmp(KVAVVRpT(5,5-ジメチル-L-プロリン)PKSPS)、WTペプチドに類似した10アミノ酸「シスロックされた」配列。
両ペプチド(ペプチドあたり≧10mg)を凍結乾燥し、復元まで-80℃で貯蔵した。ペプチドは、2,2,2-トリフルオロエタノール(Fisher Scientific)中、1mg/mLの濃度で復元し、複数アリコート中、-80℃で貯蔵し、凍結-解凍サイクル数を最小化した。pThr-Dmpペプチドはまた、Lightening-Link(登録商標)Rapidビオチンキット(Innova Biosciences)を使用してビオチン化し、使用まで-20℃で貯蔵した。
細胞株。THP-1細胞(DSMZ)は、THP-1培養培地(RPMI 1640((II))+10%熱不活性化(hi)FBS((II)))中で培養し、週に3回継代した。FcγRIIIa V158バリアントおよびルシフェラーゼ遺伝子を発現するJurkat細胞(Promega)をJurkat培養培地(RPMI1640((II))、10% hiFBS((II))、100μg/mLハイグロマイシン(LifeTechnologies)、250μg/mL G-418スルフェート溶液(Promega)、1mMピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)、0.1mM MEM非必須アミノ酸(Life Technologies))中で培養し、週に3回継代した。
細胞株FcR発現。THP-1またはJurkat細胞を回収し、冷CellWASH溶液(BD)で洗浄し、CD16(FcγRIII)、CD32(FcγRII)およびCD64(FcγR1)の細胞表面発現について染色した。非特異的結合を最小化するために染色抗体の添加の前にFcRブロッキングステップ(Biolegend)も含めた。FcR発現は、抗CD16 A647、抗CD32 PEおよび抗CD64 A488(Biolegend)を使用するフローサイトメトリーによって調べ、Guava(登録商標)easyCyte 8HTシステム(Merck Millipore)で解析した。
細胞株FcR発現。THP-1またはJurkat細胞を回収し、冷CellWASH溶液(BD)で洗浄し、CD16(FcγRIII)、CD32(FcγRII)およびCD64(FcγR1)の細胞表面発現について染色した。非特異的結合を最小化するために染色抗体の添加の前にFcRブロッキングステップ(Biolegend)も含めた。FcR発現は、抗CD16 A647、抗CD32 PEおよび抗CD64 A488(Biolegend)を使用するフローサイトメトリーによって調べ、Guava(登録商標)easyCyte 8HTシステム(Merck Millipore)で解析した。
HuPT-113D酵素結合免疫吸着測定法。MaxiSorpプレート(Fisher Scientific)のウェルを、2,2,2-トリフルオロエタノールまたはDPBS((II))に溶解した1、10または100μL/ウェルのpThr-Dmpペプチドとともに+4℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを、洗浄バッファー(DPBS+0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich))を用いて洗浄し、DPBS+1% BSA(Miltenyi Biotec)を用いて室温で60分間ブロッキングした。ウェルを洗浄バッファーを用いて洗浄し、100μl/ウェルの、HuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II))のうち1種を2連で室温で60分間添加した。ウェルを洗浄バッファーを用いて洗浄した後、結合した抗体をビオチン化抗ヒトFc抗体およびストレプトアビジン-HRPを用いて検出し、シグナルを100μLのTMB基質(Sigma-Aldrich)を用いて検出した。50μLのTMB停止溶液(Sigma-Aldrich)を添加することによって反応を停止し、吸光度を450nmで測定した。
THP-1サイトカインアッセイ。アッセイプレート(Lumitrac 600、Greiner Bio-One)を、DPBS中、100μL/ウェルのオボアルブミンまたは2,2,2-トリフルオロエタノールもしくはDPBSに溶解されたpThr-Dmpペプチドとともに+4℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルをDPBSを用いて洗浄し、200μLのブロッキング培地(RPMI+5%超低IgG血清(GE Life Sciences))を用いて室温で60分間ブロッキングした。ブロッキング後、ウェルあたり100μlの抗体(抗オボアルブミンまたはHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)))を室温で60分間添加した。いくつかのアッセイでは、結合していない抗体を、洗浄バッファーで洗浄することによって除去し、THP-1細胞をウェルあたり100μlアッセイ培地(RPMI+0.5%超低IgG血清)で添加し、37℃、5% CO2、加湿雰囲気中で24時間インキュベートした。上清サンプルを回収し、300x Gで10分間遠心分離して、任意の細胞を回収し、その後、サイトカイン解析のために-80℃で貯蔵した。上清中のサイトカインレベル(TNFα、IL-1βおよびIL-6)を、MAGPIX(登録商標)マルチプレキシングプラットフォーム(Luminex)で.Milliplex(登録商標)アッセイ(Merck Millipore)によってアッセイした。
Jurkat FcRIIIa活性化アッセイ。アッセイプレートを、DPBS中、100μL/ウェルのオボアルブミンまたは2,2,2-トリフルオロエタノールもしくはDPBSに溶解されたpThr-Dmpペプチドとともに+4℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルをDPBSを用いて洗浄し、200μLのブロッキング培地(RPMI+5%超低IgG血清(GE Life Sciences))を用いて室温で60分間ブロッキングした。ブロッキング後、ウェルあたり100μLの抗体(抗オボアルブミンまたはHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)))を室温で60分間添加した。いくつかのアッセイでは、結合していない抗体を、洗浄バッファーで洗浄することによって除去し、Jurkat細胞をウェルあたり100μLアッセイ培地(RPMI+0.5%超低IgG血清)で添加し、37℃、5% CO2、加湿雰囲気中で24時間インキュベートした。FcγRIIIa活性化は、BioGlo(商標)試薬を10分間添加することによって評価し、RLUは、GloMax(登録商標)ルミノメーター(Promega)によって測定した。
結果
THP-1細胞Fc受容体発現。THP-1細胞を3種の主要なFc受容体(CD16、CD32およびCD64)に対する抗体を用いて染色して、細胞表面発現を評価した。図30A~Cは、各FcRのヒストグラムプロットを示し、非染色細胞は赤色で、抗FcR抗体で染色された細胞は青色である。THP-1細胞は、高レベルのCD32(FCγRII)およびCD64(FCγRI)を発現するが、CD16(FCγRIII)はほとんどまたは全く発現しないと思われる。これは、THP-1アッセイが、主にCD32およびCD64のHuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)結合および活性化を評価し、Jurkatアッセイが、CD16のみによってHuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)結合および活性化を評価したことを示す。
Jurkat FcγRIIIa(CD16)V158細胞をまた、フローサイトメトリーによって評価したが、FcR発現は検出されなかった(示されないデータ)。これは、JurkatではCD16レベルが極めて低く、シグナル伝達は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって通常検出されるので、予測されることであった。製造業者は、抗CD16阻止抗体が添加される場合にシグナル伝達の阻害を示すデータを提供し、これは、ルシフェラーゼシグナルが、CD16依存性であることを示す。
免疫複合体(IC)によるTHP-1細胞の、陽性対照によって誘導された活性化。ICを固定化して(プレートを抗原を用いてコーティングすることによって)、架橋結合およびFcRのその後の活性化を増大した。ICは、オボアルブミンタンパク質および抗オボアルブミン抗体を含有する。2種の異なる抗オボアルブミン抗体を別個に使用して、IC;1つのマウスモノクローナル抗体および1つのウサギポリクローナル抗体を作製した。ウサギポリクローナルは、免疫細胞を刺激すると知られているが、マウスモノクローナルは、これらのアッセイでは試験されなかった。マウスモノクローナル抗体を、HuPT-113D抗体のモノクローナル性を模倣するために含めた。
THP-1細胞Fc受容体発現。THP-1細胞を3種の主要なFc受容体(CD16、CD32およびCD64)に対する抗体を用いて染色して、細胞表面発現を評価した。図30A~Cは、各FcRのヒストグラムプロットを示し、非染色細胞は赤色で、抗FcR抗体で染色された細胞は青色である。THP-1細胞は、高レベルのCD32(FCγRII)およびCD64(FCγRI)を発現するが、CD16(FCγRIII)はほとんどまたは全く発現しないと思われる。これは、THP-1アッセイが、主にCD32およびCD64のHuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)結合および活性化を評価し、Jurkatアッセイが、CD16のみによってHuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)結合および活性化を評価したことを示す。
Jurkat FcγRIIIa(CD16)V158細胞をまた、フローサイトメトリーによって評価したが、FcR発現は検出されなかった(示されないデータ)。これは、JurkatではCD16レベルが極めて低く、シグナル伝達は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって通常検出されるので、予測されることであった。製造業者は、抗CD16阻止抗体が添加される場合にシグナル伝達の阻害を示すデータを提供し、これは、ルシフェラーゼシグナルが、CD16依存性であることを示す。
免疫複合体(IC)によるTHP-1細胞の、陽性対照によって誘導された活性化。ICを固定化して(プレートを抗原を用いてコーティングすることによって)、架橋結合およびFcRのその後の活性化を増大した。ICは、オボアルブミンタンパク質および抗オボアルブミン抗体を含有する。2種の異なる抗オボアルブミン抗体を別個に使用して、IC;1つのマウスモノクローナル抗体および1つのウサギポリクローナル抗体を作製した。ウサギポリクローナルは、免疫細胞を刺激すると知られているが、マウスモノクローナルは、これらのアッセイでは試験されなかった。マウスモノクローナル抗体を、HuPT-113D抗体のモノクローナル性を模倣するために含めた。
図31A~Dは、THP-1細胞の活性化に対するオボアルブミンICコーティング密度および細胞数の影響を示す。オボアルブミンICを、オボアルブミンコーティングされたウェルおよびウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を用いて作製した(オボアルブミンを用いてコーティングされたウェルへの抗体の添加後、ウェルを洗浄しなかったので、いくつかの条件では、幾分かの遊離抗体が存在する可能性がある)。上の2つのプロットは、漸増量のIC(0.1、1および10μg/mLのオボアルブミンコーティングおよび50μg/mLの固定量のウサギ抗体)およびTHP-1細胞(5,000および50,000個細胞/ウェル)に応じた、TNFα分泌を示し、下の2つのプロットは、IL-6分泌を示す。オボアルブミンICの量およびTHP-1細胞数を増大することは、アッセイの間に分泌されたTNFαおよびIL-6のレベルの増大につながった。
図32A~D(TNFα放出)および図33A~D(IL-6放出)は、オボアルブミンICを作製するためにマウスモノクローナル抗体を使用する、IC濃度およびTHP-1細胞数のさらなる最適化を示す。図32A~Bおよび33A~Bは、50,000個THP-1細胞/ウェルを使用し、図32C~Dおよび33C~Dは、150,000個THP-1細胞/ウェルを使用した。図32AおよびCならびに33AおよびCは、ウェルをコーティングするために0.1μg/mLのオボアルブミンが使用された場合のデータを示す。図32BおよびDならびに33BおよびDは、ウェルをコーティングするために10μg/mLのオボアルブミンが使用された場合のデータを示す。図32A~Dおよび33A~Dは、150,000個THP-1細胞/ウェルおよび10μg/mLでコーティングされるオボアルブミンを使用することが最高レベルのサイトカイン放出をもたらし、THP-1細胞活性化は、抗体用量依存性であったことを示す。
データは、THP-1サイトカインアッセイを使用して、抗体の、固定化されたタンパク質抗原との結合後に細胞と結合し、続いて活性化する能力を評価できることを示す。
データは、THP-1サイトカインアッセイを使用して、抗体の、固定化されたタンパク質抗原との結合後に細胞と結合し、続いて活性化する能力を評価できることを示す。
Jurkat細胞の、陽性対照によって誘導された活性化。この研究は、十分に特性決定された免疫複合体(IC)によるJurkat細胞におけるFcR活性化を示した。ICを固定化して(プレートを抗原を用いてコーティングすることによって)架橋結合およびFcRのその後の活性化を増大した。ICは、オボアルブミンタンパク質および抗オボアルブミン抗体を含有する。2種の異なる抗オボアルブミン抗体を別個に使用して、IC;1つのマウスモノクローナル抗体および1つのウサギポリクローナル抗体を作製した。これまでこれらのアッセイでは、抗体は試験されなかった。マウスモノクローナル抗体を、この研究において使用されるHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))のモノクローナル性を模倣するために含めた。
図34A~Bは、FcRの活性化に対するオボアルブミンIC濃度およびJurkat細胞数の影響を示す。オボアルブミンICを、オボアルブミンコーティングされたウェル(10μg/mL)およびウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体の両方の濃度の範囲を用いて作製した(オボアルブミンを用いてコーティングされたウェルへの抗体の添加後、ウェルを洗浄しなかったので、いくつかの条件では、幾分かの遊離抗体が存在する可能性がある)。図34Aは、50,000個のJurkat細胞/ウェルを使用したFcR活性化を示し、図34Bは、100,000個のJurkat細胞/ウェルを使用した活性化を示す。両プロットは、ウサギポリクローナル抗体によるFcR活性化を示すが、マウスモノクローナル抗体を用いた場合は示さず、100,000個のJurkatは、50,000個のJurkat細胞/ウェルよりも強い応答を生成した。
図34A~Bは、FcRの活性化に対するオボアルブミンIC濃度およびJurkat細胞数の影響を示す。オボアルブミンICを、オボアルブミンコーティングされたウェル(10μg/mL)およびウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体の両方の濃度の範囲を用いて作製した(オボアルブミンを用いてコーティングされたウェルへの抗体の添加後、ウェルを洗浄しなかったので、いくつかの条件では、幾分かの遊離抗体が存在する可能性がある)。図34Aは、50,000個のJurkat細胞/ウェルを使用したFcR活性化を示し、図34Bは、100,000個のJurkat細胞/ウェルを使用した活性化を示す。両プロットは、ウサギポリクローナル抗体によるFcR活性化を示すが、マウスモノクローナル抗体を用いた場合は示さず、100,000個のJurkatは、50,000個のJurkat細胞/ウェルよりも強い応答を生成した。
データは、Jurkat FcR活性化アッセイを使用して、抗体の、固定化されたタンパク質抗原との結合後にFcγRIIIaと結合し、続いて活性化する能力を評価できることを示す。データはまた、マウス抗体は、FcγRIIIaの活性化ではウサギ抗体ほど強力ではないことを示唆する。
HuPT-113Dペプチド結合ELISA。3種のHuPT-113D抗体すべて(HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))が、ICを成功裏に形成でき、結合ELISAを使用して、pThr-DmpペプチドとのHuPT-113D抗体結合を評価した。2,2,2-トリフルオロエタノール中、1、10および100μg/mLのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングされたELISAプレートを用いて各HuPT-113D抗体の用量応答を作製した。
HuPT-113Dペプチド結合ELISA。3種のHuPT-113D抗体すべて(HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))が、ICを成功裏に形成でき、結合ELISAを使用して、pThr-DmpペプチドとのHuPT-113D抗体結合を評価した。2,2,2-トリフルオロエタノール中、1、10および100μg/mLのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングされたELISAプレートを用いて各HuPT-113D抗体の用量応答を作製した。
図35は、各pThr-Dmpペプチドコーティング濃度での各抗体の結合曲線を示す。3種のHuPT-113D抗体すべてが、極めて同様の結合曲線をもたらし、pThr-Dmpペプチドコーティング濃度の増大の影響はなく、これは、1μg/mLの濃度がすでにウェルを飽和していることを示唆した。すべての条件のEC50値は、およそ21ng/mL(140pM)であった。
THP-1サイトカインアッセイにおけるHuPT-113D pThr-Dmpペプチドコーティング最適化。この研究は、THP-1細胞に対して2,2,2-トリフルオロエタノールの何らかの影響があるか否かを調べるために実施した。pThr-Dmpペプチドを、2,2,2-トリフルオロエタノールまたはDPBSのいずれかで1μg/mLに希釈し、アッセイプレートのウェルをコーティングするために使用した。コーティング後、DPBSを用いてウェルを洗浄し、HuPT-113D IgG1(II)の濃度の範囲を添加し、ICを形成させ、その後、THP-1細胞を添加した(150,1000個細胞/ウェル)。24時間後、TNFαおよびIL-6のレベルを評価した。
図36Aは、TNFα分泌のレベルを示し、図36Bは、IL-6分泌のレベルを示す。データは、両サイトカインの分泌が用量依存性に増大され、2,2,2-トリフルオロエタノールとDPBSペプチドコーティング条件の間に有意差はなかったことを示す。
THP-1サイトカインアッセイにおけるHuPT-113D pThr-Dmpペプチドコーティング最適化。この研究は、THP-1細胞に対して2,2,2-トリフルオロエタノールの何らかの影響があるか否かを調べるために実施した。pThr-Dmpペプチドを、2,2,2-トリフルオロエタノールまたはDPBSのいずれかで1μg/mLに希釈し、アッセイプレートのウェルをコーティングするために使用した。コーティング後、DPBSを用いてウェルを洗浄し、HuPT-113D IgG1(II)の濃度の範囲を添加し、ICを形成させ、その後、THP-1細胞を添加した(150,1000個細胞/ウェル)。24時間後、TNFαおよびIL-6のレベルを評価した。
図36Aは、TNFα分泌のレベルを示し、図36Bは、IL-6分泌のレベルを示す。データは、両サイトカインの分泌が用量依存性に増大され、2,2,2-トリフルオロエタノールとDPBSペプチドコーティング条件の間に有意差はなかったことを示す。
Jurkat FcR活性化アッセイにおけるHuPT-113D pThr-Dmpペプチドコーティング最適化。この研究は、Jurkat細胞に対して2,2,2-トリフルオロエタノールの何らかの影響があるか否かを調べるために実施した。pThr-Dmpペプチドを、2,2,2-トリフルオロエタノールまたはDPBSのいずれかで1μg/mLに希釈し、アッセイプレートのウェルをコーティングするために使用した。コーティング後、DPBSを用いてウェルを洗浄し、HuPT-113D IgG1(II)の濃度の範囲を添加し、ICを形成させ、その後、Jurkat細胞を添加した(100,000個細胞/ウェル)。24時間後、FcγRIIIaの活性化をBioGlo(登録商標)試薬を用いて評価した。
図37は、FcγRIIIa活性化のレベルおよび各ペプチドコーティング条件を示す。2,2,2-トリフルオロエタノールとDPBSペプチドコーティング条件の間に有意差はなく、どちらもFcγRIIIaを活性化できないと思われた。
図37は、FcγRIIIa活性化のレベルおよび各ペプチドコーティング条件を示す。2,2,2-トリフルオロエタノールとDPBSペプチドコーティング条件の間に有意差はなく、どちらもFcγRIIIaを活性化できないと思われた。
HuPT-113D THP-1サイトカインアッセイ1。各HuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))の、THP-1細胞アッセイにおいてサイトカイン分泌を誘導する能力を比較するために、天然およびビオチン化pThr-Dmpペプチドの両方を使用して、ICを作製した。天然ペプチド(pThr-Dmpペプチド)を使用して、1μg/mLでアッセイプレートのウェルをコーティングし、ビオチン化ペプチドを使用して、ストレプトアビジンプレコーティングプレート(Greiner Bio-one)のウェルをコーティングした。ペプチドを用いて一晩コーティングした後、両プレートを洗浄し、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)の段階希釈を3連でプレートに添加した。THP-1細胞が添加される時にICのみが存在することを確実にするためにHuPT-113D抗体が添加された後にさらなる洗浄ステップを含めた。このさらなる洗浄ステップによって、阻止抗体として働き、FcRを架橋結合するプレート上に固定化されたICを妨げ得る遊離HuPT-113D抗体はすべて除去された。
図38A~Cは、各HuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))および天然pThr-Dmpペプチドによるサイトカイン放出(TNFα、IL-1βおよびIL-6)の誘導を示す。図38D~Fは、各HuPT-113D抗体およびビオチン化pThr-Dmpペプチドによるサイトカイン放出(TNFα、IL-1βおよびIL-6)の誘導を示す。HuPT-113D IgG1(II)は、青色で示され、HuPT-113D IgG1-AA(II)は赤色で示され、HuPT-113D IgG4(II)は、緑色で示される。3種のHuPT-113D抗体すべてが、サイトカイン放出を用量依存性に誘導したが、各抗体は、場合に異なる曲線を生成する傾向があり、IgG1抗体は特に、より低い最大レベルのサイトカイン放出をもたらした。
しかし、ICを作製するために天然ペプチドが使用された場合には、3種のサイトカインのすべてにおいて同様のパターンが見られ、IgG1抗体は最大を示し、IgG1-AAは、サイトカイン誘導のための最低の効力を示した。ビオチン化ペプチドプロットは、同様のパターンを示し、IgG1-AAは、サイトカイン放出の最少の効力刺激装置であった。
しかし、ICを作製するために天然ペプチドが使用された場合には、3種のサイトカインのすべてにおいて同様のパターンが見られ、IgG1抗体は最大を示し、IgG1-AAは、サイトカイン誘導のための最低の効力を示した。ビオチン化ペプチドプロットは、同様のパターンを示し、IgG1-AAは、サイトカイン放出の最少の効力刺激装置であった。
天然およびビオチン化ペプチドの結果を直接比較すると、ビオチン化ペプチドがサイトカイン放出のバックグラウンドレベルを増大することが示された。これは、ビオチン化ペプチド自体ではなくプレートをコーティングするために使用されるストレプトアビジンによる可能性が高い。THP-1細胞活性化のバックグラウンドレベルをできる限り低く維持するために、その後のアッセイは、天然pThr-Dmpペプチドを使用してプレートをコーティングし、ICを作製した。
図39は、3種のHuPT-113D抗体(天然ペプチド)について算出されたEC50値を示す。IgG1抗体は、3種のサイトカインすべてについて最低のEC50値を有しており、IgG1-AAは最大であり、これは、IgG1-AA抗体が、THP-1細胞からのサイトカインの放出を誘導する最低の能力を有することを示唆した。
HuPT-113D Jurkat FcR活性化アッセイ1。各HuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))の、Jurkat細胞アッセイにおいてFcγRIIIaを活性化する能力を比較するために、天然pThr-Dmpペプチドを使用して、ICを作製した(1、10または100μg/mLで天然ペプチドを使用してアッセイプレートのウェルをコーティングした)。次いで、プレートを洗浄し、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)の段階希釈をプレートに3連で添加した。Jurkat細胞が添加される時にICのみが存在することを確実にするためにHuPT-113D抗体が添加された後にさらなる洗浄ステップを含めた。このさらなる洗浄ステップによって、阻止抗体として働き、FcγRIIIaを架橋結合するプレート上に固定化されたICを妨げ得る遊離HuPT-113D抗体はすべて除去された。
図39は、HuPT-113D抗体の各々によるFcγRIIIaの活性化を示す。IgG1抗体は、用量依存性にJurkat細胞を活性化でき、ペプチドコーティング濃度の各々について同様の曲線が生成された。IgG1-AAおよびIgG4抗体は、Jurkat細胞の活性化を全く示さなかった。
図39は、3種のHuPT-113D抗体(天然ペプチド)について算出されたEC50値を示す。IgG1抗体は、3種のサイトカインすべてについて最低のEC50値を有しており、IgG1-AAは最大であり、これは、IgG1-AA抗体が、THP-1細胞からのサイトカインの放出を誘導する最低の能力を有することを示唆した。
HuPT-113D Jurkat FcR活性化アッセイ1。各HuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II))の、Jurkat細胞アッセイにおいてFcγRIIIaを活性化する能力を比較するために、天然pThr-Dmpペプチドを使用して、ICを作製した(1、10または100μg/mLで天然ペプチドを使用してアッセイプレートのウェルをコーティングした)。次いで、プレートを洗浄し、HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)およびHuPT-113D IgG1(II)の段階希釈をプレートに3連で添加した。Jurkat細胞が添加される時にICのみが存在することを確実にするためにHuPT-113D抗体が添加された後にさらなる洗浄ステップを含めた。このさらなる洗浄ステップによって、阻止抗体として働き、FcγRIIIaを架橋結合するプレート上に固定化されたICを妨げ得る遊離HuPT-113D抗体はすべて除去された。
図39は、HuPT-113D抗体の各々によるFcγRIIIaの活性化を示す。IgG1抗体は、用量依存性にJurkat細胞を活性化でき、ペプチドコーティング濃度の各々について同様の曲線が生成された。IgG1-AAおよびIgG4抗体は、Jurkat細胞の活性化を全く示さなかった。
HuPT-113D THP-1サイトカインアッセイ2。THP-1サイトカインアッセイを反復して、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)抗体が、実際、サイトカイン放出のあまり強力ではないインデューサーであることを確認した。プレートを1μg/mLの天然ペプチドを用いてコーティングし、各抗体のより大きな用量範囲を含めた。THP-1細胞の添加の前に任意の結合していない抗体を洗浄除去して、ICのみが存在することを確実にした。
図41A~Cは、3種のサイトカインの各々についての各HuPT-113D抗体のプロットを示す。プロットは、図38A~Fにおいて上記で見られたものと同様であり、IgG1は、THP-1細胞におけるサイトカイン放出の最も強力な、IgG1-AAは最も強力でないインデューサーである。
図41A~Cは、3種のサイトカインの各々についての各HuPT-113D抗体のプロットを示す。プロットは、図38A~Fにおいて上記で見られたものと同様であり、IgG1は、THP-1細胞におけるサイトカイン放出の最も強力な、IgG1-AAは最も強力でないインデューサーである。
図42は、3種のHuPT-113D抗体について算出されたEC50値を示す。IgG1抗体は、3種のサイトカインすべてについてIgG1-AAおよびIgG4抗体よりも低いEC50値を有しており、これは、IgG1-AAおよびIgG4抗体が、THP-1細胞からサイトカインの放出を誘導するより低い能力を有することを示唆した。
HuPT-113D Jurkat FcR活性化アッセイ。Jurkat FcR活性化アッセイを反復して、IgG1-AAおよびIgG4抗体が、実際、FcR活性化のあまり強力ではないインデューサーであることを確認した。プレートを1μg/mLの天然ペプチドを用いてコーティングし、各抗体のより大きな用量範囲を含めた。Jurkat細胞の添加の前に任意の結合していない抗体を洗浄除去して、ICのみが存在することを確実にした。
図43は、各HuPT-113D抗体のプロットを示す。プロットは、図40において上記で見られたものと同様であり、IgG1抗体のみが、FcγRIIIaを活性化できる。
HuPT-113D Jurkat FcR活性化アッセイ。Jurkat FcR活性化アッセイを反復して、IgG1-AAおよびIgG4抗体が、実際、FcR活性化のあまり強力ではないインデューサーであることを確認した。プレートを1μg/mLの天然ペプチドを用いてコーティングし、各抗体のより大きな用量範囲を含めた。Jurkat細胞の添加の前に任意の結合していない抗体を洗浄除去して、ICのみが存在することを確実にした。
図43は、各HuPT-113D抗体のプロットを示す。プロットは、図40において上記で見られたものと同様であり、IgG1抗体のみが、FcγRIIIaを活性化できる。
結果はまた、HuPT-113D IgG1(II)が、THP-1サイトカインアッセイにおいて3種のサイトカインすべて(TNFα、IL-1βおよびIL-6)において用量依存応答を誘導したことを示す。
結果はまた、IgG1-AAおよびIgG4版が、サイトカインのあまり強力ではないインデューサーであり、IgG1のものよりも最大30倍高いEC50値を有することを示す。
結果は、HuPT-113D IgG1(II)が、Jurkat FcγRIIIa活性化アッセイにおいて用量依存応答を誘導したことを示す。HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)抗体について活性化は見られなかった。
結果は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)は、そのFcRによって免疫細胞と結合し、活性化するより低い能力を示し、対象において不要な免疫応答を誘導するより低いリスクと考えられなければならないことを示す。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
結果はまた、IgG1-AAおよびIgG4版が、サイトカインのあまり強力ではないインデューサーであり、IgG1のものよりも最大30倍高いEC50値を有することを示す。
結果は、HuPT-113D IgG1(II)が、Jurkat FcγRIIIa活性化アッセイにおいて用量依存応答を誘導したことを示す。HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)抗体について活性化は見られなかった。
結果は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)は、そのFcRによって免疫細胞と結合し、活性化するより低い能力を示し、対象において不要な免疫応答を誘導するより低いリスクと考えられなければならないことを示す。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
(実施例15)
Jurkat FcγRIIIa V158活性化アッセイ-解凍および使用キット対増殖細胞株
この研究は、本技術の抗体の、FcRIIIa V158細胞を活性化する能力を評価した。
方法。ウェルを、TFE中、1μg/mlのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
結果。HuPT-113D IgG1(II)抗体のみが、細胞を活性化できた。図44A~Bを参照のこと。結果は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)抗体による活性化がなかったことを示す。図44A~Bを参照のこと。増殖および解凍および使用細胞は同様の結果を有していた。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
Jurkat FcγRIIIa V158活性化アッセイ-解凍および使用キット対増殖細胞株
この研究は、本技術の抗体の、FcRIIIa V158細胞を活性化する能力を評価した。
方法。ウェルを、TFE中、1μg/mlのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
結果。HuPT-113D IgG1(II)抗体のみが、細胞を活性化できた。図44A~Bを参照のこと。結果は、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II)抗体による活性化がなかったことを示す。図44A~Bを参照のこと。増殖および解凍および使用細胞は同様の結果を有していた。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
(実施例16)
HuPT-113D抗体を使用するJurkat FcγRIIIaおよびFcγRIIa活性化
この研究は本技術の抗体の、FcγRIIIa V158、FcγRIIIa F158およびFcγRIIa H131を活性化する能力を評価した。
方法
ウェルを、TFE中、1μg/mlのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
HuPT-113D抗体を使用するJurkat FcγRIIIaおよびFcγRIIa活性化
この研究は本技術の抗体の、FcγRIIIa V158、FcγRIIIa F158およびFcγRIIa H131を活性化する能力を評価した。
方法
ウェルを、TFE中、1μg/mlのpThr-Dmpペプチドを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
結果
HuPT-113D IgG1(II)は、FcγRIIIa V158およびFcγRIIa H131細胞を活性化した。図45AおよびCを参照のこと。HuPT-113D IgG4(II)は、FcγRIIa H131細胞において低レベルの活性化を示し、FcγRIIIa V158では全く活性化しなかった。図45AおよびCを参照のこと。HuPT-113D IgG1-AA(II)は、FcγRIIIa V158細胞およびFcγRIIa H131細胞を活性化しなかった。図45AおよびCを参照のこと。FcγRIIIa F158を活性化した抗体はなかった。図45Bを参照のこと。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
HuPT-113D IgG1(II)は、FcγRIIIa V158およびFcγRIIa H131細胞を活性化した。図45AおよびCを参照のこと。HuPT-113D IgG4(II)は、FcγRIIa H131細胞において低レベルの活性化を示し、FcγRIIIa V158では全く活性化しなかった。図45AおよびCを参照のこと。HuPT-113D IgG1-AA(II)は、FcγRIIIa V158細胞およびFcγRIIa H131細胞を活性化しなかった。図45AおよびCを参照のこと。FcγRIIIa F158を活性化した抗体はなかった。図45Bを参照のこと。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
(実施例17)
Jurkat FcγRIIIa V158活性化アッセイ-増殖細胞
この研究は、FcγRIIIa V158細胞のHuPT-113D活性化を評価した。
方法
ウェルを、DPBS中、10μg/mlのpTauを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
結果
FcγRIIIa V158細胞の活性化を誘導した抗体はなかった。図46を参照のこと。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
Jurkat FcγRIIIa V158活性化アッセイ-増殖細胞
この研究は、FcγRIIIa V158細胞のHuPT-113D活性化を評価した。
方法
ウェルを、DPBS中、10μg/mlのpTauを用いてコーティングした。HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)またはHuPT-113D IgG1(II)を60分間添加した。Jurkat細胞を24時間添加した。24時間後BioGlo(登録商標)試薬を添加し、発光をGloMax(登録商標)で読み取った。
結果
FcγRIIIa V158細胞の活性化を誘導した抗体はなかった。図46を参照のこと。
これらの結果は、本技術のHuPT-113D抗体(例えば、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))は、FcγRIIIaを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
(実施例18)
HuPT-113D抗体を使用する外傷性脳損傷(TBI)の防止
この研究は、TBIを防ぐために本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が有用であることを示す。
方法
wtC57/Bl6マウスを、TBIの3日前に、単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置した。TBIモデルは、以下から選択される:単回重度TBI(爆風;ssTBI)、反復性軽度TBI(衝撃;rmTBI)または単回軽度TBI(衝撃;smTBI)。外傷の15分前に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(20μg/5μl)を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、3つの用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgで処置する。
HuPT-113D抗体を使用する外傷性脳損傷(TBI)の防止
この研究は、TBIを防ぐために本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が有用であることを示す。
方法
wtC57/Bl6マウスを、TBIの3日前に、単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置した。TBIモデルは、以下から選択される:単回重度TBI(爆風;ssTBI)、反復性軽度TBI(衝撃;rmTBI)または単回軽度TBI(衝撃;smTBI)。外傷の15分前に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(20μg/5μl)を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、3つの用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgで処置する。
いくつかの実施形態では、偽群のマウス(すなわち、TBIなし)を対照に使う。
第1のコホート(8mg/kg ip 4日毎を用いて12日間前処置されたマウス(合計3用量))を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)およびfEPSPのために外傷の14日後に屠殺する。
第2のコホート(上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、8mg/kg ip毎週、さらに6週間)を、外傷の2カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、EPM、MWMおよび自発運動試験(ロータロッド(rotorod))。
第3のコホート(外傷後6カ月まで8mg/kg ip毎週を受け続けたマウス)を屠殺し、タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較した、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIなどのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
第1のコホート(8mg/kg ip 4日毎を用いて12日間前処置されたマウス(合計3用量))を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)およびfEPSPのために外傷の14日後に屠殺する。
第2のコホート(上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、8mg/kg ip毎週、さらに6週間)を、外傷の2カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、EPM、MWMおよび自発運動試験(ロータロッド(rotorod))。
第3のコホート(外傷後6カ月まで8mg/kg ip毎週を受け続けたマウス)を屠殺し、タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較した、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIなどのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
(実施例19)
アルツハイマー病のTMHTマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態の予防において有用であることを示す。
方法
TMHT(Thy-1突然変異ヒトタウ)トランスジェニックマウス(Flunkert et al., 2013)を、1カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(1~100mg/kgの間)を用いて処置する。マウスを、HuPT-113D抗体または対照抗体を用いて、腹腔内(IP)注射、皮下(SC)注射または静脈内(IV)投与によって毎週処置する。代替アッセイでは、異なる用量頻度は、それだけには限らないが、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、隔週、3週毎および毎月を含み得る。WTマウスを対照として使用する。
アルツハイマー病のTMHTマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態の予防において有用であることを示す。
方法
TMHT(Thy-1突然変異ヒトタウ)トランスジェニックマウス(Flunkert et al., 2013)を、1カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(1~100mg/kgの間)を用いて処置する。マウスを、HuPT-113D抗体または対照抗体を用いて、腹腔内(IP)注射、皮下(SC)注射または静脈内(IV)投与によって毎週処置する。代替アッセイでは、異なる用量頻度は、それだけには限らないが、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、隔週、3週毎および毎月を含み得る。WTマウスを対照として使用する。
第1のコホート(1~100mg/kg IP毎週を用いて2カ月間処置されたマウス)を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)のために3カ月齢で屠殺する。
第2のコホート(1~100mg/kg IP毎週を用いて4カ月間処置されたマウス)を5カ月齢で屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、高架式十字迷路、新規物体認識、回転運動能力、嗅覚を含む自発運動量の一般的指標)。
第3のコホート(1~100mg/kg IP毎週を用いて8カ月間、9カ月齢まで処置されたマウス)を屠殺し、タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスまたはシスタウを認識しない対照抗体を用いて処置されたマウスと比較して、シスタウオシスの低減、全体的なタウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
第2のコホート(1~100mg/kg IP毎週を用いて4カ月間処置されたマウス)を5カ月齢で屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、高架式十字迷路、新規物体認識、回転運動能力、嗅覚を含む自発運動量の一般的指標)。
第3のコホート(1~100mg/kg IP毎週を用いて8カ月間、9カ月齢まで処置されたマウス)を屠殺し、タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスまたはシスタウを認識しない対照抗体を用いて処置されたマウスと比較して、シスタウオシスの低減、全体的なタウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
(実施例20)
アルツハイマー病のTHMTマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4 (II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
TMHT(Thy-1突然変異ヒトタウ)トランスジェニックマウス(Flunkert et al., 2013)を、5カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
アルツハイマー病のTHMTマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4 (II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
TMHT(Thy-1突然変異ヒトタウ)トランスジェニックマウス(Flunkert et al., 2013)を、5カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
マウスを、8mg/kg ip4日毎を用いて12日間処置する(合計3回の処置)。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、嗅覚)。次いで、マウスをELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)のために屠殺する。代替アッセイでは、マウスを、各処置について3つの異なる漸増用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgを用いて処置する。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
(実施例21)
アルツハイマー病のhTauマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4 (II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を予防するのに有用であることを示す。
方法
hTauトランスジェニックマウス(Andorfer et al., 2003)を、1カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
アルツハイマー病のhTauマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4 (II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を予防するのに有用であることを示す。
方法
hTauトランスジェニックマウス(Andorfer et al., 2003)を、1カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
第1のコホート(8mg/kg ip4日毎を用いて5カ月間処置されたマウス)を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)のために6カ月齢で屠殺する。
第2のコホート(8mg/kg ip毎週を用いて11カ月間、12カ月齢まで受け続けたマウス)。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、新規物体認識)。タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を予防するために有用であることを示す。
第2のコホート(8mg/kg ip毎週を用いて11カ月間、12カ月齢まで受け続けたマウス)。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、新規物体認識)。タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を予防するために有用であることを示す。
(実施例22)
アルツハイマー病のhTauマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
hTauトランスジェニックマウス(Andorfer et al., 2003)を、12カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
マウスを、8mg/kg ip4日毎を用いて12日間処置する(合計3用量)。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、新規物体認識)。マウスをELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)のために3カ月齢で屠殺する。代替アッセイでは、マウスを、各処置について3つの異なる漸増用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgを用いて処置する。
アルツハイマー病のhTauマウスモデルにおけるHuPT-113D抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
hTauトランスジェニックマウス(Andorfer et al., 2003)を、12カ月齢で始めて、HuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。WTマウスを対照として使用する。
マウスを、8mg/kg ip4日毎を用いて12日間処置する(合計3用量)。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、MWM、新規物体認識)。マウスをELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)のために3カ月齢で屠殺する。代替アッセイでは、マウスを、各処置について3つの異なる漸増用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgを用いて処置する。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、アルツハイマー病などのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
(実施例23)
HuPT-113D抗体を使用する外傷性脳損傷(TBI)の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIを処置するのに有用であることを示す。
方法
wtC57/Bl6マウスを、TBIの直後に、単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。TBIモデルは、以下から選択される:単回重度TBI(爆風;ssTBI)、反復性軽度TBI(衝撃;rmTBI)または単回軽度TBI(衝撃;smTBI)。外傷の15分後に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(20μg/5μl)を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、3つの用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgで処置する。
いくつかの実施形態では、偽群のマウス(すなわち、TBIなし)を対照に使う。
第1のコホート(8mg/kg ip 4日毎を用いて12日間処置されたマウス(合計3用量))を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)およびfEPSPのために外傷の14日後に屠殺する。
第2のコホート(上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、8mg/kg ip毎週、さらに6週間)を、外傷の2カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、EPM、MWMおよび自発運動試験(ロータロッド(rotorod))
HuPT-113D抗体を使用する外傷性脳損傷(TBI)の処置
この研究は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIを処置するのに有用であることを示す。
方法
wtC57/Bl6マウスを、TBIの直後に、単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(200μg ip=約8mg/kg)を用いて処置する。TBIモデルは、以下から選択される:単回重度TBI(爆風;ssTBI)、反復性軽度TBI(衝撃;rmTBI)または単回軽度TBI(衝撃;smTBI)。外傷の15分後に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のHuPT-113D抗体または対照抗体(20μg/5μl)を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、3つの用量レベル、例えば、3、10および30mg/kgで処置する。
いくつかの実施形態では、偽群のマウス(すなわち、TBIなし)を対照に使う。
第1のコホート(8mg/kg ip 4日毎を用いて12日間処置されたマウス(合計3用量))を、ELISA/ウエスタンブロット解析(例えば、脳およびCSFにおいてシスタウおよび総(中間ドメイン)タウを評価するため)およびfEPSPのために外傷の14日後に屠殺する。
第2のコホート(上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、8mg/kg ip毎週、さらに6週間)を、外傷の2カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する(例えば、EPM、MWMおよび自発運動試験(ロータロッド(rotorod))
第3のコホート(外傷後6カ月まで8mg/kg ip毎週を受け続けたマウス)を屠殺し、タウ凝集(例えば、シスタウおよび総タウ)およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、IHCについてアッセイすることならびにALZ50、MC1および/またはAT8を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIなどのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するのに有用であることを示す。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち1つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体(例えば、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)およびHuPT-113D IgG4(II))が、TBIなどのシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するのに有用であることを示す。
均等物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者には明らかなように、この技術の多くの改変および変法は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に同等の方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変および変法は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲の用語、およびそのような特許請求の範囲が与えられる均等物の全範囲によってのみ制限されるべきである。この技術は、特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらはもちろん変わり得ることは理解されなければならない。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者には明らかなように、この技術の多くの改変および変法は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に同等の方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変および変法は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲の用語、およびそのような特許請求の範囲が与えられる均等物の全範囲によってのみ制限されるべきである。この技術は、特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらはもちろん変わり得ることは理解されなければならない。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から説明される場合、当業者は、開示がまた、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から説明されることを認識するであろう。
当業者によって理解されるように、特に書面による説明を提供するという観点から、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆるあり得る部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1などに分解して十分に説明し、有効にするものとして簡単に認識できる。限定されない例として、本明細書で論じられる各範囲は、下位3分の1、中3分の1、および上位3分の1などに容易に分解できる。また、当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などのすべての言語は、列挙された数を含み、上記で論じたような部分範囲にその後分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、1~3個のセルを有するグループは、1個、2個、または3個のセルを持つグループを指す。同様に、1~5個のセルを有するグループは、1、2、3、4、または5個のセルを有するグループなどを指します。
当業者によって理解されるように、特に書面による説明を提供するという観点から、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆるあり得る部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1などに分解して十分に説明し、有効にするものとして簡単に認識できる。限定されない例として、本明細書で論じられる各範囲は、下位3分の1、中3分の1、および上位3分の1などに容易に分解できる。また、当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などのすべての言語は、列挙された数を含み、上記で論じたような部分範囲にその後分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、1~3個のセルを有するグループは、1個、2個、または3個のセルを持つグループを指す。同様に、1~5個のセルを有するグループは、1、2、3、4、または5個のセルを有するグループなどを指します。
本明細書で参照されるまたは引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、すべての図および表を含む、全文が参照により組み込まれる。
その他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に示される。
その他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に示される。
Claims (31)
- 配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、を含む抗体。
- アミノ酸配列KVAVVRTPPKSPS(配列番号56)を含むリン酸化トレオニン231-タウタンパク質のエピトープと結合する、請求項1に記載の抗体。
- リン酸化トレオニン231-タウタンパク質のシス-コンホメーションと特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の抗体。
- Fab、F(ab’)2、Fab’、scFvおよびFvからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合断片。
- IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびIgMからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体をコードする組換え核酸配列。
- 請求項7に記載の組換え核酸配列を含む宿主細胞またはベクター。
- 請求項1または2に記載の抗体および医薬上許容される担体を含む組成物。
- それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法であって、対象に、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体の有効量を投与することを含む方法。
- 抗体が、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 神経疾患が、タウオパチー、外傷性脳損傷(TBI)または卒中である、請求項10または11に記載の方法。
- 前記タウオパチーが、進行性核上性麻痺(PSP)、慢性外傷性脳症(CTE)、前頭側頭型認知症(FTD)、前頭側頭葉変性症、リティコ-ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病AD)からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 対象が、前記タウオパチーの初期段階である、請求項13に記載の方法。
- 前記タウオパチーの初期段階が、対象から得られたサンプルにおける、シスpT231-タウのレベルの上昇またはシス:トランスpT231-タウ比の増大によって決定される、請求項14に記載の方法。
- 対象から得られたサンプルにおけるCSF t-タウのレベル、pT181-タウ、Αβ42またはApoE4レベルを決定することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液(CSF)からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記対象が、脳外傷の反復の病歴を有する、請求項10または11に記載の方法。
- 抗体が、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に対象に投与される、請求項10または11に記載の方法。
- さらなる治療薬が、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムのうち1種以上である、請求項19に記載の方法。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体を用いる処置のために対象を選択する方法であって、
(a)参照サンプルにおいて観察されたものに対する、前記対象から得られたサンプルにおけるシスpT231-タウタンパク質のレベルの増大またはシス:トランスpT231-タウタンパク質比の増大を検出することと、
(b)請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体を用いる処置のために前記対象を選択することと
を含む方法。 - 参照サンプルが、健常な対照対象から得られる、請求項21に記載の方法。
- 対象から得られたサンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液(CSF)からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- それを必要とする対象におけるシス-pT231-タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するためのキットであって、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含み、抗体は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、キット。
- 抗体が、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項24に記載のキット。
- サンプルにおいてシス-pT231-タウタンパク質を検出するためのキットであって、シス-pT231-タウタンパク質と特異的に結合する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含み、抗体は、配列番号1~4もしくは7~14の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、キット。
- 抗体が、配列番号41、42もしくは45~48の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項26に記載のキット。
- 抗体が、1つ以上の検出可能な標識にカップリングされている、請求項26または27に記載のキット。
- 1つ以上の検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む、請求項28に記載のキット。
- シス-pT231-タウタンパク質抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む、請求項26または27に記載のキット。
- 二次抗体が、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも1つの検出可能な標識にカップリングされている、請求項30に記載のキット。
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