KR20190028495A - 아밀로이드 베타에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 A-베타 올리고머에 결합하는 항체 및 상기 항체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 베타에 대한 항체
패밀리 상세 내역(FAMILY DETAIL)
이 국제 PCT 출원은 2016년 7월 18일 출원된 미국 가출원 일련번호 62/363566, 2016년 11월 9일자로 출원된 국제출원 PCT/CA2016/051303, 2017년 5월 17일 출원된 미국 가출원 일련번호 62/507587 및 2017년 5월 17일 출원된 미국 가출원 일련번호 62/507633에 대한 우선권의 이점을 주장하며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 개시내용은 아밀로이드 베타 (A-베타 또는 Aβ) 올리고머에 선택적인 항체뿐만 아니라 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
36-43 아미노산 펩타이드로 존재하는 아밀로이드-베타 (A-베타)는 효소인 β 및 γ 세크레타제에 의해 아밀로이드 전구 단백질 (APP)로부터 방출된 생성물이다. AD 환자에서, A-베타는 가용성 단량체, 불용성 원섬유 및 가용성 올리고머로 존재할 수 있다. 단량체 형태에서, A-베타는 우세하게 비구조적인 폴리펩타이드 사슬로서 존재한다. 원섬유 형태에서, A-베타는 종종 변형으로 지칭되는, 뚜렷한 형태로 응집될 수 있다. 이들 구조 중 일부는 고체상 NMR에 의해 결정되었다.
예를 들어, 원섬유의 몇 가지 변형에 대한 구조는 3-배 대칭 Aβ구조 (PDB 엔트리, 2M4J); Aβ-40 단량체의 2-배 대칭 구조 (PDB 엔트리 2LMN), 및 Aβ-42 단량체의 단일-사슬의 평행한 등록된 구조 (PDB 엔트리 2MXU)를 포함하는 원자 해상도 3차원 구조적 데이터의 결정학적 데이터베이스인 단백질 데이터 뱅크 (PDB)에서 이용가능하다.
2M4J의 구조는 Lu 등 [8]에 보고되고, 2MXU의 구조는 Xiao 등 [9]에 보고 된다. 2LMN의 구조는 Petkova 등 [10]에 보고 된다.
A-베타 올리고머는 배양물에서 세포주 및 뉴런을 사멸시키고, 슬라이스 배양 및 살아있는 동물에서 장기 강화작용 (LTP)으로 지칭되는, 기억을 보조하는 중요한 시냅스 활성을 차단하는 것으로 나타났다.
올리고머의 구조는 현재까지 결정되지 않았다. 또한, NMR 및 다른 증거는 올리고머가 단일의 명확한 구조는 아니지만 제한된 규칙성으로 형태적으로 가소성인 가단성이 있는 구조적 총체로 존재함을 나타낸다. 또한, 독성 올리고머 종의 농도는 단량체 또는 원섬유의 것보다 훨씬 낮아 (추정치는 다양하지만 대략 1000-배 아래 또는 그보다 더 낮음), 이 표적은 파악하기 어렵다.
A-베타에 결합하는 항체가 기재되어 있다.
안구질환에 항-아밀로이드 항체의 사용이라는 명칭으로, WO2009048538A2는 A-베타 상의 하나 이상의 결합 부위를 인식하고 안구질환에 대한 치료에 유용한 키메라성 항체를 개시한다.
아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련된 질환의 치료용 화합물이라는 명칭으로, US9221812B2는 아밀로이드-관련된 질환의 치료를 위해 아미노산 잔기 12 내지 24 사이의 에피토프를 포함하는 A-베타에 결합하는 불연속 항체와 약제학적 조성물을 개시한다.
항-아밀로이드 베타 항체 및 이의 용도라는 명칭으로, WO2003070760A2는 A-베타 불연속 에피토프를 인지하는 항체를 개시하고, 여기서 제1 영역은 아미노산 서열 AEFRHDSGY 또는 이의 단편을 포함하고 제2 영역은 아미노산 서열 VHHQKLVFFAEDVG 또는 이의 단편을 포함한다.
아밀로이드증을 치료하는 화합물이라는 명칭으로, US20110171243A1은 HQKLVF 및/또는 HQKLVFFAED에 결합하는 항체의 생체 내 형성을 유도할 수 있는 에피토프 유사 펩타이드와, 그것의 사용을 개시한다.
WO2008088983A1 및 WO2001062801A2는 A-베타 아미노산 13-28에 결합하는 페길화된 항체 단편과 A-베타 관련된 질환을 치료하는데 있어서 그것의 용도를 개시한다. 솔라네주맙 및 크레네주맙은 A-베타 상의 아미노산 16-26에 결합한다. 크레네주맙은 단량체, 올리고머 및 원섬유와 상호작용한다. 솔라네주맙 (피코몰의 친화력) 및 크레네주맙 (나노몰의 친화력)을 포함하는, 중간영역 항체는, 단량체성 A-베타에 우선적으로 결합하는 것으로 나타난다 [13].
파킨슨병과 관련된 증상을 치료하기 위한 화합물이라는 명칭으로, WO2009149487A2는 EVHHQKL, HQKLVF 및 HQKLVFFAED와 같은 A-베타 에피토프에 대해 특이적인 항체에 대해 결합능을 갖는 펩타이드를 포함하는 화합물을 기재한다.
HHQK (서열번호: 7) 도메인은 Giulian D 등 [11] 및 Winkler 등 [12]에 기재된 바와 같이, 인간 미세아교에서 신경독성의 플라크 유도에 관여되는 것으로 기재되어 있다. HHQK (서열번호: 7)에 결합하는 비-항체 치료제는 단백질 폴딩 질환의 치료에 대해 개시되어왔다 (US20150105344A1, WO2006125324A1).
미국 특허 5,766,846; 5,837,672; 및 5,593,846 (이들은 본 명세서에 참고로 편입됨)은 Aβ 펩타이드의 중심 도메인에 대한 쥣과 단클론성 항체의 생산을 개시한다. WO 01/62801은 아미노산 13-28 사이에서 A-베타에 결합하는 항체를 기술한다. WO2004071408은 인간화된 항체를 개시한다.
아밀로이드증의 치료 및 예방이라는 명칭으로, WO2009086539A2는 AA의 C-말단 영역으로부터 아밀로이드 단백질 A (AA) 단편과 같은 네오에피토프를 포함하는 펩타이드 및 응집된 아밀로이드 단백질의 네오에피토프에 특이적인 항체, 예를 들어, AA 원섬유의 C-말단 영역에 특이적인 항체를 투여함에 의한, 아밀로이드증 및 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증에 대한 것이다.
항-아밀로이드 베타 항체 및 이의 용도라는 명칭으로, WO2003070760은 R-A4 펩타이드의 2개의 영역을 특이적으로 인지할 수 있는 항체 분자에 대한 것으로, 여기서 제1 영역은 아미노산 서열 AEFRHDSGY 또는 이의 단편를 포함하고 제2 영역은 아미노산 서열 VHHAEDVFFAEDVG 또는 이의 단편를 포함한다.
인지를 개선하는데 사용하기 위한 인간화된 아밀로이드 베타 항체라는 명칭으로, WO2006066089는 베타 아밀로이드와 관련된 질환의 치료를 위한 향상된 제제 및 방법에 대한 것이고, 특히 Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하고 아밀로이드형성 장애 (예를 들어, AD)와 관련된 플라크 부하를 감소시키는데 효과적인 단클론성 항체인, 12A11의 확인 및 특성규명에 대한 것이다.
가변영역에서 당화된 아밀로이드 베타 4에 대한 항체라는 명칭으로, WO2007068429는 적어도 하나의 항원 결합 부위가 중쇄 (VH)의 가변영역 내에 당화된 아스파라긴 (Asn)을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체 분자 제조에 대한 것이다.
WO 03/016466은 중쇄의 CDR2 내의 N-당화 부위를 결여하도록 조작된 변종 266 항체, 이들의 약제학적 조성물, 및 상기 변종 항체를 발현하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 서열, 벡터, 및 형질 전환된 세포에 대한 것이다. 상기 변이체는 인간 생물학적 유체로부터 가용성 A-베타 펩타이드를 격리시키고, 아밀로이드 베타 펩타이드의 13-28 위치 내에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 기재되어 있다.
Yu 등은 PADRE 또는 독소-유래된 담체 단백질에 융합된 6가의 접힘 가능한 Aβ1-15 (6Aβ15)를 기술한다. Wang 등은 2016년에 상기 항체의 말초 투여가 나이든 알츠하이머 질환의 이식 유전자를 가진 동물에서 병리학 및 인지력 감퇴와 같은 알츠하이머 병을 완화한다고 보고했다 [14], [15].
단량체에 비해 또는 원섬유에 비해 또는 단량체와 원섬유 둘 모두에 비해 A-베타 올리고머에 우선적으로 또는 선택적으로 결합하는 항체가 바람직하다.
요약
일 양태는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을, 임의로 융합된, 포함하는 단리된 항체를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 그리고 상기 CDR들의 아미노산 서열로는 예를 들어 표 2에 나타낸 바와 같은, 서열번호: 1-6; 또는 서열번호: 1, 2, 80 및 4-6, 또는 서열번호: 1, 2, 80-83 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일 구현예에서, 단리된 항체는 형태 특이적 및/또는 선택적이다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체로서, 임의로 서열번호: 1-6 또는 서열번호: 1, 2, 80 및 4-6 또는 서열번호: 1, 2, 80-83을 포함하거나 또는 이들로 구성된 CDR들을 갖는 항체는, 상응하는 선형 펩타이드에 비해 HHQK (서열번호: 7)를 포함하는 환형 화합물에 선택적으로 결합하며, 임의로 여기서 상기 항체는 상응하는 선형 화합물에 비해 환형 화합물에 대해 적어도 2배, 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 더 선택적이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체로서, 임의로 서열번호: 1-6 또는 서열번호: 1, 2, 80 및 4-6 또는 서열번호: 1, 2, 80-83을 포함하거나 또는 이들로 구성된 CDR들을 갖는 항체는, 서열 HHQK (서열번호: 7)를 포함하는 선형 펩타이드에 특이적으로 그리고/또는 선택적으로 결합하지 않으며, 임의로 여기서 선형 펩타이드의 서열은, 항체를 발생시키기 위해 사용된 환형 화합물의 선형 버전이다.
또 다른 구현예에서, 표 2에 열거된 바와 같은 CDR 세트를 갖는 항체는 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유에 비해 A-베타 올리고머에 선택적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 상기 선택성은 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유에 비해 A-베타 올리고머에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 더 선택적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 원위치에서 A-베타 원섬유 플라크에 결합하지 않거나 무시할만한 결합을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체이다.
또 다른 구현예에서, 서열번호: 1-6 또는 서열번호: 1, 2, 80 및 4-6 또는 서열번호: 1, 2, 80-83을 포함하거나 또는 이들로 구성된 CDR들을 갖는 항체는 인간화된 항체이다. 일 구현예에서, 상기 인간화된 항체는 표 4a의 서열로부터 선택된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는다.
또 다른 양태에서, 표 2에 기재된 CDR들을 포함하는 항체를 발현하는 하이브리도마가 또한 제공된다.
추가의 양태는 인간화된 항체가 표 4b의 서열로부터 선택된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체이다.
일 구현예에서, 상기 인간화된 항체는 서열번호: 12 서열의 선형 펩타이드에 관하여, 동일한 서열을 갖는 환형 펩타이드에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하고, 또는 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유에 관하여는 올리고머성 A베타에 선택적으로 또는 특이적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 나노바디, 미니바디, 디아바디, 및 이들의 다량체로부터 선택된 본 명세서에 기재된 항체의 항체 결합 단편이다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 항체 및 검출가능한 표지 또는 세포독성 약물을 포함하는 면역접합체를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 검출가능한 표지는 양전자 방출 방사선핵종, 임의로 PET 이미지 형성과 같은 대상의 이미지 형성에 사용하기 위한 것을 포함한다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 항체, 또는 본 명세서에 기재된 면역접합체를, 임의로 희석제와 함께 포함하는 조성물을 포함한다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 화합물 또는 면역원의 단백질성 부분, 본 명세서에 기재된 항체 또는 본 명세서에 기재된 단백질성 면역접합체를 인코딩하는 핵산분자를 포함한다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 항체를 발현하는 세포를 포함하며, 임의로 여기서 상기 세포는 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 하이브리도마이다.
일 양태는 본 명세서에 기재된 항체, 본 명세서에 기재된 면역접합체, 본 명세서에 기재된 조성물, 본 명세서에 기재된 핵산분자, 본 명세서에 기재된 벡터 또는 본 명세서에 기재된 세포를 포함하는 키트를 포함한다.
일 양태는 생물학적 샘플이 A-베타를 포함하는지 여부를 결정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 상기 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 항체 또는 본 명세서에 기재된 면역접합체와 접촉시키는 단계; 및
b. 임의의 항체 복합체의 존재를 검출하는 단계.
일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 A-베타 올리고머를 함유하고 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 항체: A-베타 올리고머 복합체를 형성하기에 허용적인 조건하에서 A-베타 올리고머에 특이적인 그리고/또는 선택적인 본 명세서에 기재된 항체 또는 본 명세서에 기재된 면역접합체와 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및
b. 임의의 복합체의 존재를 검출하는 단계로;
여기서, 검출가능한 복합체의 존재는 상기 샘플이 A-베타 올리고머를 함유할 수 있다는 것을 표시한다.
또 다른 구현예에서, 복합체의 양이 측정된다.
또 다른 구현예에서, 샘플은 뇌 조직 또는 이들의 추출물, 전혈, 혈장, 혈청 및/또는 CSF를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 샘플은 인간 샘플이다.
또 다른 구현예에서, 샘플은 대조군, 임의로 이전의 샘플과 비교된다.
또 다른 구현예에서, A-베타의 수준은 비제한적으로 SPR, Kinexa, Mesoscale, ELISA, Singulex, Luminex 및 Simoa를 포함하는 분석적 검정에 의해 검출된다.
일 양태는 대상체에서 A-베타의 수준을 측정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 AD를 갖거나 또는 가질 위험에 있거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 명세서에 기재된 항체를 포함하는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 여기서 상기 항체는 검출가능한 표지에 접합되고; 그리고 상기 표지를 검출, 임의로 상기 표지를 정량적으로 검출한다.
일 구현예에서, 상기 표지는 양전자 방출 방사선핵종이다.
일 양태는 A-베타 올리고머 증식을 억제하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 A-베타를 발현하는 세포 또는 조직을 본 명세서에 기재된 A-베타 올리고머 특이적 또는 선택적 항체 또는 면역접합체의 유효량과 접촉시키거나 또는 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하여 A-베타 응집 및/또는 올리고머 증식을 억제하는 것을 포함한다.
일 양태는 AD 및/또는 다른 A-베타 아밀로이드 관련된 질환을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게 1) 본 명세서에 기재된 항체 또는 면역접합체 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량; 2) 그것을 필요로 하는 대상체에게 1의 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 또는 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 치료될 대상체로부터의 생물학적 샘플은 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 A-베타의 존재 또는 수준에 대해 평가된다.
또 다른 구현예에서, 항체, 면역접합체, 조성물 또는 핵산 또는 벡터는 뇌 또는 CNS의 다른 부분에 직접적으로 투여된다.
본 개시내용의 다른 특색 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 바람직한 구현예를 나타내는 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이기 때문이다.
본 개시내용의 구현예는 이제 도면과 관련하여 기재될 것이고, 여기서:
도 1은 시험관 내에서 A-베타 올리고머의 증식에 대한 항체의 효과를 나타내는 그래프이다.
본 명세서에서 제공되는 것은 표 2에서 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 CDR들을 포함하는 항체, 및/또는 표3, 4a 및 4b 및/또는 표 8의 서열로 기재된 것 중 어느 것에 제공된 가변 영역 서열을 갖는 항체, 이들의 면역치료적 조성물 및 이들의 사용 방법이다. 상기 항체들은 알츠하이머병 (AD)과 관련된 올리고머성 종류을 포함하는 A-베타의 독성 올리고머성 종류에 우선적으로 접근가능한 에피토프를 표적화할 수 있다.
실시예에서 나타낸 바와 같이, HHQK (서열번호: 7)를 포함하는 환형 펩타이드를 사용하여 발생시킨 항체는, 올리고머성 A 베타에 우선적으로 결합했고 그리고/또는 동일한 서열의 선형 펩타이드 (예를 들어 상응하는 선형적 서열)에 비해 환형 펩타이드에 선택적으로 결합했다. 실험적 결과가 기재되어 있고, 합성 단량체와 비교하여 선택적으로 합성 올리고머에 결합하고, 대조군 CSF보다 우선적으로 AD 환자로부터의 CSF에 결합하고 그리고/또는 대조군 가용성 뇌 추출물보다 우선적으로 AD 환자로부터의 가용성 뇌 추출물에 결합하는 에피토프-특이적이고 형태적으로 선택적인 항체를 확인한다. 게다가 AD 뇌 조직의 염색은 없거나 무시할만한 플라크 결합을 나타내는 항체를 확인했고, 시험관 내 연구로 항체가 Aβ 올리고머의 증식 및 응집을 억제하는 것이 밝혀졌다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 'A-베타'는 대안적으로 '아밀로이드 베타', '아밀로이드 β', A-베타, A-베타 또는 'Aβ'로 지칭될 수 있다. 아밀로이드 베타는 36-43 아미노산의 펩타이드이고 모든 종의 모든 야생형 및 돌연변이체 형태, 특히 인간 A-베타를 포함한다. A-베타40은 40개 아미노산 형태를 지칭하고; A-베타42는 42개 아미노산 형태 등을 지칭한다. 인간 야생형 A-베타42의 아미노산 서열은 서열번호: 73에 나타내었다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "A-베타 단량체"는 본 명세서에서 임의의 개별 하위 단위 형태의 A-베타 (예를 들어 1-40, 1-42, 1-43) 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "A-베타 올리고머"는 본 명세서에서 몇 개의 (예를 들어 적어도 2개) A-베타 단량체가 약 100 미만, 또는 보다 전형적으로 약 50 미만 단량체의 형태적으로-유연하고, 부분적으로-정렬된 3차원 구상체로 비-공유적으로 응집된 복수의 임의의 A-베타 하위 단위를 지칭한다. 예를 들어, 올리고머는 3 또는 4 또는 5 또는 그 초과의 단량체를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "A-베타 올리고머"는 합성 A-베타 올리고머 및/또는 본래의 A-베타 올리고머 둘 모두를 포함한다. "본래의 A-베타 올리고머"는 생체 내, 예를 들어 AD가 있는 대상체의 뇌 및 CSF에서 형성된 A-베타 올리고머를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "A-베타 원섬유"는 전자현미경 하에서 원섬유성 구조를 나타내는 비-공유적으로 회합된, 개별 A-베타 펩타이드의 어셈블리를 포함하는 분자 구조를 지칭한다. 원섬유성 구조는 전형적으로 "크로스 베타" 구조이고; 다량체의 크기에 대한 이론적 상한은 없고, 그리고 원섬유는 수천 또는 수천보다 많은 단량체를 포함할 수 있다. 원섬유는 수천 번 응집될 수 있어 AD의 1차 병리적 형태 진단 중 하나인 노인성 반점을 형성한다.
용어 "HHQK"는 서열번호: 7에서 나타낸 바와 같이, 아미노산 서열 히스티딘, 히스티딘, 글루타민, 라이신을 의미한다. 문맥에 따라, 아미노산 서열의 참조는 A-베타 또는 단리된 펩타이드에서의 서열, 예를 들어 환형 화합물의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
용어 "아미노산"은 모든 자연 발생 아미노산뿐만 아니라 변형된 L-아미노산을 포함한다. 아미노산의 원자는 상이한 동위 원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 수소에 대해 치환된 중수소, 질소-14에 대해 치환된 질소-15 및 탄소-12에 대해 치환된 탄소-13 및 다른 유사한 변화를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 예를 들어 단일 사슬 Fab 단편, Fab'2 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편을 포함하는, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 단일 사슬, 베니어드, 인간화된 및 다른 키메라성 항체 및 이들의 결합 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 재조합 공급원으로부터의 것일 수 있고 그리고/또는 동물 예컨대 토끼, 라마, 상어 등에서 생산될 수 있다. 이식 유전자를 가진 동물에서 또는 생화학적 기술을 사용하여 생산될 수 있거나 또는 라이브러리 예컨대 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있는 인간 항체가 또한 포함된다. 인간화된 또는 다른 키메라성 항체는 하나 이상의 아이소타입 또는 부류 또는 종류로부터의 서열을 포함할 수 있다.
어구 "단리된 항체"는 항체를 생산한 공급원, 예를 들어, 동물, 하이브리도마 또는 다른 세포주 (예컨대 항체를 생산하는 재조합 곤충, 효모 또는 박테리아 세포)로부터 제거된 생체 내 또는 시험관 내에서 생산된 항체를 지칭한다. 상기 단리된 항체는 적어도: 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 순도를 의미하는, 임의의 수치로 "정제"된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "결합 단편"은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하고 항원에 결합하거나 온전한 항체와 경쟁하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분이다. 예시적인 결합 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 나노바디, 미니바디, 디아바디, 및 이들의 다량체를 포함한다. 단편은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 수득한 F(ab')2 단편은 디설파이드 브릿지가 감소하도록 처리되어 Fab' 단편을 생산할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성으로 이어질 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 다른 단편이 또한 재조합 발현 기술에 의해 제작될 수 있다.
당해 기술분야에서 인정되는 용어들 "IMGT 넘버링" 또는 "ImMunoGeneTics 데이터베이스 넘버링"은 항체, 또는 이들의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적 (즉 초가변적)인 아미노산 잔기를 번호 매기기 하는 시스템을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "형태적 에피토프"는 에피토프 아미노산 서열이, 3차원 구조의 적어도 일 양태가 다른 형태 예를 들어 상응하는 선형 펩타이드 또는 A베타 단량체에는 존재하지 않거나 또는 거의 존재하기 쉽지 않고 같은 종류의 항체에 의해 특이적으로 및/또는 선택적으로 인식되는, 특정한 3차원 구조를 갖는 에피토프를 지칭한다. 형태-특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 그 형태-특이적 에피토프의 하나 이상의 아미노산의 공간적 배열을 인식한다. 예를 들어, HHQK (서열번호: 7) 형태적 에피토프는 선형 HHQK (서열번호: 7)를 사용하여 발생시킨 항체와 비교했을 때, 예를 들어 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 50배, 100배, 250배, 500배 또는 1000배 또는 그 초과의 선택성으로 항체에 의해 선택적으로 인식되는 HHQK (서열번호: 7)의 에피토프를 지칭한다. 항체가 에피토프 예컨대 형태적 에피토프, 예컨대 HHQK (서열번호: 7)에 선택적으로 결합한다고 언급되는 경우, 항체가 명시된 잔기 또는 이들의 일부를 함유하는 하나 이상의 특정 형태에 결합하는 것이 또 다른 형태에 있는 상기 잔기에 결합하는 것보다 더 큰 친화력으로 우선적으로 결합한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체가 상응하는 선형 펩티드에 비해 HHQK 또는 관련된 에피토프를 포함하는 환형 펩타이드에 선택적으로 결합한다고 언급되는 경우, 상기 항체는 상기 선형 펩타이드에 결합하는 것보다 적어도 2배 더 큰 친화력으로 상기 환형 펩타이드에 결합한다. 유사하게, 항체가 올리고머성 A베타에 선택적으로 결합한다고 언급되는 경우, 상기 항체는 A베타 단량체 및/또는 플라크 원섬유에 결합하는 것보다 적어도 2배 더 큰 친화력으로 상기 올리고머성 종류에 결합한다.
항체에 관하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "없는 또는 무시할만한 플라크 결합" 또는 "없거나 또는 무시할만한 플라크 결합을 갖는"은 항체가 (예를 들어, 원 위치에서, Abeta 항체 6E10으로 관찰된 플라크 염색과 비교하여 임의로) 면역조직화학에서 전형적인 플라크 형상 염색을 나타내지 않고, 그리고 염색의 수준은 IgG 음성 (예를 들어 무관한) 아이소타입 대조군으로 관찰된 수준에 필적하거나 2배 이내인 것을 의미한다.
용어 "단리된 펩타이드"는 예를 들어, 재조합 또는 합성 기술에 의해 생산되었고, 펩타이드를 생산한 공급원, 예컨대 재조합 세포 또는 잔존 펩타이드 합성 반응물로부터 제거된 펩타이드를 지칭한다. 단리된 펩타이드는 임의로 "정제"되고, 이것은 적어도: 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 순도 및 임의로 약품 등급 순도를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "검출가능한 표지"는 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 화합물에 부가되거나 또는 도입될 수 있고 직접적으로 또는 간접적으로, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 형광 단백질, 모이어티 예컨대 펩타이드 서열 (myc tag, HA-tag, V5-tag 또는 NE-tag 같은)을 지칭한다. 예를 들어, 표지는 방사선-불투과성, 양전자-방출 방사선핵종 (예를 들어 PET 이미지 형성에 사용하기 위함), 또는 방사선 동위원소, 예컨대 3H, 13N, 14C, 18F, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; 형광 (형광단) 또는 화학발광 (발색단) 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다아제 또는 홀스래디쉬 페록시다아제; 조영제; 또는 금속 이온일 수 있다. 검출가능한 표지는 또한 간접적으로 예를 들어 2차 항체를 사용하여 검출가능할 수 있다.
통상적으로 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원에 있는 항체 결합 부위, 전형적으로 폴리펩타이드 분절을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "에피토프"는 또한 기재된 집단 좌표 방법을 사용하여 A-베타에서 확인된 아미노산 서열 또는 그것의 일부를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 확인된 표적 영역 HHQK 서열번호: 7)을 포함하는 환형 화합물에 상응하는 단리된 펩타이드에 대해 생성된 항체는 상기 에피토프 서열의 일부 또는 전부를 인식한다. 에피토프는 항체에 의한 결합에 접근가능할 때 본 명세서의 문맥에서 "접근가능"하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "더 큰 친화력"은 항체 X가 표적 Y에 표적 Z보다 더 강하게 (Kon) 및/또는 더 작은 해리 상수 (Koff)로 결합하는 항체 결합의 상대적인 정도를 지칭하고, 이 문맥에서 항체 X는 표적 Y에 대해 Z에 대해서보다 더 큰 친화력을 가진다. 마찬가지로, 용어 "더 낮은 친화력"은 본 명세서에서 항체 X가 표적 Y에 표적 Z보다 덜 강하게 및/또는 보다 큰 해리 상수로 결합하는 항체 결합의 정도를 지칭하고, 이 문맥에서 항체 X는 표적 Y에 대해 Z에 대해서보다 더 낮은 친화력을 가진다. 항체와 그것의 표적 항원 사이의 결합의 친화력은 1/KD과 같은 KA로 표현될 수 있고 여기서 KD는 kon/koff과 같다. kon 및 koff 값은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여, 예를 들어 분자 친화력 선별 시스템 (MASS-1) (Sierra Sensors GmbH, 독일 함부르크 소재)을 사용하여 측정될 수 있다. 환형 화합물, 임의의 환형 펩타이드에서 보여지는 형태에 대해 선택적인 항체는 예를 들어, 선형 형태에 있는 상응하는 서열 (예를 들어, 비-고리화된 서열)과 비교하여 환형 화합물 (예를 들어, 환형 펩타이드)에 대해 더 큰 친화력을 갖는다.
환형 화합물과 관련하여 용어 "상응하는 선형 화합물"은 환형 화합물과 동일한 서열 또는 화학적 모이어티를 포함하거나 또는 구성되지만 선형 (즉 비-고리화된) 형태에서, 예를 들어 용액에서 선형 펩타이드로 존재하는 경우와 같은 특성을 갖는 화합물, 임의로 펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 상기 상응하는 선형 화합물은 고리화되지 않은 합성된 펩타이드일 수 있다.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "특이적으로 결합한다"는 항체가 에피토프 서열을 인식하고 최소 친화력으로 그것의 표적 항원에 결합한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 다가 항체는 적어도 1e-6, 적어도 1e-7, 적어도 1e-8, 적어도 1e-9 또는 적어도 1e-10의 KD로 그것의 표적에 결합한다. 적어도 1e-8보다 더 큰 친화력이 바람직할 수 있다. 예를 들어, KD는 나노몰 범위 또는 피코몰 범위일 수 있다. 하나의 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단편 예컨대 Fab 단편은, 비-단편화된 항체와의 다가 상호 작용보다 10배 또는 100배 더 낮은 친화력으로 그것의 표적에 결합할 수 있다.
A-베타 (예를 들어, 원섬유, 단량체 또는 올리고머) 또는 환형 화합물의 형태에 선택적으로 결합하는 항체에 관하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "선택적으로 결합한다"는 항체가 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배 또는 적어도 1000배 또는 그 초과의 친화력으로 상기 형태에 결합한다는 것을 의미한다. 따라서 특정 형태 (예를 들어 올리고머)에 보다 선택적인 항체는 다른 형태 및/또는 선형 펩타이드와 비교하여 적어도 2배 등 더 큰 친화력으로 A-베타의 특정한 형태에 우선적으로 결합한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "동물" 또는 "대상체"는, 임의로 인간을 포함 또는 배제한, 포유류를 포함한 동물계의 모든 구성원을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "보존적 아미노산 치환"은 단백질의 원하는 특성을 파괴하지 않으면서 하나의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 적합한 보존적 아미노산 치환은 서로 유사한 소수성, 극성 및 R-사슬 길이를 갖는 아미노산으로 치환하여 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 예는 하기를 포함한다:
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본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열 또는 2개의 핵산 서열 간의 서열 동일성의 백분율을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 상기 서열들은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있다). 그런 다음 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 그러면 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 중첩 위치의 수/총 위치 수 × 100%). 일 구현예에서, 상기 두 서열은 동일한 길이이다. 두 서열 간의 동일성 백분율의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열을 비교하기 위해 이용된 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적인 예는 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에서와 같이 변형된, 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268]에서의 알고리즘이다. 그와 같은 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 편입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 파라미터 세트로, 예를 들어 스코어 = 100, 단어 길이 = 12로 수행되어 본원의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 파라미터 세트로, 예를 들어 스코어-50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 명세서에 기재된 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, 갭이 있는 BLAST는 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST는 분자간의 원연관계를 검출하는 반복된 검색을 수행하는데 사용될 수 있다 (Id.). BLAST, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다 (예를 들어, NCBI 웹 사이트 참조). 서열의 비교를 위해 이용된 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 그와 같은 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 편입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 갭을 허용하거나 허용함이 없이 상기에 기재된 것들과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산할 때, 전형적으로 단지 정확한 일치만 카운트된다.
항체에 대해, 서열 동일성 백분율은 항체 서열이 IMGT 또는 기타 (예를 들어 Kabat 넘버링 규약)에 의해 최대로 정렬되었을 때 결정될 수 있다. 정렬 후, 대상체 항체 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙한 가변 영역)이 참조 항체의 동일한 영역과 비교되는 경우, 상기 대상체와 참조 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은 상기 대상체 및 참조 항체 영역 둘 모두에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 수를, 갭을 카운트하지 않은, 두 영역의 정렬된 위치의 총 수로 나누고, 백분율로 변환하기 위해 100을 곱한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "핵산 서열"은 자연발생 염기, 당류 및 당간 (백본) 연결기로 구성되는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 단량체의 서열을 지칭한다. 본 용어는 또한 비-자연발생 단량체 또는 이들의 일부를 포함하는 변형된 또는 치환된 서열을 포함한다. 본원의 핵산 서열은 데옥시리보핵산 서열 (DNA) 또는 리보핵산 서열 (RNA)일 수 있고 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함한 자연발생 염기를 포함할 수 있다. 상기 서열들은 또한 변형된 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형된 염기의 예는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 및 잔틴 및 하이포잔틴을 포함한다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다. 또한, 용어 "핵산"은 상보적 핵산 서열뿐만 아니라 최적화된 코돈 또는 같은 것을 나타내는 코돈 등가물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "단리된 핵산 서열"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체, 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없는 핵산을 지칭한다. 단리된 핵산은 또한 핵산이 유래된 핵산에 자연적으로 측면 배치된 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 실질적으로 없다.
"작동가능하게 연결된"은 핵산이 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도되다. 적합한 조절 서열은 박테리아, 진균, 바이러스, 포유동물 또는 곤충 유전자를 포함한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 적절한 조절 서열의 선택은 선택된 숙주 세포에 좌우되며, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 그러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터 및 증진인자 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 번역 개시 신호를 포함하는 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가로, 선택된 숙주 세포 및 이용된 벡터에 따라, 다른 서열, 예컨대 복제 기점, 부가적인 DNA 제한부위, 증진인자 및 전사의 유도성을 부여하는 서열이 발현 벡터로 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 핵산 분자가, 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포로 도입되거나 및/또는 게놈으로 통합될 수 있게 하는 상기 핵산 분자에 대한 임의의 중개 비히클을 포함하며, 플라스미드, 파아지미드, 박테리오파아지 또는 바이러스 벡터 예컨대 레트로바이러스 기반 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 기타 동종의 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는, 염색체외 유전물질의 작제물, 보통 원형 DNA 듀플렉스를 지칭한다.
"적어도 중간 정도로 엄격한 혼성화 조건"은 용액 내 2개의 상보적 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화를 촉진시키는 조건이 선택되는 것을 의미한다. 혼성화는 핵산 서열 분자의 모든 또는 일부에 대해 발생할 수 있다. 혼성화 부분은 전형적으로 길이가 적어도 15 (예를 들어, 20, 25, 30, 40 또는 50) 뉴클레오타이드이다. 당해 분야의 숙련가는 핵산 듀플렉스, 또는 하이브리드의 안정성이 나트륨 함유 완충액에서 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수인, Tm에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이다 (Tm = 81.5℃ - 16.6 (Log10 [Na+]) + 0.41(%(G+C) - 600/l), 또는 유사한 방정식). 따라서, 하이브리드 안정성을 결정하는 세정 조건에서의 파라미터는 나트륨 이온 농도 및 온도이다. 공지된 핵산 분자와 유사하지만 동일하지 않은 분자를 확인하기 위해, 1% 불일치가 Tm에서 약 1℃ 감소를 초래하는 것으로 추정될 수 있어, 예를 들어 만일 >95% 동일성을 갖는 핵산 분자를 탐색한다면, 최종 세정 온도는 약 5℃까지 감소할 것이다. 이들 고려 사항에 기반하여, 당해 분야의 숙련가는 적절한 혼성화 조건을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 엄격한 혼성화 조건이 선택된다. 예로써 하기 조건이 엄격한 혼성화를 달성하기 위해 이용될 수 있다: 상기 방정식에 기반하여 Tm - 5℃에서 5x 염화나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC)/5x 덴하르트 용액/1.0% SDS에서 혼성화, 이어서 60℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS로 세정한다. 중간 정도로 엄격한 혼성화 조건은 42℃에서 3x SSC로 세정하는 단계를 포함한다. 그러나, 대안적인 완충액, 염 및 온도를 사용하여 동등한 엄격성이 달성될 수 있음을 이해해야 한다. 혼성화 조건에 관한 추가 안내는 아래 문헌에서 찾아볼 수 있다: 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002], 및 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001].
본 명세서에서 사용된 바와 같고 본 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같은, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 검출 가능하든 검출 불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 완화, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 완화 또는 경감, 질환의 재발의 약화, 및 (부분적이든 또는 전체적이든) 차도를 포함할 수 있다. "치료하는" 및 "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 기대된 생존과 비교하여 생존기간을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "치료하는" 및 "치료"는 또한 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 초기단계 AD가 있는 대상체는 진행을 예방하기 위해 본 명세서에 기재된 화합물, 항체, 면역원, 핵산 또는 조성물로 진행을 예방하도록 치료될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "투여된"은 세포 또는 대상체에 본 개시 내용의 화합물 또는 조성물의 치료적으로 효과적인 용량의 투여를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 어구 "유효량"은 원하는 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 기간 동안, 효과적인 양을 의미한다. 대상에게 투여될 때 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투약량 처방 계획은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제 또는 부형제가 제형의 다른 성분과 양립가능하고 그것의 수용자에게 실질적으로 유해하지 않다는 것을 의미한다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 또는 "포괄하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포괄할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는" 또는 "포괄하는" 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
본 개시내용의 범위를 이해함에 있어서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "구성되는" 및 그것의 파생어는 언급된 특색, 요소, 성분, 그룹, 완전체, 및/또는 단계의 존재를 명시하고 그리고 또한 다른 언급되지 않은 특색, 요소, 성분, 그룹, 완전체 및/또는 단계의 존재를 배제하는 폐쇄형 용어들인 것으로 의도된다.
본 명세서에서 종점에 의한 수치범위의 인용은 그 범위 내에 포함되는 모든 수 및 분수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함한다). 또한, 모든 숫자 및 이들의 분수는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 추정되는 것이 이해되어야 한다. 또한, 단수("a", "an" 및 "the")는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 용어 "약"은 기준이 되는 숫자의 플러스 또는 마이너스 0.1 내지 50 %, 5-50 % 또는 10-40%, 바람직하게는 10-20%, 더 바람직하게는 10% 또는 15%를 의미한다.
또한, 특정 부문들에 기재된 정의 및 구현예는 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이 이들이 적합하다고 기재된 본 명세서에서의 다른 구현예에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들어, 다음의 구절에서, 본 발명의 상이한 양태가 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는 분명하게 반대되는 것으로 지시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
관사 ("a", "an" 및 "the")의 단수 형태는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하여, 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
II . 항체 및 핵산
특정 항체 및 이의 용도가 본 명세서에서 개시된다.
실시예에서 실증된 바와 같이, 환형 (CGHHQKG) (서열번호: 12)를 사용하여 발생된 항체는 서열분석되고, 상응하는 선형 펩티드와 비교하여 환형 화합물에 선택적으로 결합했고, 단량체에 비해 A-베타 올리고머에 선택적으로 결합했고 그리고/또는 AD 조직에서 주목할만한 플라크 염색이 없었다. 더욱이, 상기 항체는 시험관 내에서 A-베타 응집의 확대를 억제할 수 있었다.
따라서, 일 양태는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을, 임의로 융합된, 포함하는 항체를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하고 그리고 상기 CDR들의 아미노산 서열로는 하기 서열을 포함한다:
CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
CDR-H3 ARDYYGSSSYTSGFAY (서열번호: 3)
CDR-L1 QSLLNSRTRKNY (서열번호: 4)
CDR-L2 WAS (서열번호: 5)
CDR-L3 KQSYNLYT (서열번호: 6)
일 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 9와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 3에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 3에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, ii) 서열번호: 11과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 8에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 및/또는 상기 항체는 서열번호: 10에 정리된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 9에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1-6에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호: 9의 중쇄 가변 사슬 서열 및/또는 서열번호: 11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머.
또 다른 양태는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을, 임의로 융합된, 포함하는 단리된 형태 특이적 및/또는 선택적 항체를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하고 그리고 상기 CDR들의 아미노산 서열로는 하기 서열을 포함한다:
CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
CDR-H3 ARDYYGSNSYTSGFAY (서열번호: 80)
CDR-L1 QSLLNSRTRKNY (서열번호: 4)
CDR-L2 WAS (서열번호: 5)
CDR-L3 KQSYNLYT (서열번호: 6).
일 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 85에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 85와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 87에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 89와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 84에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 86에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 85에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 87에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1, 2, 80, 4-6에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 85의 중쇄 가변 사슬 서열 및/또는 서열번호: 87의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 결합하는 항체이다.
또 다른 양태는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을, 임의로 융합된, 포함하는 단리된 형태 특이적 및/또는 선택적 항체를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하고 그리고 상기 CDR들의 아미노산 서열로는 하기 서열을 포함한다:
CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
CDR-H3 ARDYYGSNSYTSGFAY (서열번호: 80)
CDR-L1 QSIVHSNGNTY (서열번호: 81)
CDR-L2 KVS (서열번호: 82)
CDR-L3 FQGSHVPLT (서열번호: 83).
일 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 85에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 85와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 89에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 89와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 81, 82 및 83에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 81, 82 및 83에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 84에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 88에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 85에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 89에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1, 2, 80-3에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 85의 중쇄 가변 사슬 서열 및/또는 서열번호: 89의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 결합하는 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 서열 HHQK (서열번호: 7)을 포함하는 선형 펩타이드에 결합하지 않는데, 임의로 여기서 선형 펩타이드의 서열은 임의로 실시예에 기재된 조건하에서, 항체를 발생시키기 위해 사용된 환형 서열의 선형 버전이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 생체 내에 존재할 때 A-베타 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 에피토프는 HHQK (서열번호: 7), 또는 이들의 일부를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 구현예에서, 상기 항체는 HHQK (서열번호: 7)로 구성되는 선형 펩타이드에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 선형 펩타이드에 대해 선택적이지 않다. 선택적 결합은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 임의로 선형 CGHHQKG (서열번호: 12)의 맥락에서, HHQK (서열번호: 7)를 포함하는 선형 펩타이드에 비하여, 임의로 사이클로(CGHHQKG) (서열번호: 12)의 맥락에서, HHQK (서열번호: 7) 또는 이들의 일부를 포함하는 환형 화합물에 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 일 구현예에서 상기 항체는 환형 형태인 HHQK (서열번호: 7)에 선택적으로 결합하고, 그리고, 예를 들어 임의로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때, 상응하는 선형 화합물과 같은 선형 화합물인 HHQK (서열번호: 7)와 비교하여 환형 형태인 HHQK (서열번호: 7)에 대해 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 더 선택적이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 선형 펩타이드에 비하여 에피토프 서열를 포함하는 환형 화합물에, 또는 단량체에 비하여 A-베타 올리고머와 같은 A-베타의 종류에 선택적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 선택성은 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유 및/또는 선형 HHQK (서열번호: 7), 임의로 선형 CGHHQKG (서열번호: 12)로부터 선택된 A-베타의 종류보다 A-베타 올리고머 및/또는 환형 화합물에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 더 선택적이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 단클론성 항체이다. 단클론성의 생산은 실시예에 기재되어 있다.
단클론성 항체를 생산하기 위해, 항체 생산 세포 (림프구)는 본 명세서에 기재된 면역원으로 면역화된 대상체로부터 수확될 수 있고, 그리고 표준 체세포 융합 절차에 의해 골수종 세포와 융합되고, 따라서 이들 세포를 불멸화하여 하이브리도마 세포를 생성한다. 이러한 기술은 당해 분야에서, (예를 들어 하이브리도마 기술은 본래 Kohler 및 Milstein에 의해 개발되었다 (Nature 256:495-497 (1975)) 뿐만 아니라 다른 기술 예컨대 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., Immunol.Today 4:72 (1983)), 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., Methods Enzymol, 121 : 140-67 (1986)), 및 조합 항체 라이브러리의 선별 (Huse et al., Science 246:1275 (1989))도 잘 알려져 있다. 하이브리도마 세포는 원하는 에피토프에 특이적으로 반응하는 항체의 생산을 위해 면역화학적으로 선별될 수 있고 단클론성 항체가 단리될 수 있다.
특정 항원 또는 분자에 대해 반응하는 특정 항체, 또는 항체 단편은 또한 세포 표면 성분을 갖는 박테리아에서 발현된 면역 글로불린 유전자, 또는 이들의 일부를 인코딩하는 발현 라이브러리를 선별하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 완전한 Fab 단편, VH 영역 및 FV 영역은 파아지 발현 라이브러리를 사용하여 박테리아에서 발현될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Ward et al., Nature 41:544-546 (1989)]; [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]; 및 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)] 참조).
일 구현예에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다. 실시예에서 실증된 바와 같이, 특정 인간화된 항체가 기재되어 있다.
비-인간 종으로부터 항체의 인간화는 문헌에 잘 기재되어 있다. 예를 들어 EP-B1 0 239400 및 문헌 [Carter & Merchant 1997 (본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된 Curr Opin Biotechnol 8, 449-454, 1997)] 참조. 인간화된 항체는 또한 쉽게 상업적으로 수득된다 (예를 들어, Scotgen Limited, 영국 미들섹스 트위크넘 2 홀리 로드 소재).
설치류 항체의 인간화된 형태는 CDR 이식에 의해 쉽게 생성된다 (Riechmann et al. Nature, 332:323-327, 1988). 이 접근법에서, 설치류 단클론성 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 6개 CDR 루프가 상응하는 인간 프레임워크 영역에 연결된다. CDR 이식은 프레임워크 영역의 아미노산이 항원 인식에 영향을 미칠 수 있기 때문에 감소된 친화력을 갖는 항체를 종종 생산한다 (문헌 [Foote & Winter. J Mol Biol, 224: 487-499, 1992]). 항체의 친화력을 유지하기 위해, 특정 프레임워크 잔기를 부위 지향된 돌연변이 유발 또는 다른 재조합 기술을 이용하여 대체하는 것이 종종 필요하고, 이것은 항원 결합 부위의 컴퓨터 모델링에 의해 도움을 받을 수 있다 (문헌 [Co et al. J Immunol, 152: 2968-2976, 1994]).
항체의 인간화된 형태는 재표면화에 의해 임의로 수득된다 (문헌 [Pedersen et al. J Mol Biol, 235: 959-973, 1994]). 이 접근법에서는 단지 설치류 항체의 표면 잔기만이 인간화된다.
일 구현예에서, 상기 인간화된 항체는 표 2에 나타낸 바와 같은 CDR들을 포함한다.
특정 인간화된 서열은 표 4a 및 4b에 제공되어 있다.
일 양태는 표 4a 또는 4b에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 또는 표 4a 또는 4b에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 보이는 서열을 갖는 인간화된 항체를 포함하고, 여기서 CDR 아미노산 서열은 거기에 나타낸 바와 같다.
일 구현예에서, 상기 인간화된 항체는 i) 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 3에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 1, 2 및 3에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 서열번호: 4, 5 및 6에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23 및 25 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 29, 31, 33, 35, 37 및 39 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나 서열에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 표 4a에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열을 포함하고, 임의로 표 4a에 나타낸 경쇄 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타, 임의로 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나에서의 중쇄 가변 사슬 서열 및/또는 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나의 서열에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타, 임의로 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 16 및 30; 서열번호: 18 및 32; 서열번호: 20 및 34; 서열번호: 22 및 36; 서열번호: 24 및 38; 또는 서열번호: 36 및 40, 또는 이들과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 서열들을 포함하고 여기서 CDR들은 표 2에서 나타낸 바와 같이 유지된다.
또 다른 구현예에서, 인간화된 항체는 표 4b에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인간화된 항체는 i) 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 74-76에서) 서열인, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (예를 들어 서열번호: 74-76) 서열인, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 i) 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 77-79에서) 서열인, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 CDR 서열이 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 77-79에서) 서열인, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 43, 45, 47, 49, 51 및 53 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 57, 59, 61, 63, 65 및 67 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나 서열에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 표 4b에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이며, 임의로 여기서 상기 항체는 표 4b에 나타낸 경쇄 서열을 더 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나의 중쇄 가변 사슬 서열 및/또는 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 44 및 58; 서열번호: 46 및 60; 서열번호: 48 및 62; 서열번호: 50 및 64; 서열번호: 52 및 66; 또는 서열번호: 54 및 68, 또는 이들과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 서열들을 포함하고 여기서 CDR들은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 74-79에서) 바와 같이 유지된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체는 i) 서열번호: 70 및/또는 72에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 70 및/또는 72 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)을 갖는 불변영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 69에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 71에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
특정 항원에 특이적인 인간 항체는 파아지 디스플레이 전략에 의해 확인될 수 있다 (문헌 [Jespers et al. Bio/Technology, 12: 899-903, 1994]). 일 접근법에서, 특정 항원에 대해 유도된 설치류 항체의 중쇄가 클로닝되고, 섬유상 파아지에 Fab 단편으로 표시하기 위해 인간 경쇄의 레퍼토리와 쌍이 된다. 파아지는 항원에 결합함에 의해 선택된다. 선택된 인간 경쇄는 이어서 파아지에 표시하기 위해 인간 중쇄의 레퍼토리와 쌍이 되고, 그리고 파아지는 항원에 결합함에 의해 다시 선택된다. 결과는 특정 항원에 특이적인 인간 항체 Fab 단편이다. 또 다른 접근법에서, 구성원이 이들의 외부 표면 상에 상이한 인간 항체 단편 (Fab 또는 Fv)을 표시하는 파아지의 라이브러리가 생성된다 (Dower 등의 WO 91/17271 및 McCafferty 등의 WO 92/01047). 원하는 특이성을 갖는 항체를 나타내는 파아지는 특정 항원에 대한 친화력 강화에 의해 선택된다. 어느 접근법으로부터 확인된 인간 Fab 또는 Fv 단편은 포유동물 세포에서 인간 항체로서 발현하기 위해 재클로닝될 수 있다.
인간 항체는 이식 유전자를 가진 동물로부터 임의로 수득된다 (미국 특허번호 6,150,584; 6,114,598; 및 5,770,429). 이 접근법에서 키메라성 또는 생식계열 돌연변이 마우스의 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자가 결실된다. 인간 생식-계열 면역 글로불린 유전자 배열이 그러한 돌연변이 마우스로 그후에 전달된다. 그러면, 수득된 이식 유전자를 가진 마우스는 항원 공격시 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있다.
인간화된 항체는 전형적으로 항원 결합 단편, 예컨대 Fab, Fab' F(ab')2, Fd, Fv 및 단일 도메인 항체 단편으로서, 또는 중쇄 및 경쇄가 스페이서에 의해 연결된 단일 사슬 항체로서 생산된다. 또한, 인간 또는 인간화된 항체는 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있다. 인간화된 항체는 임의로 하나의 비-인간 사슬 및 하나의 인간화된 사슬 (즉, 하나의 인간화된 중쇄 또는 경쇄)을 포함한다.
인간화된 또는 인간 항체를 포함하는 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 또는 IgE를 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린; 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 아이소타입으로부터 선택된다. 인간화된 또는 인간 항체는 하나 이상의 아이소타입 또는 부류로부터의 서열을 포함할 수 있다.
서열번호: 74-79에 나타난 CDR들을 갖는 항체는 코돈 최적화되었고 IgG1 또는 IgG2a 아이소타입으로 제조되었다. 서열은 표 8에 나타나 있다.
일 구현예에서, 항체는 표 8에 제공된 바와 같은 서열 또는 이들의 일부를 가지며, 상기 일부는 적어도 CDR들, 임의로 중쇄 CDR들 및/또는 경쇄 CDR들을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 일부는 표 8에서의 서열로부터 선택된 서열의 가변 사슬 부분이다.
표 8에 나타난 불변 영역 (예를 들어 서열번호: 42 및 56과 같이 본 명세서에서 제공된 다른 서열과 비교하여 결정가능함)은 또한 서열번호: 1-6, 또는 1, 2, 80, 4-6 또는 1, 2, 80-83을 갖는 CDR들이 있는 항체의 가변 서열과 조합될 수 있다.
추가로, 본 명세서에 기재된 에피토프에 대해 특이적인 항체는 항체 파아지 디스플레이 라이브러리를 선별함에 의해 쉽게 단리된다. 예를 들어, 항체 파아지 라이브러리는 질환 특이적 에피토프에 대해 특이적인 항체 단편을 확인하기 위해 본 발명의 질환 특이적 에피토프를 사용하여 임의로 선별된다. 확인된 항체 단편은 본 발명의 상이한 구현예로 유용한 다양한 재조합 항체를 생산하는데 임의로 사용된다. 항체 파아지 디스플레이 라이브러리는 예를 들어 Xoma (캘리포니아주 버클리 소재)를 통해 상업적으로 입수 가능하다. 항체 파아지 라이브러리를 선별하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 단클론성 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 키메라성 항체 예컨대 표 2에서 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 인간화된 항체이다.
또한 또 다른 구현예에서, 임의로 단일 사슬 항체의 상황에서, 표 2에 열거된 바와 같은 CDR들 및 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 제공된다.
본 명세서에서 상기 항체는 단일 사슬 항체일 수 있다. 또한 일 구현예에서, 기재된 인간화된 항체는 단일 사슬 항체이다.
언급된 바와 같이, 표 2에서 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하거나, 또는 표 3, 4a, 4b 및 8 중 어느 하나에서 제공된 바와 같은 서열을 포함하는 항체로 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체가 또한 포함된다.
항체 간의 경쟁은 예를 들어 시험중인 항체가 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적인 결합을 억제하는 그것의 능력에 대해 평가되는 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 과잉의 시험 항체 (예를 들어, 적어도 2배, 5배, 10배 또는 20배)가 경쟁적 결합 검정에서 측정될 때 기준 항체의 결합을 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 억제하는 경우 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다.
일 구현예에서 상기 항체는 단리된다. 일 구현예에서, 상기 항체는 외인성 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 예를 들어 실시예에 기재된 조건하에서 단량체성 A-베타에 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 상기 항체는 예를 들어 실시예에 기재된 조건하에서, 예를 들어 AD 뇌 조직에서의 원위치에서, 노인성 반점에 있는 A-베타와 결합하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 항체는 본래의- 또는 합성- 올리고머성 A-베타와 비교하여 단량체성 A-베타와 선택적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, A-베타 올리고머는 A-베타 1-42 하위단위를 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 예를 들어 면역조직화학에 의해 측정된 바와 같이 A-베타 원섬유 플라크 (노인성 반점으로도 지칭됨) 염색이 없다. 플라크 염색의 부재는 양성 대조군 예컨대 A-베타-특이적 항체 6E10 및 4G8 (Biolegend, 캘리포니아주 샌디에고 소재), 또는 2C8 (Enzo Life Sciences Inc., 뉴욕주 파밍데일 소재) 및 아이소타입 대조군과 비교하여 평가될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체는 상기 항체가 전형적인 플라크 형상 염색을 나타내지 않고 염색 수준이 IgG 음성 아이소타입 대조군에서 보이는 수준에 필적하거나 또는 그 수준의 2배 이내인 경우 A-베타 원섬유 플라크 염색이 없거나 무시할만하다. 척도를 예를 들어 1에서 아이소타입 대조군, 그리고 10에서 6E10의 염색 수준으로 설정할 수 있다. 이러한 척도에서 염색의 수준이 2 이하이면 항체는 A-베타 원섬유 플라크 염색이 없다. 일 구현예에서, 상기 항체는 예를 들어 전술한 척도에서, 3보다 작거나 약 3 이하로 채점되는 수준의 최소한의 A-베타 원섬유 플라크 염색을 나타낸다.
추가 양태는 치료적인 검출가능한 표지 또는 세포독성 약물에 접합된 항체이다. 일 구현예에서, 검출가능한 표지는 양전자-방출 방사선핵종이다. 양전자-방출 방사선핵종은 예를 들어 PET 이미지 형성에서 사용될 수 있다.
추가 양태는 본 명세서에 기재된 항체 및/또는 이들의 결합 단편 및 올리고머성 A-베타를 포함하는 항체 복합체에 관한 것이다.
추가 양태는 본 명세서에 기재된 항체 또는 이들의 일부를 인코딩하는 단리된 핵산이다.
중쇄 또는 경쇄 또는 이들의 일부를 인코딩하는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및/또는 CDR-H3 영역을 포함하는 중쇄를 인코딩하거나 또는 본 명세서에 기재된 CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3 영역을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 핵산, 본 명세서에 기재된 가변사슬 및 이들의 최적화된 코돈과 동의 코돈 버전이 또한 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 항체 및/또는 이들의 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열의 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기 변이체는 적어도 중간 정도로 엄격한 혼성화 조건하에서 본 명세서에서 개시된 항체 및/또는 이들의 결합 단편 또는 동의 코돈을 인코딩하는 핵산 서열 또는 최적화된 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 변이체 핵산 서열은 표 2, 3, 4a, 4b 및 8에 나타낸 아미노산 서열 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90% 그리고 더욱이 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 가진다.
추가의 양태는 본 명세서에 기재된 항체를 인코딩하는 단리된 핵산, 예를 들어 표 2, 3, 4a, 4b 및 8 중 어느 하나에 나타낸 핵산이다.
또 다른 양태는 본 명세서에서 개시된 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터이다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 단리된 벡터이다.
본 벡터는 본 명세서에 기재된 펩타이드 서열을 발현하거나 또는 항체 및/또는 이들의 결합 단편을 생산하기에 적합한 벡터를 포함하는, 임의의 벡터일 수 있다.
핵산 분자는 단백질의 발현을 보장하는 적절한 발현 벡터에 공지된 방식으로 혼입될 수 있다. 가능한 발현 벡터는 비제한적으로 코스미드, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스 (예를 들어 복제가 불완전한 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다. 벡터는 사용된 숙주 세포와 양립가능해야 한다. 발현 벡터는 "숙주 세포의 형질전환에 적합"하며, 이는 상기 발현 벡터가 본 명세서에 기재된 에피토프 또는 항체에 상응하는 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 함유함을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 예를 들어 유전자 요법에 의한 단일 사슬 항체를 발현하는데 적합하다. 상기 벡터는, 예를 들어 신경 특이적 프로모터 및 기타 동종의 것을 사용하여, 신경 조직에서 특정한 발현에 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 IRES를 포함하고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 발현을 허용한다. 이러한 벡터는 생체 내에서 항체를 전달하는데 사용될 수 있다.
적합한 조절 서열은 박테리아, 진균, 바이러스, 포유동물 또는 곤충 유전자를 비롯한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다.
이러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터 및 증진인자 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 번역 개시 신호를 포함하는 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가로, 선택된 숙주 세포 및 이용된 벡터에 따라, 복제 기점, 부가적인 DNA 제한 부위, 증진인자 및 전사의 유도성을 부여하는 서열과 같은, 다른 서열이 발현 벡터에 혼입될 수 있다.
일 구현예에서, 조절 서열은 신경 조직 및/또는 세포에서 발현을 지시하거나 증가시킨다.
일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
재조합 발현 벡터는 또한 본 명세서에 기재된 항체 또는 에피토프 펩타이드를 발현하기 위한 벡터로 형질전환, 감염 또는 형질주입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 하는 마커 유전자를 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 재조합 펩타이드의 증가된 발현 또는 안정성; 재조합 펩타이드의 증가된 용해도를 제공하면서; 그리고 예를 들어 본 명세서에 기재된 태그 및 표지를 포함하는, 친화력을 이용한 정제에서 리간드로서 작용하여 표적 재조합 펩타이드의 정제를 돕는 융합 모이어티 (즉, "융합 단백질")을 인코딩하는 발현 카세트를 또한 함유할 수 있다. 또한, 단백질 분해 절단 부위가 표적 재조합 단백질에 첨가될 수 있어 융합 단백질의 정제 뒤에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 할 수 있다. 전형적인 융합 발현 벡터는 재조합 단백질에 각각 글루타티온 S-전달효소 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합시키는 pGEX (Amrad Corp., 호주 멜버른 소재), pMAL (New England Biolabs, 메사추세츠주 비벌리 소재) 및 pRIT5 (Pharmacia, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.
예를 들어 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 뉴런 및 신경 조직으로 유전자의 전달을 위한 시스템은 바이러스, 가장 현저히는 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 및 렌티바이러스를 포함한 레트로바이러스에 기반한 벡터를 포함한다. 유전자 전달에 대한 대안적인 접근법은 네이키드, 플라스미드 DNA 뿐만 아니라 리포좀-DNA 복합체의 사용을 포함한다. 또 다른 접근법은 DNA가 다중 양이온-응축되고 지질 포획되고 뇌내 유전자 전달에 의해 뇌로 도입되는 AAV 플라스미드의 사용이다 (Leone 등의 미국 특허출원번호 2002076394).
따라서, 또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 화합물, 면역원, 핵산, 벡터 및 항체는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 항체, 화합물, 면역원 및 핵산의 전달을 위해, 소포 예컨대 리포좀, 나노입자, 및 바이러스성 단백질 입자 안에 제형화될 수 있다. 특히, 폴리머솜을 포함하는, 합성 중합체 소포를 사용하여 항체를 투여할 수 있다.
또한 또 다른 양태에서 본 명세서에 기재된 항체를 발현하거나 또는 본 명세서에서 개시된 벡터를 포함하는 세포, 임의로 단리된 및/또는 재조합 세포가 제공된다.
본 재조합 세포는 예를 들어 항체 및/또는 이들의 결합 단편을 생산하기에 적합한, 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 임의의 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 (예를 들어, 벡터)을 세포 내로 도입하기 위해, 이용된 벡터에 따라, 세포를 형질주입, 형질전환 또는 감염시킬 수 있다.
적합한 숙주 세포는 다양한 원핵 및 진핵 생물 숙주 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질은 박테리아 세포 예컨대 E. coli, 곤충 세포 (배큘로바이러스를 사용함), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포는 효모, 식물, 웜, 곤충, 조류, 어류, 파충류 및 포유동물 세포로부터 선택된 진핵 세포이다.
또 다른 구현예에서, 상기 포유동물 세포는 골수종 세포, 비장 세포 또는 하이브리도마 세포이다.
일 구현예에서, 상기 세포는 신경 세포이다.
항체 또는 펩타이드를 발현하기에 적합한 효모 및 진균 숙주 세포는, 비제한적으로 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베, 피치아 또는 클루이베로마이세스 속 및 아스페르길루스 속의 다양한 종을 포함한다. 효모 S. 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1, pMFa, pJRY88, 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 포함한다. 효모 및 진균의 형질전환을 위한 프로토콜은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
적합할 수 있는 포유동물 세포는, 그 중에서도: COS (예를 들어, ATCC No. CRL 1650 또는 1651), BHK (예를 들어 ATCC No. CRL 6281), CHO (ATCC No. CCL 61), HeLa (예를 들어, ATCC No. CCL 2), 293 (ATCC No. 1573) 및 NS-1 세포를 포함한다. 포유동물 세포에서 발현을 지시하기 위한 적합한 발현 벡터는 일반적으로 프로모터 (예를 들어, 바이러스성 물질 예컨대 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 유인원 바이러스 40으로부터 유래된 것), 뿐만 아니라 다른 전사 및 번역 조절 서열을 포함한다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 및 pMT2PC를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포는 융합된 세포 예컨대 하이브리도마 세포이고, 상기 하이브리도마 세포는 예를 들어 A-베타 단량체보다 A-베타 올리고머에 선택적으로 결합하고, 선형 화합물에 비하여 환형 화합물에 존재하는 에피토프 서열에 선택적으로 결합하거나 또는 플라크 결합이 없거나 무시할 만한 정도를 갖는 것을 포함하여, 본 명세서에 기재된 에피토프 또는 에피토프 서열에 대해 특이적인 및/또는 선택적인 항체를 생산한다.
추가의 양태는 본 명세서에 기재된 CDR 세트를 포함하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주이다.
III . 조성물
추가의 양태는 본 명세서에 기재된 핵산, 벡터 또는 항체를 포함하는 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 희석제를 포함한다.
핵산에 대해 적합한 희석제는 비제한적으로 물, 염수 용액 및 에탄올을 포함한다.
항체 또는 이의 단편을 포함한 폴리펩타이드 및/또는 세포에 대해 적합한 희석제는 비제한적으로 염수 용액, pH 완충용액 및 글리세롤 용액 또는 폴리펩타이드 및/또는 세포를 동결하기에 적합한 다른 용액을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 항체, 핵산 또는 벡터를 포함하고, 그리고 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에 기재된 조성물은 유효량의 활성 물질이 약제학적으로 허용가능한 비히클과 함께 혼합물에서 조합되는, 임의로 백신으로서, 대상체에 투여될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 조성물의 제조를 위한 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은, 비제한적으로, 동결건조된 분말 또는 수성 또는 비-수성의 멸균된 주사가능 용액 또는 현탁액을 포함하고, 추가로 산화방지제, 완충액, 정균제 및 조성물이 의도된 수령체의 조직 또는 혈액과 실질적으로 양립가능하게 하는 용질을 함유할 수 있다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 다른 성분은, 예를 들어 물, 계면활성제 (예컨대 Tween), 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균된 분말, 과립, 정제 또는 농축된 용액 또는 현탁액으로부터 제조될 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 환자에게 투여하기 전에 멸균수 또는 염수로 재구성되는 동결 건조된 분말로서 공급될 수 있다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 약제학적 조성물의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 본질적으로 화학적으로 불활성이고 무독성인 조성물을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는, 비제한적으로, 물, 염수 용액, 글리세롤 용액, 에탄올, N-(1(2,3-디올레일옥시)프로필)N,N,N-트리메틸암모늄염화물 (DOTMA), 디올레실포스포티딜-에탄올아민 (DOPE), 및 리포좀을 포함한다. 이러한 조성물은 환자에게 직접 투여하기 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 치료적으로 유효량의 화합물을 함유해야 한다.
본 조성물은, 비제한적으로, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제이철수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올로부터 유래된 것과 같은 유리 카복실기로 형성된 것을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 및 희석제를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 멸균된 조성물이다.
추가의 양태는 본 명세서에 기재된 항체 및 A-베타, 임의로 A-베타 올리고머를 포함하는 항체 복합체를 포함한다. 상기 복합체는 용액으로 될 수 있거나, 임의로 시험관 내, 조직에 포함될 수 있다.
IV . 키트
추가의 양태는 i) 항체 및/또는 이들의 결합 단편, ii) 상기 항체 또는 이들의 일부의 핵산, iii) 본 명세서에 기재된 항체, 핵산 또는 세포를 포함하는 조성물 또는 iv) 바이알 예컨대 멸균된 바이알 또는 다른 하우징에 포함된 본 명세서에 기재된 재조합 세포 및 임의로 기준 제제 및/또는 그것의 사용 설명서를 포함한 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 수집 바이알, 표준 완충액 및 검출 시약 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 키트는 알츠하이머 병 또는 올리고머성 A베타를 수반하는 병태를 진단 또는 모니터링하기 위한 것이다.
V. 방법
본 명세서에 기재된 항체를 제조하기 위한 방법이 포함된다.
특히, 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 HHQK (서열번호: 7)의 형태적 에피토프에 대해 선택적인 항체인 본 명세서에 기재된 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체, 임의로 비-인간 대상체에, 본 명세서에 기재된 에피토프 서열을 포함하는 환형 화합물을 투여하는 단계, 및 본 명세서에 기재된 CDR들을 포함하는 항체 생산 세포 또는 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 본 명세서에서 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 단클론성 항체를 제조하기 위한 것이다.
또 다른 구현예에서, 키메라성 항체 또는 이들의 결합 단편을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 (중쇄 및/또는 경쇄)의 가변 영역을 인코딩하는 핵산을, 키메라성 항체 벡터를 생산하기 위해 임의로 Fc 부분을 갖거나 갖지 않는, 인간 항체 불변 도메인 (예를 들어 IgG1, 2, 3, 또는 4)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 안으로 서브클로닝하기 위한 재조합 기술을 사용하는 단계; 세포에서 키메라성 항체 벡터를 발현시키는 단계; 및 항체를 단리하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 키메라는 마우스 인간 키메라이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 인간화된 항체를 제조하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 키메라성 중간체를 제조하는 단계를 포함한다. 키메라성 중간체의 가변 영역은 예를 들어 돌연변이되어 CDR 영역 외부에 하나 이상의 아미노산 변화가 도입된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CDR 코딩 서열은 인간 항체 스캐폴드에 삽입된다.
환형 화합물을 사용하여 생산된 항체는 본 명세서 및 실시예에서 기술된 바와 같이 선택된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 선형 펩타이드보다 환형 펩타이드에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하고, 에피토프 서열에 대해 특이적이며, 특이적으로 올리고머에 결합하고 그리고/또는 원위치에서 플라크 및/또는 상응하는 선형 펩티드와의 결합이 없거나 무시할 수 있게 결합하는 항체를, 임의로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 단리하는 것을 포함한다.
추가의 양태는 생물학적 샘플이 A-베타를 포함하는지 여부를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계 및/또는 임의의 항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플이 올리고머성 A-베타를 포함하는지 여부를 검출하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a. 항체: A-베타 올리고머 복합체를 만들어 내기에 허용적인 조건하에서 본 명세서에서의 A-베타 올리고머에 대해 특이적인 그리고/또는 선택적인 본 명세서에 기재된 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및
b. 임의의 복합체의 존재를 검출하는 단계;
여기서 검출가능한 복합체의 존재는 상기 샘플이 A-베타 올리고머를 함유할 수 있다는 것을 나타낸다.
일 구현예에서, 형성된 복합체의 수준은 시험 항체 예컨대 적합한 Ig 대조군 또는 무관한 항체와 비교된다.
일 구현예에서, 검출은 정량화되고 생산된 복합체의 양이 측정된다. 측정은 예를 들어 표준에 대해 상대적일 수 있다.
일 구현예에서, 측정된 양은 대조군과 비교된다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(a) 항체-항원 복합체를 생산하도록 허용된 조건하에서 본 명세서에 기재된 항체와 상기 대상체의 시험 샘플을 접촉시키는 단계;
(b) 시험 샘플 내 항체-항원 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 시험 샘플 내 항체-항원 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;
여기서 대조군과 비교하여 시험 샘플 내에 항체-항원 복합체를 검출하는 것은 샘플이 A-베타를 포함한다는 것을 나타낸다.
대조군은 샘플 대조군 (예를 들어, AD가 없는 대상체, 또는 경도, 중간 또는 진전된 AD의 특정 형태를 갖는 대상체로부터의 것)일 수 있거나, 또는 대상체에서의 A-베타 올리고머 수준의 변화를 모니터링하기 위해 동일한 대상체로부터의 이전의 샘플일 수 있다. 대안적으로, 대조군은 AD를 갖거나 갖지 않는 다수의 환자로부터 유도된 값일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 본 명세서에 기재된 CDR 서열을 갖는 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 키메라성 항체이다.
일 구현예에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다. 일 구현예에서, 상기 샘플은 뇌조직 또는 이들의 추출물 및/또는 CSF를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 샘플은 인간 대상체로부터 수득된다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 AD로 의심되거나, AD 위험에 있거나, 또는 AD를 갖는다.
A-베타: 항체 복합체를 검출하고 그렇게 함으로써, 면역검정 예컨대 유세포측정, 웨스턴 블랏, ELISA, SPR 및 면역침강 이어서 SDS-PAGE 면역세포화학을 포함하는, 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 A-베타 올리고머가 샘플에 존재하는가를 결정하는 수많은 방법이 사용될 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 형태 특이적 결합을 평가할 수 있다. 항체가 표지되거나 복합 항체에 대해 특이적인 검출가능하게 표지된 2차 항체가 사용되는 경우, 상기 표지는 검출될 수 있다. 통상적으로 사용되는 시약은 형광 방출 및 HRP 표지 항체를 포함한다. 정량적 방법에서, 생성된 신호의 양은 표준 또는 대조군과 비교하여 측정될 수 있다. 측정은 또한 상대적일 수 있다.
추가의 양태는 대상체 또는 조직에서 A-베타의 수준을 측정하거나 이미지 형성하는 방법을 포함하고, 임의로 여기서 측정되거나 또는 이미지화되는 A-베타는 올리고머성 A-베타이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 AD가 있거나 또는 있을 위험이 있거나 또는 있을 것으로 의심되는 대상체에게 검출가능한 표지에 접합된 본 명세서에 기재된 항체를 투여하는 단계; 및 상기 표지를 검출하는 단계, 임의로 상기 표지를 정량적으로 검출하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 상기 표지는 예를 들어 PET 이미지 형성에 사용될 수 있는 양전자 방출 방사선핵종이다.
본 방법은 또한 AD 또는 인지 손상에 대한 다른 시험과 조합될 수 있다. 예를 들어, CSF 내 시냅스 단백질 수준, 예컨대 SNAP-25 또는 시냅스 소포 당단백질 2a (SVG2a) (Sci Transl Med . 2016 Jul 20; 8(348): 348ra96. doi: 10.1126/scitranslmed.aaf6667)이 측정될 수 있다. 예를 들어, 플로우로데옥시글루코스 PET (FDG-PET)가 시냅스 대사의 간접적인 척도로서 사용된다.
본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 A-베타 수준을 검출하는 것은 단독으로 또는 치료에 대한 반응을 모니터하는 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 CDR 세트를 포함하는, 사이클로(CGHHQKG)(서열번호: 12)에 대해 발생된 항체는 A-베타 올리고머에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합할 수 있음이 본 명세서에서 실증되었다. 올리고머성 A-베타 종류는 AD에서 독성 증식 종류인 것으로 여겨진다. 또한, 도 1에 도시되고 실시예에 기술된 바와 같이, 이들 항체는 올리고머에 특이적이고, A-베타 응집 및 A-베타 올리고머 증식을 억제했다. 따라서, A-베타 올리고머 증식을 억제하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 A-베타를 발현하는 세포 또는 조직을 유효량의 A-베타 올리고머 특이적 또는 선택적인 본 명세서에 기재된 항체와 접촉시키거나 또는 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하여 A-베타 응집 및/또는 올리고머 증식을 억제하는 것을 포함한다. 시험관 내에서 상기 검정은 실시예에 기재된 바와 같이 모니터링될 수 있다.
본 항체는 또한 AD 및/또는 다른 A-베타 아밀로이드 관련 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 루이 신체 치매와 봉입체 근염 (근육 질환)의 변이체는 AD와 유사한 플라크를 나타내고 A-베타는 또한 뇌 아밀로이드 혈관 병증에 연루된 응집체를 형성할 수 있다. 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 인간화된 항체 서열에 있을 때 뿐만 아니라 CDR 세트를 포함하는 항체는 AD에서 A-베타의 독성 종류로 여겨지는 올리고머성 A-베타에 결합하고 시험관 내에서 독소형성 A-베타 올리고머의 형성을 억제한다.
따라서 추가의 양태는 AD 및/또는 다른 A-베타 아밀로이드 관련된 질환을 치료하는 방법이고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에 본 명세서에 기재된 CDR 세트를 포함하는 본 명세서에 기재된 항체, 임의로 표 4a 또는 4b에 기재된 인간화된 항체 또는 상기 항체를 포함하는 선택적 또는 약제학적 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산이 또한 상기 대상체에게, 임의로 대상체에 핵산을 전달하기에 적합한 벡터를 사용하여, 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 치료될 대상체로부터의 생물학적 샘플은 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 A-베타의 존재 또는 수준에 대해 평가된다. 일 구현예에서, 검출가능한 A-베타 수준 (예를 들어 시험관 내에서 측정되거나 또는 이미지 형성에 의해 측정된 A-베타 항체 복합체)을 갖는 대상체는 상기 항체로 치료된다.
본 항체, 펩타이드 및 핵산은 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 포함될 수 있고, 전달을 개선하기 위해 예를 들어 소포에 제형화될 수 있다.
HHQK (서열번호: 7)를 표적으로 하는 하나 이상의 항체가 조합하여 투여될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 항체는 하나 이상의 다른 치료제 예컨대 베타-세크레타제 억제제 또는 콜린에스테라아제 억제제와 함께 투여될 수 있다.
AD 또는 A-베타 아밀로이드 관련 질환을 치료하기 위한 조성물, 항체, 단리된 펩타이드, 및 핵산의 용도가 또한 제공된다.
본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 단리된 펩타이드 및 핵산, 벡터 등은 예를 들어, 비경구, 정맥내, 피하, 근육내, 두개내, 심실내, 척추강내, 안와내, 안과, 척수내, 낭내, 복강내, 비강내, 에어로졸 또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다.
다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 뇌 또는 CNS의 다른 부분에 직접적으로 투여된다. 예를 들어 그와 같은 방법은 카테터를 통해 사전-결정된 용량을 주입 부위로 배출시키는 역할을 하는 이식가능 카테터 및 펌프의 사용을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 더욱이 상기 카테터가 뇌에서 원하는 투여 또는 주입 부위에 인접하여 카테터가 위치하도록 카테터의 가시화를 허용하는 외과적 수술에 의해 이식될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 기술은 Elsberry 등의 미국 특허 5,814,014의 "뇌 주입에 의한 신경 퇴행성 장애를 치료하는 기술"에 기재되어 있고, 이것은 본 명세서에 참고로 편입된다. 또한, 미국 특허출원 20060129126 (Kaplitt 및 During의 "환자의 뇌 안으로 물질을 주입하는 방법 및 주입 디바이스")에 기재된 바와 같은 그런 방법이 고려된다. 뇌 및 CNS의 다른 부분에 약물을 전달하기 위한 디바이스는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, SynchroMed® EL 주입 시스템; Medtronic, 미네소타주 미니애폴리스 소재).
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 수용체-매개된 이송을 허용하도록 투여되는 화합물을 변형시키는 것과 같은 방법을 사용하여 뇌에 투여된다.
다른 구현예는 본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 단리된 펩타이드 및 핵산을 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이송을 촉진시키는 것으로 공지된 생물학적 활성 분자와 함께 공-투여하는 것을 고려한다.
또한, 특정 구현예에서, 본 명세서에 참고로 편입된, 미국 특허 7012061의 "혈액 뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 방법"에서 기재된 바와 같이 혈액 뇌 장벽의 투과도를 일시적으로 증가시키는 것에 대한 것과 같은, 본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 단리된 펩타이드 및 핵산을 혈액 뇌 장벽을 가로질러 투여하는 방법이 고려된다.
상기 개시내용은 일반적으로 본원을 기술한다. 하기 특정 실시예를 참조하면 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적으로만 기술되었으며 본원의 범위를 한정하려고 의도된 것은 아니다. 상황에 의해 적절한 것으로되거나 제안될 때 형태의 변화 및 동등물의 치환이 고려된다. 비록 본 명세서에서 특정 용어가 사용되었지만, 이러한 용어는 설명적인 의미로 의도된 것이지 제한하려는 목적은 아니다.
하기 비-제한적인 실시예는 본 개시내용의 실례가 된다:
실시예
실시예 1
항체 생성
방법 및 물질
면역원
사이클로(CGHHQKG) (서열번호: 12) 펩타이드를 미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 CPC Scientific에서 생성하고 트리플루오로아세테이트 반대 이온 프로토콜을 사용하여 KLH (면역화용) 및 BSA (선별용)에 접합하였다. 동일한 서열, CGHHQKG (서열번호: 12)의 선형 펩타이드를 또한 제조하였다. 펩타이드는 탈염되고 MS 및 HPLC에 의해 검사되고 95% 순수한 것으로 간주되었다. 환형 펩타이드는 마우스에서 단클론성 항체의 생산에 사용하기 위해 IPA로 이송되었다.
항체
하이브리도마 및 단클론성 항체를 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH)에 연결된 사이클로(CGHHQKG) (서열번호: 12)로 생성시켰다. 50일령의 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories, 퀘벡 소재)를 면역화하였다. 항원은 함유하지만 아쥬반트가 없는 일련의 피하 수성 주사를 19일의 기간에 걸쳐 제공하였다. 멸균된 염수에서 0.5mg/mL 환형 펩타이드-KLH 용액의 주사 당 마우스 당 100μg으로 마우스를 면역화시켰다. 모든 4마리의 마우스를 19일째에 안락사시키고 하이브리도마 세포주 생성을 위해 림프구를 수확했다.
융합 / 하이브리도마 성장
림프구를 단리하고 폴리-에틸렌글리콜 (PEG 1500)의 존재에서 쥣과 SP2/0 골수종 세포와 융합했다. 융합된 세포를 HAT 선별을 사용하여 배양하였다. 이 방법은 반-고체 메틸셀룰로스-기반 HAT 선별 배지를 사용하여 하이브리도마 선택과 클로닝을 하나의 단계로 조합한다. 단일세포-유래된 하이브리도마는 성장하여 반-고체 배지 상에 단클론성 콜로니를 형성한다. 융합 현상 10일 후, 결과적인 하이브리도마 클론을 96-웰 조직 배양 판으로 옮기고 중간-로그 성장에 도달할 때 (5일)까지 HT 함유 배지에서 성장시켰다.
하이브리도마 분석
하이브리도마로부터의 조직 배양 상청액을 선별 항원 (환형 펩타이드-BSA)에 대해 간접적인 ELISA로 시험하고 염소 항-IgG/IgM(H&L)-HRP 2차를 사용하여 IgG 및 IgM 항체 둘 모두를 탐색하고 TMB 기질로 성장시켰다. 이 검정에서 클론 >0.2 OD을 시험의 다음 단계로 취하였다. 양성 배양물을 분비를 확인하기 위한 선별 항원 및 무관한 항원 (Human Transferrin)에서 재시험하여 비-특이적 mAb를 제거하고 거짓 양성을 배제하였다. 선택된 클론은 IgG 또는 IgM 아이소타입인지를 결정하기 위해 항체 트랩핑 ELISA에 의해 아이소타입화되었다. 선택된 클론을 교차-반응성 및 링커 반응성을 평가하기 위해 다른 환형 펩타이드-BSA 콘주게이트뿐만 아니라 선형 펩타이드-BSA 콘주게이트에 대해 간접적인 ELISA로 또한 시험하였다. 항체는 또한 SPR 분석에 의해 선별되었다.
ELISA 항체 선별
ELISA 플레이트를 1) 4C에서 카보네이트 도포 완충액 (pH 9.6) O/N 내에서 100uL/웰로 0.1ug/웰 환형 펩타이드-접합된-BSA; 2) 4C에서 카보네이트 도포 완충액 (pH 9.6) O/N 내에서 100uL/웰로 0.1ug/웰 선형-펩타이드-접합된-BSA; 또는 3) 4C에서 카보네이트 도포 완충액 (pH 9.6) O/N 내에서 100uL/웰로 0.1ug/웰 음성-펩타이드로 도포하였다. 1차 항체: 100 uL/웰로 하이브리도마 상청액을 진탕하면서 37C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-Tween 내에서 100uL/웰로 2차 항체 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM(H+L)-HRP는 진탕하면서 37C에서 1시간 동안. 모든 세정 단계는 PBS-Tween으로 30분 동안 수행하였다. 기질 TMB를 50uL/웰에 첨가하고, 암부에서 성장시키고, 동등 용적의 1M HCl로 중단시켰다.
SPR 결합 검정
환형 펩타이드 , A-베타 단량체 및 올리고머에 결합하는 항체의 SPR 분석
A-베타 단량체 및 올리고머 제조: 재조합 A-베타 40 및 42 펩타이드 (California Peptide, 미국 유타주 솔트 레이크 시티 소재)를 아주 차가운 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP)에 용해시켰다. 상기 HFIP는 밤새 증발에 의해 제거되었고 SpeedVac 원심분리기에서 건조되었다. 단량체를 제조하기 위해, 펩타이드 막은 DMSO에서 5mM로 재구성되었고, dH2O에서 100μM로 추가로 희석되었고 그리고 즉시 사용되었다. 올리고머는 페놀 레드-없는 F12 배지 (Life Technologies Inc., 캐나다 온타리오주 벌링턴 소재)에서 최종 농도 100μM이 되도록 5mM DMSO 펩타이드 용액을 희석함에 의해 제조되고 4℃에서 24시간 내지 7일 동안 인큐베이션하였다.
환형 펩타이드 , A-베타 단량체 및 올리고머 결합의 SPR 분석: 모든 SPR 측정을 실시간으로 결합 상호작용을 모니터하기 위한 고강도 레이저 광 및 고속 광학 스캐닝을 이용하는 분석적 바이오 센서인 분자 친화력 선별 시스템 (MASS-1) (Sierra Sensors GmbH, 독일 함부르크 소재)을 사용하여 수행하였다. 조직 배양 상청액의 일차 선별은 SPR 직접적인 결합 검정을 사용하여 수행하였고, 그것에 의하여 BSA-접합된 펩타이드, A-베타42 단량체 및 A-베타42 올리고머가 높은 아민 수용력 (HAC) 센서칩 (Sierra Sensors GmbH, 독일 함부르크 소재)의 개별 유동 세포 상에 공유적으로 고정되고 항체는 표면 위로 유동하였다. 각각의 샘플을 희석시키고 고정된 펩타이드 및 BSA 기준 표면상에 반복하여 주사한 후 이어서 해리 단계에 대해서만 러닝 버퍼를 주사하였다. 모든 분석적 주기 후에, 센서 칩 표면이 재생성되었다. 센서그램은 BSA 기준 표면과 블랭크 러닝 버퍼 주입으로부터의 결합, 및 해리 단계에서 수집된 반응 보고 시점 결합을 차감함에 의해 이중-참조되었다.
단백질 G 정제된 mAb는 SPR 간접적인 (캡쳐) 결합 검정을 사용하여 2차 선별에서 분석되었고, 그것에 의하여 상기 항체들은 단백질 A-유도된 센서 칩 (XanTecBioanalytics GmbH, 독일 뒤셀도르프 소재) 및 A-베타40 단량체, A-베타42 올리고머, 표면 위로 유동된 풀링된 가용성 뇌 추출물 상에 고정되었다. 상기 항체의 특이성은 HAC 센서 칩의 개별 유동 세포 상에 A-베타42 단량체 및 A-베타42 올리고머를 공유적으로 고정시키고 표면 위로 정제된 mAb를 유동시킴으로써 SPR 직접적인 결합 검정에서 확인되었다.
항체 서열분석
중쇄 및 경쇄의 CDR 및 가변 영역을 서열 분석하였다. 하이브리도마에 의해 발현된 면역글로불린 유전자 전사체를 표준 RT-PCR을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA로부터 증폭시키고 표준 염료-종결자 모세관 서열분석 방법을 사용하여 서열 분석하였다.
인간화된 항체
인간화된 Fab 항체를 제조하고 (Abzena) 그리고 서열 분석하였다.
결과
ELISA 시험은 하이브리도마 클론이 선형 펩타이드보다 우선적으로 환형 펩타이드에 결합했다는 것을 나타냈다. 사이클로(CGHHQKG)에 대해 발생된 클론 301-3, 301-11 및 301-17을 추가 분석을 위해 선택하였다.
아이소타이핑은 301-3, 301-11 및 301-17이 IgG3 하위유형임을 밝혔다.
항체는 상기에 기재된 바와 같이 제조된 환형 펩타이드, 선형 펩타이드, A-베타 1-42 단량체 및 A-베타 1-42 올리고머에 결합하는 그것의 능력에 대한 하나 이상의 검정에서 시험되었다.
ELISA 및 SPR 검정은 상기 클론들이 선형 펩타이드에 비하여 환형 펩타이드에 우선적으로 결합하고 (그리고 관련없는 환형 펩티드와 교차 반응하지 않고) 및/또는 단량체에 비하여 Aβ 올리고머에 우선적으로 결합했다는 것을 확인하였다. 하이브리도마 배양 상청액으로 SPR을 사용한 결합 분석의 결과는 표 1a에 나타나 있다.
하이브리도마 상청액으로부터 정제된 항체가 고정되고 SPR에 의해 A베타 올리고머에 결합하는 그것의 능력에 대해 분석되었다. 결과는 표 1b에 나타나 있다.
[표 1a]
Figure pct00002
[표 1b]
Figure pct00003
항체 서열
클론 301-3, 301-11 및 301-17 항체가 서열 분석되었다. 301-3 및 301-11의 CDR 서열은 표 2에 제공되어 있다. 301-17에 대한 CDR들은 서열번호 74-79에 제공되어 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변성 부분의 공통 DNA 서열 및 폴리펩타이드 서열은 표 3에 제공되어 있다.
표 2에서 나타낸 바와 같이, 301-3 및 301-11에 대한 중쇄 CDR들은 CDR 1 및 2에 대해서는 동일하였고 CDR3은 하나의 위치에서 변하였다.
2개의 경쇄가 서열 분석되었다. 하나의 경쇄는 301-11에 대한 경쇄와 거의 동일하였다.
인간화된 항체는 301-17에 대해 제조되고 서열 분석되었다 (AbzenaCambridge UK). 인간화된 항체 서열은 표 4a (301-11) 및 4b (301-17)에 제공되어 있다. 각각의 항체 서열 중 CDR 서열들은 굵은 글자로 밑줄쳐져 있다.
[표 2]
Figure pct00004
[표 3]
Figure pct00005
[표 4a]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 4b]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 5]
Figure pct00012
실시예 2
면역조직화학
면역조직화학은 고정없이 또는 항원을 회수하지 않고, 냉동된 인간의 뇌 절편에 대해 수행되었다. 가습된 챔버에서, 비-특이적 염색은 1시간 동안 무 혈청 단백질 차단 시약 (Dako Canada Inc., 캐나다, 온타리오주 미시사우가 소재)과 함께 인큐베이션함으로써 차단되었다. 면역 염색을 위해 하기의 1차 항체를 사용하였다: 마우스 단클론성 아이소타입 대조군 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b, 및 항-아밀로이드β 6E10으로, 모두 Biolegend로부터 구매된 것, 및 정제된 항체 301-11 및 301-17. 모든 항체는 1 ㎍/mL에서 사용하였다. 절편을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS-T로 3 x 5분간 세정하였다. 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 항-마우스 IgG (1:1000)를 절편에 적용하고, 45분 동안 인큐베이션하고 그런 다음 TBS-T로 3 x 5분간 세정하였다. DAB 색원체 시약 (Vector Laboratories, 캐나다 온타리오주 벌링턴 소재)을 적용하고 배경 염색에 대한 표적의 원하는 수준이 달성되면 절편을 증류수로 씻어냈다. 절편을 메이어의 하에마톡실린으로 대조염색하고 탈수하고 커버 슬립을 적용하였다. 슬라이드는 광학현미경 (Zeiss Axiovert 200M, Carl Zeiss Canada, 캐나다 온타리오주 토론토 소재) 하에서 검사하고 대표적인 이미지는 Leica DC300 디지털 카메라 및 소프트웨어 (Leica Microsystems Canada Inc., 온타리오주 리치몬드힐 소재)를 사용하여 20 및 40X 배율로 포착하였다. 이미지는 Levels Auto Correction을 사용하여 어도비 포토샵에서 최적화되었다.
뇌 추출물 인간 뇌조직은 UBC 임상연구 윤리 위원회 (C04-0595)로부터의 승인을 얻어 머릴랜드 대학 뇌 및 조직은행으로부터 수득하였다. 거의 확실한 AD의 임상 진단은 NINCDS-ADRDA 기준 [5]에 기반하였다.
균질화: 인간 뇌 조직 샘플을 칭량하고 그리고 후속적으로 뇌 조직의 최종농도가 20% (w/v)가 되도록 Roche Diagnostics (캐나다 퀘벡주 라발 소재)으로부터의 신선한 아주 차가운 TBS 및 EDTA-없는 프로테아제 억제제 칵테일의 용적에 침전시켰다. 조직은 기계적 탐침 균질기를 사용하여 이 완충액에서 균질화시켰다 (3×30초 펄스, 그 사이 30초 정지, 모두 얼음 위에서 수행됨). TBS 균질화된 샘플을 그 다음 초원심분리 (90분 동안 70,000 xg)하였다. 상청액을 수집하고, 분취하고 -80℃에서 저장하였다. TBS 균질물의 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 (Pierce Biotechnology Inc, 미국 일리노이주 록퍼드 소재)을 사용하여 결정하였다.
뇌 추출물에서 양성 결합이 항체 6E10을 사용하여 확인되었다.
SPR 분석: AD 환자로부터의 뇌 추출물 4개 및 연령-매칭된 대조군으로부터의 뇌 추출물 4개를 모아 분석했다. TBS에서 균질화된 뇌 샘플은 전두엽 피질 Brodmann 영역 9를 포함했다. 모든 실험은 실시예 6에서 기재된 바와 같이 실시간으로 결합 상호작용을 모니터하기 위한 고강도 레이저 광 및 고속 광학 스캐닝을 이용하는 분석적 바이오 센서인, 분자 친화력 선별 시스템 (MASS-1) (Sierra Sensors GmbH, 독일 함부르크 소재)을 사용하여 수행하였다. 본 명세서에 기재된 환형 펩타이드에 대해 생성된 정제된 항체를 단백질 A-유도된 센서 칩의 개별 유동 세포 상에서 포착하고, 희석된 샘플을 180초 동안 표면 위로 주입하고, 이어서 완충액에서 120초의 해리 및 표면 재생이 뒤따랐다. 결합 반응은 마우스 대조군 IgG 기준 표면 결합 및 검정 완충액의 차감으로 이중-참조되었고, 상이한 샘플 군이 비교되었다.
결과
뇌 추출물, CSF 및 면역조직화학
항체는 가용성 뇌 추출물, CSF 및 건강한 기증자 대조군 및 AD 뇌의 조직 샘플에서 A-베타에 결합하는 그것의 능력에 대해 시험되었고 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6에서 양성율의 강도는 플러스 기호 개수로 나타나 있다.
항체 301-11 및 301-17 각각은 대조군 환자와 비교하여 AD 환자로부터의 뇌 균질물 및 CSF와 양성 결합을 보였다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 정제된 항체는 가용성 뇌 추출물 및 CSF에서 비-AD에 비하여 AD에 우선적인 결합을 나타내었고, IHC에 의해 플라크 원섬유에 현저하게 결합하지 않았다.
[표 6]
Figure pct00013
실시예 3
A-베타 합성 올리고머에 대한 결합.
A-베타42 올리고머 결합을 추가로 확인하고 검증하기 위해, 정제된 항체를 센서칩에 공유적으로 고정하고, 이어서 상업적으로 제조된 안정한 A-베타42 올리고머 (1 마이크로M) (SynAging SAS, 프랑스 뱅데우브르-레스-낸시 소재)의 표면 위로 주입하였다.
항체 301-3, 301-11 및 307-17은 각각 14.5 (301-3), 19.3 (301-11) 및 30 (301-17)의 평균의 결합 반응 단위 (BRU)로 안정한 A-베타 42 올리고머 (1 마이크로M)에 결합했다. 그에 비해, 음성 대조군 IgG1은 올리고머에 유의미하게 결합하지 않았고 (BRU 2.5의 평균 결합) 반면 범-Aβ 양성 대조군 항체 6E10은 90의 평균 BRU로 결합하였다.
실시예 4
포르말린 고정된 조직에 대한 면역조직화학
인간 AD 뇌 조직 절편을 항체 301-11, 301-17을 사용하여 평가하였다. 환자는 미리 특성규명되었고 다음 3부분으로 이루어진 접근법으로 알츠하이머병이 있는 것으로 진단되었다: (i) 노인성 반점 및 신경섬유 엉킴을 입증하는 빌쇼스키 은 방법, (ii) 아밀로이드를 입증하기 위한 콩고 레드 및 (iii) 엉킴을 입증하고 노인성 반점이 "신경염"인 것을 확인하기 위한 타우 면역조직화학. 이 조직을 사용하여 선택된 단클론성 항체 클론의 플라크 반응성을 시험하였다. 뇌 조직을 며칠 동안 10% 완충된 포르말린에서 고정시키고 사쿠라 VIP 조직 프로세서에서 파라핀 가공하였다. 조직 절편은 마이크로웨이브 항원 회수 (AR)가 있는 및 없는 항체 1㎍/ml로 탐색하였다. 범-아밀로이드 베타 반응성 항체 6E10을 선택된 항체 클론과 함께 양성 대조군으로 포함시켰다. 항체를 항체 희석제 (Ventana)에서 희석하고 OptiView DAB (Ventana)로 색상을 현상했다. 염색은 Ventana Benchmark XT IHC 염색기에서 수행되었다. Olympus BX45 현미경으로 이미지를 수득하였다. 이미지는 신경 병리학에 전문 지식을 가진 전문 병리학자에 의해 블라인드 분석되었다.
하기 표7에서 나타낸 바와 같이, 고정된 조직을 사용하여, 시험된 항체는 노인성 반점 아밀로이드의 특정한 염색에 대해 음성이었다. 양성 대조군으로 사용된, 6E10 항체는 강한 플라크 염색을 나타냈다.
[표 7]
Figure pct00014
실시예 5
재조합 IgG1 및 IgG2a 항체
재조합 IgG1 및 IgG2a 301-17 작제물을 하이브리도마-유래 301-17의 CDR들을 쥣과 IgG1 또는 IgG2a 백본 (WuXi, Biologics) 상에 그라프팅하여 제조하였다. 서열은 표 8에 제공되어 있다.
[표 8]
Figure pct00015
Figure pct00016
아래에 기재된 바와 같은 결합 특징에 대해 301-17 IgG1 및 IgG2a 항체가 시험되고 모 하이브리도마-정제된 IgG3 항체와 비교되었다.
AbO 에 대한 301-17 IgG2a ProteOn 바이오센서 ( BioRad ) 결합: 재조합 301-17 IgG2a 및 하이브리도마-정제된 301-17 IgG3을 Proteon GLM 센서 칩 상에서 항-마우스 IgG 또는 아민 커플링으로 포착하고 AbO 결합 (SynAgingAbO)에 대해 시험하였다. AbO 3배-희석물을 사용하였다: 1 uM, 0.33 uM, 0.11 uM, 37 nM, 12.3 nM. 검정 완충액은 PBS-E + Tween 20 + 2 mg/ml BSA였다.
결과:
근사치인 동력학적 값은 다음과 같다:
하이브리도마: KD = 26.9 nM
IgG2a-301-17 항체: KD = 16.2 - 19.5 nM
대조군 마우스 IgG로는 결합이 검출되지 않았다.
환형 펩타이드 에피토프에 대한 301-17 IgG2a ProteOn 바이오센서 ( BioRad ) 결합: 재조합 301-17 IgG2a는 Proteon GLH 바이오센서 칩에 아민-커플링되고 BSA에 커플링된 서열번호: 2의 환형 펩타이드에 대한 결합에 대해 시험되었다. 사이클로-BSA 3-배 희석물을 9nM 내지 111pM까지 사용하였다. 검정 완충액은 PBS-E + 0.05% Tween + 10 mg/ml BSA였다. 항체 301-17IgG2a는 BSA에 접합된 환형 펩타이드 (서열번호: 12)에 17 pM의 근사치 KD (3회 시험의 평균)로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 시험된 다른 상업적 A베타 항체 (범-A베타 6E10, Biolegend) 및 토끼 항-A베타 항체 (D54D2, Cell Signaling; ab201060, (abcam; NBP1-78007, Novus)에 대해서는 거의 또는 무시할만한 결합이 검출되었다.
AbO 에 대한 301-17 IgG1 MAAS -2 결합: 재조합 301-17 IgG1 및 하이브리도마-정제된 301-17 IgG3이 MAAS-2 센서 칩 상에 고정되었고 1 uM에서 AbO (SynAging)에 대한 결합에 대해 시험되었다. 시험된 조건 하에서, 재조합 IgG1 301-17 항체는 2회의 시험에서 하이브리도마-정제된 항체보다 더 강한 신호를 제공했다 (각각 40-55 BRU 대 15-25 BRU). 대조군 마우스 IgG로는 거의 또는 전혀 결합이 검출되지 않았다.
환형 펩타이드 에피토프에 대한 301-17 IgG1 MAAS -2 결합: 재조합 301-17 IgG1이 MAAS-2 센서 칩 상에 고정되었고 pH 6.5, 7.5 또는 8.0에서 BSA에 커플링된 서열번호: 2의 환형 펩타이드에 대한 결합에 대해 시험되었다. 모든 3가지 pH 조건하에서 301-17 IgG1에 대해 동등하게 높은 수준의 결합이 관측되었다 (~400 BRU). 대조군 마우스 IgG 또는 범-A베타 6E10 항체 (Biolegend)에 대한 임의의 pH 조건하에서 거의 또는 전혀 결합이 검출되지 않았다.
실시예 6
올리고머 증식의 억제
항체의 생물학적 기능성은 시험관 내에서 티오플라빈 T (ThT) 결합 검정을 사용하여 아밀로이드 베타 (Aβ) 응집에 미치는 그것의 영향을 조사하여 시험하였다. Aβ 응집은 사전 형성된 작은 Aβ 올리고머의 핵에 의해 유도되고 이를 통해 증식되며, 단량체성 Aβ에서 가용성 올리고머 내지 불용성 원섬유까지의 완전한 과정은 베타 시트 형성을 동시에 증가시킴으로써 동반된다. 이것은, 베타 시트가 풍부한 구조에 결합하여 증가된 형광을 초래할 때 여기 및 방출 최대치가 각각 385nm에서 450nm 및 445nm에서 482nm로 전이하는, ThT, 벤조티아졸 염에 의해 모니터링될 수 있다. 간단히, Aβ 1-42 (Bachem Americas Inc., 캘리포니아주 토런스 소재)를 트리스-EDTA 완충액 (pH7.4)에 용해시키고, 초음파처리하고, 희석하고 그리고 동등용적의 항체가 발생된 환형 펩타이드 또는 무관한 마우스 IgG 항체 아이소타입 대조군이 첨가된 흑색 96-웰 미세적정 플레이트 (Greiner Bio-One, 노쓰캐롤라이나주 먼로 소재)의 웰들에 첨가하여, Aβ1-42 펩타이드 대 항체의 1:5 몰비를 초래했다. ThT를 첨가하고 플레이트를 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하고, ThT 형광 측정 (440nm에서 여기, 486nm에서 방출)을 Wallac Victor3v 1420 다표지 계수기 (PerkinElmer, 매사추세츠주 월샘 소재)를 사용하여 한 시간마다 기록했다. 배경 완충액으로부터의 형광 판독 값을 모든 웰들로부터 공제하였고, 항체만의 웰들로부터의 판독 값을 상응하는 웰로부터 추가로 공제했다.
ThT 형광에 의해 모니터링된 바와 같이, Aβ42 응집은 최소 형광을 갖는 초기 지연기 상태, 형광의 급속한 증가를 갖는 대수 증식기 상태 및 마지막으로 Aβ 분자 종류들이 평형상태에 있고 그 동안 형광은 증가하지 않는 안정기 상태를 특징으로 하는 에스자형 형상을 실증하였다. 무관한 마우스 항체와 Aβ42의 공동 인큐베이션은 응집 과정에 어떠한 유의미한 영향을 미치지 않았다. 그에 반해서, 시험 항체와 Aβ42의 공동 인큐베이션은 응집 과정의 모든 단계를 완전히 억제했다. 항체 301-11로 얻어진 결과는 도 1에 도시되어 있다.
거의 동일한 결과가 301-17뿐만 아니라 301-3에서도 수득되었다.
ThT 응집 검정은 AD 발병에서 중추적인 단량체, 올리고머, 프로토피브릴 및 원섬유로부터의 Aβ 응집 및 증식의 생체 내 생체물리학적/생화학적 단계를 모방하므로, 상기 항체는 이 과정을 완전히 폐지시킬 가능성을 입증한다. 마우스 IgG 대조군 항체를 사용하여 수행된 아이소타입 대조군은 아무런 억제도 보이지 않았다.
실시예 7
독성 억제 검정
항체에 의한 A-베타42 올리고머의 독성의 억제는 랫트 1차 피질 뉴런 검정에서 시험될 수 있다.
항체 및 대조군 IgG는 각각 2 mg/mL와 같은 농도로 조정된다. A-베타 올리고머와 항체의 다양한 몰 비가 비히클 대조군, A-베타 올리고머 단독 및 신경 보호성 펩타이드 휴마닌 HNG와 같은 양성 대조군과 함께 시험된다.
예시적인 설정이 표 9에 나타나 있다.
실온에서 10분 동안 사전 인큐베이션한 후, 용적을 배양 배지로 840 마이크로리터로 조정한다. 용액을 37C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 상기 용액을 1차 피질 뉴런에 직접적으로 첨가하고 세포를 24시간 동안 인큐베이션한다. 세포 생존력은 MTT 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
[표 9]
Figure pct00017
A-베타 올리고머의 부재에서, 301-17 항체 단독은 신경세포 생존력에 대해 아무런 효과도 없었다. A-베타 올리고머의 존재에서 인큐베이션될 때, 상기 항체는 시험된 모든 몰비에서 A-베타 올리고머-유도된 뉴런의 사망을 억제했다.
실시예 8
생체 내 독성 억제 검정
항체에 의한 A-베타42 올리고머의 독성의 억제가 마우스 행동 검정에서 생체 내 시험될 수 있다.
새로운 객체 인식 ( NOR )
새로운 객체 인식 (NOR) 모델은 알려진 객체보다 상당히 더 긴 시간 동안 새로운 객체를 조사하는 설치류의 정상 거동을 이용한다. 이 시험은 항목에 대한 인식 기억을 평가하고 그것의 인간 등가물은 시각적 쌍별-비교 (VPC)이다. 객체의 인식은 설치류, 영장류 및 인간의 코 근처 피질에 의해 매개된다. AD 병리학은 해마 앞의 코 근처와 내비의 피질에서 일차로 발생한다. VPC 과제는 경도 인지 손상 (MCI)에서 기억력 결핍을 감지하고 MCI에서 AD로의 전환은 이 과제에 의해 예상된다 (16).
결과:
상기 검정은 (SynAgingSAS, 프랑스 뱅데우브르-레스-낸시 소재)에 의해 수행되었다. 그룹 (11-12주령) 당 12마리 C57BL6J 마우스에 0일째에 비히클 (Aβ 올리고머화에 사용된 완충액) 또는 AβO (50 pmole)를 비히클 (PBS) 또는 항체 301-17의 존재하에 ICV-주사하였다. 모든 마우스의 인지 성능은 +7 및 +8일에 수행된 새로운 객체 인식 (NOR) 시험에 의해 결정되었다.
실험자에 대해 블라인드로 수행된, 본 연구는 실험적 그룹 당 12마리 마우스로 4개 실험군으로 분할된 총 48마리의 마우스를 포함하였다. 모든 동물은 5 μL의 총 용적에 항체의 부재 또는 존재하에 비히클 또는 Aβ0의 단일 (및 단독의) ICV 주사를 맞았다. 실험적 그룹은 다음과 같이 정의되었다:
ㆍ A 그룹 (비히클 CTRL): 비히클의 ICV 주사 (n = 12)
ㆍ B 그룹 (AβO CTRL): AβO의 ICV 주사 (n = 12)
ㆍ C 그룹 (항체 CTRL): AβO + 항체의 ICV 주사 (n = 12)
ㆍ D 그룹 (치료): AβO + 항체의 ICV 주사 (n = 12)
ICV 주사 전에, 4 μL의 항체 1 (즉 112 pmole)을 1 μL 비히클 (즉 Aβ 올리고머화용 완충액) 또는 2.24의 항체/AβO 몰비에 상응하는 1 μL AβO (50 pmole)과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
0일째, 마우스는 비히클 또는 항체의 존재에서 비히클 또는 AβO의 단일 5 μL ICV 주사를 맞았다.
NOR 시험은 +7 및 +8일에 모든 48마리의 마우스로 한 시험에서 수행되었다. 인지 시험 1일 전 (즉, +7일째), 마우스를 비어있는 노지에 두는 동안 10분의 시험 기간 동안 익숙하게 했다. 인지 시험의 당일 (즉, +8일째)에, 동물은 동일한 노지에 배치되며 5분간의 시험 (습득 시험)을 위해 두 개의 동일한 객체를 자유롭게 탐색할 수 있게 했다. 그런 다음 동물들은 5분간의 중간-시험 시간 동안 자신의 우리로 되돌아간다. 유지 시험 동안, 동물은 2개의 다른 객체를 탐색하도록 허용된다: 동일한 익숙한 객체 및 하나의 새로운 객체. 이 시간 동안, 처리에 대해 블라인드인, 실험자는 상기 마우스가 각각의 객체를 활동적으로 탐색하고 있는 시간을 기록한다. 모든 시험은 비디오로 기록된다 (Smart v3.0 소프트웨어, Bioseb). 그런 다음 식별력 지수 (DI)가 생성된다: (DI) = (새로운 객체를 탐색하는 시간 - 친숙한 객체를 탐색하는 시간) / 총 탐색 시간. 총 탐색 시간이 ≤ 5초인 경우, 동물은 식별력 지수의 계산 및 통계적인 분석에서 배제된다.
비히클 대조군 그룹 (A 그룹)으로부터의 마우스는 0.443 ± 0.053의 평균 식별력 지수로 정상 거동을 나타냈다. 이들 결과는 SynAging에서 유사한 대조군 그룹의 이전의 관찰과 일치한다. 기대된 대로, AβO의 단일 ICV 주사 (B 그룹)는 비히클 대조군 마우스와 비교할 때; -0.062 ± 0.048의 평균 식별력 지수로 인지 성능의 유의미한 손상 (p <0.0001)을 초래하였다. AβO-주사된 마우스는 새로운 객체와 친숙한 객체 사이를 구별할 수 없었다.
비히클의 존재하에 항체가 투약된 마우스 (C 그룹)는 0.439 ± 0.049의 평균 식별력 지수로 정상 인지 성능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 마우스는 비히클 대조군 마우스와 유의미하게 다르지 않았으며 (p = 0.9163), AβO 주사된 마우스와 유의미하게 달랐다 (p <0.0001).
AβO와 함께 주사된 경우, 상기 항체는 NOR 시험에서 AβO-유도된 인지 결손을 완전히 예방하였다. 사실상, D 그룹으로부터의 마우스는 0.481 ± 0.055의 평균 식별력 지수를 나타내어, 대조 마우스와 다르지 않았으나 (p=0.6126) AβO-주사된 마우스와는 상이하였다 (p=0.0002). 하나로 합쳐서 생각해볼 때, 상기 데이터는 항체 301-17이 AβO-유도된 인지 결손에 대한 보호를 제공하였다는 것을 시사한다.
시냅스 마커
행동 검정에 부가하여, 뇌 조직을 수집하여 시냅스 마커 (PSD95, SNAP25, 스냅토파이신) 및 염증 마커 (IL-1-베타 및 TNF-알파)의 수준에 대해 분석할 수 있다. 올리고머의 ICV 주사 후 ~14일째에 마우스를 희생시키고 염수로 관류시킨다. 해마를 수집하고 분석될 때까지 -80℃에서 스냅을 냉동시켜 저장하였다. 균질화된 샘플의 단백질 농도는 BCA에 의해 결정된다. 시냅스 마커의 농도는 ELISA 키트 (Cloud-Clone Corp, USA)를 사용하여 결정된다. 전형적으로, 시냅스 마커는 A-베타 올리고머가 주사된 마우스에서 25-30% 감소되고 휴마닌 양성 대조군에 의해 90-100%로 회복된다. IL-1-베타 염증성 마커의 농도는 A-베타 올리고머가 주사된 마우스에서 대략 3배 증가하였으며, 이 증가는 휴마닌에 의해 크게 예방된다.
뇌는 행동 검사를 받은 마우스로부터 수집된다.
해마 (기억 형성을 위한 관련된 구조)를 해부하고, 항-프로테아제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충액에서 균질화시킨다. 조직을 액체 질소 및 37℃의 수조에서 수행된 3회 동결 해동 사이클에 의해 용해시킨다. 그리고 원심 분리 후 상청액을 회수한다.
용해물은 TNF-알파의 수준 (염증과 함께 증가) 및 시냅스 마커 PSD-95 및 SNAP-25 (시냅스 손상이 있을 때 내려감)의 수준에 대해 분석될 수 있다.
항체는 행동 검정에서 완전한 보호를 나타내었다. 뇌는 뇌에서의 SNAP25와 PSD-95 수준 양자에서의 향상과 TNF-알파 수준의 감소를 또한 나타낼 것으로 기대된다.
실시예 9
생체 내 증식 억제 검정
A-베타 독성 올리고머 및 관련된 병리학의 생체 내 증식이 알츠하이머병 (AD)의 다양한 설치류 모델에서 연구될 수 있다. 예를 들어, 인간 APP (예를 들어 APP23 마우스) 또는 인간 APP 및 PSEN1 (APPPS1 마우스)에 대해 형질전환된 마우스는 A-베타의 상승된 수준을 발현하며 염증 및 뉴런의 손상을 동반하는 연령에 따른 점진적인 아밀로이드 침착을 나타낸다. 올리고머-함유 뇌 추출물의 뇌내 접종은 이 과정을 상당히 가속화시킬 수 있다 (13,14). 이들 모델은 뇌내로 또는 전신으로 투여된 시험 항체에 의한 A-베타 올리고머 증식의 억제를 연구하는 시스템을 제공한다.
[표 10]
A-베타 서열 및 화합물
1)
HHQK (서열번호: 7)
CGHHQKG, 사이클로(CGHHQKG)(서열번호: 12)
[표 11]
인간 A-베타 1-42
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (서열번호: 73)
본원은 현재 바람직한 실시예로 간주되는 것을 참조하여 기재되었지만, 본원은 개시된 실시예들로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 반대로, 본원은 첨부된 청구항들의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 배열을 포함하도록 의도된다.
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청구항의 범위는 바람직한 구현예 및 실시예에 의해 제한되어서는 안되며, 전체적으로 설명과 일치하는 가장 넓은 해석으로 주어져야 한다.
명세서에서 언급된 참조 인용
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tccactctcc ctgcctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttagaa 120 tggtttcagc agaaaccagg ccagtctcca aggcgcctga tctactgggc atccaaccga 180 ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 240 atcagcagag tggaggctga ggatgttgga gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tacacgtttg gccaagggac caagctggag atcaaa 336 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn 85 90 95 Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Tyr Thr Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 86 <211> 396 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 86 atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aatagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 396 <210> 87 <211> 132 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 87 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 88 <211> 393 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 88 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctttc aaggttcaca tgttcctctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 393 <210> 89 <211> 131 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 89 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys 130 <210> 90 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctggtgaagc ctggagcctc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cctccggcta ctccttcacc agctactgga tcaactgggt gaagcagagg 120 cccggacagg gcctggagtg gattggagac gtgcaccctg gccggggagt gtccacctac 180 aacgccaagt tcaagtccaa ggccaccctg accctggaca cctccagctc caccgcctac 240 atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcag caggtcccac 300 ggcaacacct actggttttt cgacgtgtgg ggcgccggaa ccacagtgac cgtgtcctcc 360 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 420 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 480 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct ggagtctgac 540 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagcc ctcggcccag cgagaccgtc 600 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 660 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 720 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 780 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 840 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 900 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 960 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 1020 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 1080 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1140 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatgaacac gaatggctct 1200 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1260 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1320 tctcctggta aatgatga 1338 <210> 91 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Val His Pro Gly Arg Gly Val Ser Thr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Ser His Gly Asn Thr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 210 215 220 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 290 295 300 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 340 345 350 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 355 360 365 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 405 410 415 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 420 425 430 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 92 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctggtgaagc ctggagcctc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cctccggcta ctccttcacc agctactgga tcaactgggt gaagcagagg 120 cccggacagg gcctggagtg gattggagac gtgcaccctg gccggggagt gtccacctac 180 aacgccaagt tcaagtccaa ggccaccctg accctggaca cctccagctc caccgcctac 240 atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcag caggtcccac 300 ggcaacacct actggttttt cgacgtgtgg ggcgccggaa ccacagtgac cgtgtcctcc 360 gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 420 tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 480 tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 540 ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 600 acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 660 gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 720 ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 780 atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 840 tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 900 agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 960 gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 1020 aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 1080 atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 1140 tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 1200 ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 1260 gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 1320 actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tgatga 1356 <210> 93 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Val His Pro Gly Arg Gly Val Ser Thr Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Ser His Gly Asn Thr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 210 215 220 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 260 265 270 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 355 360 365 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 370 375 380 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 405 410 415 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 94 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 atgaaactgc ccgtgaggct gctggtgctc atgttctgga tccctgcctc cagctccgat 60 gtgctgatga cccagacccc tctgtccctg cctgtgtccc tgggcgatca ggccagcatc 120 tcctgcaggt cctcccagtc catcgtgcac tccaacggca acacctacct ggagtggtac 180 ctgcagaagc ccggccagtc ccccaagctg ctgatctaca aggtgtccaa ccggttctcc 240 ggcgtgcccg ataggttctc cggatccggc tccggcaccg actttaccct gaagatctcc 300 agggtggagg ccgaggacct gggcgtgtac tactgctttc agggctccca cgtgcccttc 360 accttcggct ccggcaccaa gctggagatc aagcgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttgatga 720 720 <210> 95 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (56)

  1. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을, 임의로 융합되어, 포함하는 단리된 항체로서, 상기 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 그리고 상기 CDR들의 아미노산 서열로는 서열번호: 1-6; 또는 서열번호: 1, 2, 80 및 4-6, 또는 서열번호: 1, 2, 80-83 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성되는, 단리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR들의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성되는, 항체:
    CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
    CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
    CDR-H3 ARDYYGSSSYTSGFAY (서열번호: 3)
    CDR-L1 QSLLNSRTRKNY (서열번호: 4)
    CDR-L2 WAS (서열번호: 5)
    CDR-L3 KQSYNLYT (서열번호: 6).
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 9와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 3에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기에서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 3에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, ii) 서열번호: 11과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1-6에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타, 임의로 인간 A-베타 올리고머(human A-beta, optionally human A-beta oligomers)인, 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체인, 항체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR들의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성되는 항체:
    CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
    CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
    CDR-H3 ARDYYGSNSYTSGFAY (서열번호: 80)
    CDR-L1 QSLLNSRTRKNY (서열번호: 4)
    CDR-L2 WAS (서열번호: 5)
    CDR-L3 KQSYNLYT (서열번호: 6).
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 85에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 85와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 87에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, ii) 서열번호: 89와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1, 2, 80, 4-6에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타, 임의로 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체인, 항체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 CDR들의 아미노산 서열이 하기 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성되는 항체:
    CDR-H1 GFTFSDYY (서열번호: 1)
    CDR-H2 ISDGGSYT (서열번호: 2)
    CDR-H3 ARDYYGSNSYTSGFAY (서열번호: 80)
    CDR-L1 QSIVHSNGNTY (서열번호: 81)
    CDR-L2 KVS (서열번호: 82)
    CDR-L3 FQGSHVPLT (서열번호: 83).
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 85에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 85와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 80에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 89에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, ii) 서열번호: 89와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 81, 82 및 83에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 81, 82 및 83에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 본 명세서에서 서열번호: 1, 2, 80-3에 인용된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 항체로, 서열번호: 12의 서열을 갖는 환형 펩타이드, 및/또는 인간 A-베타, 임의로 인간 A-베타 올리고머에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체인, 항체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 상응하는 선형펩타이드보다 HHQK (서열번호: 7)를 포함하는 환형 화합물에 선택적으로 결합하는, 항체.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유에 비해 A-베타 올리고머에 선택적으로 결합하는, 항체.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 원위치에서 A-베타 단량체 및/또는 A-베타 원섬유 플라크에 결합하지 않거나 무시할만한 결합을 갖는, 항체.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인, 항체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 항체.
  19. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인, 항체.
  20. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 나노바디, 미니바디, 디아바디, 및 이들의 다량체로부터 선택된 항체 결합 단편인, 항체.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 아이소타입은 IgG1, IgG2 또는 IgG4인, 항체.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 아이소타입은 IgG2, 임의로 IgG2a인, 항체.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 표 8에 제시된 서열로부터 선택된 서열 또는 이들의 일부를 포함하고 여기서 상기 일부는 적어도 CDR들 1-3, 임의로 중쇄 CDR들 및/또는 경쇄 CDR들을 포함하는, 항체.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 일부는 가변 도메인 핵산 서열인, 항체.
  25. 표 4a 또는 4b에 제시된 바와 같은 서열 또는 그것과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한 인간화된 항체로서, CDR 아미노산 서열은 서열번호: 1-6; 서열번호: 1, 2, 80, 4-6; 서열번호: 1, 2, 80-83 또는 서열번호: 74-79에서 제시된 바와 같은, 인간화된 항체.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 인간화된 항체는 i) 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24 및 26 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 3에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) 보존적으로 치환된 아미노산 서열 i)로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 1, 2 및 3에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  27. 청구항 25 또는 26에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열, ii) 서열번호: 30, 32, 34, 36, 38 및 40 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 서열번호: 4, 5 및 6에서 제시된 바와 같은, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  28. 청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23 및 25 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 29, 31, 33, 35, 37 및 39 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간화된 항체.
  29. 청구항 25에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 16 및 30; 서열번호: 18 및 32; 서열번호: 20 및 34; 서열번호: 22 및 36; 서열번호: 24 및 38; 또는 서열번호: 36 및 40, 또는 이들과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 서열을 포함하고 여기서 CDR들은 표 2에서 나타낸 바와 같이 유지되는, 인간화된 항체.
  30. 청구항 25에 있어서, 상기 인간화된 항체는 i) 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 44, 46, 48, 50, 52 및 54 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 74-76에서) 서열인, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (예를 들어 서열번호: 74-76) 서열인, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  31. 청구항 25 또는 30에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열; ii) 서열번호: 58, 60, 62, 64, 66 및 68 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 77-79에서) 서열인, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열로, 여기서 상기 CDR 서열은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 77-79에서) 서열인, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  32. 청구항 25, 30 또는 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 43, 45, 47, 49, 51 및 53 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩되고; 그리고/또는 상기 항체는 서열번호: 57, 59, 61, 63, 65 및 67 중 어느 하나에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 동의 코돈 또는 최적화된 버전에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간화된 항체.
  33. 청구항 25, 29, 30 또는 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 44 및 58; 서열번호: 46 및 60; 서열번호: 48 및 62; 서열번호: 50 및 64; 서열번호: 52 및 66; 또는 서열번호: 54 및 68, 또는 이들과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 서열들을 포함하고 여기서 상기 CDR들은 그안에 밑줄쳐서 나타낸 (또한 서열번호: 74-79에서) 바와 같이 유지되는, 인간화된 항체.
  34. 청구항 25에 있어서, 상기 인간화된 항체는 표 4a 또는 4b에서 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 갖는, 인간화된 항체.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일 사슬 항체인, 항체.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체 및 검출가능한 표지 또는 세포독성 약물을 포함하는 면역접합체.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 양전자 방출 방사선핵종, 임의로 PET 이미지 형성과 같은 대상체 이미지 형성에 사용하기 위한 것을 포함하는, 면역접합체.
  38. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체, 또는 청구항 36 또는 37의 면역접합체를, 임의로 희석제와 함께, 포함하는 조성물.
  39. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 핵산 분자.
  40. 청구항 39의 핵산을 포함하는 벡터.
  41. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 세포로서, 임의로 상기 세포는 청구항 39의 벡터를 포함하는 하이브리도마인, 세포.
  42. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체, 청구항 39의 핵산 분자, 청구항 40의 벡터 또는 청구항 41의 세포를 포함하는 키트.
  43. 청구항 1의 항체를 제조하는 방법으로서, 서열번호: 12의 A-베타 서열을 갖는 환형 펩타이드 또는 상기 환형 펩타이드를 포함하는 조성물을 대상체 예컨대 비-인간 포유동물에 투여하는 단계, 및 표 2의 서열번호들로부터 선택된 CDR들을 포함하거나 또는 이로 구성된 항체와 경쟁하거나 또는 CDR들을 갖는 항체 및/또는 항체를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 생물학적 샘플이 A-베타를 포함하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 상기 생물학적 샘플을 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체, 또는 청구항 36 또는 37의 면역접합체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 임의의 항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 A-베타 올리고머를 함유하는지 여부를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 항체: A-베타 올리고머 복합체(antibody: A-beta oligomer complex)를 형성하기에 허용적인 조건하에서 A-베타 올리고머에 특이적인 그리고/또는 선택적인 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 항체, 또는 청구항 36 또는 37의 면역접합체와 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    b. 임의의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하고;
    여기서 검출가능한 복합체의 존재는 상기 샘플이 A-베타 올리고머를 함유할 수 있다는 것을 표시하는 것인, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 복합체의 양이 측정되는, 방법.
  47. 청구항 44 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 뇌 조직 또는 이들의 추출물, 전혈, 혈장, 혈청 및/또는 CSF를 포함하는, 방법.
  48. 청구항 44 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 대조군, 임의로 이전의 샘플과 비교되는, 방법.
  49. 대상체에서 A-베타의 수준을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 AD가 있거나 또는 있을 위험이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체에게 청구항 36 또는 37의 항체를 포함하는 면역접합체를 투여하는 단계로, 상기 항체는 검출가능한 표지에 접합된 것인, 단계; 및 상기 표지를 검출하는 단계로, 임의로 상기 표지를 정량적으로 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 표지는 양전자 방출 방사선핵종인, 방법.
  51. A-베타 올리고머 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 A-베타를 발현하는 세포 또는 조직을 A-베타 올리고머에 특이적 또는 선택적인, 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항의, 유효량의 항체 또는 면역접합체와 접촉시키거나 또는 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하여, A-베타 응집 및/또는 올리고머 증식을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
  52. AD 및/또는 다른 A-베타 아밀로이드 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에 i) 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항의 유효량의 항체 또는 면역접합체 또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물; 또는 2) 상기 항체를 인코딩하는 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터를 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 치료되는 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플은 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 A-베타의 존재 또는 수준에 대해 평가되는, 방법.
  54. 청구항 51 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체, 면역접합체, 조성물 또는 핵산 또는 벡터는 뇌 또는 CNS의 다른 부분에 직접적으로 투여되는, 방법.
  55. 청구항 51 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한, 희석제 또는 담체와의 혼합물에 상기 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약제학적 조성물인, 방법.
  56. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체를 발현하거나 또는 표 2에서의 CDR들로부터 선택된 CDR들을 포함하거나 또는 이로 구성된 항체와 경쟁하는 항체를 발현하는 하이브리도마 세포 또는 세포주.
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