KR20210072415A - 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents

항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드는 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합하고, 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리될 수 있다.

Description

항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법{Peptides binding to antibodies and analyzing method using the same}
본 발명은 임뮤노어세이 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.
바이오 기술 분야에서 다양한 면역진단검사 또는 환경모니터링과 같은 바이오 검사를 위하여 임뮤노어세이가 사용되고 있다. 상기 임뮤노어세이는 항원-항체 반응의 특이성을 이용하여 특정 물질의 정량적 분석이 가능하며, 다른 분석방법에 비하여 높은 민감도를 갖는 이점이 있다.
상기 임뮤노어세이는 암 마커, 감염성 질환, 갑상선 기능, 빈혈, 알레르기, 임신, 약물남용 또는 통풍 진단과 같은 다양한 진단에 이용될 수 있다. 상기 임뮤노어세이를 다양한 종류의 항원의 진단 또는 분석에 이용하기 위해서는 상기 항원들 각각에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 항체를 준비해야 한다.
그러나, 이러한 방법은 최근 빠른 속도로 다양화되고 있는 현대화된 질병들 또는 다수의 돌연변이종을 갖는 바이러스들을 감지하는 데에는 한계점이 있다. 특히, 상기 바이러스의 경우, 상기 바이러스와 특이적 결합성을 갖는 항체를 찾는 것이 불가능한 경우도 다수 있다.
또한, 상기 항원-항체 반응을 이용하는 경우, 상기 항체를 표지 물질과 결합시키는 추가적인 단계가 요구될 수 있다. 상기 표지 물질과 상기 항체의 결합성이 떨어지는 경우, 임뮤노어세이 분석 정확도 또는 신뢰도가 저하될 수 있다. 전술한 것과 같이 다양한 항체에 대하여 결합할 수 있는 다양한 종류의 표지 물질을 각각 개발해야 하는 문제도 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 다양한 종류의 질병들 또는 상기 질병들의 원인이 되는 항원을 검출할 수 있어 항원의 종류에 제한되지 않고, 적용 가능성이 향상된 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖고, 분석 대상 항원에 대한 민감도가 향상되어 분석 신뢰도 및 정확도가 향상되고, 분석을 위한 처리 단계들이 간소화되어 신속성 및 사용 용이성이 향상된 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드는 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일 부분에 가역적으로 결합하고, 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 펩티드는 상기 항체의 3차원 구조에 의하여 상기 프레임워크 영역에 결합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 펩티드와 상기 항체가 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 펩티드는 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합에 영향을 끼치지 않을 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 펩티드는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합 가능할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 펩티드는 적어도 하나 이상의 상기 프레임워크 영역에 결합 가능한 FR 결합부 및 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions CDR)에 결합 가능한 CDR 결합부를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 펩티드는 프레임워크 영역의 전체 또는 일 부분에 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 FR1, FR2, FR3, FR4 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 중 쇄의 프레임워크 영역일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 경 쇄의 프레임워크 영역일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 어느 하나에 결합하는 펩티드는 상기 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 다른 하나에 결합하는 펩티드와 결합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 1의 일부, 서열번호 2, 서열번호 2의 일부, 서열번호 3, 서열번호 3의 일부, 서열번호 4, 서열번호 4의 일부 또는 이들의 조합일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 펩티드는 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 나타내는 표지 물질로 표지될 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 펩티드를 이용한 분석 방법은 타겟 항원과 특이적으로 반응하는 항체에 상기 펩티드를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계, 상기 항체에 피분석물을 제공하여 상기 피분석물 내의 상기 타겟 항원을 상기 항체와 결합시켜 상기 펩티드를 상기 프레임워크 영역으로부터 분리시키는 항원 처리 단계 및 상기 항원 처리 단계 이후에 상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 펩티드, 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 펩티드 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 타겟 항원을 분석하는 분석 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항체는 기판, 비드(bead), 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 분석 단계에서, 상기 결합된 잔량의 펩티드 및 상기 분리된 펩티드를 모두 정량할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 분석 단계는 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 전처리 단계에서, 상기 항체에 결합된 펩티드를 정량할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 펩티드는 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 나타내는 표지 물질로 표지되고, 상기 분석 단계에서, 상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어지는 펩티드를 이용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 전처리 단계는, 상기 항체에 상기 펩티드를 제공하여 상기 항체와 상기 펩티드의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 펩티드를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계 및 상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 결합되지 않은 펩티드를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 분석 단계는, 상기 항체로부터 분리된 펩티드와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계 및 상기 분리된 펩티드를 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드는, 여러 종류의 항체에서 동일 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합함으로써, 상기 프레임워크 영역은 상기 여러 종류의 항체에 결합이 가능하여 상기 여러 종류의 항체의 식별 또는 정량과 같은 분석에 이용할 수 있고, 적용 범위가 확장되는 이점이 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 펩티드를 이용한 분석 방법은, 전술한 이점을 갖는 펩티드를 타겟 항원과 특이적으로 반응하는 항체에 결합시키고, 상기 항체에 상기 타겟 항원을 결합시켜 상기 펩티드를 상기 프레임워크 영역으로부터 분리시킴으로써, 분석 대상물을 세척하는 추가적인 단계를 생략하여 신속하게 분석이 가능하고, 사용 용이성이 향상된 임뮤노어세이가 가능할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드의 결합을 나타낸 도면이고, 도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 펩티드의 결합을 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 경 쇄에 결합된 펩티드를 나타낸 도면이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 중 쇄에 결합된 펩티드를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서로 다른 프레임워크 영역에 결합되는 펩티드들의 결합성을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드를 이용한 분석 방법의 순서도를 나타낸 도면이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 타겟 항원의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드를 이용한 분석 방법의 순서도이고, 도 7b는 도 7a의 분석 방법에 따른 분석 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드를 이용한 분석 방법의 순서도이고, 도 8b는 도 8a의 분석 방법에 따른 분석 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
도면에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 단수로 기재되어 있다 하더라도, 문맥상 단수를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이란 용어는 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 명세서에서 기판 또는 다른 층 "상에(on)" 형성된 층에 대한 언급은 상기 기판 또는 다른 층의 바로 위에 형성된 층을 지칭하거나, 상기 기판 또는 다른 층 상에 형성된 중간 층 또는 중간 층들 상에 형성된 층을 지칭할 수도 있다. 또한, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에게 있어서, 다른 형상에 "인접하여(adjacent)" 배치된 구조 또는 형상은 상기 인접하는 형상에 중첩되거나 하부에 배치되는 부분을 가질 수도 있다.
본 명세서에서, "아래로(below)", "위로(above)", "상부의(upper)", "하부의(lower)", "수평의(horizontal)" 또는 "수직의(vertical)"와 같은 상대적 용어들은, 도면들 상에 도시된 바와 같이, 일 구성 부재, 층 또는 영역들이 다른 구성 부재, 층 또는 영역과 갖는 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용어들은 도면들에 표시된 방향뿐만 아니라 소자의 다른 방향들도 포괄하는 것임을 이해하여야 한다.
이하에서, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들(및 중간 구조들)을 개략적으로 도시하는 단면도들을 참조하여 설명될 것이다. 이들 도면들에 있어서, 예를 들면, 부재들의 크기와 형상은 설명의 편의와 명확성을 위하여 과장될 수 있으며, 실제 구현시, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 도면의 부재들의 참조 부호는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부재를 지칭한다.
용어 "항체"에는 항체, 항체 유도체 또는 이의 단편이 포함될 수 있고, 항체에 관한 상세한 설명은 본 발명의 항체 선별 방법에도 적용된다. 항체는 상기 단편들 중 폴리펩타이드와 같은 항체의 등가물 또는 항체 동족체들은 Fc 영역, 면역글로불린 결합 도메인, 결합 도메인을 모방하는 펩타이드, Fc 영역에 상동성인 영역 또는 적어도 이의 일부를 포함한다. 또한, 항체는 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물을 포함할 수 있다. 상기 항체들은 온전한(intact) 면역글로불린 분자일 수 있고, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 F(v) 및 N-글리칸 구조 및 파라토프와 같은 상기 항체의 구성 부분들 및 상기 구성 부분들 중 적어도 일부를 포함할 수도 있다.
상기 항체는 혈청의 기본 구성요소이며, 상기 항체들, 면역글로불린분자들 또는 이의 단편들의 집합체일 수 있고, 항체 또는 면역글로불린의 단일 분자일 수 있다. 상기 항체 분자는 항원 또는 상기 항원의 에피토프와 같은 특이적인 항원 결정기에 결합되거나 상기 항원 결정기와 반응함으로써 면역학적 이펙터 메카니즘을 유도할 수 있다. 상기 항체는 단일특이(monospecific)적일 수 있으며, 상기 항체들의 조성물은 동일한 항체들로 구성되어 모노클로날일 수 있고, 동일한 항원의 다른 에피토프들 또는 다른 항원들의 에피토프들과 반응하는 다른 종류의 항체들을 포함하여 폴리클로날일 수 있다. 각 항체는 상기 항체의 대응하는 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가질 수 모든 천연 항체 분자들은 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄라는 전체적으로 동일한 기본 구조를 가질 수 있다.
상기 항체는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄라는 전체적으로 동일한 기본 구조를 가질 수 있다. 상기 중쇄 또는 경쇄는 각각 가변 영역(variable region) 및 불변 영역(constant region)을 포함할 수 있다. 상기 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)를 형성할 수 있다. 상기 항원 결합 부위는 상기 항체의 Fab(antibody binding fragment)에 포함될 수 있다.
상기 항체는 인간 항체, 비인간 항체 또는 인간화된 비인간 항체일 수 있다. 상기 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 상기 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생성될 수 있다. 상기 비인간 항체는 다양한 종의 공급원, 예를 들면, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 인간을 제외한 포유 동물 또는 조류로부터 획득된 항체일 수 있다. 상기 비인간 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 실시예에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로(이하, 정의됨)부터의 잔기가 목적 특이성, 친화도 및/또는 수용력을 갖는 전술된 비인간 항체(공여자 항체)의 초가변 영역으로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 또한, 상기 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다.
상기 가변 영역은 초가변 영역(hypervariable region; HVR) 즉, 상보성 결정 영역(complementarily determining regions, CDRs) 및 상기 상보성 결정 영역을 구조적으로 지지하는 프레임 워크 영역(framework region)을 포함할 수 있다. 상기 상보성 결정 영역은 항체마다 상이한 아미노산 서열을 가져 각각의 항원과 특이적으로 결합할 수 있다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역(Hypervariable regions; HVR) 잔기 이외의 불변 도메인 잔기를 지칭한다. 불변 도메인의 상기 프레임워크 영역은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 상기 FR 서열은 일반적으로 중 쇄의 가변 영역(VH) 또는 경 쇄의 가변 영역(VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드(100a)의 결합을 나타낸 도면이고, 도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 펩티드(100b)의 결합을 나타낸 도면이다.
도 1a를 참조하면, 일 실시예에서, 펩티드(100a)는 항체(10)의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합할 수 있다. 항체(10)는 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 A(IgA) 또는 면역글로불린 E(IgE)일 수 있다. 프레임워크 영역(FR)은 타겟 항원(20) 및/또는 항체(10)의 종류가 상이하더라도 동일하거나, 상당히 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 프레임워크 영역(FR)은 초가변 영역과 달리, 항체(10)의 종류에 따라 변하지 않는 불변 영역으로서, 여러 종류의 항체에 결합이 가능하여 상기 여러 종류의 항체의 식별 또는 정량과 같은 분석에 이용할 수 있어 분석 가능한 항원의 범위가 확장되는 이점이 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100a~100f)가 결합되는 프레임워크 영역(FR)은 항체(10)의 FR1, FR2, FR3, FR4 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100a)는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4에 결합할 수 있다. 도 1a는 펩티드(100a)가 FR3에 결합된 것을 도시하고 있으나 이에 한정되는 것은 아니다 도 1b 내지 도 2b는 펩티드(100b~100f)가 FR1 또는 FR2에 결합된 것을 도시하고 있다. 또는, 펩티드(100a)는 FR4에 결합될 수도 있다. 다른 실시예에서, 펩티드(100)는 FR1 및 FR2에 동시에 결합할 수도 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100a)는 항체(10)의 3차원 구조에 의하여 프레임워크 영역(FR)에 결합될 수 있다. 펩티드(100a)는 프레임워크 영역(FR)에 적절히 결합될 수 있는 구조를 갖도록 설계될 수 있다. 펩티드(100a)와 프레임워크 영역(FR)은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합에 의하여 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)에 결합된 펩티드(100a)는 항체(10)와 특이적으로 반응하는 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리될 수 있다. 타겟 항원(20)이 항체(10)와 결합되면 타겟 항원(20) 또는 펩티드(100a)와 결합되지 않은 상태의 항체(10)의 농도가 감소할 수 있고, 상기 농도의 감소에 따라 항체(10)와 펩티드(100a)의 결합 반응의 평형을 유지하기 위하여 펩티드(100a)가 결합된 항체(10)의 농도도 감소할 수 있다. 다른 실시예에서, 펩티드(100a)가 프레임워크 영역(FR)에 결합된 항체(10)가 타겟 항원(20)과 결합되는 경우, 타겟 항원(20)의 입체 장애(steric hindrance) 효과에 의하여 펩티드(100a)가 프레임워크 영역(FR)으로부터 떨어져 나갈 수 있다. 이는 비제한적 예시로서, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합하는 경우 다양한 요인에 의하여 펩티드(100a)와 프레임워크 영역(FR)의 결합이 약화되거나 파괴될 수 있으며, 전술한 예시들은 본원 발명을 한정하지 않는다.
일 실시예에서, 펩티드(100a)와 항체(10)가 결합된 상태에서 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합이 가능할 수 있다. 예를 들면, 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)의 적어도 일 부분에 펩티드(100a)가 결합되어 있는 상태에서, 타겟 항원(20)은 항체(10)와 결합할 수 있으며, 펩티드(100a)에 의해 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합이 방해받지 않을 수 있다. 바람직하게는, 항체(10)에 결합된 펩티드(100a)는 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합에 영향을 미치지 않을 수 있다. 일 실시예에서, 타겟 항원(20)은 항체(10)의 초가변 영역에 접촉하여 결합되어 프레임워크 영역(FR)에 결합되는 펩티드(100a)로부터 영향을 받지 않을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 펩티드(100a)는 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합을 저해하지 않아 펩티드(100a)와 타겟 항원(20)의 결합이 가능함으로써, 타겟 항원(20)의 검출 또는 분석이 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100a)는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합 가능할 수 있다. 예를 들면, 동일 또는 유사 아미노산 서열을 갖는 펩티드(100a)는 인간 항체의 프레임워크 영역(FR)에 결합 가능하고, 비인간 항체의 프레임워크 영역(FR)에도 결합 가능할 수 있다. 또는, 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드(100a)는 인간 항체, 비인간 항체 및 인간화된 비인간 항체 모두에 결합 가능할 수 있다. 이는, 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열은 항체의 종류, 즉, 항체의 발현 종이 달라지더라도 상보성 결정 영역에 비하여 변화가 적어 유사하게 유지되기 때문이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 다양한 종으로부터 유래된 항체(10)와 결합이 가능하여 가용 범위가 확장된 펩티드(100a)가 제공될 수 있다.
도 1b를 참조하면, 일 실시예에서, 펩티드(100b)는 프레임워크 영역(FR)의 일 부분에 결합될 수 있다. 도 1a에서는 펩티드(100b)가 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 전체에 결합된 것을 도시하고 있으나, 도 1b와 같이 펩티드(100b)는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 일 부분에 결합될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드(100b)는 FR1 도메인의 30% 내지 70 %에 해당하는 도메인에 결합될 수 있다. 또는, 50% 내지 60%에 해당하는 도메인에 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100b)는 FR1, FR2, FR3, FR4, FR1의 일 부분, FR2의 일 부분, FR3의 일 부분, FR4의 일 부분 또는 이들의 조합에 결합될 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100b)는 FR1의 일 부분 및 FR2의 전체에 동시에 결합하거나, FR1의 일 부분 및 FR2의 일 부분에 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 전체 펩티드(100b) 중 일 부분만이 프레임워크 영역(FR)에 결합될 수 있다. 예를 들어, 펩티드(100b)는 입체 형상을 갖고, 상기 입체 형상의 적어도 하나 이상의 지점에서 펩티드(100b)가 프레임워크 영역(FR)과 결합될 수 있다. 펩티드(100b)는 프레임워크 영역(FR)과 결합되어 항체(10)의 입체 구조의 빈 공간에 삽입되거나, 항체(10)의 외부에 체결되거나, 항체(10)의 상보성 결정 영역 사이에 삽입될 수 있다. 상기 상보성 결정 영역이 고리 형태인 경우, 펩티드(100b)는 적어도 하나 이상의 고리들 사이에 배치될 수 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100b)는 적어도 하나 이상의 프레임워크 영역(FR)에 결합 가능한 FR 결합부 및 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions CDR)에 결합 가능한 CDR 결합부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100b)의 전체 아미노산 서열 중 일부는 프레임워크 영역(FR)에 결합되고, 다른 일부는 상기 상보성 결정 영역에 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 상보성 결정 영역은 펩티드(100a)가 결합되는 프레임워크 영역(FR)으로부터 연장되는 영역일 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100b)의 아미노산 서열 중 일 부분이 FR2와 결합되는 경우, 다른 부분은 CDR1 또는 CDR2와 접촉되어 결합될 수 있다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 경 쇄에 결합된 펩티드(100c)를 나타낸 도면이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 중 쇄에 결합된 펩티드(100d)를 나타낸 도면이다.
도 2a를 참조하면, 일 실시예에서, 펩티드(100c)는 중 쇄의 프레임워크 영역(FR)에 결합될 수 있다. 전술한 것과 같이, 중 쇄의 프레임워크 영역(FR')은 FR1, FR2, FR3, FR4 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100c)는 중 쇄의 FR1 도메인(FR1')에 결합될 수 있다. 또는, 펩티드(100c)는 중 쇄의 FR2 도메인(FR2')에 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 중 쇄의 FR1(FR1')에 결합하는 펩티드(100c)와 중 쇄의 FR2(FR2')에 결합하는 펩티드(100d)의 아미노산 서열은 상이할 수 있다.
도 2b를 참조하면, 일 실시예에서, 펩티드(100d)는 경 쇄의 프레임워크 영역(FR'')에 결합될 수 있다. 전술한 것과 같이, 펩티드(100d)가 결합되는 경 쇄의 프레임워크 영역(FR'')도 중 쇄와 마찬가지로, FR1, FR2, FR3, FR4 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100d)는 경 쇄의 FR1 도메인(FR1'')에 결합될 수 있다. 또는, 펩티드(100d)는 경 쇄의 FR2 도메인(FR2'')에 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 경 쇄의 FR1(FR1'')에 결합하는 펩티드(100d)와 경 쇄의 FR2(FR2'')에 결합하는 펩티드(100d)의 아미노산 서열은 상이할 수 있다.
일 실시예에서, 펩티드(100a~100f)는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열은 인공적으로 합성된 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 유전자 재조합 기법, 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) 또는 액체상 펩타이드 합성법이 사용될 수 있다. 예시적으로, 통상의 펩티드 라이브러리 서비스가 이용될 수도 있다. 전술한 펩티드 합성 방법들은 비제한적 예시이며, 공지된 다양한 종류의 펩티드 합성 방법들이 적용될 수 있다. 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열의 N 터미널에서 C 터미널 방향의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
서열번호 1(peptide1): SYWIHWVKQRPGQGLEWIGE
서열번호 2(peptide2): VYYCAREPTGTGIYFDVWGK
서열번호 3(peptide3): VYYCAREPTGTGIYFDVWGK
서열번호 4(peptide4): VYYCAREPTGTGIYFDVWGK
일 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(100c)는 중 쇄의 FR1 도메인에 결합될 수 있다. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(100d)는 중 쇄의 FR2 도메인에 결합될 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(100e)는 경 쇄의 FR1 도메인에 결합될 수 있다. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(100f)는 경 쇄의 FR2 도메인에 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4는 상기 FR 결합부일 수 있고, 펩티드(100a~100f)는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 N 터미널 및/또는 C 터미널에 결합된 CDR 결합부를 더 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 일 부분이 FR 결합부이고, 다른 일 부분은 CDR 결합부일 수 있다. 예를 들면, 상기 서열번호 1의 가운데 8 개의 아미노산 서열인 KQRPGQGL가 FR 결합부이고, N 터미널의 SYWIHWV 및 C 터미널의 EWIGE는 CDR 결합부일 수 있다. 이는 예시적인 것으로, 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열 및 다양한 종류의 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 상기 FR 결합부 및 CDR 결합부에 관한 상세한 설명은 전술한 것과 같다.
다른 실시예에서, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 1의 일부, 서열번호 2, 서열번호 2의 일부, 서열번호 3, 서열번호 3의 일부, 서열번호 4, 서열번호 4의 일부 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100a~100f)는 서열번호 1의 전체 20개의 아미노산 서열 중 5 개 내지 10 개의 일부 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 일 부분 및 상기 서열번호 1의 일 부분에 연속적으로 결합된 상기 서열번호 2의 일 부분을 포함할 수 있다. 또는, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 일 부분과 상기 서열번호 2의 일 부분이 중간의 소정의 아미노산 서열을 매개로 결합될 수도 있다. 또는, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1 및 상기 서열번호 2를 모두 포함할 수도 있다.
또 다른 실시예에서, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 양 말단에 연장된 아미노산 서열을 더 포함할 수도 있다. 예를 들면, 펩티드(100a~100f)의 아미노산 서열은 서열번호 1의 N 터미널 및/또는 C 터미널에 연장된 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 연장된 아미노산 서열의 개수는 5 개 내지 50 개, 예시적으로는 5 개 내지 15 개일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 프레임워크 영역(FR)의 적어도 일부분에 결합하는 아미노산 서열의 양 말단에 아미노산을 결합시킴으로써, 타겟 항원(도 5의 20)이 제공되어 항체(10)와 결합된 경우, 펩티드(100a~100f)와 프레임워크 영역(FR)과의 결합이 용이하게 해제되어 타겟 항원(20)에 대한 민감도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서로 다른 프레임워크 영역(FR)에 결합되는 펩티드(100)들의 결합성을 측정한 그래프이다.
일 실시예에서, FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 어느 하나에 결합하는 펩티드(100a~100f)는 상기 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 다른 하나에 결합하는 펩티드(100a~100f)와 결합될 수 있다. 예를 들면, 중 쇄의 FR1에 결합하는 펩티드(100)는 중 쇄의 FR2에 결합하는 펩티드(100)와 결합할 수 있다. 또는, 중 쇄의 FR1에 결합하는 펩티드(100c)는 경 쇄의 FR1에 결합하는 펩티드(100e) 또는 경 쇄의 FR2에 결합하는 펩티드(100)와 결합할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 일 실시예에서, 서로 다른 프레임워크 영역(FR)에 결합하는 펩티드(100f) 사이에 결합성을 가짐으로써, 항체(10)의 식별 또는 정량에 이용할 수 있고, 항체(10)와의 결합력이 상이한 펩티드들(100a~100f)을 상호간에 비교하여 정확한 분석 결과를 얻을 수 있는 이점이 있다.
도 3a를 참조하면, 일 실시예에서, 고체 지지체(도 5의 30) 상에 Applied Biosystems 사의 FAMTM으로 형광 표지된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(H2)(이하, 서열번호 2 펩티드라 함)를 공유 결합으로 지지체(30) 상에 고정하고, tetramethylrhodamine-5-maleimide(TAMRA)로 형광 표지된 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(L1)(이하, 서열번호 3 펩티드라 함)를 제공하였다. 이후, 파란색 광을 처리하는 경우, 상기 서열번호 2 펩티드(H2)와 상기 서열번호 3 펩티드(L2)가 결합되지 않는 경우, 상기 FAM이 상기 파란색 광을 흡수하여 녹색 광을 발생시킨다. 상기 서열번호 2 펩티드(H2)와 상기 서열번호 3 펩티드(L1)가 결합하는 경우, 상기 TAMRA가 상기 녹색 광을 흡수하여 주황색 광을 발생시킨다. 이에 따라, 상기 주황색 광을 FRET으로 측정하여 서열번호 2 펩티드(H2)와 서열번호 3 펩티드(L1)의 결합여부를 확인할 수 있다.
도 3b를 참조하면, FAM으로 형광 표지된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(H1)(이하, 서열번호 1 펩티드라 함)를 공유 결합으로 지지체(30) 상에 고정하고, TAMRA로 형광 표지된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(L2) (이하, 서열번호 4 펩티드라 함)를 제공하였다. 상기 서열번호 1 펩티드(H1)와 상기 서열번호 4 펩티드(L2)의 결합 여부를 측정하는 방법은 도 3a에 관한 개시 사항들을 참조할 수 있다. 도 3a 및 도 3b의 측정 방법은 예시적인 것으로, 본원 발명을 한정하지 않는다.
도 3a 및 도 3b를 참조하면, 상기 서열번호 3 펩티드(L1)의 농도가 높아질수록 상기 주황색 광의 세기가 증가하는 것을 알 수 있다. 도 3b를 참조하면, 상기 서열번호 1 펩티드(H1)의 농도가 증가할수록 상기 주황색 광의 세기가 증가하는 것을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 서열번호 3 펩티드(L1)는 상기 서열번호 2 펩티드(H2)와 결합하고, 상기 서열번호 1 펩티드(H1)는 상기 서열번호 4 펩티드(L2)와 결합하는 것을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드(100g)를 나타낸 도면이다.
도 4를 참조하면, 일 실시예에서, 펩티드(100g)는 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 나타내는 표지 물질(200)로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 표지 물질(200)은 펩티드(100g)의 적어도 어느 일부에 결합될 수 있다. 표지 물질(200)은 발색 물질, 발광 물질, 형광 물질 또는 이들의 조합할 수 있다. 상기 형광 물질은 Applied Biosystems 사의 HEXTM, TAMRA, lumiprobe 사의 Cy5 또는 술포로다민 101 산 클로라이드(술포로다민 101 산 클로라이드; Texas Red)일 수 있으며, 바람직하게는 FAM 형광 또는 TAMRA 형광일 수 있다. 다른 실시예에서, 표지 물질(200)은 기질을 분해하여 광학 반응, 화학 반응 또는 전기 반응을 나타내는 효소일 수 있다. 예를 들면, 표지 물질(200)은 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase; HRP)이고, 상기 기질은 과산화수소와 같은 과산화물 및/또는 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (Tetramethylbenzidine; TMB)일 수 있다. 또는, 표지 물질(20)은 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase; AP)일 수 있고, 상기 기질은 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색 물질이 이용될 수 있다. 이는, 비제한적인 예시이며, 펩티드(100)를 분석하기 위한 다양한 종류의 공지 기술들이 참조될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드(100)를 이용한 분석 방법의 순서도를 나타낸 도면이다.
도 5를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 타겟 항원(20)과 특이적으로 반응하는 항체(10)에 펩티드(100)를 제공하여 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계(S100)를 포함할 수 있다. 펩티드(100)에 관한 상세한 설명은 모순되지 않는 범위 내에서 도 1a 내지 도 4의 개시 사항을 참조할 수 있다. 일 실시예에서, 항체(10)는 지지체(30)에 고정되어 준비될 수 있다. 예를 들면, 지지체(30)는 기판, 비드(bead) 또는 고분자 구조체일 수 있다. 도 5는 항체(10)가 고체 지지체(30)를 이용하여 기판 상에 고정된 것을 도시하고 있으나, 이에 제한되지 않고, 항체(10)는 비드에 고정되어 용액 내에 배치되거나(도 7a 참조), 항체는 고정되지 않고, 용액 내에 혼합 상태로 제공될 수도 있다(도 8a 참조). 본 명세서에서, 펩티드(100)의 '양'은 펩티드(100)의 '농도'와 상호 호환되어 사용될 수 있고, 펩티드(100)의 양이 '많다' 또는 '적다'는 기재는 펩티드(100)의 농도가 '높다' 또는 '낮다'는 것으로 이해될 수 있다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 펩티드(110)를 정량할 수 있다. 예를 들면, 펩티드(100)에 표지 물질(200)이 결합되어 표지 반응을 나타내고, 항체(10)는 기판에 고정된 경우, 상기 기판 하면에서 상기 표지 반응의 강도를 측정할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합되기 전, 항체(10)에 결합된 펩티드(110)를 정량함으로써, 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양을 초깃값으로 이용하여, 정확도 높은 타겟 항원(20)의 식별 또는 정량이 가능한 이점이 있다. 표지 물질(200) 및 표지 반응에 관한 상세한 설명은 도 4의 개시 사항을 참조할 수 있다.
이후, 항체(10)에 타겟 항원(20)을 결합시켜 펩티드(100)를 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리시키는 항원 처리 단계(S200)가 수행될 수 있다. 피분석물 내에는 타겟 항원(20)이 포함되거나, 포함되지 않을 수 있다. 상기 피분석물 내에 타겟 항원(20)이 포함되어 항체(10)에 타겟 항원(20)이 제공되는 경우, 타겟 항원(20)의 항체(10)와의 특이적 반응성에 의하여, 항체(10)와 결합된 펩티드(110) 중 적어도 어느 일부의 펩티드(100)는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리되어 항체(10)가 포함된 용액 상으로 유리될 수 있다. 일 실시예에서, 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록, 항체(10)에 결합된 펩티드(110) 중 항체(10)로부터 분리되는 펩티드(100)의 비율이 증가할 수 있다.
다음으로, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120), 또는 프레임워크로부터 분리된 펩티드(130) 중 적어도 어느 하나를 정량하여 타겟 항원(20)을 분석하는 분석 단계(S300)가 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 피분석물을 제공한 후 세척 단계를 수행하지 않고 피분석물 내의 타겟 항원(20)을 분석함으로써, 신속한 분석이 가능하며, 세척을 위한 부가적인 장비가 요구되지 않아 간소화 및 소형화가 가능하며, 사용 용이성이 향상된 임뮤노어세이를 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)를 정량할 수 있다. 이 경우, 전처리 단계의 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양보다 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양이 감소된 경우, 상기 피분석물 내에 타겟 항원(20)이 포함되었다는 정보를 획득 수 있다. 또한, 전처리 단계의 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양에 대한 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양의 차이 클수록 타겟 항원(20)의 양이 많다는 정보 또는 타겟 항원(20)의 농도가 높다는 정보를 획득할 수 있다. 이에 따라, 본원 발명은 피분석물에 포함된 타겟 항원(20)을 식별 또는 정량할 수 있다.
다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)를 정량할 수 있다. 이 경우, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)의 양이 임계 값 이상인 경우, 상기 피분석물에 타겟 항원(20)이 포함된 것일 수 있다. 또는, 프레임워크로부터 분리된 펩티드(130)의 양이 증가할수록 상기 피분석물 내에 많은 양의 타겟 항원(20)이 포함된 것일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120) 및 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)를 모두 정량할 수 있다. 정량된 결과 분석에 관한 상세한 설명은 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있다. 이에 따라, 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양의 차이값 및 프레임워크로부터 분리된 펩티드(130)의 양의 2 가지 정량값을 이용하여 타겟 항원(20)을 정량할 수 있으므로, 타겟 항원(20) 분석의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 정량은 잔량의 펩티드(120) 및/또는 분리된 펩티드(130)에 결합된 표지 물질(200)에 의한 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 측정하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 표지 반응은 형광 반응일 수 있으며, 상기 형광의 양을 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 표지 반응 또는 표지 물질(200)에 관한 상세한 설명은 도 4의 개시 사항들을 참조할 수 있다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a에서, 항체(10)는 항-hCG 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 hCG일 수 있다. 도 6b에서, 항체(10)는 항-CRP 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 CRP일 수 있다. 도 6c에서, 항체(10)는 항-인플루엔자B 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 인플루엔자 B일 수 있다. 도 6a 내지 도 6c를 참조하면, 펩티드(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 이용하였다. 도 6a 내지 도 6c에서 그래프 A는 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 측정값, 그래프 B는 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 측정값, 그래프 C는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)의 측정값일 수 있으며, 예시적으로, 펩티드(100)에 결합된 표지 물질(200)이 나타내는 표지 반응의 세기를 측정하여 정량하였다. 상기 표지 반응은 형광 반응일 수 있다. 전술한 물질들은 비제한적인 예시이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
도 6a 내지 도 6c를 참조하면, 서열번호 1의 펩티드(H1), 서열번호 2의 펩티드(H2), 서열번호 3의 펩티드(L1) 및 서열번호 4의 펩티드(L2)에서 모두 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양(A)보다 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양(B)이 감소하였음을 알 수 있다. 또한, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)의 양(C)이 측정됨을 알 수 있다.
또한, 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양(A)에 대한 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양(B)의 감소량이 분리된 프레임워크 영역(FR)으로부터 펩티드(100)의 양(C)보다 큰 것을 알 수 있다. 이는, 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양(A)은 지지체(30)의 면 상에서 관찰된 형광의 세기이나, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)의 양(C)은 용액 상에서 관찰된 형광의 세기이기 때문이다. 이에 따라, 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 항체(10)에 결합된 펩티드(110)는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리되어 용액 상으로 유리됨을 알 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 펩티드(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 양의 차이값에 의한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하고, 동시에, 프레임워크로부터 분리된 펩티드(130)의 양을 이용한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하여, 타겟 항원(20)의 분석을 2 트랙(2 track)으로 수행할 수 있어, 분석의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드(100)를 이용한 분석 방법의 순서도이고, 도 7b는 도 7a의 분석 방법에 따른 분석 그래프이다.
도 7a를 참조하면, 일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항체(10)는 비드에 고정될 수 있다. 상기 비드는 비제한적인 예시로서, 글래스(glass) 비드, 마그네틱 비드 또는 고분자 비드일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)를 고정하기 위한 지지체(30)로 기판이 아닌 용액 중에 배치되거나 분산될 수 있는 비드를 사용함으로써, 상기 비드에 항체(10)를 균일하게 고정시키기 용이하고, 항원 처리 단계(S200')에서 항체(10)와 타겟 항원(20)이 혼합되어 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합도가 상승하는 이점이 있다. 또한, 상기 비드는 기판과 같은 고정된 지지체와 달리 용액 상에 분산 또는 배치될 수 있어, 타겟 항원(20) 분석을 위한 용액 상의 공정이 가능한 이점이 있어 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있고, 타겟 항원(20)과 항체(10)가 높은 확률로 결합하여 분석의 정확도가 향상되는 이점이 있다.
이후, 분석 단계(S300')에서, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)와 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)를 분리할 수 있다. 예를 들면, 비드, 비드에 고정된 항체(10) 및 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)의 결합체와 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)를 분리할 수 있다. 상기 결합체의 밀도는 분리된 펩티드(130)의 밀도보다 클 수 있다. 이에 따라, 상기 결합체와 분리된 펩티드(130)의 밀도 차이를 이용하여 상기 결합체를 분리할 수 있다. 예를 들면, 원심 분리기를 이용하거나, 상기 결합체를 침전시킬 수 있다.
도 7b를 참조하면, 일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항-인플루엔자 B 항체(10)를 비드에 고정시키고, 항원 처리 단계(S200')에서 피분석물은 10 ng/mL 농도의 CRP를 포함하거나, 10 ng/mL 농도의 인플루엔자 B를 포함하거나, 100 ng/mL 농도의 인플루엔자 B를 포함할 수 있다. 좌측 그래프(A)는 서로 다른 타겟 항원(20)들을 포함하는 피분석물들의 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 펩티드(130)를 정량한 그래프이고, 우측 그래프(B)는 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 펩티드(120)를 정량한 그래프이다. 전술한 물질들은 비제한적 예시로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물이 인플루엔자 B를 포함하는 경우에 비하여 피분석물이 CRP를 포함하는 경우, 분리된 펩티드(130)의 양이 작고, 잔량의 펩티드(120)의 양이 많은 것을 알 수 있다. 이는, 피분석물이 인플루엔자 B인 경우, 상기 인플루엔자 B가 항-인플루엔자 B 항체(10)와 반응하여 펩티드(100)가 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 해리되기 때문이다. 반면에, 피분석물이 CRP를 포함하는 경우에는 상기 CRP가 항-인플루엔자 B와 특이적으로 결합하지 않아 펩티드(100)가 프레임워크 영역(FR)으로부터 해리되지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 분리된 펩티드(130)의 양이 많을 수 있다. 또한, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 잔량의 펩티드(120)의 양은 적을 수 있다. 도 7b를 참조하면, 피분석물들이 동일하게 타겟 항원(20)으로 인플루엔자 B를 포함하는 경우에, 상기 인플루엔자 B의 농도가 높을수록 분리된 펩티드(130)의 양이 많은 것을 볼 수 있다. 예를 들면, 상기 피분석물에 포함된 상기 인플루엔자 B의 농도가 100 ng/mL인 경우에, 농도가 10 ng/mL인 경우에 비하여 분리된 펩티드(130)의 양이 많을 수 있다. 이는 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 많은 양의 타겟 항원(20)들이 항체(10)와 특이적으로 반응하여, 더 많은 양의 펩티드(100)가 프레임워크 영역(FR)으로부터 해리되기 때문이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 분리된 펩티드(130)의 양 및/또는 잔량의 펩티드(120)의 양을 측정함으로써, 피분석물 내에 포함된 타겟 항원(20)을 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 정량 또는 농도 측정까지 가능한 분석 방법이 제공될 수 있다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩티드(100)를 이용한 분석 방법의 순서도이고, 도 8b는 도 8a의 분석 방법에 따른 분석 그래프이다.
도 8a를 참조하면, 전처리 단계(S100'')는 항체(10)에 펩티드(100)를 제공하여 항체(10)와 펩티드(100)의 제 1 결합체(b1) 및 항체(10)와 결합되지 않은 펩티드(100)를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계(S110) 및 상기 혼합 용액으로부터 항체(10)와 결합되지 않은 펩티드(100)를 제거하는 단계(S120)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 혼합 용액을 탈염 컬럼(desalting column)에 통과시켜 상기 탈염 컬럼을 먼저 통과하는 결합되지 않은 펩티드를 제거하고, 상기 탈염 컬럼을 나중에 통과하는 제 1 결합체(b1)만을 획득할 수 있다. 전술한 방법은 예시적인 것으로, 상기 결합체와 펩티드(100)를 분리하기 위한 다양한 공지 기술들이 참조될 수 있다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는, 항체(10)로부터 분리된 펩티드(130)와 항체(10)와 타겟 항원(20)의 제 2 결합체(b2)를 분리하는 단계(S310) 및 분리된 펩티드(130)를 정량하는 단계(S320)를 더 포함할 수 있다. 제 2 결합체(b2)와 분리된 펩티드(130)는 예시적으로, 단백질-A 컬럼을 이용하여 분리될 수 있다. 이후, 분리된 펩티드(130)만을 선택적으로 획득하여 표지 반응을 통해 정량할 수 있다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는 타겟 항원(20)의 농도의 증가에 따른 분리된 펩티드(130)의 양을 측정하여 항체(10)의 항원결합계수(Kd)를 측정할 수 있다. 상기 항원결합계수는 항원과 항체의 결합 상호 작용의 세기를 나타내는 평형 해리 상수일 수 있다. 상기 항원결합계수가 클수록 항원과 항체(10)의 결합 친화도가 높을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 고체 지지체(30)에 항체(10)를 고정시키지 않고 용액 내에 포함된 항체(10)를 측정할 수 있어 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있고, 측정의 신뢰도 및 정확도가 향상되는 이점이 있다.
도 8b를 참조하면, 일 실시예에서, 타겟 항원(20)은 HRP일 수 있고, 항체(10)는 항-HRP 항체(10)일 수 있다. 전술한 물질은 예시적인 것으로 본 발명을 한정하지 않는다. 일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도를 증가시키면서 분리된 펩티드(130)의 양을 측정하고, 분리된 펩티드(130)의 양을 이용하여 항체(10)의 항원결합계수를 계산하였다. 본 발명의 실시예에서, 계산된 항원결합계수는 8.9ⅹ10-7 M으로 계산되었다.
일 실시예에서, 펩티드를 이용한 분석 방법은 면역분석(immunoassay) 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 면역분석 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 엘리사(ELISA) 키트일 수 있다. 다양한 실시예에서는, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석용 키트들에 관하여 상용화된 분석 방법에 관한 설명이 적용될 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
10: 항체
20: 타겟 항원
30: 지지체
100: 펩티드
110: 결합된 펩티드
120: 잔량의 펩티드
130: 분리된 펩티드
200: 표지 물질
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION YONSEI UNIV <120> Peptides binding to antibodies and analyzing method using the same <130> PN01317 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide1 <400> 1 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Thr Gly Thr Gly Ile Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val Trp Gly Lys 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide2 <400> 2 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Thr Gly Thr Gly Ile Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val Trp Gly Lys 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide3 <400> 3 Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Pro Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 1 5 10 15 Leu Ile Tyr Lys 20 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide4 <400> 4 Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Lys 1 5 10

Claims (22)

  1. 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일 부분에 가역적으로 결합하고,
    상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되는 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 상기 항체의 3차원 구조에 의하여 상기 프레임워크 영역에 결합되는 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드와 상기 항체가 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능한 펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합에 영향을 끼치지 않는 펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합 가능한 펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 적어도 하나 이상의 상기 프레임워크 영역에 결합 가능한 FR 결합부 및 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions CDR)에 결합 가능한 CDR 결합부를 포함하는 펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 프레임워크 영역의 전체 또는 일 부분에 결합되는 펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 FR1, FR2, FR3, FR4 또는 이들의 조합을 포함하는 펩티드.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 중 쇄의 프레임워크 영역인 펩티드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 프레임워크 영역은 상기 항체의 경 쇄의 프레임워크 영역인 펩티드.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 어느 하나에 결합하는 펩티드는 상기 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 다른 하나에 결합하는 펩티드와 결합되는 펩티드.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나를 포함하는 펩티드.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 1의 일부, 서열번호 2, 서열번호 2의 일부, 서열번호 3, 서열번호 3의 일부, 서열번호 4, 서열번호 4의 일부 또는 이들의 조합인 펩티드.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 나타내는 표지 물질로 표지된 펩티드.
  15. 펩티드를 이용한 분석 방법으로서,
    타겟 항원과 특이적으로 반응하는 항체에 상기 펩티드를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계;
    상기 항체에 피분석물을 제공하여 상기 피분석물 내의 상기 타겟 항원을 상기 항체와 결합시켜 상기 펩티드를 상기 프레임워크 영역으로부터 분리시키는 항원 처리 단계; 및
    상기 항원 처리 단계 이후에 상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 펩티드, 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 펩티드 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 타겟 항원을 분석하는 분석 단계를 포함하는 분석 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 항체는 기판, 비드(bead), 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정된 분석 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 분석 단계에서,
    상기 결합된 잔량의 펩티드 및 상기 분리된 펩티드를 모두 정량하는 분석 방법.
  18. 제 15 항에 있어서,
    상기 분석 단계는 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량하는 분석 방법.
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 전처리 단계에서,
    상기 항체에 결합된 펩티드를 정량하는 분석 방법.
  20. 제 15 항에 있어서,
    상기 펩티드는 광학적, 화학적 또는 전기적 표지 반응을 나타내는 표지 물질로 표지되고,
    상기 분석 단계에서,
    상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어지는 펩티드를 이용한 분석 방법.
  21. 제 15 항에 있어서,
    상기 전처리 단계는,
    상기 항체에 상기 펩티드를 제공하여 상기 항체와 상기 펩티드의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 펩티드를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계; 및
    상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 결합되지 않은 펩티드를 제거하는 단계를 포함하는 펩티드를 이용한 분석 방법.
  22. 제 15 항에 있어서,
    상기 분석 단계는,
    상기 항체로부터 분리된 펩티드와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 펩티드를 정량하는 단계를 더 포함하는 펩티드를 이용한 분석 방법.
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