CN117412992A - 靶向cd47和pd-l1的双特异性抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了特异性结合CD47和程序性死亡配体1(PD‑L1)的新型双特异性抗体。本公开还涉及制备双特异性抗体和编码该抗体的核酸的方法。本公开还涉及使用双特异性抗体治疗与表达CD47和/或PD‑L1的恶性细胞(例如癌症)相关的病况的治疗方法。

Description

靶向CD47和PD-L1的双特异性抗体及其使用方法

相关申请

本申请要求2022年3月8日提交的美国临时申请号63/317,892和2021年3月22日提交的美国临时申请号63/164,237的权益和优先权，每一申请均以其整体通过引用并入本文。

领域

本公开涉及结合PD-L1的抗体和编码该抗体的核酸。本公开还涉及特异性结合CD47和程序性死亡配体1(PD-L1)的双特异性抗体。本公开还涉及产生抗体的方法和在治疗与表达CD47和/或PD-L1的恶性细胞相关的病况(例如癌症)中使用该抗体的治疗方法。

参考序列表

该申请通过EFS-Web以电子方式提交并包括以.txt格式的电子提交序列表。所述.txt文件含有名为“NOVI-047_001WO_SeqList_ST25.txt”的序列表，其创建于2022年3月21日，并且大小为～32千字节。该.txt文件中含有的序列表是说明书的一部分，且以其整体通过引用并入本文。

发明背景

CD47或整联蛋白相关蛋白(IAP)是普遍存在的50kDa跨膜糖蛋白，在细胞间通讯中具有多种功能。它与多种配体，例如整联蛋白、SIRPα(信号调节蛋白α)、SIRPγ和血小板反应蛋白相互作用。

CD47在健康组织中的广泛表达带来了治疗安全性和功效的问题：首先，用中和单克隆抗体(Mab)靶向CD47可能会影响健康细胞，导致严重的毒性，如针对小鼠和食蟹猴的临床前研究所示。其次，即使通过使用备选形式可以避免或减轻严重毒性，但CD47的广泛表达仍然可能通过靶标介导的药物处置引起CD47结合分子快速消除，从而导致药代动力学不良和功效降低。

程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)，也称为B7-H1和CD274，是在造血细胞(特别是骨髓细胞)和非造血健康组织上组成型表达的跨膜蛋白。它还可以在肿瘤细胞和肿瘤基质上表达。在癌症中，抑制性受体PD-1的表达被认为是T细胞耗尽的标志，由于持续的抗原和炎症刺激，其表现出功能失调的表型。此外，已显示肿瘤微环境中PD-L1的上调允许肿瘤通过与T细胞上的PD-1相互作用来逃避宿主免疫系统。多项研究已报道，PD-L1在多种肿瘤组织中表达，无论是在肿瘤细胞上，还是在免疫浸润细胞上，或在两者上都表达。在患者中，使用单克隆抗体阻断PD-1与PD-L1的相互作用已被证明是针对一系列癌症适应症的成功疗法，并且被广泛认为通过逆转或防止T细胞耗尽的发生，而且还通过在肿瘤引流淋巴结中T细胞引发过程中促进T细胞的扩增来增强抗肿瘤T细胞反应。然而，尽管在用PD-1/PD-L1检查点抑制剂已实现的在患者结果方面具有相当大的改善，但只有少数患者观察到对这些疗法的持久反应，并且内在或获得性抗性也是常见的。

因此，存在对于能够双重靶向CD47和PD-L1的新型抗体和疗法来克服这些障碍的需要。

发明概述

本公开提供了特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体。

在一些方面，本公开提供了双特异性抗体，其包含：i)重链；ii)第一轻链；和iii)第二轻链。在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体含有包含特异性结合CD47的重链和第一轻链的第一抗原结合区和包含特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)的重链和第二轻链的第二抗原结合区。

在一些实施方案中，所述重链包含重链互补决定区1(CDRH1)，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；重链互补决定区2(CDRH2)，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和重链互补决定区3(CDRH3)，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一轻链的一部分是κ型的并且第二轻链的至少一部分是λ型的。在一些实施方案中，第一轻链包含至少κ恒定区。在一些实施方案中，第一轻链还包含κ可变区。在一些实施方案中，第一轻链还包含λ可变区。

在一些实施方案中，第二轻链包含至少λ恒定区。在一些实施方案中，第二轻链还包含λ可变区。在一些实施方案中，第二轻链还包含κ可变区。

在一些实施方案中，第一轻链包含κ恒定区和κ可变区，并且其中第二轻链包含λ恒定区和λ可变区。

在一些实施方案中，第一轻链包含轻链互补决定区1(CDRL1)，其包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；轻链互补决定区2(CDRL2)，其包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列；和轻链互补决定区3(CDRL3)，其包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，第二轻链包含：包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，双特异性抗体是人抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，分离的双特异性抗体是分离的。

本公开提供了包含双特异性抗体和药学上可接受的载体的组合物。

本公开提供了减少肿瘤细胞的增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括使细胞与包含双特异性抗体的组合物接触。本公开还提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用包含双特异性抗体的组合物。

本公开提供了本文所述的分离的双特异性抗体用于治疗、预防与异常CD47表达或活性相关、或与异常CD47-SIRPα表达或活性相关的病理或延迟其进展的用途。在一些实施方案中，病理是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是或源自乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、间皮瘤、结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肾癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、食道癌、胆源性胃癌(biliary gastric cancer)、前列腺癌或其组合。

本公开提供了特异性结合PD-L1的抗体。在一些方面，本公开提供了这样的抗体，其包含：i)重链；和ii)轻链。

在一些实施方案中，重链包含重链互补决定区1(CDRH1)，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；重链互补决定区2(CDRH2)，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和重链互补决定区3(CDRH3)，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，轻链包含：包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3。

在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，抗体是分离的。在一些实施方案中，抗体是F(ab)片段、F(ab′)2片段和Fv片段或单链Fv片段。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是单价的。

本公开提供了包含抗体和药学上可接受的载体的组合物。

本公开提供了减少肿瘤细胞的增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括使细胞与包含抗体的组合物接触。本公开还提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用包含抗体的组合物。

本公开提供了本文所述的分离的抗体用于治疗、预防与异常PD-L1表达或活性相关的、或与异常PD-L1表达或活性相关的病理或延迟其进展的用途。在一些实施方案中，病理是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是或源自乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、间皮瘤、结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肾癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、食道癌、胆源性胃癌、前列腺癌或其组合。

附图简述

图1A-1E显示了描绘本发明的示例性CD47xPD-L1双特异性抗体和抗PD-L1mAb(S79和S100)与分离自不同物种的PD-L1的结合、交叉反应性和特异性的一系列图。图1A显示通过ELISA测定法测定的与重组人PD-L1的结合。图1B显示通过ELISA测定法测定的与重组食蟹猴PD-L1的结合。图1C显示通过ELISA测定法测定的与重组小鼠PD-L1的结合。图1D显示通过ELISA测定法测定的与重组人PD-L2的结合。图1E显示了这样的图，其描绘通过基于细胞的竞争性结合测定法测定的，与hIgG4同种型对照抗体、抗PD-L1 mAb阿替利珠单抗(atezolizumab)和阿维鲁单抗(avelumab)以及抗-PD-L2 mAb相比，示例性CD47xPD-L1双特异性抗体对可溶性hPD-1与hPD-L1转染的CHO(仓鼠)细胞的结合的阻断。

图2A-2C显示了描绘本发明的示例性CD47xPD-L1双特异性抗体与分离自不同物种的CD47的结合的一系列图。图2A显示通过ELISA测定法测定的与重组人CD47的结合。图2B显示通过ELISA测定法测定的与食蟹猴CD47的结合。图2C显示通过ELISA测定法测定的与重组小鼠CD47的结合。

图2D-2E显示了描绘本发明的示例性CD47xPD-L1双特异性抗体与人CD47+PD-L1-肿瘤细胞的结合的一系列图。图2D显示通过流式细胞术测定的与Raji肿瘤细胞的结合。图2E显示通过流式细胞术的与Nalm-6肿瘤细胞的结合。

图2F显示了这样的图，其描绘在基于细胞的竞争性结合测定中与抗CD47 5F9类似物相比，一种示例性CD47xPD-L1双特异性抗体对可溶性SIRPα与人CD47⁺PD-L1-Nalm-6肿瘤细胞的结合的阻断。

图3显示了这样的图，其描绘通过流式细胞术评估与抗CD47 5F9类似物相比，示例性CD47xPD-L1双特异性抗体与分离自健康供体全血的人红细胞的结合。

图4A-4B显示了描绘通过流式细胞术评估的本发明的示例性CD47xPD-L1双特异性抗体与HT-1080肿瘤细胞的结合的一系列图。

图5A-5B显示了描绘使用人CD47⁺/PD-L1⁺HT-1080肿瘤细胞的示例性CD47xPD-L1双特异性抗体结合的PD-1和SIRPα阻断活性的一系列图。图5A显示PD-1的阻断对HT-1080肿瘤细胞的阻断。图5B显示SIRPα阻断对HT-1080肿瘤细胞的阻断。

图6A-6B显示了描绘X测定中由示例性CD47xPD-L1双特异性抗体介导的肿瘤细胞的吞噬作用的一系列图。图6A显示N87肿瘤细胞的吞噬作用。图6B显示HT-1080肿瘤细胞的吞噬作用。

图7A-7C显示一系列图，其描绘通过抗体依赖性细胞吞噬测定法通过示例性CD47xPD-L1双特异性抗体杀伤肿瘤细胞。图7A显示H226肿瘤细胞的杀伤。图7B显示N87肿瘤细胞的杀伤。图7C显示A375肿瘤细胞的杀伤。

图8.在葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素A(SEA)PBMC刺激测定法中评估的选定CD47xPD-L1双特异性抗体诱导的T细胞激活。孵育96小时后收获的上清液中的IL-2浓度通过ELISA进行定量。测试了不相关的IgG1同种型对照抗体、抗PD-L1 mAb阿维鲁单抗和阿替利珠单抗以及单价CD47对照K2以进行比较。

图9.抗PD-L1 S79 mAb在植入免疫活性C57BL/6小鼠中的MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤功效。皮下肿瘤细胞植入后八天，每3天对小鼠腹腔施用10mg/kg剂量的抗PD-L1mAb S79或不相关的IgG1对照(小鼠接受最多3个剂量)。结果显示每组8只小鼠的个体肿瘤生长曲线。黑色箭对应于治疗注射。

详述

本公开提供了结合CD47和PD-L1的双特异性抗体。具体地，双特异性抗体包括结合CD47并阻断SIRPα/CD47相互作用的第一抗原结合区和结合PD-L1并阻断PD-1/PD-L1相互作用的第二抗原结合区。

癌细胞采用多种机制来逃避免疫监视。几项研究证明，肿瘤细胞上的CD47和PD-L1表达同时受到调节，以抑制免疫反应。因此，单独激活先天性或适应性免疫可能不足以根除肿瘤，而控制两种免疫反应可能会提供更有效的策略来诱导持久的抗肿瘤活性。因此，目前临床正在探索抗PD-L1或抗PD-1抗体与抗CD47抗体的组合。然而，CD47在许多健康细胞(例如造血细胞、红细胞和血小板)上的表达提供了强大的抗原库，其影响这些药剂的药代动力学并损害安全性概况。

通过双靶向双特异性抗体(bsAb)提供克服CD47表达普遍存在的一种方式，所述双靶向双特异性抗体与同一细胞表面上的两种不同抗原结合。双特异性抗体以单价接合的方式以不同的亲和力结合其靶标(即CD47和PD-L1)。具体地，双特异性抗体以高亲和力结合PD-L1，从而允许单价结合。相反，双特异性抗体以低亲和力结合CD47，即仅在PD-L1共接合时足以抑制CD47/SIRPα的亲和力。然而，当两个靶标在同一细胞上表达时，双特异性抗体可以同时阻断它们各自的受体相互作用(即SIRPα和PD-1)。该设计允许本发明的双特异性抗体优先抑制仅PD-L1阳性细胞上的CD47。因此，与仅表达一种单个抗原的细胞相比，这种设计赋予了对表达两种抗原的细胞高选择性。

另外，本文所述的双特异性抗体需要功能性Fc部分来募集巨噬细胞和/或其他免疫效应细胞。例如，双特异性抗体是IgG1同种型。

CD47

CD47或整联蛋白相关蛋白(IAP)是普遍存在的50kDa跨膜糖蛋白，在细胞间通讯中具有多种功能。它与多种配体，例如整联蛋白和/或SIRPα相互作用。在先天免疫系统的背景中，CD47充当自我标志物，通过与骨髓细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞以及NK细胞)表达的SIRPα结合来传递抑制性“别杀我”信号(Deuse T等人，The SIRPα-CD47immune checkpoint in NK cells，J Exp Med 202lVol.218 No.3)。因此，CD47在生理情况下广泛表达的作用是保护健康细胞免受先天免疫系统的清除。

肿瘤细胞通过过表达CD47来劫持这种免疫抑制机制，其有效地帮助它们逃避免疫监视和先天免疫细胞的杀伤。CD47表达在大多数人类癌症(例如NHL、AML、乳腺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌和前列腺癌)中上调，并且CD47表达水平升高明显与侵袭性疾病和不良生存相关。因此，靶向CD47将可用于治疗癌症、延缓癌症的进展或以其他方式改善癌症的症状。

然而，CD47在健康组织中的广泛表达带来了治疗安全性和功效的问题：首先，用中和单克隆抗体(mAb)靶向CD47可能会影响健康细胞，导致严重的血液学毒性(贫血和血小板减少症)，如用小鼠和食蟹猴进行的临床前研究所示。其次，即使通过使用备选抗体形式可以避免或减轻严重毒性，但CD47的广泛表达仍然可能通过靶标介导的药物处置引起CD47结合分子快速消除，从而导致药代动力学不良和功效降低。

程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)

程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)，也称为B7-H1和CD274，是在造血细胞(特别是骨髓细胞)和非造血健康组织上组成型表达的跨膜蛋白。它还可以在肿瘤细胞和肿瘤基质上表达。多种炎症刺激，例如IFNγ、TNFα或LPS，诱导免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞系(包括源自这些细胞系的肿瘤细胞)上的PD-L1表达。PD-L1可作为程序性细胞死亡1(PD-1)(其在激活的淋巴细胞表面表达)和B7.1(也称为CD80，由抗原呈递细胞表达，尤其是树突状细胞和巨噬细胞)的配体。

PD-L1与T细胞上的PD-1接合被认为是免疫检查点，通过抵消T细胞激活信号，导致T细胞增殖、细胞因子产生和释放以及细胞毒性的抑制。事实上，已显示PD-1至少部分通过抑制CD28信号传导来抑制T细胞激活，所述CD28信号传导是T细胞最佳激活所需的主要共刺激途径。因此，PD-1/PD-L1途径通过调节T细胞反应的强度和功能活性，在生理条件下限制炎症反应期间的组织损伤和维持自我耐受方面发挥关键作用。在病理情况下，它参与肿瘤免疫和自身免疫性疾病的发展。

在癌症中，抑制性受体PD-1的表达被认为是耗尽的T细胞的标志，由于持续的抗原和炎症刺激，其表现出功能失调的表型。此外，已显示肿瘤微环境中PD-L1的上调允许肿瘤通过与T细胞上的PD-1相互作用来逃避宿主免疫系统。多项研究已报道，PD-L1在多种肿瘤组织中表达，无论是在肿瘤细胞上，还是在免疫浸润细胞上，或在两者上都表达。在患者中，使用单克隆抗体阻断PD-1与PD-L1的相互作用已被证明是针对一系列癌症适应症的成功疗法，并且被广泛认为通过逆转或阻止T细胞耗尽的发生，而且还通过在肿瘤引流淋巴结中T细胞引发过程中促进T细胞的扩增来增强抗肿瘤T细胞反应。然而，尽管在用PD-1/PD-L1检查点抑制剂已实现的患者结果方面具有相当大的改善，但只有少数患者观察到对这些疗法的持久反应，并且内在或获得性抗性也是常见的。

结合CD47和PD-L1的示例性双特异性抗体

本发明的双特异性抗体具有对CD47特异的一个抗原结合区和对PD-L1特异的第二抗原结合区。但另一方面，双特异性抗体对于CD47和PD-L1是单价的。双特异性抗体具有共同的重链。重链是天然重链(即不含有任何突变)重链是IgG1或IgG3同种型的，其效应子功能(ADCC和/或C1q结合)具有高效力。任选地，双特异性抗体具有不同类型的轻链。例如，一条轻链是κ轻链，另一条轻链是λ轻链(即，κλ体)不同的轻链允许双特异性抗体使用κ和λ选择树脂来轻松纯化。

CD7抗原结合区可源自的示例性CD47抗体包括K2抗体，PD-L1抗原结合区可源自的示例性PD-L1抗体包括S8抗体、S9抗体、S37抗体、S14抗体、S15抗体、S17抗体、S57抗体、S58抗体、S28抗体、S30抗体、S94抗体、S23抗体、S46抗体、S71抗体、S79抗体、S93抗体、S96抗体和S100抗体。

在一些实施方案中，包括结合CD47的至少第一抗原结合区的本发明的示例性双特异性抗体包含选自表1、2和3中所示的CDR序列的重链和互补决定区以及轻链互补决定区(CDR)的组合。表1、2和3中所示的CDR根据IMGT命名法定义(参见the internationalImMunoGeneTics information 可在线获得：http：//www.imgt.org/)。

在一些实施方案中，本发明的示例性双特异性抗体包括包含选自表1中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的重链CDR氨基酸序列的组合的重链、具有选自表2中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的一组第一轻链CDR氨基酸序列的至少第一轻链和具有选自表3CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的一组第二轻链CDR氨基酸序列的至少第二轻链。

在一些实施方案中，本发明的示例性双特异性抗体包括结合CD47的第一抗原结合区和结合PD-L1的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包括表1中所示的重链互补决定区(CDR)的组合和选自表2中所示的CDR序列的轻链CDR的组合，并且其中第二抗原结合区包括表1中所示的重链互补决定区(CDR)的组合和选自表3中所示的CDR序列的轻链CDR的组合。

表1.常见重链CDR

表2.抗CD47κ轻链CDR

表3.抗PD-L1λ轻链CDR

在一些实施方案中，K2 x S8双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：1 5的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S8双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEO ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：32的核酸序列编码的SEQ ID NO：31的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S8双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：29的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S9双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨，基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S9双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：36的核酸序列编码的SEQID NO：35的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S9双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID No：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：33的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S37双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID No：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S37双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：40的核酸序列编码的SEQ ID NO：39的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S37双特异性抗体具有：包含由SEQ IDNO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：37的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S14双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S14双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：44的核酸序列编码的SEQ ID NO：43的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S14双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：42中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：41的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S15双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S15双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：1 06的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：48的核酸序列编码的SEQ ID NO：47的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S15双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：1 04的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：46中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：45的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S17双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL 1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：1 6的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S1 7双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：1 06的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：52的核酸序列编码的SEQ ID NO：51的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S17双特异性抗体具有：包含由SEQ 1D NQ：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：50中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：49的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S57双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S57双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：1 06的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：56的核酸序列编码的SEQ ID NO：55的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S57双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：54中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：53的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S58双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨，基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S58双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：1 06的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：60的核酸序列编码的SEQ ID NO：59的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S58双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：58中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：57的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S28双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S28双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：64的核酸序列编码的SEQ ID NO：63的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S28双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：62中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：61的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S30双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S30双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：68的核酸序列编码的SEQ ID NO：67的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S30双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NQ：66中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：65的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S94双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S94双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：72的核酸序列编码的SEQ ID NO：71的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S94双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：70中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：69的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S23双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S23双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：76的核酸序列编码的SEQ ID NO：75的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S23双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：74中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：73的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S46双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S46双特异性抗体具有：包含由SEQQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：80的核酸序列编码的SEQ ID NO：79的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S46双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：78中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：77的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S71双特异性抗体具有：含有包含SEO ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S71双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEO ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：84的核酸序列编码的SEQ ID NO：83的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S71双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：82中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：81的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S79双特异性抗体具有：含有包含SEQID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S79双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：88的核酸序列编码的SEQ ID NO：87的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S79双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：86中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：85的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S93双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S93双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：109的核酸序列编码的SEQ ID NO：91的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S93双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：90中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：108的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S96双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S96双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEO ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：110的核酸序列编码的SEQ ID NO：95的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S96双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：94中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：93的氨基酸序列的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S100双特异性抗体具有：含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2、包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3的重链，含有包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的CDRL3的κ轻链，和含有包含SEQ IDNO：103的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3的λ轻链。

在一些实施方案中，K2 x S100双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区、和包含由SEQ ID NO：100的核酸序列编码的SEQ ID NO：99的氨基酸序列的λ轻链可变区。

在一些实施方案中，K2 x S100双特异性抗体具有：包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID No：4的氨基酸序列的重链可变区和恒定区、包含由SEQ ID NO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链、和包含由SEQ ID NO：114中所示的核酸序列编码的SEQ ID NO：113的氨基酸序列的λ轻链。

本文所述的示例性抗CD47、抗PD-L1单特异性抗体以及抗CD47和抗PD-L1双特异性抗体各自包括共同重链(HC)、一条κ链或一条λ链(对于抗CD47和抗PD-L1抗体)、一条κ和一条λ轻链(LC)(对于单特异性双特异性抗体)，如下面列出的氨基酸和相应的核酸序列中所示。下面描述的示例性抗CD47、抗PD-L1单价和双特异性抗体各自包括重链可变结构域(VH)、一个κ轻链可变结构域或一个λ轻链可变结构域(对于抗CD47和抗PD-L1抗体)、一个κ轻链可变结构域和一个λ轻链可变结构域(VL)(对于单价和双特异性抗体)，如下面列出的氨基酸和相应的核酸序列中所示。

尽管本文提供了以下抗体序列作为实例，但应当理解，这些序列可用于使用多种本领域公认的技术中的任一种来产生双特异性抗体。双特异性形式的实例包括但不限于基于Fab臂交换的双特异性IgG(Gramer等人，2013MAbs.5(6))；CrossMab形式(Klein C等人，2012MAbs 4(6))；基于强制异二聚化方法的多种形式，例如SEED技术(Davis JH等人，2010Protein Eng Des Sel.23(4)：195-202)，静电转向(Gunasekaran K等人，J BiolChem.2010285(25)∶19637-46.)或旋钮入孔(knob-into-hole)(Ridgway JB等人，ProteinEng.19969(7)：617-21.)或阻止同源二聚体形成的其他突变组(Von Kreudenstein TS等人，2013MAbs.5(5)：646-54.)；基于片段的双特异性形式，例如串联scFv(例如BiTE)(WolfE等人，2005Drug Discov.Today10(18)：1237-44.)；双特异性四价抗体(LM等人，2012Cancer Immunol Immunother.61(10)：1869-75.)；双亲和力重定向分子(Moore PA等人，2011Blood.117(17)：4542-51)，双抗体(Kontermann RE等人，Nat Biotechnol.199715(7)：629-31)。

示例性抗CD47、抗PD-L1单特异性和双特异性抗体包括重链可变区和共同区，其包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

＞VHCH IGHV3-23 hIgG1-AA(SEQ ID NO：4)

＞VHCH IGHV3-23 hIgG1-NT (SEQ ID No：5)

示例性抗CD47、抗PD-L1单特异性和双特异性抗体包括重链可变区，其包含由SEQID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

＞VH IGHV3-23 hIgG1-AA(SEQ ID NO：6)

>VHCH IGHV3-23 hIgG1-NT(SEQ ID NO：7)

ANTI-CD47抗体

示例性抗CD47抗体序列如下所示。轻链可变区以斜体下划线文本显示。CDR序列以粗体下划线文本显示。

“K2”或“Ka3”或“K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：104的核酸序列编码的SEQ ID NO：107的氨基酸序列的κ轻链。

＞K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-AA(SEQ ID No：107)

>K2_κA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-NT(SEQ ID NO：104)

“K2”或“Ka3”或“K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：106的核酸序列编码的SEQ ID NO：105的氨基酸序列的κ轻链可变区。

>K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-AA(SEQ ID No：105)

＞K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-NT(SEQ ID No：106)

抗PD-L1抗体

示例性抗PD-L1抗体序列如下所示。轻链可变区以斜体下下划线文本显示。CDR序列以粗体下划线文本显示。

“S8”或“S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：30的核酸序列编码的SEQ ID NO：29的氨基酸序列的λ轻链。

＞S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：29)

＞S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：30)

“S8”或“S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、和包含由SEQ ID NO：32的核酸序列编码的SEQ ID NO：31的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：31)

>S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：32)

“S9”或“S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQID NO：34的核酸序列编码的SEQ ID NO：33的氨基酸序列的λ轻链

>S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：33)

＞S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：34)

“S9”或“S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区、和包含由SEQ ID NO：36的核酸序列编码的SEQ ID NO：35的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：35)

>S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：36)

“S37”或“S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：38的核酸序列编码的SEQ ID NO：37的氨基酸序列的λ轻链。

>S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：37)

>S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：38)

“S37”或“S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：40的核酸序列编码的SEQ ID NO：39的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：39)

>S37_Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：40)

“S14”或“S14_Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：42的核酸序列编码的SEQ ID NO：41的氨基酸序列的λ轻链。

＞S14_Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：41)

>S14_Sh3_1C6 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：42)

“S14”或“S14_Sh31C6 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：44的核酸序列编码的SEQ ID NO：43的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S14_Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：43)

>s14_Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：44)

“S15”或“S15_Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：46的核酸序列编码的SEQ ID NO：45的氨基酸序列的λ轻链。

>S15_Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：45)

>S15_Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：46)

“S15”或“S15_Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：48的核酸序列编码的SEQ ID NO：47的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>s15_Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：47)

>S15_sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：48)

“S17”或“S17_Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：50的核酸序列编码的SEQ ID NO：49的氨基酸序列的λ轻链。

＞S17_Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：49)

＞S17_Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：50)

“S17”或“S17_Sh31D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：52的核酸序列编码的SEQ ID NO：51的氨基酸序列的λ轻链可变区。

＞s17_Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：51)

＞S17_Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：52)

“S57”或“S57_Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：54的核酸序列编码的SEQ ID NO：53的氨基酸序列的λ轻链。

＞S57_Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：53)

＞S57_Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：54)

“S57”或“S57_Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：56的核酸序列编码的SEQ ID NO：55的氨基酸序列的λ轻链可变区。

＞S57_Sh3-2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：55)

＞S57_Sh3_2D9 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：56)

“S58”或“S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：58的核酸序列编码的SEQ ID NO：57的氨基酸序列的λ轻链。

＞S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：57)

>S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：58)

“S58”或“S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：60的核酸序列编码的SEQ ID NO：59的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA (SEQ ID NO：59)

>S58_Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：60)

“S28”或“S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：62的核酸序列编码的SEQ ID NO：61的氨基酸序列的λ轻链。

>S28_sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA(SEQ ID NO：61)

＞S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT(SEQ ID NO：62)

“S28”或“S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：64的核酸序列编码的SEQ ID NO：63的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA(SEQ ID NO：63)

>S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT(SEQ ID NO：64)

“S30”或“S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：66的核酸序列编码的SEQ ID NO：65的氨基酸序列的λ轻链。

>S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA(SEQ ID NO：65)

>S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT(SEQ ID NO：66)

“S30”或“S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：68的核酸序列编码的SEQ ID NO：67的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA(SEQ ID NO：67)

>S30_Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT(SEQ ID NO：68)

“S94”或“S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：70的核酸序列编码的SEQ ID NO：69的氨基酸序列的λ轻链。

＞S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：69)

＞S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：70)

“S94”或“S94_Sa2_G11-VLCL2 aPDL1IGLV1-44”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：72的核酸序列编码的SEQ ID NO：71的氨基酸序列的λ轻链可变区。

＞S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA(SEQ ID NO：71)

＞S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT(SEQ ID NO：72)

“S23”或“S23_Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：74的核酸序列编码的SEQ ID NO：73的氨基酸序列的λ轻链。

＞S23_Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：73)

＞S23_Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：74)

“S23”或“S23_Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：76的核酸序列编码的SEQ ID NO：75的氨基酸序列的λ轻链可变区。

＞S23_Sc3_1H4 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：75)

＞S23_Sc3_1H4 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：76)

“S46”或“S46_Sc31E4 VLCL2 aPDL1IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：78的核酸序列编码的SEQ ID NO：77的氨基酸序列的λ轻链。

>S46_SC3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：77)

>S46_Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：78)

“S46”或“S46_Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：80的核酸序列编码的SEQ ID NO：79的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S46_Sc3_1E4 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：79)

>S46_Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：80)

“S71”或“S71_Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：82的核酸序列编码的SEQ ID NO：81的氨基酸序列的λ轻链。

>S71_Sc3_2C6 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：81)

>S71_Sc32C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：82)

“S71”或“S71_Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：84的核酸序列编码的SEQ ID NO：83的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S71_Sc3_2C6 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：83)

>S71_Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：84)

“S79”或“S79_Sc3_1G7 VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ IDNO：86的核酸序列编码的SEQ ID NO：85的氨基酸序列的λ轻链。

>S79_Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：85)

>S79_Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：86)

“S79”或“S79_Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：88的核酸序列编码的SEQ ID NO：87的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>s79_sc3_1G7_VLcL2 aPDL1 IGLV2-23-AA(SEQ ID NO：87)

>s79_sc3._1G7_VLcL2 aPDL1 IGLV2-23-NT(SEQ ID NO：88)

“S93”或“S93 IgG_Sa2_1F9”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ ID NO：90的核酸序列编码的SEQ ID NO：108的氨基酸序列的λ轻链。

>S93 IgG_Sa2_1F9-AA(SEQ ID NO：108)

>S93 IgG_Sa2_1F9-NT(SEQ ID NO：90)

“S93”或“S93 IgG_Sa2_1F9”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：109的核酸序列编码的SEQ IDNO：91的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S93 IgG_Sa2_1F9-AA(SEQ ID NO：91)

>S93 IgG_Sa2_1F9-NT(SEQ ID NO：109)

“S96”或“S96 IgG_Sa2 H10”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ ID NO：94的核酸序列编码的SEQ ID NO：93的氨基酸序列的λ轻链。

>s96 IgG_Sa2_H10-AA(SEQ ID NO：93)

＞S96 IgG_Sa2 H10-NT(SEQ ID NO：94)

“S96”或“S96 IgG_Sa2_H10”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：110的核酸序列编码的SEQ IDNO：95的氨基酸序列的λ轻链可变区。

>S96 IgG_Sa2_H10-AA(SEQ ID NO：95)

>S96 IgG_Sa2_H10-NT(SEQ ID NO：110)

“S100”或“S100 IgG_Sa2_1E5”抗体具有包含由SEQ ID NO：5的核酸序列编码的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和重链共同区、和包含由SEQ ID NO：114的核酸序列编码的SEQ ID NO：113的氨基酸序列的λ轻链。

>S100 IgG_Sa2_1E5-AA(SEQ ID NO：113)

>S100 IgG_Sa2_1E5-NT(SEQ ID NO：114)

“S100”或“S100 IgG_Sa2_1E5”抗体具有包含由SEQ ID NO：7的核酸序列编码的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO：110的核酸序列编码的SEQID NO：99的氨基酸序列的λ轻链可变区。

＞S100 IgG_Sa2_1E5-AA(SEQ ID NO：99)

＞S100 IgG_Sa2_1E5-NT(SEQ ID NO：100)

DUMMY轻链

Dummy轻链1(SEQ ID NO：112)由SEQ ID NO：111中所示的核酸序列编码。

＞DUMMY-LC1-NT(SEQ ID NO：111)

＞DUMMY-LC1-AA(SEQ ID NO：112)

Dummy可变轻链结构域1(SEQ ID NO：206)由SEQ ID NO：205中所示的核酸序列编码。

＞DUMMY-VL1-NT(SEQ ID NO：205)

＞DUMMY-VL1-AA(SEQ ID NO：206)

Dummy轻链2(SEQ ID NO：208)由SEQ ID NO：207中所示的核酸序列编码。

＞DUMMY-LC2-NT(SEQ ID NO：207)

＞DUMMY-LC2-AA(SEQ ID NO：208)

Dummy可变轻链结构域2(SEQ ID NO：210)由SEQ ID NO：209中所示的核酸序列编码。

＞DUMMY-VL2-NT(SEQ ID NO：209)

＞DUMMY-VL2-AA(SEQ ID NO：210)

定义：

除非另有定义，否则在本发明上下文中使用的科技术语均具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语也应该包括复数形式并且复数术语也应该包括单数形式。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关使用的命名法及其技术是众所周知的且本领域中通常使用的那些。使用标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶反应和纯化技术根据制造商说明书进行，或如同本领域中通常进行的或如本文所描述的。前述技术和程序通常根据本领域中众所周知的和如描述于多个一般性的和在整个本说明书中引用并讨论的更具体的参考文献中的常规方法进行。参见，例如Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文描述的与分析化学、合成有机化学、和医学和药物化学相关使用的术语学及其实验室程序及技术是众所周知的且在本领域中经常使用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、及患者的治疗。

如根据本发明所用，以下术语，除非另有说明，均应理解为具有以下含义：

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(K_d＞10^-6)结合。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、F_ab、F_ab′和F_(ab′)2片段、scFVs、和F_ab表达文库。

基础抗体结构单元已知包含四聚体。每一四聚体由相同的两对多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一链的氨基末端包括主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分确定主要负责效应子功能的恒定区。通常，获自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任一种，其由于分子中存在的重链性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，诸如IgG₁、IgG₂及其他。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。

如本文所用的术语“单克隆抗体(MAb)”或“单克隆抗体组合物”指含有仅一个分子种类的由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的抗体分子群。尤其是，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群的所有分子中是相同的。MAb含有能够与表征为对其独特的结合亲和力的抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点。

术语“抗原结合区”或“抗原结合位点”或“结合部分”指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链的V区内的三段高度差异的区段位于称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”指天然位于免疫球蛋白的高变区之间和邻接免疫球蛋白的高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此放置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链的每一个的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。用于对抗体的氨基酸序列进行编号和鉴定互补决定区的多种方法是本领域已知的。例如，Kabat编号系统(参见Kabat，EA等人，Sequences of Protein of immunological interest，FifthEdition，USDepartment of Health and Human Services，US Government PrintingOffice(1991))或IMGT编号系统(参见国际ImMunoGeneTics information可在线获得：http：//www.imgt.org/)。IMGT编号系统被常规使用并被认为是本领域可靠且准确的系统，用于确定编码序列中的氨基酸位置、等位基因的比对，以及容易地比较来自所有脊椎动物的免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TR)中的序列。IMGT数据的准确性和一致性基于IMGT-ONTOLOGY，这是第一个且迄今为止唯一的免疫遗传学和免疫信息学的本体(参见Lefranc.M.P.等人，Biomolecules，2014Dec；4(4)，1102-1139)。IMGT工具和数据库针对从大型序列存储库(repository)构建的IMGT参考目录运行。在IMGT系统中，只要适当，就考虑外显子界定来界定IG V-DOMAIN和IG C-DOMAIN。因此，由于更多序列可用于IMGT数据库，本领域技术人员可以并且“使用”IMGT外显子编号系统来可靠地确定编码序列中的氨基酸位置并用于比对等位基因。此外，IMGT唯一编号与其他编号(即Kabat)之间的对应关系可在IMGT科学图表中找到(参见Lefranc.M.P.等人，Biomolecules，2014Dec；4(4)，1102-1139)。。

术语“高变区”或“可变区”是指抗体中通常负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和V_H中大约为31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)附近，当根据Kabat编号系统；Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)编号时)；和/或来自“高变环”的那些残基(例如V_L中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和V_H中的26-32(HI)、52-56(H2)和95-101(H3)，当根据Chothia编号系统；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)编号时)；和/或来自“高变环”VCDR的那些残基(例如V_L中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，和V_H中的27-38(HI)、56-65(H2)和105-120(H3)，当根据IMGT编号系统；Lefranc，M.P.等人Nucl.Acids Res.27：209-212(1999)，Ruiz，M.等人Nucl.Acids Res.28：219-221(2000)编号时)。任选地，该抗体在V_L中的以下点28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)和V_H中的28、36(HI)、63、74-75(H2)和123(H3)的一处或多处具有对称插入，当根据AHo；Honneger，A.和Plunkthun，A.J.Mol.Biol.309：657-670(2001)编号时)。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv、或T细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分组的分子(诸如氨基酸或糖侧链)组成并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可以针对多肽的N末端或C末端肽产生。当解离常数为≤1μM；例如≤100nM，优选≤10nM且更优选≤1nM时，抗体特异性结合抗原。

如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”指在免疫球蛋白分子和所述免疫球蛋白对其是特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数(K_d)的形式表示，其中更小的K_d表示更大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域公知的方法来定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合体形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合体配偶体的浓度、相互作用的亲和力、和同样在两个方向上影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数(on rateconstant)”(K_on)和“解离速率常数(offrate constant)”(K_off)可以通过计算浓度和结合和解离的实际速率来测定。(参见Nature 361：186-87(1993))。K_off/K_on的比率允许删除所有与亲和力无关的参数，并等于解离常数K_d。(通常参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem59：439-473)。如通过测定诸如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定所测量的，当平衡结合常数(K_d)为≤1μM，例如，≤100nM，优选≤10nM，且更优选≤1nM时，本发明的抗体特异性结合其靶标。

如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA、或合成来源的多核苷酸或其一些组合，其由于其起源，所述“分离的多核苷酸”(1)不伴随其中在自然界中发现所述“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或一部分，(2)与其在自然界中不相连的多核苷酸可操作地连接，或(3)不作为更大序列的一部分存在于自然界中。根据本发明的多核苷酸包括编码重链免疫球蛋白分子的核酸分子和编码本文所述的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。

术语“分离的蛋白”本文指cDNA、重组RNA、或合成来源的蛋白或其一些组合，其由于其起源或衍生来源(source ofderivation)，所述“分离的蛋白”(1)不伴随自然界中发现的蛋白，(2)不含来自相同来源的其他蛋白，例如无海洋蛋白，(3)由不同种类的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。

术语“多肽”本文用作通用术语来指多肽序列的天然蛋白、片段、或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽属(genus)中的种(species)。根据本发明的多肽包括如本文所述的重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子(诸如κ轻链免疫球蛋白分子，且反之亦然)及其片段和类似物的组合形成的抗体分子。

术语“天然存在的”如本文所用应用于对象来指对象在自然界中可发现的事实。例如，存在于可以从自然界的来源中分离的生物(包括病毒)中且尚未在实验室中由人或以其他方式有目的的改变的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

术语“可操作地连接”如本文所用来指所述的组分的位置处于这样的关系中，其允许它们以其预期的方式来行使功能。以这样的方式将控制序列“可操作地连接至”编码序列，所述方式即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“控制序列”如本文所用来指对于实现它们所连接的编码序列的表达和加工必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质依赖于宿主生物而不同，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在在最小程度上包括其存在对表达和加工是必需的所有组分，并且还能够包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文所指的术语“多核苷酸”意指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合硼(polymeric boron)，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA。

如本文所用，二十个常见氨基酸及其缩写按照常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第二版，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，SunderlandMass.(1991))。二十个常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常见氨基酸也可以是本发明的多肽的合适组分。非常见氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和规定，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。

当应用至多肽时，术语“实质上的同一性”表示当通过诸如程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重最佳比对时，两条肽序列具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性，并且最优选至少99％序列同一性。

优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。

保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺的侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。

如本文所讨论，抗体和免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小改变应理解为涵盖于本发明中，条件是氨基酸序列中的改变保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％和最优选99％。尤其是，考虑保守氨基酸取代。保守取代是在与其侧链相关的氨基酸家族内发生的那些取代。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他家族的氨基酸包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂族-羟基家族；(ii)精氨酸和谷氨酰胺，其为含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂族家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳族家族。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、用谷氨酸单独取代天冬氨酸、用丝氨酸单独取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所产生的分子的结合或特性产生大的影响，尤其是如果所述取代不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活来确定。测定在本文详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物优选的氨基末端和羧基末端出现在靠近功能结构域的边界。结构和功能结构域可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或专有的序列数据库来鉴定。优选地，使用计算机化的比较方法来鉴定出现在具有已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253：164(1991)。因此，以上实例证实本领域技术人员可以识别可以用于定义本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。

优选的氨基酸取代是以下那些，其：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变对形成的蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修饰此类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸取代(优选地，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中(优选地，在形成分子间接触的结构域外部的多肽的部分中)进行。保守的氨基酸取代应基本上不会改变亲本序列(parent sequence)的结构特征(例如，取代氨基酸应该趋于不打破在亲本序列中形成的螺旋，或不破坏为亲本序列的特征的其他类型的二级结构)。本领域技术公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures andMolecular Principles(Creighton，编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354∶105(1991)。

如本文所用，术语“标记”或“标记的”指掺入可检测的标记物，例如，通过掺入放射标记的氨基酸或连接至可以由标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标记物或可以通过光学或量热法检测的酶促活性的链霉抗生物素)检测的生物素基部分的多肽上。在某些情况下，标记和标记物还可以是治疗的。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并可以使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、由二级报道分子识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链成对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记由各种长度的间隔臂连接以降低潜在的空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”指当适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗作用的化合物或组合物。

本文的其他化学术语根据本领域常规用法来使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.，编辑，McGraw-Hill，San Francisco(1985))所示例的。

如本文所用，“基本上纯”意指目标种类是存在的主要种类(即，在摩尔的基础上，其比组合物中任何其他单独种类更为丰富)，并且优选基本上纯化的级分是这样的组合物，其中目标种类占所有存在的大分子种类的至少约50％(在摩尔基础上)。

通常，基本上纯的组合物将包含多于约80％的组合物中存在的所有大分子种类，更优选多于约85％、90％、95％和99％。最优选地，目标种类纯化至实质的同质性(污染物种类在组合物中通过常规检测方法无法检测到)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。

术语患者包括人和兽医受试者(veterinary subjects)。

抗体

本领域内已知的各种程序可用于产生针对给定靶例如CD47、肿瘤相关抗原或其他靶、或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体。(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow E和Lane D，1988，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，通过引用并入本文)。

抗体通过众所周知的技术诸如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析(其主要提供免疫血清的IgG级分)来纯化。随后，或可选地，其为寻求的免疫球蛋白的靶的特异性抗原或其表位可以固定在柱上以通过免疫亲和力层析来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化的例如由D.Wilkinson(The Scientist，由The Scientist，Inc.出版，Philadelphia PA，Vol.14，No.8(2000年4月17日)，第25-28页)所讨论。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体例如通过使用本文提供的实施例中描述的程序来生成。抗体还例如通过用在其表面上表达高水平的给定靶的细胞转染子的组合免疫BALB/c小鼠来生成。由骨髓瘤/B细胞融合体产生的杂交瘤随后针对所选靶的反应性进行筛选。

单克隆抗体例如使用杂交瘤方法诸如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些方法来制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物通常用免疫剂进行免疫来引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。

免疫剂通常将包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果期望人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果期望非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)第59-103页)。无限增殖化细胞系通常转化哺乳动物细胞，尤其是啮齿类动物、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在优选含有一种或多种抑制未融合的、无限增殖化细胞的生长或存活的物质的合适的培养基中培养。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质阻止HGPRT缺乏细胞的生长。

优选的无限增殖化细胞系是有效融合、由所选的产生抗体细胞支持抗体的稳定的高水平表达、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些细胞系。更优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，其可以例如从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California和American Type Culture Collection，Manassas，Virginia获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已描述用于生产单克隆抗体。(参见Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)第51-63页))。

其中培养杂交瘤细胞的培养基可以随后测定针对抗原的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力例如可以通过Scatchard analysis ofMunson andPollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定具有对靶抗原的高度特异性和高结合亲和力的抗体。

鉴定期望的杂交瘤细胞后，克隆可以通过有限稀释程序来亚克隆并通过标准方法来生长。(参见Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice.，AcademicPress，(1986)第59-103页)。用于此目的的合适培养基包括例如Dulbecco的改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析从培养基或腹水流体中分离或纯化。

单克隆抗体还可以通过重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567中描述的那些来制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以容易地使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。本发明的杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA放置入表达载体中，所述表达载体随后转染入宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。DNA还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；Morrison，Nature368，812-13(1994))或通过共价连接至免疫球蛋白编码序列全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列来修饰。此类非免疫球蛋白多肽可以替换本发明抗体的恒定结构域，或可以替换本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。

本发明的单克隆抗体包括人源化的抗体或人抗体。这些抗体适合于向人施用而不会引起由人针对所施用的免疫球蛋白的免疫应答。抗体的人源化形式是主要包含人免疫球蛋白的序列并含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化例如通过按照Winter及同事(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行。(还参见美国专利号5,225,539)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基取代。人源化抗体还包含例如在受体抗体或输入的CDR或框架序列内均未发现的残基。通常，人源化抗体包括基本上所有、至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的Fc(Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。

完全人抗体是其中轻链和重链两者的整个序列包括CDR均来自人基因的抗体分子。此类抗体本文称为“人抗体”或“完全人抗体”。单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等人，1983Immunol Today 4：72)；和EBV杂交瘤技术来制备以产生单克隆抗体(参见Cole，等人，1985In：Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。单克隆抗体可以利用并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote，等人，1983.Proc Nat1 Acad Sci USA 80∶2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole，等人，1985In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)来产生。

此外，人抗体还可以使用另外的技术包括噬菌体展示文库来产生。(参见Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白位点引入转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠来制备。一旦攻击，观察到人抗体产生，其与在人中在所有方面看到的类似，包括基因重排、组装和抗体所有组分。该方法例如描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和Marks等人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。

人抗体可以另外使用转基因非人动物(其修饰以产生应答于抗原攻击的完全人抗体而非动物内源抗体)来产生。(参见PCT公开WO94/02602)。非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链的内源基因已被失效，并且编码人重和轻链免疫球蛋白的活性位点插入到宿主基因组中。例如，使用含有必需的人DNA区段的酵母人工染色体来并入人基因。提供所有期望的修饰的动物随后作为通过将含有少于修饰的全部补充的中间转基因动物杂交的后代而获得。此类非人动物的一个实例是如PCT公开WO 96/33735和WO 96/34096中公开的称为Xenomouse^TM的小鼠。该动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。抗体可以在用目标免疫原免疫后例如作为多克隆抗体的制备物直接获自动物，或可选地获自来源于动物的无限增殖化B细胞诸如产生单克隆抗体的杂交瘤。另外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可以回收并表达以直接获得抗体，或可以进一步修饰以获得抗体的类似物，例如诸如单链Fv(scFv)分子。

产生缺乏内源免疫球蛋白重链的表达的非人宿主(示例为小鼠)的方法实例公开于美国专利号5,939,598中。它可以通过这样的方法获得，所述方法包括在胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座缺失J区段基因以防止基因座重排并防止重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物形成，缺失通过含有编码可选择标记物的基因的靶向载体来起效；和从胚胎干细胞中产生其体细胞和生殖细胞均含有编码可选择的标记物的基因的转基因小鼠。

产生目标抗体诸如人抗体的一种方法公开于美国专利号5,916,771。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养物中的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入到另一个哺乳动物宿主细胞中，并融合两个细胞以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。

在对该程序进一步改进中，鉴定免疫原上的临床相关表位的方法和选择以高亲和力特异性结合相关表位的抗体的相关方法公开于PCT公开WO 99/53049。

抗体可以由含有编码上文所述的单链抗体的DNA区段的载体表达。

这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括诸如描述于WO 93/64701中的化学缀合物，其具有靶向部分(例如对细胞表面受体的配体)、和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、诸如描述于PCT/US95/02140(WO 95/22618)的融合蛋白(其是含有靶部分(例如对靶细胞特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)、质粒、噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体(pox vector)诸如天花或禽痘(orthopox or avipox)载体、疱疹病毒载体诸如单纯疱疹病毒I(HSV)载体(参见Geller，A.I.等人，J.Neurochem，64：487(1995)；Lim，F.，等人，于DNA Cloning：MammalianSystems，D.Glover，编辑(Oxford Univ.Press，Oxford England)(1995)；Geller，A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.：U.S.A.90：7603(1993)；Geller，A.I.，等人，ProcNatl.Acad.Sci USA 87：1149(1990)、腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人，Science，259：988(1993)；Davidson，等人，Nat.Genet3：219(1993)；Yang，等人，J.Virol.69：2004(1995)和腺伴随病毒载体(参见Kaplitt，M.G.等人，Nat.Genet.8：148(1994)。

痘病毒载体将基因引入到细胞质内。禽痘病毒载体导致核酸的仅短期表达。腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体对于将核酸引入神经细胞是优选的。腺病毒载体导致比腺伴随病毒(约4个月)更短期的表达(约2个月)，腺伴随病毒依次比HSV载体更短。所选的具体载体将取决于靶细胞和处理的条件。引入可以通过标准技术例如感染、转染、转导或转化。基因转移的模式的实例包括例如裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞微注射和病毒载体。

可以利用载体以基本上靶向任何期望的靶细胞。例如，立体定向注射可以用于将载体(例如腺病毒、HSV)导向期望位置。另外，微粒可以通过使用微泵输注系统诸如SynchroMed Infusion System脑室内(icv)输注来递送。基于总体流量的方法(称为对流)也已证实在递送大分子至脑的延展区域是有效的并可以用于递送载体至靶细胞。(参见Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994)；Morrison等人，Am.J.Physiol.266：292-305(1994))。可以使用的其他方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，和口服或其他已知的施用途径。

双特异性抗体是对于至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本发明中，结合特异性之一是对于靶诸如CD47或其任何片段。第二结合靶是任何其他抗原，且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。类似程序公开于WO93/08829，于1993年5月13日公开，和公开于Traunecker等人，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。

本方面的双特异性和/或单价抗体可以使用多种本领域公认的技术中的任一种，包括于2011年8月16日提交的共同待审申请WO2012/023053(其内容通过引用以其整体并入本文)中公开的那些来制备。描述于WO 2012/023053中的方法生成结构上与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。这类分子由两个拷贝的独特的重链多肽、融合至恒定κ结构域的第一轻链可变区和融合至恒定λ结构域的第二轻链可变区构成。每一结合位点展示重链和轻链贡献的不同的抗原特异性。轻链可变区可以是λ或κ家族，并且优选分别融合至λ和κ恒定结构域。这是优选的以避免生成非天然多肽接头。然而，也可以通过将κ轻链可变结构域融合至恒定λ结构域(对于第一特异性)并将λ轻链可变结构域融合至恒定κ结构域(对于第二特异性)来获得本发明的双特异性抗体。WO2012/023053中描述的双特异性抗体称为IgGκλ抗体或“κλ体”，一种新的完全人双特异性IgG形式。该κλ体形式允许双特异性抗体的亲和力纯化，所述双特异性抗体与具有与标准单克隆抗体难以区分并因此当与之前形式相比时有利的特征的标准IgG分子难以区分。

方法的必要步骤是鉴定具有分享相同的重链可变结构域的不同抗原特异性的两个抗体Fv区(每个由可变轻链和可变重链结构域构成)。多种方法已描述生成单克隆抗体及其片段。(参见例如Antibodies：ALaboratory Manual，Harlow E和Lane D，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，通过引用并入本文)。完全人抗体是其中轻链和重链两者的序列包括CDR 1和2均来自人基因的抗体分子。CDR3区可以是人起源或由合成方法设计。此类抗体本文称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等人，1983Immunol Today4：72)；和EBV杂交瘤技术来制备以产生人单克隆抗体(参见Cole，等人，1985In：MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。人单克隆抗体可以利用并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote，等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole，等人，1985In：Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)来产生。

例如，通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫动物来生成单克隆抗体。或者，用这样的细胞免疫动物，所述细胞用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染，使得靶抗原表达并与转染细胞的表面结合。用于产生异种非人动物的多种技术是本领域熟知的。例如，参见美国专利号6,075,181和6,150,584，其以其整体通过引用并入本文。

或者，通过筛选含有结合靶抗原的抗体或抗原结合结构域序列的文库来获得抗体。该文库例如在噬菌体中制备为与表达于装配的噬菌体颗粒的表面上的噬菌体外壳蛋白和噬菌体颗粒内包含的编码DNA序列的蛋白或肽融合体(即“噬菌体展示文库”)。

由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤随后针对靶抗原的反应性进行筛选。单克隆抗体例如使用杂交瘤方法诸如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些方法来制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物通常用免疫剂进行免疫来引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。

尽管并非严格不可能，但具有相同重链可变结构域但针对不同抗原的不同抗体的偶然的鉴定是高度不可能的。实际上，在大部分情况下，重链对抗原结合表面做出大部分贡献，并且在序列上也是最可变的。具体而言，重链上的CDR3在序列、长度和结构上是最不同的CDR。因此，对不同抗原特异的两种抗体将几乎一定携带不同的重链可变结构域。

在共同待审申请WO 2012/023053中公开的方法克服了这一限制，并极大地促进通过使用抗体文库分离具有相同重链可变结构域的抗体，在所述抗体文库中重链可变结构域对于所有文库成员均是相同的并因此多样性限于轻链可变结构域。此类文库例如描述于共同待审申请WO 2010/135558和WO 2011/084255中，其每一个以其整体通过引用并入本文。然而，因为轻链可变结构域与重链可变结构域共同表达，因此两个结构域都可以对抗原结合有贡献。为了进一步促进方法，含有相同重链可变结构域和多样的λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库可以平行使用来体外选择针对不同抗原的抗体。该方法能够鉴定具有共同的重链但一个携带λ轻链可变结构域而另一个携带κ轻链可变结构域(其可用作生成本发明的完全免疫球蛋白形式中的双特异性抗体的结构单元)的两种抗体。本发明的双特异性抗体可以是不同的同种型且其Fc部分可以修饰以改变对不同Fc受体的结合特性和以该方式修饰抗体的效应子功能以及其药代动力学特性。修饰Fc部分的多种方法已描述并可应用于本发明的抗体。(例如参见Strohl，WR Curr Opin Biotechnol 2009(6)：685-91；美国专利号6,528,624；于2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可以用于生成以缺乏Fc部分的F(ab’)2形式的双特异性抗体和抗体混合物。

共同的重链和两个不同轻链共表达入单个细胞以允许装配本发明的双特异性抗体。如果所有多肽以相同水平表达且同样好地装配以形成免疫球蛋白分子，则随后单特异性(相同轻链)和双特异性(两种不同轻链)的比例应为50％。然而，可能不同轻链以不同水平表达和/或不以相同效率装配。因此，调节不同多肽相对表达的方法用于补偿它们的固有的表达特征或不同倾向，以与共同重链装配。该调节可以经启动子强度、使用特征在于不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或其他类型的调节元件(其可作用于转录或翻译水平以及作用于mRNA稳定性)来实现。不同强度的不同启动子可以包括CMV(立即早期巨细胞病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α-亚基启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。来自哺乳动物和病毒起源的不同的IRES也已经描述。(参见例如Hellen CU和SarnowP.Genes Dev 200115：1593-612)。这些IRES可以在其长度和核糖体补充效率上极大不同。此外，可以通过引入IRES的多个拷贝进一步调整活性(Stephen等人2000Proc Natl AcadSci USA 97：1536-1541)。表达的调节还可以通过细胞的多次连续转染以增加表达一种或另一种轻链的各个基因的拷贝数并因此修饰其相对表达来实现。本文提供的实施例证实控制不同链的相对表达对于将双特异性抗体的装配和总体产率最大化是至关重要的。

重链和两种轻链的共表达生成三种不同抗体的混合物至细胞培养上清液中：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得目标分子。本文描述的方法通过使用亲和层析介质(其特异性与κ或λ轻链恒定结构域诸如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和基质(BAC BV，Holland)相互作用)极大地促进该纯化程序。这种多步骤亲和层析纯化方法是有效的并通常可应用于本发明的抗体。这与特定的纯化方法截然相反，所述纯化方法必须进行开发并对来源于四源杂交瘤或其他表达抗体混合物的细胞系的每一双特异性抗体进行优化。实际上，如果混合物中的不同抗体的生物化学特征是相似的，则使用标准层析技术诸如离子交换层析对其分离可能是挑战性的，或者根本不可能。

其他合适的纯化方法包括于2012年10月19日提交的共同待审申请PCT/IB2012/003028公开为WO2013/088259中公开的那些，其内容以其整体通过引用并入本文。

在产生双特异性抗体的其他实施方案中，具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。融合体优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，包含至少部分铰链、CH2、和CH3区。优选具有含有对于至少一个融合体中存在的轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如期望)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体内，并共转染入合适的宿主生物中。对于生成双特异性抗体的进一步细节例如见Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

根据WO 96/27011中描述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可以工程化以将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包括抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。相同或相似大小的对大侧链的补偿“腔”(Compensatory“cavities”)通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上产生。这提供了提高异二聚体相对于其他不想要的末端产物诸如同二聚体的产率的机制。

从抗体片段生成双特异性抗体的技术已描述于文献中。例如，双特异性抗体可以使用化学键制备。产生的双特异性抗体可以用作用于酶的选择性固定的试剂。

从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术也已描述。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两个不同抗体的Fab′部分。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，并随后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法还可以用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已提供制备双特异性抗体片段的可选机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(V_L)相连的重链可变结构域(V_H)，所述接头非常短以致于无法允许相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一片段的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略也已报道。参见Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。

考虑具有多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。

示例性双特异性抗体可以结合两种不同表位，其至少一种起源于本发明的蛋白抗原。可选地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合白细胞上的引发分子诸如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28、或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，以将细胞防御机制集中在表达具体抗原的细胞上。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂导向表达具体抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA的臂。另一种目的双特异性抗体结合本文所述的蛋白抗原并且还结合组织因子(TF)。

异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价连接的抗体构成。此类抗体例如已提出以靶向免疫系统细胞至不想要的细胞(参见美国专利号4,676,980)和用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。应考虑抗体可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(mercaptobutyrimidate)和例如美国专利号4,676,980中公开的那些。

可以期望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，以增强例如抗体在治疗癌症和/或与异常CD47表达和/或活性相关的其他疾病或病症中的效力。例如，可以将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区，由此允许该区中链间二硫键形成。因此生成的同二聚抗体可以具有改进的内化的能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人，J.Exp Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148：2918-2922(1992))。可选地，具有双Fc区的抗体可以工程化并由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。(参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design，3：219-230(1989))。

本发明还涉及包含缀合至细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物、或动物起源的酶促活性毒素、或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)的抗体的免疫缀合物。

可以使用的酶促活性毒素或其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y、和¹⁸⁶Re。

抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，所述双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如亚苄基(tolyene)2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，Science238：1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于缀合放射性核素至抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11 026)。

本领域普通技术人员将公认许多种可能的部分可以偶联至本发明所得的抗体。(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis，Jr(eds)，Carger Press，New York，(1989)，其完整内容通过引用并入本文)。

偶联可以通过任何化学反应完成，所述化学反应将结合两个分子，只要抗体和其他部分保留其各自活性。该连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。然而，优选的结合是共价结合。共价结合可以通过直接缩合存在的侧链或通过掺入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白分子，诸如本发明的抗体，至其他分子。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和环己二胺。该列表不旨在排除本领域已知的各种类别的偶联剂，而是示例更多常见的偶联剂。(参见Killen和Lindstrom，Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62：185-216(1982)；和Vitetta等人，Science 238：1098(1987)。

优选的接头描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan，S.等人，Cancer Res.44：201-208(1984)，其描述使用MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。还参见美国专利号5,030,719，其描述使用借助于寡肽接头偶联至抗体的卤代的乙酰基酰肼衍生物。特别优选的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸化物；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基(pridyl)-二硫代)-甲苯(PierceChem.Co.，Cat.(21 558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat#21651G)；(iv)硫代-LC-SPDP(硫代琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)缀合至EDC的硫代-NHS(N-羟基硫代-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。

上述接头含有具有不同属性因而导致缀合物具有不同物理化学特性的组分。例如，烷基羧酸酯的硫代-NHS酯比芳香羧酸酯的硫代-NHS酯更稳定。含有接头的NHS-酯比硫代-NHS酯溶解度更低。此外，接头SMPT含有空间位阻的二硫键，并可以形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键一般说来比其他键更不稳定，因为二硫键体外切割，导致更少可获得的缀合物。尤其是硫代-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与硫代-NHS一同使用时，碳二亚胺偶联(诸如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解更具有抗性的酯。

本文公开的抗体还可以配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。

特别有用的脂质体可以通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇、和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反向蒸发法来生成。脂质体经确定孔径的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以如Martin等人，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)中描述经由二硫化物交换反应缀合至脂质体。

使用方法

将理解的是根据本发明施用治疗实体将与合适的载体、赋形剂、和其他试剂(其掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等)施用。多种适合的制剂可以在所有药剂师已知的处方集中发现：Remington′sPharmaceutical Sciences(第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1975))，尤其是其中的由Blaug，Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂类(lipids)、含有小泡(诸如Lipofectin^TM)的脂质(lipid)(阳离子的或阴离子的)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳状液、乳状液聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有聚乙二醇的半固体混合物。任何前述混合物可以根据本发明在治疗和疗法中是适合的，条件是制剂中的活性组分不会被制剂失活，并且制剂与施用途径是生理上相容的且可耐受的。还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization anddevelopment of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-someemerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)，Powell等人“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)及其中对关于药物化学家熟知的制剂、赋形剂和载体的额外信息的引用。

本发明的治疗制剂(其包括本发明的抗体)用于治疗或减轻与癌症相关的症状，例如但不限于，白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌和支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌和肾盂癌、口腔和咽癌、子宫体癌、和/或黑素瘤。本发明还提供治疗或减轻与癌症相关的症状的方法。治疗方案通过使用标准方法鉴定受试者，例如患有癌症(或处于发生癌症的风险中)的人受试者来进行。

测定治疗连同任何已知的用于诊断或治疗特定免疫相关病症的方法的有效性。减轻免疫相关病症的一种或多种症状表明抗体赋予临床益处。

用于筛选具有期望的特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和其他本领域已知的免疫介导的技术。

针对靶诸如CD47、PD-L1或其组合(或其片段)的抗体可以用在本领域内与这些靶的定位和/或定量相关的方法中，例如用于测量这些靶在合适的生理样品中的水平，用于诊断方法，用于成像蛋白等等)。在给定的实施方案中，将对这些靶的任何特异性的抗体、或其衍生物、片段、类似物或同源物(其含有抗体衍生的抗原结合结构域)用作药学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。

本发明的抗体可以用于使用标准技术诸如免疫亲和、层析或免疫沉淀分离特定靶。本发明的抗体(或其片段)可以作为临床测试程序的一部分在诊断上用于监测组织中的蛋白水平，例如以测定给定治疗方案的效力。检测可以通过偶联(即物理交联)抗体至可检测的物质而变得容易。可检测物质的实例包括各种酶、假体基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料、和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的假体基团复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

包括多克隆、单克隆、人源化和完全人抗体的本发明的抗体可用作治疗剂。此类试剂通常将用于治疗或预防与给定靶在受试者中的异常表达或活化相关的疾病或病理。将抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂施用于受试者并通常将由于其与靶结合而具有作用。施用抗体可以消除或抑制或干扰靶的信号传递功能。施用抗体可以消除或抑制或干扰靶与内源配体(靶与所述配体天然结合)的结合。例如，抗体结合靶并中和或另外抑制CD47和SIRPα之间的相互作用。

本发明的抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上所指出，这可以是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶的功能。待施用所需的量此外将取决于抗体对其特定抗原的结合亲和力，并还取决于所施用的抗体从其所施用的其他受试者的自由体积耗尽的速率。本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的通常范围可以是但不限于约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。通常给药频率范围可以是例如从每天两次至每周一次。

本发明的抗体或其片段可以以药物组合物的形式施用用于治疗多种疾病和病症。涉及制备此类组合物的原则和考虑以及选择组分的指导例如提供于Remington：TheScience And Practice Of Pharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro，等人，编辑)MackPub.Co.，Easton，Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，And Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne，Pa.，1994；和Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991，M.Dekker，New York。

当使用抗体片段时，特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制性片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993))。制剂还可以含有对于待治疗的具体适应症必需的多于一种活性化合物，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。可选地，或另外，组合物可以包含增强其功能的试剂，诸如例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。

活性成分还可以包入制备的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒、和纳米胶囊)或在粗乳剂(macroemulsion)中分别为羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以容易地通过经无菌滤膜过滤来实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白为更短的时期。

根据本发明的抗体可以用作用于检测样品中给定靶(或其蛋白片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体含有可检测的标记。抗体是多克隆的，或更优选地，是单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如F_ab、scFv、或F_(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”意在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素末端标记DNA探针，使得其可以用荧光标记的链霉抗生物素检测。术语“生物样品”意在包括分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及受试者内存在的组织、细胞和流体。因此，包括在术语“生物样品”的使用中的是血液和血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴。即，本发明的检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记、免疫沉淀和免疫荧光。检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的程序例如描述于“ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology”，Vol.42，J.R.Crowther(编辑)Human Press，Totowa，NJ，1995；“Immunoassay”，E.Diamandis和T.Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1996；and“Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays”，P.Tijssen，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985。此外，检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入受试者内。例如，可以将抗体用放射性标记物标记，所述放射性标记物在受试者内的存在或位置可以通过标准成像技术来检测。

药物组合物

本发明的抗体(本文也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可以掺入适合于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意在包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与药物施用是相容的。合适的载体描述于最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences中，其是本领域的标准参考书，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。脂质体和非含水媒介物诸如不挥发性油也可以使用。使用此类介质和试剂用于药学上有活性的物质是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂范围之外，其在组合物中的使用均被考虑。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。

将本发明的药物组合物配制为与其旨在的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即局部的)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱调节，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶内。

适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶的)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流动的直至易于可注射性的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须针对微生物诸如细菌或真菌的污染作用是防腐的。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用涂料诸如卵磷脂，通过在分散的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如蔗糖、多元醇诸如甘露醇(manitol)、山梨醇、或氯化钠。可注射的组合物延长的吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达到。

无菌的可注射溶液可以通过将活性化合物以需要的量掺入具有一种上文列举的成分或其组合的合适的溶剂中(如需要，随后为过滤灭菌)来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌的媒介物含有基础分散介质和上文列出的那些中的需要的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其之前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以装在明胶胶囊内或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以掺有赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口剂的流体载体来制备，其中将流体载体中的化合物口服应用并漱口且吐出或吞下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以包括作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或增味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。

对于通过吸入施用，化合物以来自加压的容器或分液器(其含有合适的推进剂例如气体诸如二氧化碳)或喷雾器的气溶胶喷雾的形式递送。

全身施用还可以通过透粘膜或经皮方式。对于透粘膜或经皮施用，对于待渗透的屏障合适的渗透剂可用于制剂中。此类渗透剂通常是本领域已知的且包括例如对于透粘膜施用为去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制入本领域通常已知的油膏(ointment)、药膏(salves)、凝胶或乳膏中。

化合物还可以制备为用于直肠递送的栓剂(例如，与常规栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式。

在一个实施方案中，将活性化合物与将保护所述化合物免于从机体快速排除的载体制备，诸如控释制剂，包括埋植剂和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。材料还可以商业获自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂质体悬浮液(包括靶向受感染的细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法例如美国专利号4,522,811中描述的进行制备。

为了容易施用和剂量的一致性，尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上分离的单位(physically discrete units)；每一单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和必需的药物载体。对本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果以及在调配此类用于治疗个体的活性化合物的领域中固有的限制所指明且直接取决于它们。

药物组合物可以连同施用说明书一起包括在容器、包装或分液器中。

本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：使用含有固定可变重链的人scFv文库对PD-L1Fv进行噬菌体展示选择

Vaughan等人(Nat.Biotech.1996，14：309-314)(其全部内容通过引用并入本文)描述了用于构建和处理在M13噬菌体(bacteriophage)上展示的人scFv文库的一般程序。用于选择和筛选的文库编码全部共享相同VH结构域并且仅在VL结构域中多样化的scFv。用于生成固定VH文库的方法及其用于鉴定和组装双特异性抗体的方法描述于US 2012/0184716和WO 2012/023053中，其各自的全部内容通过引用并入本文。鉴定scFv与人PD-L1结合的程序如下所述。

A.蛋白质选择

将scFv噬菌体文库的等分试样(10¹²Pfu)用含有3％(w/v)脱脂乳的PBS在旋转混合器上室温封闭一小时。在室温下，在旋转混合器上，在链霉亲和素磁珠(Dynabeads^TM M-280)上取消选择(deselected)封闭的噬菌体一小时。对于针对CD47的选择，在一些情况下，将10⁸纯化的红细胞添加到珠粒中以进行取消选择。将取消选择的噬菌体与链霉亲和素磁珠上捕获的100nM生物素化人PD-L1胞外结构域在室温下在旋转混合器上孵育两小时。为了提高结合亲和力，每轮选择使用浓度降低的PD-L1(从10nM至0.1nM)。使用磁力架捕获珠粒，然后用PBS/0.1％Tween 20洗涤五次，并用PBS洗涤两次。室温下，在旋转混合器上用100nMTEA洗脱噬菌体30分钟。洗脱的噬菌体和珠粒用Tris-HCl1M pH 7.4中和，直接添加到10ml指数生长的TG1细胞中，并在37℃下缓慢摇动(90rpm)孵育一小时。对受感染TG1的等分试样进行系列稀释以滴定选择输出。将剩余受感染的TG1以3800rpm旋转10分钟，重悬于2ml2xTY中，并铺在2xTYAG(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xTY培养基)琼脂生物测定板上。30℃过夜孵育后，将10ml 2xTY添加到板中，从表面刮下细胞并转移到50ml聚丙烯管中。将50％甘油溶液添加到细胞悬浮液中以获得17％甘油的终浓度。选择轮次的等分试样保存在-80℃。

B.噬菌体拯救(Rescue)

将从之前选择轮次获得的50μl细胞悬浮液添加到50ml2xTYAG中，并在37℃搅拌(240rpm)下生长，直至达到OD₆₀₀0.3至0.5。然后用1.2x10¹¹ M13K07辅助噬菌体对培养物进行超级感染，并在37℃(90rpm)下孵育一小时。通过以3800rpm离心细胞10分钟、除去培养基并将沉淀重悬于50ml 2xTYAK(含有100μg/ml氨苄青霉素；50μg/ml卡那霉素的2xTY培养基)中来更换培养基。然后将培养物在30℃(240rpm)下生长过夜。第二天，含有上清液的噬菌体用于下一轮选择。

C.细胞表面选择

将含有上清液的噬菌体用含有3％(w/v)脱脂乳的PBS在室温下在旋转混合器上封闭一小时。然后在不表达人PD-L1的1x10⁷MKN-45细胞上取消选择封闭的噬菌体一小时。将取消选择的噬菌体与1x10⁷A431或THP-1细胞(其与IFNg预孵育了24小时)在室温下轻轻摇动孵育两个小时，以增强PD-L1表达(用PBS 3％BSA、0.1％NaN₃封闭)。将细胞沉淀并用PBS洗涤六次。用76mM柠檬酸洗脱结合的噬菌体并摇动10分钟。用Tris-HCl1M pH 8中和后，将含有细胞的洗脱液直接添加到10ml指数生长的TG1中，并在37℃下缓慢摇动孵育一小时。对受感染TG1的等分试样进行系列稀释以滴定选择输出。将受感染的TG1以3800rpm旋转10分钟，重悬于2ml 2xTY培养基中，并铺在2xTYAG琼脂生物测定板上。在30℃过夜孵育后，将10ml 2xTY添加到板中，从表面刮下细胞并转移到50ml聚丙烯管中。将50％甘油溶液添加到细胞悬浮液中以获得17％甘油的终浓度。选择轮次的等分试样保存在-80℃。

实施例2：筛选与PD-L1结合的scFv

A.用于结合和功能测试的scFv周质制剂

将单个受感染的TG1克隆接种到每孔含有0.9ml 2xTYAG培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素，0.1％葡萄糖的2xTY培养基)的深孔96孔板中，并在37℃下生长5-6小时(240rpm)。添加2xTY培养基中的IPTG 0.2mM，以得到0.02mM的终浓度。将板在30℃下以240rpm摇动孵育过夜。将深孔板在4℃下以3200rpm离心10分钟，并小心除去上清液。将沉淀重悬于150μl TES缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8)、1mM EDTA(pH 8)、20％蔗糖)中。通过添加150μl稀释的TES缓冲液(1：5TES：水稀释液)并在冰上孵育30分钟来产生低渗休克。将板在4℃下以4000rpm离心10分钟，以沉淀细胞和碎片。将上清液小心地转移至96孔微量滴定板中并保存在冰上，以便立即在功能测定或结合测定中进行测试。

B.结合

使用CellInsight^TM技术在同质测定中测试对于PD-L1结合的scFv的筛选。将以下试剂在384透明底孔板(Corning)的每个孔中混合：30μl链霉亲和素聚苯乙烯珠悬浮液(Polysciences；3000珠/孔)，其包被有生物素化PD-L1或生物素化无关蛋白作为对照蛋白；60μl封闭的scFv周质制剂；10μl检测缓冲液(含有2μg/ml人抗c-myc抗体的PBS；按1：500稀释的抗人IgG Fc647)。以600rpm摇动5分钟后，将384孔板在室温下孵育，并在2小时后在CellInsight^TM CX5 High-Content Screening平台(ThermoFisherScientific)上读数。选择在PD-L1上而非对照蛋白上给出特定信号的表达scFv的克隆用于进一步分析或测序。

C.PD-1/PD-L1相互作用的抑制

使用CellInsight^TM技术，在基于珠粒的均质测定中，针对其抑制PD-1和PD-L1之间相互作用的能力筛选靶向PD-L1的ScFv。将以下试剂在384透明底孔板(Corning)的每个孔中混合：30μl链霉亲和素聚苯乙烯珠悬浮液(Polysciences；3000珠/孔)，其包被有生物素化PD-L1、0.1μg/ml PD-1-huFc(ACROBiosystems)、1：2000稀释的抗人IgG Fc647和50μlscFv周质制剂。以600rpm摇动5分钟后，将384孔板在室温下孵育，并在2小时后在CellInsight^TM CX5 High-Content Screening平台(ThermoFisher Scientific)上读数。每个板中都包括含有不与PD-L1结合的无关scFv的对照孔，以便选择表达scFv导致对照中测量的PD-1/PD-L1信号减少的克隆用于进一步分析或测序。

实施例3：携带λ和κ轻链的双特异性抗体的表达和纯化

在相同细胞中一条重链和两条轻链的同时表达可以导致装配三种不同抗体。同时表达可以以不同方式诸如转染表达链之一的多个载体以共表达或通过使用驱动多个基因表达的载体来实现。之前生成载体pNoviκHλ以允许共表达一条重链、一条κ轻链和一条λ轻链，如US 2012/0184716和WO 2012/023053中所述，其每一个以其整体通过引用并入本文。三个基因的表达由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动，并且载体还含有能够选择并建立稳定细胞系的谷氨酰胺合成酶基因(GS)。将抗hPD-L1 IgGλ或抗hCD47 IgG κ的VL基因克隆在载体pNoviκHλ中，用于在哺乳动物细胞中瞬时表达。将Expi293细胞(Gibco)以3x10⁶细胞/mL的浓度在Erlenmeyer烧瓶中在50ml的Expi293培养基(Gibco)中扩增和分裂。使用聚乙烯亚胺转染试剂(PEI，Polyscience)根据制造商说明书将62.5μg质粒DNA转染入细胞中。转染的细胞的上清液中的IgG浓度在生产过程中使用Bio-Layer Interferometry(BLI)技术来测量。OctetRED96仪器和蛋白A生物传感器用于定量(Sartorius)。将生物反应器预调节(pre-conditioned)并使用10mM甘氨酸pH 1.7再生，制备在调节的(conditioned)细胞培养基中稀释的IgG校准品(calibrators)用于标准曲线生成。使用剂量应答5PL未加权的Y标准曲线方程和起始斜率结合速率方程来测定浓度。根据抗体浓度，在转染后7-10天收获上清液，并以2000g离心10分钟并在0.22μm上过滤将其澄清。纯化方法由使用来自Thermo FisherScientific的亲和树脂的三个步骤构成。首先，用PBS洗涤CaptureSelect FcXL树脂并随后加入澄清的上清液中。在+4℃和15rpm下孵育过夜后，将上清液以600g离心10分钟，储存流通物(flow through)直至纯化过程结束并用PBS洗涤树脂两次。随后，将树脂转移至AmiconPro柱(Merck Millipore)上，并将含有50mM甘氨酸pH 3的溶液用于洗脱。产生几种洗脱级分，用1/10Tris HCl pH7.4(Invitrogen)中和并合并。含有总人IgG的纯化产物使用Nanodrop分光光度计(NanoDrop Technologies)定量并在RT和15rpm下与合适体积的CaptureSelect KappaXL亲和基质孵育30分钟。孵育、树脂回收、洗脱和中和步骤如之前所述进行。最后的亲和纯化步骤使用CaptureSelect LC-lambda(Hu)亲和基质如对于之前两步纯化应用相同方法来进行。洗脱级分的集合使用50kDa Amicon离心单元(MerckMillipore)针对25mM组氨酸/125mM NaC1pH6.0来脱盐。使用Nanodrop来定量纯化的κλ体并如制造商(Agilent Technologies)所述，使用Agilent2100Bioanalyzer和Protein 80试剂盒，通过毛细管电泳在变性和还原条件下进行分析。将来自第一纯化步骤的等分试样(含有双特异性抗体和两种单特异性mAb)和最终产物的等分试样(含有纯化的κλ体)加载在等电聚焦(IEF)凝胶上，以评估最终纯化的双特异性抗体的纯度(不存在mAb污染)。聚集物水平通过SEC-UPLC测定。最后，使用Limulus Amebocyte Lysate测试(LAL；Charles RiverLaboratories)测试所有样品的内毒素污染。

实施例4：示例性CD47xPD-L1双特异性抗体的表征

CD47xPD-L1双特异性抗体(bsAb)通过将先前描述的CD47臂K2(＝Ka3臂，WO2014087248A2)与来自本发明的多种抗PD-L1臂配对而产生。所有bsAb均使用人IgG1Fc结构域重新格式化。

与重组人PD-L1的结合和交叉反应

通过夹心ELISA测定评估选定的CD47xPD-L1bsAb结合重组人PD-L1(ACROBiosystems)、食蟹猴PD-L1(Sino Biological)和小鼠PD-L1(内部产生)可溶性蛋白的能力。简言之，将在PBS中以5μg/ml稀释的山羊抗人Fc捕获抗体(JacksonImmunoResearch)，在4℃下O/N包被于MaxiSorp 96孔黑色板(Nunc)中。将板用封闭试剂(PBS缓冲液/BSA 3％/Tween 0.05％)在室温下封闭一小时。用PBS缓冲液-Tween 0.05％洗涤3次后，加入固定浓度的bsAb，并在室温下孵育一小时，再进行3次洗涤。洗涤后，添加渐增浓度的生物素化的人、食蟹猴或小鼠重组PD-L1蛋白，并在室温下孵育一小时。最后，与链霉亲和素-HRP孵育一小时后，加入Amplex red检测试剂，在室温下暗中孵育20分钟，并用读板器检测荧光信号。图1A显示与抗PD-L1基准阿替利珠单抗和阿维鲁单抗相比，选定的bsAb和mAb与人PD-L1的多种单价结合。图1B强调了所有测试的PD-L1臂都与食蟹猴PD-L1有交叉反应，而图1C显示其中只有一些PD-L1与小鼠PD-L1有交叉反应。

B.PD-L1特异性

示例性CD47xPD-L1 bsAb对PD-L1的特异性是通过ELISA评估它们与人PD-L2结合的不存在来确定的。人PD-L2与人PD-L1具有34％的序列同一性。通过夹心ELISA测定评估bsAb结合重组人PD-L2可溶性蛋白(ACROBiosystems)的能力。简言之，将在PBS中以5μg/ml稀释的山羊抗小鼠Fc捕获抗体(Jackson ImmunoResearch)，在4℃下O/N包被于MaxiSorp96孔黑色板(Nunc)中。将板用封闭试剂(PBS缓冲液/BSA 3％/Tween 0.05％)在室温下封闭一小时。用PBS缓冲液-Tween 0.05％洗涤3次后，加入固定浓度的bsAb，并在室温下孵育一小时。洗涤后，添加渐增浓度的生物素化人重组PD-L2蛋白，并在室温下孵育一小时。最后，与链霉亲和素-HRP孵育一小时后，加入Amplex red检测试剂，在室温下暗中孵育20分钟，并用读板器检测荧光信号。使用同型对照抗体作为阴性对照，市售的小鼠抗人PD-L2IgG(R&D系统)作为阳性对照。

如图1D中所示，测试的CD47xPD-L1bsAb均未与人PD-L2发生交叉反应。

C.PD-1/PD-L1对PD-L1转染的CHO细胞的阻断活性

在基于PD-1/PD-L1竞争性结合细胞的测定中评估CD47xPD-L1bsAb的PD-1阻断活性。将用Cell Trace Violet(Invitrogen)预染色的人PD-L1转染的CHO细胞(对人CD47呈阴性)与多种浓度的bsAb在室温下孵育1小时。作为检测试剂，添加人PD-1-moFc蛋白(ACROBiosystem，终浓度100ng/ml)和抗小鼠Fc AF647(Jackson ImmunoResearch)的混合物，在室温下持续3小时。最后，使用CellInsight^TM CX5 High Content Screening平台读取板。图1E显示选定的bsAb以多种效力单价阻断(即没有CD47共接合)PD-1和PD-L1之间的相互作用(表4)。将二价抗PD-L1阿替利珠单抗用作参考。

表4：选定的CD47xPD-L1双特异性抗体和抗PD-L1阿替利珠单抗对人PD-L1转染的CHO细胞的PD-1阻断效力

E.与CD47阳性肿瘤细胞的结合

使用人Raji(ATCC；CCL-86)和Nalm-6(ATCC；CRL-3273)肿瘤细胞系和CHO细胞(作为阴性对照)，通过流式细胞术研究了示例性CD47xPD-L1bsAb在细胞上的CD47结合。Raji和Nalm-6细胞系表达非常低水平或不表达PD-L1(表5)，允许评估bsAb的单价CD47结合。

将多种浓度的抗体与先前重悬于PBS/BSA 2％中的细胞一起在4℃下孵育15分钟。两次洗涤后，使用AF647缀合的抗人Fc F(ab′)2(Jackson ImmunoResearch)检测结合的抗体。在4℃孵育15分钟，然后进行2次洗涤步骤后，通过流式细胞术分析细胞。

表5：Raji和Nalm-6人肿瘤细胞系的细胞表面上PD-L1和CD47的目标密度

细胞系	起源	PD-L1结合位点	CD47结合位点
				Raji	伯基特淋巴瘤	700	44’000
Nalm-6	急性淋巴细胞白血病	<100	53’000

图2D和2E分别显示CD47xPD-L1 bsAb和二价抗CD47 5F9类似物的CD47臂在Raji和Nalm-6肿瘤细胞上的结合概况。两种肿瘤细胞系之间的结合概况是一致的。与高亲和力抗CD47 5F9类似物相比，CD47臂K2显示出如所预期的与肿瘤细胞的低结合。在CHO细胞上未观察到任何测试分子的结合(数据未显示)。

F.CD47/SIRPα对CD47阳性肿瘤细胞的阻断活性

在基于CD47/SIRPα细胞的竞争性结合测定中测定了示例性CD47xPD-L1bsAb的SIRPα阻断活性。将用Cell Trace Violet(Invitrogen)预染色的PD-L1-CD47⁺Nalm-6肿瘤细胞(表5)与多种浓度的bsAb和对照在室温下孵育1小时。作为检测试剂，添加人SIRP α-小鼠Fc蛋白(内部)和抗小鼠Fc AF647(Jackson ImmunoResearch)的混合物，在室温下3小时。最后，使用CellInsight^TM CX5 High Content Screening平台读取板。

在CD47单价接合后，与抗CD47 5F9类似物相比，bsAb以低效力诱导SIRPα阻断(表6)，这与其CD47结合特性一致(图2F)。

表6：示例性CD47xPD-L1双特异性抗体和抗CD47 5F9类似物对人PD-L1-CD47⁺Nalm-6肿瘤细胞的SIRPα阻断效力

G.与人红细胞(RBC)的结合

人RBC在其细胞表面表达CD47靶标，但不表达PD-L1，并且代表CD47靶向抗体的重要抗原库，影响其安全性和药代动力学特性。因此，通过流式细胞术评估携带相同低亲和力CD47 K2臂的选定CD47xPD-L1bsAb在人RBC上的结合，并与用作临床基准分子的抗CD47 5F9类似物进行比较。

从健康供体的全血中分离出RBC，重悬于PBS/BSA 2％中，并与多种浓度的抗体在4℃下孵育15分钟。两次洗涤后，使用AF647缀合的抗人Fc F(ab′)2(JacksonImmunoResearch)检测结合的bsAb。在4℃孵育15分钟并进行2次洗涤步骤后，通过流式细胞术分析细胞。

图3显示K2xS100和K2XS23 CD47xPD-L1bsAb和5F9类似物与人红细胞的代表性结合概况。正如预期的，基于其低亲和力CD47臂，bsAb显示出与红细胞非常弱的结合。

H.选定的双特异性抗体与PD-L1的结合亲和力

使用Bio-Layer Interferometry技术在30℃下测定选定的CD47xPD-L1bsAb与PD-L1重组蛋白的亲和力。使用OctetRED96仪器。水合并在动力学缓冲液(Sartorius，#18-1105；PBS、0.02％Tween20、0.1％BSA、0.05％叠氮化钠)中进行基线步骤后，用动力学缓冲液中1μg/mL的生物素化的人、食蟹猴或小鼠PD-L1重组蛋白(Acrobiosystems，分别为#PD1-H82E5、#PD1-C52H4和#PD1-M5220)将链霉亲和素生物传感器(Sartorius，#18-5019)加载5分钟。然后，将生物传感器浸入从28.6nM开始稀释倍数为2倍的连续稀释的bsAb中。分别监测结合和解离步骤600秒和900秒。在双参考曲线上、在完全结合和解离步骤上应用1：1全局拟合模型来测量亲和力。亲和力结果如表7中所示。

表7：选定的bsAb与重组PD-L1可溶性蛋白的结合亲和力

ND：未测定

I.与CD47/PD-L1双阳性肿瘤细胞的结合

使用用IFNg预激活的HT-1080肿瘤细胞系(ATCC；CCL-121)通过流式细胞术研究所选CD47xPD-L1bsAb与PD-L1⁺CD47⁺人肿瘤细胞的结合(表8)。CHO细胞系用作阴性细胞系。

将多种浓度的抗体与之前重悬于PBS/BSA 2％中的肿瘤细胞在4℃下孵育15分钟。两次洗涤后，使用AF647缀合的抗人Fc F(，ab′)2((Jackson ImmunoResearch)检测结合的抗体。4℃下孵育15分钟，然后进行2次洗涤步骤后，通过流式细胞术分析细胞。

表8：IFNg诱导24小时后HT-1080肿瘤细胞的细胞表面上PD-L1和CD47的目标密度

图4A显示了抗PD-L1mAb S79和S100的结合概况与抗PD-L1基准阿替利珠单抗和阿维鲁单抗相似。正如预期的，基于CD47和PD-L1共接合，bsAb表现出比抗PD-L1 mAb更高的结合力，这取决于它们对PD-L1的亲和力(K2xS23 bsAb比K2xS100对PD-L1具有较低的亲和力，如表7和图1A中所示)。

图4B显示了与CD47和PD-L1单价对照K2和S100相比的bsAb K2xS100的结合，突出了两个靶标的共接合在分子结合中的贡献。在CHO细胞上未观察到任何测试分子的结合(数据未显示)。

J.CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1对CD47和PD-L1阳性肿瘤细胞的阻断活性

与多种对照相比，在基于CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1细胞的竞争性结合测定中评估了选定的CD47xPD-L1 bsAb和抗PD-L1 mAb的SIRPα和PD-1阻断活性。简言之，将用IFNg诱导24小时(表8)并用Cell Trace Violet(Invitrogen)染色的PD-L1⁺CD47⁺HT-1080肿瘤细胞与多种浓度的抗体在室温下孵育1小时。作为检测试剂，添加人SIRPα-小鼠Fc蛋白(内部)或人PD-1-moFc蛋白(ACROBiosystem)和抗小鼠Fc AF647(Jackson ImmunoResearch)的混合物，在室温下持续3小时。最后，使用CellInsight ^TM CX5 HighContent Screening平台读取板。

如图5A和表9中所示，与抗PD-L1临床基准相比，抗PD-L1 mAbS100和S79以及K2xS100bsAb表现出改善的PD-1阻断作用。单价PD-L1对照S100的PD-1阻断显著降低显示K2CD47臂在K2xS100bsAb的有效阻断中的贡献。另一方面，由于PD-L1共接合，K2xS100 bsAb可以诱导优于单价CD47对照K2的SIRPαα阻断活性(图5B)。bsAb呈现双相SIRPα阻断曲线，其可能依赖于低bsAb浓度下与PD-L1的共接合，且一旦PD-L1靶标饱和，则主要依赖于最高浓度下的单价CD47阻断。由于该曲线型式，未确定SIRPα阻断效力。

表9：选定的CD47xPD-L1双特异性抗体和抗PD-L1 mAb对人PD-L1⁺CD47⁺HT-1080肿瘤细胞的PD-1阻断效力

抗体名称	PD-1抑制效力(IC50，pM)
		阿替利珠单抗	2.96
阿维鲁单抗	9.11
		K2xS100 bsAb	2.19
单价PD-L1对照S100	15.05
		S100抗PD-L1 mAb	0.84
S79抗PD-L1 mAb	2.52

实施例5：由靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体诱导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)

针对从ATCC获得的多种肿瘤细胞系评估本发明的选定抗CD47xPD-L1双特异性抗体通过ADCP或ADCC的体外杀伤活性，所述肿瘤细胞系预暴露于IFNg 24小时以诱导PD-L1表达(表10)。

表10：ADCP和ADCC测定中使用的IFNg诱导24小时后肿瘤细胞的细胞表面上PD-L1和CD47的目标密度

A.ADCP测定中的活性

该测定依赖于基于成像的方法，该方法利用CellInsight^TM CX5High ContentScreening平台。获得的吞噬作用指数定义为被100个巨噬细胞吞噬的靶细胞的平均数量。

1.巨噬细胞的制备：

通过Ficoll梯度从健康供体的血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞(PBMC)。通过在完全培养基(RPMI 1640、10％热灭活胎牛血清，Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、25mg/mL庆大霉素(均来自Sigma-Aldrich)和50mM 2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific)中，在20ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)存在下培养PBMC 7至9天来产生巨噬细胞。随后通过更换细胞培养基在分化期(第+1天)消除非贴壁细胞，并在第6天使用细胞解离缓冲液剥离代表巨噬细胞的贴壁细胞，并以每孔30′000个接种在96孔光学板(Costar)中。

2.吞噬作用活性的评估

粘附在微孔板孔上的巨噬细胞(用钙黄绿素红橙染色)与Calcein AM标记的靶标在不同浓度的测试抗体存在下以1：3的效应细胞：靶细胞比例于37℃共孵育2.5小时。孵育期结束时，用完全培养基替换上清液，并使用CellInsight^TM CX5 High Content Screening平台对微孔板进行成像。每孔获取并分析1500个巨噬细胞。吞噬作用证明为双阳性事件(巨噬细胞+靶肿瘤细胞)，并且吞噬作用指数由CellInsight^TM制造商的软件计算。

图6显示本发明的选定bsAb以剂量依赖性方式，以类似于或优于IgG1抗PD-L1基准阿维鲁单抗的活性诱导NCI-N87(A)和HT-1080(B)肿瘤细胞的吞噬作用。此外，如图6B中所示，K2xS100bsAb在增强HT-1080肿瘤细胞的吞噬作用方面比单价PD-L1对照S100或单价对照CD47 K2更有效。

B.ADCC测定中的活性

使用补充有10ng/mL重组hIL-2的RPMI/10％热灭活FCS，在37℃下将来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)活化过夜。第二天，用不同浓度的测试抗体调理靶癌细胞NCI-H226、NCI-N87或A375。将PBMC和调理后的靶细胞以50/1或25/1的效应子/靶标比例在圆底板中于37℃下共孵育6小时。然后将上清液转移至光学平底板中，并使用Roche的商业试剂盒通过用酶标仪测量OD来定量LDH释放。特异性裂解的百分比用以下公式计算：

图7显示本发明的选定bsAb以剂量依赖性方式诱导对NCI-H226(A)、NCI-N87(B)和A375(C)肿瘤细胞的多种杀伤，其具有相对于IgG1抗PD-L1基准阿维鲁单抗的K2xS94、K2xS96和K2xS100bsAb改进的活性。

实施例6：CD47xPD-L1双特异性抗体增强T细胞激活

通过在存在葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A(200ng/mL；SEA)的情况下将bsAbs的连续稀释物和抗PD-L1临床基准与来自健康供体的人PBMC孵育96小时来评估CD47xPD-L1 bsAbs增强T细胞激活的能力。通过ELISA(DuoSET ELISA R&D系统DY2020)测量上清液中人IL-2的产生，并用于测定T细胞激活。

结果显示，本发明的选定抗CD47xPD-L1双特异性抗体在与抗PD-L1阿替利珠单抗和阿维鲁单抗可比较的范围内有效增强T细胞激活(图8)。

实施例7：抗PD-L1 mAb S79在植入C57BL/6小鼠的MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤活性

将5x10⁵MC38肿瘤细胞皮下(s.c.)移植到8至10周龄雌性C57BL/6小鼠中。植入后八天，每3天用10mg/kg的IgG1抗PD-L1mAb S79或不相关的IgG1腹膜内处理携带MC38肿瘤的小鼠，总共3剂。

如图9中观察到的，IgG1抗PD-L1mAb S79显著延迟肿瘤进展，在第一次施用后几天和治疗期间诱导肿瘤生长的抑制。然后，停止治疗后一周左右肿瘤复发。

其他实施方案

尽管本发明已连同其详细说明进行了描述，但前述描述旨在举例说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围所限定。其他方面、优点和修改均在以下权利要求的范围之内。

序列表

<110> NOVIMMUNE SA

<120> 靶向CD47和PD-L1的双特异性抗体及其使用方法

<130> NOVI-047/001WO 322145-2971

<150> 63/317,892

<151> 2022-03-08

<150> 63/164,237

<151> 2021-03-22

<160> 210

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH2

<400> 2

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH3

<400> 3

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHCH IGHV3-23 hIgG1-AA

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 5

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHCH IGHV3-23 hIgG1-NT

<400> 5

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagttat 300

ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcacag tctcgagcgc ctccaccaag 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cagtctcgtg gaactcagga 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgactgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatctc gggaggagat gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacttgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaacg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaagt ccaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggttaa 1338

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH IGHV3-23 hIgG1-AA

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHCH IGHV3-23 hIgG1-NT

<400> 7

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagttat 300

ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcacag tctcgagc 348

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-1

<400> 8

Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser Phe

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-2

<400> 9

Ser Ser Asp Val Val Lys Asn Asn Phe

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-3

<400> 10

Ser Ser Asn Ile Ala His Lys Pro

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-4

<400> 11

Ser Val Asp Ile Ala His Lys Pro

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-5

<400> 12

Ser Ser Asp Val Ala Lys Ile Pro Leu

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-6

<400> 13

Ser Ser Asp Val Leu Arg Pro Pro Leu

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-7

<400> 14

Ser Ser Asp Val Phe Arg Pro Pro Leu

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL2-1

<400> 15

Ala Thr Asn

1

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL2-2

<400> 16

Phe Gly Ser

1

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL2-3

<400> 17

His Asp Asn

1

<210> 18

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL2-4

<400> 18

His Asp Thr

1

<210> 19

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL2-5

<400> 19

Phe Ala Ser

1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-1

<400> 20

Ala Ala Trp His Pro Tyr Tyr Thr Leu

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-2

<400> 21

Ala Ser Trp Trp Pro Tyr Gly Thr Val

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-3

<400> 22

Ala Ser Trp Trp Pro Phe Gly Thr Val

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-4

<400> 23

Ser Ser Trp Asp Met Pro Ala Leu Phe

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-5

<400> 24

Ser Ser Trp Asp Glu Pro Asp Arg Pro

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-6

<400> 25

Ser Ser Trp Asp Leu Pro Phe Leu Met

1 5

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-9

<400> 26

Ser Ser Trp Asp Asn Ala Gly Asp Gly His Val

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-10

<400> 27

Ser Ser Trp Asp Gln Ser Gly Asp Gly His Val

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-11

<400> 28

Ser Ser Trp Asp His Thr Gly Asp Gly His Val

1 5 10

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 29

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp His Pro Tyr Tyr

85 90 95

Thr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 30

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 30

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcacc cgtattacac gttgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360

ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420

ttctacccgg gagccgtgac agtggcttgg aaagcagata gcagccccgt caaggcggga 480

gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540

agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600

gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 31

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp His Pro Tyr Tyr

85 90 95

Thr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115

<210> 32

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S8_Sa10_1A9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 32

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcacc cgtattacac gttgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctg 357

<210> 33

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 33

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Trp Pro Tyr Gly

85 90 95

Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 34

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 34

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca tcgtggtggc cgtacggtac tgtgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360

ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420

ttctacccgg gagccgtgac agtggcttgg aaagcagata gcagccccgt caaggcggga 480

gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540

agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600

gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642

<210> 35

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 35

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Trp Pro Tyr Gly

85 90 95

Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115

<210> 36

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S9_Sa10_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 36

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca tcgtggtggc cgtacggtac tgtgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctg 357

<210> 37

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S37_ Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 37

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Trp Pro Phe Gly

85 90 95

Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 38

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S37_ Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 38

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca tcctggtggc cgttcggtac tgtgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360

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ttctacccgg gagccgtgac agtggcttgg aaagcagata gcagccccgt caaggcggga 480

gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540

agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600

gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642

<210> 39

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S37_ Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 39

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Asp Ser

20 25 30

Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Thr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Trp Pro Phe Gly

85 90 95

Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115

<210> 40

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S37_ Sa10_1D7_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 40

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca tcctggtggc cgttcggtac tgtgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctg 357

<210> 41

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S14_ Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 41

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Val Lys Asn

20 25 30

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

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Met Ile Tyr Phe Gly Ser Val Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

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Ser Gly Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

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Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Met Pro Ala

85 90 95

Leu Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 42

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S14_ Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 42

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgtt aagaataatt ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttggga gtgttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atatgcctgc gcttttcttc 300

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ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600

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<210> 43

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S14_ Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 43

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Val Lys Asn

20 25 30

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Gly Ser Val Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Met Pro Ala

85 90 95

Leu Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115

<210> 44

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S14_ Sh3_1C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 44

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgtt aagaataatt ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttggga gtgttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atatgcctgc gcttttcttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360

<210> 45

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S15_ Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 45

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Val Lys Asn

20 25 30

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Gly Ser Val Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Glu Pro

85 90 95

Asp Arg Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 46

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S15_ Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S15_ Sh3_1E2_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S17_ Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 49

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210 215

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S17_ Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S17_ Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 51

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Val Lys Asn

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<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S17_ Sh3_1D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 52

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgtt aagaataatt ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa acccatgatt tattttggga gtgttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atctcccttt ccttatgttc 300

ggcggrggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360

<210> 53

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S57_ Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

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210 215

<210> 54

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S57_ Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 54

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S57_ Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

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Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S57_ Sh3_2D9_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 56

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

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<210> 57

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S58_ Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

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<210> 58

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S58_ Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 58

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcaata gtcctagcag tgacgttgtt aagaataatt ttgtctcttg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttggga gtgttactgg tcctggggtt 180

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S58_ Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

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<213> 人工序列

<220>

<223> S58_ Sh3_1G5_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

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cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

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<213> 人工序列

<220>

<223> S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT

<400> 62

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA

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<212> DNA

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<223> S28_Sa2_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT

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<210> 65

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S30_ Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA

<400> 65

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala His Lys

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S30_ Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT

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ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgataatt ctcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcagccgctg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600

gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttca 654

<210> 67

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S30_ Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-AA

<400> 67

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Asn Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ser Arg

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 68

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S30_ Sa2_C10_VLCL2 aPDL1 IGLV2-44-NT

<400> 68

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgataatt ctcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcagccgctg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctg 369

<210> 69

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 69

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ile Ser Gly Ser Val Asp Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Thr Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 70

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 70

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtatta gtggtagcgt tgatatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacct ctactcctga tggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600

gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657

<210> 71

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-AA

<400> 71

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ile Ser Gly Ser Val Asp Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Thr Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 72

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S94_Sa2_G11_VLCL2 aPDL1 IGLV1-44-NT

<400> 72

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtatta gtggtagcgt tgatatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacct ctactcctga tggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctg 369

<210> 73

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S23_ Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 73

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Lys Ile

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Asn Ala

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 74

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S23_ Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 74

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

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tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg ataatgctgg tgatgggcat 300

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actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcttgga aagcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 75

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S23_ Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 75

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Lys Ile

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Asn Ala

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 76

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S23_ Sc3_1H4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 76

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgct aagattcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg ataatgctgg tgatgggcat 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctg 366

<210> 77

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S46_ Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 77

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Leu Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Asn Ala

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 78

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S46_ Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 78

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttctt aggcctcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg ataatgctgg tgatgggcat 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcttgga aagcagatag cagccccgtc 480

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agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 79

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S46_ Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 79

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Leu Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Asn Ala

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 80

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S46_ Sc3_1E4_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 80

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

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cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg ataatgctgg tgatgggcat 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctg 366

<210> 81

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S71_ Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 81

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Phe Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Gln Ser

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 82

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S71_ Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 82

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttttt aggcctcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atcagtccgg ggacggccat 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcttgga aagcagatag cagccccgtc 480

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agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 83

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S71_ Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 83

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Phe Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Gln Ser

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 84

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S71_ Sc3_2C6_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 84

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttttt aggcctcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atcagtccgg ggacggccat 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctg 366

<210> 85

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S79_ Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 85

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Phe Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp His Thr

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 86

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S79_ Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 86

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttttt aggcctcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atcacacggg cgatgggcat 300

gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcttgga aagcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 87

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S79_ Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-AA

<400> 87

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Phe Arg Pro

20 25 30

Pro Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Phe Ala Ser Leu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp His Thr

85 90 95

Gly Asp Gly His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 88

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S79_ Sc3_1G7_VLCL2 aPDL1 IGLV2-23-NT

<400> 88

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttttt aggcctcctc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattttgcta gtcttcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg atcacacggg cgatgggcat 300

gtcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctg 366

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47-CDRL1

<400> 89

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 90

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S93 IgG_Sa2_1F9-NT

<400> 90

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtgttt ctactagcga tcatatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacct ctcgtcctga tggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600

gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657

<210> 91

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S93 IgG_Sa2_1F9-AA

<400> 91

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Ser Thr Ser Asp His Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 92

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47-CDRL2

<400> 92

Ala Ala Ser

1

<210> 93

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S96 IgG_Sa2_H10-AA

<400> 93

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Asn Leu Pro Ser Ala Asp Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Val Val Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 94

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S96 IgG_Sa2_H10-NT

<400> 94

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcacc cgtattacac gttgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360

ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420

ttctacccgg gagccgtgac agtggcttgg aaagcagata gcagccccgt caaggcggga 480

gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540

agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600

gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642

<210> 95

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S96 IgG_Sa2_H10-AA

<400> 95

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Asn Leu Pro Ser Ala Asp Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Val Val Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47-CDRL3

<400> 96

Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro Lys Thr

1 5 10

<210> 97

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-7

<400> 97

Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr Trp Pro Ala Thr Glu Val

1 5 10

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL3-8

<400> 98

Ala Ala Trp Asp Phe Ser Arg Trp Pro Ala Thr Glu Val

1 5 10

<210> 99

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S100 IgG_Sa2_1E5-AA

<400> 99

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Thr Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 100

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S100 IgG_Sa2_1E5-NT

<400> 100

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgag aataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacta ctcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctg 369

<210> 101

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-8

<400> 101

Ser Asp His Ile Ala His Lys Pro

1 5

<210> 102

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-9

<400> 102

Ser Ala Asp Ile Ala His Lys Pro

1 5

<210> 103

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-CDRL1-10

<400> 103

Ser Ser Asn Ile Glu Asn Lys Pro

1 5

<210> 104

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-NT

<400> 104

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 180

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 300

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag atgcacccgc gcgccccgaa gaccttcggc 360

caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaa 708

<210> 105

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-AA

<400> 105

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro

85 90 95

Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 106

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-NT

<400> 106

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag atgcacccgc gcgccccgaa gaccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 107

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K2_KA3 VKCK aCD47 IGKV1-39-AA

<400> 107

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro

85 90 95

Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 108

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S93 IgG_Sa2_1F9-AA

<400> 108

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Ser Thr Ser Asp His Ile Ala His Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Ser Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 109

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S93 IgG_Sa2_1F9-NT

<400> 109

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtgttt ctactagcga tcatatcgct cataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacct ctcgtcctga tggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctg 369

<210> 110

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S96 IgG_Sa2_H10-NT

<400> 110

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcagg gatagttttg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctacgaata ttcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcacc cgtattacac gttgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctg 357

<210> 111

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dummy-LC1-NT

<400> 111

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc caatattgag actggttctg tatcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatg acagcctgcc tggatgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcttggaaag cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata a 651

<210> 112

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Dummy-LC1-AA

<400> 112

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Pro Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 113

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S100 IgG_Sa2_1E5-AA

<400> 113

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Lys

20 25 30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr His Asp Thr Thr Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ala Thr

85 90 95

Trp Pro Ala Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

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Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 114

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S100 IgG_Sa2_1E5-NT

<400> 114

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgag aataagcctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat catgatacta ctcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt tcgcgacgtg gccggctact 300

gaggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600

gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657

<210> 115

<400> 115

000

<210> 116

<400> 116

000

<210> 117

<400> 117

000

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<400> 118

000

<210> 119

<400> 119

000

<210> 120

<400> 120

000

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<400> 121

000

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<400> 122

000

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<400> 123

000

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000

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<400> 125

000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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<400> 149

000

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000

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000

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000

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000

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000

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000

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<400> 157

000

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<400> 158

000

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<400> 159

000

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<400> 160

000

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000

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<400> 162

000

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<400> 163

000

<210> 164

<400> 164

000

<210> 165

<400> 165

000

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<400> 166

000

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<400> 167

000

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000

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<400> 169

000

<210> 170

<400> 170

000

<210> 171

<400> 171

000

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<400> 172

000

<210> 173

<400> 173

000

<210> 174

<400> 174

000

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<400> 175

000

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000

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<400> 177

000

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<400> 178

000

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000

<210> 180

<400> 180

000

<210> 181

<400> 181

000

<210> 182

<400> 182

000

<210> 183

<400> 183

000

<210> 184

<400> 184

000

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<400> 185

000

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<400> 186

000

<210> 187

<400> 187

000

<210> 188

<400> 188

000

<210> 189

<400> 189

000

<210> 190

<400> 190

000

<210> 191

<400> 191

000

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<400> 192

000

<210> 193

<400> 193

000

<210> 194

<400> 194

000

<210> 195

<400> 195

000

<210> 196

<400> 196

000

<210> 197

<400> 197

000

<210> 198

<400> 198

000

<210> 199

<400> 199

000

<210> 200

<400> 200

000

<210> 201

<400> 201

000

<210> 202

<400> 202

000

<210> 203

<400> 203

000

<210> 204

<400> 204

000

<210> 205

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dummy-VL1-NT

<400> 205

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc caatattgag actggttctg tatcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatg acagcctgcc tggatgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 206

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Dummy-VL1-AA

<400> 206

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Pro Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 207

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DUMMY-LC2-NT

<400> 207

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gacggttaag aataatttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataacaact ggttgcccat caacccctat 300

accttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657

<210> 208

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DUMMY-LC2-AA

<400> 208

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Lys Asn Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Pro

85 90 95

Ile Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 209

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DUMMY-VL2-NT

<400> 209

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gacggttaag aataatttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataacaact ggttgcccat caacccctat 300

accttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaa 333

<210> 210

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DUMMY-VL2-AA

<400> 210

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Lys Asn Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Pro

85 90 95

Ile Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (31)

1.双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

i)重链，其包含

包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDRH1)；

包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDRH2)；和

包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDRH3)；

ii)第一轻链，其包含

包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDRL1)；或

包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDRL2)；和

包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDRL3)；和

iii)第二轻链，其包含：

a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3；或

b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDRL3；或

c)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨，基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDRL3；或

d)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRL3；或

e)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3；或

f)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDRL3；或

g)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

h)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDRL3；或

i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

j)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3；或

k)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3；或

l)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDRL3；或

m)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDRL3；或

n)包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

o)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

p)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；和

其中所述双特异性抗体含有包含i)和ii)的特异性结合CD47的第一抗原结合区和包含i)和iii)的特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)的第二抗原结合区。

2.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中所述第一轻链的至少一部分是κ型的并且所述第二轻链的至少一部分是λ型的。

3.根据权利要求2所述的分离的双特异性抗体，其中所述第一轻链包含至少κ恒定区。

4.根据权利要求3所述的分离的双特异性抗体，其中所述第一轻链进一步包含κ可变区。

5.根据权利要求3所述的分离的双特异性抗体，其中所述第一轻链进一步包含λ可变区。

6.根据权利要求2所述的分离的双特异性抗体，其中所述第二轻链包含至少λ恒定区。

7.根据权利要求6所述的分离的双特异性抗体，其中所述第二轻链进一步包含λ可变区。

8.根据权利要求5所述的分离的双特异性抗体，其中所述第二轻链进一步包含κ可变区。

9.根据权利要求2所述的分离的双特异性抗体，其中所述第一轻链包含κ恒定区和κ可变区，并且其中所述第二轻链包含λ恒定区和λ可变区。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是人抗体。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体。

12.组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

13.减少肿瘤细胞增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求12所述的组合物接触。

14.治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求12所述的组合物。

15.根据权利要求12所述的组合物用于治疗、预防与异常CD47表达或活性相关、或与异常CD47-SIRPα表达或活性相关的病理或延迟其进展的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述病理是癌症。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述实体瘤是或源自乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、间皮瘤、结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肾癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、食道癌、胆源性胃癌、前列腺癌或其组合。

19.抗体，所述抗体包含：

i)重链，其包含：

包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1；

包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2；和

包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3；和

ii)轻链，其包含：

a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3；或

b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDRL3；或

c)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDRL3；或

d)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRL3；或

e)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDRL3；或

f)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDRL3；或

g)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

h)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDRL3；或

i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

j)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3；或

k)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDRL3；或

l)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDRL3；或

m)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDRL3；或

n)包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

o)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；或

p)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的CDRL1；

包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDRL2；和

包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的CDRL3；和

其中所述抗体特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)。

20.根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是人抗体。

21.根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是IgG1抗体。

22.根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是F(ab)片段、F(ab′)2片段和Fv片段或单链Fv片段。

23.根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是单特异性的。

24.根据权利要求19所述的抗体，其中所述抗体是单价的。

25.组合物，其包含根据权利要求19-24中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

26.减少肿瘤细胞增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求25所述的组合物接触。

27.治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求25所述的组合物。

28.根据权利要求25所述的组合物用于治疗、预防与异常PD-L1表达或活性相关、或与异常PD-L1表达或活性相关的病理或延迟其进展的用途。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述病理是癌症。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述实体瘤是或源自乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、间皮瘤、结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肾癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、食道癌、胆源性胃癌、前列腺癌或其组合。