MX2014014187A - Agente terapeutico o agente profilactico para los trastornos cognitivos. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un novedoso agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos. Medios Da Solución: La invención proporciona un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en las proximidades de Ser413 de la SEC. ID NO: 1, y un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden como un ingrediente activo un péptido que se ha fosforilado en las proximidades de Ser413.

Description

i AGENTE TERAPÉUTICO O AGENTE PROFILÁCTICO PARA LOS TRASTORNOS COGNITIVOS Campo téenico La presente invención se refiere a un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos. Más específicamente, la invención se refiere a un novedoso anticuerpo anti-proteína o péptido fosforilados que tiene un excelente efecto para mejorar la función cognitiva, y a un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden el anticuerpo anti-tau fosforilada, o antígeno que provoca el anticuerpo anti-tau fosforilada. Antecedentes de la Técnica Un trastorno cognitivo es un estado en el cual la inteligencia desarrollada se deteriora debido a alguna causa adquirida, lo que constituye un obstáculo para la adaptación social. Los trastornos cognitivos se clasifican como enfermedades neurodegenerativas, trastornos cognitivos vasculares, enfermedades causadas por priones, enfermedades infecciosas, trastornos metabólicos/endocrinos, traumatismos y trastornos cerebrales y trastornos tóxicos (NPL 1). A partir de 2010, en la actualidad hay alrededor de 2,1 millones de pacientes con trastornos cognitivos en Japón, con una tasa de prevalencia de la morbilidad de alrededor de 8 a 10%, o incluso más de un 10%, entre las personas mayores de 65 años, y esto ha sido reconocido como un serio problema en la sociedad añosa mundial (NPL 2). Los datos sobre las enfermedades subyacentes de los trastornos cognitivos indican que la mayoría son enfermedades neurodegenerativas tales como la EA y DLFT, con aproximadamente 35% de la enfermedad de Alzheimer (EA), aproximadamente el 15% de una combinación de la EA y la enfermedad cerebrovascular, y 5% de las enfermedades neurodegenerativas tales como degeneración lobular frontotemporal (DLFT) (NPL 2). El trastorno cognitivo debido a la enfermedad neurodegenerativa se caracteriza por la aparición insidiosa del deterioro de la memoria y/o cambios en la personalidad que progresan durante un período de al menos 6 meses o más. Un factor constante en los procesos neurodegenerativos que exhibe un elevado grado de correlación con el grado de deterioro de la función cognitiva es la presencia de ovillos neurofibrilares (NFT) (NPL 3).

Tau (proteína) es una proteína codificada por el gen MAPT localizado en el cromosoma 17 (17q21) en los seres humanos, y es una de las proteínas de unión a microtúbulos que se expresan abundantemente en el sistema nervioso central. Tau se ha encontrado que es una proteína constituyente principal de los filamentos helicoidales apareados y filamentos rectos que forman NFT en la EA, una de las enfermedades neurodegenerativas más prominentes, y su acumulación intracelular se ha demostrado en una variedad de afecciones neuropatológicos. Las enfermedades causadas por la acumulación intracelular de tau se denominan colectivamente como "taupatías" (NPL 4). Las enfermedades neurodegenerativas que se incluyen entre las taupatías son la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración de los ganglios córtico-basales (CBD o CBS), parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, (demencia con granos argirófilos (enfermedad con granos argirófilos), taupatía sistemica múltiple con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI) y la degeneración lobar frontotemporal con inclusiones tau-positivas (FTLD-tau), pero las enfermedades no neurodegenerativas, que incluyen las enfermedades infecciosas tales como la enfermedad de Parkinson postencefalítica de von Economo y panencefalitis esclerosante subaguda, y las afecciones inducidas por trauma tales como encefalopatía del boxeador, también se incluyen entre la taupatías (NPL 4).

La estructura del gen MAPT en el genoma se encuentra que es una proteína que consiste en 13 exones, con múltiples isoformas debido al corte y empalme alternativo (NPL 4). Una característica de la estructura de la proteína tau es que comprende un dominio de carácter ácido con N-terminal que contiene 0-2 secuencias repetitivas (N) de 29 aminoácidos dependido del corte y empalme alternativo del exón 2 y el exón 3 (N0-N2), un dominio intermedio rico en prolina, y un dominio de unión a mícrotúbulos C-terminal (codificado por los exones 9 a 12) que contiene 3 (3R) o 4 (4R) secuencias repetitivas (R) que contribuyen a la unión a los mícrotúbulos (NPL 3 y 4). Por lo tanto, tau tiene 6 isoformas representativas, 3R0N (352 aminoácidos) · 3R1N (381 aminoácidos) · 3R2N (410 aminoácidos) · 4R0N (383 aminoácidos) · 4R1N (412 aminoácidos) y 4R2N (441 aminoácidos), en función del número de 29 secuencias repetitivas de aminoácidos (N) y las secuencias repetitivas de unión a mícrotúbulos (R) que contiene. De estos isotipos, sólo 3R0N está presente en el cerebro embrionario, mientras que todos los 6 isotipos están presentes en el cerebro humano adulto, con el tipo 4R que es el más abundante (NPL 3). La diferencia entre los isotipos 3R y 4R es ya sea que el exón 10 se elimine mediante corte y empalme alternativo (3R) o esté presente (4R). Existen varias ¡soformas de tau, por lo tanto, pero los números de aminoácidos (1-441) de la ¡soforma más larga 4R2N (SEC. ID NO: 1) están representados por la identificación de los números de los aminoácidos en las posiciones correspondientes. Por ejemplo, la designación "Ser413" indica la serina que es el residuo de aminoácido 413° en 4R2N (SEC. ID NO: 1), aunque esta serina es el residuo de amino ácido 384° en 4R1N (SEC. ID NO: 2), 355° en 4R0N (SEC. ID NO: 3), 382° en 3R2N (SEC. ID NO: 4), 353° en 3R1N (SEC. ID NO: 5), y 324° en 3R0N (SEC. ID NO: 6).

En cuanto al papel de tau en las enfermedades neurodegenerativas, se descubrió en primer lugar que existe una relación entre la mutación del gen MAPT y la acumulación de tau en la demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), con más de 40 diferentes mutaciones geneticas en el gen MAPT que se han reportado en la FTDP-17 (NPL 4). Se ha sugerido que dichas mutaciones genéticas pueden dar lugar a alteraciones en la proporción de isoformas de tau y cambiar la interacción de tau mutante con respecto a los microtúbulos, lo que contribuye a la creación de la patología. Sin embargo, a diferencia de las enfermedades neurodegenerativas familiares, las mutaciones en MAPT generalmente no se encuentran en las enfermedades neurodegenerativas esporádicas tales como la EA. Por otra parte, una de las características de acumulación de tau en las enfermedades neurodegenerativas es un alto grado de modificación mediante la fosforilación. Por otra parte, en los pacientes que presentan deterioro de la función cognitiva leve (MCI), se ve una correlación entre los niveles de tau fosforilada en el líquido cefalorraquídeo y la atrofia pituitaria, lo que sugiere a la tau fosforilada como un biomarcador altamente fiable para la neurodegeneración en pacientes con taupatías (NPL 5). Por esta razón, se ha intentado utilizar inhibidores de la enzima contra quinasas, y en particular GSK-3 beta, como las enzimas implicadas en la fosforilación, con el fin de inhibir la fosforilación de tau excesiva, y el desarrollo ha progresado en esta área (NPL 5). Sin embargo, debido a que las quinasas, tales como la GSK-3 beta son enzimas que están implicadas no sólo en la enfermedad, sino tambien en el control de la función en los procesos fisiológicos normales, los efectos secundarios han sido una fuente de preocupación. De hecho, dado que algunos de los sitios donde tau está fosforilada por la GSK-3 beta coinciden con los sitios de fosforilación de tau observados en los cerebros humanos normales y fetales (NPL 3), hay posibilidades de afectar a la función normal de tau.

La sabiduría convencional ha sido que las fugas de tau extracelular fuera de la célula como una consecuencia de la muerte celular de las neuronas degeneradas, pero la investigación reciente ha sugerido que después de la fosforilación intracelular excesiva, la tau se procesa y se secreta activamente fuera de la célula. La tau fosforilada secretada fuera de la célula se cree que se desfosforila en ciertos sitios de fosforilación, posteriormente que actúa sobre los receptores muscarínicos M1 y M3 de las células circundantes, y por lo tanto promueve la fosforilación de tau intracelular y que contribuye a provocar la muerte celular (NPL 6, NPL 7). Aunque el consenso es la construcción de que tau funciona como un factor con actividad extracelular, hay una creciente atención de sus posibilidades en los agentes terapéuticos, utilizando los componentes de drogas que son macromoléculas tales como los anticuerpos que no pueden causar fácilmente que presentan actividad intracelular. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la tau extracelularmente secretada se puede procesar parcialmente y puede volverse desfosforilada, lo que podría sufrir modificaciones adicionales más allá de la información estructural de la tau fosforilada en exceso que se ha focalizado en el pasado. Tambien se ha sugerido que los fármacos que actúan sobre porciones de tau desfosforilada pueden afectar la función de la proteína tau normal. Cuando la tau asociada con la patología se marca con anticuerpos o similares, que es aún más importante para seleccionar la entidad que actuará en un sitio dado específico de la patología, es decir, epítopo de fosforilación de tau, y la selección del epítopo se vuelve aún más difícil debido a la complejidad de esta información.

Las invenciones relacionadas con la ¡nmunoterapia para las taupatías con la proteína tau como el objetivo se han informado, se dirigen a la ejecución de medidas específicas contra tau (NPL 5, PTL 1 , PTL 2, PTL 3). La ¡nmunoterapia se lleva a cabo con el fin de provocar la producción de anticuerpos específicos mediante la administración de vacunas de péptidos y similares, y se espera reducir los efectos secundarios debido a su alta especificidad para proteínas o péptidos blanco. Se ha informado de que la función motora se mejora en modelos animales que expresan tau mutante, mediante la inmunización de los animales del modelo mediante la vacunación utilizando péptidos parciales de tau fosforilada (que tiene los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser396 y Ser404 fosforilados, y que tiene el residuo de aminoácido que corresponde a Ser262 fosforilado). Sin embargo, estos informes son los estudios que utilizan ratones transgénicos (ratones Tg) con mutaciones de genes inducidas tales como P301L (una mutación de prolina a leucina en el residuo de aminoácido 301° de tau), y aunque estos ratones Tg sirven como modelos de mutación de genes para FTDP-17, un tipo de enfermedad neurodegenerativa familiar, no representan a la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, entre tauopatías que no vayan acompañados de mutaciones génicas de tau, y las enfermedades neurodegenerativas particularmente esporádicas. Además, dado que los ratones P301Ltg son modelos de deterioro de la función motora y no son modelos que representan deterioro de la función cognitiva, que es el problema con los trastornos cognitivos humanos (NPL 8), es difícil saber si los resultados en estos modelos animales se pueden aplicar al tratamiento de trastornos cognitivos humanos. En PTL 4, se examinó el efecto del tratamiento da taupatía, mediante la administración de un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con el péptido tau que tiene Ser409 fosforilada. Sin embargo, las vacunas de péptidos son costosas, requieren altas dosis totales y requieren largos periodos de tiempo para exhibir sus efectos. Por otra parte, los efectos de las vacunas de péptidos y la reactividad de la respuesta inmune en los seres humanos y los animales administrados difieren de acuerdo con los antecedentes genéticos, y la producción de anticuerpos eficaz no siempre puede ser provocada en cada individuo. Por lo tanto, mientras que la inmunoterapia mediante la inmunización pasiva con anticuerpos tiene potencial, un número muy grande de sitios se fosforilan en tau, y no existe prácticamente ninguna información con respecto a que los anticuerpos para los sitios de fosforilación sean eficaces para su uso. Además, los anticuerpos actualmente disponibles no se pueden considerar en absoluto que tienen suficiente función para su uso en terapia, en base a sus efectos en modelos animales.

Por otra parte, cuando un anticuerpo se utiliza como un compuesto de base para un agente terapeutico o agente profiláctico es necesario tener en cuenta también la cantidad de anticuerpo utilizado para el tratamiento, con el fin de evitar efectos secundarios y minimizar los problemas de costo médico, y esto es especialmente importante en relación con la dosis para las enfermedades crónicas o enfermedades genéticas. Por ejemplo, la dosis para el tratamiento con ActemraR (tocilizumab), que es un anticuerpo anti-IL-6R humano, es de 8 mg por 1 kg de peso corporal durante 1 a 4 semanas, y la dosis para el tratamiento con SolirisR (eculizumab), el cual es un anticuerpo humanizado anti-complemento C5, es de 600-900 mg por adulto por administración, durante 2 a 4 semanas. Estos son anticuerpos superiores desarrollados por la selección de entre un gran número de anticuerpos, pero sus dosis son relativamente grandes en comparación con los fármacos de anticuerpos utilizados en la actualidad. Por lo tanto, un efecto debe ser exhibido con dosis iguales o inferiores a éstas, para fármacos de anticuerpos que se desarrollarán en el futuro. Además, mientras que el cerebro es el órgano a tratar en los trastornos cognitivos tales como la EA, la administración sistémica por vía intravenosa o subcutánea generalmente se cree que resulta en una baja tasa de migración del anticuerpo de la sangre al cerebro, debido a la presencia de la barrera hematoencefálica, y por lo tanto se espera que los anticuerpos utilizados para el tratamiento de trastornos cognitivos tengan efectos farmacológicos más bajos en comparación con el tratamiento para las enfermedades que afectan a otros órganos, y esto ha constituido un problema importante.

Los principales síntomas en los trastornos cognitivos humanos son deterioro de la memoria y deterioro de la función cognitiva, y dado que la función cognitiva es especialmente importante para la exposición de juicio basado en memoria, la comunicación y el rendimiento, los síntomas de los trastornos cognitivos son de gran importancia. La función motora, por otro lado, mientras que es un síntoma que se encuentra en la demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17) y la enfermedad de Alzheimer en etapa terminal, no es necesariamente un síntoma importante exhibido en los trastornos cognitivos. En consecuencia, la cuestión principal a considerarse en el tratamiento de los trastornos cognitivos es la mejora de la función cognitiva. En el momento actual, sin embargo, no hay medios de obtención de un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que exhiban una mejora superior en la función cognitiva, utilizando modelos animales adecuados para el deterioro de la función cognitiva asociado a taupatía que son necesarios para resolver el problema planteado anteriormente, ni tampoco existe ningún agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que exhiban un efecto específico y superior contra los trastornos cognitivos.

A la luz de estas circunstancias, por lo tanto, existe una demanda de un agente terapéutico o agente profiláctico con un efecto de gran alcance para mejorar la función cognitiva.

Referencia Bibliográfica Literatura de Patentes PTL 1: US8012936 PTL 2: WO2010/142423 PTL 3: WO2010/144711 Literatura distinta de la de patentes NPL 1: Kishimoto, T., Takahashi, S., STEP Series Seishinka, 2th Edition, P.103- 104, Kaibashobo, 2008 NPL 2: Asada, T, Igaku no Ayumi, supplementary volume, "Cognitive disorders", p.5-10, Ishiyaku Publishing, 2011 NPL 3: Alistair Burns, John O'Brien and David Ames, Dementia. 3o Edición, P.408-464, 2005 NPL 4: Arai, T, Shinkei Naika, Vol.72, special number, (Suppl.6), P.46-51, 2010 NPL 5: Wendy Noble et al., Expert Opin. Drug Discov., Vol.6, No.8, P.797-810, 2011 NPL 6: Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biologlcal Chemistry Vol.285, p.32539-32548, 2010 NPL 7: Venessa Plouffe et al., PLoS ONE Vol.7, p36873, 2012 NPL 8: Alistair Burns, John O'Brien and David Ames, Dementia. 3o Edición, P.459, 2005 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problemas a Resolver por la Invención Es un objetivo de la presente invención proporcionar un agente terapeutico o agente profiláctico para trastornos cognitivos, centrándose en la fosforilación de tau en taupatías.

Es otro objetivo de la invención proporcionar un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprendan como ingrediente activo un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específica para la tau fosforilada en un residuo de aminoácido que corresponde a la vecindad de Ser413, o un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la vecindad de Ser413 y se fosforila en al menos un residuo de aminoácido.

Es incluso otro objetivo de la invención proporcionar un anticuerpo monoclonal que tiene un alto efecto de la mejora de la función cognitiva, y un método para la preparación de un anticuerpo que es incluso más adecuado para el tratamiento del trastorno cognitivo, tal como un anticuerpo humanizado, basado en el análisis de la estructura del anticuerpo monoclonal.

Medios para Resolver los Problemas La presente invención es tal como se describe a continuación. La proteína tau de la invención incluye no sólo 4R2N, sino todos los 6 tipos de isoformas. Por conveniencia, las posiciones de los residuos de aminoácidos de acuerdo con la invención se identifican sobre la base de la SEC. ID NO: 1, y, por ejemplo, si el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 se menciona, esto se refiere a la 413° serina de la SEC. ID NO: 1 (4R2N), o la serina que es el residuo de aminoácido 384° de la SEC. ID NO: 2 (4R1N), la 355° de la SEC. ID NO: 3 (4R0N), la 382° de la SEC. ID NO: 4 (3R2N), la 353° de la SEC. ID NO: 5 (3R1 N) o la 324° de la SEC. ID NO: 6 (3R0N). (1 ) Un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la proteína tau representada por la SEC. ID NO: 1. (2) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con (1), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau fosforilada característica de los trastornos cognitivos. (3) El agente terapeutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con (1) o (2), en donde el anticuerpo participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se fosforila en uno o más sitios seleccionados de entre Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416. (4) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (3), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que, en la unión con la proteína tau, se une en la competencia con un anticuerpo que incluye VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26. (5) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (3), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que incluye VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26. (6) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (4), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se fosforila en el residuo de aminoácido que corresponde al sitio de Ser413. (7) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (6), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, una secuencia de CDR en la cadena H representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 7 a 13 o una secuencia de CDR en la cadena H que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NO: 7 a 13, y/o una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17, una secuencia de CDR en la cadena L representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 14 a 17 o una secuencia de CDR en la cadena L que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17. (8) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (7), en donde el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena H representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24 o una región variable de la cadena H que contiene una secuencia que tiene al menos 85% de homología con una cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24, y/o una región variable de la cadena L representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30 o una región variable de la cadena L que contiene una secuencia que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30. (9) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (8), en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. (10) Un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que contienen, como ingrediente activo, un péptido que incluye una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 410 - 421 de la SEC. ID NO: 1, al menos uno de los residuos de aminoácidos en el peptido está fosforilado. (11) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con (10), en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos fosforilados en el péptido corresponde a los residuos de aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 o Ser 416 de la SEC. ID NO: 1. (12) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con (10) u (11), en donde los residuos de aminoácidos fosforilados en el péptido incluyen al menos el residuo de aminoácidos correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. (13) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de (1) a (12), en donde el trastorno cognitivo es una taupatía. (14) El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con (13), en donde la taupatía es la enfermedad de Alzheimer, la degeneración de los ganglios córtico-basales, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia con granos argirofílicos (enfermedad con granos argirófilos), taupatía sistémica múltiple con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligad al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI) o degeneración lobar frontotemporal con inclusiones tau-positivas (DLFT-tau). (15) Un anticuerpo monoclonal que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con un péptido que comprende una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos números 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 en el peptido está fosforilado. (16) Un anticuerpo para la proteína tau fosforilada, el anticuerpo es uno cuya unión al antígeno es competitiva frente a un anticuerpo que incluye VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26. (17) Un anticuerpo para la proteína tau fosforilada, siendo el anticuerpo uno que incluye VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26. (18) Un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, una secuencia de CDR en la cadena H representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 7 a 13, o una cadena H incluida en la secuencia de CDR que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, y/o una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17, una secuencia de CDR en la cadena L representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 14 a 17, o una cadena L incluida en la secuencia de CDR que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17. (19) Un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de la cadena H representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24 o una región variable de la cadena H que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24, y/o una región variable de la cadena L representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30 o una región variable de la cadena L que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30. (20) El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de (15) a (19), en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. (21) Un péptido que consiste en una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de entre la secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos números 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, al menos uno de los residuos de aminoácidos en el péptido está fosforilado. (22) El péptido de acuerdo con (21), en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 está fosforilado. (23) El péptido de acuerdo con (21) o (22), en donde el residuo de aminoácido fosforilado es el residuo de aminoácidos correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1.

Efecto de la Invención La presente invención puede proporcionar un agente terapéutico o agente profiláctico para trastornos cognitivos, porque contiene como un ingrediente activo, un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con tau fosforilada en la proximidad del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, o un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos en la vecindad de la Ser413 de la SEC. ID NO: 1, al menos uno de los residuos de aminoácidos está fosforilado. La invención también puede proporcionar un anticuerpo monoclonal que tiene un alto efecto en la mejora de la función cognitiva, y un método para la preparación de un anticuerpo que es incluso más adecuado para el tratamiento del trastorno cognitivo, tal como un anticuerpo humanizado, basado en el análisis de la estructura de la monoclonal anticuerpo. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una lista de las porciones iniciales de secuencias de aminoácidos de las isoformas de la proteína tau humana, alineadas utilizando ClustalW.

La Figura 2 es un listado de las últimas porciones de secuencias de aminoácidos de las isoformas de la proteína tau humana, alineadas usando ClustalW.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la especificidad del anticuerpo policlonal de conejo para el péptido pSer413.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de ensayo en ratones modelo administrados con anticuerpo policlonal de conejo que reconoce pSer413.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de sonda en ratones modelo administrados con anticuerpo policlonal de conejo que reconoce pSer413.

La Figura 6 es un gráfico lineal que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo policlonal de conejo que reconoce pSer413.

La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo policlonal de conejo que reconoce pSer413.

La Figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de ensayo en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer413 (Ta1505).

La Figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de sonda en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer413 (Ta1505).

La Figura 10 es un gráfico lineal que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer413 (Ta1505).

La Figura 11 es un gráfico de barras que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer413 (Ta1505).

La Figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de ensayo en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer396 (TA9).

La Figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de sonda en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer396 (TA9).

La Figura 14 es un gráfico lineal que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer396 (TA9).

La Figura 15 es un gráfico de barras que muestra los resultados de una prueba de campo abierto en ratones modelo administrados con anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer396 (TA9).

La Figura 16 es un gráfico de barras que muestra los niveles de sinaptofisina del hipocampo en ratones modelo administrados con anticuerpo Ta1505.

La Figura 17 es un diagrama que representa un fragmento de gen que contiene el gen de tau.

La Figura 18 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de ensayo de laberinto de agua en ratones con deterioro en la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con anticuerpo Ta1505.

La Figura 19 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de sonda de laberinto de agua en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con anticuerpo Ta1505.

La Figura 20 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de ensayo de laberinto de agua en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con anticuerpo TA9.

La Figura 21 es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de sonda de laberinto de agua en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados anticuerpo TA9.

La Figura 22 es una fotografía que muestra inmunohistotinción del hipocampo región CA3 y región CA23 con anticuerpo Ta1505 en ratones con deterioro en la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con IgG de control (1mg/cabeza) o anticuerpo Ta1505 (1mg/cabeza).

La Figura 23 es una fotografía que muestra inmunohistotinción de la región de circunvolución del hipocampo con Ta1505 en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con IgG de control (1mg/cabeza).

La Figura 24 es una fotografía que muestra inmunohistotinción de la región de circunvolución del hipocampo con anticuerpo Ta1505 en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con anticuerpo Ta1505 (1mg/cabeza).

La Figura 25 es una fotografía que muestra inmunohistotinción del hipocampo región CA3 y región CA23 con AT8 en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con IgG de control (1mg/cabeza) o anticuerpo Ta1505 (1 mg/cabeza).

La Figura 26 es una fotografía que muestra inmunohistotinción de la región de circunvolución del hipocampo con AT8 en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con IgG de control (1 mg/cabeza).

La Figura 27 es una fotografía que muestra inmunohistotinción de la región de circunvolución del hipocampo con AT8 en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con Ta1505 (1mg/cabeza).

La Figura 28 es un gráfico que muestra la cantidad de G2, AT8, PHF1, y Ta1505 tau reactiva en TBS fracción soluble de cerebro en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con Ta1505 (1 mg/cabeza).

La Figura 29 es un gráfico que muestra la cantidad de G2, AT8, PHF1, y Ta1505 tau reactiva en la fracción soluble de sarcosilo del cerebro en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg) administrados con Ta1505 (1 mg/cabeza).

Mejor Modo de Llevar a cabo la Invención Los presentes inventores han preparado el anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la tau que se ha fosforilado en el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, que es el sitio específicamente fosforilado en la EA, se ha administrado a ratones Tg que exhiben deterioro de la función cognitiva asociado a la maduración, y han encontrado que la función cognitiva se puede recuperar hasta aproximadamente el mismo nivel que un grupo de control. Por otra parte, la mejora adecuada de la función cognitiva no se observó utilizando, para la comparación, una concentración comparable del anticuerpo para la tau que se ha fosforilado en el residuo de aminoácido correspondiente a Ser396 de la SEC. ID NO: 1, que tiene mayor afinidad por el antígeno equivalente que el anticuerpo de la invención. La porción en la proximidad del residuo de aminoácidos correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 es una región para la cual no hay información particular conocida en terminos de la relación entre la estructura y la función de tau, y fue un resultado completamente inesperado encontrar que un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con esta porción tiene un efecto tan poderoso en la mejora de la función cognitiva. Por lo tanto, el sitio en la vecindad del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 , que hasta ahora fue un foco de interés, primero se ha dilucidado por la presente invención como un sitio importante para la aparición del deterioro de la función cognitiva en tauopatías, y acto seguido la invención se ha completado.

Anticuerpo anti-tau fosforilada Tau (proteína), con el propósito de la invención, incluye no sólo la proteína tau humana como la representada por la SEC. ID NO: 1-6, sino tambien mutantes genéticos de los mismos. Como se ha explicado anteriormente en Antecedentes de la téenica, más de 40 mutaciones se conocen en FTDP-17, una enfermedad neurodegenerativa familiar asociada con el trastorno cognitivo, pero los sitios de mutación no se limitan necesariamente a las mismas. Además, las proteínas con mutaciones en los aminoácidos en 1 a 50 ubicaciones, preferentemente 1 a 30 localizaciones y más preferentemente de 1 a 10 localizaciones, como el número de mutaciones en las SEC. ID NO: 1-6, también se trata como tau con el fin de la invención. Además, las proteínas que exhiben al menos 80% de homología (identidad) con la proteína tau humana enumeradas como SEC. ID NO: 1 de acuerdo con el método BLAST (condiciones predeterminadas para NCBI PBLAST), y sus ¡soformas, también se incluyen. Dichas proteínas también incluyen tau de especies distintas de los seres humanos, tales como chimpancés, mono rhesus, caballo, cerdo, perro, ratón, conejo y rata, y se pueden utilizar para preparar agentes terapéuticos o agente profiláctico dirigidas a aquellas proteínas tau, con el propósito de mejorar la función cognitiva en estos animales.

Los números de aminoácidos de acuerdo con la invención, es decir, las posiciones de los residuos de aminoácidos, se designan en base a la secuencia indicada como SEC. ID NO: 1, por conveniencia. Así, por ejemplo, si el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 se menciona, se refiere a la serina que es el residuo de aminoácido 413° de la SEC. ID NO: 1 (4R2N), 384° de la SEC. ID NO: 2 (4R1N), la 355° de la SEC. ID NO: 3 (4R0N), la 382° de la SEC. ID NO: 4 (3R2N), la 353° de la SEC. ID NO: 5 (3R1N) o el 324° de la SEC. ID NO: 6 (3R0N). La Tabla 1 muestra las posiciones de los residuos de aminoácidos que se encuentran en las mismas posiciones recíprocas, para cada isoforma. En la Tabla 1, las posiciones de los residuos de aminoácidos para cada isoforma que se muestran corresponden a 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, y las relaciones posicionales recíprocas de los residuos de aminoácidos en otras posiciones serán fácilmente comprensibles sobre la base de la Figura 1 y la Figura 2, por ejemplo.

Tabla 1 El termino "anticuerpo anti-tau fosforilada" se refiere a un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con tau que se ha fosforilado en un residuo de aminoácido en uno o más lugares de la secuencia de aminoácidos de la proteína tau que se refiere anteriormente. Los residuos de aminoácidos fosforilados pueden ser serina (Ser), treonina (Thr), tirosina (Tyr), o similares. Además, el sitio en la tau fosforilada en el cual el anticuerpo anti-tau fosforilada de la invención participa en la reacción antígeno-anticuerpo es preferentemente el sitio que está específicamente fosforilado en las enfermedades neurodegenerativas tales como la EA. Además, como otro modo preferido para el sitio de la tau fosforilada en donde el anticuerpo anti-tau fosforilada de la invención participa en la reacción antígeno-anticuerpo, es preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 adnSer416 de la SEC. ID NO: 1, que es más preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con tau que se ha fosforilado en un residuo de aminoácido que corresponde a Ser412 o Ser413 de la SEC. ID NO: 1, o ambos sitios, y es incluso más preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con tau que se ha fosforilado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. Aquí, un residuo de aminoácido correspondiente a Ser412, Ser413, Thr414 o Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 se refiere al sitio que corresponde al número de aminoácidos en tau 4R2N humana (SEC. ID NO: 1), y como se explica en los Antecedentes de la Teenica, el sitio correspondiente en isoformas, o el sitio correspondiente en homólogos no humanos, se tratan de la misma manera independientemente del número de aminoácidos asignado a partir de esa secuencia de aminoácidos. Los sitios correspondientes en isoformas u homólogos se pueden determinar por una persona experta en la técnica a través del análisis adecuado mediante un método de alineamiento de secuencias por pares, tales como el método de Needleman-Wunsch o el método de Smith-Waterman, o mediante la alineación de secuencias múltiples, tales como el método ClustalW o el método PRRP. Un ejemplo de un método de análisis de un sitio correspondiente se muestra en la Figura 1 y la Figura 2, con las secuencias de aminoácidos (representación de una sola letra) de 6 ¡soformas diferentes en los seres humanos alineados utilizando ClustalW.Tal como se observa en la presente, la estructura en las proximidades de los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 se conserva en las 6 isoformas, y se puede discernir fácilmente que son los aminoácidos correspondientes.

Un anticuerpo anti-tau fosforilada que se puede utilizar en un agente terapéutico o agente profiláctico de acuerdo con la invención es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido presente de la posición 410 a la posición 421 de la proteína tau de la SEC. ID NO: 1, preferentemente es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1, más preferentemente es un anticuerpo que se une competitivamente contra un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos de VFI es la SEC. ID NO: 20 y cuya secuencia de aminoácidos de VL es la SEC. ID NO: 26 (en adelante denominada como "anticuerpo 1505"), e incluso más preferentemente es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio de Ser413. La proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1, o la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, es la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio correspondiente incluyendo ¡sotipos de seres humanos o de otras especies, tal como se mencionó anteriormente, pero más preferentemente es la proteína tau humana, e incluso más preferentemente es cualquiera de las 6 ¡soformas en los seres humanos.

En lo que se refiere a la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1 de la invención, la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondiente a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1, o la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, estas proteínas tau fosforiladas incluyen peptidos que tienen completa homología con porciones de las secuencias de aminoácidos de los residuos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 410 a 421 de la proteína tau, u homología con al menos 80% de las secuencias, y se fosforilan en estos residuos de aminoácidos, y un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con un péptido tal que es también un anticuerpo anti-tau fosforilada de acuerdo con la Invención.

De acuerdo con la invención, "participa en la reacción antígeno-anticuerpo" significa la unión con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser416 de la SEC. ID NO: 1 , y/o la proteína tau que se ha fosforllado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, con afinidad representada por una constante de equilibrio de disociación (KD) de al menos 1 x 10-6 M, preferentemente con una afinidad de unión representada por una constante de disociación de equilibrio de al menos 1 x 10 7 M, e incluso más preferentemente de unión con afinidad representada por una constante de de disociación de equilibrio de al menos 1 x 10-8 M.

El termino "específicamente" significa que la unión con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1 , la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 y/o proteína tau que se ha fosforilado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, se encuentra en estado que es al menos 10 veces más fuerte, más preferentemente al menos 30 veces más fuerte y aún más preferentemente al menos 100 veces más fuerte, que la unión con la proteína tau que no se ha fosforilado en ese sitio (incluyendo péptidos que tienen homología completa con una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína tau, o que tiene homología con al menos 80% de la secuencia).

Además, "se une competitivamente" con un anticuerpo VH cuya secuencia de aminoácidos es SEC. ID NO: 20 y cuya secuencia de aminoácidos de VL es la SEC. ID NO: 26 (anticuerpo 1505) se refiere a un fenómeno en el cual, cuando otro anticuerpo está copresente con el anticuerpo monoclonal durante la unión al antígeno, la unión del anticuerpo monoclonal se inhibe, y hablando en términos generales, se puede medir mediante la medición de la cantidad de adición (concentración) en la que se reduce la cantidad de unión del anticuerpo monoclonal al antígeno cuando un anticuerpo diferente se agrega en mayor o menor cantidad (concentración) con respecto a una cantidad fija (concentración) del anticuerpo monoclonal, el grado de inhibición se expresa como el valor de IC50 o K¡. Un anticuerpo que se une competitivamente con un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos de VH es la SEC. ID NO: 20 y cuya secuencia VL es SEC. ID NO: 26 (anticuerpo 1505) de acuerdo con la invención es uno que tiene un valor de IC50 menor que 1 mM, más preferentemente inferior a 100 nM e incluso más preferentemente menor que 10 nM, cuando la unión antígeno-anticuerpo se ha detectado utilizando 10 nM del anticuerpo monoclonal.

La unión anticuerpo-antígeno de dicho anticuerpo con la proteína tau fosforilada se puede determinar mediante la medición de unión apropiada por una persona experta en la téenica usando un sistema de fase líquida o fase sólida, con un método tal como ELISA, EIA, resonancia de plasmón superficial, FRET, LRET o similares, aunque no hay ninguna limitación a estos. Cuando en la medición de dicha unión antígeno-anticuerpo, el anticuerpo y/o antígeno (proteína tau fosforilada o proteína tau) está marcado con una enzima, sustancia fluorescente, sustancia luminiscente, isótopo radioactivo o similares, y un método de medición adecuado para determinar las propiedades físicas y/o químicas de la sustancia marcada se utiliza para permitir la detección de la reacción antígeno-anticuerpo.

El anticuerpo anti-tau fosforilada de la invención también incluye un anticuerpo en donde la región variable de la cadena H contiene las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que consisten en una combinación de las SEC. ID NO: 7 u 8 como la secuencia de aminoácidos de CDR-H1, cualquiera seleccionada de entre SEC. ID NOs: 9, 10, 11 y 12 como la secuencia de aminoácidos CDRH-H2 y la SEC. ID NO: 13 como la secuencia de aminoácidos CDRH-H3, y la región variable de la cadena L contiene las secuencias de aminoácidos de CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3, que consiste en una combinación de las SEC. ID NO: 14 ó 15 como la secuencia de aminoácidos de CDR-L1, la SEC. ID NO: 16 como la secuencia de aminoácidos de CDR-L2 y la SEC. ID NO: 17 como la secuencia de aminoácidos de CDR-L3. Preferentemente, es un anticuerpo en donde el conjunto de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 en la región variable de la cadena H es cualquiera selecciona de entre las combinaciones de: SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 9 y SEC. ID NO: 13; SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 9 y SEC. ID NO: 13; SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 10 y SEC. ID NO: 13; SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 12 y SEC. ID NO: 13, y SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 11 y SEC. ID NO: 13, el conjunto de CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 en la región variable de la cadena L es la SEC. ID NO: 14, SEC. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17; o SEC. ID NO: 15, SEC. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17, y más preferentemente es un anticuerpo en donde la combinación del conjunto de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 en la región variable de la cadena H y el conjunto de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 en la región variable de la cadena L se selecciona de entre las combinaciones de: SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 9, SEC. ID NO: 13, SEC. ID NO: 14, SEC. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17; SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 9, SEC. ID NO: 13, SEC. ID NO: 14, SEC. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17; SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 10, SEC. ID NO: 13, SEC. ID NO: 14, SEC. ID NO: 16 y SEC.

ID NO: 17; SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 12, SEO. ID NO: 13, SEC. ID NO: 14, SEO. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17; y SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 11, SEC. ID NO: 13, SEC. ID NO: 15, SEC. ID NO: 16 y SEC. ID NO: 17. El anticuerpo de la invención también incluye aquellos en donde al menos una de las correspondientes secuencias de CDR entre las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 es una secuencia que presenta al menos 85% de homología (identidad) y preferentemente al menos 90% de homología, con cualquiera de las SEC. ID NO: 7 al 17, de acuerdo con el método BLAST (condiciones predeterminadas para NCBI PBLAST).

El método para la identificación de la secuencia de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1 , CDR-L2 o CDR-L3 en el anticuerpo puede ser, por ejemplo, el método de Kabat o el método de Chothia, y un experto en la téenica puede identificar la secuencia de la porción correspondiente a cada CDR, los métodos de Kabat (Kabat, E.A. and Wu, T.T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991) y Chothia (Al-Lazikani, B., Lesk, A.M. and Chothia, C., J. Mol. Biol., 273,927-948, 1997) son el conocimiento técnico común para los expertos en el campo correspondiente, y sus resúmenes se pueden encontrar en el sitio web del Dr. Andrew C.R. Martin’s Group (http:bwww.bioinf.org.uk/abs/), por ejemplo.

Como una forma diferente del anticuerpo de la invención, puede ser un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) es una seleccionada de entre las SEC. ID NOs: 18 a 24 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) es una seleccionada de entre las SEC. ID NOs: 25 a 30, y preferentemente un anticuerpo en donde la combinación de las secuencias de aminoácidos VH y VL es una seleccionada de entre las combinaciones de: SEC. ID NO: 18 y SEC. ID NO: 25, SEO. ID NO: 19 y SEC. ID NO: 26, SEC. ID NO: 20 y SEC. ID NO: 26, SEC. ID NO: 21 y SEC. ID NO: 27, SEC. ID NO: 22 y SEC. ID NO: 28, SEC. ID NO: 23 y SEC. ID NO: 29, y SEC. ID NO: 24 y SEC. ID NO: 30. El anticuerpo de la invención incluye aquellas en donde al menos una de las secuencias de aminoácidos de VH y VL es cualquier secuencia de aminoácidos de VH enumeradas como SEC. ID NO: 18 a 24 o cualquier secuencia de aminoácidos de VL enumeradas como SEC. ID NO: 25 a 30, y las secuencias exhiben al menos 85% de homología (identidad) y preferentemente al menos 90% de homología con las SEC. ID NOs: 18 a 30 que basan en el metodo BLAST (condiciones predeterminadas para NCBI PBLAST).

Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes en dichos anticuerpos se seleccionan de entre los subtipos mamíferos IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, o sus variantes.

Una persona experta en la téenica puede diseñar anticuerpos recombinantes adecuados para la administración hacia el tratamiento de la especie de interés, tales como anticuerpos humanizados, basados en la información de las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y/o las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para ellos, o las secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 y/o las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para ellos, y una persona experta en la técnica también puede diseñar anticuerpos quiméricos de acuerdo para el propósito, sobre la base de información para la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H y/o la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica para ello, o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L y/o la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica para ella. Además, una persona experta en la téenica puede utilizar adecuadamente la tecnología conocida para la creación de anticuerpos de bajo peso molecular o anticuerpos de andamio, sobre la base de información para las secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y/o las secuencias de nucleótidos de genes que codifican para ellos, o las secuencias de aminoácidos de CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 y/o las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para ellas, o sobre la base de información para la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H y/o la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica para ello, o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L y/o la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica para ella.

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo compuesto por dos cadenas H y dos cadenas L, o puede ser un anticuerpo compuesto por sólo dos cadenas H. Además, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento de anticuerpo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos, incluyendo fragmentos F (ab ') 2, Fab y estructuras Fv.

El anticuerpo de la invención se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal (Milstein et al., Nature (Inglaterra), 6 de octubre de 1983, Vol.305, N° 55934, p.537-540). Por ejemplo, el anticuerpo policlonal se puede obtener utilizando como antígeno la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido que corresponde a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más puntos seleccionados de entre Ser412, Ser413, Thr414 y Ser416 de la SEC. ID NO: 1, la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio Ser413 de la SEC. ID NO: 1, o un peptido que tiene homología completa con al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de las posiciones 410 a 421 de la proteína tau de la SEC. ID NO: 1, o de homología con al menos 80% de la secuencia, y que se ha fosforilado en estos residuos de aminoácidos, para sensibilizar a un mamífero, y el anticuerpo recuperado a partir del suero del animal. Cuando el péptido se va a utilizar como antígeno, el antígeno se puede utilizar en una forma conjugada con una proteína portadora tal como BSA o KLH, o con polilisina. Los ejemplos específicos de péptidos para ser utilizados como antígenos incluyen los péptidos de la SEC. ID NO: 31 o 32 que se han fosforilado en el sitio correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1, tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2, pero no hay ninguna limitación a éstos. Para obtener un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, un hibridoma establecido mediante el uso de inmunocitos de un mamífero sensibilizado con el antígeno y fusionándolos con células de mieloma o similares, se puede clonar y el anticuerpo recuperar del cultivo. Un método para la obtención de dichos anticuerpos monoclonales se describe en el Ejemplo 2, y los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo pueden ser anticuerpos monoclonales que contienen las secuencias de aminoácidos VH de las SEC. ID NO: 18 a 24 y las secuencias de VL de las SEC. ID NO: 25 a 30 (Ta1501, 1502, 1505-1509), pero no hay ninguna limitación a los mismos.

Para el anticuerpo monoclonal obtenido, es posible obtener una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de gen que codifica para los aminoácidos de la proteína del anticuerpo, y es posible preparar el anticuerpo por teenicas de ingeniería genética utilizando dicha molécula de ácido nucleico. La introducción de modificaciones para aumentar la capacidad de unión o la especificidad de un anticuerpo, usando la información genética del anticuerpo, tal como la información para la cadena H, la cadena L o sus regiones variables o secuencias de CDR, y la preparación de anticuerpos que tienen una estructura adecuada para su uso en el tratamiento mediante la modificación un anticuerpo de un animal tal como un ratón a un anticuerpo de tipo humano, son técnicas que son bien conocidas por los expertos en la arte. Además, mediante el uso de animales transgénicos no humanos en los que un gen de anticuerpo humano se ha transferido, como los animales para la sensibilización con el antígeno, es posible obtener anticuerpos monoclonal de tipo humano. Además, las técnicas en las que se utiliza una genoteca de fagos que expresan la región de unión a antígeno de un anticuerpo humano o una porción del mismo (presentación de fagos de anticuerpos humanos) para obtener el anticuerpo que se une específicamente con el antígeno correspondiente, o un clon de fago que comprende una secuencia de aminoácidos específica, los anticuerpos humanos se prepararon a partir de esa información, se puede llevar adecuadamente a cabo por una persona experta en la técnica, como un método que no requiere la sensibilización de los animales. (Véase Taketo Tanaka et al., Keio J. Med., vol.60, p.37-46, por ejemplo).

Por otra parte, como el método mencionado anteriormente de producción de anticuerpos monoclonales, un hibridoma que produce el anticuerpo que se ha obtenido puede ser cultivado y el anticuerpo purificado y obtenido por métodos comunes desde el sobrenadante del cultivo resultante. Como un método diferente de producción, un gen que codifica para un anticuerpo, y más específicamente un gen que codifica para la cadena pesada de la inmunoglobulina y/o cadena ligera, se puede obtener a partir de un hibridoma que produce el anticuerpo de interes, o de un clon de fago o similares que se obtienen por una presentación en fagos de anticuerpo humano, y un vector para la expresión del gen preparado y transferido a las células huésped (células de mamíferos, células de insectos, microbios o similares) para producir el anticuerpo. Durante este procedimiento, una persona experta en la téenica puede llevar a cabo técnicas conocidas públicamente para la modificación génica del gen que codifica para la cadena pesada de la inmunoglobulina y/o la cadena ligera, para la introducción de rasgos deseados, o puede crear un anticuerpo de tipo humano, el anticuerpo de proteína quimera, anticuerpo de bajo peso molecular o anticuerpo andamio, el uso de información estructural de la región variable o CDR de la cadena pesada de la inmunoglobulina y/o cadena ligera. Además, con el fin de mejorar el rendimiento del anticuerpo o evitar los efectos secundarios, las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica se pueden emplear adecuadamente para la introducción de modificaciones en la estructura de la región constante del anticuerpo, o la modificación de sus porciones de cadena de azúcar.

Péptido fosforilado con secuencia de aminoácidos derivada de tau La invención abarca péptidos que contienen porciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína tau y que se ha fosforilado en uno o más residuos de aminoácidos. Un residuo de aminoácido "fosforilado" es uno que es un éster unido a un grupo fosfato en una cadena lateral del residuo de aminoácido, residuos de aminoácidos fosforilados típicos son serina, treonina y tirosina. El péptido fosforilado es un péptido con una longitud de al menos 8 aminoácidos que contienen al menos 3 aminoácidos contiguos entre la secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, preferentemente un peptido con una longitud de al menos 8 aminoácidos que contienen al menos 5 aminoácidos contiguos, y más preferentemente un péptido con una longitud de al menos 8 aminoácidos que contienen al menos 8 aminoácidos contiguos. Además, los residuos de aminoácidos fosforilados en los péptidos fosforilados pueden ser cualquiera de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos números 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, preferentemente cualquiera de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 y Ser416 de la SEC. ID NO: 1, y más preferentemente el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. Un ejemplo típico de dicho péptido fosforilado es el péptido fosforilado que se utiliza para la preparación de anticuerpos en el Ejemplo 1 (SEC. ID NO: 31), pero no hay ninguna limitación a éste.

Un péptido fosforilado que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de tau de acuerdo con la invención se puede usar en un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden el antígeno para la preparación de anticuerpos anti-tau fosforilada de acuerdo con la invención, o el propio péptido. El péptido fosforilado se puede modificar también con sustancias que proporcionan otras funciones, de acuerdo con el propósito, en el extremo N-terminal y/o C terminal de la secuencia. Por ejemplo, puede tener un residuo de metionina, ácido acetilo o piroglutámico añadido al extremo N-terminal del péptido fosforilado, o se puede modificar con una sustancia fluorescente o similares. Las sustancias utilizadas para modificar el extremo N-terminal y/o C-terminal del péptido fosforilado también pueden ser péptidos o proteínas, los ejemplos de los cuales incluyen péptidos con secuencias de aminoácidos de las secuencias de etiqueta apropiadas (típicamente etiqueta histidina o una etiqueta FLAG), la secuencia de reconocimiento de receptores de células T (TCR) o de los principales antígenos de histocompatibilidad (MHC), y las proteínas virales o bacterianas, o péptidos con secuencias derivadas de los mismos, que se agregan al extremo N-terminal o C-terminal. El péptido fosforilado de la invención incluye también los modificados con los compuestos o péptidos en uno o más residuos de aminoácidos distintos de en el extremo N-terminal o C-terminal. Dicha modificación de péptido fosforilado se puede lograr usando métodos conocidos por los expertos en la téenica, tales como el método descrito por Hermanson et al. (Bioconjugate techniques, USA, 1996, Academic Press).

El péptido fosforilado de la invención se puede producir por una persona experta en la técnica utilizando los métodos apropiados de síntesis o de ingeniería genética. Los ejemplos de métodos para la producción de péptidos fosforilados mediante la síntesis incluyen métodos BOC (Wakamiya T. et al., Chemistry Letters, Vol.22 P.1401, 1993), métodos Fmoc (PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol.40, P.134-140, 1992), y el método descrito en la Patente Japonesa N° 3.587.390, aunque otros métodos adecuados pueden ser implementadas por una persona experta en la técnica. Además, los métodos de producción mediante ingeniería genética pueden implicar la preparación de material genético (ADN, ARN) que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido a producirse o su precursor, y de insertar en un vector de expresión apropiado con la adición de una secuencia promotora y similares, para la introducción en un huésped adecuado para la expresión, o la producción utilizando un sistema de síntesis de proteínas libre de células. En este caso, el péptido fosforilado que se ha fosforilado en el sitio de interés se puede producir mediante la reacción de fosforilación adecuada en un huésped por una quinasa que se encuentra en el huésped o se induce mediante la expresión de ingeniería genética, o el péptido de interés se pueden recolectar primero y luego hacer reaccionar con quiinasa o similares in vitro para la reacción de fosforilación. Para dicha reacción de fosforilación in vitro, la enzima utilizada puede ser una cuya función en la reacción de fosforilación de tau mediante los péptidos de interés se conoce, tal como GSK3 o CDK5. Con el fin de obtener péptidos con los residuos de aminoácidos fosforilados de interés, entre los péptidos fosforilados que se han fosforilado de esta manera en un huésped o in vitro, se pueden utilizar métodos para la recuperación de péptidos fosforilados unidos específicamente al anticuerpo en la reacción anticuerpo-antígeno usando los anticuerpos anti-tau fosforilada se ha mencionado anteriormente.

Agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden el anticuerpo anti-tau fosforilada o el péptido tau fosforilada El término "trastornos cognitivos" para los seres humanos significa una condición de deterioro de la función intelectual que se ha desarrollado o adquirido, y se considera un tipo de perturbación intelectual (Kamijima, K., Niwa, S., Nankodo's Essential Well - Advanced Series, New Seishin Igaku, p.69-70, 2008), y en un sentido más amplio se consideran enfermedades que presentan alteraciones intelectuales y/o deterioro de la memoria. En las enfermedades neurodegenerativas tales como la EA, "neurodegeneración" puede ser comprobada mediante la confirmación de la presencia de ovillos neurofibrilares (NFT) mediante el análisis histológico post mortem, pero un médico puede llevar a cabo el diagnóstico de la enfermedad neurodegenerativa por la Escala de Demencia Hasegawa - Revisada (HDS-R) o Mlni Examen del Estado Mental (MMSE), con base en el Interrogatorio como parte de un examen neuropsicológico, mediante la Clasificación de la Demencia Clínica (CDR) o Escala de Clasificación para la Evaluación Funcional (FAST), que se basa en la observación, mediante el aumento de la abundancia de tau o tau fosforilada o el aumento de la abundancia de Ab en el líquido cefalorraquídeo, como examen bioquímico, o sobre la base de la información obtenida de la TC craneal, MRI craneal, SPECT o PET, como el examen de imágenes, para el diagnóstico de trastorno cognitivo y la enfermedad neurodegenerativa específicamente. Por lo tanto, el agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención se administran a un paciente diagnosticado con el trastorno cognitivo por un médico, y tiene un efecto de mejora en comparación con antes de la administración, de al menos un elemento de diagnóstico de la enfermedad neurodegenerativa, o un efecto de inhibición de la progresión de los síntomas o mantenimiento o recuperación del estado antes de la administración.

Las patentes que se administran con el agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención son pacientes con trastornos cognitivos, y especialmente los pacientes con taupatías, que incluyen pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración de los ganglios córtico-basales (CBD o CBS), parálisis progresiva supranuclear, enfermedad de Pick, demencia con granos argirofílicos (enfermedad con granos argirófilos), taupatía sistemica múltiple con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI), degeneración lobar frontotemporal con inclusiones tau-positivas (FTLD-tau), enfermedad de Parkinson postencefalítica de Economo y panencefalitis esclerosante subaguda o encefalopatía del boxeador. Por lo tanto, el agente terapéutico para los trastornos cognitivos de la invención es un agente terapéutico o agente profiláctico para taupatías, y desde un punto de vista diferente, puede ser considerado como un agente terapéutico o agente profiláctico para la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración de los ganglios córtico-basales (CBD o CBS), parálisis progresiva supranuclear, enfermedad de Pick, demencia con granos argirofílicos (enfermedad con granos argirófilos), taupatía sistémica múltiple con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI), degeneración lobar frontotemporal con inclusiones tau-positivas (FTLD-tau), enfermedad de Parkinson postencefalítica de Economo y panencefalitis esclerosante subaguda o encefalopatía del boxeador.

El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención también se pueden considerar que tienen el efecto de mejorar o inhibir la pérdida de la función cognitiva o el mantenimiento de la función cognitiva en animales no humanos. Dichos animales no humanos incluyen animales tales como chimpances, monos rhesus, caballos, cerdos, perros, ratones, conejos, ratas, gatos y similares que expresan tau con alta homología para tau humana, sin limitación a éstos.

Modelos animales para el trastorno cognitivo Los animales para la investigación en el agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención incluyen modelos animales para los trastornos cognitivos, entre los cuales los modelos animales de taupatías se pueden mencionar en particular. Los modelos animales para taupatías son animales que expresan gen muíante tau o de tipo normal en el cerebro, y en particular los modelos animales exhiben deterioro en la función cognitiva. Dichos animales que expresan gen mutante tau o de tipo normal en el cerebro se pueden preparar por ingeniería genética, siendo un ejemplo típico los ratones transgénicos (ratones Tg). Los modelos animales tales como ratones Tg que expresan el gen mutante tau son útiles como modelos de taupatías genéticas familiares, pero para el examen del efecto de un agente terapéutico o agente profiláctico para taupatías esporádicas que constituyen la mayoría de los casos entre los seres humanos, preferentemente un efecto se exhibe en ratones Tg que expresan tau de tipo normal. Los más adecuados como ratones Tg que expresan tau de tipo normal son ratones preparados en los ejemplos de producción de la presente invención, pero también pueden utilizarse los ratones Tg reportados por Kambe et al. (Neurobiology of Disease, vol.42, p.404-414, 2011) y Kimura et al. (The EMBO J. vol.26. P.5143-5152, 2007). Sin embargo, a pesar del deterioro de la función cognitiva que se observa en los ratones de Kambe et al. y Kimura et al., este aparece despues de 14 meses de edad y 20 meses de edad, respectivamente, y por lo tanto el inicio es bien en la senescencia y los efectos del envejecimiento también pueden ser factores contribuyentes, mientras que los efectos y el trabajo de reproducción a largo plazo también son problemas. En contraste, los ratones preparados en los ejemplos de producción de la presente invención expresan tau humana de tipo normal y exhiben el comienzo del deterioro de la función cognitiva en una fase relativamente temprana de alrededor de 6 meses de edad, y que por lo tanto son más adecuados como modelos para los trastornos cognitivos por lo cual los factores tales como el envejecimiento pueden excluirse, y el uso de dichos modelos permite una evaluación más precisa de los agentes terapéuticos o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que tienen efectos mejorados sobre la función cognitiva.

El método preferido para examinar el efecto de un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención en un modelo animal es un método de prueba de la función cognitiva, tal como una prueba de aprendizaje de memoria. Dicho método puede ser una prueba de laberinto de agua de Morris, una prueba de aprendizaje a través de etapas o una prueba de reconocimiento de objetos novedosa, pero preferentemente es una combinación de los ensayos de medición del comportamiento tales como una prueba de campo abierto, a fin de tener en cuenta las condiciones de cantidad, comportamiento y ansiedad animal.

Como métodos para examinar el efecto de un agente terapéutico o profiláctico agente para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención, es posible utilizar métodos de examen de los niveles de proteína tau o tau fosforilada en el tejido cerebral, durante la administración a un modelo animal del trastorno cognitivo. En la EA y otras enfermedades neurodegenerativas, los niveles de expresión de la proteína tau o tau fosforilada aumentada anormal están asociados con la patología (Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., Vol.7, p.654-664, 2010). Tambien es bien conocido que la reducción de la expresión de tau y los niveles de tau fosforilada anormales en algunos modelos patológicos de animales produce una mejoría en la función cognitiva y la función motora (K. Santa Cruz et al., Science, 30, Vol.9, p.476-481, 2005; Sylvie Le Corre et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 10, Vol.3, p.9673-9678, 2006). Como un método de examen de los cambios en la proteína tau o tau fosforilada, esto se puede lograr mediante un método tal como transferencia Western usando un homogeneizado de tejido cerebral, tal como se describe en los ejemplos, pero una persona experta en la téenica puede seleccionar otro método apropiado, tal como ELISA (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., Vol.286, p.34457-34467, 2011) o un método de inmunohistoquímica (David J. Irwin et al., BRAIN, Vol.135, p.807-818, 2012).

El efecto de un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención en un modelo animal se puede usar como datos de efectos farmacológicos para el desarrollo de un agente terapéutico o agente profiláctico en los seres humanos.

Agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos Una forma del agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención es uno que comprende el anticuerpo anti-tau fosforilada, y preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido correspondiente a las posiciones 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1 en la proteína tau, más preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se ha fosforilado en uno o más sitios seleccionados de entre los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 , más preferentemente un anticuerpo que se une competitivamente contra un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos VH es la SEC. ID NO: 20 y cuya secuencia de aminoácidos de VL es la SEC. ID NO: 26 (1505), e incluso más preferentemente un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se ha fosforilado en el sitio del residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. Dichos anticuerpos se explicaron anteriormente bajo el encabezado: Anticuerpo anti-tau fosforilada.

Otra forma del agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención es una que contiene un péptido que incluye una porción de la secuencia de tau y se ha fosforilado en uno o más residuos de aminoácidos, el péptido es un péptido fosforilado que es un péptido con una longitud de al menos 8 aminoácidos que contienen al menos 3 aminoácidos contiguos entre la secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos números 410-421 de la SEC. ID NO: 1, preferentemente un péptido con una longitud de por lo menos 8 aminoácidos que contienen al menos 5 aminoácidos contiguos, y más preferentemente un péptido con una longitud de al menos 8 aminoácidos que contienen al menos 8 aminoácidos contiguos. Además, los residuos de aminoácidos fosforilados en los péptidos fosforilados pueden ser cualquiera de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos números 410-421 de la SEC. ID NO: 1, preferentemente cualquiera de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1, y más preferentemente el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. Dichos peptidos se explicaron anteriormente bajo el encabezado Péptido fosforilado con la secuencia de aminoácidos derivada de tau.

El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención también pueden contener aditivos farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones con aditivos farmacéuticamente aceptables pueden prepararse mediante el método descrito en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Williams & Wilkins, 15 de diciembre de 2000". Una forma para dicho agente terapéutico o agente profiláctico es un medicamento líquido preparado por disolución, suspensión o emulsión en una solución acuosa aséptica o solución oleosa. Los disolventes para esto incluyen agua destilada para inyección y solución salina fisiológica, para soluciones acuosas, con adición de un agente de osmorregulción (por ejemplo, D-glucosa, D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares), utilizados a menudo en combinación con un auxiliar de disolución adecuado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol o polietilenglicol), o un tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80 o aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 50). Las soluciones oleosas también se utilizan a veces como disolventes, los ejemplos de dichas soluciones oleosas que incluyen aceite de sésamo y aceite de soja, que se utilizan a menudo en combinación con benzoato de bencilo, alcohol bencílico o similares como auxiliares de disolución. En dichos medicamentos líquidos, se usan a menudo aditivos apropiados tales como agentes reguladores (por ejemplo, agentes buffer fosfato y agentes buffer de acetato), agentes calmantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio y clorhidrato de procaína), estabilizantes (por ejemplo, albúmina de suero humano y polietilenglicol), conservantes (por ejemplo, ácido ascórbico, ácido eritórbico, y sus sales), agentes colorantes (por ejemplo, clorofila de cobre b-caroteno, rojo # 2 y azul # 1 ), agentes antisepticos (por ejemplo, ésteres de ácido paraoxibenzoico, fenol, cloruro de bencetonlo y cloruro de benzalconio), espesantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, y sus sales), estabilizadores (por ejemplo, sorbitol, manitol y albúmina de suero humano), y correctores del olor (por ejemplo, mentol y aromas cítricos ). Las diferentes formas de agentes terapéuticos o agentes profilácticos incluyen formulaciones sólidas tales como polvos, comprimidos, gránulos, cápsulas, píldoras, supositorios, pastillas de disolución bucal y similares. Para una formulación sólida para administrarse en forma oral, se pueden utilizar aditivos tales como excipientes (por ejemplo, celulosa cristalina, lactosa y almidón), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio y talco), aglutinantes (hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, macrogol y similares), y disgregantes (por ejemplo, almidón y carboximetilcelulosa cálcica). Si es necesario, se pueden usar aditivos tales como agentes antisépticos (por ejemplo, alcohol bencílico, clorobutanol, paraoxibenzoato de metilo y paraoxi benzoato de propiol), antioxidantes, agentes colorantes, endulzantes y similares. Otras formas alternativas incluyen agentes terapéuticos o agente profiláctico para la aplicación a membranas mucosas, dichas formulaciones que contienen a menudo aditivos tales como adhesivos sensibles a la presión, potenciadores sensibles a la presión, reguladores de la viscosidad, agentes espesantes y similares (por ejemplo, mucina, agar, gelatina, pectina, carragenina, alginato de sodio, goma de algarrobo, goma de xantano, goma de tragacanto, goma arábiga, quitosano, pululano, almidón ceroso, sucralfato, celulosa y sus derivados (tales como hidroxipropilmetilcelulosa), ásteres de ácidos grasos de poliglicerol, copolímeros de ácido acrílico-(met)acrilato de alquilo, o sus sales y esteres de ácidos grasos de poliglicerol), principalmente con el propósito de impartir propiedades de adsorción o de retención de la mucosa. Sin embargo, la forma, el disolvente y los aditivos para el agente terapéutico o agente profiláctico para administrarse al cuerpo no se limitan a éstos, y de manera apropiada la selección se puede ser realizar por una persona experta en la téenica.

El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención también abarcan el concepto de un agente terapéutico o agente profiláctico que comprenden sustancias existentes con efectos para inhibir el desarrollo de los trastornos cognitivos, además del anticuerpo anti-tau fosforilada antes mencionado o péptido fosforilado. Además, el agente terapéutico o profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención abarcan un kit para el uso combinado de un agente terapéutico o agente profiláctico que contiene el anticuerpo anti-fosforilación o péptido fosforilado y un agente terapéutico o agente profiláctico que contiene una sustancia existente con efectos de inhibición del desarrollo de los trastornos cognitivos. Los ejemplos de sustancias que inhiben el desarrollo de trastorno cognitivo incluyen, pero no se limitan a, donepezilo, galantamina, memantina y rivastigmina. La dosificación de la sustancia con un efecto para inhibir el desarrollo de los trastornos cognitivos que se va a agregar, o el agente terapéutico o agente profiláctico que contiene la sustancia con un efecto para inhibir el desarrollo de los trastornos cognitivos, puede ser una dosis comúnmente empleada para el tratamiento, que se puede variar de acuerdo con las afecciones.

También, mientras que los resultados de los ejemplos demuestran que el anticuerpo a utilizarse para llevar a cabo la invención exhibe un efecto de la droga al actuar sobre el cerebro a través de la barrera hematoencefálica, incluso cuando se administra periféricamente mediante la administración intraperitoneal, es posible preparar una formulación que suministra de forma eficaz un anticuerpo anti-tau fosforilada, que también se puede utilizar como un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de la invención, en el tejido cerebral, y dichas formulaciones también están abarcadas por el agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención. Se conocen métodos para suministrar eficientemente anticuerpos o péptidos al tejido cerebral a través de la barrera hematoencefálica, tales como los métodos de la adición de sustancias objetivo o métodos de encapsulación en liposomas o nanopartículas. Las sustancias que se utilizarán para la focalización incluyen aquellas que se someten a cambio total o parcial en características de carga por la unión con el anticuerpo, o péptidos, proteínas u otros compuestos que tienen una propiedad de unirse con un receptor o transportador específico. Los ejemplos de péptidos, proteínas u otros compuestos que tienen una propiedad de unirse con un receptor específico o proteína de membrana incluyen ligandos que se unen a ligandos de los receptores o proteínas de membrana, y sus análogos, y anticuerpos, compuestos agonistas/compuestos antagonistas/moduladores alostéricos que se unen a ligandos de receptores o proteínas de la membrana, y sus compuestos análogos. Los ejemplos de ligandos de receptores o proteínas de membrana como blanco para un péptido, proteína u otro compuesto que tiene la propiedad de unirse a un receptor o transportador específico incluyen el receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina (IR), receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP) y el receptor de toxina de la difteria (HB-EGF), sin ninguna limitación particular a estas (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., Vol.24, p.1759-1771, 2007). Una sustancia para marcar se puede agregar químicamente al anticuerpo a utilizarse para el agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con la invención, el método es uno que se puede llevar a cabo adecuadamente por una persona experta en la téenica con referencia a un conocido método tal como se describe en, por ejemplo, Hermanson et al., Bioconjugate techniques, USA 1996, Academic Press. La sustancia para marcar también se puede unir a liposomas o nanopartículas que encapsulan el anticuerpo o péptido (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, Vol.7, No.3, 2010). Además, cuando la sustancia para marcar es un péptido o proteína, que se puede producir como una proteína de fusión apropiada por una persona experta en la técnica usando técnicas de ingeniería genética, ya sea mediante la producción de un péptido de fusión mediante la síntesis química de péptidos, o mediante la combinación de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos para el anticuerpo o peptido para utilizarse.

Un agente para el tratamiento o prevención de acuerdo con la invención se puede administrar por vía oral o parenteral, con el fin de mejorar los síntomas. Para la administración oral, una forma de dosificación tal como granulos, polvo, comprimidos, cápsulas, medicamentos líquidos, jarabe, emulsión, agente de suspensión o elixir se puede seleccionar. Para la administración parenteral, un agente transnasal se puede preparar, y un medicamento líquido, suspensión o formulación sólida se puede seleccionar. Una inyección puede prepararse como una forma diferente para la administración parenteral, la inyección se selecciona como la inyección hipodérmica, inyección intravenosa, inyección de goteo, inyección intramuscular, inyección intracerebroventricular o inyección ¡ntraperitoneal. Otras formulaciones utilizadas para la administración parenteral incluyen supositorios, agentes sublinguales, agentes percutáneos y agentes de administración transmucosa distintos de los agentes transnasales. Además, la administración local intravascular es posible gracias a un modo de adición o de recubrimiento sobre un stent o obturador intravascular.

La dosis de un agente para el tratamiento o prevención de acuerdo con la invención variará en función de la edad, sexo, peso corporal y los síntomas del paciente, el efecto terapéutico, el método de administración, el tiempo de tratamiento, o los tipos de ingredientes activos en la composición médica, pero normalmente se puede administrar en el intervalo de 0,1 mg a 1 g, y preferentemente en el intervalo de 0,5 mg a 200 mg de compuesto activo por administración para adultos. Sin embargo, dado que la dosis variará dependiendo de una variedad de afecciones, dosis más bajas que las mencionadas anteriormente pueden ser suficientes, o dosis superiores a estos intervalos pueden ser necesarias.

El agente para el tratamiento o prevención de acuerdo con la invención puede presentar un efecto dentro de un período de administración corto. Ejemplos La presente invención se explicará ahora con mayor detalle por medio de ejemplos, con el entendimiento de que los ejemplos no son limitativos de la invención en modo alguno. Los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comite de Experimentación Animal de la Universidad de la Ciudad de Osaka, Abeno Campus.

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpo policlonal de conejo para el péptido pSer413 El antígeno utilizado para preparar un anticuerpo para el péptido pSer413 fue un péptido sintético (SEC. ID NO: 31, sintetizada por Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. [MBL]) que tiene Cys unida en el sitio C-terminal de la secuencia de aminoácidos que corresponde a la reglón de la Asn 410° a la Ser 416° de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 1 para la proteína tau humana, fosforilada en Ser correspondiente a la posición 413 (este péptido a continuación se referirá como péptido pSer413 (S)).

Péptido pSer413 (S): N-AsnValSer (pSer) ThrGIySerCys-C (SEC. ID NO: 31) Luego de la síntesis, el péptido pSer413 (S) se purificó con HPLC y se unió de forma covalente con KLH (hemocianina de lapa californiana). El conjugado obtenido se utilizó para la inmunización con 0,1 mg por dosis por conejo. Para la primera inmunización, 0,2 mi de solución de conjugado (concentración de conjugado: 0,5 mg/ml) se mezcló con una cantidad igual de adyuvante completo de Freund, y la zona dorsal de un conejo blanco japonés afeitado se inyecta por vía intradérmica en 8 lugares con 50 mI_ cada uno. Para la segunda y posteriores inmunizaciones, el adyuvante incompleto de Freund se utilizó para dos inmunizaciones más similares cada 2 semanas. A las 2 semanas después de la inmunización final, una muestra de sangre se tomó y la titulación de anticuerpos del suero se confirmó mediante ELISA utilizando un péptido conjugado inmunizado, y el animal se sacrificó después de 1 semana y se recogió la sangre total. Se preparó el suero de la sangre obtenida, y los anticuerpos se purificaron a partir del suero utilizando una columna de afinidad del péptido pSer413 (Af) (SEC. ID NO: 32).

La titulación del suero se confirmó mediante el siguiente método. El péptido pSer413 (S) se diluyó a 5 pg/ml con PBS, y luego se dispensó en una placa a 100 m?/rooNIo y se dejó reposar durante la noche a 4°C. Después de retirar la solución, buffer de bloqueo (MBL Co.) se dispensó a 250 pL/pocillo, y la placa se dejó en reposo durante la noche a 4°C. La serie de dilución para el suero de conejo preinmunización y el suero de conejo post-inmunización fue de 100, 500, 2.500, 12.500 y 62.500 veces, con una muestra diluida de PBS agregada a 100 pL/pocillo, y la reacción se realizó a 25°C durante 60 minutos. Después del enjuague, anti-lgG de conejo-peroxidasa marcada (producto de MBL) diluida 8.000 veces con buffer (MBL) se agregó a 100 pL/pocillo, y la reacción se realizó a 25°C durante 60 minutos. Después de enjuagar, se agregó solución colorante (MBL) a 100 pL/pocillo para la coloración durante 3 a 10 minutos, y después se agregó ácido sulfúrico 2N a 100 pL/pocillo para terminar la reacción. Luego se dio por terminada la reacción, se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 620 nm.

La reactividad del anticuerpo del anticuerpo purificado se confirmó mediante el metodo siguiente. El péptido pSer413 (L) [péptido pSer413 (S) (subrayado) que se extiende adicionalmente en las direcciones N-terminal y C-terminal (SEC. ID NO: 33, que se sintetiza mediante Biosíntesis Co.): ProArqHisLeuSerAsnValSer(pSer)ThrGlvSerlleAspMetValAsp-C1 o péptido Nonp (L) que tiene la misma secuencia de aminoácidos pero no fosforilada en el sitio correspondiente a Ser413 (SEC. ID NO: 34, sintetizada mediante Biosíntesis Co.) se diluyó a 1 m g/ml con PBS y luego se dispensó en un placa a 50 m L/pocillo, y se dejó reposar durante la noche a 4°C. Después de retirar la solución, el buffer de bloqueo (3% de BSA-PBS), se dispensó en 250 mL/pocillo, y la mezcla se dejó en reposo a 37°C durante 1 hora o más. El anticuerpo purificado se diluyó con PBS y se agregó en serie a 50 pL/pocillo, y la reacción se realizó a 25°C durante 90 minutos. Luego del enjuague, anti-lgG de conejo marcada con fosfatasa alcalina de cabra (Bioscience) se diluyó 2.000 veces con buffer de dilución (3% de BSA-PBS) y se agregó a 50 pL/pocillo, y la reacción se realizó a 25°C durante 60 minutos. Después de enjuagar, la solución colorante (2,5 mM de MgCl2-que contiene 0,1 M de solución buffer de dietanolamina, con 1 mg/ml de PNPP (paranitrofenil fosfato) agregado a pH 9,8) se agregó a 100 m?/roo?IIo para la coloración durante 30 minutos, y la absorbancia se midió a una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 550 nm. Resultados Tal como se muestra en la Figura 3, el anticuerpo purificado tenía una alta especificidad para el péptido pSer413 (L), mientras que prácticamente no se observó reacción con el peptido Nonp (L). Por lo tanto, el anticuerpo es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con pSer413 (L) (a lo largo de la presente memoria descriptiva, esto también puede ser denominado como "pSer413 marcado con anticuerpo policlonal de conejo" o "pS413AB").

Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo monoclonal para el péptido pSer413 (Serie TA15) El antígeno utilizado fue péptido sintético pSer413 (Im) (SEC. ID NO: 35), que tiene unido GlyCysSerGIy en el extremo N-terminal de la secuencia correspondiente a la región de la Thr 403° a la Pro 423°, fosforilada en el residuo de aminoácido que corresponde a Ser en la posición 413 de la secuencia de aminoácidos de la proteína tau humana representada por la SEC. ID NO: 1. Después de la síntesis, el péptido pSer413 (Im) se purificó con HPLC y se unió de forma covalente con KLH (hemocianina de lapa californiana). El conjugado obtenido se utilizó para la inmunización con 0,04 mg por dosis por ratón. La inmunización se realizó por inyección intraperitoneal en 10 ratones a 200 pL cada una de una mezcla de 0,4 mi de solución de conjugado (1,1 mg/ml en términos de péptido), 0,7 mi de solución salina y 1,1 mi de adyuvante completo de Freund. Tres inmunizaciones más similares (con la misma localización de inmunización y dosis de antígeno, usando adyuvante incompleto de Freund) se llevaron a cabo cada 2 semanas. Un mes después de la inmunización final, 100 mI de una solución de antígeno a 0,5 mg/ml (disuelta en solución salina) en términos de péptido se inyectó en la vena caudal de un ratón entre los diez que había aumentado la titulación de anticuerpos en suero para el antígeno, y al tercer día se sacrificaron los animales y se recuperaron los bazos. Dos agujas de inyección 18G se utilizaron para fraccionar los bazos, y los bazos fraccionados se trituraron suavemente con una superficie de tapón de goma. Los esplenocitos triturados se suspendieron en aproximadamente 10 mi de medio de RPMI 1640 frío, el sobrenadante se filtró con un colador de celulas de 40 miti, y el filtrado se recogió en un tubo de 50 mi. Los restos de células de bazo se trituraron adicionalmente con una superficie de tapón de goma, y se suspendieron de manera similar en medio de RPMI 1640 frío, se filtraron, y el filtrado se recolectó. Se agregó medio RPMI 1640 frío (o PBS frío) a un volumen final de 40 mi para la suspensión de células de bazo. La concentración de linfocitos en la suspensión se midió con un hemocitómetro, y los linfocitos en una cantidad final que corresponde a 2 x 107 células se transfirieron a un tubo de 50 mi. Para esto, se agregó un equivalente de 4 x 107 células de la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8 · U1 (P3 · U1) en la etapa de crecimiento logarítmico, que se habían cultivado en la solución de cultivo B (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + 2 mM de glutamina + 100 pg/ml de estreptomicina + 100 unidades/ml de penicilina), y después de de la centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante. El sedimento de células se dispersó completamente golpeando el tubo. A esto se agregó 0,5 mi de una solución de polietilenglicol (compuesto de RPMI 1640 (2,3 mi) + polietilenglicol 2000 (1,4 mi) + sulfóxido de dimetilo (0,3 mi), a continuación abreviado como "solución de PEG"), y las células se suspendieron suavemente. Después de 1 minuto, se agregó lentamente 0,5 mi de solución de PEG gota a gota durante un período de 1 minuto, 1,0 mi de RPMI 1640 se agregó lentamente gota a gota durante un período de 1 minuto, y se añadió lentamente a continuación, 2 mi de RPMI 1640 gota a gota durante un período de 2 minutos. Luego, 4 mi de HAT/solución de cultivo GIT (medio GIT [Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% de suero fetal bovino + 100 pg/ml de estreptomicina + 100 unidades/ml de penicilina + 95 mM + hipoxantina 0,4 mM de aminopterina + 16 mM de timidina) se agregó gota a gota durante un período de 2 minutos, y luego se agregó gota a gota 4 mi de HAT/solución de cultivo GIT durante un período de 2 minutos. Finalmente, se agregó HAT/solución de cultivo GIT para obtener 40 a 50 mi de suspensión celular. Luego de la incubación en un baño termostático a 37°C durante 30 minutos, la suspensión se sembró en 7 placas de cultivo (96 pocilios). Las placas de cultivo utilizadas fueron placas de 96 pocilios (placas de alimentación) en la que se habían cultivado macrófagos de la cavidad abdominal de ratón (ICR) (células alimentadoras) durante varios días (> 1 x 105/pocillo). Las placas se cultivaron a continuación durante 7 a 10 días a 37°C, 5% de CO2.

La mitad de la solución de cultivo se reemplazó con solución de cultivo HT fresca (HAT/solución de cultivo GIT sin aminopterina) una vez por semana, y se obtuvieron hibridomas.

El rastreo de anticuerpos se llevó a cabo mediante el siguiente método. El péptido pSer413 (L) se diluyó a 1 pg/ml con PBS, y luego se dispensó en una placa de 96 pocilios a 50 pL/pocillo y se dejó reposar durante la noche a 4°C. Luego de retirar la solución, el buffer de bloqueo (3% de BSA-PBS), se dispensó en 250 pL/pocillo, y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora o más. El buffer de bloqueo (3% de BSA-PBS) se aspiró, se agregó el sobrenadante de hibridoma a 30-50 pL/pocillo, y la reacción se llevó a cabo a 25°C durante 60 minutos. Después de enjuagar con solución salina amortiguada con fosfato que contiene 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween), anticuerpo secundario (una solución que contiene anti-lgG de ratón-anticuerpo Fe de cabra marcado con fosfatasa alcalina (SouthernBiotech), diluida 2.000 veces con buffer de bloqueo) se agregó a 100 m?/roaIIo, y la reacción se llevó a cabo a 25°C durante 60 minutos. Despues de enjuagar, la solución de sustrato (2,5 mM de MgCl2-que contiene 0,1 M de buffer de dietanolamina, con 0,7 a 1,2 mg/ml de PNPP (paranitrofenilfosfato) agregado a pH 9,8) se agregó a 100 pL/pocillo para la coloración a 25°C durante 60 minutos, después de lo cual se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 405 nm.

En esta rastreo, las células se recuperaron de los pocilios positivos y se contaron con un hemocitómetro, y luego se sembraron en una placa de 96 pocilios (la placa de alimentación anterior) en 1-3 células/pocillo, para la clonación mediante el método de dilución limitante (Ta1501, Ta1502, Ta1505-1509). Para el análisis posterior, los clones fueron masa cultivada y el anticuerpo se purificó con una columna de proteína G. Ta1505 es el mismo que Tal 505-2. Los isotipos se determinaron utilizando un kit de Abd Serotec.

El anticuerpo purificado se hizo reaccionar con una placa de ELISA recubierta con el péptido parcial que corresponde a los diferentes sitios de fosforilación de tau, para determinar la especificidad del grupo fosfato. El método fue el siguiente.

Una solución de DMSO al 10% de cada péptido tau (PS46 [SEC. ID NO: 36], pS199 [SEC. ID NO: 37], Ps202 [SEC. ID NO: 38], PT212 [SEC. ID NO: 39], Ps214 [SEC. ID NO: 40], pT212/pS214 [SEC. ID NO: 41], pT217 [SEC. ID NO: 42], pS413 [SEC. ID NO: 33], no pS413 [SEC. ID NO: 34]), o una solución de PBS de BSA-peptido conjugado (PS400 [SEC. ID NO: 43]-BSA, pS412 [SEC. ID NO: 44]-BSA) se diluyó a 1 pg/ml con PBS (pH 7) y se agregó a una placa de 96 pocilios (MaxiSorp: Nunc) a 50 mL/pocillo, y después se incubaron durante la noche a 4°C para la inmovilización. A continuación, la solución de péptido se separó y se lavó 3 veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20, después de lo cual se agregó 3% de BSA/PBS a 280 pL/pocillo y el bloqueo se realizó a 37°C durante 1 hora.

La solución de bloqueo se aspiró, el enjuague se realizó 3 veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20, y luego se agregó 1 pg/ml de cada serie solución de anticuerpo monoclonal TA15 en 3% de BSA-PBS a 50 pL/pocillo, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de enjuagar 3 veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20, 50 mI de anticuerpo anti-lgG de ratón de cabra marcado con fosfatasa alcalina (ThermoScience) diluido 2000 veces con PBS que contiene 3% de BSA se agregó, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de enjuagar 3 veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20, 100 pL de 1 mg/ml de solución de PNPP (fosfato de paranitrofenilo) disuelto en 0,1 M de dietanolamina (pH 10) se agregó, la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, y se midió la absorbencia a 405 nm. Los resultados de la evaluación de la reactividad de cada anticuerpo para cada péptido se muestran en la Tabla 2. La reactividad se evaluó en una escala de 3 niveles.

+: Reactividad, -: No reactividad ±: poca reactividad pero muy débil Tabla 2: Especificidad de la reacción de los grupos de fosfato respectivos de tau con respecto al anticuerpo obtenido Estos anticuerpos (denominados a continuación como "Serie TA15 ") se hicieron reaccionar sólo con pSer413 entre los peptidos examinados, y la especificidad de grupo fosfato fue extremadamente alta.

Ejemplo 3: Medición de la afinidad de unión del anticuerpo Serie TA15 Con el fin de evaluar la afinidad de unión entre los anticuerpos serie TA15 y péptido antígeno (péptido pSer413 (Im): véase el Ejemplo 2), un sistema de Resonancia de Plasmón Superficial Biacore (SPR) (BIACORE3000, código # BR-1100-45, por GE Healthcare, Japón) y cada producto Biacore se utilizaron para la medición de acuerdo con el manual del fabricante. Un método de medición utilizado fue un método de inmovilización (código # BR-1006-33) de anticuerpo anti-ratón (código # BR-1008-38) en un chip CM5 (capa carboximetildextrano-chip formado, código # BR-1100-1114) mediante enlace covalente a traves de la reacción de acoplamiento de amina, la unión del anticuerpo Serie TA15 al anticuerpo anti-ratón inmovilizado, y medir el comportamiento de unión del péptido antígeno al anticuerpo unido serie TA15.

La mezcla de reacción específicamente unida se utilizó con buffer HBS-EP (código # BR-T-1001-88), y el chip CM5 se activó mediante una solución mixta de clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Una solución de anticuerpo anti-ratón diluida a 0,001 mg/ml con 10 mM de buffer de acetato sódico a pH 5,0 se hizo reaccionar con 4 celdas de flujo en el chip, y después de unir covalentemente el anticuerpo antiratón al chip CM5, se sometió a bloqueo con etanolamina. De las 4 celdas de flujo de inmovilización de anticuerpos anti-ratón, un anticuerpo negativo atrapado (control de ¡sotipo lgG2a de ratón, código # MAB003, por R&D Systems), mientras que las otras celdas de flujo atraparon anticuerpo Serie TA15, a una densidad de alrededor de 1000 RU cada una. El buffer HBS-EP (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de surfactante P20) con adición de 1 M de NaCI se hizo reaccionar durante 3 minutos y el anticuerpo adsorbido no específico se eliminó, y luego el buffer HBS-EP se hizo reaccionar durante 10 minutos a un caudal de 50 pL/min para estabilizar la línea de base. El péptido se diluyó en serie con buffer HBS-EP a partir de una concentración de 100 pM a 5 mM (cerca de la constante de disociación de unión estimada [KD]), las soluciones de péptidos obtenida (5 concentraciones) se hicieron reaccionar durante entre 4 minutos y 6 minutos (uniforme) en intervalos de 6 minutos cada uno continuamente desde el nivel más bajo de concentración, y se midieron los comportamientos de unión.

Como los datos específicos de comportamiento de unión para el peptido antigénico, se obtuvieron los datos de unión de comportamiento para un péptido no fosforilado (péptido no pSer413) como un péptido negativo, y esto se resta de los datos de comportamiento de unión para el péptido antigénico, con el fin de eliminar los efectos del ruido producido por el procedimiento. No se observó unión del péptido no fosforilado a anticuerpo en las concentraciones de medición. Los datos específicos de comportamiento de unión se ajustaron con la Cinética de un solo ciclo 1:1, la unión con el modelo de desviación, utilizando el software del análisis Biacore (evaluación BIA: Análisis de Cinética de un solo ciclo, código # AP-4000-01), y la velocidad de asociación cinética (ka) y la velocidad de disociación (Kd) se obtuvieron simultáneamente (Karlsson, R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006). "Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors." Anal.Biochem. 349(1): 136-47). El valor de la constante de disociación de equilibrio (KD), como la medición de afinidad para los anticuerpos de la serie TA15, se calculó como kd/ka.

Resultados Tabla 3 De los anticuerpos de la serle TA15, se utilizó el anticuerpo Ta1505 con la afinidad más fuerte para el peptido antigénico en un ensayo de comportamiento utilizando ratones con deterioro de la memoria.

Ejemplo 4: Preparación de anticuerpo monoclonal que reconoce pSer396 y/o péptido pSer404 Como antígeno se utilizó un péptido sintético (SEC. ID NO: 47, sintetizada por Biosíntesis Co.) que tiene GlyCys unido al sitio N-terminal de la secuencia de la Arg 379° a la 408° Leu y fosforilado en los residuos de aminoácidos correspondientes a Ser en las posiciones 396 y 404 de la secuencia de aminoácidos de la proteína tau humana representada por la SEC. ID NO: 1 (en adelante, este péptido se referirá que tiene "péptido pSer396/pSer404").

Péptido pSer396/pSer404: N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyA spThr(pSer)ProArgHisLeu-C (SEC. ID NO: 47) Después de la síntesis del péptido pSer396/pSer404, se purificó mediante HPLC y se unió covalentemente a KLH activada por maleimida (hemocianina de lapa californiana) (Thermo Scientific). El conjugado obtenido se utilizó para la inmunización de ratones Balb/c con aproximadamente 0,04 mg por dosis por ratón. La inmunización se realizó por inyección intraperitoneal en 4 ratones a 100 m? cada uno de una mezcla de 0,3 mi de solución de conjugado (0,77 mg/ml en terminos de péptido) y 0,3 mi de adyuvante completo de Freund. Dos de los ratones se inmunizaron mediante la inmunización intraperitoneal (con la misma cantidad de antígeno, usando adyuvante incompleto de Freund) e inmunización en la plante del pie (antígeno + adyuvante Titer Max), mientras que los otros dos fueron inmunizados sólo por la inmunización intraperitoneal, y esto se repitió dos veces en intervalos de 2 semanas. Los ratones inmunizados mediante la inmunización intraperitoneal y la inmunización en la planta del pie, que había aumentado títulos séricos de anticuerpos para el antígeno, se inyectaron con solución de antígeno (disuelto en solución salina) a través de la vena caudal 15 días después de la inmunización final, y después de 3 días se sacrificaron los animales y se extrajeron los bazos. Dos agujas de inyección 18G se utilizaron para fraccionar los bazos, y luego los bazos fraccionados se trituran suavemente con una superficie tapón de goma. Los esplenocitos triturados se suspendieron en aproximadamente 10 mi de medio RPMI 1640 frío, el sobrenadante se filtró con un colador de células de 40 miti, y el filtrado se recolectó en un tubo de 50 mi. Los restos de células de bazo se trituraron adicionalmente con una superficie de tapón de goma, y se suspendieron de manera similar en medio RPMI 1640 frío, se filtraron, y el filtrado se recolectó. Se agregó medio RPMI 1640 frío (o PBS frío) a un volumen final de 40 mi para la suspensión de células de bazo. La concentración de linfocitos en la suspensión se midió con un hemocitómetro, y los linfocitos en una cantidad final que corresponde a 2 x 107 células se transfirieron a un tubo de 50 mi. Para ello se agregó un equivalente de 4 x 107 células de línea celular de mieloma de ratón P3 · U1 en la fase de crecimiento logarítmico, que se habían cultivado en la solución de cultivo B (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + 2 mM de glutamina + 100 pg/ml de estreptomicina + 100 unidades/ml de penicilina), y después de la centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante. El sedimento celular se dispersó completamente golpeando el tubo de ensayo. Una solución de 0,5 mi de PEG se agregó a la misma y las células se suspendieron suavemente. Después de 1 minuto, se agregó lentamente 0,5 mi de solución de PEG gota a gota durante un período de 1 minuto, 1,0 mi de RPMI 1640 se agregó lentamente gota a gota durante un período de 1 minuto, y se agregó lentamente a continuación, 2 mi de RPMI 1640 gota a gota durante un período de 2 minutos. Luego, 4 mi de HAT/solución de cultivo GIT (medio GIT [Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% de suero fetal bovino + 100 pg/ml de estreptomicina + 100 unidades/ml de penicilina + 95 mM + hipoxantina 0,4 mM de aminopterina + 16 mM de timidina) se agregó gota a gota durante un período de 2 minutos, y a continuación se agregó gota a gota 4 mi de HAT/solución de cultivo GIT durante un período de 2 minutos. Finalmente, se agregó HAT/solución de cultivo GIT para obtener 40 a 50 mi de suspensión celular. Luego de la incubación en un baño termostático a 37°C durante 30 minutos, la suspensión se sembró en 7 placas de cultivo de (96 pocilios). Las placas de cultivo utilizadas fueron placas de 96 pocilios (placas de alimentación) en la que se había cultivado macrófagos de la cavidad abdominal de ratón (ICR) (células alimentadoras) durante varios días (> 1 x 105/pocillo). Las placas a continuación se cultivaron durante 7 a 10 días a 37°C, 5% de CO2.

La mitad de la solución de cultivo se reemplazó con solución de cultivo HT fresca (HAT/solución de cultivo GIT sin aminopterina) una vez por semana, y se obtuvieron hibridomas.

El rastreo de anticuerpos monoclonales se llevó a cabo de la siguiente manera. Los antígenos de rastreo utilizados fueron pSer396/péptido pSer404-BSA, que tiene BSA conjugado al extremo N-terminal Cys del péptido pSer396/pSer404 (N-GlyCys- ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyA spThr(pSer)ProArgHisLeu-C) (SEC. ID NO: 47), y péptido no fosforilado-BSA, que tiene BSA conjugado al extremo N-terminal Cys de un péptido no fosforilado (N-GlyCys- ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulleValTyrLysSerProValValSerGIyAsp ThrSerProArgHisLeu-C) (SEC. ID NO: 48). El péptido no fosforilado-BSA o péptido pSer396/pSer404-BSA se diluyó a 1 g/ml con PBS, y luego se dispensó en una placa de 96 pocilios a 50 pL/pocillo y se dejó reposar durante la noche a 4°C. Después de retirar la solución, el buffer de bloqueo (3% de BSA-PBS), se dispensó en 250 pL/pocillo, y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora o más. El buffer de bloqueo (3% de BSA-PBS) se aspiró, se agregó el sobrenadante de hibridoma a 30-50 m?/roo?IIo, y la reacción se realizó a 25°C durante 60 minutos. Después de enjuagar con solución salina amortiguada con fosfato que contiene 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween), un reactivo de detección se agregó (una solución que contiene proteína A marcada con fosfatasa alcalina agregada, diluida 2.000 veces con buffer de bloqueo) en 100 m?/rooPIo, y la reacción se llevó a cabo a 25°C durante 60 minutos. Despues de enjuagar, la solución de sustrato (2,5 mM de MgCh-que contiene 0,1 M de buffer de dietanolamina, con 0,7 a 1,2 mg/ml de PNPP (fosfato de paranitrofenilo) agregado a pH 9,8) se agregó a 100 pL/pocillo para la coloración a 25°C durante 60 minutos, luego de lo cual se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 405 nm.

Las células se recuperaron de los pocilios que tenían baja reactividad con péptido no fosforilado-BSA y alta reactividad con péptido pSer396/pSer404-BSA, y se sembraron en una placa de 96 pocilios (la placa de alimentación anterior) en 1-3 células/pocillo, para la clonación mediante el método de dilución limitante. Los clones que producen anticuerpos TA9 (lgG3/K) se seleccionaron entre los mismos. Para el análisis posterior, los clones se cultivaron en masa y el anticuerpo se purificó con una columna de proteína G.

Al medir el valor KD del anticuerpo TA9 para el péptido pSer396/pSer404 mediante el método descrito en el Ejemplo 3, se encontró que es 1,08 x 10-10, con afinidad para el péptido que fue superior que los anticuerpos de la serie TA15. Ejemplo 5: Prueba de Comportamiento: Efecto de los anticuerpos obtenidos en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje Se examinaron los efectos de la administración de los siguientes tres anticuerpos en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje (Tau-Tg). (1) anticuerpo policlonal de conejo de reconocimiento de pSer413: ratones Tau-Tg (línea 609) o ratones no Tg (control normal), de 9-11 meses de edad, n = 9-10/grupo. (2) Ta1505 (anticuerpo monoclonal de reconocimiento de pSer413): ratones Tau-Tg (línea 784) o ratones no Tg, de 14 meses de edad, n = 9-10/grupo. (3) TA9 (anticuerpo monoclonal de reconocimiento de pSer396): ratones Tau-Tg (línea 609) o ratones no Tg, de 14 meses de edad, n = 9-10/grupo.

Para el experimento se utilizaron ratones Tau-Tg hetera mutantes machos (línea 609 o la línea 784), y los compañeros de camada no Tg,de 9-14 meses de edad. Los grupos se dividieron de manera que no hubo diferencia en el peso promedio entre los grupos. Los ratones Tau-Tg hetera mutantes se les administró anticuerpo diluido con PBS o buffer de citrato (pH 5), una vez por semana, por un total de 5 veces, en la cavidad abdominal a 1 mg por ratón por administración. Como un grupo de control negativo, el buffer utilizado para preparar el anticuerpo, o anticuerpo monoclonal de ratón IgG sin reactividad para tau, se administró en la cavidad abdominal a la misma dosificación. Como control positivo, a los compañeros de camada no Tg se les administró el buffer utilizado para preparar el anticuerpo, en la cavidad abdominal a la misma dosificación.

Las estructuras para los grupos (1 ) a (3) se muestran a continuación. (1) Ratones usados: Tau-Tg mutante (línea 609), de 9 a 11 meses de edad. Estructura de Grupo Evaluación del grupo de anticuerpos: 1 ,6 mg/ml de anticuerpo policlonal de conejo anti-tau pSer413 en PBS (n = 10) Grupo de anticuerpo control: PBS (n = 9) Grupo no Tg: PBS (n = 9) (2) Ratones usados: Tau-Tg mutante (línea 784), de 14 meses de edad.

Estructura de Grupo Evaluación del grupo de anticuerpos: 3,84 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-tau pSer413 Ta1505 en 0,1 M de buffer citrato (pH 5) (n = 10).

Grupo de anticuerpo control: 4,28 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti -Pseudomonas aeruginosa 4C10F4 en 0,1 M de buffer citrato (pH 5) (n = 9) Grupo no-Tg: 0,1 M de buffer de citrato (pH 5) (n = 9) (3) Ratones usados: Tau-Tg muíante (línea 609), de 14 meses de edad.

Estructura de Grupo Evaluación del grupo de anticuerpos: 2,66 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-tau pSer396 TA9 en 0,02 M de buffer de citrato (pH 6) (n = 10) Grupo de anticuerpo control: 4,50 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-Pseudomonas aeruginosa 6F11 en 0,02 M buffer de citrato (pH 6) (n = 9) Grupo no-Tg: 0,02 M de buffer de citrato (pH 6) (n = 9) Desde el lunes de la semana siguiente a la administración final, una prueba de memoria de referencia espacial se llevó a cabo utilizando un laberinto de agua de Morris (prueba de laberinto de agua). En el día despues de la finalización de la prueba del laberinto de agua, se utilizó un aparato de campo abierto para medir la cantidad de movimiento activo de los ratones (prueba de campo abierto).

Prueba de laberinto de agua: Lo mismo para los grupos (1) a (3) Preparación: Una piscina de color negro con un diámetro interior de 100 cm y una altura de 45 cm se llenó con agua hasta una profundidad de 16 cm. La temperatura del agua se ajustó a 21-23 grados, manteniendo de la transparencia incolora sin coloración con óxido de titanio o similares. No se añadió cloro, y después de cada día de prueba se eliminaron las heces y aproximadamente 10 L de agua se reemplazó.

Prueba de Ensayo (Adquisición): Una plataforma transparente de 15 cm de altura se sumergió en una posición de 20 cm de la pared (30 cm desde el centro). Con partición en 4 cuadrantes, incluyendo la ubicación en la que se sumerge la plataforma, los ratones se introdujeron al azar en uno de los 3 cuadrantes sin la plataforma. El límite para cada prueba fue de 60 segundos, con 5 ensayos que se realizaron por día. El intervalo entre las pruebas fue de aproximadamente 5 minutos. El "tiempo de escape" para alcanzar la plataforma se registró como datos. Los ratones que no escapan dentro de 60 segundos se dirigieron a la plataforma mediante la mano del operador, y el tiempo de escape se trató como 60 segundos. El ratón en la plataforma se retiró de la piscina después de 10 segundos y se lo dejó comportarse libremente hasta que la siguiente prueba, se le secó el cuerpo. Los resultados para cada ratón en cada día se registraron como la cantidad promedio de segundos durante los tiempos de escape de las 5 pruebas.

La prueba de adquisición se completó cuando los resultados para el grupo de control (noTg) estabilizados, y una prueba de sonda se llevó a cabo al día siguiente.

Prueba de Sonda: Al día siguiente al último día, la plataforma se retiró de la piscina y se fotografió la natación libre con una cámara de vídeo durante 60 segundos. Se observó el vídeo fotografiado, y el tiempo durante el cual los ratones que nadaron libremente nadaron en el cuadrante que había contenido la plataforma (cuadrante objetivo) entre los 4 cuadrantes, se midió y se expresó como un porcentaje de los 60 segundos. Durante este tiempo, también se analizó la natación hasta 30 segundos después de la introducción en la piscina.

La prueba importante para la prueba de ensayo (adquisición) se realizó mediante la medición repetida y PLSD de Fisher y la prueba significativa para la prueba de sonda se realizó mediante PLSD de Fisher.

Prueba de Campo Abierto: Lo mismo para los grupos (1 ) a (3) Aparato: Un tablero de acrílico transparente de 5 mm de espesor se utilizó para crear una caja cuadrada de 30 x 30 x 30 cm, y se almacenó en un entorno insonorizado. Una lámpara incandescente de 40 W se colocó sobre el entorno de almacenamiento y la cara del piso se irradió con una iluminancia de 110 lux.

Cantidad Comportamiento: (i) los rayos infrarrojos se establecieron en el exterior de los lados de la caja de acrílico en ubicaciones de 1,5 cm desde la superficie del suelo, a una distancia de 10 cm. Cuando el ratón continuamente bloquea 2 rayos se detectó la locomoción, y se contó. (ii) Las superficies de rayos infrarrojos se proporcionaron en ubicaciones de dos lados opuestos, 3,5 cm de la superficie del piso. Cuando el ratón bloqueó una porción de la superficie del haz, se detectó que se encontraba erguido en sus patas ( rearíng ) y se contó.

Prueba: Cada ratón se sometió a una sola sesión de 20 minutos. El ratón se introdujo en la sección central de la caja de acrílico y, al cerrar rápidamente la puerta para crear un entorno insonorizado, se inició la sesión.

Los primeros 10 minutos de la sesión fueron la actividad libre en condiciones de luz, mientras que para los últimos 10 minutos, la iluminación se interrumpió para la actividad libre en condiciones de oscuridad.

Análisis: La cantidad de comportamiento de cada ratón cada minuto se indicó en un gráfico de líneas, para la locomoción y el erguido sobre sus patas.

La percepción visual normal se definió como la reacción al cambio en el entorno en condiciones de oscuridad 10 minutos despues del inicio de la sesión, por lo cual el ratón exhibió un cambio en la cantidad comportamiento.

La cantidad de cada comportamiento bajo condiciones de luz y oscuridad, y la cantidad total de comportamiento durante 20 minutos, se representaron en un gráfico de barras.

Una prueba significativa se llevó a cabo entre los grupos, para determinar la cantidad total de comportamiento de la locomoción y el erguido sobre sus patas.

La locomoción es una importante cantidad de conducta espontánea, mientras que pararse sobre sus patas es un comportamiento exploratorio importante, pero de hecho ambos indicadores son mutuamente influyentes (ejemplo: incluso cuando la locomoción parece reducirse, si el erguido sobre sus patas se incrementa durante ese tiempo, entonces la cantidad comportamiento no puede decirse que se ha reducido).

Ensayo de inmunohistoquímica: sólo para el grupo (2) Al termino de la prueba de comportamiento, 5 ratones se seleccionaron de cada grupo y se fijaron por perfusión con formalina. Después de la incorporación en parafina, una rebanada delgada se preparó a partir del cerebro usando un micrótomo y se trató 4 veces con xileno y etanol cada 10 minutos, como tratamiento de desparafinación. A continuación, se hirvió durante 30 minutos en buffer de ácido cítrico (pH 6) (tratamiento activador de antígeno) y volvió a la temperatura ambiente, después de lo cual se lavó dos veces con solución salina fisiológica amortiguada con Tris (TS) durante 10 minutos. Después de bloquear durante 60 minutos a temperatura ambiente con TS que contenía 20% de suero bovino, anticuerpo de ratón anti-sinaptofisina humana (SVP-38 diluido 200 veces con TS que contiene 10% de suero bovino, por Sigma) se montó y el tratamiento se llevó a cabo durante la noche a 4°C. Despues de lavar dos veces con TS durante 10 minutos, anticuerpo anti-lgG de ratón marcado con FITC (el anticuerpo diluido 20 veces con TS que contiene 10% de suero bovino, por Vector) se montó, y el tratamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavar dos veces con TS durante 10 minutos, VECTASHIELD (Vector) se montó, y la observación se realizó con un microscopio. La intensidad de fluorescencia se cuantificó y se digitalizó con el NIH ImageJ, y se expresó en unidades arbitrarias.

Resultados 1. Los efectos de cada administración de anticuerpos en el deterioro de la memoria (1) anticuerpo policlonal de conejo pSer413 Los resultados para (1-1) a (1-3) se muestran en la Figura 4 a la Figura 7. Para resumir, la inmunización pasiva con anticuerpo policlonal anti-pSer413 mejoró notablemente el deterioro de la memoria en los ratones modelo (Tau-Tg) al mismo nivel que no Tg. En (1-3), no hubo diferencia significativa en el movimiento activo y la percepción visual se observó entre los grupos. (2) Anticuerpo monoclonal de ratón pSer413 (anticuerpo 1505) Los resultados para (2-1 ) a (2-3) se muestran en la Figura 8 a la Figura 11. Para resumir, la inmunización pasiva con anticuerpo monoclonal anti-pSer413 mejoró notablemente el deterioro de la memoria en los ratones modelo al mismo nivel que no Tg. En (2-3), no hubo diferencia significativa en el movimiento activo y la percepción visual se observó entre los grupos.

Sobre la base de los resultados de (2-1 ) y (2-2), se llegó a la conclusión de que el epítopo pSer413 es un epítopo satisfactorio como un objetivo de la terapia de inmunización pasiva, para ambos anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. (3) Anticuerpo monoclonal de ratón pSer396 (anticuerpo TA9) Los resultados para (3-1) a (3-3) se muestran en la Figura 12 a la Figura 15. Para resumir, la administración de TA9 mejoró significativamente el deterioro de la memoria al mismo nivel que no Tg. En (3-3), no hubo diferencia significativa en el movimiento activo y la percepción visual se observó entre los grupos.

Cuando TA9 se compara con Ta1505, sin embargo, se encontró que su efecto de droga es más débil. Aunque la afinidad de antígeno fue TA9 > Ta1505 (véase los Ejemplos 2 y 3), el efecto de la droga fue TA9 < Ta1505 (Ejemplo 5), lo que sugiere una diferencia significativa en el efecto del fármaco debido a las diferencias en la fosforilación del epítopo.

Ejemplo 6: Efectos de la administración de anticuerpos Ta1505 sobre la función neural Los efectos de la administración del anticuerpo Ta1505 en los niveles de sinaptofisina, conocido como un marcador que refleja la función neural, se examinaron mediante inmunotinción del anticuerpo anti-sinaptofisina en la región CA3 del hipocampo, que es un centro de la memoria. La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante NIH-lmage J.

Los resultados se muestran en la Figura 16. Con la administración del anticuerpo Ta1505 se observó recuperación en los niveles de sinaptofisina del hipocampo, aunque no en un grado significativo.

Ejemplo 7: Secuenciación de nucleótidos de anticuerpo monoclonal Serie TA15 ADNc (1) Purificación de ARN total hibridoma Los hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales se cultivaron, y 1 mi de ISOGEN se utilizó por pocilio de una placa de 6 pocilios para lisar las celulas. Después de la adición de 0,2 mi de cloroformo al lisado y mezclando con un vórtice, se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos. La centrifugación se realizó a 12.000 rpm, 4°C durante 10 minutos, y la capa superior se transfirió a un nuevo tubo. A continuación del agregado de 0,5 mi de alcohol isopropílico y la mezcla, la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se centrifugó a 15.000 rpm, 4°C durante 15 minutos para precipitar el ARN total. Después de la adición de 1 mi de etanol al 75% al sedimento y de mezclar exhaustivamente, se centrifugó a 10.000 rpm, 4°C durante 5 minutos. El sedimento se secó al aire, se disolvió en DNasa/RNasa libre de agua, y se almacenó a -80°C. (2) Obtención de la cadena H y la cadena L de ADNc por 5-RACE y 3'- RACE y secuenciación de nucleótidos de estos ADNc Los cebadores se sintetizaron por 5-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) y 3-RACE, sobre la base de las secuencias de ADNc conocidas de las regiones constantes de las cadenas H de lgG2b e lgG2a de ratón. Los cebadores se sintetizaron de manera similar para 5-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) y 3-RACE, sobre la base de la secuencia de ADNc de la región constante de la cadena L de ratón.

Por otra parte, se utilizó 1 pg de RNA total obtenido a partir de los hibridomas para la síntesis de ADNc para 5-RACE y 3-RACE utilizando un kit SMART-RACE (producto de Clontech), y 5-RACE y 3-RACE se llevaron a cabo. La reacción de PCR se llevó a cabo usando la mezcla de polimerasa Advantage 2 (Clontech), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los productos de PCR obtenidos por 5'-RACE y 3-RACE se sometieron a electroforesis en gel de agarosa, y el principal fragmento de ADN amplificado se cortó del gel de agarosa, se insertó en un vector de clonación TA (Invitrogen) y se utilizó para transformar E. coli, obteniendo varios clones. Los plásmidos se prepararon a partir de los transformantes por un método establecido, y se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado. (3) Obtención de ADNc de longitud completa de la cadena H y la cadena L y secuenciación de nucleótidos de estos ADNc Las secuencias de ADNc que codifican para el extremo N-terminal y C-terminal de la cadena H y la cadena L se determinaron sobre la base de la información de la secuencia de nucleótidos y cebadores directos e inversos se diseñaron para la amplificación de la secuencia de longitud completa. Estos cebadores se utilizaron para la amplificación de las longitudes completas de la cadena H y la cadena L utilizando Prime STAR MaxPCR (TaKaRa), y los fragmentos de PCR se clonaron en el vector pEF4. Esto se utilizó para la determinación final de las secuencias de ADNc de longitud completa.

La traducción para secuencias de aminoácidos se llevó a cabo sobre la base de la información de la secuencia de nucleótidos obtenida, e IgBLAST (NCBI, http:bwww.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) se utilizó para identificar las regiones de CDR mediante el método de Kabat (Kabat, EA y Wu, T.T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991).

Las secuencias de las regiones de CDR obtenidas se enumeran a partir de la SEC. ID NO: 14 en adelante.

La información relativa a las secuencias de CDR de anticuerpos que reconocen específicamente pSer413 se obtuvo a partir de la homología con estas secuencias (Tablas 4 a 6).

Tabla 4 Secuencias de aminoácidos CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de anticuerpos monoclonales Tabla 5 Secuencias de aminoácidos CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de anticuerpos monoclonales Tabla 6 Secuencias de aminoácidos VH y VL de anticuerpos monoclonales Ejemplo 8: Prueba de Comportamiento: Efecto de los anticuerpos obtenidos en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje Se examinó el efecto de la administración de los siguientes dos anticuerpos de memoria en ratones con deterioro de la memoria de aprendizaje, con una dosis de 0,1 mg. (4) Ta1505 (anticuerpo monoclonal de reconocimiento de pSer413-): ratones Tau-Tg (línea 784) o ratones no Tg, 10 meses de edad, n = 9-10/grupo (5) TA9 (anticuerpo monoclonal de reconocimiento de pSer396): ratones Tau-Tg (línea 784) o ratones no Tg, 11 meses de edad, n = 8-10/grupo Para el experimento se utilizaron ratones Tau-Tg hetera mutantes machos (línea 784), y sus compañeros de camada no Tg, 10-11 meses de edad. Los grupos se dividen de manera que no hubo diferencia en el peso promedio entre los grupos. Los ratones Tau-Tg hetera mutantes se administraron con anticuerpo diluido con PBS, una vez por semana, por un total de 5 veces, en la cavidad abdominal a 0,1 mg por ratón por administración. Como un grupo de control negativo, el PBS utilizado para preparar el anticuerpo, o el anticuerpo monoclonal IgG de ratón, sin reactividad para tau, se administró en la cavidad abdominal en la misma dosificación. Como un control positivo, a los compañeros de camada no Tg se les administró el PBS utilizado para preparar el anticuerpo, en la cavidad abdominal a la misma dosificación.

Las estructuras de los grupos (4) a (5) se muestran a continuación. (4) Ratones utilizados: Tau-Tg muíante (línea 784), a 10 meses de edad.

Estructura de Grupo: Grupo de anticuerpo de evaluación: 0,25 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-tau pSer413 Tal 505 en PBS (n = 10) Grupo de anticuerpo control: 0,25 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti -Pseudomonas aeruginosa 4C10F4 en PBS (n = 10) Grupo no Tg: PBS (n = 9) (5) Ratones utilizados: Tau-Tg muíante (línea 784), 11 meses de edad. Estructura de Grupo: Grupo de anticuerpo de evaluación: 0,25 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-tau pSer396 TA9 en PBS (n = 10) Grupo de anticuerpo control: 0,25 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-Pseudomonas aeruginosa 6F11 de anticuerpos en PBS (n = 8) Grupo no Tg: PBS (n = 8) Desde el lunes de la semana siguiente a la administración final, una prueba de memoria de referencia espacial se llevó a cabo usando un laberinto de agua de Morris (prueba del laberinto de agua). La prueba del laberinto de agua se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 5.

Resultados 1. Efectos de cada administración de anticuerpos en el deterioro de la memoria (4) anticuerpo monoclonal de ratón pSer413 (anticuerpo 1505) Los resultados de la prueba de ensayo (4-1 ) y la prueba de sonda (4-2) se muestran en la Figura 18 y la Figura 19. En resumen, la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales anti-pSer413 mejoró el deterioro de la memoria en los ratones modelo a un nivel de 50% o mayor en comparación con no-Tg.

Los resultados de (4-1 ) y (4-2) confirmaron un efecto del fármaco para el anticuerpo monoclonal epítopo pSer413 incluso a una dosis de 0,1 mg. (5) Anticuerpo monoclonal de ratón pSer396 (anticuerpo TA9) Los resultados para la prueba de ensayo (5-1 ) y la prueba de sonda (5-2) se muestran en la Figura 20 y la Figura 21. Para resumir, el deterioro de la memoria no se ha mejorado con la administración de TA9 a una dosis de 0,1 mg.

Estas pruebas sugieren aún más claramente una diferencia en el efecto del fármaco a una dosis de 0,1 mg, debido a las diferencias en la fosforilación del epítopo.

La administración de anticuerpo a 0,1 mg por ratón corresponde a la administración a una dosis de aproximadamente 2,5 mg/kg.

Ejemplo 9: Cambio en el nivel de Tau fosforilada en el cerebro mediante la administración del anticuerpo Ta1505 El efecto de la administración del anticuerpo Ta1505 en los niveles de tau fosforilada en los cerebros de ratones Tg-Tau se examinó por inmunohistotinción con anticuerpo Ta1505 que reconoce pSer413 y anticuerpo AT8 (epítopo pSer202/pThr205 que reconoce PHF), en la región del hipocampo, que son centros de la memoria.

Al termino de la prueba de comportamiento, 5 ratones se seleccionaron de cada grupo y se fijaron por perfusión con 4% de paraformaldehído/PBS. Los cerebros se removieron y embebieron en parafina, y rodajas finas de 5 pm se prepararon con un micrótomo. Después del tratamiento 4 veces con xileno y etanol durante 10 minutos cada vez, se realizó el tratamiento de desparafinación y las rodajas se someten a un tratamiento de ebullición (tratamiento activador de antígeno) durante 10 minutos a pH 2, a temperatura ambiente. Después de la restauración a temperatura ambiente, se enjuagaron dos veces con solución salina fisiológica HCI-Tris (TS) durante 10 minutos. El bloqueo se llevó a cabo a continuación durante 60 minutos a temperatura ambiente utilizando TS que contiene suero bovino al 20%.

Los anticuerpos anti-tau (Ta1505, AT8) diluidos a 1 pg/ml con TS que contiene suero bovino al 10% se montaron, para el tratamiento durante la noche a 4°C. Después de enjuagar dos veces con TS durante 10 minutos, el anticuerpo anti-ratón marcado con biotina (Vector Co.) diluido 500 veces con TS que contiene 10% de suero bovino se montó, para el tratamiento a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Después de enjuagar dos veces con TS durante 10 minutos, solución ABC marcada con HRP (Vector Co.) se montó para la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después del enjuague adicional, se realizó la coloración con diaminobencidina (DAB). Se encapsuló con Entellan (Merck) y se observó y fotografió.

Los resultados de inmunohistotinción con Ta1505 se muestran en la Figura 22 a la Figura 24.

Tal como se observa en la Figura 22, la tinción Tau-positiva Ta1505 se observó en la región CA3 del hipocampo (primera columna de la izquierda) y la región CA23 del hipocampo (segunda columna de la izquierda) en 5 individuos del grupo administrado con IgG control, sin embargo los niveles de tinción en la región CA3 del hipocampo (tercera columna de la izquierda) y la región CA23 del hipocampo (cuarta columna de la izquierda) en 5 individuos del grupo administrado con Ta1505 fueron claramente más bajos que los del grupo de administrado con IgG control. Esto confirmó que la administración de Ta1505 reduce Tau positiva para Ta1505, es decir, Tau fosforilada-Ser413, en la región CA3 del hipocampo y la región CA23 del hipocampo. Más específicamente, el grupo de IgG control mostró puntos marrones finos acumulados, tinción en una línea gruesa de izquierda a derecha en CA3. Con CA23, una curva gruesa teñida de la parte superior derecha hacia el lado izquierdo. El grupo administrado con Ta1505 tenía puntos marrones delgados muy finos, con una línea teñida gruesa de la parte superior izquierda hacia la parte inferior derecha en CA3. Con CA23, una curva gruesa teñida de la parte superior derecha hacia el lado izquierdo. Prácticamente no se observó ninguna tinción en cuatro regiones CA3 y tres regiones CA23.

En la Figura 23 y la Figura 24, tinción Tau-positiva de AT8 se observó en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal (primera columna de la izquierda en la Figura 23), Corteza Entorrinal Lateral (segunda columna de la izquierda en la Figura 23), y Corteza Entorrinal Media (tercera columna de la izquierda en la Figura 23)), para cinco individuos en el grupo administrado con IgG control. (Tinción en forma de puntos de color marrón en la Figura 23.) Los niveles de tinción en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal (primera columna de la izquierda en la Figura 24), Corteza Entorrinal Lateral (segunda columna de la izquierda en la Figura 24) y Corteza Entorrinal Media (tercera columna desde la izquierda en la Figura 24)), se redujeron claramente por debajo del grupo administrado con IgG control, por cinco individuos en el grupo administrado con Ta1505, a un nivel que no mostró tinción.

Esto confirmó que la administración de Ta1505 reduce Ta1505-Tau positiva, es decir, Tau fosforilada Ser413, en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal, Corteza Entorrinal Lateral, Corteza Entorrinal Media).

La tinción de puntos marrones está presente en la Figura 23, pero prácticamente no se pudo observar ninguna tinción de puntos marrones en la Figura 24.

La administración anticuerpo Ta1505 se confirmó para reducir los niveles de tau fosforilada en Ser413 en el cerebro (= región CA3 del hipocampo, región CA23 del hipocampo, PRh, Ent (Lateral, Media)).

PRh = Corteza Perirrinal Ent = Corteza Entorrinal Los resultados de inmunohistotinción con AT8 se muestran en la Figura 25 a la Figura 27.

Tal como se observa en la Figura 25, la tinción Tau positiva con AT8 se observó en la región CA3 del hipocampo (primera columna de la izquierda) y la región CA23 del hipocampo (segunda columna de la izquierda) en 5 individuos del grupo administrado con IgG control, pero los niveles de tinción en la región CA3 del hipocampo (tercera columna de la izquierda) y la región CA23 del hipocampo (cuarta columna de la izquierda) en 5 individuos del grupo administrado con Ta1505 fue claramente más baja que el grupo administrado con IgG control. Esto confirmó que la administración de Ta1505 reduce Tau positiva con AT8, es decir Ser202/Thr205-Tau fosforilada, en la región CA3 del hipocampo y la región CA23 del hipocampo. Más específicamente, en la Figura 25, el grupo de IgG de control muestra puntos marrones finos acumulados, tinción en una línea gruesa de la parte superior izquierda a la parte inferior derecha, con CA3. Con CA23, una curva gruesa teñida de la parte superior derecha hacia el lado izquierdo. El grupo administrado con Ta1505 tiene puntos marrones delgados muy finos, con una línea de tinción gruesa de la parte superior izquierda hacia la parte inferior derecha con CA3. Con CA23, una curva gruesa teñida de la parte superior derecha hacia el lado izquierdo.

En la Figura 26, la tinción con Tau positiva con AT8 se observa en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal (primera columna desde la izquierda en la Figura 26), Corteza Entorrinal Lateral (segunda columna desde la izquierda en la Figura 26), y Corteza Entorrinal Media (tercera columna de la izquierda en la Figura 26)), para cinco individuos en el grupo administrado con IgG control. (Tinción en forma de puntos de color marrón en la Figura 26.) En la Figura 27, los niveles de tinción en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal (primera columna desde la izquierda en la Figura 27), Corteza Entorrinal Lateral (segunda columna desde la izquierda en la Figura 27) y Corteza Entorrinal Media (tercera columna desde la izquierda en la Figura 27)) se reducen claramente por debajo del grupo administrado con IgG de control, para cinco individuos en el grupo administrado con Ta1505. (Tinción como puntos marrones finos en la Figura 27).

Esto confirmó que la administración de Ta1505 reduce Tau positiva con AT8, es decir, Ser202/Thr205 Tau fosforilada, en las regiones de la corteza (Corteza Perirrinal, Corteza Entorrinal Lateral, Corteza Entorrinal Media).

La administración del anticuerpo Ta1505 se confirmó que tiende a reducir los niveles de tau fosforilada Ser202/Thr205 que reconoce AT8 en el cerebro (= región CA3 del hipocampo =, región CA23 del hipocampo, PRh, Ent. (lateral, media)).

Este resultado proporciona apoyo que la administración de anticuerpos mejora la patología en el cerebro y tiene un efecto de mejora para el deterioro de la memoria. Los resultados indican que el anticuerpo administrado por vía intraperitoneal actúa en el cerebro.

Ejemplo 10: Efecto de la administración del anticuerpo Ta1505 en los niveles de tau en el cerebro La utilización del anticuerpo AT8, que se cree que reconoce Tau hiperfosforilada presente en PHF (anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer202/pThr205, Innax Co.), G2 (anticuerpo que reconoce la región N-terminal específico anti-humano: anticuerpo policlonal de conejo), PHF1 (anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce pSer396/pSer404, se cree que reconoce Tau hiperfosforilada presente en PHF) y Ta1505, el efecto de la administración del anticuerpo 1505 en Tau y los niveles de tau hiperfosforilada en homogeneizados de cerebro se examinó por transferencia de Western usando homogeneizados de cerebro de ratones Tg Tau administrados con el anticuerpo.

La sonicación se llevó a cabo en 100 a 200 mg del hemisferio cerebral del ratón en una cantidad de 5 veces de TBS (que contenía cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa). Esto se centrifugó a 100.000 g durante 15 minutos a 4°C, y el sobrenadante se recogió como la fracción soluble de TBS.

El precipitado se suspendió en 1% sarcosilo/TBS (que contenía cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa), y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifugó a 100.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante se utilizó como fracción soluble de sarcosilo.

La fracción soluble de TBS y fracción soluble de sarcosilo se sometieron a electroforesis con 7% de gel de acetato-Tris y se separaron, se transfirieron a una membrana de PVDF, y se sometieron a bloqueo durante la noche a temperatura ambiente con 1% de BSA/3% de SkimMilk/0,05% de Tween20/TBS. A continuación, la solución de anticuerpo se hizo reaccionar mediante la utilización de anticuerpo conjugado HRP como el anticuerpo secundario, la reacción se llevó a cabo por el método de ECL, y el análisis se realizó con un analizador de imágenes LAS3000 para la cuantificación.

Los resultados se muestran en la Figura 28 y la Figura 29.

Para la fracción soluble de TBS, se confirmó que la administración del anticuerpo Ta1505 redujo significativamente Tau humana (reconocida por el anticuerpo G2), Tau hiperfosforilada (reconocida por AT8 (epítopo pS202/pT205) y PHF1 (epítopo pS396/pS404)) y pS413Tau (reconocida por Ta1505) en cerebro de ratones Tg Tau.

Para la fracción soluble de sarcosllo, se confirmó que la administración de anticuerpo Ta1505 redujo significativamente Tau hiperfosforilada (reconocida por AT8) en cerebro de ratones Tg Tau.

Este resultado proporciona apoyo a que la administración de anticuerpos mejora la patología en el cerebro y tiene un efecto de mejora para deterioro de la memoria. Los resultados tambien indican que el anticuerpo administrado por vía ¡ntraperitoneal actúa en el cerebro.

Ejemplo de Producción 1: Los ratones Tg que expresan tau de tipo humano normal (ratones Tau-Tg), como modelo de deterioro de la función cognitiva El efecto farmacológico de los anticuerpos de la invención en la mejora de la función cognitiva se examinó utilizando ratones Tg que tienen la característica de expresar tau tipo humana normal, y en particular el mismo patrón de expresión como en la ontogénesis en los seres humanos, que es la expresión de sólo el tipo tau 3R durante la etapa embrionaria y ambos tipos 3R y 4R tau con continuo crecimiento, y que muestran la aparición del deterioro de la función cognitiva a los 6 meses después del nacimiento. Los ratones Tg se prepararon mediante el siguiente método.

La estructura de genes utilizada para la preparación de los ratones Tg fue el ácido nucleico que confiere gen tau que tiene la estructura que se muestra en la Figura 17, que comprende el virus de simio 40 (SV40) 5'-¡ntrón (0,3 kb), gen tau (tau; 7,3 kb), 3’— intrón de SV40 (0,8 kb) y la señal de poliA de SV40 (0,3 kb) en ese orden, en dirección 3’ del promotor a-calmodulina quinasa lia (CaMKII) (8,5 kb). El gen tau utilizado se obtuvo mediante el mismo método descrito por Yamashita T. et al. (FEBS Letters, Vol.579, P.241-244, 2005), como un gen de longitud 7,3 kb que comprende la secuencia de nucleótidos de la porción correspondiente a los exones 1 a 9 de ADNc que codifica para la tau humana, una secuencia de nucleótidos que incluye la porción de los primeros 18 nucleótidos y los últimos 3 kb de intrón 9, la secuencia de nucleótidos del exón 10, la porción de los 3 primeros kb y los últimos 38 nucleótidos del intrón 10 (con la sustitución de citosina por timina en el número de base 16 del extremo 5'- del intrón 10) y la secuencia de nucleótidos de ADNc correspondiente a los exones 11 a 13. El gen tau se clonó en el sitio de restricción EcoRV enzima de pNN265, un vector que incluye el intrón SV405'- y el 3'— intrón y secuencia señal poli (A) (Choi T et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 11, pp.3070-3074, 1991). Un fragmento de ADN que contiene el 5'-intrón SV40, el gen tau, el 3'-¡ntrón SV40 y la secuencia señal poli (A) se cortó a partir de los plásmidos obtenidos con las enzimas de restricción Xhol y Notl, y el fragmento de ADN se clonó en el vector pMM403 que incluye el promotor CaMKII (Mayford M et al., Cell, vol.81 pp.891-904, 1995). Además, un fragmento de gen que tiene la estructura que se muestra en la Figura 17, que contiene el gen tau, se cortó a partir de los plásmidos obtenidos con la enzima de restricción Sfil (17,2 kb), se aisló mediante electroforesis en agarosa, y se purificó a partir de la región de gel correspondiente mediante la utilización de QIAGEN (R) QIAquick Gel Extraction Kit (Cat. No.28704 ). El fragmento obtenido gen (ADN) se incubó con embriones en etapa pronuclear obtenidos mediante la reproducción macho/hembra C57BL/6 ratones, de acuerdo con un método conocido [Hogan, B et al., "Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual," Coid Spring Harbor Laboratory (1986)]. Estos fueron implantados en las trompas uterinas de ratones hembra C57BL pseudopreñadas por inyección. Algunas partes de las colas de los ratones nacidos fueron amputadas, la PCR se llevó a cabo para confirmar si el gen introducido se había transferido, y los ratones hembra o macho con el gen transferido se criaron con los ratones hembras o machos normales para establecer los hetero ratones Tg para determinar el gen tau transferido, que se utilizaron para la experimentación. Los ratones Tau-Tg mencionados en la línea 609 y la línea 784 son ejemplos de los ratones producidos por el mismo método y que exhiben rasgos equivalentes (posiblemente se eliminada la referencia a las líneas de los ejemplos).

Claims (23)

REIVINDICACIONES: Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un agente terapeutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden, como ingrediente activo, un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se ha fosforilado en al menos un residuo de aminoácido presente entre las posiciones 410 a 421 de la proteína tau representadas por la SEC. ID NO: 1.

2. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau fosforilada característica de los trastornos cognitivos.

3. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos, de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que se fosforila en uno o más sitios seleccionados de entre Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416.

4. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que, en la unión con la proteína tau, se une en competición con un anticuerpo incluyendo VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumera como SEC. ID NO: 26.

5. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo incluyendo VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26.

6. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con la proteína tau que está fosforilada en el sitio de Ser413.

7. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, una secuencia de CDR en la cadena H representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 7 a 13 o una secuencia de CDR en la cadena H que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, y/o una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17, una secuencia de CDR en la cadena L representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 14 a 17 o una secuencia de CDR en la cadena L que tiene al menos 85% homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17.

8. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena H representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24 o una región variable de cadena H que contiene una secuencia que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24, y/o una región variable de la cadena L representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30 o una región variable de la cadena L que contiene una secuencia que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30.

9. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

10. Un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que contienen, como ingrediente activo, un péptido que incluye una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos números 410 a 421 de la SEC. ID NO: 1, en al menos uno de los residuos de aminoácidos en el péptido está fosforilado.

11. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos, de acuerdo la reivindicación 10, en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos fosforilados en el péptido corresponde a los residuos de aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 o Ser 416 de la SEC. ID NO: 1.

12. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos, de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde los residuos de aminoácidos fosforilados en el péptido incluyen al menos el residuo de aminoácidos correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1.

13. El agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el trastorno cognitivo es una taupatía.

14. El agente terapeutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos, de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la taupatía es la enfermedad de Alzheimer, la degeneración de los ganglios córtico-basales, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia con granos argirofílicos (enfermedad con granos argirófilos), taupatía sistémica múltiple con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI), degeneración lobar frontotemporal con inclusiones tau-positivas (FTLD-tau),.

15. Un anticuerpo monoclonal que participa en la reacción antígeno-anticuerpo con un péptido que comprende una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos números 410-421 de la SEC. ID NO: 1, el residuo de aminoácido correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1 en el péptido está fosforilado.

16. Un anticuerpo para la proteína tau fosforilada, el anticuerpo es uno cuya unión al antígeno es competitiva frente a un anticuerpo incluyendo VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerados como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26.

17. Un anticuerpo para la proteína tau fosforilada, siendo el anticuerpo uno que incluye VH que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 20 y VL que consiste en la secuencia de aminoácidos enumerada como SEC. ID NO: 26.

18. Un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NOs: 7 a 13, una secuencia de CDR en la cadena H representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 7 a 13, o una cadena H incluida en la secuencia de CDR que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena H representada por las SEC. ID NO: 7 a 13, y/o una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17, una secuencia de CDR en la cadena L representada por al menos una de las SEC. ID NOs: 14 a 17, o una cadena L incluida en la secuencia de CDR que tiene al menos 85% de homología con al menos una secuencia de CDR en la cadena L representada por las SEC. ID NOs: 14 a 17.

19. Un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de la cadena H representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24 o una región variable de la cadena H que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 18 a 24, y/o una región variable de la cadena L representada por una cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30 o una región variable de la cadena L que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEC. ID NOs: 25 a 30.

20. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

21. Un péptido que consiste en una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos números 410-421 de la SEC. ID NO: 1, al menos uno de los residuos de aminoácidos en el péptido está fosforilado.

22. El peptido de acuerdo con la reivindicación 21, en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos Ser412, Ser413, Thr414 y Ser 416 de la SEC. ID NO: 1 se fosforila.

23. El péptido de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde el residuo de aminoácido fosforilado es el residuo de aminoácidos correspondiente a Ser413 de la SEC. ID NO: 1. RESUMEN La invención proporciona un novedoso agente terapeutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos. MEDIOS DE SOLUCIÓN: La invención proporciona un anticuerpo que participa en la reacción antígeno-anticuerpo específicamente con la proteína tau que se ha fosforilado en las proximidades de Ser413 de la SEC. ID NO: 1 , y un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos que comprenden como un ingrediente activo un péptido que se ha fosforilado en las proximidades de Ser413. 1/31 FIG. 1 Programa: mtp://np$ I soforma Tau 10 20 30 40 50 60 iim (Sec. 10:6) MAEPRQBFEYMEDBAGTYGlGDSKDQGGYTMaQDGEGDTDAGtK- -- — 44 3R1R (Sec. 10:5) XAEPRQEFEVXEDBAGTYGLGDIIDQGGYTXSQDQEGDTDAGIKESPLQTPTEDGSEEPG60 3R2K (Sec. 10:4) MAEPRQBFÉVXEDHAGtYGLQOBKBQOGYTXBQOQBGOTOAGiKESPLQTPTEOOSEEPG60 4R0N (Sec. |B:3) KAEPRQEFEYXEDBAGTYGIGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK— — ™~— — 44 4RIH fSec. ID:2) HABPRQRFEYMSDBAGTYGLGORKDQGGYTXHQOOEGOTOAGLKESPLQTPTEOGSEEPG60 412N (Sec. ID:I) XAEPRQEFEVXEDHAGTYGLGOSSOaGGYTNBQDOEGDTDAGLKESPLGTPTEOGSEEPG60 ******************************************** Ceb. Cons. MAEPRQBFEYBEDHAGtYGLGDRXDOGGYtNBODt!EGOTDAGLIESPLGTPT60GSEBPG 70 80 90 100 110 120 t I 1 I I I 3R0 (Sec. 10:6) - -- AEEAG1GDTPSLEDEAAG62 3R1N (Sec. ID:5) SETSDAKSTPTAE- AEEAGIGDTPSLEDEAAG91 3R2N {Sec.10:4) SETSDARSYPtAEDYtAPLVDEGAPGXOAAAQPlITEI PEGTTAEEAGl GDTPSLEDEAAG 120 4R0N (Sec. ip:3) - - -- AEEAGIGDTPSLEDEAAG62 4R1N fSec. 10:2) SETSDAKSTPTAE- -- AEEAGIGDTPSLEDEAAG91 4R2N (Sec. [0: 1) SETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTE1PEGTTAEEAGIDTPSLEDEAAG120 ****************** Ceb. Cons. SBTSDAKSTPTABDYTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAG 130 140 150 160 170 130 I I I i 1 ! 8R0IÍ (Sec.lD:6) HVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGAOGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAFK122 3R1K (Sec.lO’S) RVTQARNVSKSROGTGSDMUURGAOGKTKIATPRGAAPPGQKGOAlíATRIPAKTPPAPX151 3R2N (Sec.10; 4) BVTQARMYSKSKDGTGSBDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATR1PAKTPPAPK180 4 RON (Sec. [0;3) HVTQARNY5KSKOGTGSDSKKAKGADGKTK1A7PRGAAPfGQKGQAMTRiPAKTPPAPKJ22 4R1S (Sec, 10; 2) IIVTQAR SKSKDGTGSDDKKAKGADGKTK1ATPRGAAPPG0KGQANATR1PAKTPPAPK151 4R2» (Sec.10: 1) BVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQRGQAXATR1PAK1PPAPK180 * tt t* **********»«**#*** ****************************** Ceb. Cons. BVTQJUanrSKSSDGTGSDDKUXGABGKTK1ATPKGAAFPGQXGQAHATK1PAKTPPAPK 190 200 210 220 230 240 I i t 3R0N (Sec.10; íi TPPSSGEPPRSGDRSGYSSpGSPGTPGSRSRlPSlPtPPtREPKKYAYYRIPPKSPSSAK182 3R1N (Sec.10: 5) TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKYAYYRTPPKSPSSAX211 3R2IÍ (Sec.10:4) TPPSSGEPPRSGORSGYSSPGSPGTPGSRSRIPSLPTPPIREPKSYAYYRTPPKSPSSAK240 4R0N (Sec.10:3) TPPSSGEPPRSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSITPSLPTPPTREPKKYAYVRTPPKSPSSAK182 4R1K (Sec.10: !) TRR5$6ERRK50BE56U$$R65ROTR6$C5ETR51RTRRTCERCKUAUUCTRRK5R$5AK211 1 R 2 K (Sec.10: 1) TfPSSGEPPSSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKYAYYRTPPKSPSSAK240 ************************************************************ Ceb. Cons. TPpSSGEPPKSGORSGYSSPGSPGTPGSISRYPSLPTPPtRBPKKVAYVRTPPKSPSSAK