CN104602708B

CN104602708B - 痴呆症治疗药或预防药

Info

Publication number: CN104602708B
Application number: CN201380040658.9A
Authority: CN
Inventors: 森启; 富山贵美; 松本洋一; 江口广志; 九里裕一
Original assignee: Teijin Pharma Ltd; Osaka City University
Current assignee: Public University Legal Person Osaka; Teijin Pharma Ltd; Teijin Ltd
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: LT2857039T; JP2016147902A; CY1122530T1; JPWO2013180238A1; PL2857039T3; RU2014153099A; US20150183854A1; DK2857039T3; ZA201409186B; IL235899B; KR102133610B1; SI2857039T1; KR20200029619A; MX361128B; HUE046919T2; JP6406678B2; EP2857039A4; AU2013268364B2; US20200148753A1; MX2014014187A

Abstract

本发明可以提供新的痴呆症治疗药或预防药。本发明提供含有与SEQ ID NO:1的Ser413周围被磷酸化的tau蛋白特异性地进行抗原抗体反应的抗体或Ser413周围被磷酸化的肽作为有效成分的痴呆症治疗药或预防药等。

Description

痴呆症治疗药或预防药

技术领域

本发明涉及痴呆症治疗药或预防药。具体而言，本发明涉及具有优异的认知功能改善效果的新的含有抗磷酸化蛋白或肽抗体和抗磷酸化tau抗体或能够诱导抗磷酸化tau抗体的抗原的痴呆症治疗药或预防药。

背景技术

痴呆症是指一且发达了的智力因后天的某种原因而下降、呈现社会性适应困难的状态。痴呆性疾病分为神经变性疾病、血管性痴呆症、朊病毒病、感染性疾病、代谢·内分泌疾病、外伤和脑外科疾病、中毒性疾病等(非专利文献1)。在日本，2010年时存在约210万名左右的痴呆症患者，据报道65岁以上的高龄者中的患病率为8～10%左右或10%以上，在全球性的高龄化潮流中被认为是大问题(非专利文献2)。看看痴呆症的基础疾病可知：约35%为阿尔茨海默病(AD)，约15%为AD和脑血管性的混合型，5%为额叶颞叶变性病(FTLD)，作为变性疾病的AD或FTLD等神经变性疾病占大部分比例(非专利文献2)。由神经变性疾病引起的痴呆症是以用至少6个月以上的时间进行的记忆障碍和/或人格变化的潜在性发病为特征的疾病。在与认知功能障碍的程度具有高度相关性的神经变性过程中一贯的特长是神经原纤维变化(神经原纤维缠结，NFT)(非专利文献3)。

在人体内，tau(蛋白)是指由存在于17号染色体(17q21)的MAPT基因编码的蛋白，是在中枢系统大量表达的微小管结合蛋白之一。发现tau是构成作为神经变性疾病的代表的AD中的NFT的双股螺旋状纤维(paired helical filament)和直纤维(straightfilament)的主要构成蛋白，更明确了在各种神经疾病中tau在细胞内蓄积。这种发生tau在细胞内蓄积的疾病统称为Tau蛋白病(Tau病，Tauopathy)(非专利文献4)。作为Tau蛋白病中包含的神经变性疾病，有阿尔茨海默病(AD)、皮质基底核变性病(CBD或CBS)、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(Multiplesystem tauopathy with dementia，MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维变化型痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维变化病(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)、伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)等，即使在神经变性疾病以外，Tau蛋白病还包括：昏睡性脑炎后遗症或亚急性硬化性全脑炎等由感染症引起的疾病、拳击者脑病等由外伤引起的疾病(非专利文献4)。

MAPT基因的基因组上的结构包含13个外显子，通过选择性剪接表达多个作为同工型的蛋白(非专利文献4)。另外，作为tau的结构特征，依据外显子2和外显子3的选择性剪接的29个氨基酸重复序列(N)由0～2个(N0～N2)N末端酸性结构域、含有大量脯氨酸的中间结构域、以及包含3个(3R)或4个(4R)参与微小管结合的重复序列(R)的C末端微小管结合结构域(由外显子9～12编码)构成(非专利文献3和4)。因此，根据包含29个氨基酸重复序列(N)和参与微小管结合的重复序列(R)的数目，tau以3R0N(352个氨基酸)・3R1N(381个氨基酸)・3R2N(410个氨基酸)・4R0N(383个氨基酸)・4R1N(412个氨基酸)和4R2N(441个氨基酸)这6种作为代表性的同工型。在这些同种型中，在胎儿期的脑中只存在3R0N，相对于此，在成人的人脑中存在所有的6种同种型，但4R型大量存在(非专利文献3)。同种型的3R型与4R型的不同是由包含通过选择性剪接除去外显子10的(3R)的(4R)来决定。这样，虽然tau中存在几种同工型，但为了特定其对应位置的氨基酸编号，用作为最长同工型的4R2N(SEQ ID NO: 1)中的氨基酸的编号(1～441)表示。例如，记作Ser413时，在4R2N(SEQ ID NO: 1)中表示第413位的氨基酸残基即丝氨酸，在4R1N(SEQ ID NO: 2)中表示第384位的氨基酸残基即丝氨酸、在4R0N(SEQ ID NO: 3)中表示第355位的氨基酸残基即丝氨酸、在3R2N(SEQ ID NO: 4)中表示第382位的氨基酸残基即丝氨酸、在3R1N(SEQ ID NO: 5)中表示第353位的氨基酸残基即丝氨酸、在3R0N(SEQ ID NO: 6)中表示第324位的氨基酸残基即丝氨酸。

神经变性疾病中的tau的参与在与连锁于最初17号染色体伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)中存在着由MAPT基因突变与tau蓄积的关系解明的原委，在FTDP-17中报道了MAPT基因中的40种以上的基因突变(非专利文献4)。这样的基因突变会引起tau同工型的比率变化或突变tau与微小管的相互作用的变化，暗示参与病态形成的可能性。但是，不同于家族性神经变性疾病，在AD等散发性神经变性疾病中，往往看不到MAPT的突变。另外，作为在神经变性疾病中蓄积的tau的特征，具有高度接受磷酸化修饰的特征。另外，在显示出轻度的认知功能障碍的患者(MCI)中，在骨髓液中的磷酸化tau量与下垂体萎缩之间发现了相关性，认为磷酸化tau是关于Tau蛋白病患者中的神经变性的可靠性高的生物标志物(非专利文献5)。因此，为了抑制tau的磷酸的过剩磷酸化，尝试着在治疗中使用针对作为与磷酸化有关的酶的激酶、其中特别是GSK-3β的酶抑制剂，并进行了开发(非专利文献5)。但认为GSK-3β等激酶不仅在病态下、在正常生理作用中也与功能控制有关，因此担心副作用等。事实上，在tau被GSK-3β磷酸化的位点中，有若干个位点与在胎儿或正常人的脑中看到的tau的磷酸化位点一致(非专利文献3)，由此还考虑到其影响到正常tau功能的可能性。

另外，按照以往的考虑，认为存在于细胞外的tau由于变性了的神经细胞的细胞死亡而泄露到细胞外，但根据最近的研究，认为tau在细胞内被过度磷酸化后，接受加工而能动地分泌到细胞外。认为分泌到细胞外的磷酸化tau在一部分的磷酸化位点接受脱磷酸化，之后与周围细胞的毒蕈碱型受体的M1和M3作用，参与细胞内的tau磷酸化亢进或细胞死亡的诱导等作用(非专利文献6、非专利文献7)。这样，认为tau发挥在细胞外作用的因子的作用，因此以难以在细胞内发挥作用的抗体等高分子作为药效成分的治疗药的可能性也逐渐受到重视。但是，如上所述，分泌到细胞外的tau一部分接受加工，还接受脱磷酸化等，根据迄今为止作为靶向的过度磷酸化的tau的结构信息，存在着进一步接受改变的可能性。而且，还考虑到与脱磷酸化的tau部分作用的药物对正常tau功能也有影响的可能性。在抗体等中以病态中的tau为靶时，选择什么样的病态特异性位点、即与tau的磷酸化表位作用的位点较为重要，但由于具有这样的复杂信息，可以说选择这样的表位会变得更加困难。

作为指向与tau的特异性作用的尝试，报道了关于以tau蛋白为靶的Tau蛋白病的免疫学治疗的发明(非专利文献5、专利文献1、专利文献2、专利文献3)。免疫学治疗是指以通过给予肽疫苗等诱导特异性抗体的产生为目的而进行的疗法，由于对靶蛋白或肽的特异性高，因此期待着减轻副作用。作为这样的搭配，报道了通过使用磷酸化的tau的部分肽(相当于Ser396和Ser404的氨基酸残基被磷酸化了的肽、以及相当于Ser262的氨基酸残基被磷酸化了的肽)的疫苗对表达突变tau的动物模型进行免疫，改善该模型动物的运动功能改善等。但是，在这些报道中，是使用导入了P301L(作为tau的第301位氨基酸残基的脯氨酸转变成亮氨酸的突变)等基因突变的转基因小鼠(tg小鼠)的研究，该tg小鼠虽然是关于作为家族性神经变性疾病之一的FTDP-17的基因突变模型，但未必表现出不伴有Tau蛋白病所包含的tau基因突变的神经变性疾病中的大多数、特别是散发性神经变性疾病的病态。另外，P301Ltg小鼠是运动功能障碍的模型，并不是表现在人的痴呆症等中成为问题的认知功能障碍的模型(非专利文献8)，因此根据该动物模型中的结果，难以知晓能否适于人痴呆症的治疗。在专利文献4中，给予与Ser409被磷酸化的tau肽发生抗原抗体反应的抗体，观察关于Tau蛋白病治疗的效果。但是，作为昂贵的肽疫苗，总给药量多、且直至体现出效果的期间长。另外，给药的人或动物的免疫应答反应性根据遗传背景而不同，肽疫苗的效果未必在所有个体中均可有效地诱导抗体产生。因此，考虑采用通过抗体进行被动免疫的免疫疗法，但在tau中存在非常多的接受磷酸化的位点，使用针对其中的哪一个磷酸化位点的抗体才有效，这样的信息基本上不存在。另外，即使看到目前存在的抗体在动物模型中的效果，也不认为就具有足以用于治疗的功能。

而且，使用抗体作为治疗药或预防药的主剂时，由于避免副作用或医疗经济上的问题，对用于治疗的抗体量也必需留意，特别是在慢性疾病或遗传疾病等中，给药量成为重要课题。例如，作为人抗IL-6R抗体的Actemra(注册商标)(托珠单抗，tocilizumab)在治疗中的用量为8mg/1kg体重，以1～4周的间隔进行给药；作为人源化抗补体C5抗体的Soliris(注册商标)(艾库组单抗，eculizumab)在治疗中的用量为成人每人每次600～900mg，每2周～4周进行给药。这些抗体是从众多抗体中选择开发的优秀抗体，作为用量在目前使用的抗体药物中属于多的。因此，在今后开发的抗体药物中，也需要与其同等以下的用量下的效果。而且，在AD等痴呆症中作为治疗对象的脏器是脑，但在进行静脉内或皮下给药等全身给药时，据报道由于血脑屏障的存在，抗体从血液到脑中的转移率低，因此与以其他脏器的疾病为对象时相比，用于治疗痴呆症的抗体难以期待药理效果，存在着大的课题。

在人的痴呆症中，主要症状是记忆障碍和认知功能障碍，特别是认知功能是根据记忆来发挥判断、交流、行为功能的，因此是重要的功能，所以作为痴呆症的症状占据重要位置。另一方面，关于运动功能，虽然该功能是在连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)或末期阿尔茨海默病中确认到的症状，但未必是在痴呆症中显示的主要症状。因此，在考虑痴呆症的治疗时，改善认知功能成为主要课题。但是，在目前状况下，为了解决这样的课题，尚未显示出可以使用必要的由Tau蛋白病引起的认知功能障碍的适当的动物模型取得显示出优异的认知功能改善效果的痴呆症治疗药或预防药的方法，另外，对痴呆症显示出特异性的优异效果的痴呆症治疗药或预防药并不存在。

因此，根据如上所述的状况，要求开发特别是对认知功能的改善具有强力效果的治疗药或预防药。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：US8012936；

专利文献2：WO2010/142423；

专利文献3：WO2010/144711；

非专利文献

非专利文献1：岸本年史、高桥茂树编, STEP Series 精神科第2版, 第103～104页, 海马书房, 2008年；

非专利文献2：浅田隆, 增刊医学的进展“痴呆症”, 第5～10页, 医齿药出版,2011年；

非专利文献3：Alistair Burns, John O’Brien和David Ames编, Dementia. 第3版, 第408～464页, 2005年；

非专利文献4：新井哲明, 神经内科, 72卷特别增刊号(Suppl.6)，第46～51页,2010年；

非专利文献5：Wendy Noble等人, Expert Opin. Drug Discov., 6卷8号, 第797～810页, 2011年；

非专利文献6：Miguel Diaz-Hernandes等人, Journal of BiologicalChemistry, 285卷, 第32539-32548页, 2010年；

非专利文献7：Venessa Plouffe等人, PLoS ONE, 7卷, 第36873页, 2012年；

非专利文献8：Alistair Burns, John O’Brien和David Ames编, Dementia. 第3版, 第459页, 2005年。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于着眼于Tau蛋白病中的tau磷酸化，提供痴呆症治疗药或预防药。

另外，本发明的目的还在于提供：含有与相当于Ser413周围的氨基酸残基被磷酸化的tau特异性地进行抗原抗体反应的抗体、或具有Ser413周围的氨基酸序列且至少一个氨基酸残基被磷酸化的肽作为有效成分的痴呆症治疗药或预防药。

而且，本发明的目的还在于提供具有高的认知功能改善效果的单克隆抗体，而且本发明还根据该单克隆抗体的结构分析提供人源化抗体等更适合痴呆症治疗的抗体的制作方法。

用于解决课题的手段

本发明如下所示。需要说明的是，本发明中的tau蛋白不仅包含4R2N，还包含全部的6种同工型。另外，本发明中的氨基酸残基的位置方便地根据SEQ ID NO: 1所示的氨基酸残基来特定，例如，表述为相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基时，意思是指SEQ IDNO: 1(4R2N)的第413位的丝氨酸、作为SEQ ID NO: 2(4R1N)的第384位、SEQ ID NO: 3(4R0N)的第355位、SEQ ID NO: 4(3R2N)的第382位、SEQ ID NO: 5(3R1N)的第353位、或SEQID NO: 6(3R0N)的第324位的氨基酸残基的丝氨酸。

(1) 痴呆症治疗药或预防药，其中含有与相当于SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的410位～421位的至少一个氨基酸残基接受了磷酸化而获得的tau蛋白进行抗原抗体反应的抗体作为有效成分。

(2) (1)所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是与痴呆症的特征性的接受了磷酸化的tau蛋白进行抗原抗体反应的抗体。

(3) (1)或(2)所述的痴呆症治疗药或预防药，其特征在于：该抗体与选自Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的1个以上的位点被磷酸化的tau蛋白进行抗原抗体反应。

(4) (1)～(3)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是在与tau蛋白的结合中与包含由SEQ ID NO: 20所记载的氨基酸构成的VH和由SEQ ID NO: 26所记载的氨基酸序列构成的VL的抗体进行结合竞争的抗体。

(5) (1)～(3)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是包含由SEQID NO: 20所记载的氨基酸构成的VH和由SEQ ID NO: 26所记载的氨基酸序列构成的VL的抗体。

(6) (1)～(4)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是与相当于Ser413的位点的氨基酸残基被磷酸化了的tau蛋白进行抗原抗体反应的抗体。

(7) (1)～(6)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是具有SEQID NO: 7～13所表示的H链CDR序列、SEQ ID NO: 7～13的至少一个所表示的H链CDR序列、或与SEQ ID NO: 7～13所表示的H链CDR序列中的至少一个具有85%以上的同源性的H链CDR序列；和/或SEQ ID NO: 14～17所表示的L链CDR序列、SEQ ID NO: 14～17的至少一个所表示的L链CDR序列、或与SEQ ID NO: 14～17所表示的L链CDR序列中的至少一个具有85%以上的同源性的L链CDR序列的抗体。

(8) (1)～(7)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体是具有SEQID NO: 18～24的任一个所表示的H链可变区、或与SEQ ID NO: 18～24中的任一个具有85%以上的同源性的序列的H链可变区；和/或SEQ ID NO: 25～30的任一个所表示的L链可变区、或与SEQ ID NO: 25～30中的任一个具有85%以上的同源性的序列的L链可变区的抗体。

(9) (1)～(8)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该抗体为人源化抗体或嵌合抗体。

(10) 痴呆症治疗药或预防药，其中含有肽作为有效成分，所述肽是包含由相当于SEQ ID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基构成的氨基酸序列中的至少连续的8个氨基酸序列的肽，且该肽中所含的至少一个氨基酸残基被磷酸化。

(11) (10)所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该肽所包含的磷酸化的氨基酸残基中的至少一个是相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414或Ser416的氨基酸残基的肽。

(12) (10)或(11)所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，该肽所包含的磷酸化的氨基酸残基是至少相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基。

(13) (1)～(12)中任一项所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，痴呆症为Tau蛋白病。

(14) (13)所述的痴呆症治疗药或预防药，其中，Tau蛋白病为阿尔茨海默病、皮质基底核变性病、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维变化型痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维变化病(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)、或伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)。

(15) 单克隆抗体，该单克隆抗体与肽进行抗原抗体反应，所述肽是具有由SEQ IDNO: 1的氨基酸编号410～421构成的氨基酸序列中的至少连续的8个氨基酸序列的肽，且该肽所包含的相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基被磷酸化。

(16) 抗体，该抗体是针对磷酸化的tau蛋白的抗体，在该抗体与包含由SEQ IDNO: 20所记载的氨基酸构成的VH和由SEQ ID NO: 26所记载的氨基酸序列构成的VL的抗体之间与抗原的结合是竞争性的。

(17) 抗体，该抗体是针对磷酸化的tau蛋白的抗体，该抗体包含由SEQ ID NO: 20所记载的氨基酸构成的VH和由SEQ ID NO: 26所记载的氨基酸序列构成的VL。

(18) 单克隆抗体，该单克隆抗体具有H链和/或L链，所述H链在CDR序列中具有SEQID NO: 7～13所表示的H链CDR序列、SEQ ID NO: 7～13的至少一个所表示的H链CDR序列、或与SEQ ID NO: 7～13所表示的H链CDR序列的至少一个具有85%以上的同源性的序列，所述L链在CDR序列中具有SEQ ID NO: 14～17所表示的L链CDR序列、SEQ ID NO: 14～17的至少一个所表示的L链CDR序列、或与SEQ ID NO: 14～17所表示的L链CDR序列的至少一个具有85%以上的同源性的序列。

(19) 单克隆抗体，该单克隆抗体具有SEQ ID NO: 18～24的任一个所表示的H链可变区、或与SEQ ID NO: 18～24中的任一个具有85%以上的同源性的H链可变区和/或SEQID NO: 25～30的任一个所表示的L链可变区、或与SEQ ID NO: 25～30的任一个具有85%以上的同源性的L链可变区。

(20) (15)～(19)中任一项所述的单克隆抗体，其中，抗体为人源化抗体或嵌合抗体。

(21) 肽，该肽包含在由相当于SEQ ID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基构成的氨基酸序列中的至少连续的8个氨基酸序列，且该肽所包含的至少一个氨基酸残基被磷酸化。

(22) (21)所述的肽，其特征在于：相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸的氨基酸残基的至少一个被磷酸化。

(23) (21)或(22)所述的肽，其中，磷酸化的氨基酸残基是相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基。

发明效果

本发明通过含有与相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基周围被磷酸化的tau特异性地进行抗原抗体反应的抗体、或具有SEQ ID NO: 1的Ser413周围的氨基酸序列且至少一个氨基酸残基被磷酸化的肽作为有效成分，可以提供痴呆症治疗药或预防药。

另外，本发明还提供具有高的认知功能改善效果的单克隆抗体，而且还根据该单克隆抗体的结构分析提供人源化抗体等更适合痴呆症治疗的抗体的制作方法。

附图说明

图1是显示利用ClustalW排列人tau蛋白同工型的前一半氨基酸序列而得到的结果的图。

图2是显示利用ClustalW排列人tau蛋白同工型的后一半氨基酸序列而得到的结果的图。

图3是显示抗pSer413肽的兔多克隆抗体的特异性的图。

图4是显示给予了pSer413识别兔多克隆抗体的模型小鼠的Trial试验结果的图。

图5是显示给予了pSer413识别兔多克隆抗体的模型小鼠的探测(Probe)试验结果的图。

图6是显示给予了pSer413识别兔多克隆抗体的模型小鼠的旷场(Open Field)试验结果的折线图。

图7是显示给予了pSer413识别兔多克隆抗体的模型小鼠的旷场试验结果的柱形图。

图8是显示给予了pSer413识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的Trial试验结果的图(Ta1505)。

图9是显示给予了pSer413识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的探测试验结果的图(Ta1505)。

图10是显示给予了pSer413识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的旷场试验结果的折线图(Ta1505)。

图11是显示给予了pSer413识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的旷场试验结果的柱形图(Ta1505)。

图12是显示给予了pSer396识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的Trial试验结果的图(Ta9)。

图13是显示给予了pSer396识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的探测试验结果的图(Ta9)。

图14是显示给予了pSer396识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的旷场试验结果的折线图(Ta9)。

图15是显示给予了pSer396识别小鼠单克隆抗体的模型小鼠的旷场试验结果的柱形图(Ta9)。

图16是显示给予了Ta1505抗体的模型小鼠的海马突触素量的图。

图17是表示tau基因所含的基因片段的图。

图18是显示给予了Ta1505抗体的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的水迷宫Trial试验结果的图。

图19是显示给予了Ta1505抗体的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的水迷宫探测试验结果的图。

图20是显示给予了Ta9抗体的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的水迷宫Trial试验结果的图。

图21是显示给予了Ta9抗体的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的水迷宫探测试验结果的图。

图22是显示给予了对照IgG(1mg/只)或Ta1505抗体(1mg/只)的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的、用Ta1505抗体进行的海马CA3区和CA23区的免疫组织染色的照片。

图23是显示给予了对照IgG(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、用Ta1505抗体进行的副海马回区的免疫组织染色的照片。

图24是显示给予了Ta1505抗体(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、用Ta1505抗体进行的副海马回区的免疫组织染色的照片。

图25是显示给予了对照IgG(1mg/只)或Ta1505抗体(1mg/只)的记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的、用AT8进行的海马CA3区和CA23区的免疫组织染色的照片。

图26是显示给予了对照抗体(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、用AT8进行了副海马回区的免疫组织染色的照片。

图27是显示给予了Ta1505(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、用AT8进行的副海马回区的免疫组织染色的照片。

图28是显示给予了Ta1505(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、TBS可溶性脑馏分中的G2、AT8、PHF1和Ta1505的反应性Tau量的图。

图29是显示给予了Ta1505(1mg/只)的记忆学习损伤小鼠(Tau-Tg)的、肌氨酰可溶性脑馏分中的G2、AT8、PHF1和Ta1505的反应性Tau量的图。

具体实施方式

本发明人在制作与AD中作为特异性磷酸化位点的相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基被磷酸化的tau特异性地进行抗原抗体反应的抗体，并将其给予随着成熟而出现认知功能障碍的tg小鼠时，发现认知功能可以恢复至与对象组几乎相同的程度。另一方面，以相同浓度使用对同等的抗原具有比本发明的抗体强的亲和性的、针对相当于SEQID NO: 1的Ser396的氨基酸残基被磷酸化的tau的抗体进行比较时，没有发现充分的认知功能的改善。相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基周围部分是在tau的结构与功能的关系中特别没有信息的区，与该部分进行特异性抗原抗体反应的抗体具有这样的强认知功能改善效果，这是完全出乎意料的结果。因此，至今未被关注的该相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的周围部位在Tau蛋白病中是认知功能障碍发病的重要部位，这通过本发明第一次得到阐明，从而完成了本发明。

[抗磷酸化tau抗体]

本发明中的tau(蛋白)除了包括SEQ ID NO: 1～6所示的人tau蛋白，还包括它们的基因突变体。如上述背景技术所示，在作为与痴呆症有关的家族性神经变性疾病的FTDP-17中，已知有40处以上的突变，但突变位点并不限于此。另外，突变数目为相对于SEQ IDNO: 1～6有1～50处、优选1～30处、更优选1～10处氨基酸突变的tau也作为本发明中的tau来对待。而且，还包括相对于SEQ ID NO: 1所示的人tau蛋白按照BLAST法(NCBI的PBLAST的缺省条件)显示出80%以上的同源性(Identities)的蛋白及其同工型。这样的tau包括黑猩猩、恒河猴、马、猪、狗、小鼠、兔、大鼠等除人以外的种中的tau，为了改善这样的动物认知功能，还可以制作以这种tau为靶的治疗药或预防药。

另外，本发明中的氨基酸编号、即氨基酸残基的位置方便地根据SEQ ID NO: 1所示的编号来特定。因此，例如表述为相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基时，是指作为SEQ ID NO: 1(4R2N)的第413位、SEQ ID NO: 2(4R1N)的第384位、SEQ ID NO: 3(4R0N)的第355位、SEQ ID NO: 4(3R2N)的第382位、SEQ ID NO: 5(3R1N)的第353位、或SEQ IDNO: 6(3R0N)的第324位的氨基酸残基的丝氨酸。表1显示在各同工型中彼此位于相同位置的氨基酸残基的位置。需要说明的是，表1中虽然显示相当于SEQ ID NO: 1的410～421的各同工型中的氨基酸残基的位置，但关于位于除此以外的位置上的氨基酸残基彼此的位置关系，例如根据图1和图2可以容易地理解。

[表1]

抗磷酸化tau抗体是指与以上所示的tau中的氨基酸序列中1处以上的氨基酸残基被磷酸化而获得的tau进行抗原抗体反应的抗体。作为被磷酸化的氨基酸残基，可以列举丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)等。另外，作为本发明的抗磷酸化tau抗体发生抗原抗体反应的磷酸化tau的位点，优选在AD等神经变性疾病中特异性地被磷酸化的位点。另外，作为本发明的抗磷酸化tau抗体发生抗原抗体反应的磷酸化tau中的位点的其他优选方式，是与选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的1个以上的位点被磷酸化的tau进行抗原抗体反应的抗体，更优选为与相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413的氨基酸残基、或两者的位点被磷酸化的tau进行抗原抗体反应的抗体，更优选为与相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基位点被磷酸化的tau进行抗原抗体反应的抗体。这里，相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基是指相当于人的4R2Ntau(SEQ ID NO: 1)中的氨基酸编号的位点，但如上述背景技术所述，关于同工型中的对应位点、以及人以外的同系物所对应的位点，与由该氨基酸序列附带的氨基酸编号无关，也同样地进行对待。为了理解这样的同工型或同系物中的对应位点，本领域技术人员可以通过Needleman-Wunsch法或Smith-Waterman法等Pairwise序列比对的方法、或ClustalW法或PRRP法等多序列比对进行适当分析理解。作为对应位点的分析方法的一个例子，图1和图2显示用ClustalW排列人中的6种同工型的氨基酸序列(单字母表示)而获得的结果。观察这些结果时，在6个同工型中相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基周围的结构得以保存，可以容易地理解对应的氨基酸是否是任意一个。

本发明的治疗药或预防药中可以使用的抗磷酸化tau抗体是指与存在于SEQ IDNO: 1的tau蛋白的410位～421位的氨基酸残基的至少一个接受了磷酸化而获得的tau蛋白特异性地进行抗原抗体反应的抗体，是指与选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的一个以上的位点被磷酸化而获得的tau蛋白特异性地进行抗原抗体反应的抗体，更优选为与VH的氨基酸序列为SEQ ID NO: 20、且VL的氨基酸序列为SEQ ID NO: 26的抗体(以下还称作“1505抗体”。)竞争结合的抗体，更优选为与Ser413的位点被磷酸化的tau蛋白特异性地进行抗原抗体反应的抗体。如上所述，相当于SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白、选自相当于SEQ IDNO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的一个以上的位点被磷酸化的tau蛋白、或相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的位点被磷酸化的tau蛋白表示包括人或其他种中的同种型在内的对应位点被磷酸化的tau蛋白，但更优选为人的tau蛋白，更优选为人的6个同工型中的任意一个。

另外，在本发明中的相当于SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基中的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白、选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的一个以上位点被磷酸化了的tau蛋白、或相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的位点被磷酸化的tau蛋白中，与相当于tau蛋白的410位～421位的氨基酸残基的一部分氨基酸序列完全相同或具有80%以上的序列同源性、且该氨基酸残基被磷酸化了的肽也包含在这样的磷酸化tau蛋白中，与这样的肽特异性地进行抗原抗体反应的抗体也是本发明中的抗磷酸化tau抗体。

在本发明中，“进行抗原抗体反应”是指，与相当于SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基中的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白、选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的1个以上的位点被磷酸化的tau蛋白和/或相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的位点被磷酸化的tau蛋白以平衡解离常数(KD)为1×10^-6M以上的亲和性进行结合，优选以平衡解离常数为1×10^-7M以上的亲和性进行结合，进一步优选以平衡解离常数为1×10^-8M以上的亲和性进行结合。

另外，“特异性地”是指，与相当于SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白、选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的一个以上的位点被磷酸化的tau蛋白和/或相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的位点被磷酸化的tau蛋白的结合较与该位点没有被磷酸化的tau蛋白(包含与tau蛋白的一部分氨基酸序列完全相同或具有80%以上的序列同源性的肽)的结合强10倍以上、优选强30倍以上、进一步优选强100倍以上的状态。

而且，与VH序列的氨基酸序列为SEQ ID NO: 20、且VL的氨基酸序列为SEQ ID NO:26的抗体(1505抗体)“竞争结合”是指，在该单克隆抗体与抗原结合时有其他抗体共存时，该单克隆抗体的结合被抑制的现象，通常相对于一定量(浓度)的该单克隆抗体改变其他抗体的加入量(浓度)时，通过测定该单克隆抗体与抗原的结合量下降的添加量(浓度)即可测得，其抑制程度可以用IC₅₀或Ki的值表示。本发明中的与VH的氨基酸序列为SEQ ID NO: 20、且VL的序列为SEQ ID NO: 26的抗体(1505抗体)竞争结合的抗体是指，以10nM使用该单克隆抗体来检测抗原抗体结合时IC₅₀值低于1μM的抗体，更优选IC₅₀值低于100nM的抗体，进一步优选IC₅₀值低于10nM的抗体。

关于这种抗体与磷酸化tau蛋白的抗体抗原结合，本领域技术人员可以适当选择固相或液相体系中的结合测定来进行，作为这样的方法，可以列举ELISA法、EIA法、表面等离振子共振法、FRET法、LRET法等，但并不限于这些。另外，测定这样的抗原抗体结合时，还可以用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等对抗体和/或抗原(磷酸化tau蛋白或tau蛋白)进行标记，再利用适合该进行了标记的物质的物理和/或化学特性的测定方法检测抗原抗体反应。

另外，作为本发明的抗磷酸化tau抗体，还包含如下抗体，所述抗体的H链可变区包含由CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO: 7或8、CDRH-H2的氨基酸序列为选自SEQ ID NO:9、10、11和12中的任一个和CDRH-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO: 13的组合构成的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列，而L链可变区包含由CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO: 14或15、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO: 16和CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO: 17的组合构成的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列。优选H链可变区所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的组是选自以下组合、即SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 13；SEQ IDNO: 8、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 13；SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 13；SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13；以及SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 11和SEQID NO: 13的任一个、而L链可变区所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的组是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17；或SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17的抗体；更优选H链可变区所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的组、以及L链可变区所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的组的组合是选自下述组合的任一个组合的抗体：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17；SEQ IDNO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17；SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ IDNO: 17；SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17；以及SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQID NO: 16和SEQ ID NO: 17。这里，在这些CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3的氨基酸序列中，对应的CDR序列的至少一个根据BLAST法(NCBI的PBLAST的缺省条件)与SEQ ID NO: 7～17的任一个显示出85%以上的同源性(Identities)、优选90%以上的同源性的抗体也包含在本发明的抗体中。

这里，作为鉴定抗体中的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3的序列的方法，本领域技术人员可以通过采用例如Kabat的方法或Chothia的方法来鉴定各CDR所对应的部分的序列，Kabat(Kabat, E. A.和Wu, T. T., J. Immunol., 147, 1709-1719,1991年)或Chothia(Al-Lazikani, B., Lesk, A. M.和Chothia, C., J. Mol. Biol.,273，927-948, 1997年)的方法对该领域的技术人员而言是技术常识，例如还可以由Dr.Andrew C.R. Martin’s Group的主页(http://www.bioinf.org.uk/abs/)了解概要。

作为本发明中的抗体的另一形态，有H链可变区(VH)的氨基酸序列为选自SEQ IDNO: 18～24的任一个、而L链可变区(VL)的氨基酸序列为选自SEQ ID NO: 25～30的任一个的抗体，优选为VH和VL的氨基酸序列的组合是选自SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 25、SEQID NO: 19和SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 21和SEQ IDNO: 27、SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 29、以及SEQ IDNO: 24和SEQ ID NO: 30的组合的任一个组合的抗体。这里，VH和VL的氨基酸序列的至少单方为SEQ ID NO: 18～24所示的VH的任一个氨基酸序列或SEQ ID NO: 25～30所示的VL的任一个氨基酸序列、以及通过BLAST法(NCBI的PBLAST的缺省条件)与SEQ ID NO: 18～30显示85%以上的同源性(Identities)、优选90%以上的同源性的序列的抗体也包含在本发明的抗体中。

在该抗体中，恒定区的氨基酸序列选自哺乳类的IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的各亚型或其突变体。

根据上述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列的信息，本领域技术人员可以设计人源化抗体等适用于根据治疗目的对目标种进行给药的重组抗体，根据H链可变区的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列、L链可变区的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列的信息，本领域技术人员可以设计符合目的的嵌合抗体等。另外，本领域技术人员还可以利用公知的技术，根据CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列的信息、或者H链可变区的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列、L链可变区的氨基酸序列和/或编码其的基因的核苷酸序列的信息适当地制作低分子抗体或支架抗体。

本发明中的抗体可以是由2条H链和2条L链构成的抗体，也可以是只由2条H链构成的抗体。另外，本发明的抗体还可以是抗体片段，作为这样的抗体片段，可以例示F(ab’)2、Fab、Fv等结构。

本发明中的抗体可以利用本领域技术人员所周知的方法来得到。本发明中的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(Milstein等, Nature (England) 1983年10月6日发行,305卷5934号, 第537～540页)。例如，可以以相当于SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白、选自SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的一个以上的位点被磷酸化的tau蛋白、SEQ ID NO: 1的Ser413的位点被磷酸化的tau蛋白、或与SEQ ID NO: 1的tau蛋白的410位～421位的氨基酸序列的至少一部分完全相同或具有80%以上的序列同源性、且该氨基酸被磷酸化的肽作为抗原，对哺乳动物进行致敏，从该动物的血清等中回收多克隆抗体。另外，使用肽作为抗原时，可以使用与BSA或KLH等载体蛋白或聚赖氨酸等结合的形态的抗原。另外，作为用作抗原的肽的具体例子，如实施例1和2所述，可以使用相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的位点被磷酸化的SEQ ID NO: 31或32的肽，但并不限于此。可以克隆通过从抗原致敏的哺乳动物中取出免疫细胞并使其与骨髓瘤细胞等进行细胞融合而得到的杂交瘤，从其培养物中回收本发明的单克隆抗体。作为这样的单克隆抗体的获取方法，如实施例2所述，作为由此得到的单克隆抗体，可以列举具有SEQ ID NO: 18～24的VH氨基酸序列、SEQ ID NO: 25～30的VL序列的单克隆抗体(Ta1501、1502、1505～1509)，但并不限于这些。

得到的单克隆抗体既可以得到具有编码该抗体蛋白的氨基酸的基因序列的核酸分子，也可以使用这样的核酸分子通过基因工程学方法制作抗体。使用该抗体的基因信息、例如H链、L链、以及它们的可变区的CDR序列等信息，进行用于提高抗体的结合性或特异性的改变等、或者通过由小鼠等动物的抗体改变成人型抗体来制作适合用于治疗药的结构的抗体，这是本领域技术人员所熟知的技术。另外，通过使用导入了人抗体基因的非人-转基因动物作为进行抗原致敏的动物，也可以获得人型单克隆抗体。除此以外，作为不需要对动物进行致敏的方法，本领域技术人员可以适当采用以下技术：使用表达人抗体的抗原结合区或其一部分的噬菌体文库(人抗体噬菌体展示)，获得与对应的抗原进行特异性结合的抗体或由特定的氨基酸序列构成的噬菌体克隆，根据该信息制作人抗体。(例如参照TaketoTanaka等, Keio J. Med., 60卷, 第37-46页的评论等。)

另外，作为制备上述单克隆抗体的方法，可以分别培养产生想要取得的抗体的杂交瘤，按照常规方法由得到的培养上清中纯化、获得抗体。另外，作为其他的制备方法，还可以由产生想要获得的抗体的杂交瘤或通过人抗体噬菌体展示得到的噬菌体克隆等获得编码抗体的基因、更详细而言是指编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，制作用于表达该基因的载体，将其导入宿主细胞(哺乳类细胞、昆虫细胞、微生物等)中，产生该抗体。此时，对于编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，进行用于导入所期望的特性的基因改变、或者利用免疫球蛋白的重链和/或轻链的可变区或CDR区的结构信息制作人型化抗体、抗体嵌合蛋白、低分子抗体或支架抗体，这可以由本领域技术人员通过采用公知的技术来实施。另外，为了提高抗体的性能或避免副作用，向抗体恒定区的结构中导入改变、或者进行糖链部分的改变，这也可以利用本领域技术人员所熟知的技术来适当进行。

[具有来自tau的氨基酸序列的磷酸化肽]

本发明还包括：包含tau的一部分氨基酸序列、且其中1个以上的氨基酸残基被磷酸化的肽。氨基酸残基被磷酸化是指磷酸基与氨基酸残基侧链进行了酯键合的状态，作为磷酸化的氨基酸残基的代表性例子，可以列举丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等。该磷酸化肽是指，在由相当于SEQ ID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基构成的氨基酸序列中，至少包含连续的3个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽、优选至少包含连续的5个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽、更优选至少包含连续的8个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽。而且，在该磷酸化肽中磷酸化的氨基酸残基为相当于SEQ ID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基中的任一个，优选相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414、Ser416的氨基酸的氨基酸残基中的任一个，更优选相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基。作为这样的磷酸化肽的代表性例子，可以列举实施例1中在抗体制作中使用的磷酸化肽(SEQID NO: 31)，但并不限于此。

本发明的具有来自tau的氨基酸序列的磷酸化肽可用于以包含本发明中的抗磷酸化tau抗体的制作中的抗原或该肽为特征的痴呆症治疗药或预防药。该磷酸化肽根据目的还可以用具有其他功能的物质修饰该序列的N末端和/或C末端。例如，可以是在该磷酸化肽的N末端添加有甲硫氨酸残基、乙酰基或焦谷氨酸等形式或用荧光物质等进行修饰的形式。另外，修饰该磷酸化肽的N末端和/或C末端的物质可以是肽或蛋白，作为这样的物质的例子，可以列举：在N末端或C末端添加了适当的标记(Tag)序列(典型的是组氨酸标记或FLAG标记)、用于被T细胞受体(TCR)或主要组织相容性抗原(MHC)识别的氨基酸序列的肽、病毒或细菌的蛋白或来自该蛋白的序列的肽等物质。另外，本发明中的磷酸化肽还包括：除N末端和C末端以外的至少一个氨基酸残基被化合物或肽修饰的肽。这种磷酸化肽的修饰可以由本领域技术人员利用公知方法、例如Hermanson等著的Bioconjugate techniques(USA,1996年发行, Academic Press)中记载的方法等来实施。

本发明中的磷酸化肽可以由本领域技术人员利用适当的合成法或基因工程学方法等来制备。作为通过合成制备磷酸化肽的方法，可以例示：采用Boc法的方法(WakamiyaT.等人, Chemistry Letters, 第22卷, 第1401页, 1993年)、采用Fmoc法的方法(PERICH,J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, 第40卷, 第134-140页, 1992年)、或日本专利第3587390号中记载的方法等，但本领域技术人员还可以利用其他适当的方法来实施。另外，在采用基因工程学方法的制备方法中，调制具有编码要制备的肽或其前体的核苷酸序列的遗传物质(DNA、RNA)，将其插入适当的表达用载体中或添加启动子序列等，从而将其导入适当的宿主中使之表达，或者通过使用无细胞系蛋白合成系统等的方法进行制备。这种情况下，为了得到所期望的位点被磷酸化的磷酸化肽，通过适当地利用宿主所具有的或在基因工程学上诱导表达的激酶类在宿主内进行磷酸化反应，或者在一度回收目标肽后在体外使激酶等反应来进行磷酸化反应，从而即可制得。为了在体外进行该磷酸化反应，可以利用目标肽在GSK3或CDK5等tau的磷酸化反应中的功能已知的酶。这样，在宿主内或在体外被磷酸化的磷酸化肽中，为了获得目标氨基酸残基被磷酸化的磷酸化肽，可以采用回收利用针对上述抗磷酸化tau的抗体的抗体抗原反应特异性地与抗体结合的磷酸化肽的方法等。

[含有抗磷酸化tau抗体或磷酸化tau肽的痴呆症治疗药或预防药]

人的痴呆症是指一旦发达的或者获得的认知功能下降的状态，是智力障碍之一(上岛国利、丹羽真一编, NANKODO’s ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES New精神医学, 第69-70页, 2008年)，但在广泛意义上认为是呈现智力障碍和/或记忆障碍的疾病。在AD等神经变性疾病中，确定“神经变性”时，可以通过在死后进行组织学分析以确认神经原纤维变化(NFT)的存在等来进行，但作为神经变性疾病的诊断，医生会根据作为神经心理学检查的问诊检查/长谷川式简易智力评价级别修订版(HDS-R)或Mini-Mental State Examination(MMSE)等、观察检查Clinical Dementia Rating(CDR)或Functinal Assessment Staging(FAST)等、作为生化学检查的脑脊液中的tau或磷酸化tau的存在量的上升或Aβ存在量的上升、作为影像检查的通过头部CT、颈部MRI、SPECT或PET等得到的信息，来诊断痴呆症、特别是作为神经变性疾病的痴呆症。因此，对被医生诊断为痴呆症的患者给予本发明的痴呆症治疗药或预防药，在上述神经变性疾病中的诊断项目的1个以上的项目中，本发明的痴呆症治疗药或预防药具有与给药前相比改善的效果、或通过给药抑制病态进行的程度或维持或恢复到给药前的状态的效果。

作为给予本发明的痴呆症治疗药或预防药的患者，是指作为痴呆症患者的、其中的Tau蛋白病的患者、其中的阿尔茨海默病(AD)、皮质基底核变性病(CBD或CBS)、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维变化型痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维变化病(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)、伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)、昏睡性脑炎后遗症、亚急性硬化性全脑炎或拳击者脑病中的任一种疾病的患者。因此，本发明的痴呆症治疗药是Tau蛋白病治疗药或预防药，从其他观点来看，还可以说是阿尔茨海默病(AD)、皮质基底核变性病(CBD或CBS)、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维变化型痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维变化病(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)、伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)、昏睡性脑炎后遗症、亚急性硬化性全脑炎或拳击者脑病等的治疗药或预防药。

另外，本发明的痴呆症治疗药或预防药还可以说是具有改善非人动物的认知功能、或抑制认知功能下降或维持认知功能的效果的药物。作为该非人动物，包括表达与人的tau具有高度同源性的tau的动物、黑猩猩、恒河猴、马、猪、狗、小鼠、兔、大鼠、猫等，但并不限于此。

[痴呆症的模型动物]

作为用于研究本发明的痴呆症治疗药或预防药的动物，可以列举痴呆症的模型动物，其中特别列举Tau蛋白病的模型动物。另外，作为Tau蛋白病的动物模型，是在脑中表达正常型或基因突变型tau的动物，特别是出现认知功能障碍的动物模型。这种在脑中表达正常型或基因突变型tau的动物可以通过基因操作来制作，作为其代表性的动物，可以列举转基因小鼠(Tg小鼠)。表达基因突变型tau的Tg小鼠等动物模型作为遗传性家族性Tau蛋白病的模型是有效的，但为了观察治疗药或预防药对于在人中占大多数的散发性Tau蛋白病的效果，希望在表达正常型tau的Tg小鼠中显示出效果。作为这种表达正常型tau的Tg小鼠，本发明的制备例中制作的小鼠最适合，但除此以外，也可以使用神户等人(Neurobiology ofDisease, 第42卷, 第404-414页, 2011年)或木村等人(The EMBO J. 第26卷. 第5143-5152页, 2007年)报道的Tg小鼠等。但是，虽然在神户等人的小鼠和木村等人的小鼠中确认到了认知功能障碍，但这些小鼠分别是14月龄和20月龄以上，所以是达到一定老龄后的发病，存在着还包含年龄增加所产生的影响的可能性、或长期饲养所产生的影响或费工的问题。相对于此，本发明的制备例中制作的小鼠是表达人的正常型tau、且在6月龄左右的较早期发生认知功能障碍的小鼠，因此最适合作为可以排除年龄增加等要因的痴呆症模型，通过使用这样的模型，可以更明确地评价具有认知功能改善效果的痴呆症治疗药或预防药。

作为在动物模型中研究本发明的痴呆症治疗药或预防药的作用的方法，优选对记忆学习试验等认知功能进行试验的方法。作为这样的方法，可以采用Morris水迷宫试验、一步完成法(step through)型学习试验、新奇物质识别试验等方法，但为了证实行为量或动物的不安等条件，希望组合旷场试验等行为测定试验的方法。

另外，作为研究本发明的痴呆症治疗药或预防药的作用的方法，还可以采用在对痴呆症模型动物给药时研究脑组织中的tau蛋白或磷酸化tau的增减的方法。据报道，在AD或其他神经变性疾病中，tau蛋白的表达量或异常磷酸化tau的增加与病态有关(KhalidIqbal等, Curr. Alzheimer Res., 7卷, 第654-664页, 2010年)。而且，在几个病态模型动物中，通过降低tau的表达或异常磷酸化tau的量，在认知功能或运动功能上看到改善，这也是公知的(K. SantaCruz等, Science, 309卷, 第476-481页, 2005年; Sylvie LeCorre等, Porc. Nat. Acad. Sci. USA, 103卷, 第9673-9678页, 2006年)。作为研究tau蛋白或磷酸化tau的增减的方法，如实施例所述，可以使用脑组织匀浆，通过蛋白质印迹等方法来实施，此外，本领域技术人员还可以适当选择ELISA法(Xiyun Chai等, J. Biol.Chem., 286卷, 第34457-34467页, 2011年)或组织免疫化学法(David J. Irwin等,BRAIN, 135卷, 第807-818页, 2012年)等来实施。

本发明中的痴呆症治疗药或预防药在模型动物中的效果可以用作人等中的治疗药或预防药的开发中的药理效果的数据。

[痴呆症治疗药或预防药]

作为本发明的痴呆症治疗药或预防药的形态，有含有抗磷酸化tau抗体的形态，优选为与相当于tau蛋白的SEQ ID NO: 1的410位～421位的氨基酸残基中的至少一个接受了磷酸化的tau蛋白特异性地进行抗原抗体反应的抗体，是与选自相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414和Ser416的氨基酸残基的一个以上的位点被磷酸化的tau蛋白进行抗原抗体反应的抗体，更优选为与VH的氨基酸序列为SEQ ID NO: 20、且VL的氨基酸序列为SEQ ID NO: 26的(1505)抗体竞争结合的抗体，进一步优选为与相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基的位点被磷酸化的tau蛋白进行抗原抗体反应的抗体。关于这种抗体的说明，记载在上述的“抗磷酸化tau抗体”部分。

作为本发明的痴呆症治疗药或预防药的其他形态，有含有包含tau的一部分序列、且其中1个以上的氨基酸残基被磷酸化的肽的形态，作为该肽，磷酸化肽是在由相当于SEQID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基构成的氨基酸序列中，至少包含连续的3个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽、优选至少包含连续的5个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽、更优选为至少包含连续的8个氨基酸且长度为8个氨基酸以上的肽。而且，在该磷酸化肽中被磷酸化的氨基酸残基是相当于SEQ ID NO: 1的氨基酸编号410～421的氨基酸残基中的任一个、优选相当于SEQ ID NO: 1的Ser412、Ser413、Thr414、Ser416的氨基酸的氨基酸残基中的任一个、更优选为相当于SEQ ID NO: 1的Ser413的氨基酸残基。关于这样的肽的说明，记载在上述的“具有来自tau的氨基酸序列的磷酸化肽”部分。

本发明的痴呆症治疗药或预防药可以含有药学上可接受的任一种添加剂。使用了药学上可接受的添加剂的制剂还可以按照“REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY 20th EDITION, University of the Sciences in Philadelphia著, Williams& Wilkins公司, 2000年12月15日发行”中记载的方法来实施。作为这样的治疗药或预防药的一种形态，以通过在无菌水性液或油性液中溶解、悬浮或乳化而调制的液剂的形式提供。作为这样的溶剂，作为水性液，可以列举注射用蒸馏水、生理盐水等，除此以外，有时还添加渗透压调节剂(例如D-葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等)，或者结合使用适当的助溶剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油50)等。另外，作为溶剂，有时还使用油性液，作为该油性液的例子，可以列举芝麻油、大豆油等，有时还结合使用苯甲酸苄酯、苄醇等作为助溶剂。在这样的液剂中，有时可以适当地使用缓冲剂(例如磷酸盐类缓冲剂、乙酸盐类缓冲剂)、无痛剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如抗坏血酸、异抗坏血酸及它们的盐等)、着色剂(例如叶绿素铜、β-胡罗卜素、红色2号、蓝色1号等)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯、苯酚、苄索氯铵、苯扎氯铵等)、增稠剂(例如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素及它们的盐等)、稳定化剂(例如人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇等)、矫臭剂(例如薄荷醇、柑橘香料等)等添加剂。另外，作为治疗药或预防药的其他形态，可以列举散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、锭剂等固体剂型。当为以口服用制剂的形式给药的固形剂型时，作为添加剂，使用赋形剂(例如结晶性纤维素、乳糖、淀粉等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉等)、粘合剂(羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇等)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素钙等)等。另外，根据需要，可以使用防腐剂(例如苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等添加剂。作为其他形态，还可以列举粘膜适用的治疗药或预防药，在该制剂中，以赋予在粘膜上的吸附性、滞留性等作为主要目的，有时还含有粘附剂、粘附增强剂、增稠剂、增稠化剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、卡拉胶、海藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、脱乙酰壳多糖、普鲁兰糖、腊样淀粉、硫糖铝、纤维素及其衍生物(例如羟丙基甲基纤维素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物或其盐、聚甘油脂肪酸酯等)作为添加剂。但是，供给生物体的治疗药或预防药的形态和溶剂或添加剂并不限于这些，本领域技术人员可以适当选择。

本发明的痴呆症治疗药或预防药还包括：除了混合上述的抗磷酸化tau抗体或磷酸化肽以外、还混合了现有的具有痴呆症进展抑制效果的物质的治疗药或预防药。另外，本发明的痴呆症治疗药或预防药还包括：用于将上述的含有抗磷酸化抗体或磷酸化肽的治疗药或预防药和现有的含有具有痴呆症进展抑制效果的物质的治疗药或预防药结合使用的试剂盒。作为抑制痴呆症进展的物质，例如可以列举多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)、美金刚胺(Memantine)或利凡斯的明(Rivastigmine)等，但并不限于此。作为所混合的具有痴呆症进展抑制效果的物质或含有具有痴呆症进展抑制效果的物质的治疗药或预防药的用量，可以按照通常用于治疗的用量来进行，但也可以根据状况而增减。

另外，本发明的实施例中使用的抗体，即使通过腹腔内给药这种来自末梢的给药也能够通过血脑屏障，在脑中发挥作用而显示出药效，这由实施例的结果得到了证明，但也可以制作用于将还用于本发明的痴呆症治疗药或预防药的抗磷酸化tau抗体有效地供给脑组织的制剂，这样的制剂也包括在本发明的痴呆症治疗药或预防药中。作为使抗体或肽等通过血脑屏障有效地供应到脑组织的方法，已知有添加靶向用物质的方法、或封入脂质体或纳米颗粒内的方法等。作为用于靶向的物质，可以使用通过与抗体结合而改变整体或部分的电荷特性的物质，或者使用具有与特异性受体或转运蛋白等结合的特性的肽或蛋白或化合物。作为具有与特异性受体或膜蛋白等结合的特性的肽或蛋白或化合物的例子，可以列举与受体的配体或膜蛋白结合的配体或其类似物、与受体的配体或膜蛋白结合的抗体、激动剂化合物/拮抗剂化合物/别构调节物或它们的类似化合物等。作为具有与特异性受体或转运蛋白等结合的特性的肽或蛋白或化合物的目标受体的配体或膜蛋白的例子，可以列举转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、LDL受体相关蛋白(LRP)或白喉毒素受体(HB-EGF)等，但并不限于此(Angela R. Jones等, Pharm. Res., 24卷, 第1759-1771页, 2007年)。用于靶向的物质还可以化学添加在本发明的痴呆症治疗药或预防药所使用的抗体中，作为其方法，本领域技术人员可以参照公知方法、例如Hermanson等 Bioconjugate techniques (USA) 1996年发行 Academic Press中记载的方法适当地进行。另外，用于靶向的物质可以与包含抗体或肽的脂质体或纳米颗粒结合(SonuBhaskar等, Particle and Fibre Toxicology, 7卷3号, 2010年)。而且，当用于靶向的物质是肽或蛋白时，本领域技术人员可以以肽化学合成的融合肽的形式制备，或者将包含编码肽或蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸与包含编码所使用的抗体或肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸组合，利用基因工程技术以适当的融合蛋白的形式制备。

本发明的治疗药或预防药以改善症状为目的，可以进行口服或胃肠外给药。进行口服给药时，可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、液剂、糖浆剂、乳剂或悬浮剂、酏剂等剂型。进行胃肠外给药时，例如可以制成经鼻剂，可以选择液剂、悬浮剂、固体制剂等。另外，作为其他的胃肠外给药的方式，可以制成注射剂，作为注射剂，可以选择皮下注射剂、静脉注射剂、点滴注射剂、肌肉注射剂、脑室内注射剂或腹腔内注射剂等。另外，作为其他的用于胃肠外给药的制剂，还可以列举栓剂、舌下剂、经皮剂、除经鼻剂以外的经粘膜给药物等。而且，还可以以包含或涂布于支架(stent)或血管内栓塞剂的方式，进行血管内局部给药。

本发明中的治疗药或预防药的给药量根据患者的年龄、性别、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间、或该药物组合物中所含的活性成分的种类等而不同，但通常成人每人每次可以以0.1mg～1g的范围、优选0.5mg～200mg的范围给予主剂。但由于给药量根据各种条件而变动，所以有时即使是少于上述给药量的量也足以，而有时又需要超过上述范围的给药量。

另外，本发明中的治疗药或预防药可以在短的给药期间内获得效果。

实施例

以下，根据实施例来进一步详细说明本发明，但这些实施例并不限定本发明。根据大阪市立大学阿倍野地区动物实验委员会的批准进行实验。

[实施例1] 抗pSer413肽的兔多克隆抗体的制作

为了制作抗pSer413肽抗体，使用在相当于人tau蛋白的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列第413位的Ser被磷酸化的、相当于第410位的Asn～第416位的Ser的氨基酸序列的C末端部位添加了Cys的合成肽(SEQ ID NO: 31. 由株式会社医学生物学研究所[MBL]合成)(以下，将该肽称作pSer413(S)肽)作为抗原。

pSer413(S)肽：N-AsnValSer(pSer)ThrGlySerCys-C (SEQ ID NO: 31)

合成pSer413(S)肽后，通过HPLC进行纯化，与钥孔戚血蓝素(Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)进行共价键合。使用0.1mg的所得缀合物对1只兔进行1次免疫。第1次免疫是通过将0.2mL缀合物溶液(缀合物浓度为0.5mg/mL)与等量的氟氏完全佐剂混合，在已剃毛的日本白色种兔背部的8个部位各皮内注射50μL来进行。第2次以后的免疫使用氟氏不完全佐剂，每隔2周再进行2次同样的免疫。从最后的免疫起2周后采集一部分血液，通过使用了免疫肽缀合物的ELISA法确认该血清中的抗体效价，在其1周后宰杀动物，采集全血。由得到的血液制作血清，使用pSer413(Af)肽(SEQ ID NO: 32)的亲和柱由该血清纯化抗体。

需要说明的是，血清抗体值的确认按照以下的方法进行。将pSer413(S)肽用PBS稀释至5μg/mL后，以100μL/孔分别注入板中，在4℃下静置一夜。除去溶液后，以250μL/孔分别注入封闭缓冲液(MBL公司制造)，在4℃下静置一夜。免疫前兔血清和免疫后兔血清的稀释系列设为100、500、2,500、12,500、62,500倍、空白，以100μL/孔加入经PBS稀释后的兔血清，在25℃下反应60分钟。清洗后，以100μL/孔加入将抗兔IgG-过氧化物酶标记(MBL公司制造)用稀释缓冲液(MBL公司制造)稀释了8,000倍的稀释物，在25℃下反应60分钟。清洗后，以100μL/孔加入显色液(MBL公司制造)，显色3～10分钟，再以100μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。反应停止后，在测定波长450nm、参照波长620nm下测定吸光度。

另外，纯化抗体的抗体反应性的确认按照以下方法进行。将pSer413(L)肽[将pSer413(S)肽(下划线部分)沿N端、C端方向进一步延长而获得的肽(SEQ ID NO: 33. 由Biosynthesis公司合成)：N-ProArgHisLeuSerAsnValSer(pSer) ThrGlySerIleAspMetValAsp-C]或虽然具有相同的氨基酸序列但相当于Ser413的位点没有被磷酸化的NonP(L)肽(SEQ ID NO: 34. 由Biosynthesis公司合成)用PBS稀释至1μg/mL后，以50μL/孔分别注入板中，在4℃下静置一夜。除去溶液后，以250μL/孔分别注入封闭缓冲液(3%的BSA-PBS)，在37℃下静置1小时以上。将纯化抗体用PBS稀释，以50μL/孔加入经系列化稀释后的抗体，在25℃下反应90分钟。清洗后，以50μL/孔加入将山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶标记(Bioscience公司制造)用稀释缓冲液(3%的BSA-PBS)稀释了2,000倍的稀释物，在25℃下反应60分钟。清洗后，以100μL/孔加入显色液(向含2.5mM MgCl₂的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中添加1mg/mL的PNPP[对硝基苯基磷酸盐(酯)]而得到的溶液)，显色30分钟，在测定波长405nm、参照波长550nm下测定吸光度。

＜结果＞

如图3所示，可知纯化后的抗体对pSer413(L)肽的特异性高，几乎不与nonP(L)肽反应。因此，该抗体是特异性地与pSer413(L)进行抗原抗体反应的抗体(在本说明书中，有时还记作“pSer413识别兔多克隆抗体”或“pS413AB”)。

[实施例2] 抗pSer413肽单克隆抗体(Ta15系列)的制作

使用在相当于SEQ ID NO: 1所示的人tau蛋白的氨基酸序列第413位的Ser的氨基酸残基被磷酸化的、相当于第403位的Thr～第423位的Pro的序列的N末端部位添加了GlyCysSerGly的合成肽pSer413(Im)肽(SEQ ID NO: 35)作为抗原。合成pSer413(Im)肽后，通过HPLC进行纯化，与钥孔戚血蓝素(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)进行共价键合。使用0.04mg所得缀合物对1只小鼠进行1次免疫。将0.4ml缀合物溶液(以肽换算计为1.1mg/ml)和0.7mL生理盐水以及1.1mL氟氏完全佐剂混合，通过对10只小鼠的腹腔内各注射200μL进行免疫。每隔2周再进行3次相同的免疫(免疫部位、抗原量均相同，使用氟氏不完全佐剂)。对于10只小鼠中对抗原的血清抗体效价唯一上升的1只小鼠，从最后免疫起1个月后，尾静脉内注射100μL以肽换算计为0.5mg/mL的抗原溶液(溶解于生理盐水中)，3天后宰杀动物，采集脾脏。使用2根18G注射针切开脾脏后，用橡胶塞面缓缓地压碎切开的脾脏。压碎后的脾细胞用10mL左右的冷RPMI1640培养基悬浮，用40μm的细胞滤过器过滤该上清，滤液采集到50mL离心管中。再用橡胶塞面压碎脾脏细胞的碎片，同样用冷RPMI1640培养基悬浮、过滤，采集滤液。加入冷RPMI1640培养基(或冷PBS)，使脾脏细胞悬浮液最终达到40mL。使用血细胞计数仪测定悬浮液中的淋巴细胞浓度，最终将相当于2×10⁷个细胞的淋巴细胞转移到50mL离心管中。向其中加入用培养液B(RPMI1640+10%胎牛血清+2mM谷氨酰胺+100μg/mL链霉素+100单位/mL青霉素)培养好的相当于4×10⁷个细胞的对数增殖期的小鼠·骨髓瘤细胞P3X63Ag8·U1株(简记为P3·U1)，以1500rpm离心5分钟，舍弃上清。通过敲打试管使细胞团块充分分散。向其中加入0.5mL的聚乙二醇溶液(由2.3mL RPMI1640+1.4mL聚乙二醇2000+0.3mL二甲基亚砜构成：以下简记为“PEG液”)，使细胞慢慢悬浮。1分钟后，用1分钟缓慢滴加0.5mL PEG液，再用1分钟缓慢滴加1.0mL RPMI1640，再用2分钟缓慢滴加2mL RPMI1640。之后，用2分钟滴加4mL HAT/GIT培养液(GIT培养基[日本制药]+5%的胎牛血清+100μg/mL的链霉素+100单位/mL的青霉素+95μM的次黄嘌呤+0.4μM的氨基蝶呤+16μM的胸苷)，再用2分钟滴加4mL HAT/GIT培养液。最后，加入HAT/GIT培养液，得到40-50mL的细胞悬浮液。在37℃下用恒温槽培养30分钟后，将其接种在7块96孔培养板中。需要说明的是，作为培养板，使用培养小鼠(ICR系)的腹腔巨噬细胞(饲养细胞)数天(＞1×10⁵/孔)后的96孔板(饲养板)。之后，将该板在37℃、5%CO₂下培养7～10天。

每周用新的HT培养液(从HAT/GIT培养液中除去了氨基蝶呤后的培养液)交换半量的培养液时，得到了杂交瘤。

抗体的筛选按照以下方法进行。将pSer413(L)肽用PBS稀释至1μg/mL后，以50μL/孔分别注入96孔板中，在4℃下静置一夜。除去溶液后，以250μL/孔分别注入封闭缓冲液(3%的BSA-PBS)，在室温下放置1小时以上。吸引封闭缓冲液(3%的BSA-PBS)，以30～50μL/孔加入杂交瘤的上清，在25℃下反应60分钟。用含有0.05%Tween20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-Tween)清洗后，以100μL/孔加入二次抗体(用封闭缓冲液稀释了2000倍的添加了碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG-Fc抗体[SouthernBiotech公司]的溶液)，在25℃下反应60分钟。清洗后，以100μL/孔加入底物溶液(向含有2.5mM MgCl₂的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中添加0.7～1.2mg/mL的PNPP[对硝基苯基磷酸盐(酯)]而得到的溶液)，在25℃下显色60分钟后，在测定波长405nm下测定吸光度。

通过该筛选，从显示出阳性的孔中取出细胞，用血细胞计数仪计数细胞数量后，以1～3个细胞/孔接种在96孔板(之前的饲养板)中，利用有限稀释法进行克隆(Ta1501、Ta1502、Ta1505～1509)。为了以后的分析用，大量培养克隆后，使用蛋白G柱纯化抗体。Ta1505和Ta1505-2相同。同种型的确定使用AbD serotec公司的试剂盒来进行。

使纯化后的抗体与包被了针对tau的各种磷酸化位点的部分肽的ELISA板反应，研究磷酸基特异性。方法如下。

使用PBS(pH7)将各种tau肽(pS46[SEQ ID NO: 36]、pS199[SEQ ID NO: 37]、pS202[SEQ ID NO: 38]、pT212[SEQ ID NO: 39]、pS214[SEQ ID NO: 40]、pT212/pS214[SEQ ID NO: 41]、pT217[SEQ ID NO: 42]、pS413[SEQ ID NO: 33]、non pS413[SEQ IDNO: 34])的10% DMSO溶液或者肽的BSA缀合物(pS400[SEQ ID NO: 43]-BSA、pS412[SEQ IDNO: 44]-BSA)的PBS溶液稀释至1μg/mL，以50μL/孔添加在96孔板(MaxiSorp：Nunc公司)中，在4℃下培养一夜，进行固定。之后，除去肽溶液，用含有0.05%Tween20的TBS清洗3次后，以280μL/孔添加3%的BSA/PBS，在37℃下封闭1小时。

吸引除去封闭液，用含有0.05%Tween20的TBS清洗3次后，以50μL/孔添加各种Ta15系列的单克隆抗体溶液(1μg/mL，用3% BSA-PBS稀释)，在室温下反应1小时。用含有0.05%Tween20的TBS清洗3次后，加入50μL用含有3% BSA的PBS稀释至2000倍的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(ThermoScience公司)，在室温下反应1小时。用含有0.05%Tween20的TBS清洗3次后，加入100μL溶解于0.1M二乙醇胺(pH10)中的1mg/mL的PNPP(对硝基苯基磷酸盐(酯))的溶液，在室温下反应1小时，测定405nm下的吸光度。各抗体相对于各种肽的反应性评价结果见表2。反应性分3个等级进行评价。+：有反应性；-：无反应性；±：确认到一些反应性，但非常弱。

[表2]

在所研究的肽中，这些抗体(以下称作“Ta15系列”。)只与pSer413反应，磷酸基特异性极高。

[实施例3] Ta15系列抗体的结合亲和性测定

为了评价Ta15系列抗体与抗原肽(pSer413肽(Im)：参照实施例2)的结合亲和性，使用表面等离振子共振(SPR)系统Biacore(GE Healthcare·Japan株式会社、BIACORE3000、code＃BR-1100-45)和各Biacore制品，依据操作说明书进行测定。其中的一种测定方法如下：通过胺偶联反应的共价键合将抗小鼠抗体(code＃BR-1008-38)固定在CM5芯片(形成有羧甲基葡聚糖层的芯片，code＃BR-1100-14)上(code＃BR-1006-33)，使Ta15系列抗体与固定化的抗小鼠抗体结合，对于所结合的Ta15系列抗体，测定抗原肽的结合动力学。

以HBS-EP缓冲液(code＃BR-T-1001-88)作为特异性结合的反应溶液，利用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液来活化CM5芯片。使用10mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)将抗小鼠抗体稀释至0.001mg/mL，使得到的稀释溶液与芯片上的4个流动池(flow cell)反应，使抗小鼠抗体与CM5芯片进行共价键合，之后用乙醇胺进行封闭。在固定有抗小鼠抗体的4个流动池中，在1个流动池中以1000RU左右的密度捕集阴性抗体(小鼠IgG2a同种型对照，R＆D Systems公司，code＃MAB003)，在其他流动池中以1000RU左右的密度捕集Ta15系列抗体。与添加了1M NaCl的HBS-EP缓冲液(0.01M的HEPES pH7.4、0.15M的NaCl、3mM的EDTA、0.005%v/v的SurfactantP20)反应3分钟，除去非特异性吸附的抗体，使HBS-EP缓冲液以50uL/分钟的流速反应10分钟，使基线稳定。使用HBS-EP缓冲液将肽在100pM～5mM的浓度之间(估算结合解离常数[KD]附近)进行阶段稀释，使得到的肽溶液(5种浓度)一律从低浓度侧起连续地各间隔6分钟进行4分钟～6分钟的反应，测定结合动力学。

作为抗原肽的特异性结合动力学数据，为了消除由操作产生的噪声(noise)的影响，得到作为阴性肽的非磷酸化肽(non pSer413肽)的结合动力学数据，并将其从抗原肽的结合动力学数据中扣除。需要说明的是，在测定浓度方面没有确认到非磷酸化肽与抗体的结合。使用Biacore分析软件(BIAevaluation：单循环动力学分析(Single cycle kineticsanalysis)，code#AP-4000-01)，通过Single cycle kinetics 1:1 binding with driftmodel拟合特异性结合动力学数据，同时得到了动力学的缔合速度(Ka)和解离速度(Kd)(Karlsson. R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006).“Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.” Anal.Biochem. 349(1): 136-47)。由Kd/Ka算出作为Ta15系列抗体的亲和性测定值的平衡解离常数(KD)值。

＜结果＞

[表3]

在Ta15系列抗体中，与抗原肽的亲和性最强的Ta1505抗体被用于使用了记忆障碍小鼠的行为试验。

[实施例4] 识别pSer396和/或pSer404肽的单克隆抗体的制作

使用在相当于SEQ ID NO: 1所示的人tau蛋白的氨基酸序列第396位、第404位的Ser的氨基酸残基被磷酸化的第379位的Arg～第408位的Leu序列N末端部位添加了GlyCys的合成肽(SEQ ID NO: 47：由Biosynthesis公司合成)作为抗原(以下，将该肽称作pSer396/pSer404肽)。

pSer396/pSer404肽：N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyr Lys(pSer)ProValValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C(SEQ ID NO:47)

合成pSer396/pSer404肽后，通过HPLC进行纯化，使用约0.04mg的与马来酰亚胺活化KLH(钥孔戚血蓝素)(Thermo Scientific公司)进行共价键合而得到的缀合物对1只Balb/c小鼠进行1次免疫。通过将0.3mL(以肽换算计为0.77mg/ml)缀合物溶液和0.3mL氟氏完全佐剂混合，并对4只小鼠腹腔内各注射100μL来进行免疫。对于其中的2只，间隔2周再进行2次腹腔内免疫(抗原量相同，使用氟氏不完全佐剂)和足底免疫(使用抗原+Titer Max的佐剂)，对于剩下的2只，间隔2周再进行2次腹腔内免疫。对于相对于抗原的血清抗体效价高、且进行了腹腔内免疫和足底免疫的小鼠，自最后免疫起15天后，尾静脉内注射抗原溶液(溶解于生理盐水中)，3天后宰杀动物，取出脾脏。用2根18G注射针切开脾脏后，用橡胶塞面缓慢地压碎切开的脾脏。压碎的脾细胞用10mL左右的冷RPMI1640培养基悬浮，用40μm细胞滤过器过滤其上清，采集滤液到50mL离心管中。再用橡胶塞面压碎脾脏细胞的碎片，同样用冷RPMI1640培养基悬浮、过滤，采集滤液。加入冷RPMI1640培养基(或冷PBS)，使脾脏细胞悬浮液最终达到40mL。使用血细胞计数仪测定悬浮液中的淋巴细胞浓度，最终将相当于2×10⁷个细胞的淋巴细胞转移到50mL离心管中。向其中加入用培养液B(RPMI1640+10%胎牛血清+2mM谷氨酰胺+100μg/mL链霉素+100单位/mL青霉素)培养好的相当于4×10⁷个细胞的对数增殖期的小鼠·骨髓瘤细胞P3·U1，以1500rpm离心5分钟，舍弃上清。通过敲打试管使细胞团块充分分散。向其中加入0.5mL PEG液，使细胞慢慢悬浮。1分钟后，用1分钟缓慢滴加0.5mL PEG液，再用1分钟缓慢滴加1.0mL RPMI1640，再用2分钟缓慢滴加2mL RPMI1640。之后，用2分钟滴加4mL HAT/GIT培养液(GIT培养基[日本制药]+5%胎牛血清+100μg/mL链霉素+100单位/mL青霉素+95μM次黄嘌呤+0.4μM氨基蝶呤+16μM胸苷)，再用2分钟滴加4mL HAT/GIT培养液。最后，加入HAT/GIT培养液，形成40-50mL细胞悬浮液。在37℃下用恒温槽培养30分钟后，将其接种在7块96孔培养板上。需要说明的是，作为培养板，使用培养小鼠(ICR系)的腹腔巨噬细胞(饲养细胞)数天(＞1×10⁵/孔)的96孔板(饲养板)。之后，将该板在37℃、5%CO₂下培养7～10天。

每周用新的HT培养液(从HAT/GIT培养液中除去了氨基蝶呤后的培养液)交换半量的培养液，得到杂交瘤。

单克隆抗体的筛选如下进行。作为筛选用抗原，使用在pSer396/pSer404肽(N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProValValSerGlyAsp Thr(pSer)ProArgHisLeu-C)(SEQ ID NO: 47)的N端Cys上缀合了BSA的pSer396/pSer404肽-BSA、以及在非磷酸化肽(N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleVal TyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeu-C)(SEQ IDNO: 48)的N端Cys上缀合了BSA的非磷酸化肽-BSA。将非磷酸化肽-BSA或pSer396/pSer404肽-BSA用PBS稀释至1μg/mL后，以50μL/孔分别注入96孔板中，在4℃下静置一夜。除去溶液后，以250μL/孔分别注入封闭缓冲液(3%的BSA-PBS)，在室温下放置1小时以上。吸引封闭缓冲液(3%的BSA-PBS)，以30～50μL/孔加入杂交瘤的上清，在25℃下反应60分钟。用含有0.05%Tween20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-Tween)清洗后，以100μL/孔加入检测用试剂(向封闭缓冲液中添加稀释至2,000倍的碱性磷酸酶标记蛋白A而获得的溶液)，在25℃下反应60分钟。清洗后，以100μL/孔加入底物溶液(向含有2.5mM MgCl₂的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中添加0.7～1.2mg/mL的PNPP[对硝基苯基磷酸盐(酯)]而得到的溶液)，在25℃下显色60分钟后，在测定波长405nm下测定吸光度。

从与非磷酸化肽-BSA的反应性低、而与pSer396/pSer404肽-BSA的反应性高的孔中取出细胞，以1-3个细胞/孔接种在96孔板(之前的饲养板)中，利用有限稀释法进行克隆。从中选出产生Ta9抗体(IgG3/κ)的克隆。为了以后的分析用，大量培养克隆后，用蛋白G柱纯化抗体。

按照实施例3记载的方法测定Ta9抗体对于pSer396/pSer404肽的KD值时，KD值为1.08×10^-10，与Ta15系列抗体相比，其对肽的亲和性高。

[实施例5] 行为试验：获得抗体对记忆学习障碍小鼠的影响

研究以下3种抗体的给药对记忆学习障碍小鼠(Tau-Tg)的影响。

(1) pSer413识别兔多克隆抗体：使用9-11月龄的Tau-Tg(609株系)小鼠或non-Tg小鼠(正常对照)，n＝9-10/组；

(2) Ta1505(pSer413识别单克隆抗体)：使用14月龄的Tau-Tg(784株系)小鼠或non-Tg小鼠，n＝9-10/组；

(3) 使用14月龄的Ta9(pSer396识别单克隆抗体)、Tau-Tg(609株系)小鼠或non-Tg小鼠，n＝9-10/组。

实验中使用9-14月龄雄性的异源突变Tau-Tg小鼠(609株系或784株系)、及其non-Tg同窝出生仔鼠。以组间不存在平均体重差的方式进行分组。对于异源突变Tau-Tg小鼠，每次每只腹腔给予1mg用PBS或枸橼酸缓冲液(pH5)稀释的抗体，1周1次，共计5次。作为阴性对照组，腹腔给予相同用量的在调制抗体时使用的缓冲液或对tau没有反应性的小鼠IgG单克隆抗体。作为阳性对照，对non-Tg同窝出生仔鼠腹腔给予相同用量的在调制抗体时使用的缓冲液。

(1)～(3)的组构成如下所示。

(1) <使用小鼠>：突变Tau-Tg(609株系)，9-11mo(9-11月龄)

＜组构成＞

评价抗体组：1.6mg/mL溶解于PBS中的抗tau pSer413兔多克隆抗体(n＝10)；

对照抗体组：PBS(n＝9)；

non-Tg组：PBS(n＝9)；

(2) ＜使用小鼠＞：突变Tau-Tg(784株系)，14mo(14月龄)

＜组构成＞

评价抗体组：3.84mg/ml溶解于0.1M枸橼酸盐缓冲液(pH5)中的抗tau pSer413小鼠单克隆抗体Ta1505 (n＝10)；

对照抗体组：4.28mg/ml溶解于0.1M枸橼酸盐缓冲液(pH5)中的抗绿脓杆菌小鼠单克隆抗体4C10F4 (n＝9)；

non-Tg组：0.1M的枸橼酸盐缓冲液(pH5)(n＝9)。

(3) ＜使用小鼠＞：突变Tau-Tg (609株系)，14mo(14月龄)

＜组构成＞

评价抗体组：2.66mg/ml溶解于0.02M枸橼酸盐缓冲液(pH6)中的抗tau pSer396小鼠单克隆抗体Ta9 (n＝10)；

对照抗体组：4.50mg/ml溶解于0.02M枸橼酸盐缓冲液(pH6)中的抗绿脓杆菌单克隆抗体6F11 (n＝9)；

non-Tg组：0.02M的枸橼酸盐缓冲液(pH6)(n＝9)。

从最终给药的次周的周一起，使用Morris水迷宫进行空间参照记忆(spatialreference memory)试验(水迷宫试验)。水迷宫试验结束次日起，使用旷场装置测定小鼠的自发运动量(旷场试验)。

＜水迷宫试验：(1)～(3)共通＞

准备：在内径100cm、高45cm的黑色池内装入16cm深的水。调整水温达到21～23度，不用氧化钛等进行着色，保持无色透明。也不添加氯，每Trial日后清除粪便，并每次换水约10L。Trial(获得)试验：使15cm高的透明平台沉入距离壁20cm(距中心30cm)的位置。包括沉入平台的场所在内划分成4个象限，只从没有平台的3个象限中的任一个象限随机投入小鼠。1次尝试以60秒为限，按5次尝试/天来进行。1次尝试的间隔为约5分钟。记录小鼠好容易才走到平台的逃逸时间(escape time)作为数据。对于60秒以内没有逃避的小鼠，通过操作员的手将其向平台诱导，逃逸时间算作60秒。平台上的小鼠10秒后从池中挪开，在下次尝试之前让其自由活动，干燥其身体。小鼠每天的成绩采用5次尝试的逃逸时间的平均秒数。

在对照组(non-Tg)的成绩稳定的时间点结束获得试验，次日进行探测试验。

探测试验：在最终日的次日，从池中挪开平台，用数码相机拍摄60秒间的自由游泳。观察拍摄的视频，测定自由游泳中的小鼠在4个象限中的存在平台的象限(靶象限)内游泳的时间，以60秒间的百分率表示。此时，对于投入池中之后30秒为止的游泳也同样地进行分析。

Trial(获得)试验的显著性差异检验通过重复测量、Fisher’s PLSD来进行，而探测试验的显著性差异检验通过Fisher’s PLSD来进行。

＜旷场试验：(1)～(3)共通＞

装置：使用5mm厚的透明丙烯酸酯板制作30×30×30cm的正方形箱子，收藏在隔音环境中。在收藏环境上部设置40w的白炽灯，以110lux的照度照射板面(floor face)。

行为量：(i) 在丙烯酸酯箱的侧面外侧、距板面1.5cm的位置以10cm的间隔设置红外线光束。在小鼠连续阻断2个光束时，进行检测、计数，作为运动(locomotion)。

(ii) 在相对的2个侧面的、距板面3.5cm的位置设置红外线光束面。在小鼠阻断一部分光束面时，进行检测、计数，作为饲养(rearing)。

试验：给小鼠1次20分钟的活动时间(session)。将小鼠投入丙烯酸酯箱中央部，迅速关门，形成隔音环境，之后活动时间开始。

在活动时间的前10分钟在明亮条件下测定自由行为，在后10分钟取消照明，测定黑暗条件下的自由行为。

分析：小鼠每分钟的行为量分别以运动、饲养的方式用折线图显示。

自活动时间开始起10分钟后小鼠对变成黑暗条件的环境变化有所反应，可以确认小鼠在行为量上出现变化时，定义为视觉正常。

明亮条件、黑暗条件的各自的总行为量、以及20分钟的总行为量用柱形图显示。

就运动、饲养的总行为量进行组间的显著性差异检验。

虽然解释为运动主要是自发行为量、而饲养主要是探查行为量，但实际上两者的指标相互影响(例：即使运动看上去是在减少，但如果此时饲养实际上是在上升，则不能说行为量减少)。

＜免疫组织化学试验；只实施(2)＞

行为试验结束后，从各组各选出5只，用福尔马林进行回流固定。石蜡包埋后，使用切片机由脑制作薄切切片，用二甲苯、乙醇各处理10分钟，处理4次，进行脱石蜡处理。用枸橼酸缓冲液(pH6)进行30分钟的煮沸处理(抗原活化处理)，恢复至室温后，用Tris缓冲生理盐水(TS)清洗10分钟，清洗2次。使用含有20%牛血清的TS在室温下封闭60分钟后，包埋(mount)小鼠抗人突触素抗体(将SIGMA公司的SVP-38用含有10%牛血清的TS稀释200倍而获得的抗体)，在4℃下处理一夜。用TS清洗10分钟，清洗2次后，包埋FITC标记抗小鼠IgG抗体(将VECTOR公司的该抗体用含有10%牛血清的TS稀释20倍而获得的抗体)，在室温下处理60分钟。用TS清洗10分钟、清洗2次后，包埋VECTASHIELD (VECTOR公司)，进行显微镜观察。通过NIH image J对荧光强度进行定量、数值化，用任意单位(arbitrary unit)表示。

＜结果＞

1. 各抗体的给药对记忆障碍的影响

(1) pSer413兔多克隆抗体

(1-1)～(1-3)的结果见图4～图7。总体说来，通过抗pSer413多克隆抗体的被动免疫，模型小鼠(Tau-Tg)中的记忆障碍显著改善，达到与non-Tg相同的水平。需要说明的是，在(1-3)中，在各组间的自发运动和视觉上没有发现显著性差异。

(2) pSer413小鼠单克隆抗体(1505抗体)(2-1)～(2-3)的结果见图8～图11。总体说来，通过抗pSer413单克隆抗体的被动免疫，模型小鼠中的记忆障碍显著改善，达到与non-Tg相同的水平。需要说明的是，在(2-3)中，在各组间的自发运动和视觉上没有发现显著性差异。

根据(2-1)和(2-2)的结果，认为pSer413表位对于多克隆抗体、单克隆抗体而言均是作为被动免疫疗法的靶的良好表位。

(3) pSer396小鼠单克隆抗体(Ta9抗体)

(3-1)～(3-3)的结果见图12～图15。总体说来，通过给予Ta9，记忆障碍显著改善，达到与non-Tg相同的水平。需要说明的是，在(3-3)中，在各组间的自发运动和视觉上没有发现显著性差异。

但是，与Ta1505相比，Ta9的药效弱。虽然抗原亲和性是Ta9＞Ta1505(参照实施例2、3)，但药效却是Ta9＜Ta1505(实施例5)，由此暗示：因磷酸化表位的不同，而产生了药效的差异。

[实施例6] Ta1505抗体给药对神经功能的影响

通过作为记忆中枢的海马CA3区的抗突触素抗体的免疫染色，研究Ta1505抗体给药对作为反映神经功能的标志物而已知的突触素量的影响。荧光强度通过NIH-Image J来定量。

结果见图16。通过给予Ta1505抗体，看到了海马突触素量的恢复，但并不显著。

[实施例7] Ta15系列单克隆抗体cDNA的核苷酸序列的确定

(1) 杂交瘤总RNA的纯化

培养各种产生单克隆抗体的杂交瘤，6孔板的每1个孔使用1mL的ISOGEN，溶解细胞。在该溶解液中加入0.2mL氯仿，通过涡流进行混合，在室温下放置2～3分钟。以12000rpm在4℃下离心10分钟，将上层转移到新的管中。向其中加入0.5mL异丙醇，混合，在室温下放置10分钟。将其在15000rpm、4℃下离心15分钟，使总RNA沉淀。在团块(pellet)中加入1mL75%的乙醇，充分混合后，在10000rpm、4℃下离心5分钟。将团块风干，溶解于不含DNase、RNase的水中，在-80℃下保存。

(2) 通过5’-RACE、3’-RACE获得H链、L链cDNA以及该cDNA的核苷酸序列的确定

根据已知的小鼠IgG2a和IgG2b的H链恒定区cDNA序列，合成5’-RACE(cDNA末端快速扩增，Rapid Amplified of cDNA Ends)和3’-RACE用的引物。同样，根据小鼠L链恒定区的cDNA序列，合成5’-RACE(cDNA末端快速扩增)和3’-RACE用的引物。

另一方面，使用从杂交瘤中采集的1μg总RNA，使用SMART-RACE试剂盒(Clonetech公司制造)，进行5’-RACE、3’-RACE用cDNA的合成，施行5’-RACE和3’-RACE。PCR反应则使用Advantage 2 polymerase Mix(Clonetech公司制造)按照附带的实验设计(protocol)来进行。将通过5’-RACE、3’-RACE得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中切出主要的增幅DNA片段，插入TA克隆载体(Invitrogen公司制造)中，在大肠杆菌中转化，分别得到多个克隆。按照常规方法由这些转化体调制质粒，确定插入的DNA片段的核苷酸序列。

(3) H链、L链全长cDNA的获得和该cDNA的核苷酸序列的确定

根据核苷酸序列信息，确定编码H链和L链的N末端和C末端的cDNA序列，还设计了用于扩增全长序列的正向和反向引物。使用该引物，通过Prime STAR MaxPCR(TaKaRa公司制造)扩增H链、L链的全长，将其PCR片段克隆到pEF4载体中。使用该产物，最终确定全长cDNA序列。

由得到的核苷酸序列信息翻译成氨基酸序列，再使用IgBLAST(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，按照KABAT的方法(Kabat, E.A. and Wu, T.T., J.Immunol., 147, 1709-1719, 1991年)进行CDR区的鉴定。

得到的CDR区的序列见SEQ ID NO: 14。

根据这些序列的同源性，得到关于用于特异性识别pSer413的抗体的CDR序列的信息(表4～表6)。

[表4]

各单克隆抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列

单克隆抗体克隆	CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3
				Ta1501	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 13
Ta1502	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 13
				Ta1505	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 13
Ta1506	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 13
				Ta1507	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 13
Ta1508	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 13
				Ta1509	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 13

[表5]

各单克隆抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列

单克隆抗体克隆	CDR-L1	CDR-L2	CDR-L3
				Ta1501	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
Ta1502	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
				Ta1505	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
Ta1506	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
				Ta1507	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
Ta1508	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
				Ta1509	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17

[表6]

各单克隆抗体的VH和VL的氨基酸序列

单克隆抗体克隆	VH	VL
			Ta1501	SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO: 25
Ta1502	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 26
			Ta1505	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 26
Ta1506	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 27
			Ta1507	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 28
Ta1508	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 29
			Ta1509	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 30

[实施例8] 行为试验：获得抗体对记忆学习障碍小鼠的影响

在以下两种抗体的0.1mg的给药中，研究对记忆学习障碍小鼠的影响。

(4) Ta1505(pSer413识别单克隆抗体)：使用10月龄的Tau-Tg(784株系)小鼠或non-Tg小鼠、n＝9-10/组；

(5) Ta9(pSer396识别单克隆抗体)：使用11月龄的Tau-Tg(784株系)小鼠或non-Tg小鼠、n＝8-10/组。

实验中使用10-11月龄雄性的异源突变Tau-Tg小鼠(784株系)及其non-Tg同窝出生仔鼠。以组间不存在平均体重差的方式进行分组。对于异源突变Tau-Tg小鼠，每次每只腹腔给予0.1mg用PBS稀释的抗体，1周1次，共计5次。作为阴性对照组，腹腔给予相同用量的在调制抗体时使用的PBS或对tau没有反应性的小鼠IgG单克隆抗体。作为阳性对照，对non-Tg同窝出生仔鼠腹腔给予相同用量的在调制抗体时使用的PBS。

(4)～(5)的组构成如下所示。

(4)＜使用小鼠＞：突变Tau-Tg(784株系)，10mo

＜组构成＞

评价抗体组：0.25mg/ml溶解于PBS中的抗tau pSer413小鼠单克隆抗体Ta1505 (n＝10)；

对照抗体组：0.25mg/ml溶解于PBS中的抗-绿脓杆菌小鼠单克隆抗体4C10F4 (n＝10)；

non-Tg组：PBS(n＝9)。

(5)＜使用小鼠＞：突变Tau-Tg(784株系)，11mo

＜组构成＞

评价抗体组：0.25mg/ml溶解于PBS中的抗tau pSer396小鼠单克隆抗体Ta9 (n＝10)；

对照抗体组：0.25mg/ml溶解于PBS中的抗-绿脓杆菌单克隆抗体6F11 (n＝8)；

non-Tg组：PBS(n＝8)。

从最终给药的次周的周一起，使用Morris水迷宫进行空间参照记忆(spatialreference memory)试验(水迷宫试验)。水迷宫试验与实施例5同样地进行。

＜结果＞

1. 各抗体的给药对记忆障碍的影响

(4) pSer413小鼠单克隆抗体(1505抗体)

Trial试验(4-1)、探测试验(4-2)的结果见图18和图19。总体说来，通过抗pSer413单克隆抗体的被动免疫，与non-Tg相比，模型小鼠中的记忆障碍改善达到了50%以上的水平。

根据(4-1)和(4-2)的结果，pSer413表位单克隆抗体的药效在0.1mg的给药中得到了确认。

(5) pSer396小鼠单克隆抗体(Ta9抗体)

Trial试验(5-1)、探测试验(5-2)的结果见图20和图21。总体说来，在Ta9的给药中，在0.1mg的给药中记忆障碍没有得到改善。

根据这些试验，在0.1mg的给药中进一步明确地暗示了因磷酸化表位的不同引起的药效差异。

需要说明的是，每只小鼠给予0.1mg的抗体，这相当于约2.5mg/kg的给药用量。

[实施例9] Ta1505抗体给药引起的脑内磷酸化Tau量的变化

关于作为记忆中枢的海马区，通过pSer413识别Ta1505抗体和AT8抗体(PHF识别pSer202/pThr205表位)的免疫组织染色，研究Ta1505抗体给药对Tau-Tg小鼠脑内的磷酸化Tau量的影响。

行为试验结束后，从各组中各选出5只，用4%的多聚甲醛/PBS进行回流固定。取出脑，进行石蜡包埋，用切片机制作5μm薄切切片。用二甲苯和乙醇各处理10分钟，处理4次，再进行脱石蜡处理，在pH2、室温下对切片进行10分钟的煮沸处理(抗原活化处理)。恢复至室温后，用Tris缓冲生理盐水(TS)清洗10分钟，清洗2次。用含有20%牛血清的TS在室温下封闭60分钟。

包埋用含有10%牛血清的TS稀释至1ug/mL的抗tau抗体(Ta1505、AT8)，在4℃下处理一夜。用TS清洗10分钟、清洗2次后，用含有10%牛血清的TS稀释了500倍的生物素标记抗小鼠抗体(VECTOR公司)，在室温下处理60分钟。

用TS清洗10分钟、清洗2次后，包埋HRP标记ABC液(VECTOR社)，在室温下反应30分钟，再次清洗后，用二氨基联苯胺(DAB)显色。用Entellan(Merck)密封，观察、摄影。

用Ta1505进行的免疫组织染色结果见图22～图24。

在图22中，在对照IgG给药组的5个个体的海马CA3区(左起第1列)和海马CA23区(左起第2列)确认到Ta1505阳性Tau的染色，但确认到Ta1505给药组的5个个体的海马CA3区(左起第3列)和海马CA23区(左起第4列)的染色水平较对照IgG给药组明显降低。由此可知，通过给予Ta1505，在海马CA3区和海马CA23区确认到Ta1505阳性Tau即Ser413磷酸化Tau的减少。更详细而言，在对照IgG组中，茶色细点聚集，在CA3中从左向右染色成粗线状。在CA23中，从右上向左横被染成粗曲线状。在Ta1505给药组中，非常浅的茶色细点聚集，在CA3中从左上向右下被染色成粗线状。在CA23中从右上向左横被染成粗曲线状。在CA3的4个个体和CA23的3个个体中几乎没有确认到染色。

在图23和24中，在对照IgG给药组的5个个体的皮质区(Perirhinal Cortex(图23左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(图23左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(图23左起第3列))中确认到了AT8阳性Tau的染色。(在图23中染色成茶色斑点状)

Ta1505给药组的5个个体的皮质区(Perirhinal Cortex(图24左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(图24左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(图24左起第3列))中的染色水平较对照IgG给药组明显降低，确认到了染色没有达到能够确认到的水平。

由此可知，通过给予Ta1505，在皮质区(Perirhinal Cortex、Lateral EntrhinalCortex、Medial Entrhinal Cortex)确认到Ta1505阳性Tau即Ser413磷酸化Tau的减少。

在图23中，被染成茶色斑点状，但在图24中，几乎无法确认到茶色斑点状的染色。

在脑内(＝海马CA3区、海马CA23区、PRh、Ent(Lateral、Medial))，通过给予Ta1505抗体，确认到Ser413磷酸化Tau量的减少。

PRh＝Perirhinal Cortex

Ent＝Entrhinal Cortex

用AT8进行的免疫组织染色结果见图25～图27。

在图25中，在对照IgG给药组的5个个体的海马CA3区(左起第1列)和海马CA23区(左起第2列)确认到了AT8阳性Tau的染色，但确认到Ta1505给药组的5个个体的海马CA3区(左起第3列)和海马CA23区(左起第4列)的染色水平较对照IgG给药组明显降低。由此可知，通过给予Ta1505，在海马CA3区和海马CA23区确认到了AT8阳性Tau即Ser202/Thr205磷酸化Tau的减少。具体而言，在图25中，对照IgG组中茶色细点聚集，在CA3中从左上向右下被染色成粗线状。在CA23中，从右上向左横被染成粗曲线状。Ta1505给药组中，非常浅的茶色细点聚集，在CA3中从左上向右下被染色成粗线状。在CA23中，从右上向左横被染成粗曲线状。

在图26中，在对照IgG给药组的5个个体的皮质区(Perirhinal Cortex(图26左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(图26左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(图26左起第3列))确认到了AT8阳性Tau的染色。(在图26中，染色成茶色斑点)

在图27中，确认到Ta1505给药组的5个个体的皮质区(Perirhinal Cortex(图27左起第1列)、Lateral Entrhinal Cortex(图27左起第2列)、Medial Entrhinal Cortex(图27左起第3列))的染色水平较对照IgG给药组明显降低。(在图27中染色成浅茶色斑点)

由此可知，通过给予Ta1505，在皮质区(Perirhinal Cortex、Lateral EntrhinalCortex、Medial Entrhinal Cortex)确认到了AT8阳性Tau即Ser202/Thr205磷酸化Tau的减少。在脑内(＝海马CA3区、海马CA23区、PRh、Ent(Lateral、Medial))，通过给予Ta1505抗体，确认到了AT8识别的Ser202/Thr205磷酸化Tau量的减少趋势。

该结果是，通过给予抗体，显示出脑内的病态改善，证实了上述记忆障碍的改善效果。另外，该结果显示：腹腔内给药的抗体在脑内发挥作用。

[实施例10] Ta1505抗体给药对脑内Tau量的影响

使用认为识别构成PHF的过磷酸化Tau的AT8抗体(pSer202/pThr205识别小鼠单克隆抗体、INNAＸ公司制造)、G2(抗人特异性N末端区识别抗体：兔多克隆抗体)、PHF1(认为识别构成PHF的过磷酸化Tau的pSer396/pSer404识别小鼠单克隆抗体)和Ta1505，使用抗体给药后的Tau-Tg小鼠脑匀浆，通过蛋白质印迹研究1505抗体给药对脑匀浆中的Tau和过磷酸化Tau量的影响。

对100-200mg小鼠大脑半球用5倍量的TBS(含蛋白酶抑制剂的混合物、磷酸酶抑制剂混合物)进行超声处理。将其以100,000g在4℃下离心分离15分钟，回收上清作为TBS可溶性组分。

再将沉淀悬浮于1%肌氨酰/TBS(含蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物)中，在室温下培养1小时。将其以100,000g在室温下离心分离15分钟，以上清作为肌氨酰可溶性组分。

将该TBS可溶性组分、肌氨酰可溶性组分用7% Tris-乙酸盐凝胶进行电泳、分离，转移到PVDF膜上，使用1% BSA/3%脱脂乳/0.05%Tween20/TBS在室温下封闭一夜。之后，与抗体溶液反应，使用HRP缀合物抗体作为二次抗体，通过ECL法进行反应，利用LAS3000图像分析仪进行分析、定量。

结果见图28和图29。

在TBS可溶性组分中，通过给予Ta1505抗体，确认到Tau-Tg小鼠脑内的人Tau(用G2抗体识别)和过磷酸化Tau(用AT8(pS202/pT205表位)、PHF1(pS396/pS404表位)识别)、pS413Tau(Ta1505识别)明显减少。

在肌氨酰可溶性组分中，通过给予Ta1505抗体，确认到Tau-Tg小鼠脑内的过磷酸化Tau(用AT8识别)明显减少。

[制备例1] 作为认知功能障碍模型的表达人正常型tau的Tg小鼠(Tau-Tg小鼠)

在本发明的抗体所产生的认知功能改善药理效果的研究中，与在人正常型tau、特别是胎儿期仅表达3R型tau、而随着生长表达3R型和4R型这两个tau的人中的个体发生相同的表达模式，使用具有在出生后6个月龄左右发生认知功能障碍的特征的Tg小鼠。该Tg小鼠通过以下方法制作。

用于制作Tg小鼠的基因的结构使用下述的核酸：在α钙调蛋白激酶IIα(CaMKII)启动子(8.5kb)的下游，按照猿猴病毒40(SV40)的5’内含子(0.3kb)、tau基因(Tau；7.3kb)、SV40的3’内含子(0.8kb)、SV40 polyA信号(0.3kb)的顺序构成排列形状的、具有图17所示结构的tau基因供给核酸。其中使用的tau基因是通过与Yamashita T.等(FEBS Letter，Vol.579，P241-244，2005年)中记载的方法同样地获得的基因，从编码人tau的cDNA起依次包含相当于外显子1～9的部分的核苷酸序列、内含子9的最初的18个核苷酸和最后的3kb部分的核苷酸序列、外显子10的核苷酸序列、内含子10的最初的3kb和最后的38个核苷酸的部分(其中，从内含子10的5’端方向起第16位的核苷酸胞嘧啶被取代成胸腺嘧啶)、相当于外显子11～13的cDNA的核苷酸序列的长7.3kb的基因。将该tau基因克隆到具有SV40的5’内含子、3’内含子和poly(A)信号序列的载体即pNN265(Choi T等, Mol. Cell. Biol. 第11卷,第3070-3074页, 1991年)的限制酶EcoRV位点。由得到的质粒切出在限制酶ＸhoI和NotI中包含SV40的5’内含子、tau基因、SV40的3’内含子和poly(A)信号序列的DNA片段，将其DNA片段克隆到具有CaMKII启动子的pMM403载体(Mayford M等, Cell 第81卷, 第891-904页,1995年)中。然后，通过限制酶SfiI由得到的质粒切出包含tau基因的图17所示结构的基因片段(17.2kb)，通过琼脂糖电泳进行分离，再使用QIAGEN(R) QIAquick凝胶提取试剂盒(Cat. No. 28704)从对应的凝胶部位纯化。得到的基因(DNA)片段按照公知的方法[Hogan,B等, “Manipulating the mouse embryo. A LaboratoryManual” Cold Spring HarborLaboratory(1986)]，注射到C57BL/6系小鼠雌雄交配而得到的前核期胚中。注入到进行了注射的假妊娠雌性C57BL小鼠的输卵管中。对于生出的鼠仔，切断其一部分尾巴，通过PCR法确认导入的基因是否被插入，通过使插入有所导入的基因的雌性或雄性小鼠与正常的雌或雄性小鼠交配，作为异源携带所导入的tau基因的Tg小鼠来维持，用于实验。需要说明的是，按照相同的方法制作在实施例中有记载的记作609株系和784株系的Tau-Tg小鼠，是显示相同特性的小鼠(或者在实施例中删除株系的记载)。

Claims

1.用于治疗或预防Tau蛋白病的治疗药或预防药，其包含抗体，其中所述抗体的特征在于选自以下(a)-(e)的一项：

(a)所述抗体包含

重链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 8所示的CDR-H1序列、SEQ IDNO: 9所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 13所示的CDR-H3序列，和

轻链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 14所示的CDR-L1序列、SEQID NO: 16所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 17所示的CDR-L3序列；

(b)所述抗体包含

重链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 7所示的CDR-H1序列、SEQ IDNO: 9所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 13所示的CDR-H3序列，和

(c)所述抗体包含

重链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 7所示的CDR-H1序列、SEQ IDNO: 10所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 13所示的CDR-H3序列，和

(d)所述抗体包含

重链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 8所示的CDR-H1序列、SEQ IDNO: 12所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 13所示的CDR-H3序列，和

轻链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 14所示的CDR-L1序列、SEQID NO: 16所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 17所示的CDR-L3序列；以及

(e)所述抗体包含

重链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 7所示的CDR-H1序列、SEQ IDNO: 11所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 13所示的CDR-H3序列，和

轻链可变区，其具有三个CDR，所述CDR分别是SEQ ID NO: 15所示的CDR-L1序列、SEQID NO: 16所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 17所示的CDR-L3序列；并且

其中所述抗体以比在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白更大的亲和力，结合已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白。

2.权利要求1的治疗药或预防药，其中所述抗体的特征在于选自以下(i)-(vii)的一项：

(i) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 20所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 26所示的序列的VL；

(ii) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 18所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 25所示的序列的VL；

(iii) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 19所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 26所示的序列的VL；

(iv) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 21所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 27所示的序列的VL；

(v) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 22所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 28所示的序列的VL；

(vi) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 23所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 29所示的序列的VL；以及

(vii) 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 24所示的序列的VH和具有SEQ ID NO: 30所示的序列的VL。

3.权利要求1的治疗药或预防药，其中所述抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少10倍。

4.权利要求1的治疗药或预防药，其中所述抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少30倍。

5.权利要求1的治疗药或预防药，其中所述抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少100倍。

6.权利要求1的治疗药或预防药，其中所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。

7.权利要求1-6中任一项的治疗药或预防药，其中Tau蛋白病选自阿尔茨海默病、皮质基底核变性病、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维缠结痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)和伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)。

8.单克隆抗体，其特征在于选自以下(a)-(e)的一项，其中

(a)所述抗体包含

(b)所述抗体包含

(c)所述抗体包含

(d)所述抗体包含

(e)所述抗体包含

其中所述单克隆抗体以比在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白更大的亲和力，结合已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白。

9.权利要求8的单克隆抗体，其中在所述单克隆抗体与抗原之间的结合对在所述抗原和特征在于选自以下(i)-(vii)的一项的抗体之间的结合是竞争性的：

10.权利要求8的单克隆抗体，其中所述抗体的特征在于选自以下(i)-(vii)的一项：

11.权利要求8的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少10倍。

12.权利要求8的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少30倍。

13.权利要求8的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体对已在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位存在的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白的亲和力是在SEQ ID NO: 1所示的tau蛋白的413位上未磷酸化的tau蛋白的至少100倍。

14.权利要求8的单克隆抗体，其中所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。

15.权利要求8-14中任一项的单克隆抗体在制备用于治疗tau蛋白病的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中Tau蛋白病选自阿尔茨海默病、皮质基底核变性病、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维缠结痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)和伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)。

17.一种由SEQ ID NO: 35组成的肽，其中其相当于SEQ ID NO: 1所示的人tau蛋白的氨基酸序列第413位的Ser的氨基酸残基被磷酸化。

18.权利要求17的肽在制备用于治疗或预防Tau蛋白病的单克隆抗体中的用途。

19.权利要求18的用途，其中Tau蛋白病选自阿尔茨海默病、皮质基底核变性病、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆症(嗜银性颗粒病)、痴呆症患者多系统tau蛋白病(MSTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森式综合征的额颞型痴呆症(FTDP-17)、神经原纤维缠结痴呆症、伴有钙质沉积的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质封入体的白质Tau蛋白病(WMT-GGI)和伴有tau阳性封入体的额颞叶变性病(FTLD-tau)。