TW201738255A - 類澱粉球蛋白(aspd)構造體及醫藥組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種細胞分泌型類澱粉球蛋白構造體及使用其之醫藥及疫苗、以及該等之製法。 於一態樣中，本發明係關於一種製造方法，其包括如下步驟：於培養液中對表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)或包含類澱粉β蛋白質(Aβ)序列之其一部分的細胞進行培養，於該培養液中獲得細胞分泌型類澱粉球蛋白(ASPD)構造體。
Description
本發明係關於一種類澱粉球蛋白(ASPD)構造體、其製造方法及其用途、醫藥組合物、其製造方法及其用途、以及篩選方法。
澱粉球蛋白(a
mylosp
heroid
s(ASPD))係約30個類澱粉β蛋白質(Aβ)聚集而成之直徑約10 nm之球狀之Aβ集合體，且其係可認為於阿茲海默症發病之不可逆階段中發揮重要作用之構造體。 ASPD係以表現出較強之神經毒性的以in vitro方式之Aβ集合體(即合成ASPD)之形式而單離(非專利文獻1)。製作針對該合成ASPD之特異性之抗體(專利文獻1及2)，使用該抗體，自阿茲海默症之人類患者之腦部單離出實際上於活體內形成之ASPD(即天然ASPD)(非專利文獻1)。 天然ASPD及合成ASPD同樣地對成熟神經細胞選擇性地誘發細胞死亡。已發現該神經細胞死亡中之ASPD之靶係對神經之生存及功能發揮極其重要之作用的突觸蛋白質「Na+
、K+
-ATPase泵之α3次單元(以下記作NAKα3)」，已表明NAKα3之功能因ASPD之結合而降低，神經細胞過度興奮，由此導致神經細胞死亡(專利文獻3、非專利文獻2)。 與阿茲海默症之臨床症狀最相關者係神經細胞之脫落。已表明可見神經細胞脫落之阿茲海默症患者之大腦皮質中之天然ASPD量係與阿茲海默症之重症度相關地增加，而且，不大可見神經細胞脫落之阿茲海默症患者之小腦中之天然ASPD量係僅微量存在(非專利文獻3)。因此，可認為澱粉球蛋白於阿茲海默症發病之不可逆階段中發揮重要作用。進而，天然ASPD亦自路易小體性癡呆症患者之腦部中檢測出(非專利文獻3)，可認為於路易小體性癡呆症中，ASPD亦於其發病中發揮重要作用。 可認為與天然ASPD等效之合成ASPD係可藉由將包含Aβ之液體緩慢攪拌而製造(非專利文獻1、專利文獻4)。 [先前技術文獻] [專利文獻] 專利文獻1：WO2006/016644 專利文獻2：WO2009/057664 專利文獻3：WO2013/099806 專利文獻4：WO2013/094614 [非專利文獻] [非專利文獻1]Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375 [非專利文獻2]Ohinishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474 [非專利文獻3]Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47): 32895-905
[發明所欲解決之問題] 如上所述，澱粉球蛋白(ASPD)係於阿茲海默症或路易小體性癡呆症中發揮重要作用。目前，自患者腦部精製天然ASPD並用於治療藥等之開發非常困難。因此可認為，若容易製造與存在於患者腦中之天然ASPD等效或部分地等效之類ASPD構造體，則大幅有助於阿茲海默症或路易小體性癡呆症之研究、以及針對該等疾病之預防方法及預防藥、及治療方法及預防・治療藥之開發。 藉由將包含類澱粉β蛋白質(Aβ)之液體緩慢攪拌，能以in vitro方式製造與天然ASPD基本等效之合成ASPD(非專利文獻1及專利文獻4)。而且發現：合成ASPD可於無佐劑情況下對兔誘發免疫；於高齡猴子中有一定之疫苗效果且較為安全。另一方面，關於合成ASPD亦發現以下問題：於每一製造批次中ASPD量以某程度上下波動；難以將所製造之ASPD長期保管；難以提昇製造量之規模等。 因此，於一態樣中，本發明提供一種類ASPD構造體及其製造方法。 [解決問題之技術手段] 於一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體之製造方法，其包括如下步驟：於培養液中對表現APP或包含Aβ序列之其一部分的細胞進行培養，於該培養液中獲得細胞分泌型類ASPD構造體。 於另一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體，其係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中獲得之構造體，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 於另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其係以細胞分泌型類ASPD構造體作為有效成分。 於另一態樣中，本發明係關於一種疫苗，其包含細胞分泌型類ASPD構造體。 於另一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作主動疫苗。 於另一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用於疫苗製造中。 於另一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作ASPD測定中之標準物質。 於另一態樣中，本發明係關於一種由ASPD所引起之疾病之預防、改善及/或治療之方法，其包括向對象投予細胞分泌型類ASPD構造體、上述醫藥組合物或上述疫苗。 於另一態樣中，本發明係關於一種使對象獲得對ASPD、由ASPD所引起之疾病、或阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之免疫之方法，其包括向對象投予細胞分泌型類ASPD構造體、上述醫藥組合物或上述疫苗。 於另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物或疫苗之製造方法，其包括將細胞分泌型類ASPD構造體與藥學上容許之賦形劑組合。 於另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包含細胞分泌型類ASPD構造體及抗ASPD抗體。 於另一態樣中，本發明係關於一種套組之製造方法，其包括將細胞分泌型類ASPD構造體與抗ASPD抗體組合。 於另一態樣中，本發明係關於一種非人類動物，其具有導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞。 於另一態樣中，本發明係關於一種對ASPD之形成造成影響之物質之篩選方法，其包括將構造體之形成效率作為指標，該構造體係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中形成，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 本發明係關於一種對Aβ之C末端切斷造成影響之物質之篩選方法，其係將選自由以下者所組成之群中之至少1個作為指標：於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中分泌之Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及該等之組合。
於一或複數個實施形態中，本發明係基於在對表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)之細胞進行培養的培養液中確認到類ASPD構造體之存在。 於一或複數個實施形態中，本發明係關於簡便且可提昇規模而提供之細胞分泌型類ASPD構造體。 於一或複數個實施形態中，本發明中之細胞分泌型類ASPD構造體係保存穩定性優異。 於一或複數個實施形態中，本發明中之細胞分泌型類ASPD構造體係亦可使Aβ單體之含有率極低而製造，故而藉由超濾所進行之Aβ單體之去除變得簡單，可提昇疫苗等之製造效率。 又，於一或複數個實施形態中，本發明中之細胞分泌型類ASPD構造體係可降低Aβ單體之含有率，故而例如與天然ASPD或合成ASPD相比，投予至活體之情形時之安全性可提昇。 [類澱粉球蛋白(ASPD)構造體] 於本發明中，類ASPD構造體係指針對ASPD具特異性之抗體進行抗原抗體反應之構造體，換言之，係指對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性之構造體。 再者，於本發明中，於簡稱為澱粉球蛋白(ASPD)之情形時，可包含天然ASPD及合成ASPD。 作為針對ASPD具特異性之抗體，於一或複數個實施形態中，可列舉WO2006/016644及WO2009/057664中所揭示之多株抗ASPD抗體及單株抗ASPD抗體，於又一或複數個實施形態中，可列舉：兔多株抗ASPD抗體(rpASD1、rpASD2及rpASD3)、小鼠單株抗ASPD抗體(MASD1、MASD2及MASD3)、倉鼠單株抗ASPD抗體(haASD1、haASD2、haASD3、haASD4及haASD5)以及人源化單株抗ASPD抗體(huASD2)等。 [細胞分泌型類ASPD構造體] 於本發明中，細胞分泌型類ASPD構造體係指藉由本發明之製造方法所製造之類ASPD構造體。於一或複數個實施形態中，係指於導入有APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞之培養液中發現的類ASPD構造體。本發明之細胞分泌型類ASPD構造體由於係於表現APP或包含Aβ序列之其一部分的細胞之培養液中獲得，故而可謂為細胞分泌型。 因此，於一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體，其係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中獲得之構造體，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 於一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體可與ASPD等效，於另一或複數個實施形態中，亦可為與ASPD部分地等效。所謂部分地等效，係指為至少針對ASPD具特異性之抗體進行抗原抗體反應之構造體，換言之，係指對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性之構造體。 於一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體為Aβ集合體。於本發明中，於簡稱為Aβ時，可指Aβ40(Aβ1-40)、Aβ41(Aβ1-41)、Aβ42(Aβ1-42)、Aβ43(Aβ1-43)、或者該等之全部或一部分。 於一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體可為與ASPD相同之分子量，於另一或複數個實施形態中，為100 kDa以上或100～700 kDa。 關於本發明之細胞分泌型類ASPD構造體，關於類ASPD構造體，於一或複數個實施形態中，ASPD之細胞毒性、即對功能上成熟之神經細胞選擇性地誘發細胞死亡之特性可與ASPD同等，或者與ASPD相比可為弱毒性，或者可不具有細胞毒性，或者與ASPD相比毒性可較高。 於一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體可為與ASPD相同之形狀，亦可為不同之形狀。於又一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體可為於電子顯微鏡觀察中直徑10～15 nm之球狀，亦可為與該形狀不同之形狀。 [細胞分泌型類ASPD構造體之製造方法] 於一或複數個實施形態中，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體可於培養液中對表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)或包含類澱粉β蛋白質(Aβ)序列之其一部分的細胞進行培養，藉此於該培養液中獲得。 因此，於一態樣中，本發明係關於一種細胞分泌型類ASPD構造體之製造方法，其包括如下步驟：於培養液中對表現APP或包含Aβ序列之其一部分的細胞進行培養，於該培養液中獲得細胞分泌型類ASPD構造體。以下，亦將上述製造方法簡稱為「本發明之製造方法」。 於本發明之製造方法中，於一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP可為人類APP，亦可為人類以外之動物之APP。人類APP可為hAPP770、hAPP751及hAPP695中之任一剪切變異體。APP及Aβ之序列可自公知之資料庫獲得。例如，hAPP770之NCBI之登錄號為NP_000475(VERSION NP_000475.1 GI:4502167)。剪切變異體之序列例如可參照UniProtKB-P05067(Modified: November 1, 1991 -v3)。 又，於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成量之方面而言，於培養之細胞內表現之APP較佳為由導入至上述細胞之APP之表現系統所表現，且/或較佳為上述細胞中之過度表現。於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成量之方面而言，於培養之細胞內表現之APP較佳為具有APP之訊號序列。 於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP可為野生型，或者亦可為變異型APP。作為變異型APP，可列舉與家族性阿茲海默症連鎖之變異，例如可列舉：Swedish變異、Italian變異、Leuven變異、Icelandic變異、London變異、Iranian變異、Austrian變異、German變異、French變異、Florida變異、Iberian變異、Australian變異、Belgian變異、Flemish變異、Icelandic變異、British變異、Tottori變異、Italian變異、Arctic變異、Osaka變異、Iowa變異、Dutch變異等。於該等中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成量之方面而言，較佳為包含Swedish變異。 進而，於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率之方面而言，於培養之細胞內表現之APP較佳為於Aβ之第25～37位之胺基酸序列中之GXXXG結構組元的甘胺酸中具有1個或複數個置換變異。即，較佳為具有選自由相當於Aβ之第25位、第29位、第33位及第37位之甘胺酸所組成之群中的1個或複數個甘胺酸之置換變異，較佳為具有至少第33位之甘胺酸之置換變異。作為置換變異，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率之方面、及減少培養液中之Aβ量之方面而言，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或半胱胺酸之置換變異。於本發明中，所謂1或複數個為1、2、3或4，或者1、2或3，或者1或2。 於另一或複數個實施形態中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率之方面而言，於培養之細胞內表現之APP較佳為具有Aβ之第33位及第37位之甘胺酸之置換變異。於本實施形態中，作為置換變異，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率之方面、及減少培養液中之Aβ量之方面而言，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或半胱胺酸之置換變異，更佳為第33位及第37位之至少一者為向異白胺酸之置換變異。 於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率之方面而言，於培養之細胞內表現之APP可列舉：具有Swedish變異以及選自由相當於Aβ之第25位、第29位、第33位及第37位之甘胺酸所組成之群中的1個或複數個甘胺酸之置換變異者。於另一或複數個實施形態中，本發明中之APP可列舉：於hAPP770或hAPP695中具有Swedish變異以及選自由相當於Aβ之第25位、第29位、第33位及第37位之甘胺酸所組成之群中的1個或複數個甘胺酸之置換變異者。於又一或複數個實施形態中，本發明中之APP可列舉：於hAPP770或hAPP695中具有Swedish變異以及相當於Aβ之第33位之甘胺酸之置換變異者。於進而一或複數個實施形態中，本發明中之APP可列舉：於hAPP770或hAPP695中具有Swedish變異以及相當於Aβ之第33位及第37位之甘胺酸之置換變異(較佳為至少一者為向異白胺酸之置換變異)者。於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP可於不明顯妨礙類ASPD構造體之形成的範圍內具有其他變異。作為其他變異，可包含向修飾胺基酸、非天然胺基酸、D-胺基酸等之變異。作為修飾胺基酸，於一或複數個實施形態中，可列舉：胺基修飾、羧基修飾、硫醇基修飾、羥基修飾、糖化修飾、PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)化修飾等。 於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP可為APP之一部分，且為包含類澱粉β蛋白質(Aβ)序列之部分肽(以下，亦將該部分肽簡稱為「APP之一部分」)。其原因在於ASPD係自APP切割出之Aβ之集合體之一形態。 於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP之一部分可為N末端經切斷的形態，於又一或複數個實施形態中，可為N末端於β分泌酵素之切斷部位經切斷之形態。 於本發明之製造方法之一或複數個實施形態中，於培養之細胞內表現之APP之一部分可列舉為包含Aβ之第1～43位、第1～42位或第1～40位之部分，於進而一或複數個實施形態中，可列舉具有包含Aβ之第1～43位、第1～42位或第1～40位之部分及APP之訊號序列。 培養之細胞內之APP或其一部分之表現可於導入有可表現APP或其一部分之表現系統的細胞內進行。APP或其一部分之表現可藉由短暫性表現系統進行，亦可藉由穩定表現細胞株進行。就提昇類ASPD構造體之形成量之方面而言，APP或其一部分之表現較佳為於不妨礙類ASPD構造體之形成之範圍內為高表現或過度表現。APP或其一部分之表現系統可為可進行控制者。 於一或複數個實施形態中，可表現APP或其一部分之表現系統可列舉：於編碼APP或其一部分之序列中具有作動性地連結有與導入之宿主細胞對應之表現調節序列之核酸的表現盒。作為表現調節序列，可列舉：啟動子、促進子、轉錄終止子等，除此以外，亦可列舉：起始密碼子、內含子之剪切訊號及終止密碼子等。 於一或複數個實施形態中，APP或其一部分之表現系統可適當選擇與欲表現之細胞(宿主)對應之表現載體而導入。於一或複數個實施形態中，該表現載體可列舉具有上述表現盒之載體。作為表現載體，於一或複數個實施形態中，可列舉：質體、黏接質體、YACS(yeast artificial chromosomes，酵母人工染色體)、病毒(例如腺病毒、反轉錄病毒、游離基因體EBV(Epstein-Barr virus，EB病毒)等)載體及噬菌體載體。 本發明之製造方法中培養之細胞係表現APP或其一部分之細胞。就提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成量之方面而言，本發明之製造方法中培養之細胞較佳為導入有可表現APP或其一部分之表現系統的細胞，更佳為高表現或過度表現、或者可高表現或過度表現APP或其一部分之細胞。於本發明之製造方法之另一實施形態中，表現APP或其一部分之細胞可為藉由基因導入或基因組編輯而基因組APP基因過度表現之細胞。 又，於一或複數個實施形態中，本發明之製造方法中培養之細胞較佳為可產生Aβ之細胞，更佳為表現γ分泌酵素與β分泌酵素兩者之細胞。 於一或複數個實施形態中，導入APP或其一部分之表現系統之宿主細胞可列舉：動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、微生物等、及該等之細胞株。作為動物細胞，可列舉：哺乳類細胞、人類細胞、人類以外之哺乳類細胞。 於一或複數個實施形態中，就操作性之方面而言，導入APP或其一部分之表現系統之宿主細胞較佳為細胞株。作為並無限定之具體之細胞株，可列舉：CHO細胞、HEK293細胞、Neuro2a細胞等。 關於本發明之製造方法中之表現APP或其一部分之細胞的培養條件，業者可根據該細胞之種類、導入至該細胞之表現系統之種類、及該表現系統之導入形態(短暫性導入或穩定導入)等，以表現(較佳為過度表現)引入至表現系統之APP或其一部分之方式，適當設定培養基、溫度、CO2
濃度等。 於一或複數個實施形態中，作為使用短暫性之APP表現系統之情形時之培養，可列舉：於增殖培養基中進行培養、轉導，其後交換為無血清培養基並培養24小時～48小時。然後，於上述培養後於培養基中獲得細胞分泌型類ASPD構造體。 於細胞為動物細胞之情形時，作為培養基，可列舉：Medium199培養基、EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium，伊格爾最低必需培養基)培養基、αMEM培養基、DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium，杜爾伯科改良伊格爾培養基)培養基、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、及該等之混合培養基等。於該等培養基中，可含有血清或血清代替物，或者亦可無血清。視需要，培養基亦可含有脂質、胺基酸、非必需胺基酸、維生素、生長因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等之1種以上之物質。 於一或複數個實施形態中，本發明之製造方法進而包括自上述培養液中回收細胞分泌型類ASPD構造體。 於一或複數個實施形態中，培養液中之細胞分泌型類ASPD構造體之回收可藉由如下步驟進行：將對孔徑0.22 μm過濾器之濾液進行50 kDa或100 kDa之超濾所獲得之保持液回收。但是，ASPD之回收方法可不限定於該方法。 若為本發明之製造方法，則容易製造細胞分泌型類ASPD構造體，故而於一或複數個實施形態中，容易進行以細胞分泌型類ASPD構造體本身作為抗原之主動疫苗療法之開發、或作為主動疫苗發揮作用之醫藥組合物之開發、神經細胞死亡抑制藥之開發。 [疫苗] 已報告有嘗試將構成ASPD之Aβ本身導入至活體內而賦予免疫，結果Aβ之序列之一部分(第16～33位之殘基)將T細胞活化，引起炎症性反應(Monsonego, A. et al. J. Clin. Invest. 112:415-422 (2003), Monsonego, A. et al. PNAS 103:5048-5053 (2006))。因此，難以使用Aβ本身作為疫苗。 另一方面，關於ASPD已獲得了如下資料：將T細胞活化之Aβ之序列(第16～33位之殘基)被摺疊於球狀構造之內部而幾乎被隱藏(Ohnishi et al. PNAS 112:E4465-E4474 (2015))，不會引起Aβ疫苗中成問題之炎症性T細胞應答。 而且，關於合成ASPD發現：於無佐劑情況下對兔賦予免疫；其免疫量為通常之肽抗原之1/5～1/10，少量且較為充分。進而亦發現：若使用ASPD藉由高齡食蟹猴之皮下投予進行免疫，則腦之糖代謝(神經活動)提高。 根據該等見解，可謂ASPD可用作安全性較高之主動疫苗。而且，本發明之細胞分泌型類ASPD構造體亦可用作主動疫苗，又，可用於疫苗之製造。 因此，於一態樣中，本發明係關於一種以ASPD作為有效成分之醫藥組合物，或者關於一種包含ASPD之疫苗。 於欲使用合成ASPD製造例如疫苗等般之醫藥組合物之情形時，發現以下之問題。即，於合成ASPD之先前之製造方法中發現如下問題：於每一製造批次中ASPD量以某程度上下波動，又，難以將所製造之ASPD長期保管，而且難以提昇製造量之規模，進而必須將製造合成ASPD後殘存之Aβ去除，製造效率降低等。 若為使用本發明之細胞分泌型類ASPD構造體之疫苗等醫藥組合物，則於一或複數個實施形態中，可消除該等問題中之1個或一部分或更多。 因此，於一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其係以細胞分泌型類ASPD構造體作為有效成分。作為本發明之醫藥組合物之一或複數個實施形態，可列舉包含細胞分泌型類ASPD構造體之疫苗。本發明之醫藥組合物及疫苗可包含藥學上容許之賦形劑及/或佐劑。 於一或複數個實施形態中，本發明之醫藥組合物及疫苗可用於由ASPD所引起之疾病之預防、改善及/或治療。於一或複數個實施形態中，本發明之醫藥組合物及疫苗可用於阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之預防、改善及/或治療。 於一或複數個實施形態中，本發明之醫藥組合物及疫苗可投予至有罹患由ASPD所引起之疾病之虞之對象、有已罹患之虞之對象、或已罹患之對象。於一或複數個實施形態中，本發明之醫藥組合物可投予至有罹患阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之虞之對象、有已罹患之虞之對象、或已罹患之對象。作為該對象，可列舉：哺乳類、人類、人類以外之哺乳類。 針對本發明之醫藥組合物及疫苗，對使對象獲得對ASPD、由ASPD所引起之疾病、或阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之免疫之一或複數個實施形態進行說明。於一或複數個實施形態中，本發明之醫藥組合物及疫苗之投予方法可包含對肌內、腹腔內、皮內或皮下之注射或對食道、消化道、呼吸道、泌尿生殖道之經黏膜投予。作為本發明之醫藥組合物及疫苗中之細胞分泌型類ASPD構造體之投予量，可列舉不會對投予對象造成明顯之副作用而誘發免疫防禦應答之量。於一或複數個實施形態中，預計本發明之醫藥組合物及疫苗之投予量為於0.01 μg～10 mg、0.1～1000 μg、1～100 μg、5～50 μg或5～25 μg之範圍內包含細胞分泌型類ASPD構造體的量。可繼初期投予之後，隔開充分之時間而進行1次或數次加量投予。 因此，於一態樣中，本發明係關於一種由ASPD所引起之疾病(例如阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症)之預防、改善及/或治療之方法，其包括向對象投予細胞分泌型類ASPD構造體或本發明之醫藥組合物或疫苗。 於另一態樣中，本發明係關於一種使對象獲得對ASPD、由ASPD所引起之疾病、或阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之免疫之方法，其包括向對象投予細胞分泌型類ASPD構造體或本發明之醫藥組合物或疫苗。 又，於一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物或疫苗之製造方法，其包括將細胞分泌型類ASPD構造體與賦形劑及/或佐劑組合。 於另一態樣中，本發明係關於一種以細胞分泌型類ASPD構造體作為有效成分之醫藥組合物、或具有細胞分泌型類ASPD構造體之疫苗之製造方法，其包括藉由本發明之製造方法製造細胞分泌型類ASPD構造體之步驟。 於另一態樣中，本發明係關於一種用於本發明之製造方法中之套組，其包含導入有APP或其一部分之表現系統之細胞株。根據本發明之套組，容易製造細胞分泌型類ASPD構造體。於本發明之套組中，可進而包含培養容器、培養基及說明書之至少1者。於一或複數個實施形態中，本發明之製造方法中使用之套組可為代替導入有APP或其一部分之表現系統之細胞株而具有APP或其一部分之表現系統之載體。 [模型動物] 於另一態樣中，本發明係關於一種非人類動物，其具有導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞。由於上述細胞分泌細胞分泌型類ASPD構造體，故而上述非人類動物可成為由ASPD所引起之疾病、例如阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之模型動物。作為上述細胞，就作為該模型動物之觀點而言，較佳為腦之細胞，或者較佳為神經細胞。上述表現系統之導入方法並無特別限制，可列舉：使用基因導入技術之方法；使用基因組編輯技術之方法等。作為非人類動物，可列舉：人類以外之哺乳類、人類以外之靈長類。本態樣之一或複數個實施形態係具有以表現APP或包含Aβ序列之其一部分之方式進行基因修改之細胞的基因修改動物。 於本態樣之模型動物中，於經基因修改之細胞內表現之APP例如可為本發明中所揭示般之APP之變異體或Aβ之變異體。即，於上述細胞內表現之APP較佳為與上述同樣地，具有選自由相當於Aβ之第25位、第29位、第33位及第37位之甘胺酸所組成之群中的1個或複數個甘胺酸之置換變異，較佳為具有至少第33位之甘胺酸之置換變異。作為置換變異，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或半胱胺酸之置換變異。 於另一或複數個實施形態中，於上述細胞內表現之APP較佳為具有Aβ之第33位及第37位之甘胺酸之置換變異。於本實施形態中，作為置換變異，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或半胱胺酸之置換變異，更佳為第33位及第37位之至少一者為向異白胺酸之置換變異。 [標準物質] 於一或複數個實施形態中，細胞分泌型類ASPD構造體可用作ASPD測定中之ASPD之標準物質。於另一或複數個實施形態中，細胞分泌型類ASPD構造體可用於測定ASPD之套組。即，於一態樣中，本發明係關於一種套組，其包含細胞分泌型類ASPD構造體及抗ASPD抗體。作為抗ASPD抗體，可列舉上述針對ASPD具特異性之抗體。又，於一態樣中，本發明係關於一種套組之製造方法，其包括將細胞分泌型類ASPD構造體與抗ASPD抗體組合。該等套組例如可用於ASPD之測定。 [篩選方法1] 於一態樣中，本發明係關於一種對ASPD之形成造成影響之物質之篩選方法，其包括將構造體(即細胞分泌型類ASPD構造體)之形成效率作為指標，該構造體係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中形成，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 於一或複數個實施形態中，上述指標可為細胞分泌型類ASPD構造體之形成量，亦可為相對於Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43或該等之合計量之相對量。該形態之篩選方法可包括：將於培養液中添加測試物質之情形與不添加之情形時之細胞分泌型類ASPD構造體之形成效率進行比較，判斷是否為對ASPD之形成造成影響之物質。例如，若於將測試物質添加至培養液中之情形時該形成效率降低，則可判斷為該物質具有阻礙ASPD之形成之影響。又，例如，若於將測試物質添加至培養液中之情形時該形成效率提高，則可判斷為該物質具有促進ASPD之形成之影響。 於本態樣之篩選方法中，於培養之細胞內表現之APP例如可為本發明中所揭示般之APP之變異體或Aβ之變異體。 [篩選方法2] 於一態樣中，本發明係關於一種對Aβ之C末端切斷造成影響之物質之篩選方法，其包括將選自由以下者所組成之群中之至少1個Aβ作為指標：於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中形成之Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及該等之組合。 於一或複數個實施形態中，上述指標可為Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及該等之組合之分泌量或培養液中之濃度，或者例如可為Aβ42相對於Aβ40之比率(Aβ42/Aβ40)等相對量。該形態之篩選方法可包括：將於培養液中添加測試物質之情形與不添加之情形時之上述指標進行比較，判斷是否為對Aβ之C末端切斷造成影響之物質，或者是否為對γ分泌酵素造成影響之物質。例如，若於將測試物質添加至培養液中之情形時「Aβ42/Aβ40」降低，則可判斷為該物質具有抑制Aβ42之產生之影響。 於本態樣之篩選方法中，於培養之細胞內表現之APP例如可為本發明中所揭示般之APP之變異體或Aβ之變異體。 [變異型合成ASPD] 於進而又一態樣中，本發明係關於一種變異型合成ASPD。於本發明中，變異型合成ASPD係指使用變異型Aβ，藉由與合成ASPD之製造方法相同之製法而合成之合成類ASPD構造體。即，於本發明中，變異型合成ASPD係指藉由將包含變異型Aβ之液體攪拌而形成之合成類ASPD構造體，上述變異型Aβ之液體係於Aβ之第25～37位之胺基酸序列中之GXXXG結構組元的甘胺酸中具有1個或複數個置換變異。就提昇變異型合成ASPD之形成效率之觀點而言，於上述液體中例如可包含鄰苯二甲酸酯等塑化劑。於一或複數個實施形態中，變異型合成ASPD可藉由包括如下步驟之製造方法合成：將上述變異型Aβ溶解於包含上述塑化劑之有機溶劑中；藉由水性溶液將上述變異型Aβ之溶液稀釋；及將上述稀釋後之溶液攪拌。 作為上述變異型Aβ，較佳為具有選自由相當於Aβ之第25位、第29位、第33位及第37位之甘胺酸所組成之群中的1個或複數個甘胺酸之置換變異，較佳為至少具有第33位之甘胺酸之置換變異。作為置換變異，就提昇合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸、半胱胺酸之置換變異。 作為上述變異型Aβ，於另一或複數個實施形態中，較佳為具有Aβ之第33位及第37位之甘胺酸之置換變異。於本實施形態中，作為置換變異，就提昇合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為向白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或半胱胺酸之置換變異，更佳為第33位及第37位之至少一者為向異白胺酸之置換變異。 於一或複數個實施形態中，本發明之變異型ASPD係對ASPD特異性抗體表現出抗原性。又，於另一或複數個實施形態中，本發明之變異型ASPD係對成熟神經細胞表現出細胞毒性。 於一或複數個實施形態中，本發明可關於以下內容。 [1]一種細胞分泌型類澱粉球蛋白(ASPD)構造體之製造方法，其包括如下步驟：於培養液中對表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)或包含類澱粉β蛋白質(Aβ)序列之其一部分的細胞進行培養，於該培養液中獲得細胞分泌型類ASPD構造體。 [2]如[1]記載之製造方法，其進而包括自上述培養液中回收細胞分泌型類ASPD構造體。 [3]如[1]或[2]記載之製造方法，其中上述細胞係導入有APP或包含Aβ序列之其一部分之表現系統的細胞。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之製造方法，其中上述APP係野生型、或具有1個或複數個胺基酸變異之上述野生型之變異體。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之製造方法，其中上述APP係於Aβ胺基酸序列之GXXXG結構組元中之甘胺酸中具有胺基酸變異之野生型或變異體的APP。 [6]一種細胞分泌型類ASPD構造體，其係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中獲得之構造體，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 [7]一種醫藥組合物，其係以如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體作為有效成分。 [8]一種疫苗，其包含如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體。 [9]一種套組，其包含如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體、及抗ASPD抗體。 [10]一種如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作主動疫苗。 [11]一種如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用於疫苗製造中。 [12]一種如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作ASPD測定中之標準物質。 [13]一種由ASPD所引起之疾病之預防、改善及/或治療之方法，其包括向對象投予如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體、如[7]記載之醫藥組合物、或如[8]記載之疫苗。 [14]如[13]記載之方法，其中由ASPD所引起之疾病為阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症。 [15]一種使對象獲得對ASPD、由ASPD所引起之疾病、或阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之免疫之方法，其包括向對象投予如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體、如[7]記載之醫藥組合物、或如[8]記載之疫苗。 [16]一種醫藥組合物或疫苗之製造方法，其包括將如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體與藥學上容許之賦形劑組合。 [17]一種套組之製造方法，其包括將如[6]記載之細胞分泌型類ASPD構造體與抗ASPD抗體組合。 [18]一種非人類動物，其具有導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞。 [19]一種對ASPD之形成造成影響之物質之篩選方法，其包括將構造體之形成效率作為指標，該構造體係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中形成，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。 [20]一種對Aβ之C末端切斷造成影響之物質之篩選方法，其係將選自由以下者所組成之群中之至少1個作為指標：於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中分泌之Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及該等之組合。 [21]一種合成類ASPD構造體，其係藉由將包含變異型Aβ之液體攪拌而形成，該變異型Aβ係於Aβ之第25～37位之胺基酸序列中之GXXXG結構組元的甘胺酸中具有1個或複數個置換變異。 以下，使用實施例進一步說明本發明之一或複數個實施形態。 [實施例] 1.表現hAPP之培養細胞之構建 (1-1)人類類澱粉前驅物蛋白質(hAPP) 作為表現之類澱粉前驅物蛋白質(APP)，使用下述表1及圖1所示之試驗例1～14之APP。圖1之序列(序列編號1)係人類之包含Aβ的hAPP之部分胺基酸序列。 試驗例1～7之APP為hAPP770野生型、hAPP770Swedish變異型、及GXXXG結構組元之1或2個甘胺酸發生變異而成之hAPP770Swedish型。 試驗例8～14之APP為hAPP695野生型、hAPP695Swedish變異型、及GXXXG結構組元之1或2個甘胺酸發生變異而成之hAPP695Swedish型。 [表1]
(1-2)過度表現hAPP之培養細胞 以如下之方式製作過度表現上述試驗例1～14之hAPP之CHO細胞。 藉由增殖培養基以2.5×104
cells/cm2
之密度將CHO/K1細胞播種於12孔板，於37℃、5%CO2
之條件下維持。24小時後，使用基因導入試劑(FuGENE HD)將表現載體導入至CHO/K1細胞。關於導入方法，每孔混合25 μL之Opti-MEM及0.5 μg之質體DNA，進而加入1.5 μL之FuGENE HD，於室溫下反應10分鐘。於此期間，更換0.5 mL增殖培養基，反應結束後，添加反應液25 μL。24小時後，更換為新的1 mL增殖培養基進一步進行培養。 增殖培養基：於含有10%FBS(fetal calf serum，胎牛血清)之Ham's F-12培養基中加入100單元/mL之青黴素(penicillin)及100 μg/mL之鏈黴素(streptomycin)而成者 2.ASPD之形成及回收 (2-1)過度表現hAPP之培養細胞之培養及上清液之回收 自基因導入起48小時後，藉由1×PBS(-)將細胞清洗2次後，更換為1 mL無血清培養基。更換為無血清培養基24小時後，回收經0.22 μm過濾器過濾之培養上清液，立即藉由液態氮進行冷凍並於-80℃下保存。 無血清培養基：於DMEM/F-12中加入1×ITS-X而成者 (2-2)分析 將培養APP過度表現細胞之培養液回收，藉由下述條件之ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析)法確認培養液中之ASPD、Aβ1-40及Aβ1-42之含量。將其結果示於圖2～4。 [ASPD ELISA] 針對所回收之培養上清液，藉由使用2種抗ASPD抗體(rpASD1、MASD3)之夾心ELISA進行定量。 詳細而言，於測定前一天，以成為500 ng/孔之方式對白色96孔板分注抗ASPD多株抗體(rpASD1)，於4℃下固相化一夜。次日，藉由PBS-T將孔清洗3次後，藉由3%BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)進行30分鐘阻斷，再次清洗3次。於各孔分注100 μL之標準液或樣本，於室溫下培養1小時後，清洗3次，以成為100 ng/孔之方式添加抗ASPD單株抗體(MASD3)，進而於室溫下培養1小時。再次進行3次清洗，以100 μL/孔分注經1/10,000稀釋之二次抗體(抗小鼠IgG-HRP)，於室溫下培養1小時。清洗3次後，添加100 μL之發光基質並於遮光下反應1分鐘，藉由照度計檢測發光。 [Aβ ELISA] 針對所回收之培養上清液，使用市售可獲取之Aβ monomer ELISA kit進行測定。所使用之Kit如下所述。測定係如Kit隨附之說明書般進行。 Aβ1-40：人類β類澱粉(1-40)ELISA Kit Wako(Wako#292-62301) Aβ1-42：人類β類澱粉(1-42)ELISA Kit Wako高感度品(Wako#296-64401) 如圖2～4所示，於過度表現試驗例1～14之APP之任一情形時，均於培養液中可見ASPD之形成。 於將hAPP770與hAPP695進行比較之情形時，未見因變異所引起之較大差異，但若干hAPP695有培養上清液中之ASPD濃度較高之傾向。又，關於變異之部位及數量，可認為不論是2處還是1處，G704或G629之G/L變異均對ASPD形成較為重要。進而啟示，與野生型(wt)相比，Swedish(sw)變異之情況下分泌更多之類澱粉蛋白，但藉由進而對GXXXG結構組元引入變異，大部分之類澱粉蛋白被用作ASPD之構成要素。 3.hAPP695sw-G33X之過度表現 以與上述(1-2)相同之方式製作過度表現使hAPP695Swedish變異型之629位(Aβ之33位)之甘胺酸變異為19種胺基酸之APP的細胞，以與上述2.相同之方式進行培養，於該培養液中確認培養液中之ASPD、Aβ1-40及Aβ1-42之含量。將其結果示於表2及圖5～7。 [表2]
如表2及圖5～7所示，確認到藉由將hAPP695Swedish變異型之629位(Aβ之33位)之甘胺酸置換為特定之胺基酸，例如白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、酪胺酸、半胱胺酸，可明顯減少培養液中之Aβ量，並且提昇細胞分泌型類ASPD構造體之形成量。另一方面，藉由進行向脯胺酸(或蘇胺酸)之置換，關於Aβ1-40、Aβ1-42及類ASPD構造體之任一者均確認到培養液中濃度之降低。由該結果啟示，Aβ自APP之切割因由該等胺基酸所引起之629位(Aβ之33位)之變異而受到阻礙，且類ASPD構造體之形成受到抑制。根據以上之情況可認為，亦可將變異體用於對類澱粉β產生及ASPD形成兩者之阻礙劑篩選。 3.使用其他宿主細胞之細胞分泌型類ASPD構造體之製造 除CHO以外，於HEK293及Neuro2a之細胞株中亦確認到，藉由製成導入有APP或包含Aβ序列之其一部分之表現系統的細胞，而於細胞內形成類ASPD構造體。 4.細胞分泌型類ASPD構造體之穩定性確認：-80℃之保存穩定性 藉由使用2種ASPD特異性抗體(中和抗體)之夾心ELISA，對將表現試驗例14之hAPP695-sw-G33I所獲得之細胞分泌型ASPD構造體於-80℃下保存0個月、3個月及6個月之樣本進行測定，製作校準曲線。 其結果為，該校準曲線之一次回歸直線之斜率係3個樣本顯示出大致一定之值。因此可認為，對用於夾心ELISA之2種中和抗體之反應性穩定，不存在由保存所引起之劣化。 另一方面可認為，藉由先前之方法所製造之合成ASPD係於-80℃之保存後，一次回歸直線中之斜率之偏差較大，相對於ASPD濃度之訊號之大小亦偏差較大，保存穩定性較低。 5.合成ASPD之免疫原性 對紐西蘭白兔(各條件3隻)於Freund佐劑、氫氧化鋁佐劑、無佐劑之條件下進行6次利用合成ASPD之100 μg免疫，其後進行完全採血，藉由點漬墨法對針對血清中之合成ASPD之反應性進行評估。將其結果之一例示於圖8。可知於所有兔中，即便於無佐劑條件下亦獲得充分之反應性。 6.合成ASPD及變異型合成ASPD(G33L)之神經細胞毒性 將使用野生型Aβ1-42所製造之合成ASPD之神經細胞毒性、與使用G33L變異型Aβ1-42所製造之變異型合成ASPD(G33L)之神經細胞毒性進行比較。 具體而言，將一定濃度之合成ASPD(0.58 μM)及變異型合成ASPD(0.53 μM)分別投予至源自成熟大鼠海馬之初代培養神經細胞中並放置一夜後，添加螢光試劑(Thermo Fisher公司製造之CyQUANT)，使用共聚聚焦影像細胞儀CQ1確認細胞存活率。將其結果示於圖9之右方。如該圖所示，變異型合成ASPD(G33L型)係與合成ASPD(野生型)同樣地對成熟神經細胞表現出相同程度之細胞毒性。 7.變異型合成ASPD與rpASD1抗體之解離常數 以合成ASPD或變異型合成ASPD(G33L)作為配體於感測晶片上進行固相化，流通抗ASPD多株抗體(rpASD1)作為分析物，藉由表面電漿子共振(SPR)求出解離常數(KD
)。其結果為，關於對抗ASPD多株抗體(rpASD1)之反應性，合成ASPD與變異型合成ASPD(G33L)同等。 8.hAPP695sw之1及2胺基酸變異體之過度表現 作為表現之類澱粉前驅物蛋白質(APP)，使用下述表3及圖1所示之試驗例15～36之APP。以與上述1及2之記載相同之方式，將培養APP過度表現細胞之培養液回收，藉由下述條件之ELISA法確認培養液中之ASPD、Aβ1-40及Aβ1-42之含量。將其結果示於圖10～12。 [表3]
如圖10～12所示，於過度表現試驗例15～36之APP之任一情形時，均於培養液中可見ASPD之形成。 關於向白胺酸之1胺基酸或2胺基酸置換變異、與向異白胺酸之該等置換變異，上清液中之ASPD、Aβ1-40及Aβ1-42之含量未見較大差異。但是，關於Aβ之第33位及第37位之甘胺酸兩個均變異為異白胺酸之APP(試驗例30)的ASPD形成量，與Aβ之第33位及第37位之甘胺酸兩個均變異為白胺酸之APP(試驗例23)相比，明顯增加。 又，於使2處變異為白胺酸及異白胺酸之APP(試驗例31-36)中，使Aβ之第33位及第37位之甘胺酸變異為白胺酸及異白胺酸之APP(試驗例35-36)之ASPD之形成量係與Aβ之第33位及第37位之甘胺酸兩個均變異為異白胺酸之APP(試驗例30)相同程度地增加。
圖1係對所表現之APP之變異體及該等變異體之變異部位進行說明之概略圖。 圖2係表示於試驗例1～14之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之ASPD濃度之測定結果的圖表。 圖3係表示於試驗例1～14之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之Aβ1-40濃度之測定結果的圖表。 圖4係表示於試驗例1～14之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之Aβ1-42濃度之測定結果的圖表。 圖5係表示過度表現hAPP695sw-G33X之細胞之培養液中之ASPD濃度之測定結果的圖表。 圖6係表示過度表現hAPP695sw-G33X之細胞之培養液中之Aβ1-40濃度之測定結果的圖表。 圖7係表示過度表現hAPP695sw-G33X之細胞之培養液中之Aβ1-42濃度之測定結果的圖表。 圖8係表示對合成ASPD之免疫原性進行評估之結果之一例的圖表。 圖9係表示對合成ASPD(野生型)及合成ASPD(G33L型)之神經細胞毒性進行確認之結果之一例的圖表。 圖10係表示於試驗例15～36之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之ASPD濃度之測定結果的圖表。 圖11係表示於試驗例15～36之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之Aβ1-40濃度之測定結果的圖表。 圖12係表示於試驗例15～36之APP之表現系統中過度表現之細胞之培養液中之Aβ1-42濃度之測定結果的圖表。
無
Claims (21)
- 一種細胞分泌型類澱粉球蛋白(ASPD)構造體之製造方法，其包括如下步驟： 於培養液中對表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)或包含類澱粉β蛋白質(Aβ)序列之其一部分的細胞進行培養，於該培養液中獲得細胞分泌型類ASPD構造體。
- 如請求項1之製造方法，其進而包括自上述培養液中回收細胞分泌型類ASPD構造體。
- 如請求項1或2之製造方法，其中上述細胞係導入有APP或包含Aβ序列之其一部分之表現系統的細胞。
- 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中上述APP係野生型、或具有1個或複數個胺基酸變異之上述野生型變異體。
- 如請求項1至4中任一項之製造方法，其中上述APP係於Aβ胺基酸序列之GXXXG結構組元(motif)中之甘胺酸中具有胺基酸變異之變異體的APP。
- 一種細胞分泌型類ASPD構造體，其係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中獲得之構造體，且對針對ASPD具特異性之抗體表現出抗原性。
- 一種醫藥組合物，其係以如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體作為有效成分。
- 一種疫苗，其包含如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體。
- 一種套組，其包含如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體、及抗ASPD抗體。
- 一種如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作主動疫苗。
- 一種如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用於疫苗製造中。
- 一種如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體之用途，其係將該細胞分泌型類ASPD構造體用作ASPD測定中之標準物質。
- 一種由ASPD所引起之疾病之預防、改善及/或治療之方法，其包括向對象投予如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體、如請求項7之醫藥組合物、或如請求項8之疫苗。
- 如請求項13之方法，其中由ASPD所引起之疾病為阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症。
- 一種使對象獲得對ASPD、由ASPD所引起之疾病、或阿茲海默症及/或路易小體性癡呆症之免疫之方法，其包括向對象投予如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體、如請求項7之醫藥組合物、或如請求項8之疫苗。
- 一種醫藥組合物或疫苗之製造方法，其包括將如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體與藥學上容許之賦形劑組合。
- 一種套組之製造方法，其包括將如請求項6之細胞分泌型類ASPD構造體與抗ASPD抗體組合。
- 一種非人類動物，其具有導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞。
- 一種對ASPD之形成造成影響之物質之篩選方法，其包括將構造體之形成效率作為指標，該構造體係於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中形成者，且對ASPD特異性抗體表現出抗原性。
- 一種對Aβ之C末端切斷造成影響之物質之篩選方法，其係將選自由以下者所組成之群中之至少1個作為指標：於對導入有表現APP或包含Aβ序列之其一部分的表現系統之細胞進行培養的培養液中分泌之Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43及該等之組合。
- 一種合成類ASPD構造體，其係藉由將包含變異型Aβ之液體攪拌而形成，該變異型Aβ係於Aβ之第25～37位之胺基酸序列中之GXXXG結構組元的甘胺酸中具有1個或複數個置換變異。
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