CN107847613A - 神经退行性病症 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其包含在近红外(NIR)下和/或使用磁共振成像(MRI)和/或计算机断层扫描(CT)可见的纳米颗粒。生物特异性试剂还包含对于转铁蛋白受体和淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的至少一种抗体或其抗原结合片段。

Description

神经退行性病症
技术领域
本发明涉及神经退行性病症，且特别涉及用于诊断和治疗这种状况的新型组合物、疗法和方法，所述状况包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。
背景技术
术语“神经退行性”广泛地用于神经元的结构和/或功能的逐渐丧失。许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病，由于神经退行性过程而发生，并且目前无法治愈，导致神经元的进行性退化和/或死亡。连接许多神经退行性疾病的共同特征在于它们都涉及淀粉样蛋白的积累，所述淀粉样蛋白是共享特定结构特性的纤维蛋白聚集体。淀粉样蛋白是不溶性的，并且起于天然存在于体内的至少18种不适当折叠形式的蛋白质和多肽。这些错误折叠的结构改变了它们的适当构型，使得它们与彼此或其他细胞组分错误地相互作用，形成不溶性原纤维。迄今为止，淀粉样蛋白已与多于20种严重的人疾病的病理学有关，因为器官中淀粉样蛋白原纤维的异常积累可导淀粉样变性。
例如，阿尔茨海默氏病的特征在于细胞外淀粉样蛋白斑块中淀粉样蛋白β(Aβ)的沉积，以及脑内神经原纤维缠结中tau的细胞内积聚。Aβ和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)中的突变与家族性阿尔茨海默氏病联系，并且因此认为Aβ在疾病过程中起重要作用。Aβ家族的某些成员是毒性的，最显著的是Aβ寡聚物，并且已显示引起膜缺陷、神经元细胞死亡和对功能的作用，并且导致动物行为和神经元网络中的变化。Aβ肽是淀粉样蛋白生成肽(amyloidogenic peptide)和蛋白质的较大组的成员，并且认为这些淀粉样蛋白生成肽的毒性效应与其自组装形成富含β-片的寡聚物种和交叉-β结构化淀粉样蛋白原纤维的能力联系。负责帕金森氏病和亨廷顿氏病的基于淀粉样蛋白的肽分别是α-突触核蛋白和亨廷顿蛋白。
目前可用的诊断工具能够检测到这些淀粉样蛋白，包括Aβ斑块、突触核蛋白和亨廷顿蛋白等，其在相应疾病的晚期存在，并且因此不能集中于状况的早期鉴定。因此，存在提供用于神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病的早期诊断和/或治疗的新型手段的显著需要。
本发明人目前已开发了新型神经退行性病症诊断和治疗工具，其显示出对于下述的高度特异性：(i)转铁蛋白受体，使得它可经由受体介导的转胞吞作用容易地转运跨越血脑屏障，和(ii)一系列不同的淀粉样蛋白生成肽，如Aβ、突触核蛋白和亨廷顿蛋白。
发明内容
因此，根据本发明的第一个方面，提供了淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其包含在近红外(NIR)下和/或使用磁共振成像(MRI)和/或计算机断层扫描(CT)可见的纳米颗粒，以及对于转铁蛋白受体和淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的至少一种抗体或其抗原结合片段。
如实例中所述，本发明的生物特异性试剂展示非常低的细胞毒性，同时显示出靶向细胞内淀粉样蛋白β(Aβ)物种的能力。生物特异性试剂展示与Aβ单体和斑块的低交叉反应性，同时展示对于淀粉样蛋白β寡聚物和原纤维的高亲和力，使得它可用于实现比使用当前可用的诊断工具能够的早得多的神经退行性病症诊断。一旦被双特异性抗体靶向，生物特异性试剂就还展示对于转铁蛋白受体的低亲和力，这是经由受体介导的转胞吞作用有效地穿过血脑屏障所需的。由于其化学组成，本发明的生物特异性试剂在近红外(NIR)下发光，最大在约850nm处，使得它可在2cm左右的组织深度处可见，这对于患有或被认为患有神经退行性病症的受试者的体内诊断是理想的。此外，如实例中所述的试剂的组合物显著改进试剂的生物相容性，并且急剧降低其毒性，并且允许经由MRI或CT的检测。除其令人惊讶的强大的诊断能力之外，本发明人还惊讶地观察到该试剂展示治疗效应，因为该试剂能够结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物，该寡聚物因此由于它们被致使不可溶而较不易进入神经元，如通过免疫荧光展示的。
由于靶向且特异性结合淀粉样蛋白生成肽的抗体或其抗原结合片段的存在，本发明的生物特异性试剂可用于靶向作为任何神经退行性疾病的生物标记物的任何淀粉样蛋白生成肽或蛋白质，例如阿尔茨海默氏病中的Aβ、帕金森氏病中的α-突触核蛋白、或亨廷顿氏病中的亨廷顿蛋白。该试剂高度适合于淀粉样蛋白生成肽的敏感性和非侵入性检测和成像，并且因此高度适合于神经退行性疾病的早期诊断。这些疾病的早期检测意味着治疗方案可比当前可用技术可能的早得多地起始，并且通过集中于病理生理改变在症状开始显示之前，所述病理生理改变中的一些可在症状普遍之前十年发生。这种早期诊断可帮助患者及其家属为未来作好准备，允许他们在较早期选择进入潜在救命药物的临床试验，并且确保现有药物用于更佳起效，使得患者具有更佳预后。
优选地，至少一种抗体或抗原结合片段包含IgG抗淀粉样蛋白生成肽抗体或其抗原结合片段。优选地，对于淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的双特异性试剂的部分包含抗体片段，更优选Fab′片段。
优选地，至少一种抗体或抗原结合片段特异性结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维(包括前原纤维)，但不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块和肽单体。有利地，抗体对于淀粉样蛋白生成肽寡聚物和原纤维，而不是淀粉样蛋白生成肽斑块和单体的特异性，意味着本发明的生物特异性试剂可用于检测早期神经退行性疾病。
例如，在一个实施例中，本发明的生物特异性试剂可用于检测和治疗阿尔茨海默氏病。因此，优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：Aβ的氨基酸序列、或其变体或片段。野生型Aβ(1-42)的氨基酸序列是已知的，并且可在本文中表示为SEQ ID No：1，如下：-
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
[SEQ ID No：1]
优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：SEQ ID No.1、或其变体或片段。发明人已认识到Aβ寡聚物在阿尔茨海默氏病患者的脑中以高得多的浓度存在，并且这种增加在疾病的最早阶段期间出现，使Aβ寡聚物成为比Aβ斑块或Aβ单体更有吸引力的生物标记物。相应地，优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：部分聚集的野生型Aβ(1-42)肽，更优选部分聚集的SEQ ID No：1。优选地，至少一种抗体或抗原结合片段特异性结合淀粉样蛋白β寡聚物和原纤维(包括前原纤维)，但不特异性结合Aβ斑块或单体。像这样，抗体对于Aβ寡聚物和原纤维，而不是Aβ斑块和单体的特异性，意味着本发明的生物特异性试剂可用于检测早期阿尔茨海默氏病。
在另一个实施例中，本发明的生物特异性试剂可用于检测和治疗亨廷顿氏病。优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：亨廷顿蛋白的氨基酸序列、或其变体或片段。人亨廷顿蛋白的一个实施例的氨基酸序列是已知的，并且可在本文中表示为SEQ ID No：2，如下：-
优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：SEQ ID No：2、或其变体或片段。优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含部分聚集的SEQ ID No：2或由部分聚集的SEQ ID No：2组成。最优选地，至少一种抗体或抗原结合片段特异性结合亨廷顿蛋白寡聚物和原纤维(包括前原纤维)，但不特异性结合亨廷顿蛋白斑块和单体。有利地，抗体对于亨廷顿蛋白寡聚物和原纤维，而不是亨廷顿蛋白斑块和单体的特异性，意味着本发明的生物特异性试剂可用于检测早期亨廷顿氏病。
在又一个实施例中，本发明的生物特异性试剂可用于检测和治疗帕金森氏病。优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：α-突触核蛋白的氨基酸序列、或其变体或片段。人α-突触核蛋白的一个实施例(例如同种型NACP140)的氨基酸序列是已知的，并且可在本文中表示为SEQ ID No：3，如下：-
优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：SEQ ID No：3、或其变体或片段。优选地，用于产生针对淀粉样蛋白生成肽的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含部分聚集的SEQ ID No：3或由部分聚集的SEQ ID No：3组成。最优选地，至少一种抗体或抗原结合片段特异性结合α-突触核蛋白寡聚物和原纤维(包括前原纤维)，但不特异性结合α-突触核蛋白斑块和单体。有利地，抗体对于α-突触核蛋白寡聚物和原纤维，而不是α-突触核蛋白斑块和单体的特异性，意味着本发明的生物特异性试剂可用于检测早期帕金森氏病。
血脑屏障是由毛细血管内皮细胞形成的高度选择性渗透屏障，并且这确保了很少的物体可到达大脑，有利于保护大脑免受入侵的病原体或毒素，但由于很少的治疗试剂能够通过以到达大脑而是成问题的。对于转铁蛋白受体(TfR)具有低亲和力的抗体能够经由受体介导的转胞吞作用穿过血脑屏障。抗TfR抗体或其片段靶向TfR并且使纳米颗粒与TfR结合，并且转运跨越内皮细胞，但由于抗体对于受体的低亲和力，当它到达内皮细胞的另一侧时，它从TfR释放且进入大脑内。
相应地，优选地，至少一种抗体或抗原结合片段包含IgM抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。图4显示了用于确定本发明的生物特异性试剂对于转铁蛋白受体的亲和力的表面等离振子共振的结果。如可见的，高Kd值是对于这些受体的低亲和力的明确证实，所述低亲和力对于使受体介导的转胞吞作用能够发生是重要的。优选地，与转铁蛋白受体的结合亲和力在微摩尔范围内。优选地，至少一种抗体或其抗原结合片段对于转铁蛋白受体的解离常数值为至少1x 10-4M，更优选至少1x 10-3M。优选地，亲和常数应不小于1x 10-4M，因为低于此的亲和常数可能未能完全接合转铁蛋白受体。
优选地，对于转铁蛋白受体免疫特异性的双特异性试剂的部分包含抗体片段，更优选Fab′片段。
人转铁蛋白受体的一个实施例的氨基酸序列是已知的，并且可在本文中表示为SEQ ID No：4，如下：-
优选地，用于产生针对转铁蛋白受体的至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：SEQ ID No：4、或其变体或片段。
在一个实施例中，生物特异性试剂可包含对于转铁蛋白受体具有免疫特异性的至少一种抗体或其抗原结合片段，以及对于淀粉样蛋白生成肽具有免疫特异性的至少一种抗体或其抗原结合片段。优选地，生物特异性试剂包含对于转铁蛋白受体具有免疫特异性的多种抗体或其抗原结合片段，以及对于淀粉样蛋白生成肽具有免疫特异性的多种抗体或其抗原结合片段。
至少一种抗体可为完整抗体(即免疫球蛋白)，或者它可为相应全长抗体的抗原结合片段或区域。至少一种抗体或其抗原结合片段可为单价、二价或多价。单价抗体是包含由二硫桥与轻链(L)结合的重链(H)的二聚体(HL)。二价抗体是包含由至少一个二硫桥结合的两个二聚体的四聚体(H2L2)。多价抗体也可例如通过连接多个二聚体来产生。抗体分子的基本结构由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，其非共价结合并且可通过二硫键连接。每条重链和轻链含有约110个氨基酸的氨基末端可变区以及在链的剩余部分中的恒定序列。可变区包括几个高变区或互补决定区(CDR)，其形成抗体分子的抗原结合位点并且确定其对于抗原、转铁蛋白受体或淀粉样蛋白生成肽或其变体或片段(例如表位)的特异性。在重链和轻链的CDR的任一侧上是框架区，锚定和定向CDR的相对保守的氨基酸序列。抗体片段可包括双特异性抗体(BsAb)或嵌合抗原受体(CAR)。
恒定区由五个重链序列(μ、γ、ζ、α或ε)之一和两个轻链序列(κ或λ)之一组成。重链恒定区序列确定抗体的同种型和分子的效应子功能。优选地，分离或纯化抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段包含多克隆抗体或其抗原结合片段。至少一种抗体或其抗原结合片段可在兔、小鼠或大鼠中生成。
然而，在一个优选实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段包含单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，本发明的抗体是人抗体。
如本文使用的，术语“人抗体”可意指抗体，如单克隆抗体，其包含与对于转铁蛋白受体(优选地，SEQ ID No：4)或淀粉样蛋白生成肽(优选地，SEQ ID No：1、2或3)显示出免疫特异性的特定人抗体中发现的基本上相同的重链和轻链CDR氨基酸序列。当与参考序列比较时，与重链或轻链CDR基本上相同的氨基酸序列显示出相当大量的序列同一性。这种同一性是明确已知的或可被认为代表特定人抗体的氨基酸序列。基本上相同的重链和轻链CDR氨基酸序列可具有例如氨基酸的微小修饰或保守取代。这样的人抗体维持其选择性结合转铁蛋白受体(优选地，SEQ ID No：4)或淀粉样蛋白生成肽(优选地，SEQ ID No：1、2或3)的功能。
术语“人单克隆抗体”可包括例如通过重组方法如通过噬菌体文库产生、通过淋巴细胞或通过杂交瘤细胞产生的具有基本上或完全人CDR氨基酸序列的单克隆抗体。
术语“人源化抗体”可意指来自非人物种(例如小鼠或兔)的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人中天然产生的抗体的相似性。
抗体可为重组抗体。术语“重组人抗体”可包括使用重组DNA技术产生的人抗体。
术语“抗原结合区”可意指对于其靶抗原(例如转铁蛋白受体或淀粉样蛋白生成肽)具有特异性结合亲和力的抗体区域。结合区可为高变CDR或其功能部分。术语CDR的“功能部分”可意指CDR内的序列，其显示出对于靶抗原即转铁蛋白受体或淀粉样蛋白生成肽的特异性亲和力。CDR的功能部分可包含特异性结合转铁蛋白受体或淀粉样蛋白生成肽的配体。
术语“CDR”可意指重和轻可变链中的高变区。在抗体的每条重链和轻链中可存在一个、两个、三个或更多个CDR。通常，每条链上存在至少三个CDR，当配置在一起时，它们形成抗原结合位点，即抗原与之结合或特异性反应的三维组合位点。然而，已假定在一些抗体的重链中可存在四个CDR。
CDR的定义还包括当针对彼此比较时氨基酸残基的重叠或亚组。涵盖特定CDR或其功能部分的确切残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可常规地确定哪些残基包含特定的CDR。
术语抗体的“功能片段”可意指保留功能活性的抗体的一部分。功能活性可为例如抗原结合活性或特异性。功能活性还可为例如由抗体恒定区提供的效应子功能。术语“功能片段”还预期包括例如通过人单克隆抗体的蛋白酶消化或还原，以及通过本领域技术人员已知的重组DNA方法产生的片段。人单克隆抗体功能片段包括例如各个重链或轻链及其片段，如VL、VH和Fd；单价片段，如Fv、Fab和Fab′；二价片段如F(ab′)2；单链Fv(scFv)；和Fc片段。
术语“VL片段”可意指包括轻链可变区(包括CDR)的全部或部分的人单克隆抗体的轻链片段。VL片段还可包括轻链恒定区序列。
术语“VH片段”可意指包含重链可变区(包括CDR)的全部或部分的人单克隆抗体的重链片段。
术语“Fd片段”可意指与重链可变区和恒定区(即VL、CL和VH、CH-1)偶联的轻链可变区和恒定区。
术语“Fv片段”可意指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括重链和轻链的可变区的全部或部分，以及重链和轻链的恒定区的不存在。重链和轻链的可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链两者的约110个氨基酸的氨基末端可变区的全部或部分。
术语“Fab片段”可意指比Fv片段大的人单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab片段包括可变区以及重链和轻链的第一恒定结构域的全部或部分。因此，Fab片段另外包括例如重链和轻链的约110至约220个的氨基酸残基。
术语“Fab′片段”可意指比Fab片段大的人单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab′片段包括轻链的全部、重链可变区的全部、以及重链的第一恒定结构域和第二恒定结构域的全部或部分。例如，Fab′片段可另外包括重链的氨基酸残基220-330的一些或全部。因此，在一个优选实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于转铁蛋白受体免疫特异性的Fab′片段。在另一个优选实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的Fab′片段。优选地，Fab′片段特异性结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维，而不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块或单体。
术语“F(ab′)2片段”可意指人单克隆抗体的二价抗原结合片段。F(ab′)2片段包括例如两条重链和两条轻链的可变区的全部或部分，并且还可包括两条重链和两条轻链的第一恒定结构域的全部或部分。相应地，在一个最优选的实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽和转铁蛋白受体免疫特异性的二价或双特异性F(ab′)2片段。双特异性F(ab′)2片段优选包含显示出对于转铁蛋白受体的免疫特异性的第一Fab′片段，所述第一Fab′片段与第二Fab′片段缀合(优选经由其暴露的巯基)，所述第二Fab′片段显示出对于淀粉样蛋白生成肽的免疫特异性。最优选地，第二Fab′片段特异性结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维，而不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块或单体。
术语“单链Fv(scFv)”可意指用短接头肽连接的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合物。
术语“双特异性抗体(BsAb)”可意指包含通过较短连接肽彼此连接的两个scFv的双特异性抗体。
本领域技术人员已知，只要片段维持功能活性，抗体片段的确切边界并不重要。使用众所周知的重组方法，本领域技术人员可改造多核苷酸序列，以表达对于特定应用具有所需的任何终点的功能片段。抗体的功能片段可包含下述或由下述组成：与人抗体具有基本上相同的重链和轻链可变区的片段。
优选地，就本发明的第一个方面而言，其抗原结合片段是转铁蛋白受体或淀粉样蛋白生成肽。其抗原结合片段可包含选自下述的任何片段或由选自下述的任何片段组成：VH、VL、Fd、Fv、Fab、Fab′、scFv、F(ab′)2和Fc片段。
其抗原结合片段可包含下述或由下述组成：VL的抗原结合区序列中的任何一个、VH的抗原结合区序列中的任何一个、或者人抗体的VL和VH抗原结合区的组合。取决于抗原结合片段的所需亲和力和特异性以及预期用途，本领域技术人员可确定VH和VL抗原结合区序列的适当数目和组合。使用本领域技术人员众所周知的方法，可容易地产生且分离抗体的功能片段或抗原结合片段。这样的方法包括例如蛋白酶解方法、重组方法和化学合成。用于分离功能片段的蛋白酶解方法包括使用人抗体作为原材料。适合于人免疫球蛋白的蛋白酶解的酶可包括例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。本领域技术人员可容易地选择适当的酶，取决于例如是需要单价还是二价片段。例如，木瓜蛋白酶切割导致结合抗原的两个单价Fab′片段和一个Fc片段。例如，胃蛋白酶切割导致二价F(ab′)片段。本发明的F(ab′)2片段可使用例如DTT或2-巯基乙醇进一步还原，以产生两个单价Fab′片段。
通过蛋白酶解产生的抗体的功能或抗原结合片段可通过亲和层析和柱层析程序纯化。例如，未消化的抗体和Fc片段可通过与蛋白A结合而去除。另外，可使用例如离子交换和凝胶过滤层析，借助于其电荷和大小来纯化功能片段。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。
至少一种抗体或其抗原结合片段可通过重组方法产生。优选地，最初分离编码抗体重链和轻链的所需区域的多核苷酸。这样的区域可包括例如重链和轻链的可变区的全部或部分。优选地，这样的区域可特别包括重链和轻链的抗原结合区，优选抗原结合位点，最优选CDR。
编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可使用本领域技术人员已知的方法产生。编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可通过本领域已知的寡核苷酸合成方法直接合成。可替代地，可使用本领域已知的重组方法合成且连接较小的片段，以形成较大的功能片段。
如本文使用的，术语“免疫特异性”可意指结合区能够通过与淀粉样蛋白生成肽特异性结合而与其免疫反应。抗体或其抗原结合片段可与抗原(例如SEQ ID No：1、2或3，或其变体或片段)选择性相互作用，其亲和常数为大约10-5至10-13M，优选10-6至10-9M，甚至更优选10-10至10-12M。
如本文使用的，术语“免疫特异性”可意指结合区能够通过与转铁蛋白受体特异性结合而与其免疫反应。优选地，与转铁蛋白受体的结合亲和力在微摩尔范围内。抗体或其抗原结合片段可与抗原(例如SEQ ID No：4，或其变体或片段)选择性相互作用，其亲和常数不小于1x 10-4M，更优选不小于1x 10-3M。
术语“免疫反应”可意指结合区在与SEQ ID No：1-4中任一个或其表位结合时能够引发免疫应答。
术语“表位”可意指具有引发抗体或其抗原结合片段的结合区并且与其组合的能力的抗原的任何区域。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No：1-4中任一个的一个或多个氨基酸。
应了解，本发明的生物特异性试剂的纳米颗粒组分由材料组成，所述材料使它能够在红外下和/或使用磁共振成像(MRI)和/或计算机断层扫描(CT)可见。这种纳米颗粒也称为量子点。
优选地，纳米颗粒包含在近红外下可见的内核。优选地，核包含镉或铅。优选地，核包含选自CdSe、CdTe、CdS、PbS和PbSe的材料。最优选地，核包含CdSe。核的平均直径可在5nm至30nm之间，或者在8nm至20nm之间，优选在10nm至15nm之间，并且最优选在12nm至14nm之间。
优选地，纳米颗粒包含壳，其优选包围核，并且优选包含镉或锌，其改进且增强核的光学性质，同时增加量子产率(即吸收的光子数目/发射的光子数目)。壳可包含ZnS或CdS。优选地，壳包含ZnS。有利地，如图2所示，壳还减少了镉基核或铅基核的毒性。壳优选围绕核生长，形成一层。
纳米颗粒优选包含造影材料，其使用MRI或CT可见。优选地，造影材料包封或包围核，且更优选壳。
造影材料可包含金属或非金属材料。造影材料可包含磁性或非磁性材料。在其中造影材料是磁性的实施例中，它可包含MRI造影材料。造影材料可包含顺磁或超顺磁材料。例如，造影材料核可包含铁、镍、钴或镝或者含有这些元素中的一种或多种的化合物，例如氧化物或合金。造影材料可包含磁铁矿(Fe3O4)。
在其中造影材料是非磁性的实施例中，它可包含MRI和CT造影材料两者。例如，造影材料可包含钆、金、碘或硫酸硼。这些材料各自可用作MRI或CT造影材料。优选地，造影材料包含钆。
优选地，造影材料包含1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(即DOTA)。最优选地，造影材料包括钆特酸，大环结构的基于Gd的MRI造影剂，由作为螯合剂的有机酸“DOTA”组成。
造影材料优选包封壳。Gd-DOTA/二氧化硅封装可借助于表面盐化附着至壳。3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPS)可借助于Zn/硫醇结构充当对表面的底层(primer)。目前的甲氧基硅烷基团(Si-OCHB3B)可水解成硅烷醇基(Si-OH)并且因此交联，这使硅烷层稳定到壳的表面上。硅酸钠和亲水性三甲氧基硅烷的加入允许借助于硅氧烷键形成的三甲氧基硅烷基团交联，其确保二氧化硅层与底层连接并且最终与壳连接。
至少一种抗体或其抗原结合片段可通过共价键合附着至生物特异性试剂的造影剂。优选地，造影剂被配置为允许羧基官能化，通过所述羧基官能化，至少一种抗体或其抗原片段可与之缀合。在一个实施例中，至少一种抗体或其抗原结合片段可使用碳化二亚胺化学共价附着至造影剂，以便产生本发明的生物特异性试剂。例如，如实施例中所述，EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基碳化二亚胺盐酸盐)是水溶性碳化二亚胺交联剂，其活化羧基以与伯胺自发反应，允许抗体固定和半抗原-载体蛋白缀合。因此，缀合涉及抗体的胺基与存在于造影剂外层上的羧基的共价结合。
附着至纳米颗粒的抗体或其抗原结合片段的量取决于造影材料上官能团(优选羧基)的量、造影材料的类型和附着化学。优选地，多种抗体或其抗原结合片段以覆盖造影材料层的外表面的间隔阵列排列。
生物特异性试剂在形状中可为基本上球形的。生物特异性试剂的平均直径可为亚微米，即小于1000nm，更优选小于500nm，或甚至更优选小于300nm。生物特异性试剂的平均直径可为100-450nm。
相应地，在一个优选实施例中，生物特异性试剂包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)CdSe、CdTe、CdS、PbS或PbSe内核(优选CdSe)，其在近红外下可见；
(ii)围绕核的锌或镉壳(优选ZnS)，其改进且增强核的光学性质，同时增加量子产率；
(iii)包封壳的造影材料(优选Gd-DOTA/二氧化硅)，其使用磁共振成像(MRI)和/或计算机断层扫描(CT)可见；和
(iv)至少一种抗体或其抗原结合片段，其对于转铁蛋白受体和淀粉样蛋白生成肽是免疫特异性的。
优选地，至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽和转铁蛋白受体免疫特异性的双特异性F(ab′)2片段。双特异性F(ab′)2片段优选包含显示出对于转铁蛋白受体的免疫特异性的第一Fab′片段，以及显示出对于淀粉样蛋白生成肽的免疫特异性的第二Fab′片段。最优选地，第二Fab′片段特异性结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维，但不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块或单体。
如实施例中所述，本发明人已证实本发明的生物特异性试剂具有在神经退行性病症的诊断和治疗两者中的效用。
因此，在第二个方面，提供了用于诊断的根据第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂。
应了解，生物特异性试剂可用作一系列不同的生物成像应用中的生物传感器。例如，生物特异性试剂优选作为生物标记用于MRI、CT或IR成像技术中。
因此，在第三个方面，提供了第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂作为NIR生物标记、MRI生物标记或作为CT生物标记的用途。
在第四个方面，提供了包含根据第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂的生物标记。
生物标记可用于NIR、MRI或CT成像中。
因此，在第五个方面，提供了NIR、MRI或CT成像方法，其包括第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂的使用。
优选地，本发明的生物特异性试剂在近红外区发光。红外被定义为波长700nm至1mm的辐射，并且近红外具有约0.75-1.4μm的波长。最优选的近红外I具有约705nm-900nm的波长。优选地，本发明的生物特异性试剂导致随着增加光致发光的减少自发荧光，具有经由功能NIR I光谱学的非侵入性检测的能力。本发明制剂的最大发射波长约为850nm，而最大吸收波长在496nm处。有利地，由于量子点的使用，在NIR中的发射峰可穿过生物组织至多于2nm，这对于诊断脑疾病如阿尔茨海默氏病是理想的。
优选地，本发明的生物特异性试剂由于Gd-DOTA二氧化硅而具有MRI和/或CT检测特性。磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)是在组织成像中选择的方法。MRI基于大磁场产生净磁矢量的能力，暂时改变高度水合组织中的质子排列。MRI主要适合于韧带、腱和脊髓以及脑肿瘤中损伤的成像。然而，这种技术不允许如可通过CT获得的那些一样详述的脑部病症成像。
CT基于由检测器检测到的X射线衰减，其中像素的值被计算并且然后被转换成图像。定量计算机断层扫描(QCT)能够提供脑密度的测量，并且在三维中测量真实体积(mg/cm3)，与脑密度的二维区域相反。
本发明人已证实，根据本发明的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂可用于由于淀粉样蛋白生成肽的共同存在的使神经退行性病症的症状成像。
例如，神经退行性病症可选自阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；亨廷顿氏病；运动神经元病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和额颞叶痴呆。优选地，所述病症是阿尔茨海默氏病。
应了解，为了诊断阿尔茨海默氏病，至少一种抗体或其抗原结合片段优选特异性结合淀粉样蛋白β(优选部分聚集的SEQ ID No：1)寡聚物和原纤维，但不特异性结合淀粉样蛋白斑块。为了诊断亨廷顿氏病，至少一种抗体或其抗原结合片段优选特异性结合亨廷顿蛋白(优选部分聚集的SEQ ID No：2)寡聚物和原纤维，但不特异性结合亨廷顿蛋白斑块和单体。为了诊断帕金森氏病，至少一种抗体或其抗原结合片段优选特异性结合α-突触核蛋白(优选部分聚集的SEQ ID No：3)寡聚物和原纤维，但不特异性结合α-突触核蛋白斑块和单体。在本文所述的每个实施例中，生物特异性试剂包含对于转铁蛋白受体(优选SEQ IDNo：4)免疫特异性的至少一种抗体或抗原结合片段，因为这使得能够穿过血脑屏障。
根据第一个方面的生物特异性试剂可用于体内、离体或体外诊断。
本发明还提供了用于诊断患有神经退行性疾病的患者的试剂盒。
因此，根据本发明的第六个方面，提供了用于诊断患有神经退行性病症或其倾向的受试者、或者用于提供受试者状况的预后的试剂盒，所述试剂盒包含根据第一个方面的生物特异性试剂，所述生物特异性试剂配置为检测来自测试受试者的生物样品中存在的淀粉样蛋白生成肽的浓度，其中样品中肽的存在提示受试者患有神经退行性病症。
根据第七个方面，提供了用于诊断患有神经退行性病症或其倾向的受试者、或者用于提供受试者状况的预后的方法，所述方法包括检测得自受试者的生物样品中存在的淀粉样蛋白生成肽的浓度，其中所述检测使用根据第一个方面的生物特异性试剂来实现，并且其中所述样品中抗原的存在提示受试者患有神经退行性病症。
样品可包含血液、尿、组织、脑活组织检查等。
优选地，试剂盒或方法用于鉴定样品中淀粉样蛋白生成肽寡聚物和原纤维(包括前原纤维)(而不是淀粉样蛋白生成肽斑块和单体)的存在或不存在，因为寡聚物和原纤维指示早期神经退行性病症，或确定其在样品中的浓度。检测手段可包含适于检测样品中淀粉样蛋白生成肽的存在和/或不存在的测定。试剂盒或方法可包含测定可针对其进行比较的阳性对照和/或阴性对照的使用。例如，试剂盒可包含关于来自患有(即阳性对照)或不患有(即阴性对照)神经退行性病症的个体的样品中淀粉样蛋白生成肽的浓度的参考。
试剂盒还可包含可被检测的标记。术语“标记”可意指可附着至生物特异性试剂的部分。例如，部分可用于治疗或诊断程序。治疗性标记包括例如可附着至本发明的试剂且用于监测试剂与淀粉样蛋白生成肽的结合的部分。诊断标记包括例如可通过分析方法检测的部分。分析方法包括例如定性和定量程序。定性分析方法包括例如免疫组织化学和间接免疫荧光。定量分析方法包括例如免疫亲和程序如放射性免疫测定、ELISA或FACS分析。分析方法还包括体外和体内成像程序两者。可通过分析手段检测的诊断标记的具体例子包括酶、放射性同位素、荧光染料、化学发光标记物和生物素。标记可直接附着至本发明的试剂，或附着至特异性结合本发明的试剂的第二结合剂。这样的第二结合剂可为例如第二抗体。第二抗体可为多克隆或单克隆的，并且具有人、啮齿类动物或嵌合起源。
除可利用生物特异性试剂的强大淀粉样蛋白生成靶向特性的各种成像和诊断技术之外，实例和图3、14-17还解释了特异性靶向淀粉样蛋白生成肽的经缀合双特异性抗体或其抗原结合片段如何致使神经毒性淀粉样蛋白β寡聚物不可溶，因为它们被固定。像这样，这些结合的寡聚物较不易进入神经元细胞，并且其毒性显著降低。这显示生物特异性试剂通过与神经毒性淀粉样蛋白β寡聚物结合且抑制它们进入细胞而具有显著的治疗潜力。
因此，根据第八个方面，提供了用于治疗的根据第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂。
本发明的生物特异性试剂特别可用于预防或治疗神经退行性病症。
因此，在第九个方面中，提供了用于治疗、改善或预防神经退行性病症的根据第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂。
在第十个方面中，提供了治疗、改善或预防受试者中的神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一个方面的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂。
优选地，神经退行性病症选自阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；亨廷顿氏病；运动神经元病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和额颞叶痴呆，并且优选为阿尔茨海默氏病。
治疗的神经退行性病症优选特征在于‘总体’神经元的损伤或死亡。例如，神经退行性病症可选自阿尔茨海默氏病，帕金森氏病；亨廷顿氏病；运动神经元病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和额颞叶痴呆。
优选地，治疗的神经退行性病症是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病或运动神经元疾病。最优选地，治疗的神经退行性病症是阿尔茨海默氏病。
应了解，根据本发明的生物特异性试剂可用于单一疗法(例如，单独使用抗体或其抗原结合片段，或单独使用抗体-药物缀合物)，用于治疗、改善或预防神经退行性病症。可替代地，根据本发明的试剂可用作已知疗法的附加物或与已知疗法组合，所述已知疗法用于治疗、改善或预防神经退行性病症，例如其他乙酰胆碱酯酶抑制剂。
根据本发明的试剂可在具有许多不同形式的组合物中组合，特别取决于使用组合物的方式。因此，例如，组合物可为粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾剂、胶束溶液、经皮贴剂、脂质体悬浮液的形式或可施用于需要治疗的人或动物的任何其他合适形式。应了解，根据本发明的药剂的媒介物应该是由它给予其的受试者良好耐受的媒介物，并且优选使试剂能够递送跨越血脑屏障。
包含本发明的试剂的药物可以多种方式使用。例如，可能需要经口施用，在这种情况下，试剂可包含在组合物内，所述组合物可例如以片剂、胶囊或液体的形式经口摄入。包含本发明的试剂和药剂的组合物可通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可配制用于局部使用。例如，可将乳膏或软膏应用于皮肤，例如脑附近。
根据本发明的试剂和药剂也可被掺入缓释或延迟释放装置内。这样的装置可例如插入皮肤上或皮肤下，并且药剂可经过数周甚至数月释放。该装置可至少位于治疗部位即脑附近。当需要用根据本发明使用的试剂的长期治疗时并且通常需要频繁施用(例如至少每天注射)时，这样的装置可能是特别有利的。
在一个优选实施例中，根据本发明的试剂和药剂可通过注射到血流内或直接进入需要治疗的部位内而施用于受试者。例如，药剂可至少注射到脑附近。注射可为静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)、或皮内(推注或输注)。
应了解，所需的生物特异性试剂的量由其生物学活性和生物利用度决定，所述生物学活性和生物利用度依次又取决于施用模式、试剂的生理化学性质、以及它是作为单一疗法使用还是在组合疗法中使用。施用的频率也将受试剂在被治疗的受试者内的半衰期影响。本领域技术人员可确定待施用的最佳剂量，并且最佳剂量将随使用的特定试剂、药物组合物的强度、施用模式和细菌感染的进展而变化。取决于被治疗的特定受试者的另外因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、重量、性别、饮食和施用时间。
一般地，根据本发明试剂的0.001μg/kg体重至10mg/kg体重的日剂量可用于治疗、改善或预防神经退行性病症，取决于何种试剂。更优选地，所述试剂的日剂量在0.01μg/kg体重至1mg/kg体重之间，更优选在0.1μg/kg至100μg/kg体重之间，并且最优选在大约0.1μg/kg至10μg/kg体重之间。
该试剂可在神经退行性病症发作之前、发作期间或发作之后施用。日剂量可作为单次施用(例如每日一次注射)而给予。可替代地，该试剂可能需要在一天内施用两次或更多次。作为一个例子，试剂可作为0.07μg至700mg(即假设体重为70kg)的两个(或更多个，取决于被治疗的神经退行性病症的严重程度)日剂量施用。接受治疗的患者可在醒来后服用第一剂量，然后在晚上服用第二剂量(如果是两剂量方案)或之后以3或4小时的间隔服用。可替代地，缓释装置可用于对患者提供根据本发明试剂的最佳剂量，而不需要施用重复剂量。已知的程序，例如制药工业常规使用的程序(例如体内实验、临床试验等)，可用于形成根据本发明试剂的特定制剂和精确的治疗方案(例如试剂的日剂量和施用频率)。
在本发明的第十一个方面，提供了包含根据第一个方面的生物特异性试剂和任选的药学可接受的媒介物的药物组合物。
药物组合物优选是抗神经退行性疾病组合物，即用于治疗性改善、预防或治疗受试者中的神经退行性病症，例如优选阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或亨廷顿氏病的药物制剂。
本发明还在第十二个方面提供了用于制备根据第九个方面的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据第一个方面的生物特异性试剂与药学可接受的媒介物组合。
至少一种抗体或其抗原结合片段可如关于第一个方面所定义的。优选地，至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽和转铁蛋白受体免疫特异性的双特异性F(ab′)2片段。双特异性F(ab′)2片段优选包含显示出对于转铁蛋白受体的免疫特异性的第一Fab′片段，所述第一Fab′片段与第二Fab′片段缀合，所述第二Fab′片段显示出对于淀粉样蛋白生成肽的免疫特异性。最优选地，第二Fab′片段特异性结合淀粉样蛋白β蛋白的寡聚物和原纤维，而不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块和肽单体。
“受试者”可为脊椎动物、哺乳动物或驯养动物。因此，根据本发明的药剂可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或者可用于其他兽医应用中。最优选地，受试者是人类。
生物特异性试剂的“治疗有效量”是当施用于受试者时，治疗神经退行性疾病或产生所需效应的所需的试剂量。
例如，所使用的生物特异性试剂的治疗有效量可为约0.001ng至约1mg，并且优选约0.01ng至约100ng。优选生物特异性试剂的量为约0.1ng至约10ng，且最优选约0.5ng至约5ng的量。
如本文所提及的，“药学可接受的媒介物”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
在一个实施例中，药学可接受的媒介物可为固体，并且组合物可为粉末或片剂的形式。固体药学可接受的媒介物可包括一种或多种物质，其也可充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘结剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂崩解剂。媒介物也可为封装材料。在粉末中，媒介物是精细粉碎的固体，其与根据本发明的精细粉碎活性剂混合。在片剂中，活性剂可与具有必要的压缩特性的媒介物以合适的比例混合，并且压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体媒介物包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施例中，药物媒介物可为凝胶，并且组合物可为乳膏等等的形式。
然而，药物媒介物可为液体，并且药物组合物为溶液的形式。液体媒介物用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂、酏剂和加压组合物。根据本发明的活性剂可溶解或悬浮于药学可接受的液体媒介物中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或者药学可接受的油或脂肪。液体媒介物可含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于经口和肠胃外施用的液体媒介物的合适实例包括水(部分含有如上的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物和油(例如分馏的椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，媒介物也可为油性酯如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒介物可用于肠胃外施用的无菌液体形式的组合物中。用于加压组合物的液体媒介物可为卤代烃或其他药学可接受的推进剂。
其为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和特别是皮下注射来利用。试剂可制备为无菌固体组合物，其可在施用时使用无菌水、盐水或其他适当的无菌注射介质溶解或悬浮。
本发明的试剂和组合物可以含有其他溶质或悬浮剂(例如足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等等的无菌溶液或悬浮液的形式经口施用。根据本发明使用的试剂也可以液体或固体组合物的形式经口施用。适合于经口施用的组合物包括固体形式，例如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉末，以及液体形式，例如溶液、糖浆剂、酏剂和悬浮液。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳剂和悬浮液。
应了解，本发明延伸至任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其包含下述或由下述组成：本文所提及的任何序列的基本上的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“基本上的氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”可为与本文所提及的任何一种序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性的序列，例如与鉴定为SEQ ID No：1-4的序列具有40％的同一性等等的序列。
还设想了与所提及的任何序列具有大于50％的序列同一性，更优选大于65％、70％、75％，且再更优选大于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的任何序列具有至少85％的同一性，更优选至少90％、92％、95％、97％、98％，且最优选与本文所提及的任何序列具有至少99％的同一性。
熟练的技术人员将了解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比，必须首先制备两个序列的比对，随后计算序列同一性值。两个序列的同一性百分比取决于下述可采取不同的值：(i)用于比对序列的方法，例如，ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同的程序中实施)或来自3D比较的结构比对；和(ii)由比对方法使用的参数，例如局部相对于总体比对，所使用的成对得分矩阵(例如blosum62、pam250、gonnet等)和空位罚分，例如函数形式和常量。
进行比对后，存在计算两个序列之间的同一性百分比的许多不同方法。例如，可将同一性数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位的数目；或者(iv)排除突出端的等价位置的数目。此外，应了解，同一性百分比也是强烈长度依赖性的。因此，一对序列越短，可预期偶然发生的序列同一性值就越高。
因此，应了解，蛋白质或DNA序列的精确比对是复杂过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680；Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research，24，4876-4882)是用于生成根据本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选方法。ClustalW的合适参数可如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，矩阵＝Identity。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1和GAPDIST＝4。本领域技术人员将意识到可能有必要改变这些和其他参数用于最佳序列比对。
优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比的计算然后可从这种比对计算为(N/T)*100，其中N是在该处序列共享相同残基的位置数目，并且T是比较的位置总数目，包括空位，但排除突出端。因此，用于计算两个序列之间的同一性百分比的最优选方法包括(i)使用clustalw程序使用例如如上所述的合适的一组参数来制备序列比对；和(ii)将n和t的值插入下式中：-序列同一性＝(N/T)*100。
用于鉴定相似序列的替代方法将是本领域技术人员已知的。例如，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与本文所示的任何核酸序列或其互补体杂交的序列编码。严格条件意指核苷酸在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在大约45℃下与过滤器结合的DNA或RNA杂交，随后为在大约20-65℃下在0.2x ssc/0.1％SDS中的至少一次洗涤。可替代地，基本上相似的多肽可与本文所示的序列相差至少1，但少于5、10、20、50或100个氨基酸。
由于遗传密码的简并性，明确的是本文所述的任何核酸序列可改变或变化，而基本上不影响由其编码的蛋白质的序列，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有通过不同密码子的取代而改变的序列的那些，所述密码子编码序列内的相同氨基酸，因此产生沉默变化。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列，但包含序列的全部或一部分的那些变体，所述序列的全部或一部分通过不同密码子的取代而改变，所述不同密码子编码具有与它取代的氨基酸相似的生物物理性质的侧链的氨基酸，以产生保守变化。例如，小的非极性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应了解哪些氨基酸可替换为具有相似生物物理特性的氨基酸，并且熟练的技术人员将知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。
本文(包括任何所附权利要求、摘要和附图)所述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合与以上方面中的任一个组合，除了这样的特征和/或步骤中的至少一些是相互排斥的组合之外。
附图说明
为了更好地理解本发明，并且显示可如何实现本发明的实施例，现在通过举例的方式参考附图，其中：
图1是根据本发明的纳米颗粒或“量子点”的一个实施例的图示。纳米颗粒包括硒化镉核和硫化锌壳，其被Gd-DOTA二氧化硅外壳包封，具有对于淀粉样蛋白β和转铁蛋白受体的免疫特异性的双特异性抗体或其抗原结合片段与之缀合；
图2显示了与充当“诊断探针”的双特异性抗体缀合的Gd-DOTA二氧化硅包封的CdSe/ZnS纳米颗粒的吸收光谱和发射光谱；
图3是显示了暴露于本发明的纳米颗粒后的细胞活力的条形图；
图4是显示了暴露于纳米颗粒后的神经元活力的条形图；
图5显示了用于测定纳米颗粒对于转铁蛋白受体的亲和力的表面等离子体共振的结果；
图6-11显示了纳米颗粒的荧光数据；
图12显示了C57B1/Sv129的免疫荧光染色。a)显示了DAPI核染色。b)显示了胰岛素的定位。c)淀粉样蛋白β寡聚物；
图13显示了采取不同的免疫荧光方法；和
图14-17显示了淀粉样蛋白β寡聚物和纳米颗粒一起温育30+分钟后的结果。
具体实施方式
实例
材料和方法
1)F(ab’)2片段
F(ab’)2片段使用从Life Technologies商购可得的试剂盒获得：
单克隆抗体(mAB)抗Aβ(寡聚物和原纤维特异性)抗体(IgG1)F(ab′)2生成：
将0.5mL的抗体(8mg/mL)加入先前平衡的固定化的无花果蛋白酶柱中，并且温育(37℃)25小时。所生成的F(ab′)2片段用NAb蛋白A柱纯化并且离心(1000xg)1分钟。通过测量在280nm处的吸光度，分光光度法测定流通物浓度。
单克隆抗体(mAB)抗TfR(转铁蛋白受体)抗体(IgM)F(ab′)2生成：
用8mL IgM F(ab’)2消化缓冲液(200ml，100mM乙酸钠，150mM NaCl，0.05％NaN3；pH4.5)洗涤先前平衡的固定化的胃蛋白酶柱。将柱和1mL抗体(1mg/mL)分开温育(37℃)3分钟。将抗体加入柱中并且温育(37℃)1.5小时。生成的F(ab′)2片段在C30浓缩器中离心，并且通过测量在595nm处的吸光度，分光光度法测定浓度。
2)双特异性抗体合成(包括Fab′生成)
如由Greg T.Hermanson在Bioconjugate Techniques Second Edition，ISBN：978-0-12-370501-3中所述执行抗体合成。
Fab′生成：
将1mL抗Aβ寡聚物特异性抗体F(ab′)2(10mg/mL)溶解于20mM缓冲液(磷酸钠，0.15M NaCl，5mM EDTA，pH7.4)中。加入6mg 2-MEA·HCl并且温育(37℃)1.5小时。过量2-MEA·HCl通过凝胶过滤去除。方案对于抗TfR抗体Fab′生成进行重复。
双特异性抗体合成：
将抗Aβ寡聚物特异性抗体Fab′(Fab′A)加入DTNB(40mg DTNB，10ml 1M Tris-HCl，pH7.5)中并且在室温下温育。将等摩尔比的Fab′A-DTNB和抗TfR抗体(Fab′B)混合并且温育(37℃)1.5小时。反应温育(4℃)过夜。双特异性BsAb级分用在PBS中平衡的Superdex 200柱进行纯化。
3)CdSe/ZnS纳米颗粒的合成
基于来自Yang Xu等人和B.O.Dabbousi等人的出版物，用二氧化硅封装合成纳米颗粒。然而，本文所述的方案还将钆掺入外壳中，并且允许羧基官能化以允许抗体片段缀合。
CdSe/ZnS合成：
硒化物有机金属前体(即三辛基硒化膦)的制备通过将0.1mol硒化物丸溶解于100ml三辛基膦中来实现，由此导致1M三辛基硒化膦溶液。二甲基镉用作另一种有机金属前体。经由二甲基镉和三辛基硒化膦在配位三辛基氧化膦溶剂中的热解来合成CdSe前体材料(也称为量子点)。前体在350℃下注入，并且颗粒/点在290℃下生长。用甲醇执行选择性大小沉淀，以收集作为粉末的颗粒，然后将它们再分散在己烷中。5g三辛基氧化膦在真空下加热直至它达到190℃，然后将它冷却至60℃。将0.3umol的CdSe分散在己烷中，并且转移到反应容器内，伴随将溶剂泵出。
六甲基二硅硫烷(hexamethyldisilathiane)和二乙基锌被用作锌和硫化物的前体。由TEM确定CdSe核前体的平均半径，然后计算适当的CdSe/ZnS比。这通过考虑壳体积/核体积的比率并且假定球形核和壳并且考虑体晶格参数来完成。将前体溶解于惰性大气手套箱内的3mL三辛基膦中。将前体装载转移到加料漏斗内，加料漏斗附接到具有分散在三辛基氧化膦中的CdSe核的反应烧瓶。三辛基膦在氮气氛下加热，然后将前体在180℃的温度下逐滴加入反应混合物中10分钟。然后将混合物冷却至90℃，同时搅拌3小时；然后加入5mL丁醇以抑制冷却期间三辛基氧化膦的固化。将纳米颗粒贮存于溶液中，使得它们的表面用三辛基氧化膦保持钝化。回收时，粉末形成的颗粒用甲醇沉淀，然后再分散在溶剂(例如己烷、THF等)中。
螯合钆(Gd-DOTA)二氧化硅封装：
将硅酸钠和巯基丙基三甲氧基硅烷在去离子水中稀释至0.15％和0.7％的最终百分比。将0.1mL稀巯基丙基三甲氧基硅烷加入10mL CdSe/ZnS纳米颗粒溶液中，然后振荡20分钟。这允许硫化锌壳与巯基丙基三甲氧基硅烷通过Zn/硫醇键的连接，以允许二氧化硅涂层的沉积。加入0.2mL预先稀释的硅酸钠溶液(pH 10)，将该溶液充分混合并且保持在室温下的暗室中，以允许二氧化硅的聚合。4小时后，将溶液转移至含有8mL乙醇(100％)的另一个小瓶中，以允许由于过量硅酸盐的沉淀而生长较厚的二氧化硅涂层。然后将二氧化硅包封的纳米颗粒沉淀出来。将所得到的二氧化硅包封的纳米颗粒在室温下加入10umol 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)单-N-羟基琥珀酰亚胺酯中24小时。通过在室温下添加两摩尔当量的钆前体(Gd3+；GdCl3)24小时实现了钆与DOTA的螯合。通过离心和洗涤收集Gd-DOTA掺杂的二氧化硅包封的纳米颗粒。
Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒的羧基官能化：
在室温下，将40g Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒与0.05mmol APTES在1：2去离子水-乙醇混合物(12mL，4mL：12mL)中反应24小时。在胺化之后，为了将末端胺基团转化为羧基，将Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒在乙醇中洗涤两次，然后在室温下伴随琥珀酸酐(0.06mmol)的加入在20mL无水二甲基甲酰胺中再分散过夜，随后为用乙醇的另外两次洗涤。
4)与EDC缀合
EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基碳化二亚胺盐酸盐)是水溶性碳化二亚胺交联剂，其活化羧基用于与伯胺的自发反应，使能够肽固定和半抗原-载体蛋白缀合。缀合涉及双特异性抗体的胺基团与羧基的共价键合(如Wen-Yen Huang等人所述)
与羧基官能化的Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒的双特异性抗体缀合：
将25mM羧基官能化的Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒与双特异性抗体(1mg/mL)偶联。EDC(20mM)/磺基-NHS(50Mm)紧在使用前制备。在羧基官能化的Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒的溶液中加入250μL EDC/磺基-NHS。将反应在室温下温育10分钟，并且加入7μL2-MEA以淬灭任何过量的EDC。将25μL双特异性抗体溶液加入活化的羧基官能化的Gd-DOTA二氧化硅包封的纳米颗粒中。反应在室温下温育60分钟。通过针对Tris(pH 7.4，50mM)透析去除过量的反应物和磺基-NHS。
5)聚集
如由制造商建议的(abcam http：//www.abcam.com/amyloid-beta-peptide-1- 42-human-ab120301.html)，遵循淀粉样蛋白β1-42的聚集方案。
在使用之前且在打开小瓶之前，推荐将产品平衡至室温至少1小时。淀粉样蛋白β(1-42)人肽最初应在100％HFIP(1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇)中以1mg/ml的浓度溶解。该溶液应该在室温下温育1小时，伴随以中等速度的偶尔涡旋。接下来，溶液应该在水浴超声波仪中超声10分钟。然后HFIP/肽溶液应该在温和的氮气流下干燥。100％的DMSO应该用于重悬浮肽。该溶液应该在室温下温育12分钟，伴随偶尔涡旋。然后将最终溶液等分成较小的体积并且贮存于-80℃下。对于工作溶液，将500-1000μl D-PBS(取决于待使用的最终浓度)加入肽储备溶液中，并且在室温下温育2小时以允许肽聚集。通过凝胶电泳确定淀粉样蛋白β物种的分子量。
6)表面等离子体共振
使用GE Healthcare BiacoreTM执行表面等离子体共振，如通过BiacoreTM测定手册和BiacoreTM传感器表面手册所述，遵循实验设置：
纳米颗粒-探针亲和力：
表面等离子体共振(Biacore)用于测定双特异性抗体对于各种靶的亲和力。将0.4M EDC/1M NHS溶液以10μl/分钟的流速加入葡聚糖基质中共7分钟，以活化表面。以10μl/分钟的流速加入TfR溶液(配体，50μg/mL，PBS稀释剂)共7分钟。1M乙醇胺-HCl(pH8.5)以10μl/分钟的流速加入共7分钟，以使过量的反应性基团失活。使用各种浓度的纳米颗粒-探针溶液(分析物，PBS稀释剂)，包括一式两份的浓度。未改性的表面用于参考分析。使用各种大小的Aβ寡聚物作为配体重复方案。
7)直接荧光测定
Aβ单体、寡聚物、原纤维和斑块(100pg/ml-800pg/ml)在384孔板中的PBS(w/5％BSA)中进行封闭。加入探针并且在室温下温育1小时，然后用PBS-T洗涤。用板阅读器在800nm(488nm激发)下读取荧光。
8)测定试剂盒
标准的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)测定试剂盒(MTT细胞增殖测定(30-1010KTM))用于测定量子点探针针对NIH/3T3细胞的细胞毒性。
9)免疫荧光
如由abcam(http：//www.abcam.com/ps/pdf/protocols/double％ 20immuunofluorescence％20-simulatneous％20protocol.pdf)所述，执行双重免疫荧光。
免疫荧光方案：
盖玻片在室温下用聚乙烯基亚胺涂布1小时。盖玻片用无菌水清洗3次，每次5分钟。允许盖玻片完全干燥，然后在UV光下完全灭菌6小时。使C57B1/Sv129细胞在玻璃盖玻片上生长，然后在磷酸盐缓冲盐水中短暂清洗。将细胞在PBST(w/1％BSA)中温育30分钟，以减少非特异性结合。贮存于黑暗中以防止光漂白的经缀合的第一抗体(针对淀粉样蛋白β1-42(寡聚物和原纤维)和波形蛋白)与PBST一起在4℃下温育过夜。将该溶液倾析并且在PBS中洗涤三次，每次5分钟。还将细胞与0.5μg/ml的DAPI一起温育1分钟，然后在PBS中清洗。将固定介质滴在盖玻片上，并且通过应用指甲油密封盖玻片以避免干燥。将样品贮存于在-20℃下的黑暗中。共聚焦显微术用于表征免疫荧光的结果。
实例1-纳米颗粒
参考图1，显示了根据本发明的纳米颗粒2的一个实施例。纳米颗粒2用于通过特异性靶向每种疾病中普遍存在的生物标记物来检测神经退行性病症，例如阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病。另外，纳米颗粒2可用于通过阻断和预防疾病发展来治疗每种疾病，如下文讨论的。
纳米颗粒2(在本文中也被称为“量子点”)由硒化镉(CdSe)制成的内核4组成，所述内核4由硫化锌(ZnS)壳6涂布，并且其自身被钆(Gd)-DOTA二氧化硅包封，形成外壳8。在其他实施例中，核由CdTe、CdS、PbS或PbSe等(代替CdSe)组成，壳可由CdS(代替ZnS)组成，并且金纳米颗粒可用于代替Gd。一系列双特异性抗体10或其抗原结合片段与Gd-DOTA二氧化硅壳8缀合。每个双特异性抗体10由对于转铁蛋白受体免疫特异性的第一Fab′片段12组成，即它是IgM抗转铁蛋白受体抗体的Fab′片段。
在一个实施例中，第一Fab′片段12经由其暴露的巯基缀合至第二Fab′片段14，所述第二Fab′片段14对于淀粉样蛋白β蛋白的寡聚物和原纤维是免疫特异性的，即它是IgG1抗淀粉样蛋白β(寡聚物和原纤维特异性)抗体的Fab′片段；它对于淀粉样蛋白斑块并非免疫特异性的。在该第一个实施例中，双特异性抗体10可用于诊断/治疗阿尔茨海默氏病。然而，在第二个实施例中，双特异性抗体10可通过将双特异性抗体10中的抗淀粉样蛋白β(寡聚物和原纤维特异性)Fab′片段14转变为靶向且由此鉴定其他生物标记物(例如关于帕金森氏病的α-突触核蛋白寡聚物和原纤维、或关于亨廷顿氏病的亨廷顿蛋白)进行修饰，以用于诊断/治疗其他神经退行性疾病(帕金森氏病、亨廷顿氏病等)。
用于产生IgG1抗淀粉样蛋白β(寡聚物和原纤维特异性)抗体片段14的免疫原是对应于具有以下氨基酸序列的人淀粉样蛋白β(1-42)的部分聚集的重组肽：D-A-E-F-R-H-D-S-G-Y-E-V-H-H-Q-K-L-V-F-F-A-E-D-V-G-S-N-K-G-A-I-I-G-L-M-V-G-G-V-V-I-A(SEQ IDNo：1)。由于IgM抗转铁蛋白受体抗体的Fab′片段，双特异性抗体2对于转铁蛋白受体具有低亲和力，并且可经由受体介导的转胞吞作用穿过血脑屏障。双特异性抗体10对于淀粉样蛋白β寡聚物和原纤维是特异性的(淀粉样蛋白β寡聚物和原纤维导致阿尔茨海默氏病的活性可在第一症状普遍存在之前十年被检测到)，同时展示与淀粉样蛋白β单体和斑块的低交叉反应性。原纤维明显大于寡聚物，并且在阿尔茨海默氏病的较早期阶段也存在。因此，与单独的原纤维相反，检测原纤维和寡聚物是有益的。
纳米颗粒2首先通过形成被硫化锌壳6包围的硒化镉内核4而形成。然后壳6被掺入钆的羧基官能化的二氧化硅壳8包封。纳米颗粒2被羧基官能化，以允许通过使用共价键合与其胺基团反应与Fab′片段12、14的蛋白质缀合。纳米颗粒2能够在近红外(NIR II)区域中发光，并且导致减少的自发荧光，伴随增加光致发光，具有经由功能性NIR I光谱的非侵入性检测的能力。量子点的最大发射波长为845nm，其最大吸收波长在496nm处。另外，由于Gd-DOTA二氧化硅壳8，纳米颗粒2具有MRI检测特性。
具有其缀合的双特异性抗体10的纳米颗粒2致使神经毒性淀粉样蛋白β寡聚物不可溶(固定化)，并且因此结合的寡聚物较不易进入细胞，并且其毒性显著降低。
实例2-评价吸收光谱和发射光谱
参考图2，显示了与双特异性抗体10缀合的Gd-DOTA二氧化硅包封的CdSe/ZnS纳米颗粒2的吸收光谱和发射光谱。纳米颗粒2展示宽吸收光谱，但是展示具有可区分的峰的相对窄的发射光谱，这是量子点高度特有的。还存在大的“斯托克斯位移”，这将最终降低荧光淬灭且增加信号，这又是量子点特有的。发射峰位于850nm处，而吸收峰位于496nm处。发射峰位于近红外(NIR)中，其可穿透生物组织。此外，如由Hong等人所述，量子点的使用将穿透深度增加到>2nm。
实例3-细胞活力测试
参考图3，显示了暴露于本发明的纳米颗粒2后的细胞活力的条形图。纳米颗粒2对于神经元细胞(NIH/3T3)展示非常小的细胞毒性，其可归因于镉基核4周围的二氧化硅包封8和ZnS壳6，与对照样品相比，48小时温育期后的细胞活力>90％。
实例4-神经元活力测试
参考图4，显示了暴露于纳米颗粒2后的神经元活力的条形图。寡聚物和原纤维对于神经元细胞(NIH/3T3)展示显著的细胞毒性，与对照样品相比，细胞活力分别为25％和42％。然而，结合的寡聚物和原纤维展示降低的细胞毒性，其中用结合的寡聚物的细胞活力为71％，并且用结合的原纤维的细胞活力为83％。像这样，纳米颗粒2通过降低淀粉样蛋白β原纤维和寡聚物(淀粉样蛋白β的最神经毒性形式)的细胞毒性而展示显著的治疗潜力。
实例5-纳米颗粒与转铁蛋白受体的亲和力
图5显示了用于测定纳米颗粒2对于转铁蛋白受体的亲和力的表面等离子体共振的结果。纳米颗粒2具有1.36x 10-4的微摩尔Kd(解离常数)值。这个高Kd值是对于转铁蛋白受体的低亲和力的证实。由于对于转铁蛋白受体的低亲和力，纳米颗粒2可经由受体介导的转胞吞作用穿过血脑屏障。双特异性抗体10中的抗转铁蛋白受体Fab′12是IgM，并且IgM倾向于具有天然的低亲和力。
实例6-荧光实验
图6-11显示了纳米颗粒2的荧光数据。如可见的，从结合的原纤维和寡聚物发射显著的荧光。从原纤维发射的荧光保持不变。然而，可如图11所示，从结合的寡聚物物种发射的荧光取决于寡聚物的“大小”(分子量)。图9显示了57kDa及以上的结合的寡聚物导致从单体和原纤维发射少量荧光，因此证实纳米颗粒2与其他淀粉样蛋白β物种具有很小的交叉反应性，因此减少了误诊的机会。
实例7-淀粉样蛋白β寡聚物的检测
参考图12，显示了C57B1/Sv129的免疫荧光染色。图12(a)显示了DAPI核染色，图12(b)显示了胰岛素的定位，和图12(c)显示了淀粉样蛋白β寡聚物。免疫荧光的成功证实纳米颗粒2可成功靶向细胞内淀粉样蛋白β寡聚物。
图13显示了采取不同的免疫荧光方法。将纳米颗粒加入具有淀粉样蛋白β寡聚物的培养基中并且预先温育15分钟。与图12相比，由于更少的寡聚物能够从培养基进入细胞，所以存在淀粉样蛋白β寡聚物的细胞内水平的显著降低。这证实纳米颗粒可阻碍神经毒性蛋白进入细胞内。
实例8-纳米颗粒的治疗潜力
图14-17显示了淀粉样蛋白β寡聚物和纳米颗粒2一起温育30+分钟后的结果。然后将含有结合的寡聚物的培养基引入神经外胚层细胞中。如由共聚焦图像可见的，存在极少的细胞内淀粉样蛋白β。如图13所示，对于15分钟的温育时间，一些淀粉样蛋白β寡聚物仍然能够从培养基中进入细胞，然而，在30+分钟的温育时间后，非常少的寡聚物在细胞内。这显示纳米颗粒2通过结合神经毒性淀粉样蛋白β寡聚物并且抑制它们进入细胞而具有治疗潜力。
讨论
数据显示，由缀合至Gd-DOTA二氧化硅外壳8的双特异性抗体10组成的本发明的纳米颗粒2展示低细胞毒性，同时显示出靶向细胞内淀粉样蛋白β物种的能力。纳米颗粒2展示与淀粉样蛋白β单体和斑块的低交叉反应性，同时对于淀粉样蛋白β寡聚物和原纤维展示高亲和力。纳米颗粒2还对于转铁蛋白受体展示低亲和力，这是经由受体介导的转胞吞作用穿过血脑屏障所需的特征。外壳8被羧基官能化，以允许抗体Fab′片段的直接蛋白质缀合。由于CdSe/ZnS组成，纳米颗粒也被证实在NIR中发光，最大在850nm处。Gd-DOTA二氧化硅封装(即外壳8)显著改进了纳米颗粒2的生物相容性并且急剧降低了其毒性，并且Gd允许潜在的MRI检测。
本发明人惊讶地观察到纳米颗粒2也展示治疗效应，因为它结合了寡聚物，如由免疫荧光展示的，由于它们变得不可溶，所以较不易进入细胞。
纳米颗粒2的重要特征是IgM抗转铁蛋白受体抗体Fab′片段12，因为它允许纳米颗粒2穿过血脑屏障。然而，用于合成双特异性抗体的IgG1抗淀粉样蛋白β(寡聚物和原纤维特异性)抗体Fab′片段14可替换为检测其他蛋白质寡聚物和原纤维(其对于其他神经退行性病症是诊断性的)的抗体。例如，对于帕金森氏病，抗体例如抗α突触核蛋白(寡聚物和原纤维特异性)抗体可用于鉴定帕金森氏病的生物标记物特征。
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<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
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Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
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<211> 3144
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Thr Leu Glu Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser
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Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
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Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu
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Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro
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Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro Lys Lys Glu Leu Ser Ala
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Thr Lys Lys Asp Arg Val Asn His Cys Leu Thr Ile Cys Glu Asn Ile
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Ile Ala Met Glu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Asp Asp Ala Glu Ser Asp
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Val Arg Met Val Ala Asp Glu Cys Leu Asn Lys Val Ile Lys Ala Leu
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Ser Val Gln Glu Thr Leu Ala Ala Ala Val Pro Lys Ile Met Ala Ser
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Glu Asp Glu His Ser Thr Leu Leu Ile Leu Gly Val Leu Leu Thr Leu
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Leu Phe Arg Thr Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gln Thr Leu Thr Ala Val
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Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Ala Lys Glu Glu Ser Gly Gly Arg
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435 440 445
Glu Glu Glu Ala Leu Glu Asp Asp Ser Glu Ser Arg Ser Asp Val Ser
450 455 460
Ser Ser Ala Leu Thr Ala Ser Val Lys Asp Glu Ile Ser Gly Glu Leu
465 470 475 480
Ala Ala Ser Ser Gly Val Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly His Asp Ile
485 490 495
Ile Thr Glu Gln Pro Arg Ser Gln His Thr Leu Gln Ala Asp Ser Val
500 505 510
Asp Leu Ala Ser Cys Asp Leu Thr Ser Ser Ala Thr Asp Gly Asp Glu
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Asp Pro Ala Met Asp Leu Asn Asp Gly Thr Gln Ala Ser Ser Pro Ile
545 550 555 560
Ser Asp Ser Ser Gln Thr Thr Thr Glu Gly Pro Asp Ser Ala Val Thr
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Pro Ser Asp Ser Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr
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Leu Gly Leu Gln Ile Gly Gln Pro Gln Asp Glu Asp Glu Glu Ala Thr
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Pro Ser Asp Ser Ser Val Asp Lys Phe Val Leu Arg Asp Glu Ala Thr
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Ala Ala Ala Ser Leu Ile Arg Leu Val Pro Lys Leu Phe Tyr Lys Cys
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Ser Val Tyr Leu Lys Leu Leu Met His Glu Thr Gln Pro Pro Ser His
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Phe Gly Cys Cys Glu Ala Leu Cys Leu Leu Ser Thr Ala Phe Pro Val
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Cys Ile Trp Ser Leu Gly Trp His Cys Gly Val Pro Pro Leu Ser Ala
1045 1050 1055
Ser Asp Glu Ser Arg Lys Ser Cys Thr Val Gly Met Ala Thr Met Ile
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Leu Thr Leu Leu Ser Ser Ala Trp Phe Pro Leu Asp Leu Ser Ala His
1075 1080 1085
Gln Asp Ala Leu Ile Leu Ala Gly Asn Leu Leu Ala Ala Ser Ala Pro
1090 1095 1100
Lys Ser Leu Arg Ser Ser Trp Ala Ser Glu Glu Glu Ala Asn Pro Ala
1105 1110 1115 1120
Ala Thr Lys Gln Glu Glu Val Trp Pro Ala Leu Gly Asp Arg Ala Leu
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Val Pro Met Val Glu Gln Leu Phe Ser His Leu Leu Lys Val Ile Asn
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Ile Cys Ala His Val Leu Asp Asp Val Ala Pro Gly Pro Ala Ile Lys
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Ala Ala Leu Pro Ser Leu Thr Asn Pro Pro Ser Leu Ser Pro Ile Arg
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Arg Lys Gly Lys Glu Lys Glu Pro Gly Glu Gln Ala Ser Val Pro Leu
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Ser Pro Lys Lys Gly Ser Glu Ala Ser Ala Ala Ser Arg Gln Ser Asp
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Thr Ser Gly Pro Val Thr Thr Ser Lys Ser Ser Ser Leu Gly Ser Phe
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Tyr His Leu Pro Ser Tyr Leu Lys Leu His Asp Val Leu Lys Ala Thr
1235 1240 1245
His Ala Asn Tyr Lys Val Thr Leu Asp Leu Gln Asn Ser Thr Glu Lys
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Phe Gly Gly Phe Leu Arg Ser Ala Leu Asp Val Leu Ser Gln Ile Leu
1265 1270 1275 1280
Glu Leu Ala Thr Leu Gln Asp Ile Gly Lys Cys Val Glu Glu Ile Leu
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Gly Tyr Leu Lys Ser Cys Phe Ser Arg Glu Pro Met Met Ala Thr Val
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Cys Val Gln Gln Leu Leu Lys Thr Leu Phe Gly Thr Asn Leu Ala Ser
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Gln Phe Asp Gly Leu Ser Ser Asn Pro Ser Lys Ser Gln Gly Arg Ala
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Gln Arg Leu Gly Ser Ser Ser Val Arg Pro Gly Leu Tyr His Tyr Cys
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1540 1545 1550
Val Leu Arg Gly Thr Asn Lys Ala Asp Ala Gly Lys Glu Leu Glu Thr
1555 1560 1565
Gln Lys Glu Val Val Val Ser Met Leu Leu Arg Leu Ile Gln Tyr His
1570 1575 1580
Gln Val Leu Glu Met Phe Ile Leu Val Leu Gln Gln Cys His Lys Glu
1585 1590 1595 1600
Asn Glu Asp Lys Trp Lys Arg Leu Ser Arg Gln Ile Ala Asp Ile Ile
1605 1610 1615
Leu Pro Met Leu Ala Lys Gln Gln Met His Ile Asp Ser His Glu Ala
1620 1625 1630
Leu Gly Val Leu Asn Thr Leu Phe Glu Ile Leu Ala Pro Ser Ser Leu
1635 1640 1645
Arg Pro Val Asp Met Leu Leu Arg Ser Met Phe Val Thr Pro Asn Thr
1650 1655 1660
Met Ala Ser Val Ser Thr Val Gln Leu Trp Ile Ser Gly Ile Leu Ala
1665 1670 1675 1680
Ile Leu Arg Val Leu Ile Ser Gln Ser Thr Glu Asp Ile Val Leu Ser
1685 1690 1695
Arg Ile Gln Glu Leu Ser Phe Ser Pro Tyr Leu Ile Ser Cys Thr Val
1700 1705 1710
Ile Asn Arg Leu Arg Asp Gly Asp Ser Thr Ser Thr Leu Glu Glu His
1715 1720 1725
Ser Glu Gly Lys Gln Ile Lys Asn Leu Pro Glu Glu Thr Phe Ser Arg
1730 1735 1740
Phe Leu Leu Gln Leu Val Gly Ile Leu Leu Glu Asp Ile Val Thr Lys
1745 1750 1755 1760
Gln Leu Lys Val Glu Met Ser Glu Gln Gln His Thr Phe Tyr Cys Gln
1765 1770 1775
Glu Leu Gly Thr Leu Leu Met Cys Leu Ile His Ile Phe Lys Ser Gly
1780 1785 1790
Met Phe Arg Arg Ile Thr Ala Ala Ala Thr Arg Leu Phe Arg Ser Asp
1795 1800 1805
Gly Cys Gly Gly Ser Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Leu Asn Leu Arg Ala
1810 1815 1820
Arg Ser Met Ile Thr Thr His Pro Ala Leu Val Leu Leu Trp Cys Gln
1825 1830 1835 1840
Ile Leu Leu Leu Val Asn His Thr Asp Tyr Arg Trp Trp Ala Glu Val
1845 1850 1855
Gln Gln Thr Pro Lys Arg His Ser Leu Ser Ser Thr Lys Leu Leu Ser
1860 1865 1870
Pro Gln Met Ser Gly Glu Glu Glu Asp Ser Asp Leu Ala Ala Lys Leu
1875 1880 1885
Gly Met Cys Asn Arg Glu Ile Val Arg Arg Gly Ala Leu Ile Leu Phe
1890 1895 1900
Cys Asp Tyr Val Cys Gln Asn Leu His Asp Ser Glu His Leu Thr Trp
1905 1910 1915 1920
Leu Ile Val Asn His Ile Gln Asp Leu Ile Ser Leu Ser His Glu Pro
1925 1930 1935
Pro Val Gln Asp Phe Ile Ser Ala Val His Arg Asn Ser Ala Ala Ser
1940 1945 1950
Gly Leu Phe Ile Gln Ala Ile Gln Ser Arg Cys Glu Asn Leu Ser Thr
1955 1960 1965
Pro Thr Met Leu Lys Lys Thr Leu Gln Cys Leu Glu Gly Ile His Leu
1970 1975 1980
Ser Gln Ser Gly Ala Val Leu Thr Leu Tyr Val Asp Arg Leu Leu Cys
1985 1990 1995 2000
Thr Pro Phe Arg Val Leu Ala Arg Met Val Asp Ile Leu Ala Cys Arg
2005 2010 2015
Arg Val Glu Met Leu Leu Ala Ala Asn Leu Gln Ser Ser Met Ala Gln
2020 2025 2030
Leu Pro Met Glu Glu Leu Asn Arg Ile Gln Glu Tyr Leu Gln Ser Ser
2035 2040 2045
Gly Leu Ala Gln Arg His Gln Arg Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Arg Phe
2050 2055 2060
Arg Leu Ser Thr Met Gln Asp Ser Leu Ser Pro Ser Pro Pro Val Ser
2065 2070 2075 2080
Ser His Pro Leu Asp Gly Asp Gly His Val Ser Leu Glu Thr Val Ser
2085 2090 2095
Pro Asp Lys Asp Trp Tyr Val His Leu Val Lys Ser Gln Cys Trp Thr
2100 2105 2110
Arg Ser Asp Ser Ala Leu Leu Glu Gly Ala Glu Leu Val Asn Arg Ile
2115 2120 2125
Pro Ala Glu Asp Met Asn Ala Phe Met Met Asn Ser Glu Phe Asn Leu
2130 2135 2140
Ser Leu Leu Ala Pro Cys Leu Ser Leu Gly Met Ser Glu Ile Ser Gly
2145 2150 2155 2160
Gly Gln Lys Ser Ala Leu Phe Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Leu Ala
2165 2170 2175
Arg Val Ser Gly Thr Val Gln Gln Leu Pro Ala Val His His Val Phe
2180 2185 2190
Gln Pro Glu Leu Pro Ala Glu Pro Ala Ala Tyr Trp Ser Lys Leu Asn
2195 2200 2205
Asp Leu Phe Gly Asp Ala Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Pro Thr Leu Ala
2210 2215 2220
Arg Ala Leu Ala Gln Tyr Leu Val Val Val Ser Lys Leu Pro Ser His
2225 2230 2235 2240
Leu His Leu Pro Pro Glu Lys Glu Lys Asp Ile Val Lys Phe Val Val
2245 2250 2255
Ala Thr Leu Glu Ala Leu Ser Trp His Leu Ile His Glu Gln Ile Pro
2260 2265 2270
Leu Ser Leu Asp Leu Gln Ala Gly Leu Asp Cys Cys Cys Leu Ala Leu
2275 2280 2285
Gln Leu Pro Gly Leu Trp Ser Val Val Ser Ser Thr Glu Phe Val Thr
2290 2295 2300
His Ala Cys Ser Leu Ile Tyr Cys Val His Phe Ile Leu Glu Ala Val
2305 2310 2315 2320
Ala Val Gln Pro Gly Glu Gln Leu Leu Ser Pro Glu Arg Arg Thr Asn
2325 2330 2335
Thr Pro Lys Ala Ile Ser Glu Glu Glu Glu Glu Val Asp Pro Asn Thr
2340 2345 2350
Gln Asn Pro Lys Tyr Ile Thr Ala Ala Cys Glu Met Val Ala Glu Met
2355 2360 2365
Val Glu Ser Leu Gln Ser Val Leu Ala Leu Gly His Lys Arg Asn Ser
2370 2375 2380
Gly Val Pro Ala Phe Leu Thr Pro Leu Leu Arg Asn Ile Ile Ile Ser
2385 2390 2395 2400
Leu Ala Arg Leu Pro Leu Val Asn Ser Tyr Thr Arg Val Pro Pro Leu
2405 2410 2415
Val Trp Lys Leu Gly Trp Ser Pro Lys Pro Gly Gly Asp Phe Gly Thr
2420 2425 2430
Ala Phe Pro Glu Ile Pro Val Glu Phe Leu Gln Glu Lys Glu Val Phe
2435 2440 2445
Lys Glu Phe Ile Tyr Arg Ile Asn Thr Leu Gly Trp Thr Ser Arg Thr
2450 2455 2460
Gln Phe Glu Glu Thr Trp Ala Thr Leu Leu Gly Val Leu Val Thr Gln
2465 2470 2475 2480
Pro Leu Val Met Glu Gln Glu Glu Ser Pro Pro Glu Glu Asp Thr Glu
2485 2490 2495
Arg Thr Gln Ile Asn Val Leu Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Leu Val
2500 2505 2510
Leu Ser Ala Met Thr Val Pro Val Ala Gly Asn Pro Ala Val Ser Cys
2515 2520 2525
Leu Glu Gln Gln Pro Arg Asn Lys Pro Leu Lys Ala Leu Asp Thr Arg
2530 2535 2540
Phe Gly Arg Lys Leu Ser Ile Ile Arg Gly Ile Val Glu Gln Glu Ile
2545 2550 2555 2560
Gln Ala Met Val Ser Lys Arg Glu Asn Ile Ala Thr His His Leu Tyr
2565 2570 2575
Gln Ala Trp Asp Pro Val Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Thr Gly Ala
2580 2585 2590
Leu Ile Ser His Glu Lys Leu Leu Leu Gln Ile Asn Pro Glu Arg Glu
2595 2600 2605
Leu Gly Ser Met Ser Tyr Lys Leu Gly Gln Val Ser Ile His Ser Val
2610 2615 2620
Trp Leu Gly Asn Ser Ile Thr Pro Leu Arg Glu Glu Glu Trp Asp Glu
2625 2630 2635 2640
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Asp Ala Pro Ala Pro Ser Ser Pro Pro Thr
2645 2650 2655
Ser Pro Val Asn Ser Arg Lys His Arg Ala Gly Val Asp Ile His Ser
2660 2665 2670
Cys Ser Gln Phe Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Trp Ile Leu Pro Ser
2675 2680 2685
Ser Ser Ala Arg Arg Thr Pro Ala Ile Leu Ile Ser Glu Val Val Arg
2690 2695 2700
Ser Leu Leu Val Val Ser Asp Leu Phe Thr Glu Arg Asn Gln Phe Glu
2705 2710 2715 2720
Leu Met Tyr Val Thr Leu Thr Glu Leu Arg Arg Val His Pro Ser Glu
2725 2730 2735
Asp Glu Ile Leu Ala Gln Tyr Leu Val Pro Ala Thr Cys Lys Ala Ala
2740 2745 2750
Ala Val Leu Gly Met Asp Lys Ala Val Ala Glu Pro Val Ser Arg Leu
2755 2760 2765
Leu Glu Ser Thr Leu Arg Ser Ser His Leu Pro Ser Arg Val Gly Ala
2770 2775 2780
Leu His Gly Val Leu Tyr Val Leu Glu Cys Asp Leu Leu Asp Asp Thr
2785 2790 2795 2800
Ala Lys Gln Leu Ile Pro Val Ile Ser Asp Tyr Leu Leu Ser Asn Leu
2805 2810 2815
Lys Gly Ile Ala His Cys Val Asn Ile His Ser Gln Gln His Val Leu
2820 2825 2830
Val Met Cys Ala Thr Ala Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Tyr Pro Leu Asp
2835 2840 2845
Val Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ser Ile Ile Gln Met Cys Gly Val Met
2850 2855 2860
Leu Ser Gly Ser Glu Glu Ser Thr Pro Ser Ile Ile Tyr His Cys Ala
2865 2870 2875 2880
Leu Arg Gly Leu Glu Arg Leu Leu Leu Ser Glu Gln Leu Ser Arg Leu
2885 2890 2895
Asp Ala Glu Ser Leu Val Lys Leu Ser Val Asp Arg Val Asn Val His
2900 2905 2910
Ser Pro His Arg Ala Met Ala Ala Leu Gly Leu Met Leu Thr Cys Met
2915 2920 2925
Tyr Thr Gly Lys Glu Lys Val Ser Pro Gly Arg Thr Ser Asp Pro Asn
2930 2935 2940
Pro Ala Ala Pro Asp Ser Glu Ser Val Ile Val Ala Met Glu Arg Val
2945 2950 2955 2960
Ser Val Leu Phe Asp Arg Ile Arg Lys Gly Phe Pro Cys Glu Ala Arg
2965 2970 2975
Val Val Ala Arg Ile Leu Pro Gln Phe Leu Asp Asp Phe Phe Pro Pro
2980 2985 2990
Gln Asp Ile Met Asn Lys Val Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Gln Gln
2995 3000 3005
Pro Tyr Pro Gln Phe Met Ala Thr Val Val Tyr Lys Val Phe Gln Thr
3010 3015 3020
Leu His Ser Thr Gly Gln Ser Ser Met Val Arg Asp Trp Val Met Leu
3025 3030 3035 3040
Ser Leu Ser Asn Phe Thr Gln Arg Ala Pro Val Ala Met Ala Thr Trp
3045 3050 3055
Ser Leu Ser Cys Phe Phe Val Ser Ala Ser Thr Ser Pro Trp Val Ala
3060 3065 3070
Ala Ile Leu Pro His Val Ile Ser Arg Met Gly Lys Leu Glu Gln Val
3075 3080 3085
Asp Val Asn Leu Phe Cys Leu Val Ala Thr Asp Phe Tyr Arg His Gln
3090 3095 3100
Ile Glu Glu Glu Leu Asp Arg Arg Ala Phe Gln Ser Val Leu Glu Val
3105 3110 3115 3120
Val Ala Ala Pro Gly Ser Pro Tyr His Arg Leu Leu Thr Cys Leu Arg
3125 3130 3135
Asn Val His Lys Val Thr Thr Cys
3140
<210> 3
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 4
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760

Claims (44)

1.一种淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其包含在近红外(NIR)下和/或使用磁共振成像(MRI)和/或计算机断层扫描(CT)可见的纳米颗粒，以及对于转铁蛋白受体和淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的至少一种抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或抗原结合片段包含IgG抗淀粉样蛋白生成肽抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或抗原结合片段特异性结合所述淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维，但不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块或肽单体。
4.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中用于产生针对所述淀粉样蛋白生成肽的所述至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：Aβ的氨基酸序列、或其变体或片段，优选部分聚集的SEQ ID No：1。
5.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中用于产生针对所述淀粉样蛋白生成肽的所述至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：亨廷顿蛋白的氨基酸序列、或其变体或片段，优选部分聚集的SEQ ID No：2。
6.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中用于产生针对所述淀粉样蛋白生成肽的所述至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：α-突触核蛋白的氨基酸序列、或其变体或片段，优选部分聚集的SEQ ID No：3。
7.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段对于所述淀粉样蛋白生成肽的解离常数值为大约10-5至10-13M、或10-6至10-9M、或10-10至10-12M。
8.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或抗原结合片段包含IgM抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。
9.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段对于所述转铁蛋白受体的解离常数值不小于1x10-4M或不小于1x10-3M。
10.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中用于产生针对所述转铁蛋白受体的所述至少一种抗体或抗原结合片段的免疫原序列包含下述或由下述组成：SEQ IDNo：4、或其变体或片段。
11.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述生物特异性试剂包含对于转铁蛋白受体具有免疫特异性的多种抗体或其抗原结合片段，以及对于淀粉样蛋白生成肽具有免疫特异性的多种抗体或其抗原结合片段。
12.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段包含单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述抗原结合片段选自：VH、VL、Fd、Fv、Fab、Fab′、scFv、F(ab′)2和Fc片段。
14.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于转铁蛋白受体免疫特异性的Fab′片段。
15.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽免疫特异性的Fab′片段。
16.根据权利要求15所述的生物特异性试剂，其中所述Fab′片段特异性结合淀粉样蛋白生成肽的寡聚物和原纤维，但不特异性结合淀粉样蛋白生成肽斑块或单体。
17.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段包含对于淀粉样蛋白生成肽和转铁蛋白受体免疫特异性的双特异性F(ab′)2片段。
18.根据权利要求17所述的生物特异性试剂，其中所述双特异性F(ab′)2片段包含显示出对于转铁蛋白受体的免疫特异性的第一Fab′片段，所述第一Fab′片段与显示出对于淀粉样蛋白生成肽的免疫特异性的第二Fab′片段缀合。
19.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述纳米颗粒包含在近红外下可见的内核，并且其中所述核包含镉或铅。
20.根据权利要求19所述的生物特异性试剂，其中所述核包含选自CdSe、CdTe、CdS、PbS和PbSe的材料。
21.根据权利要求20所述的生物特异性试剂，其中所述核包含CdSe。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的生物特异性试剂，其中所述纳米颗粒包含围绕所述核的镉或锌壳。
23.根据权利要求22所述的生物特异性试剂，其中所述壳包含ZnS或CdS。
24.根据权利要求23所述的生物特异性试剂，其中所述壳包含ZnS。
25.根据任何前述权利要求所述的生物特异性试剂，其中所述纳米颗粒包含使用MRI或CT可见的造影材料。
26.根据权利要求25所述的生物特异性试剂，其中所述造影材料包封所述壳。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的生物特异性试剂，其中所述造影材料包含钆、金、碘或硫酸硼。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的生物特异性试剂，其中所述造影材料包含1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(即DOTA)。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的生物特异性试剂，其中所述造影剂被配置为允许羧基官能化，通过所述羧基官能化，所述至少一种抗体或其抗原片段可与之缀合。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的生物特异性试剂，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段使用碳化二亚胺化学共价附着至所述造影剂。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的生物特异性试剂，其中多种抗体或其抗原结合片段以覆盖所述造影材料层的外表面的间隔阵列排列。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其用于诊断。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂作为NIR生物标记、MRI生物标记或作为CT生物标记的用途。
34.一种生物标记，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂。
35.一种NIR、MRI或CT成像方法，所述方法包括根据权利要求1-31中任一项所述的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂的使用。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的试剂、用途、生物标记或成像方法，其用于诊断选自下述的神经退行性病症：阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；亨廷顿氏病；运动神经元病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和额颞叶痴呆。
37.一种用于诊断患有神经退行性病症或其倾向的受试者、或者用于提供所述受试者的状况的预后的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-31中任一项所述的生物特异性试剂，所述生物特异性试剂配置为检测来自测试受试者的生物样品中存在的淀粉样蛋白生成肽的浓度，其中所述样品中肽的存在提示所述受试者患有神经退行性病症。
38.一种用于诊断患有神经退行性病症或其倾向的受试者、或者用于提供所述受试者的状况的预后的方法，所述方法包括检测得自受试者的生物样品中存在的淀粉样蛋白生成肽的浓度，其中所述检测使用根据权利要求1-31中任一项所述的生物特异性试剂来实现，并且其中所述样品中抗原的存在提示所述受试者患有神经退行性病症。
39.根据权利要求1-31中任一项所述的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其用于治疗。
40.根据权利要求1-31中任一项的淀粉样蛋白生成肽生物特异性试剂，其用于治疗、改善或预防神经退行性病症。
41.用于根据权利要求40所述使用的试剂，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；亨廷顿氏病；运动神经元病；脊髓小脑1型、2型和3型；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和额颞叶痴呆，并且优选为阿尔茨海默氏病。
42.用于根据权利要求41所述使用的试剂，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病或运动神经元病。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-31中任一项的生物特异性试剂；和任选的药学可接受的媒介物。
44.一种用于制备权利要求43所述的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-31中任一项的生物特异性试剂与药学可接受的媒介物组合。
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