JP6856611B2 - Ｃｄ８に対する抗原結合性構築物 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮出願第６１／７８０，２８６号の利益を請求し、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
（コンピュータプログラムリスト）
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願される。配列表は、２０１４年２月２８日に作成され、サイズが６８，２３０バイトであるＳｅｑＬｉｓｔＩＧＮＡＢ０１４ＷＯ．ｔｘｔという題名のファイルとして提供される。この配列表の電子フォーマット情報は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
本明細書に記載される実施形態は、一般的に、抗体（抗体フラグメントを含む）などのＣＤ８に結合する抗原結合性構築物（例えば、ミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ、ｓｃＦｖ）及びこれらを使用するための方法に関する。
ＣＤ８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８）は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞を含む）のサブクラスの特異的なマーカーである膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ８は、ＣＤ８αサブユニットとＣＤ８βサブユニットのヘテロダイマー、又はＣＤ８αホモダイマーとして会合する。会合したダイマーＣＤ８複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に補助受容体として作用し、ＭＨＣクラスＩ細胞による抗原提示を認識する。ＣＤ８は、Ｔ細胞の発達及び成熟Ｔ細胞の活性化に対して作用する。Ｔ細胞局在性の変化は、免疫応答の進行を反映する場合があり、長期間にわたって起こる場合がある。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、配列番号３又は６中のＨＣＤＲ１配列のＨＣＤＲ１（「重鎖相補性決定領域１」）；配列番号３又は６中のＨＣＤＲ２配列のＨＣＤＲ２（「重鎖相補性決定領域２」）；配列番号３又は６中のＨＣＤＲ３配列のＨＣＤＲ３（「重鎖相補性決定領域３」）；配列番号９中のＬＣＤＲ１配列のＬＣＤＲ１（「軽鎖相補性決定領域１」）；配列番号９中のＬＣＤＲ２配列のＬＣＤＲ２（「軽鎖相補性決定領域２」）；及び配列番号９中のＬＣＤＲ３配列のＬＣＤＲ３（「軽鎖相補性決定領域３」））を含む、抗体（抗体フラグメントを含む）などの抗原結合性構築物に関する。ある実施形態では、抗原結合性構築物はＣＤ８に特異的に結合する。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるような検出可能なマーカーを含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるような治療薬を含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、ＣＤ８に結合するヒト化ｃｙｓ−ダイアボディに関する。ヒト化ｃｙｓ−ダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端までに、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続した可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、Ｃ末端システインとを含むポリペプチドを含んでいてもよい。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、ＣＤ８に結合するヒト化ミニボディに関する。ヒト化ミニボディは、Ｎ末端からＣ末端までで、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続した可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２ヒンジ領域を含むヒンジ伸長ドメインと、ヒトＩｇＧ ＣＨ３配列とを含むポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施形態では、ヒンジ伸長ドメインは、ネイティブＩｇＧ２ヒンジ配列、例えば、配列番号５５のＩｇＧ２ヒンジ配列を含むヒンジ配列を含む。ある実施形態では、ヒンジ伸長ドメインは、人工ＩｇＧ２ヒンジ配列、例えば、配列番号７９のヒンジ伸長配列を含むヒンジ伸長配列を含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物（例えば、ＣＤ８抗体又は抗体フラグメント）をコードする核酸に関する。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物（例えば、ＣＤ８抗体又は抗体フラグメント）を産生する細胞株に関する。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、キットに関する。キットは、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物（例えば、ＣＤ８抗原結合性フラグメント）を含んでいてもよい。ある実施形態では、キットは、検出可能なマーカーを含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、ＣＤ８の有無を検出する方法に関する。この方法は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物（例えば、ＣＤ８抗原結合性構築物）をサンプルに適用することを含んでいてもよい。この方法は、ＣＤ８に対する抗原結合性構築物の結合の有無を検出することを含んでいてもよい。ある実施形態では、この方法はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。ある実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。ある実施形態では、この方法の一部がｉｎ ｖｉｖｏで行われ、この方法の一部がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、治療薬をＣＤ８を標的とする治療薬とする方法に関する。この方法は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物（例えば、ＣＤ８抗体又は抗体フラグメント）を対象に投与することを含んでいてもよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、治療薬に結合している。
ＣＤ８に対する二価の結合を有するミニボディの模式のいくつかの実施形態を示す。 ミニボディの模式のいくつかの実施形態を示す。 ＣＤ８αの一例を表す。 ヒト抗体及びヒト化ＶＨ領域（ｈｕＯＫＴ８構築物）に対するマウスＯＫＴ８可変重鎖（ＶＨ）領域のアラインメントのいくつかの実施形態を示す。ＣＤＲ領域（Ｃｈｏｔｈｉａ）のいくつかの実施形態は、四角で囲まれた領域で示される。 ヒト化ＶＬ領域及びｈｕＯＫＴ８構築物に対するマウスＯＫＴ８可変軽鎖（ＶＬ）領域のアラインメントのいくつかの実施形態を示す。ＣＤＲ領域（Ｃｈｏｔｈｉａ）のいくつかの実施形態は、四角で囲まれた領域で示される。 抗原に対して２価の結合を示すｃｙｓ−ダイアボディの模式のいくつかの実施形態を示す。 抗原に対して２価の結合を示すｃｙｓ−ダイアボディの模式を示す。 キメラＯＫＴ８ミニボディＶＬ−ＶＨ配列のいくつかの実施形態を示す。 キメラＯＫＴ８ミニボディＶＨ−ＶＬ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ミニボディＶＬ−ＶＨ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ミニボディＶＨ−ＶＬ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディＶＬ−５−ＶＨ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディＶＨ−５−ＶＬ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディＶＬ−８−ＶＨ配列のいくつかの実施形態を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディＶＨ−８−ＶＬ配列のいくつかの実施形態を示す。 ｃｙｓ−ダイアボディの配列のいくつかの実施形態を示す。 ミニボディの配列のいくつかの実施形態を示す。 ＶＬの配列のいくつかの実施形態を示す。 ｈｕＶＬの配列のいくつかの実施形態を示す。 ＶＨの配列のいくつかの実施形態を示す。 ｈｕＶＨの配列のいくつかの実施形態を示す（バージョン１からのバージョン「ａ」）。 ｈｕＶＨの配列のいくつかの実施形態を示す（バージョン１からのバージョン「ｂ」）。 ｈｕＶＨの配列のいくつかの実施形態を示す（バージョン２からのバージョン「ｃ」）。 ｈｕＶＨの配列のいくつかの実施形態を示す（バージョン２からのバージョン「ｃ」）。 ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）バージョンＡ、Ｂ、Ｃのベクターマップのいくつかの実施形態を示す。 標的の有無を検出する方法のいくつかの実施形態を示す。 キメラヒト化ＯＫＴ８ミニボディのウェスタンブロット分析を示す。 ＥＬＩＳＡによる、精製されたｒｈＣＤ８に対するＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体の結合を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ヒト化ＯＫＴ８ミニボディのウェスタンブロットのゲルの描写である。 ヒト化ＯＫＴ８ミニボディのウェスタンブロットのゲルの描写である。 ＥＬＩＳＡによるＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８発現分析を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによる、ｒｈＣＤ８に対するＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ａ及びＢの結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによる、ｒｈＣＤ８に対するＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ｃ及びＤの結合を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ａ及びＢのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ａ及びＢのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ｃ及びＤのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体Ｃ及びＤのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂａ＿ＣＤ８改変体のウェスタンブロット分析の画像を示す。 ＥＬＩＳＡによる、ｒｈＣＤ８に対するＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂａ＿ＣＤ８改変体の結合を示すグラフである。 ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂａ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析を示す。 ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂａ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析を示す。 ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂａ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＯＫＴ８構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８構築物及びＩＡｂ Ｍ２ｂ ＣＤ８構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８構築物及びＩＡｂ Ｍ２ｂ ＣＤ８構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８構築物及びＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８−Ｄｆ構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８構築物及びＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８−Ｄｆ構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８構築物、ＩＡｂ＿Ｍ１ｂＣＤ８ ＩｇＧ２ ＥＨ構築物及びＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８ ＩｇＧ２ ＮＨ構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ＿ＣｙｓＤｂ３ｂ＿ＣＤ８構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態のＩＡｂ＿ＣｙｓＤｂ３ｂ＿ＣＤ８構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態ＩＡｂ＿ＣｙｓＤｂ３ｂ＿ＣＤ８構築物及びＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ＿ＣＤ８−Ｄｆ構築物のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 本明細書のいくつかの実施形態の８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ＿ＣＤ８構築物で標識されたマウスの一連のＰＥＴ画像である。 本明細書のいくつかの実施形態の８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８構築物で標識されたマウスの一連の冠状ＭＩＰ ＰＥＴ／ＣＴ重ね合わせ画像である。 本明細書のいくつかの実施形態の８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８構築物で標識された切除した腫瘍の標識を示す画像と共に表を並べたものである。 本明細書のいくつかの実施形態の６４Ｃｕ−ＮＯＤＡＧＡ−ＩＡｂ＿Ｍ１Ｂ＿ＣＤ８ ＩｇＧ２ ＥＨ（Ｃｙｓ）構築物で標識されたマウスの一連のＭＩＰ画像である。
標的分子ＣＤ８に結合する抗原結合性構築物（抗体及びそのフラグメントを含む、例えば、ｃｙｓ−ダイアボディ及びミニボディ）が本明細書に記載される。このような抗原結合性構築物は、標的分子（ＣＤ８及び／又はＣＤ８＋細胞、例えば、特定の種類のＴ細胞）の存在、局在性及び／又は量を検出するのに有用となりうる。このような抗原結合性構築物は、治療薬を標的分子を発現する細胞を標的とする治療薬とするのに有用となりうる。ある実施形態では、抗原結合性構築物（抗体、及びｃｙｓ−ダイアボディ及び／又はミニボディなどの構築物を含む）を用い、標的分子（又は「標的」）の有無を検出するための方法が提供される。ある実施形態では、治療目的のために抗原結合性構築物を用いるための方法が提供される。
（定義及び種々の実施形態）
ある状態を「処置する」又は「処置」とは、状態を予防すること、状態の開始及び／又は進行速度を遅らせること、状態の進行のリスクを下げること、状態に関連する症状の進行を予防すること、及び／又は遅らせること、状態に関連する症状を低減すること、又は終わらせること、状態の完全な退縮又は部分的な退縮を生じさせること、又はこれらのいくつかの組み合わせを指してもよい。「予防する」という用語は、障害又は疾患が完全になくなることを必要としない。
「治療に有効な量」又は「治療に有効な投薬量」は、対象において望ましい治療効果を生じる、例えば、標的となる状態を予防し、処置し、障害及び／又は症状の開始を遅らせ、及び／又は状態に関連する症状を緩和する量である。この量は、限定されないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学及びバイオアベイラビリティを含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、全身状態、所定の投与量に対する応答、及び薬物治療の種類）、配合物中の医薬的に許容される１つ以上の担体の性質、及び／又は投与経路を含め、種々の因子に基づいて変動する。臨床分野及び薬理学の分野の当業者は、本開示に従って、例えば、化合物の投与に対する対象の応答をモニタリングし、投薬量を調節することによって、通常の実験によって治療に有効な量を決定することができる。さらなる手引きのために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１．ｓｕｐ．ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， ２００５を参照のこと。
用語「抗原結合性構築物」は、その結合フラグメントを含め、あらゆる多様な抗体を含む。さらに、１個、２個、３個、４個、５個、及び／又は６個のＣＤＲを含む構築物が含まれる。ある実施形態では、これらのＣＤＲが、従来の抗体の適切なフレームワーク領域の間に分布していてもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の中に含まれていてもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、重鎖及び／又は軽鎖の内部にあってもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、一本鎖ペプチド鎖の内部にあってもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、共有結合した２以上のペプチドの中にあってもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、ジスルフィド結合によって共有結合していてもよい。ある実施形態では、ＣＤＲは、連結分子又は部分を介して連結していてもよい。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質は非共有性、例えば、ダイアボディ及び一価ｓｃＦｖである。本明細書で特に示されていない限り、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、示されている標的分子に結合する。「標的」又は「標的分子」は、ＣＤ８タンパク質を示す。ＣＤ８タンパク質の例は、当該技術分野で公知であり、例えば、配列番号２４のＣＤ８タンパク質（図１Ｃ）が挙げられる。
用語「抗体」には、限定されないが、遺伝子操作された、又は他の方法で改変された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント及びヘテロ結合抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなど）が含まれる。用語「抗体」は、ｃｙｓ−ダイアボディ及びミニボディを含む。従って、「抗体」に関して本明細書で提供されるそれぞれの実施形態及びすべての実施形態は、他の部分で明確に示されていない限り、ｃｙｓ−ダイアボディ及び／又はミニボディの実施形態としても想定されている。用語「抗体」は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、又は、非共有結合的に、可逆的に、特異的な様式で対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを含む。例示的な抗体の構造単位として、テトラマーが挙げられる。ある実施形態では、全長抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、それぞれの対は、ジスルフィド結合によって接続した１つの「軽」鎖と１つの「重」鎖を有するものであってよい。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμの定常領域遺伝子、及び多種の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長鎖の場合、軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。全長鎖の場合、重鎖は、γ、μ、α、δ又はεのいずれかに分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの免疫グロブリン分類を規定する。それぞれの鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖のこれらの領域を指す。本明細書で使用される場合、「抗体」は、抗体及びそのフラグメントのすべての変形を包含する。従って、同じ結合特異性を有する全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びこれらのフラグメントのマルチマー態様（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）は、この概念の範囲内にある。ある実施形態では、抗体は、所望の標的に特異的に結合する。
「相補性決定ドメイン」又は「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、相互に置き換え可能に、ＶＬ及びＶＨの超可変領域を指す。ＣＤＲは、このような標的タンパク質への特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。ある実施形態では、それぞれのＶＬ及び／又はＶＨにおいて３種類のＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から順次番号を付ける）が存在し、可変ドメインの約１５〜２０％を構成する。ＣＤＲは、構造的に標的タンパク質のエピトープと相補的であり、従って、直接的に結合特異性に関与する。ＶＬ又はＶＨの残りの伸長部（いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ））では、アミノ酸配列の変形は少ない（Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４ｔｈ ｅｄ．、Ｃｈａｐｔｅｒ ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００）。
当該技術分野でよく知られた種々の定義を用い、ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置を決定することができる。例えば、Kabat (Wu, T. T., E. A. Kabat. 1970. An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132: 211-250; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91−3242, Bethesda, MD)、Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)), ImMunoGeneTics database (IMGT) (imgt.org/のワールドワイドウェブで) Giudicelli, V., Duroux, P., Ginestoux, C., Folch, G., Jabado-Michaloud, J., Chaume, D. and Lefranc, M.-P. IMGT/LIGM-DB, the IMGT（商標）comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006), PMID: 16381979; Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). PMID: 12477501; Brochet, X., Lefranc, M.-P. and Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis Nucl. Acids Res, 36, W503-508 (2008); AbM (Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); the contact definition (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)), and/or the automatic modeling and analysis tool Honegger A, Pluckthun A. (bioc dot uzh dot ch/antibody/Numbering/index dot htmlのワールドワイドウェブで)。
用語「結合特異性決定因子」又は「ＢＳＤ」は、相互に置き換え可能に、抗体の結合特異性を決定するのに必要な相補性決定領域内の最低限の連続した又は連続していないアミノ酸配列を指す。最低限の結合特異性決定因子は、１つまたは２つ以上のＣＤＲ配列の中にあってもよい。ある実施形態では、最低限の結合特異性決定因子は、抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３配列の一部又は全長の中にある（すなわち、これらにのみによって決定される）。ある実施形態では、抗原結合性構築物の特異性のためには重鎖可変領域のＣＤＲ３だけで十分である。
「抗体可変軽鎖」又は「抗体可変重鎖」は、本明細書で使用される場合、それぞれ、ＶＬ又はＶＨを含むポリペプチドを指す。内因性ＶＬは、遺伝子セグメントＶ（可変）及びＪ（結合部）によってコードされ、内因性ＶＨは、Ｖ、Ｄ（多様性）及びＪによってコードされる。それぞれのＶＬ又はＶＨは、ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含む。本出願では、抗体可変軽鎖及び／又は抗体可変重鎖は、時々、まとめて「抗体鎖」と呼ばれてもよい。これらの用語は、当業者なら容易に理解するように、ＶＬ又はＶＨの基本構造を破壊しない突然変異を含む抗体鎖を包含する。ある実施形態では、全長重鎖及び／又は軽鎖が想定される。ある実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖の可変領域のみが存在するものが想定される。
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼで消化して作製される複数のフラグメントとして存在していてもよい。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化し、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）であるＦ（ａｂ）’２（Ｆａｂ’のダイマー）を生じる。Ｆ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元し、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊して、これによりＦ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換してもよい。Ｆａｂ’モノマーは、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｄ ｅｄ．（１９９３））。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化という観点で定義されているが、このようなフラグメントを化学的方法によっても組み換えＤＮＡ方法によってもｄｅ ｎｏｖｏ合成しうることを当業者は理解するだろう。従って、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、全抗体を改変して作られる抗体フラグメント、組み換えＤＮＡ方法を用いてｄｅ ｎｏｖｏ合成した抗体フラグメント（一本鎖Ｆｖなど）、又はファージディスプレイライブラリを用いて特定される抗体フラグメントをも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照）。
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を調製するために、当該技術分野で公知の任意の技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975); Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983); Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、pp.77-96.Alan R.Liss,Inc.1985; Advances in the production of human monoclonal antibodies Shixia Wang,Antibody Technology Journal 2011:11-4; J Cell Biochem.2005 Oct 1;96(2):305-13;Recombinant polyclonal antibodies for cancer therapy; Sharon J,Liebman MA,Williams BR; 及びDrug Discov Today.2006 Jul,11(13-14):655-60,Recombinant polyclonal antibodies:the next generation of antibody therapeutics?,Haurum JS）。一本鎖抗体を産生するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体の産生に応用することができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の生物、例えば、他の哺乳動物を使用し、完全ヒトモノクローナル抗体を発現してもよい。又は、ファージディスプレイ技術を使用し、選択された抗原に対し、高親和性のバインダーを特定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、前出；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３、（１９９２））。
非ヒト抗体をヒト化するか、又は霊長類化するための方法は、当該技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト由来源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くは、インポート残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれ、典型的には、インポート可変ドメインから得られる。ある実施形態では、「ドナー」配列及び「アクセプター」配列という用語を使用することができる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒらの方法に従って、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって、行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。従って、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）残基及び場合によりいくつかのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が、げっ歯類の抗体の類似部位からの残基で置換されたヒト抗体である。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）を、異なる又は改変された種類、エフェクター機能及び／又は種の定常領域に接続させるために、又はキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子及び薬物）に接続させるために、定常領域又はその一部が改変、置換、又は交換されたか、又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる又は改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、又は交換された抗体分子である。
抗体としては、さらに、他のタンパク質に化学的に結合し、又は他のタンパク質との融合タンパク質として発現する１つ又は２つ以上の免疫グロブリン鎖が含まれる。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、一価ｓｃＦｖ構築物であってもよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、二重特異性構築物であってもよい。二重特異性又は二官能抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と、２つの異なる結合部位とを含む人工ハイブリッド抗体である。本発明の他の抗原結合フラグメント又は抗体部分は、二価のｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、単一の結合ドメイン（ｓｄＡｂ又はナノボディ）及びミニボディを含む。
用語「抗体フラグメント」としては、限定されないが、抗体単独の１つ又は２つ以上の抗原結合フラグメント、又は、限定されないが、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧ（還元したＩｇＧ）、ｓｃＦｖフラグメント（一価、三価など）、一本鎖ドメインフラグメント（ナノボディ）、ペプチボディ、ミニボディ、ダイアボディ及びｃｙｓ−ダイアボディを含む他の分子と組み合わせた抗体の１つ又は２つ以上の抗原結合フラグメントが挙げられる。「ｓｃＦｖ」という用語は、従来の二本鎖抗体の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインが接続して一本の鎖を生成する、一本鎖Ｆｖ（「フラグメント可変」）抗体を指す。
医薬的に許容される担体は、組織、臓器又は身体の一部から、別の組織、臓器又は身体の一部へと目的の化合物を運ぶか、又は輸送することに関連する、医薬的に許容される材料、組成物又は媒体であってよい。例えば、担体は、液体又は固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、又はカプセル化材料、又はこれらのいくつかの組み合わせであってよい。担体のそれぞれの要素は、配合物の他の成分と適合性があるという点で、「医薬的に許容される」ものである。この担体は、遭遇し得る任意の組織、臓器又は身体の一部との接触に適している必要がある。つまり、治療の利益を過剰に超えるような毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、又は任意の他の合併症のリスクがあってはならない。本明細書に記載される医薬組成物は、任意の適切な投与経路で投与してよい。投与経路は、当該技術分野で公知の任意の投与経路を指してもよく、限定されないが、エアロゾル、経腸、経鼻、眼内、経口、非経口、直腸、経皮（例えば、局所用クリーム又は軟膏、パッチ剤）、又は膣内を含む。「経皮」投与は、局所用クリーム又は軟膏を用いて、又は経皮パッチによって行ってもよい。「非経口」は、一般的に、注射に関連する投与経路を指し、眼窩下、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、髄腔内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、胸骨内、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、又は経気管を含む。ある実施形態では、介入又は切除中に、抗原結合性構築物を手術中に局所投与で送達することができる。
用語「ＣＤ８依存性障害」は、免疫学的要素（癌免疫療法に対する応答を含む）が存在する癌、自己免疫疾患、炎症性疾患及び癌、（限定されないが、肺癌、卵巣癌、結腸直腸のメラノーマなどを含む。
ミニボディは、抗体に対する二価結合特性を維持しつつ、全長抗体よりも小さな分子量を有する抗体の形式である。ミニボディは、サイズが小さいため、系から迅速に排出され、腫瘍組織を標的とする場合には浸透性が高い。ミニボディは強い標的化能力及び迅速な排出能を有するため、長期間循環系に保持されることが患者の投薬や薬量測定に悪影響となる、画像診断や細胞傷害性／放射性の薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の送達にとって有利である。
「特異的に（又は選択的に）結合する」という句は、抗原（例えば、タンパク質）と抗体又は抗体由来の結合物質との相互作用を記述する文脈において、タンパク質や他の生物学的物質の不均一な集合中（例えば血液、血清、血漿、組織サンプルなどの生物学的サンプル中）において、抗原の存在を決定する結合反応を指す。従って、所定の免疫アッセイ条件で、ある実施形態では、特定の結合特異性を有する抗体又は結合物質が、特定の抗原とは少なくともバックグラウンドの２倍結合するが、サンプル中に存在する他の抗原に顕著な量では実質的に結合しない。このような条件で抗体又は結合物質へ特異的に結合するためには、抗体や結合物質が特定のタンパク質に特異性を有することにより選択された必要があることがある。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために、種々のイムノアッセイの形式を使用してよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的な免疫反応性を有する抗体を選択するために日常的に用いられる（特異的免疫反応性の決定に使用できるイムノアッセイの形式や条件の説明として、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）等を参照）。典型的には、特異的又は選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍のシグナルを生成し、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０倍〜１００倍のシグナルを生成する。
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」は、解離速度定数（ｋｄ、ｔｉｍｅ−１）を会合速度定数（ｋａ、ｔｉｍｅ−１、Ｍ−１）で割ったものを指す。平衡解離定数は、当該技術分野で任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は、一般的に、平衡解離定数が約１０−７未満又は１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍ未満、ある実施形態では、約１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、又は１０−１３Ｍ未満である。
用語「単離された」は、核酸又はタンパク質に対して使用するとき、核酸又はタンパク質が、天然状態で関係している他の細胞要素を本質的に含まないことを示す。ある実施形態では、乾燥していても水溶液であってもよい。純度及び均質性は、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて決定することができる。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」とは、核酸又はタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて、本質的に１つのバンドを生じることを示す。ある実施形態では、核酸又はタンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する分子に対して、純度が少なくとも８５％、さらに好ましくは、純度が少なくとも９５％、最も好ましくは、純度が少なくとも９９％であることを示してもよい。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、オキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及び一本鎖又は二本鎖の形態でのこれらのポリマーを指す。具体的に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と似た結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列に加え、保存的に改変されたその改変体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１つ又は２つ以上の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されて生成されてもよい。（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で、相互に置き換え可能に、アミノ酸残基のポリマーを指すために用いられる。この用語は、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が天然に存在する対応アミノ酸の人工化学疑似物質であるアミノ酸ポリマー、天然に存在するアミノ酸ポリマー、及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と似た様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸疑似物質を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、及びその後改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、Ｒ基に結合するα炭素）を有するものを指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は改変されたペプチドの骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸疑似物質は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に似た様式で機能する化合物を指す。
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変された改変体とは、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、すべて、アラニンアミノ酸をコードする。従って、アラニンがコドンで特定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなく、コドンが上述の任意の対応コドンに変えられてもよい。このような核酸の変異は、「サイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も表している。核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを当業者は理解するだろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異が、それぞれの記載された配列に暗示されている。
アミノ酸配列については、コードされる配列において１個のアミノ酸又は割合の少ない一部のアミノ酸を改変、付加、又は欠失させるような、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個別の置換、欠失又は付加が、その改変によって化学的に類似したアミノ酸に置換されることとなる「保存的に改変された改変体」であることを当業者は理解するだろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的な置換の表は、当該技術分野で周知である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種内ホモログ又は対立遺伝子に加えて含まれるものであり、本発明の多型改変体、種内ホモログ又は対立遺伝子が除外されるものではない。
以下の８種類の基は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
「配列同一性の割合」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウで比較することによって決定することができ、この比較ウィンドウでのポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較したとき、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。参照配列は、２つの配列の最適なアラインメントのためには、付加又は欠失を含まない。この割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列で起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を比較ウィンドウの位置の合計数で割り算し、その結果に１００を掛け算して百分率を得ることによって計算される。
「同一な」という用語又は「同一性」の割合は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する文脈において、同じ配列である２つ以上の配列又は部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて又はマニュアルでのアラインメントと視覚観察によって測定された、比較ウィンドウ全体中又は指定された領域全体中で、一致度が最大となるように比較及びアラインメントした場合に、２つの配列が同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定の割合含む場合（例えば、特定の範囲にわたって、又は特定されない場合、参照配列の配列全体にわたって７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性）、２つの配列は「実質的に同一」である。本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書に例示されるそれぞれのポリペプチド又はポリヌクレオチドと実質的に同一のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを提供する（例えば、図２Ａ、２Ｂ、又は４〜１１、１２Ｃ〜１２Ｉのいずれかに例示される可変領域；図２Ａ、２Ｂ、又は１２Ｃ〜１２Ｉのいずれかに例示されるＣＤＲ；図２Ａ、２Ｂ、又は１２Ｃ〜１２Ｉのいずれかに例示されるＦＲ；及び図１２Ａ〜１２Ｉ又は４〜１１のいずれかに例示される核酸配列）。場合により、少なくとも約１５、２５又は５０ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは、１００〜５００又は１０００以上のヌクレオチド長の領域にわたって、又は参照配列の全長にわたって同一性が存在する。アミノ酸配列について、少なくとも５、１０、１５又は２０アミノ酸長、場合により、少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５又は１００アミノ酸長、場合により、少なくとも約１５０、２００又は２５０アミノ酸長の領域にわたって、又は参照配列の全長にわたって、同一性又は実質的な同一性が存在する場合がある。より短いアミノ酸配列について（例えば、２０以下のアミノ酸を含むアミノ酸配列）、ある実施形態では、本明細書に定義する保存的な置換に従って、１個又は２個のアミノ酸残基が保存的に置換されている場合、実質的な同一性が存在する。
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、この配列に対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には、部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対するテスト配列の配列同一性の割合を計算する。
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、通常は、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、２つの配列を最適にアラインメントした後、配列を、同じ連続位置数の参照配列と比較してもよい。比較のために配列をアラインメントする方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又はマニュアルでのアラインメント又は視覚観察（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）等によって、比較のための最適な配列アラインメントを行うことができる。
配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例として、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムがあり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公に利用可能である。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに、ある正の値の閾値スコアＴに合致するかこれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）。これらの初期の隣接ワードヒットは、これらのワードを含むもっと長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための元となる。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（合致する残基のペアについてのリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）及びパラメータＮ（合致しない残基についてのペナルティースコア（ｐｅｎａｌｔｙ ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを使用する。各方向へのワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その達成された最大値からＸ量落ちた場合、１又は２以上の負のスコアが付いた残基のアラインメントの蓄積によって、累積スコアが０以下になった場合、又は、いずれかの配列の最後に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定付ける。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、予想値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３及び予想値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５）、アラインメント（Ｂ）５０、予想値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、両鎖の比較をデフォルトとして使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性について統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の測定値の１つは、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸の配列の合致が偶然起こる確率の指標を与える。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるとき、参照配列と類似していると考える。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるとの指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチド対する抗体と免疫学的に交差反応性を有することである。従って、ある実施形態では、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、この２つのペプチドは、保存的な置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子又はその相補部分が、ストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅させることができることである。
用語「対象」、「患者」及び「個人」は、相互に置き換え可能に、試験及び／又は処置される実体を指す。これらには、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類の哺乳動物が挙げられる。哺乳動物は、実験用哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであってもよい。ある実施形態では、哺乳動物は、農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）又は家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）であってもよい。
用語「治療的に許容される量」又は「治療に有効な投薬量」は、相互に置き換え可能に、望ましい結果を与えるのに十分な量を指す。ある実施形態では、治療的に許容される量は、望ましくない副作用を誘発したり、その原因とならない。治療的に許容される量は、まず低投薬量で投与し、次いで、望ましい効果が達成されるまで投薬量を徐々に上げることによって決定することができる。
用語「併用投与」は、個人の血液中、又は試験されるサンプルにおいて、２つの活性薬剤を投与することを指す。併用投与される活性薬剤は、同時に送達されても逐次送達されてもよい。
（抗原結合性構築物（抗体及び結合フラグメントを含む））
標的に結合する抗原結合性構築物が、本明細書に記載される。抗原結合性構築物は、標的分子に特異的に結合するか、又は標的分子と免疫学的に反応性である、免疫グロブリン又は免疫グロブリンに関連する分子の１つ以上の部分を含む分子である。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、免疫系の画像診断法のために、Ｔ細胞のサブセットの表面に見出される特異的なバイオマーカーであるヒトＣＤ８を検出することができる。ＣＤ８の撮像は、Ｔ細胞の局在性をｉｎ ｖｉｖｏで検出することができる。Ｔ細胞局在性の変化は、免疫応答の進行を反映することがあり、種々の治療的な処置や疾患の状態の結果として、経時的に起こることがある。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、免疫療法のためにＴ細胞局在性を撮像するのに有用である。養子免疫療法は、患者自体のＴ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで操作され、患者に再導入される治療の一形態である。この処置の形態について、Ｔ細胞の撮像は、処置の状態を決定するのに有用である。
それに加え、ＣＤ８は、ウイルス病原体を除去し、腫瘍に対する免疫を与えるように機能する細胞溶解性Ｔ細胞の活性化にとって重要な、下流のシグナル伝達経路を活性化することに何らかの役割を果たす。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣＩタンパク質内に存在する短いペプチドを認識することができる。ある実施形態では、ＣＤ８を指向する操作されたフラグメントは、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達を増強し、対象がウイルス病原体を除去し、腫瘍抗原に応答する能力を高めることができる。従って、ある実施形態では、本明細書で提供される抗原結合性構築物は、アゴニストであってもよく、ＣＤ８標的を活性化することができる。ある実施形態では、アゴニストｓｃＦｖ、ミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ、及び／又は抗体が提供される。ある実施形態では、アゴニスト抗原結合性構築物は、本明細書で提供されるＣＤＲ、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のうち１つ以上を含む。ある実施形態では、アゴニストは、ウイルス病原体を除去し、腫瘍に対する免疫を与えるように機能する細胞溶解性Ｔ細胞の活性化のため、ＣＤ８を介して下流のシグナル伝達経路を活性化することができる。
ある状況では、全長抗体の血清での半減期が長く、典型的に投与後に１週間を超える撮像時間を計画する必要があるため、撮像のために全長抗体を用いることは最適ではない。
免疫細胞のサブタイプを撮像するための別の標的系の手法として、低分子が挙げられる。例えば、内因性免疫系の画像診断法の１つの手法として、細胞の代謝経路の変化を検出する低分子トレーサー、例えば、１８Ｆ−フルオロアセテート（［１８Ｆ］ＦＡＣ）の使用が挙げられる。このようなトレーサーは、代謝経路の変化を検出するため、主にＴ細胞を含む代謝活性が増加した細胞集合を標的とする。この手法の制限は、Ｔ細胞の活性化されたサブセットしか検出されないことであり、一方、抗ＣＤ８抗体フラグメントを用いた撮像は、この標的が活性化ＣＤ８細胞及び非活性化（ｒｅｓｔｉｎｇ）ＣＤ８細胞の両方で発現しているため、ＣＤ８を発現するＴ細胞の全集合を検出する。
ＯＫＴ８抗体の可変領域は、タンパク質の操作によって、種々の代替的な抗原結合構築物に再配列された。ミニボディの形式は、各モノマーが、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに接続した一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むホモダイマーである（図１Ａ及び１Ｂを参照）。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖（ＶＬ）ドメインで構成され、１８アミノ酸のＧｌｙＳｅｒを豊富に含むリンカーによって接続される。ある実施形態では、ｓｃＦｖを、ヒトＩｇＧ１の上側領域及びコアヒンジ領域（１５残基）、次いで１０アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーによって、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに連結している。ミニボディ（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）は、ＣＨ３ドメイン間の会合と、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の生成に起因して、安定なダイマーとして存在する。ミニボディを分泌させるために、可変重鎖ドメインのＮ末端にシグナル配列が融合される。ある実施形態では、ＧｌｙＳｅｒ残基によって柔軟性をもたせることができる。ある実施形態では、グルタミン残基及び／又はリジン残基を加えて溶解度を高めることができる。
可変領域の向きが異なる（ＶＨからＶＬ、及びＶＬからＶＨ）キメラＯＫＴ８ミニボディの２つの改変体を遺伝子的に作製した。それぞれの抗体のＶドメインは、内部ジスルフィド結合を生成する２つのシステインを含む。マウスＯＫＴ８のＶＨは、フレームワーク３（ＦＲ３）の中に余分のシステインを含み、これにより凝集がおこり、その結果小胞体（ＥＲ）中に保持されるため、タンパク質の発現が妨害されることがある。このフレームワーク中、余分のシステインをセリンで置き換えたキメラミニボディが作製された（マウスＶＨのＣ８４Ｓ）。ある実施形態では、本明細書で提供される任意の実施形態は、Ｃ８４Ｓの調整を含むように調整することができる。表０．１、０．２及び０．３に、本明細書に記載される種々の抗原結合性構築物のアレンジメントの実施形態をまとめる。
Figure 0006856611
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表０．１、０．２及び０３に示されるのは、ミニボディ（表０．１及び０．２）及びｃｙｓ−ダイアボディ（表０．３）に使用することができるモノマーの配列のアレンジメントである。表のそれぞれの列は、モノマー構築物の配列を表し、左から右に、Ｎ末端からＣ末端を表す。ある実施形態では、それぞれのモノマー構築物について示されている配列は、互いに直接的に接続している。従って、ある実施形態では、構築物は、表０．１、表０．２又は表０．３の１つの列の任意の構築物を含むものでよい。ある実施形態では、構築物は、表０．１、表０．２、又は表０．３の任意の組み合わせを含むものでもよい。ある実施形態では、例えば、第１列第２欄にある最初の項目を、第１列第３欄と、さらに第１列第４欄と、さらに第１列第５欄と、さらに第１列第６欄と組み合わせてもよい。ある実施形態では、第３欄と第６欄を交換してもよい。ある実施形態では、第１列第２欄にある最初の項目を、第１列第３欄と、さらに第２列第４欄と、さらに第２列第５欄と、さらに第２列第６欄と組み合わせてもよい。従って、これらの表は、単一の列内にあるもの及び種々の列にわたるもの（及び欄を交換したもの）のすべての可能な組み合わせを表す。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＣＤＲ１の重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＣＤＲ２の重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＣＤＲ３の重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；配列番号９又は４２中のＬＣＤＲ１の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；配列番号９又は４２中のＬＣＤＲ２の軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；及び／又は配列番号９又は４２中のＬＣＤＲ３の軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４８中のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１、配列番号４８中のＨＣＤＲ２のＨＣＤＲ２、配列番号４８中のＨＣＤＲ３のＨＣＤＲ３は、配列番号４２中のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１、配列番号４２中のＬＣＤＲ２のＬＣＤＲ２、及び配列番号４２中のＬＣＤＲ３のＬＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個の上記のＣＤＲを含む（ＣＤＲのいくつかの実施形態は、図２Ａ、２Ｂ、１２Ｃ〜１２Ｉに示されている）。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ＨＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、標的分子に特異的に結合する。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、本明細書に提供されるＣＤＲを有する１つ以上の抗体と、結合について競合する。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、本明細書に示される少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、重鎖ＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、さらに、本明細書に提供される重鎖ＣＤＲ２配列のいずれか１つを含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ヒトであるか、又はヒト化されている。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含むか、又は、ヒトフレームワーク領域と少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有するフレームワーク領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＦＲ１の重鎖ＦＲ１（ＨＦＲ１）；配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＦＲ２の重鎖ＦＲ２（ＨＦＲ２）；配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＦＲ３の重鎖ＦＲ３（ＨＦＲ３）；配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２中のＨＦＲ４の重鎖ＦＲ４（ＨＦＲ４）；配列番号９又は４２中のＬＦＲ１の軽鎖ＦＲ１（ＬＦＲ１）；配列番号９又は４２中のＬＦＲ２の軽鎖ＦＲ２（ＬＦＲ２）；配列番号９又は４２中のＬＦＲ３の軽鎖ＦＲ３（ＬＦＲ３）；及び配列番号９又は４２中のＬＦＲ４の軽鎖ＦＲ４（ＬＦＲ４）を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４８中のＨＦＲ１の重鎖ＦＲ１（ＨＦＲ１）；配列番号４８中のＨＦＲ２の重鎖ＦＲ２（ＨＦＲ２）；配列番号４８中のＨＦＲ３の重鎖ＦＲ３（ＨＦＲ３）；配列番号４８中のＨＦＲ４の重鎖ＦＲ４（ＨＦＲ４）；配列番号４２中のＬＦＲ１の軽鎖ＦＲ１（ＬＦＲ１）；配列番号４２中のＬＦＲ２の軽鎖ＦＲ２（ＬＦＲ２）；配列番号４２中のＬＦＲ３の軽鎖ＦＲ３（ＬＦＲ３）；及び配列番号４２中のＬＦＲ４の軽鎖ＦＲ４（ＬＦＲ４）を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個の列挙されたＦＲを含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、検出可能なマーカーを含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、治療薬を含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、二価である。二価の抗原結合性構築物は、少なくとも第１の抗原結合ドメイン、例えば、第１のｓｃＦｖと、少なくとも第２の抗原結合ドメイン、例えば、第２のｓｃＦｖとを含んでいてもよい。ある実施形態では、二価の抗原結合性構築物は、少なくとも２つのモノマー、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８モノマーを含み、それぞれが抗原結合ドメインを有するマルチマーである。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ミニボディである。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ダイアボディであり、例えば、ｃｙｓ−ダイアボディを含む。ｓｃＦｖ、及び／又はミニボディ及び／又はｃｙｓ−ダイアボディは、本明細書に提供される実施形態のいずれかのＣＤＲ及び重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含んでいてもよい（例えば、図２Ａ、２Ｂ及び１２Ｃ〜１２Ｉに表されるＣＤＲ配列）。ある実施形態では、抗原結合性構築物は一価ｓｃＦｖである。ある実施形態では、図２Ａ、図１２Ｅ〜１２Ｉ、又は配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１；図２Ａ、図１２Ｅ〜１２Ｉ、又は配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２のＨＣＤＲ２のＨＣＤＲ２；図２Ａ、図１２Ｅ〜１２Ｉ、又は配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２のＨＣＤＲ３のＨＣＤＲ３；図２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、配列番号９又は４２のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１；図２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、配列番号９又は４２のＬＣＤＲ２のＬＣＤＲ２、及び図２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、配列番号９又は４２のＬＣＤＲ３のＬＣＤＲ３を含む一価ｓｃＦｖが提供される。ある実施形態では、配列番号４８のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１、配列番号４８のＨＣＤＲ２のＨＣＤＲ２、配列番号４８のＨＣＤＲ３のＨＣＤＲ３、配列番号４２のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１、配列番号４２のＬＣＤＲ２のＬＣＤＲ２、及び配列番号４２のＬＣＤＲ３のＬＣＤＲ３を含む一価ｓｃＦｖが提供される。ある実施形態では、ＣＤＲは、図１２Ｄに示されるように、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定義される。
ある実施形態では、一価ｓｃＦｖは、図２Ａ、図４〜１１、図１２Ｃ〜１２Ｉ、又は配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２の重鎖可変領域の重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、一価ｓｃＦｖは、図２Ｂ、４〜１１、１２Ｃ、１２Ｄ、配列番号９、４２、又は４０の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、一価ｓｃＦｖは、図２Ａ、図４〜１１、図１２Ｃ〜１２Ｉ、又は配列番号３、６、４４、４６、４８、５０、又は５２の重鎖可変領域の重鎖可変領域と、図２Ｂ、４〜１１、１２Ｃ、１２Ｄ、配列番号９、４２、又は４０の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域とを含む。ある実施形態では、一価ｓｃＦｖは、配列番号４８の重鎖可変領域の重鎖可変領域と、配列番号４２の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域とを含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、二重特異性を有する。二重特異性抗体は、少なくとも第１の結合ドメイン（例えば、第１のエピトープに特異的に結合するｓｃＦｖ）と、少なくとも第２の結合ドメイン（例えば、第２のエピトープに特異的に結合するｓｃＦｖ）とを含んでいてもよい。従って、二重特異性抗原結合性構築物は、２つ以上のエピトープに結合することができる。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じ抗原の一部であり、従って、二重特異性抗原結合性構築物は、同じ抗原の２つのエピトープに結合することができる。ある実施形態では、第１のエピトープは、第１の抗原の一部であり、第２のエピトープは、第２の抗原の一部であり、従って、二重特異性抗原結合性構築物は、２つの異なる抗原に結合することができる。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、２つのエピトープに同時に結合する。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号３、６、１６、１８、２０、２２、４４、４６、４８、５０、又は５２中の重鎖可変領域の重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号３に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号６に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４４に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４６に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４８に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号５０に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号５２に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号９、１６、１８、２０、２２、４０、又は４２を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号９に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４０に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４２に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ヒト抗原結合性構築物であり、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は少なくとも上述の重鎖及び／又は軽鎖可変配列と少なくとも同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、配列番号４８に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４２に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、標的分子との結合について本明細書に提供される１つ以上の抗原結合性構築物と競合する抗原結合性構築物を含む。ある実施形態では、競合する抗原結合性構築物は、標的分子上の、参照抗原結合性構築物が結合するものと同じエピトープに結合する。ある実施形態では、参照抗原結合性構築物は、標的分子の第１のエピトープに結合し、競合する抗原結合性構築物は、標的分子の第２のエピトープに結合するが、例えば、参照抗原結合性構築物の結合を立体的に遮断することによって、又は標的分子のコンフォメーション変化を誘発することによって、標的分子に対する参照抗原結合性構築物の結合を妨害する。ある実施形態では、第１のエピトープは、第２のエピトープと重なり合う。ある実施形態では、表０．１及び／又は０．２の第３欄と第５欄を交換することができる。ある実施形態では、本明細書で提供される任意の重鎖可変領域を本明細書の任意の軽鎖可変領域と組み合わせて、ｓｃＦｖ、ミニボディ、及び／又はダイアボディとすることができる。ある実施形態では、表０．１、０．２及び０．３の任意の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域（第３欄及び第５欄）を、互いに交換し、又は別の軽鎖可変領域若しくは重鎖可変領域と交換し、抗原結合性構築物（例えば、ｓｃＦｖ、ｃｙｓ−ダイアボディ、ミニボディ又は抗体）を作製することができる。
ある実施形態では、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディの形式は、親抗体の高い結合と特異性を維持しつつ、画像診断法及び特定の治療用途にとって有利な薬物動態的特徴を有する。全長親抗体を用いた撮像と比較すると、迅速な高コントラスト撮像において、これらのフラグメントは、抗原を標的化することができ、系から迅速に除去される点で、より望ましい薬物動態を有する。ある実施形態では、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディの血清中の半減期が短いため、ミニボディを注射してから約８〜４８時間、ｃｙｓ−ダイアボディを注射してから２〜２４時間の範囲で撮像を行うことができる。迅速な血清からの除去及び良好な組織への浸透によって、１日で撮像を行うことができ、患者のケアマネジメントの点で臨床上の顕著な利点がある。
それに加え、ｃｙｓ−ダイアボディ抗体の形式は、Ｃ−末端システインテールを特徴とする。（穏和に還元された）これらの２つのスルフヒドリル基によって、機能的部分（例えば、ｃｙｓ−ダイアボディの結合活性を妨害しなくてよい放射線標識）が部位特異的に結合する方法が得られる。
（標的分子に結合するダイアボディ）
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ダイアボディであってもよい。ダイアボディは、第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖（ＶＨ）可変ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖を含んでいてもよい。ある実施形態では、軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、リンカーで接続していてもよい。第１のポリペプチド鎖の２つのドメイン間のペアリングの可能性を下げるためにリンカーは適切な長さを有していてもよく、第２のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上に、顕著なペアリングをするには短すぎるリンカーによって連結されている重鎖可変ドメインＶＨに接続した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むものであってもよい。
ある実施形態では、適切な長さのリンカーは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の相補的なドメイン間の鎖ペアリングを促進し、２つの機能的抗原結合部位を含むダイマー分子の集合を促進することができる。従って、ある実施形態では、ダイアボディは、二価である。ある実施形態では、ダイアボディは、システインが接続したダイアボディ（Ｃｙｓ−Ｄｂ）であってもよい。２つの抗原部位に対するＣｙｓ−Ｄｂの結合の模式図を図３Ａ及び３Ｂに示す。
ある実施形態では、リンカーは、ペプチドであってもよい。ある実施形態では、リンカーは、例えば、会合を促進する任意の適切な長さであってよく、例えば、１〜２０アミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長であってもよい。本明細書でさらに記載されるように、ある種のｃｙｓ−ダイアボディは、５〜８アミノ酸長のペプチドリンカーを含んでいてもよい。ある実施形態では、リンカーは、アミノ酸から作られている必要はなく、又はアミノ酸のみから作られている必要はなく、例えば、改変されたアミノ酸を含んでいてもよい（例えば、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｙ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ Ａｍｉｎｏ Ｇｒｏｕｐｓ、 Ｒｏｓｓｅｌｌａ Ｇａｌａｔｉ、Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ Ｖｅｒｄｉｎａ、Ｇｉｕｌｉａｎａ Ｆａｌａｓｃａ及びＡｌｂｅｒｔｏ Ｃｈｅｒｓｉ、（２００３）Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、５８ｃ、５５８−５６１を参照）。ある実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸長であってもよい。ある実施形態では、リンカーは、２〜３０Å長、例えば、２．５〜２７Åであってもよい。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、ヒト化ｃｙｓ−ダイアボディを含む。ヒト化ｃｙｓ−ダイアボディは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続した可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、Ｃ末端システインとを含んでよい。ある実施形態では、ヒト化ｃｙｓ−ダイアボディは、ホモダイマーである。ある実施形態では、ヒト化ダイアボディは、ヘテロダイマーである。ある実施形態では、個々のモノマーのそれぞれがシステイン末端残基を有する。
ある実施形態では、ヒト化ｃｙｓ−ダイアボディのｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ方向又はＶＬ−ＶＨ方向を有する。本明細書で使用される場合、ＶＨ−ＶＬ（本明細書では「ＶＨＶＬ」とも呼ばれることがある）方向は、ｓｃＦｖの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）より上流にあることを意味し、ＶＬＶＨ方向は、ｓｃＦｖのＶＬドメインは、ＶＨドメインより上流にあることを意味する。本明細書で使用される場合、「上流」は、アミノ酸のＮ末端に向かう方、又はヌクレオチド配列の５’末端に向かう方を意味する。
複数の抗体可変領域が本明細書に記載されるリンカーで共に接続していてもよい。ある実施形態では、リンカーは、本明細書に記載されるＧｌｙＳｅｒリンカーである。
ある実施形態では、ｃｙｓ−ダイアボディは、検出可能なマーカーを含む。
ある実施形態では、ｃｙｓ−ダイアボディは、モノマー対を含む。それぞれのモノマーは、ポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、同一である（例えば、ｃｙｓ−ダイアボディは、ホモダイマーであってもよい）。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、異なっている（例えば、ｃｙｓ−ダイアボディは、ヘテロダイマーであってもよい）。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１２を含む（図８を参照）。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１２（ｃｙｓ−ダイアボディ（ＶＬ−５−ＶＨ））に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１３を含む（図９を参照）。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１３（ｃｙｓ−ダイアボディ（ＶＨ−５−ＶＬ））に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１４（ＶＬ−８−ＶＨ）を含む（図１０を参照）。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１５（ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディ（ＶＨ−８−ＶＬ））を含む（図１１を参照）。ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、表０．３に示されるような任意の部分の組み合わせを含み、表０．３に示されるモノマーに対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含むモノマーのポリペプチドを含む。
ある実施形態では、システインが互いに架橋されている。ある実施形態では、システインが還元されており、これらテールを形成するシステインは互いにジスルフィド結合を生成しない。ある実施形態では、１つ又は２つ以上の「テールを形成する」システインは、１つ又は２つ以上の検出可能なマーカー（例えば、蛍光プローブ）と共有結合を生成する。
当業者に理解されるように、本開示は、一般的に「ｃｙｓ−ダイアボディ」に言及するが、同じ又は類似の結果を得るために代わりのアレンジメントを使用してもよい。ある実施形態では、１つ又は２つ以上のシステインの代わりに、任意の共有結合により修飾可能な部分を使用してもよい。例えば、これは、ＧｌｙＳｅｒリンカー、ＧｌｙＬｅｕリンカー、及び／又は短いタグの後の挿入システインを含み得る。ある実施形態では、コイルドコイル又はロイシンジッパーによって接続を形成することができる。ある実施形態では、「テール」自体は、ジスルフィド結合自体の代わりに、それぞれのポリペプチド末端の望ましい残基及び／又は位置に選択的に結合することができるように、その末端に官能基を含み得る。ある実施形態では、２つのポリペプチド鎖の間に空間を与えるテールではなく、共有結合によって修飾可能な部分を、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドに直接接続し、その２つの共有結合によって修飾可能な部分をリンカーで接続することができる。
ある実施形態では、標的分子に結合するキメラｃｙｓ−ダイアボディが提供される。ある実施形態では、キメラｃｙｓ−ダイアボディは、ＶＬ−ＶＨの形式中にモノマーを含み、配列番号１２又は１４の配列、又は、これらに対し少なくとも約８０％の同一性、例えば、これらに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、キメラｃｙｓ−ダイアボディは、モノマーＶＨ−ＶＬの形式中にモノマーを含み、配列番号１３又は１５の配列、又はこれらに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、例えば、これらに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、本明細書に提供される任意の構築物（ｃｙｓ−ダイアボディの実施形態に示されるようなアレンジメントを含む）が、ｓｃＦｖの実施形態として提供されてもよい。このような実施形態では、構築物は、テールにシステインを含んでもよいが、単に架橋していない。他の実施形態では、構築物は、あるテールにシステインを含んでいなくてもよく、テールに全くシステインを含んでいなくてもよい。
（リンカー及び／又はテールの選択肢）
ある実施形態では、個々の抗体において、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、異なる様式で会合してもよい。そのため、異なる長さのリンカーを使用することで、コンフォメーションが柔軟となり、ジスルフィド結合の生成を確保する移動範囲が可能となる。
ある実施形態では、２つのリンカー長は、約１〜５０アミノ酸、例えば、２〜１５アミノ酸、２〜１４、３〜１３、４〜１０、又は５〜８アミノ酸のうちのいずれか（境界値を含む）の長さであってもよい。ある実施形態では、ダイアボディ対の中のそれぞれのリンカーは、同じ長さであってよい。ある実施形態では、この対のそれぞれのリンカーは、異なる長さであってよい。ある実施形態では、望ましい組み合わせを可能にし、及び／又は促進する限り、任意のリンカー長さの組み合わせの対を使用することができる。ある実施形態では、改変されたアミノ酸を使用することができる。
図８〜１１は、４種類のＣｙｓ−Ｄｂ改変体ＶＨ−５−ＶＬ、ＶＨ−８−ＶＬ、ＶＬ−５−ＶＨ及びＶＬ８ＶＨを提供する（図８〜１１及び表０．３を参照）。４種類の改変体すべてを作製し、発現及び結合を試験することにより、それぞれの新たなＣｙｓ−Ｄｂのタンパク質産生の望ましい形式を特定することができる。一連の改変体を評価することは、ジスルフィド架橋が形成可能な高品質かつ安定なタンパク質が産生されるのを確認することに役立ち得る。従って、Ｃｙｓ−Ｄｂの作製においては、ミニボディと同様に、１つではなく、２つの異なるリンカー長を用いてもよく、可変領域のＶＨ−ＶＬ及びＶＬ−ＶＨの両方向を用いてもよい。
ある実施形態では、リンカーは、ＧｌｙＳｅｒリンカーである。ＧｌｙＳｅｒリンカーは、Ｇｌｙ残基及び／又はＳｅｒ残基を豊富に含むポリペプチドであってよい。ある実施形態では、ＧｌｙＳｅｒリンカーのアミノ酸残基の少なくとも約４０％が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙとＳｅｒの組み合わせであり、例えば、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙとＳｅｒの組み合わせである。ある実施形態では、ＧｌｙＳｅｒリンカーは、少なくとも約２アミノ酸長であり、例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、又は４０アミノ酸長である。ある実施形態では、リンカーは、配列番号２８、３０、及び／又は３６の少なくとも１つを含む。
ある実施形態では、ダイアボディのＣ末端にシステインが付加されている。このシステインによって、ダイアボディ複合体は、システイン共有結合を生成することができ、放射性標識などの機能性部分の部位特異的な結合に硫黄残基を利用する選択肢が与えられる。ある実施形態では、抗体自体の末端がシステインを含むように改変される。ある実施形態では、テール配列、例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）がＣ末端に加えられる。ある実施形態では、システインテール配列によって、ｃｙｓ−ダイアボディの２つのモノマーが、互いにジスルフィド結合を生成することができる。ある実施形態では、システインテール配列によって、ｃｙｓ−ダイアボディが、検出可能な部分（例えば、検出可能なマーカー）及び／又は治療薬とジスルフィド結合を生成することができる。システインテールのスルフヒドリル基は、望ましい機能性部分（例えば、検出可能なマーカー及び／又は治療薬）の部位特異的な結合の前に穏和な還元を受けてもよい。ある実施形態では、テールは、少なくとも約１アミノ酸長、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、又は４０アミノ酸長である。ある実施形態では、テールは、少なくとも１つの配列番号３２を含む。ある実施形態では、テールは、３〜８アミノ酸長である。ある実施形態では、テールは、コイルドコイル及び／又はロイシンジッパーであってもよく、及び／又はこれらを含んでいてもよい。上述のように、ある実施形態では、システインは、Ｃ末端に位置している。しかし、システインが最後のＣ末端アミノ酸に位置していることは必要ではない。その代わりに、システインが、タンパク質のＣ末端に位置する任意の残基の一部であってもよいことを示す。
ある実施形態では、２つのＣ末端間の連結の選択肢は、直接的及び／又は間接的な架橋のためのシステインによって達成することができる。
（標的分子に結合するミニボディ）
「ミニボディ」は、本明細書で使用される場合、ホモダイマーを含み、それぞれのモノマーは、リンカー（例えば、ヒンジ配列）によってヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに接続した一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、ヒンジ配列は、図１２Ｂの配列番号５３〜６０に示されるようなヒトＩｇＧ１ヒンジ配列又はヒトＩｇＧ２ヒンジ配列である。ある実施形態では、ＣＨ３配列は、図１２Ｂの配列番号３７〜３８及び８０〜８１に示されるようなＩｇＧ１ ＣＨ３配列又はＩｇＧ２ ＣＨ３配列を含む。
ある実施形態では、ヒンジ配列は、人工ヒンジ配列である。ある実施形態では、ヒンジ配列は、４種類の任意の１つ以上に由来するＩｇＧヒンジであってもよい。人工ヒンジ配列は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２ヒンジ及びＧｌｙＳｅｒリンカー（Ｖｈ配列とＶｌ領域とを接続する総称的なリンカー配列からこの部分を区別するとき、「伸長」としても知られる）配列の一部を含んでいてもよい。
ある実施形態では、人工ヒンジ配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジの最初の約１４残基又は１５残基に続いて伸長配列を含む。ある実施形態では、伸長は、本明細書で提供されるいずれであってもよい。ある実施形態では、伸長は、６、７、８、９又は１０アミノ酸長のＧｌｙＳｅｒ伸長配列であってもよい。ある実施形態では、人工ヒンジ配列は、ＩｇＧ１ヒンジの最初の約１５残基に続いて約１０アミノ酸長のＧｌｙＳｅｒ伸長配列を含む。ある実施形態では、ＣＨ３ドメイン間の会合によって、ミニボディは安定なダイマーとして存在する。
ある実施形態では、ヒンジ配列は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列を含む。ある実施形態では、ヒンジ配列は、ＩｇＧ２ヒンジ配列を含む。ある実施形態では、ヒンジ配列は、ネイティブｈＩｇＧ２ＩｇＧ２配列（「ＮＨ」）を含む。本明細書の実施形態と組み合わせて使用可能な例示的なネイティブヒンジ配列を図１２Ｂの配列番号５５に示す。ある実施形態では、本明細書に提供されるいずれか及びすべての構築物を、ｈＩｇＧ２ヒンジ領域と共に使用することができる。
ある実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号５５のネイティブヒトＩｇＧ２配列を含む。ある実施形態では、ヒンジ配列は、人工ＩｇＧ２ヒンジ配列を含む。ある実施形態では、ネイティブＩｇＧ２配列は、人工ヒンジ伸長（ＥＨ）配列を含む。ある実施形態では、人工ヒンジ伸長配列は、配列番号７９を含む。ある実施形態では、人工ヒンジ配列は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列の最初の約１２〜１５残基に続いて、例えば、１２残基に続いて、６、７、８、９、１０、１１、又は１２アミノ酸長のＧｌｙＳｅｒ伸長配列を含む。本明細書の実施形態と組み合わせて使用可能な例示的な人工ヒンジ配列を図１２Ｂの配列番号７９に示す。ある実施形態では、上述の任意のヒンジ領域の選択肢（例えば、表０．１又は０．２）をミニボディに使用することができる。ある実施形態では、表０．１又は０．２に示される任意のヒンジ領域を、ＩｇＧ２ヒンジ領域と置き換えることができる。ある実施形態では、表０．１又は０．２の任意の構築物、及び／又は図に示される任意の構築物において、そのヒンジ領域をｈＩｇＧ２又はＩｇＧ２からのヒンジ領域の一部又はすべてに置き換えたものとしてもよい。
ある実施形態では、ミニボディｓｃＦｖ配列は、本明細書に記載されるダイアボディ配列と類似する及び／又は同じである、ＣＤＲ及び／又はＦＲ及び／又は可変領域配列を含む（例えば、図２Ａ、２Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２Ｃ〜１２Ｉ及び表０．１及び０．２に記載されるもの）。ある実施形態では、ミニボディｓｃＦｖは、本明細書に記載されるｃｙｓ−ダイアボディのｓｃＦｖと同一の配列（ＣＤＲ、ＣＤＲｓ、全セットの６ＣＤＲＳ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域など）を含む。
ある実施形態では、ミニボディは、配列番号３、６、９、１６、１８、２０、２２、３４、３６、３８、５３〜６０、４０、４２、４４、４６、４８、５０及び５２の配列、及び／又は表０．１及び／又は０．２のアレンジメントの配列に対して少なくとも約８０％の同一性がある配列、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を有する。
ある実施形態では、ミニボディは、配列番号３、６、９、１６、１８、２０、２２、４０、４２、４４、４６、４８、５０及び５２の配列に対して少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する可変鎖領域を有する。
ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ方向を有していてもＶＬ−ＶＨ方向を有していてもよい。ある実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、アミノ酸リンカー配列によって互いに接続される。アミノ酸リンカーは、本明細書に記載されるようなリンカーであってよい。ある実施形態では、リンカーは、ＧｌｙＳｅｒを豊富に含み、約１５〜２０アミノ酸長である。別の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙＳｅｒを豊富に含み、１８アミノ酸長である。ある実施形態では、リンカー長は、約１〜５０アミノ酸、例えば、２〜３０アミノ酸、３〜２０、４〜１５、又は５〜８アミノ酸の範囲（境界値を含む）の様々な長さである。ある実施形態では、ミニボディｓｃＦｖは、本明細書に記載されるｃｙｓ−ダイアボディのｓｃＦｖに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を有し、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を有する。ｓｃＦｖは、ＶＨＶＬ方向を有していてもよく、ＶＬＶＨ方向を有していてもよい。
ある実施形態では、ミニボディのそれぞれのモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の要素を含む。（ａ）ＶＬドメインに接続するＶＨドメインを含み、標的分子に結合する、ｓｃＦｖ配列、（ｂ）ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を含むヒンジ伸長ドメイン、及び（ｃ）ヒトＩｇＧ ＣＨ３配列。ある実施形態では、ミニボディのそれぞれのモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の要素を含む。（ａ）ＶＬドメインに接続したＶＨドメインを含み、標的分子に結合する、ｓｃＦｖ配列、（ｂ）本明細書に記載されるＩｇＧ２ヒンジ領域を含む、ヒンジ伸長ドメイン、及び（ｃ）ヒトＩｇＧ ＣＨ３配列。ある実施形態では、ミニボディのそれぞれのモノマーは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ３を含む。ある実施形態では、ミニボディのそれぞれのモノマーは、ＩｇＡ又はＩｇＤのＣＨ３ドメイン、及び／又はＩｇＭ及び／又はＩｇＥのＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。ある実施形態では、ミニボディは、核酸によってコードされ、本明細書に記載される細胞、細胞株又は他の適切な発現系によって発現することができる。従って、細胞又は細胞株で発現するとき、シグナル配列をｓｃＦｖのＮ末端に融合させ、ミニボディを分泌することができる。
ある実施形態では、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ及び／又は抗体は、図２Ａ及び／又は２Ｂに示され、アステリスクを付けて示されるヒト化配列の１つ以上の残基を含む。ある実施形態では、図２Ａ又は２Ｂでアステリスクが付けられた１つ以上の残基が存在する一方、残りの配列が変更されたものでもよい。例えば、配列は、配列の残りの部分に対して８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又はより高い同一性を有していてよい。ある実施形態では、ヒト及び／又はヒト化抗原結合性構築物は、図２Ａにアステリスクが付けられた１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、又は４７の残基を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、図２Ａで下線が引かれた１つ以上の残基を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、図２Ａに、下線が引かれていない１つ以上の残基を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、図２Ａに下線が引かれていない１つ以上の残基と、四角で囲まれたＣＤＲ部分とを含み、一方、他の残基は変動する。ある実施形態では、抗原結合性構築物。
これに代えて、及び／又はそれに加え、抗原結合性構築物は、図２Ａ又は２Ｂにおける１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアステリスクが付けられた残基を含んでいてもよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、図２Ａ又は２Ｂに１つ以上の下線が引かれていない残基を含む。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、図２Ａ又は２Ｂに下線が引かれていない１つ以上の残基と、四角で囲まれたＣＤＲ部分とを含み、一方、他の残基は変動しうるものである。ある実施形態では、ＣＤＲ残基が維持され、アステリスクが付いた残基が維持されるが、１つ以上の他の残基は変動しうるものである。
ある実施形態では、標的分子に結合するキメラミニボディが提供される。ある実施形態では、キメラミニボディは、ＶＬ−ＶＨの形式のモノマーを含み、配列番号１６又は２０の配列、又はこれらに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、例えば、これらに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、キメラミニボディは、ＶＨ−ＶＬの形式のモノマーを含み、配列番号１８又は２２の配列、又はこれらに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、例えば、これらに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、モノマーのポリペプチドは、表０．１及び０．２に示されるような組み合わせた任意の部分を含み、表０．１及び０．２に示されるようなモノマーに対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含むモノマーのポリペプチドを含む。
（核酸）
ある実施形態では、抗原結合性構築物のポリペプチドは、核酸によってコードされ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで発現されてもよく、又は、これらのペプチドは、化学的に合成されてもよい。従って、ある実施形態では、抗原結合性構築物をコードする核酸が提供される。ある実施形態では、核酸は、ｃｙｓ−ダイアボディ又はミニボディの一部又はモノマーをコードする。ある実施形態では、核酸は、２つ以上のモノマー、例えば、少なくとも２つのモノマーをコードする。複数のモノマーをコードする核酸は、少なくとも２つのモノマーの間に核酸切断部位を含んでいてもよく、２つ以上のモノマーの間に転写開始部位又は翻訳開始部位をコードしていてもよく、及び／又は２つ以上のモノマーの間にタンパク質分解の標的部位をコードしていてもよい。
ある実施形態では、発現ベクターは、本明細書に開示するような抗原結合性構築物をコードする核酸を含む。ある実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物の発現のためのｐｃＤＮＡ３．１ＴＭ／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）バージョンＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、又はその改変体（図１３を参照）を含む。ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターは、哺乳動物の発現のためのＣＭＶプロモーター、哺乳動物の選択マーカー（ネオマイシン）、及び細菌の選択マーカー（アンピシリン）を有するという特徴がある（図１０を参照）。ある実施形態では、発現ベクターは、プラスミドを含む。ある実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター又はアデノウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コスミド、ＹＡＣ又はＢＡＣを含む。
ある実施形態では、ミニボディモノマーの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、１９、２１、２３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、又はこれらに対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い同一性を有する配列の少なくとも１つを含む。
ある実施形態では、ｃｙｓ−ダイアボディモノマーの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７７、７８、１０、１１、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、又はこれらに対して少なくとも約８０％の同一性、例えば、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い同一性を有する配列を含む。
（細胞株）
ある実施形態では、本明細書に記載される抗原結合性構築物の少なくとも１つを発現する細胞株が提供される。ある実施形態では、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）は、本明細書に記載されるようなミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ又は他の抗体を産生する発現系である。ある実施形態では、本明細書に記載されるようなミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ及び他の抗体又は抗体フラグメントはグリコシル化されず、このような翻訳後の改変を必要としないため、哺乳動物の発現系は必要ではない。従って、ある実施形態では、限定されないが、哺乳動物の発現系（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、細菌発現系（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母発現系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は任意の他の既知の発現系を含め、１又は２以上の多種多様な哺乳動物又は非哺乳動物の発現系を使用し、本明細書に開示される抗原結合性構築物（例えば、抗−ＣＤ８ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディ）を産生する。他の系としては、昆虫細胞及び／又は植物細胞を挙げることができる。
（抗原結合性構築物の改変）
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、少なくとも１つの改変を含む。例示的な改変としては、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、及び細胞リガンド又は他のタンパク質への連結によって改変された抗原結合性構築物が挙げられる。任意の多数の化学修飾を、限定されないが、特定の化学開裂、アセチル化、ホルミル化及びツニカマイシンの代謝合成を含め、既知の技術によって行ってもよい。ある実施形態では、誘導体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
ある実施形態では、抗原結合性構築物を別の物質に結合し、抗標的結合体を生成する。本明細書に記載される結合体は、抗原結合性構築物と、脂質、炭水化物、タンパク質又は他の原子及び分子とを連結する既知の方法によって調製することができる。ある実施形態では、結合体は、適切な連結又は結合によって、部位特異的な結合によって作られる。部位特異的な結合は、抗原結合性構築物の結合活性を保存する可能性がより高い。この物質は、ジスルフィド結合生成によって、還元した抗原結合性構築物のヒンジ領域に結合又は接続してもよい。例えば、ｓｃＦｖフラグメントのＣ末端へのシステイン残基の導入（例えば、本明細書に記載されるｃｙｓ−ダイアボディへ導入することができるもの）によって、多種多様な薬剤に対する抗原結合部位から離れた部位で、部位特異的なチオール反応性カップリングが可能となる。結合体を作成するために用いられる他の連結又は結合としては、限定されないが、共有結合、非共有結合、スルフィド結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジン結合、エステル結合、アミド結合及びアミノ結合、イミノ結合、チオセミカルバゾン結合、エミカルバゾン（ｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ）結合、オキシム結合及び炭素−炭素結合が挙げられるだろう。
（検出可能なマーカー）
ある実施形態では、改変された抗原結合性構築物は、検出可能なマーカーに結合する。本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」は、標的分子、細胞、組織、臓器などの位置及び／又は量を診断し、検出し、又は視覚化するのに有用な原子、分子、又は化合物を含む。本明細書の実施形態に従って使用可能な検出可能なマーカーとしては、限定されないが、放射性物質（例えば、放射性同位体、放射性核種、放射性標識又は放射性トレーサー）、染料、コントラスト剤、蛍光化合物又は分子、生体発光化合物又は分子、酵素及び増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。それに加え、ある種のナノ粒子、例えば、量子ドット及び金属ナノ粒子（以下に記載される）は、検出剤として使用するのに適している場合がある。ある実施形態では、検出可能なマーカーは、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）である。
本明細書の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な例示的な放射性物質としては、限定されないが、１８Ｆ、１８Ｆ−ＦＡＣ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｃ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５８Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ及び２２５Ａｃが挙げられる。検出可能なマーカーとして使用可能な例示的な常磁性イオン物質としては、限定されないが、遷移金属及びランタニド金属（例えば、原子番号が６〜９、２１〜２９、４２、４３、４４、又は５７〜７１の金属）のイオンが挙げられる。これらの金属としては、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕのイオンが挙げられる。
検出可能なマーカーが放射性金属又は常磁性イオンである場合、ある実施形態では、マーカーを、これらのイオンと結合するための長いテールに接続した１つ以上のキレート化基を有する、長いテールを有する試薬と反応させることができる。この長いテールは、ポリマー、例えば、ポリリジン、多糖、又はイオンに結合するためのキレート化基が結合し得るペンダント鎖を有する他の誘導体化された鎖若しくは誘導体化可能な鎖であってもよい。本明細書の実施形態に従って使用可能なキレート化基の例としては、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＧＡＤＡ、ＮＥＴＡ、デフェロキサミン（ＤｆＯ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムなどの基が挙げられる。このキレートは、免疫反応性の低下が最低限であり、凝集及び／又は内部架橋が最低限でありつつ、分子に対する結合を生成することができる基によって、抗原結合性構築物に接続することができる。同じキレートは、非放射性金属（例えば、マンガン、鉄及びガドリニウム）と錯体を形成したとき、本明細書に記載される抗原結合性構築物及び担体と共に使用すると、ＭＲＩに有用である。大環状キレート（例えば、ＮＯＴＡ、ＮＯＧＡＤＡ、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡ）は、限定されないが、それぞれ、ガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種を使用するときなど、種々の金属及び放射性金属に有用である。他の環状キレート、例えば、大環状ポリエーテルは、放射性核種（例えば、ＲＡＩＴのためのラジウム−２２３）に安定的に結合するため興味深いが、これを使用してもよい。ある実施形態では、ＰＥＴ分析で使用するため、キレート化部分を使用し、ＰＥＴ造影剤、例えば、アルミニウム−１８Ｆ複合体を、標的分子に接続してもよい。
本開示の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な例示的なコントラスト剤としては、限定されないが、バリウム、ジアトリゾエート、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、ヨーセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、ヨーグルアミド（ｉｏｇｕｌａｍｉｄｅ）、イオヘキシル、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、ヨーセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸（ｉｏｓｅｍｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、イオタズル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ酸、プロピリオドン、塩化タリウム、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
本開示の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な生体発光及び蛍光の化合物又は分子及び染料としては、限定されないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリスリンなど）、腫瘍関連プロテアーゼにより活性化される自己消光蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
本開示の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な酵素としては、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ又はβ−ラクタマーゼが挙げられる。このような酵素は、検出可能なシグナルを生成するために、色素原、蛍光発生化合物又は発光発生化合物と組み合わせて使用することができる。
ある実施形態では、抗原結合性構築物を、ナノ粒子に結合する。「ナノ粒子」という用語は、粒径がナノメートルで測定される超微細粒子（例えば、少なくとも１つの寸法が約１００ｎｍ未満の粒子）を指す。ナノ粒子は、十分に小さく、可視光を吸収するよりも散乱させるため、ナノ粒子を検出可能な物質として使用することができる。例えば、金ナノ粒子は、顕著な可視光吸光特性を有し、溶液中で深赤色から黒色の外観を呈する。その結果、ナノ粒子に結合する抗原結合性構築物を含む組成物を、対象におけるＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ撮像に使用することができる。粒径範囲の小さい方では、ナノ粒子は、多くは、クラスターと呼ばれる。金属、誘電体及び半導体ナノ粒子に加え、ハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）が作製されてきた。ナノスフェア、ナノロッド及びナノカップは、作製されてきた形状のほんの数例である。半導体量子ドット及びナノ結晶は、さらなる種類のナノ粒子の例である。このようなナノスケールの粒子が、抗原結合性構築物と結合すると、本明細書に記載されるようなＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための造影剤として使用することができる。
（治療薬）
ある実施形態では、抗原結合性構築物は治療薬に結合される。「治療薬」は、本明細書で使用される場合、癌、炎症、他の疾患状態の処置に有用であるか、又は、その他免疫応答を抑制（例えば、臓器移植における免疫抑制）するための原子、分子若しくは化合物である。治療薬の例としては、限定されないが、薬物、化学治療薬、治療抗体及び抗体フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素（例えば、抗原結合性構築物の結合部位でプロドラッグを切断して細胞毒性薬とする酵素）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調整剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤及び染料及びナノ粒子が挙げられる。
化学治療薬は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性であることが多く、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、ホルモン治療、標的治療及び免疫療法を含んでいてもよい。ある実施形態では、本開示の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な化学治療薬としては、限定されないが、１３−シス−レチノイン酸、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アナグレリド、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、三酸化ヒ素、アムサクリン、アミノカンプトテシン、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アザシチジン、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子、カペシタビン、カネルチニブ、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルチゾン、シクロホスファミド、シタラビン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デキサメタゾン、デキサゾン、デクスラゾキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキシフルリジン、エニルウラシル、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン、エストラムスチン、エトポシド、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フルベストラント、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヘキサメチルメラミン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、インターフェロンアルファ、インターロイキン２、インターロイキン１１、イソトレチノイン、イキサベピロン、イダルビシン、メシル酸イマチニブ、イホスファミド、イリノテカン、ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、リポソームＡｒａ−Ｃ、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ネララビン、ニルタミド、オクトレオチド、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、パニツムマブ、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リツキシマブ、ロミプロスチム、ラリトレキセド、サパシタビン、サルグラモスチム、サトラプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テガフール、テガフール−ウラシル、テムシロリムス、テモゾラミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリミトレキサート、アルルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はゾレドロン酸が挙げられる。
本開示の実施形態に従って検出可能なマーカーとして使用可能な毒素としては、限定されないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素が挙げられる。
ある実施形態では、治療用途でナノ粒子が薬物担体として使用される。このナノ粒子は抗原結合性構築物に結合されると、化学治療薬、ホルモン治療薬、放射性治療薬、毒素、又は当該技術分野で知られる任意の他の細胞傷害薬剤又は抗癌剤を、細胞表面で標的を過剰発現する癌性細胞に送達する。
本明細書に記載される任意の抗原結合性構築物を、１つ以上のさらなる治療薬、検出可能なマーカー、ナノ粒子、担体又はこれらの組み合わせとさらに結合させてもよい。例えば、抗ＣＤ８−脂質結合体がミセルを形成するように、抗原結合性構築物がヨウ素１３１で放射性標識されて脂質担体に結合していてもよい。このミセルには、１つ以上の治療薬又は検出可能なマーカーを組み込むことができる。これに代えて、それに加え、抗原結合性構築物は、（例えば、チロシン残基で）ヨウ素１３１で放射性標識されて、（例えば、リジン残基のイプシロンアミノ基で）薬物に結合していてもよく、担体にはさらなる治療薬又は検出可能なマーカーを組み込んでもよい。
（キット）
ある実施形態では、キットが提供される。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物を含む。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物をコードする核酸を含む。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物を産生する細胞株を含む。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような検出可能なマーカーを含む。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような治療薬を含む。ある実施形態では、キットは、バッファーを含む。ある実施形態では、キットは、ポジティブコントロール、例えば、ＣＤ８、ＣＤ８＋細胞、又はこれらのフラグメントを含む。ある実施形態では、キットは、ネガティブコントロール、例えば、実質的にＣＤ８を含まない表面又は溶液を含む。ある実施形態では、キットは、包装を含む。ある実施形態では、キットは、説明書を含む。
（標的分子の有無を検出する方法）
抗原結合性構築物を使用し、標的分子の有無をｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。従って、いくつかの実施形態は、標的の有無を検出する方法を含む。この方法は、サンプルに抗原結合性構築物を適用することを含んでいてもよい。この方法は、標的分子ＣＤ８に対する抗原結合性構築物の結合の有無を検出することを含んでいてもよい。
図１４は、ＣＤ８の有無を検出するための方法のいくつかの実施形態を示す。図１４に示される工程は、任意の順序で行ってよく、及び／又は場合により、繰り返しても、及び／又は省略してもよく、場合によりこの方法にさらなる工程を追加してもよいことが理解されるだろう。本明細書に記載されるような抗原結合性構築物をサンプルに適用することができる（１００）。任意で洗浄（１１０）を行ってもよい。場合により、二次抗原結合性構築物をサンプルに適用することができる（１２０）。任意で洗浄を行ってもよい（１３０）。標的分子に対する抗原結合性構築物の結合の有無を検出することができる（１４０）。
ある実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物をｉｎ ｖｉｖｏでサンプルに適用する。抗原結合性構築物を対象に投与することができる。ある実施形態では、対象は、ヒトである。ある実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物であり、例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、サル又は類人猿である。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、対象に注入される。ある実施形態では、注入は、静脈内である。ある実施形態では、注入は、腹腔内である。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、対象に対し、局部的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）又は局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）に適用される（介入性又は手術中に適用する場合など）。ある実施形態では、抗原結合性構築物が入ったカプセルを、例えば、経口又は腹腔から、対象に適用する。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、対象による免疫原性応答のリスクを減らすように選択される。例えば、ヒト対象のために、抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるようにヒト化されてもよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物をｉｎ ｖｉｖｏで適用した後、サンプル又はサンプルの一部が宿主から除去される。ある実施形態では、抗原結合性構築物がｉｎ ｖｉｖｏで適用され、ｉｎ ｖｉｖｏで、本明細書に記載されるように所定時間インキュベートされ、分析（例えば、本明細書に記載されるような標的分子に結合した抗原結合性構築物又はその非存在のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出）のためにサンプルがｉｎ ｖｉｔｒｏで取り出される。
ある実施形態では、抗原結合性構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサンプルに適用する。ある実施形態では、サンプルは対象から新たに収集される（例えば、生検）。ある実施形態では、サンプルを対象から収集した後にインキュベートする。ある実施形態では、サンプルを固定する。ある実施形態では、サンプルは、臓器全体及び／又は組織を含む。ある実施形態では、サンプルは、１つ以上の全細胞を含む。ある実施形態では、サンプルは、細胞抽出物（例えば、溶解物）に由来する。ある実施形態では、溶液中の抗原結合性構築物を、サンプル中の溶液に加える。ある実施形態では、溶液中の抗原結合性構築物を、溶液を含まないサンプル（例えば、凍結乾燥されたサンプル）に加え、これによりサンプルを再構築する。ある実施形態では、凍結乾燥された抗原結合性構築物を、溶液を含むサンプルに加え、これにより抗原結合性構築物を再構築する。
ある実施形態では、抗原結合性構築物を、場合によりサンプルと共にインキュベートする。抗原結合性構築物を、約１０日を超えない期間、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間を超えない期間、又は約２３時間を超えない期間、例えば、約２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、又は０．１時間を超えない期間インキュベートしてもよい（列挙された任意の２つの値の間の範囲を含む）。ある実施形態では、インキュベーションは、抗原結合性構築物が投与された対象の中で行われる。ある実施形態では、インキュベーションは、インキュベータの中で行われる。ある実施形態では、インキュベータは、固定された温度、例えば、約２１℃、室温、２５℃、２９℃、３４℃、３７℃、又は４０℃に維持される。
ある実施形態では、場合により、標的に結合していない抗原結合性構築物をサンプルから除去する。ある実施形態では、サンプルを洗浄する。サンプルの洗浄は、結合していない抗原結合性構築物を含む溶液を除去することと、抗原結合性構築物を含まない溶液（例えば、バッファー溶液）を加えることとを含んでいてもよい。ある実施形態では、例えば、結合していない抗原結合性構築物を含む溶液をアスピレータにより吸引し、ピペットにより吸引し、圧送し、又は排出し、次いで抗原結合性構築物を含まない溶液を加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏサンプルを洗浄する。ある実施形態では、例えば、抗原結合性構築物を含まない溶液を対象に投与することによって、又は局部的な抗原結合性構築物投与の部位を洗浄することによって、ｉｎ ｖｉｖｏサンプルを洗浄する。ある実施形態では、少なくとも２回、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０回、洗浄が行われる。ある実施形態では、１回又は複数回の洗浄の後、結合していない抗体の少なくとも約５０％がサンプルから除去され、例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はより多くがサンプルから除去される。
ある実施形態では、結合していない抗原結合性構築物が、サンプルから除去される。抗原結合性構築物をサンプルに適用した後、標的に結合した抗原結合性構築物は、標的に結合していない抗原結合性構築物と平衡状態に達し、その結果、抗原結合性構築物を適用してからある程度時間が経過しても、標的に結合した抗原結合性構築物は実質的に増えない。この時間の後、標的に結合していない抗原結合性構築物の量の少なくとも一部を除去してもよい。ある実施形態では、結合していない抗原結合性構築物は、抗体又はフラグメントが送達された対象の代謝プロセス又は他の生体プロセスによって除去される。ある実施形態では、結合していない抗原結合性構築物は、結合していない抗原結合性構築物を破壊するか、又は不安定化する薬剤（例えば、プロテアーゼ又は中和抗体）を加えることによって除去される。ある実施形態では、抗原結合性構築物を適用してから１日後に、適用された抗原結合性構築物の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３０％、４０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％が除去される。ある実施形態では、抗原結合性構築物を適用してから２日後に、適用された抗原結合性構築物の少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％が除去される。
ある実施形態では、標的であるＣＤ８の有無が検出される。標的の有無は、サンプル中の抗原結合性構築物の有無に基づいて検出することができる。例えば、洗浄及び／又は代謝による除去によって、サンプルから抗原結合性構築物が除去及び／又は排出された後、サンプル中の残りの抗原結合性構築物は標的の存在を示唆し、一方、サンプル中に抗原結合性構築物が存在しないことは、標的が存在しないことを示唆しうる。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、腎臓を介して除去される傾向を有するように構成される。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、肝臓を介して除去される傾向を有するように構成される。ある実施形態では、本明細書に記載されるようなｈＩｇＧ２又はＩｇＧ２ヒンジ及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含む抗原結合性構築物は、肝臓を介して実質的に排出されるように構成される。ある実施形態では、本明細書に記載されるようなＩｇＧ２ヒンジ及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含む抗原結合性構築物は、肝臓を介して実質的に排出されるが、腎臓を介して実質的に排出されないように構成される。ある実施形態では、腎臓で除去される抗原結合性構築物に対する、肝臓で除去される抗原結合性構築物の比率は、少なくとも約２：１、例えば、約２：１、３：１、３．５：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、１００：１、又は２００：１である（列挙された値の間の範囲を含む）。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、除去される間、腎臓を介してではなく、肝臓を介して除去される可能性が高い分子量を有するように、ダイマーのまま維持される。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、腎臓での閾値である約６０ｋＤａより大きな原子質量、例えば、約６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、又は２００ｋＤａを維持している（列挙されている任意の２つの値の間の範囲を含む）。
ある実施形態では、抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるような検出可能なマーカーを含む。従って、抗原結合性構築物の存在は、検出可能なマーカーを検出することによって推定することができる。
ある実施形態では、二次抗原結合性構築物を使用し、抗原結合性構築物を検出する。二次抗原結合性構築物は、抗原結合性構築物に特異的に結合することができる。例えば、二次抗原結合性構築物は、抗体の宿主型に対する、又は抗原結合性構築物自体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、ダイアボディ、ミニボディ、などを含んでよい。二次抗原結合性構築物を本明細書に記載されるような検出可能なマーカーに結合することができる。二次抗原結合性構築物をサンプルに適用することができる。ある実施形態では、二次抗原結合性構築物を、抗原結合性構築物と実質的に同じ様式でサンプルに適用する。例えば、抗原結合性構築物を対象に注入した場合、二次抗原結合性構築物も対象に注入することができる。
ある実施形態では、抗原結合性構築物の結合の有無は、陽電子放出断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴撮像（ＮＭＲ）、又は蛍光発光の検出のうち少なくとも１つによって検出される。ＰＥＴとしては、限定されないが、ｍｉｃｒｏＰＥＴ撮像を含んでもよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物の結合の有無は、２つ以上の形態の撮像によって検出される。ある実施形態では、検出は、近赤外（ＮＩＲ）及び／又はＣｅｒｅｎｋｏｖによって行うことができる。
（治療薬を細胞を標的とする治療薬とする方法）
抗原結合性構築物を使用し、治療分子、例えば、標的となる陽性細胞（例えば、ＣＤ８を発現する細胞）への細胞毒を標的とすることができる。従って、ある実施形態は、治療薬を標的陽性細胞を標的とする治療薬とする方法を含む。この方法は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物を対象に投与することを含んでいてもよい。対象は、必要性を有する対象、例えば、少なくとも１つの標的陽性細胞の除去又は中和を必要とする対象であってよい。ある実施形態では、抗原結合性構築物は、少なくとも１つの本明細書に記載されるような治療薬を含む。ある実施形態では、治療薬を、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって、抗原結合性構築物に直接的に結合することができる。ある実施形態では、対象は、ＣＤ８陽性細胞を別の細胞又は薬剤に局在化することによって利益を得ることができる。
場合により、少なくとも１つの治療薬を含む抗原結合性構築物を投与する前及び／又は後に、患者の標的陽性細胞の数及び局在性を決定する。例えば、投与前に標的陽性細胞の数及び／又は局在性を決定することによって、患者が標的陽性細胞の中和及び／又は除去から利益を受ける可能性が高いかどうかが示唆されうる。投与後に標的陽性細胞の数及び／又は局在性を決定することによって、標的陽性細胞が患者から取り除かれたかどうかが示唆されうる。
（さらなる実施形態）
いくつかの実施形態は、免疫系の画像診断法のための、Ｔ細胞のサブセットの表面に見出される特異的なバイオマーカーであるヒトＣＤ８の検出を含む。標的分子の撮像によって、Ｔ細胞の局在性をｉｎ ｖｉｖｏで検出することができる。Ｔ細胞局在性の変化は、免疫応答の進行を反映していてもよく、種々の治療的な処置又は疾患の状態の結果として、経時的に起こる場合がある。例えば、Ｔ細胞の局在性の撮像は、免疫療法に有益であろう。養子免疫療法は、患者自体のＴ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで操作され、患者に再び導入される治療の一形態である。この処置の形態について、Ｔ細胞の撮像は、処置の状態をモニタリング及び／又は決定するのに有用である。従って、ある実施形態では、標的分子の局在性のモニタリングは、薬物の開発において作用機序、効果、及び／又は安全性を分析するのに有用であり、及び／又は疾患の臨床管理を補助することができる。
ある実施形態では、（例えば抗体ＯＫＴ８の、）標的に特異的に結合する抗原結合性構築物のＣＤＲは、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディのアレンジメントに調節されている。マウス抗体のＣＤＲを、ヒトミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディフレームワークに結合し、これによりキメラミニボディを生成することができる。抗体のＶドメインは、典型的には、内部のジスルフィド結合を生成する２個のシステインを含む。ＯＫＴ８ ＶＨは、フレームワーク３（ＦＲ３）の中に余分のシステインを含み、これにより凝集がおこり、その結果、小胞体中に保持されるため、タンパク質の発現が妨害されることがある。従って、ある実施形態は、フレームワーク中、余分のシステインをセリンで置き換えたミニボディを含む（例えば、配列番号１６、１８、２０及び２２）。
ある実施形態では、ＣＤ８＋細胞を、第１の抗原を標的とするものとする方法が提供される。この方法は、二重特異性抗原結合性構築物をサンプルに適用することを含んでいてもよい。二重特異性抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるようなＣＤ８抗原結合性構築物を含んでいてもよい。二重特異性抗体は、第１の抗原に結合する抗原結合性構築物、例えば、１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲ、ｓｃＦｖ、又はミニボディ若しくはｃｙｓ−ダイアボディのモノマーを含んでいてもよい。ある実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物の１、２又は３個のＨＣＤＲ、及び／又は本明細書に記載されるような抗原結合性構築物の１、２又は３個のＬＣＤＲを含む。ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるような抗原結合性構築物のｓｃＦｖを含む。ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるようなＶＨ配列又はＶＬ配列を含む。ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、本明細書に記載されるようなミニボディ又はｃｙｓ−ダイアボディモノマーを含む。ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでサンプル（例えば、対象の臓器又は組織）に適用される。ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサンプルに適用される。いかなる理論にも限定されないが、ある実施形態では、二重特異性抗原結合性構築物は、標的陽性細胞の標的に結合し、第１の細胞の第１の抗原（ＣＤ８とは異なっていてもよい）に結合し、これにより標的陽性細胞を第１の細胞に近接させる。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を癌細胞に近づけることができ、癌細胞に対する免疫応答を促進することができる。
ある実施形態では、抗ＣＤ８抗原結合性構築物は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に標的とする造影剤であってもよい。ある実施形態では、抗ＣＤ８フラグメントは、ＣＤ８を発現するＴ細胞の特定のサブクラスに直接結合し、その局在性を検出することができる。ある実施形態では、ＣＤ８と架橋することができる操作されたフラグメントは、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達を強化し、対象がウイルス病原体を除去し、腫瘍抗原及びワクチンに応答する能力を高めることができる。
ある実施形態では、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディ抗体の形式は、親抗体の高い結合親和性及び特異性を維持しつつ、画像診断法にとって望ましい薬物動態の特徴を有する。全長親抗体を用いた撮像と比較して、これらのフラグメントは、かなり速く除去されるが、抗原を標的とし、迅速な高コントラスト撮像を可能にする。同じ望ましい薬物動態特性は、Ｔ細胞の刺激をより制御することができ、望ましくない過剰刺激（例えば、サイトカインストーム）の影響を防ぐことができる免疫応答を標的とするのに有利である。前臨床モデルにおいて、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディの血清での半減期はより短いため、ミニボディの場合は注射してから約１６〜２０時間後、ｃｙｓ−ダイアボディの場合は注射してから２〜６時間後に最適な撮像が可能になる。同日撮像は、患者の治療管理という点で臨床的に顕著な利点がある。
それに加え、ｃｙｓ−ダイアボディ抗体の形式は、Ｃ−末端システインテールを特徴とする。（穏和に還元された）これらの２つのスルフヒドリル基によって、機能的部分（例えば、ｃｙｓ−ダイアボディの結合活性を妨害しない放射線標識）が部位特異的に結合する方法が得られる。
ある実施形態では、これらの抗原結合性構築物は、（適切な放射性同位体、例えば、ヨウ素−１２４、Ｃｕ−６４又はＺｒ−８９（ＰＥＴ撮像の場合）、又はフルオロフォア（蛍光撮像の場合）で標識した）診断用造影剤であってもよい。臨床的な造影剤として、これらのＣＤ８抗原結合性構築物は、処置をモニタリングするのに役立ち、患者選択ツールとして使用することができる。
ある実施形態では、抗原結合性構築物を、高特異性かつ高親和性でのＣＤ８への結合を要する用途で使用することができる。画像診断法以外に、これらのフラグメントは、異なる官能基の接続によって、異なる目的に役立たせることができる。
適切な赤外色素又は蛍光染料を接続すると、これらの構築物を、イメージガイド手術中の手術のための標的化剤として使用することができる。
ある実施形態では、フラグメントに接続した官能基に対する改変に加え、二重特異性フラグメント（フラグメントが、２つの異なる抗体に結合することができる）の使用によって、二次抗原に対してＣＤ８＋細胞を一緒にすることができる。二重特異性全長抗体は、癌免疫療法に使用され、免疫系の細胞傷害性細胞を腫瘍細胞に近づける。従って、このような実施形態も、適切な抗原結合性構築物のために想定される。
ある実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ヒトＣＤ８αに結合し、ヒトＣＤ８αを特異的に標的とすることができる、操作されたｓｃＦｖ、ミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディ抗体フラグメントが本明細書に提供される。
（実施例１：ＣＤ８抗体及び抗体フラグメントのヒト化）
マウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークにグラフト結合することによって、ＯＫＴ８抗体のマウス可変領域をヒト化した。マウスＶ遺伝子を、ヒトＶ生殖細胞系統データベースに対して調べた。最も高い配列同一性を有するヒトＶ遺伝子を官能残基及び抗原結合ループ（ＣＤＲ）構造の類似性について調べた。次いで、マウスＯＫＴ８のＶＬ及びＶＨのＣＤＲをヒト受容体の可変領域フレームワークに組み込み、ヒトＣＤＲを置き換えた。対応するマウス、ヒト生殖細胞系及びヒト化配列のアラインメントを、重鎖可変領域（図２Ａ）及び軽鎖可変領域（図２Ｂ）について示す。これらの図において、ＣＤＲは四角で囲まれ、アステリスクは、互いに異なる残基を示す。ループ構造で機能することが知られる、選択されたマウス残基が、ヒトフレームワークに保持されていた。
（実施例２：ＣＤ８ミニボディの発現）
発現を検証するために、ＯＫＴ８ミニボディ構築物（表０．１に概説するような配列組み合わせ）をＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、６ウェルプレート中で行った。ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で７２時間インキュベートした後、上清を集め、濾過して細胞を除去した。
抗体フラグメントの発現を確認するために、一過性トランスフェクトからの上清に対してウェスタンブロット分析を行った。ネガティブコントロールとして空ベクターのトランスフェクトからの上清が含まれており、ポジティブコントロールとして無関係なミニボディのトランスフェクトからの上清を使用した。非還元条件下で、ミニボディは予想分子量８０〜９０ｋＤａの位置に流れる（図１５）。モノマー形態を表す若干のバンドも、約４０ｋＤａに検出される。これらの結果から、キメラヒト化ミニボディが適切に発現したことが確認できる。
（実施例３ 結合）
キメラミニボディ改変体１は、ＥＬＩＳＡによってＣＤ８に対して最も高い結合を示し、一方、ヒト化改変体は、ＣＤ８に対する顕著な結合をなんら示さなかった（図１６）。ヒト化改変体のＳＰＲ分析では、可溶性ＣＤ８に対する結合を示したが、キメラミニボディ及び親ＯＫＴ８抗体と比較して、親和性が数分の１に消失することが観察された。９６ウェルプレートを組み換えヒトＣＤ８抗原でコーティングし、一過性トランスフェクションから得られる上清と共にインキュベートした。結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）及び発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用い、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって分析した。希釈を３個ずつ行った。データを、相対的な吸光度の平均として示す。
図１７Ａ〜１７Ｄに、ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体のフローサイトメトリー分析の結果を示す。すべてのヒストグラムは、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）シグナル 対 計測数を示す。異なる希釈物での改変体のトランスフェクションからの上清をＣＤ８＋細胞と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、その後、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。１点あたり１×１０５の細胞を染色し、分析は１０，０００イベント／点で行った。
キメラヒト化ミニボディは、ＣＤ８＋細胞に対し、濃度依存性の結合を示した（図１７Ａ〜１７Ｄ）。ヒト化ミニボディは、キメラよりも良好に発現したが、キメラミニボディは、フローサイトメトリーにおいてより強いシグナルを示し、キメラミニボディが、より強い結合親和性を有することを示唆している。
（実施例４−抗原結合性構築物の成熟）
ヒト化抗体フラグメントの結合親和性を高めるために、２つのヒト化ＶＨ領域について、さらに親和性を成熟させた。第１のバージョンのＶＨについて、親和性成熟によって、サブバージョンａ及びｂになった。第２のバージョンのＶＨについて、親和性成熟によって、サブバージョンｃ及びｄになった。図１２Ｆ〜１２Ｉは、得られた抗体可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）の遺伝子を示す。ＤＮＡ及びアミノ酸配列が示される。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義を用いて四角で囲まれる。
親和性成熟したヒト化ＯＫＴ８ Ｖ遺伝子を用いて、ｓｃＦｖのＶ遺伝子の方向が異なる２つのミニボディ改変体を作製した。ＶＬ−ＶＨの向きを番号（１）と称し、ＶＨ−ＶＬの向きを番号（２）と称する。具体的な配列の組み合わせは、表０．２に概説される。
（実施例５：ＣＤ８ミニボディの発現）
上述のＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８発現構築物を、一過的にＣＨＯ−Ｋ１細胞へとトランスフェクトした。ミニボディの適切な発現を確認するために、トランスフェクションからの上清をウェスタンブロットによって分析した。ネガティブコントロールとして空ベクターのトランスフェクションからの上清を含め、ポジティブコントロールとして、無関係なミニボディの精製されたタンパク質を含めた。会合したミニボディ複合体の予想分子量（約９５ｋＤａ）のバンドに実証されるように、すべての改変体が発現した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。約４５ｋＤａに存在するバンドは、モノマーを表す。一過性トランスフェクション体からのトランスフェクション上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜をアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体でプローブし、ＡＰ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴと共にインキュベートすることによって現像した。これは、複数の実験の代表的なブロットである。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションから、ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体の発現レベルを測定するために、定量的ＥＬＩＳＡを行った。ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８ミニボディ改変体は、約０．５〜１．９μｇ／ｍｌの範囲で発現し、この範囲の高い方の境界値は、以前に発現した参照コントロールミニボディに匹敵した（図１９）。ミニボディを捕捉するためにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を使用し、検出のためにＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を使用した。精製された無関係なアイソタイプコントロールミニボディタンパク質をスタンダードとして使用した。ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８上清を段階希釈し、標準曲線の線形範囲に合う希釈点を見つけた。
（実施例６：ミニボディの機能的活性）
ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８ミニボディ改変体の機能的活性を示すために、一過性トランスフェクションからの上清の、精製された組み換えヒトＣＤ８タンパク質に対する結合を、ＥＬＩＳＡで試験した。図１９に示す定量的ＥＬＩＳＡに基づき、改変体ＩＡｂ＿Ｍｂｌｂ＿ＣＤ８、ＩＡｂ＿Ｍｂ２ｂ＿ＣＤ８及びＩＡｂ＿Ｍｂｌａ＿ＣＤ８の濃度を、ＩＡｂ＿ＭＢ２ａ＿ＣＤ８の濃度（０．５μｇ／ｍｌ）に合うように規格化した。次いで、サンプルを段階希釈し、一連の濃度での結合を評価した。親ＯＫＴ８抗体も、このアッセイのポジティブコントロールとして含まれていた（データは示さない）。すべてのミニボディ改変体は、可溶性組み換えヒトＣＤ８（ｒｈＣＤ８）に対し、濃度依存性の結合を示した。
図２０は、ＩＡｂ＿Ｍｂｌａ＿ＣＤ８が抗原に対する最も高いレベルの結合を有し、その後にＩＡｂ＿Ｍｂｌｂ＿ＣＤ８が続くことを示す。９６ウェルプレートをｒｈＣＤ８抗原でコーティングし、一過性トランスフェクションから得た上清と共にインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ＩｇＧ、及びＴＭＢ基質を用い、結合を検出した。吸光度を４０５ｎｍで測定した。希釈は３個ずつ行った。データは、相対的な吸光度の平均として示される。
図２１は、改変体ｌｃが最も高い結合レベルを有し、その後に改変体ｌｃが続くことを示した。９６ウェルプレートをｒｈＣＤ８抗原でコーティングし、一過性トランスフェクションから得た上清と共にインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異な）ＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用い、結合を検出した。吸光度を４０５ｎｍで測定した。希釈を３個ずつ行った。データは、相対的な吸光度の平均として示される。
（実施例７：細胞ヒトＣＤ８に対する結合）
フローサイトメトリーを用いて、ＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体の細胞ヒトＣＤ８に対する結合を評価した。一過性トランスフェクションからの上清の、ＰＣ３−ＣＤ８細胞（ＣＤ８が安定的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞）に対する結合を試験した（図２２Ａ、２２Ｂ及び２３Ａ、２３Ｂ）。ミニボディの上清をフローサイトメトリー実験のために規格化した。親ＯＫＴ８は、結合のためのポジティブコントロールとして含まれていた（データは示さない）。ネガティブコントロールとしてＰＣ３細胞を使用し、ミニボディ改変体が結合しなかったことを確認した（データは示さない）。ＩＡｂ＿Ｍｂｌｂ＿ＣＤ８は、４種類のミニボディ改変体の中で最も高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
図２２Ａ及び図２２Ｂに示される結果に関し、すべてのヒストグラムは、ＡＰＣシグナル 対 計測数を示す。改変体のトランスフェクションからの上清をＰＣ３−ＣＤ８細胞と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、その後、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体で染色した。１点あたり１×１０５細胞を染色し、分析は１０，０００イベント／点で行った。
図２３Ａ及び図２３Ｂに示される結果に関し、すべてのヒストグラムは、ＡＰＣシグナル 対 計測数を示す。改変体のトランスフェクションからの上清をＰＣ３−ＣＤ８細胞と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、その後、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体で染色した。１点あたり１×１０５細胞を染色し、分析は１０，０００イベント／点で行った。
この結果、構築物が細胞のヒトＣＤ８にまだ結合していることが示された。
（実施例８：ＳＰＲ分析）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用し、すべてのＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体の、組み換えヒトＣＤ８に対する結合親和性を決定した（表８．０）。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体を用い、上清中のミニボディタンパク質をＢＩＡコアチップ上に捕捉した。親和性をランク分けするために、動力学的「探査」実験として、改変体間の結合親和性を直接比較できるように、チップ上に捕捉されたミニボディの量を規格化した。捕捉されたミニボディタンパク質の上にｒｈＣＤ８タンパク質を通し、結合を測定した。すべての改変体は、親ＯＫＴ８ ｍＡｂと類似するＣＤ８タンパク質への強い結合を示した。
Figure 0006856611
表８．０は、組み換えｈＣＤ８に対するＩＡｂ＿Ｍｂ＿ＣＤ８改変体の結合について、測定された会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）及びｋＤ定数をまとめている。この改変体は、抗ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ抗体を用い、ＢＩＡコアチップ上に捕捉された。
ある実施形態では、ナノモル濃度範囲（例えば、１〜２、２〜１０、１０〜１００、又は１００〜１，０００ｎＭ）で結合する抗原結合性構築物が提供され、（例えば）ミニボディ、ｃｙｓ−ダイアボディ及びｓｃＦｖのアレンジメントが含まれる。
（実施例９：ＣＤ８ Ｃｙｓ−ダイアボディの発現）
発現を検証するために、表０．３に概説されるようなｃｙｓ−ダイアボディ構築物（ヒト化バージョンｂ）を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過的にトランスフェクションした。リポフェクタミン試薬を用い、６ウェルプレートでトランスフェクションを行った。３７℃、ＣＯ２中のインキュベータで、７２時間インキュベートした後、上清を集め、濾過して細胞を除去した。
抗体フラグメントの発現を確認するために、一過性トランスフェクションからの上清を用い、ウェスタンブロット分析を行った。ネガティブコントロールとして空ベクターのトランスフェクションからの上清が含まれ、ポジティブコントロールとして無関係なｃｙｓ−ダイアボディのトランスフェクションからの上清が使用された。非還元条件で、ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディの４種類すべての改変体について、適切な分子量である約５５ｋＤの位置に流れた（図２４）。モノマー形態を表す小さなバンドも、約２５ｋＤで検出される。これらの結果から、ヒト化ＯＫＴ８ ｃｙｓ−ダイアボディが適切に発現したことが確認される。ウェスタンブロットのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞への一過性トランスフェクションの後、上清を収集した。非還元条件で、トランスフェクション上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体でプローブし、ＨＲＰ基質ＴＭＢを用いて現像した。
（実施例１０：ＣＤ８ Ｃｙｓ−ダイアボディの結合）
ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂｂ＿ＣＤ８改変体の一過性トランスフェクションからの上清の、組み換えヒトＣＤ８（ｒｈＣＤ８）タンパク質に対する結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＣＤ８を用いたインキュベートの前に、所定濃度範囲での結合を評価するため、サンプルを段階希釈した。９６ウェルプレートをｒｈＣＤ８抗原でコーティングした。コーティングされたプレートを、異なるｃｙｓ−ダイアボディ改変体の一過性トランスフェクション後の上清と共にインキュベートし、次いで、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体と共にインキュベートした。ＴＭＢを用いてシグナルを検出し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
４種類すべての改変体が、ｒｈＣＤ８タンパク質に対し、濃度依存性の結合を示した（図２５）。この分析に含まれたネガティブコントロールｃｙｓ−ダイアボディからのトランスフェクション上清は、ＣＤ８に対する結合を示さなかった（図２５）。
４種類すべてのＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂｂ＿ＣＤ８改変体の、細胞ヒトＣＤ８に対する結合を、フローサイトメトリーを用いてさらに試験した。一過性トランスフェクションからの上清の、ＰＣ３−ＣＤ８細胞に対する結合を試験した（図２６Ａ及び２６Ｂ）。結合のポジティブコントロールとして親ＯＫＴ８が含まれていた（データは示さない）。ネガティブコントロールとしてＰＣ３細胞が含まれ、この細胞に対し、ｃｙｓ−ダイアボディ改変体の非特異的な結合が存在しないことを確認した（データは示さない）。ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂｌｂ＿ＣＤ８及びＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ＿ＣＤ８は、他の２種類の改変体と比較して、より平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。図２６Ａ及び２６Ｂのすべてのヒストグラムは、ＡＰＣシグナル 対 計測数を示す。改変体のトランスフェクションからの上清の、ＰＣ３−ＣＤ８細胞に対する結合を評価した。その後、細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を用いて染色した。１×１０５細胞／点で、１０，０００イベントをそれぞれの点について分析した。
ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂｂ＿ＣＤ８改変体の、内因性ＣＤ８を発現するＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に結合する能力を評価した。すべてのＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ １ｂ及び３ｂ改変体は、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に結合した（図２７）。結合のポジティブコントロールとして親ＯＫＴ８が含まれ、ネガティブ細胞株としてＰＣ３細胞が含まれていた。ＣＤ８を発現しないＰＣ３細胞に対するｃｙｓ−ダイアボディ改変体の結合はみられなかった（データは示さない）。改変体のトランスフェクションからの上清の、内因性ＣＤ８を発現するＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する結合を評価した。その後、細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体で染色した。すべてのヒストグラムは、ＡＰＣシグナル 対 計測数を示す。１×１０５細胞／点で、１０，０００イベントをそれぞれの点について分析した。
（実施例１１：ＣＤ８のｉｎ ｖｉｖｏ検出）
表０．３のヒト化ＣＤ８ ｃｙｓ−ダイアボディを、ｃｙｓ−ダイアボディのＣ末端システインを介して、関連するキレート剤と結合し、その後、Ｉｎ１１１の同位体（又はその代替として、Ｚｒ−８９又はＣｕ−６４）を用いて放射性標識する。又は、リジン残基に関連するキレート剤を接続した後にｃｙｓ−ダイアボディを放射性標識することや、ヨウ素で直接的に放射性標識することもできる。
ｃｙｓ−ダイアボディを、健康なヒト対象に静脈内注入する。注入してから１０分間、ｃｙｓ−ダイアボディをヒト対象中でインキュベートする。インキュベーションと同日に、ＰＥＴスキャン又は外部シンチレーションシステムによってｃｙｓ−ダイアボディの局在性を検出する。
ｃｙｓ−ダイアボディの局在性を使用し、対象におけるＣＤ８の局在性を検出する。
（実施例１２：ＣＤ８のｉｎ ｖｉｖｏ検出）
表０．２のミニボディを、ミニボディのリジン残基を介して、関連するキレート剤と結合し、その後、Ｉｎ１１１の同位体（又はその代替として、Ｚｒ８９又はＣｕ６４）を用いて放射性標識した。又は、ミニボディを、チロシン残基を介して、ヨウ素で直接的に放射性標識することもできる。
ミニボディを、健康なヒト対象に静脈内注入する。注入してから１０分間、ミニボディをヒト対象中でインキュベートする。インキュベーションと同日に、ＰＥＴスキャン及び外部シンチレーションシステムによってミニボディの局在性を検出する。
ｃｙｓ−ダイアボディの局在性を使用し、対象におけるＣＤ８の局在性を検出する。
（実施例１３：ＣＤ８のｉｎ ｖｉｖｏ検出）
配列番号２２のモノマーのホモダイマーであるヒト化ＣＤ８ミニボディが提供される。ミニボディを、健康なヒト対象に静脈内注入する。注入してから１時間、ミニボディをヒト対象中でインキュベートする。ＣＤ８ミニボディに特異的に結合し、３３Ｐに結合する二次抗体であるヒト化ｃｙｓ−ダイアボディが提供される。インキュベーションと同日に、二次抗体を対象に注入する。二次抗体を１時間インキュベートする。ＰＥＴ撮像によって、二次抗体上のマーカーを介してミニボディの局在性を検出する。
ミニボディの局在性を使用し、対象におけるＣＤ８の局在性を検出する。
（実施例１４：Ｃｙｓ−ダイアボディを用いた治療的処置）
表０．３のモノマーのホモダイマーであるヒト化ＣＤ８ミニボディが提供される。ｃｙｓ−ダイアボディを、ＣＤ８に関連する障害を有する対象に、ＣＤ８に関連する障害の症状を低減するために対象中の十分な量のＣＤ８に結合するのに適切な量で静脈内に注入する。ｃｙｓ−ダイアボディをイットリウム９０に結合する。
（実施例１５：ミニボディを用いた治療的処置）
表０．２のＣＤ８ミニボディが提供される。感染性疾患の抗原又は腫瘍関連抗原を用いてワクチン接種された対象に、ミニボディを注射する。ＣＤ８に向けられたフラグメントが、免疫応答を強化し、ＣＤ８発現Ｔ細胞の細胞溶解活性を高める。
（実施例１６：Ｃｙｓ−ダイアボディを用いた治療的処置）
表０．３のモノマーのホモダイマーであるＣＤ８ ｃｙｓ−ダイアボディが提供される。ｃｙｓ−ダイアボディを、ＣＤ８に関連する障害を有する対象に、ＣＤ８に関連する障害の症状を低減するために対象中の十分な量のＣＤ８に結合するのに適切な量で静脈内に注入する。ｃｙｓ−ダイアボディをＬｕ１７７Ｔｘに結合する。ＣＤ８ ｃｙｓ−ダイアボディは、ＣＤ８発現Ｔ細胞に結合し、Ｌｕ１７７Ｔｘによって、細胞が死亡する。
（実施例１７：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ８に対するＯＫＴ８ ｍＡｂの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するＯＫＴ８ ｍＡｂ構築物の結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度の抗体で染色し、洗浄し、次いで、二次抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２８にグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．２２ｎＭであることを示す。
（実施例１８Ａ：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ８に対するミニボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するミニボディの結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のミニボディで染色し、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２９Ａにグラフの形式で示す。このグラフは、規格化された平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．１５ｎＭ及び０．１９ｎＭであることを示す。
（実施例１８Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８に対するミニボディの結合のフローサイトメトリー分析）
初代ＣＤ８＋Ｔ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するミニボディの結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のミニボディで染色し、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２９Ｂにグラフの形式で示す。このグラフは、規格化された平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．１ｎＭ及び０．２６ｎＭであることを示す。
（実施例１８Ｃ：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ８に対する、Ｄｆ標識されたミニボディ及び標識されていないミニボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するミニボディ（デスフェロキサミン（Ｄｆ）に対するリジンの結合 有／無）の結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のミニボディで染色し、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２９Ｃにグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．１３ｎＭ及び０．１２ｎＭであることを示す。
（実施例１８Ｄ：ＰＣ３細胞上のＣＤ８に対する、Ｄｆ標識されたミニボディ及び標識されていないミニボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＣＤ８を過剰発現するＰＣ３細胞に対するミニボディ（デスフェロキサミンに対するリジンの結合 有／無）の結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のミニボディで染色し、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＡＰＣが結合した抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２９Ｄにグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．６４ｎＭ及び０．８３ｎＭであることを示す。
（実施例１８Ｅ：ＰＣ３細胞上のＣＤ８に対する、Ｄｆ標識されたミニボディ及び標識されていないミニボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するＩｇＧ２ミニボディの結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のミニボディで染色し、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図２９Ｅにグラフの形式で示す。このグラフは、規格化された平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．１ｎＭ、０．１３ｎＭ及び０．０８ｎＭであることを示す。
（実施例１９Ａ：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ８に対する、ｃｙｓ−ダイアボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するｃｙｓ−ダイアボディの結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のｃｙｓ−ダイアボディで染色し、洗浄し、次いで、ビオチン結合二次タンパク質Ｌで染色し、洗浄し、次いで、三次ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図３０Ａにグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．０４ｎＭであることを示す。
（実施例１９Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８に対する、ｃｙｓ−ダイアボディの結合のフローサイトメトリー分析）
初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するｃｙｓ−ダイアボディの結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のｃｙｓ−ダイアボディで染色し、洗浄し、次いで、ビオチン結合二次タンパク質Ｌで染色し、洗浄し、次いで、三次ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図３０Ｂにグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．０２ｎＭであることを示す。
（実施例１９Ｃ：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のＣＤ８に対する、Ｄｆ標識されたｃｙｓ−ダイアボディ及び標識されていないｃｙｓ−ダイアボディの結合のフローサイトメトリー分析）
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の細胞表面ヒトＣＤ８に対するｃｙｓ−ダイアボディ（デスフェロキサミンに対するＣ末端システインの結合 有／無）の結合のフローサイトメトリー分析を行った。細胞をそれぞれの濃度のｃｙｓ−ダイアボディで染色し、洗浄し、次いで、ビオチン結合二次タンパク質Ｌで染色し、洗浄し、次いで、三次ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。各濃度について、３個ずつ、１０，０００イベント／点で分析を行った。結果を図３０Ｃにグラフの形式で示す。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ） 対 濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。このデータは、ＥＣ５０が０．０４ｎＭ及び０．０６ｎＭであることを示す。
（実施例２０：フローサイトメトリーによる構築物の特性決定）
以下に示す表９は、実施例１８Ａ〜１８Ｅ及び１９Ａ〜１９Ｃからのミニボディ及びｃｙｓ−ダイアボディ構築物の特性決定の結果をまとめている。
Figure 0006856611
（実施例２１：８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ ＣＤ８を用いた、ヒトＣＤ８発現腫瘍異種移植のヒトＣＤ８腫瘍異種移植片の撮像）
８匹の雌ＳＣＩＤマウスを試験した。右肩の領域において、４匹のマウスに、５×１０６のＰＣ３−ｈＣＤ８細胞を移植し、別の４匹に、ＰＣ３（ｈＣＤ８ネガティブ）細胞を移植した。マウスに、８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ＿ＣＤ８（Ｃ末端システイン残基にＤｆが結合した）を静脈内注射した。６匹のマウス（４匹が腫瘍ポジティブ、２匹が腫瘍ネガティブ）を、ＰＥＴによって４時間目、６時間目、及び２４時間目に撮像した（１０分間のスタティックスキャン）。１匹のマウスは、０〜２時間のダイナミックスキャンも受けた。２４時間目の最後のスキャンの後に、生体分布を行った。
得られた画像を図３１に示す。図３１は、右肩の領域（矢尻を参照）にＰＣ３−ｈＣＤ８異種移植を行った同じＳＣＩＤマウスの４時間目、６時間目、及び２４時間目の冠状面及び横断面のＰＥＴ画像を示す。マウスに、約１２０μＣｉの８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｃｙｓ−Ｄｂ３ｂ＿ＣＤ８を静脈内注射した（比活性は、４．９６μＣｉ／μｇであった）。理論によって限定されないが、Ｃｙｓ−Ｄｂは、６時間目に腫瘍の輪郭を明らかに示し、予想されるように、腎臓によって除去される。２４時間目に、ネガティブ腫瘍に対するポジティブ腫瘍の平均的な比率（ＰＣ３に対するＰＣ３−ｈＣＤ８）は、約１．６倍であった。血液に対する平均的なポジティブ腫瘍の比率は、１６．０であった（血液に対するネガティブ腫瘍の比率は９．５）。
（実施例２２：８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８を用いた、ヒトＣＤ８発現腫瘍異種移植のヒトＣＤ８腫瘍異種移植片の撮像）
８匹の雌ＳＣＩＤマウスを試験した。右肩の領域において、４匹のマウスに、５×１０６のＰＣ３−ｈＣＤ８細胞を移植し、別の４匹に、ＰＣ３（ｈＣＤ８ネガティブ）細胞を移植した。マウスに、８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８（Ｃｙｓ）（ＩｇＧ１ヒンジ伸長とＣＨ３を有し、ヒンジ領域のシステイン残基にＤｆが結合したミニボディ）を静脈内注射した。６匹のマウス（４匹が腫瘍ポジティブ、２匹が腫瘍ネガティブ）を、ＰＥＴによって４時間目、２４時間目、及び４８時間目に撮像し（１０分間のスタティックスキャン）、その後、解剖学的参照のために、１０分間のＣＴスキャンを行った。１匹のマウスは、０〜２時間のダイナミックスキャンも受けた。４８時間目の最後のスキャンの後に、生体分布を行った。
得られた画像を図３２Ａに示す。図３２Ａは、右肩の領域（矢尻を参照）にＰＣ３−ｈＣＤ８異種移植を行った同じＳＣＩＤマウスの２時間目、４時間目、及び２４時間目の冠状面のＭＩＰ ＰＥＴ／ＣＴ重ね合わせ画像を示す。マウスに、約１１６μＣｉの８９Ｚｒ−Ｄｆ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８（Ｃｙｓ）を静脈内注射した（比活性は、５．１６μＣｉ／μｇであった）。いくつかの腫瘍の取り込みが４時間目及び２４時間目にみられた。大部分の活性は、腎臓によって除去された。腎臓では４８時間目に、肝臓よりも取り込みが４〜５倍高かった。理論によって限定されないが、腎臓での高い取り込みは、Ｍｂが、Ｄｆとの結合の後に分解され、８０ｋＤａのダイマーとしてではなく、（６０ｋＤａの腎臓の閾値より小さいサイズである）４０ｋＤａのモノマー（半分子）として存在することを示す。４８時間目に、腫瘍及び臓器を収集し、放射性活性を計測した。ポジティブ腫瘍への取り込みは、ネガティブ腫瘍への取り込みより有意に高かった（Ｐ＝０．０２９３３）。血液に対するポジティブ腫瘍の比率は１１．０であった（血液に対するネガティブ腫瘍は５．６）。
切除した腫瘍を４８時間目に別個に撮像した。図３２Ｂに示されるように、主にモノマーであるが、ネガティブ腫瘍（−）と比較して、ポジティブ腫瘍（＋）においてＭｂとの活性がかなり高く保持される。上述の結果に示されるように、ミニボディ構築物は、３個より多いシステインがヒンジ領域の各半分に存在するとき、さらなる利点を有することができるようである。
（実施例２３：６４Ｃｕ−ＮＯＤＡＧＡ−ＩＡｂ Ｍ１ｂ ＣＤ８ ＩｇＧ２ ＥＨを用いたヒトＣＤ８ Ｔ細胞の撮像）
６匹の雌ＮＯＤ Ｓｃｉｄ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスを試験した。２０×１０６の新鮮なヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ；生存力９８％）を尾側面の静脈に注射することによって、３匹のマウスに移植した。この処置結果によって、使用されるドナーにかかわらず、脾臓に一様に高い生着がおこった。３〜４週間後、すべてのマウスに、６４Ｃｕ−ＮＯＤＡＧＡ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８ ＩｇＧ２ ＥＨ（Ｃｙｓ）（ＩｇＧ２ヒンジ伸長及びＣＨ３ドメインを有し、ＮＯＤＡＧＡがヒンジ領域のシステイン残基に結合したＭｂ）を静脈内注射した。６匹すべてのマウスを４時間目に撮像した。各群から１匹のマウスを７時間目に撮像した。７時間目に生態分布を行った。
得られた画像を図３３に示す。図３３は、４時間目及び７時間目にスキャンした２匹のＮＳＧマウス（１匹はＰＢＭＣ移植され、１匹は移植されていない）のＭＩＰ画像を示す。約８４μＣｉの６４Ｃｕ−ＮＯＤＡＧＡ−ＩＡｂ＿Ｍ１ｂ＿ＣＤ８ ＩｇＧ２ ＥＨ（Ｃｙｓ）（比活性は７．４１μＣｉ／μｇ）をそれぞれのマウスに投与した。脾臓（Ｓｐ）と、おそらく腋窩リンパ節（ＬＮ）での高い取り込みが、ＰＢＭＣを移植したマウスでみられる。ＮＳＧマウスにおいて、Ｍｂは、主に、肝臓（Ｌｉ）によって除去される。理論によって制限されないが、肝臓での除去は、８０ｋＤａのフラグメントにおいて行われると予想された。ネガティブコントロールマウスにおいて、血液の活性は、高いまま維持され、活性は、肝臓と腎臓（Ｋｉ）の両方に分布した。７時間目に、ＰＢＭＣが移植されたＮＳＧマウスにおける生体分布は、コントロールに対し、脾臓での２．１倍高い取り込み、腎臓での４．０倍低い活性、肝臓での１．７倍高い活性、血液での３．１倍低い活性を示した。
本明細書で、単数形の使用は、特に明確に述べられている場合を除き、又は本開示に鑑みて単数形が唯一の機能的な実施形態であると当業者に理解される場合を除き、複数形も含むことができる。従って、例えば、「１つの（ａ）」は、１個より多いことを意味していてもよく、「１つの実施形態」は、その記載が複数の実施形態に適用されることを意味し得る。
（参照による取り込み）
本明細書に引用されるすべての参考文献（特許、特許出願、論文、テキストなど）及びこれらに引用される参考文献は、すでに記載されているものを除いて、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。１つ以上の組み込まれた文献及び類似の事項が、本明細書とは異なるか、又は矛盾する場合には、限定されないが、定義される用語、用語の使用、記載される技術などを含め、本出願が優先する。
（均等物）
上述の記載及び実施例は、ある実施形態を詳しく述べている。しかし、文章中にどの程度詳細に上述の事項が表れているかに関わらず、本発明を、多くの様式で実施してもよく、本発明を添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈すべきであることが理解されるだろう。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞ 配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ２；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ３；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ２；及び
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ３
を含む、抗原結合性構築物。
＜２＞ 前記抗原結合性構築物が、ＣＤ８に特異的に結合する、＜１＞に記載の抗原結合性構築物。
＜３＞ 検出可能なマーカーをさらに含む、＜１＞に記載の抗原結合性構築物。
＜４＞ 治療薬をさらに含む、＜１＞に記載の抗原結合性構築物。
＜５＞ 前記抗原結合性構築物が、二重特異性を有する、＜１＞に記載の抗原結合性構築物。
＜６＞ 前記抗原結合性構築物が、一価ｓｃＦｖである、＜１＞に記載の抗原結合性構築物。
＜７＞ 可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ドメインに接続した可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、
Ｃ末端システインと、
を含むポリペプチドを含む、ＣＤ８に結合するヒト化ｃｙｓ−ダイアボディ。
＜８＞ 前記ポリペプチドの可変ドメインの順序が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｖ Ｌ 、Ｖ Ｈ の順序である、＜７＞に記載のヒト化ｃｙｓ−ダイアボディ。
＜９＞ 前記ポリペプチドの可変ドメインの順序が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｖ Ｈ 、Ｖ Ｌ の順序である、＜７＞に記載のヒト化ｃｙｓ−ダイアボディ。
＜１０＞ 検出可能な分子をさらに含む、＜７＞に記載のヒト化ｃｙｓ−ダイアボディ。
＜１１＞ 配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ２；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ３；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ２；及び
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ３
を含む、＜７＞に記載のヒト化ｃｙｓ−ダイアボディ。
＜１２＞ Ｎ末端からＣ末端に向かって、
ＣＤ８に結合し、可変軽鎖（Ｖ Ｌ ）ドメインに接続した可変重鎖（Ｖ Ｈ ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を含むヒンジ伸長ドメイン；及び
ヒトＩｇＧ Ｃ Ｈ ３配列、
を含むポリペプチドを含む、ＣＤ８に結合するヒト化ミニボディ。
＜１３＞ 検出可能なマーカーをさらに含む、＜１２＞に記載のヒト化ミニボディ。
＜１４＞ 配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ１；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ２；
配列番号３又は６のＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ３；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ１；
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ２；及び
配列番号９のＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ３
を含む、＜１２＞に記載のヒト化ミニボディ。
＜１５＞ ＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
＜１６＞ ＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の抗体を産生する細胞株。
＜１７＞ ＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物、＜１５＞に記載の核酸、又は＜１６＞に記載の細胞株の細胞のうち少なくとも１つと、
検出可能なマーカーと、
を含む、キット。
＜１８＞ ＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物をサンプルに適用すること、及び
前記抗原結合性構築物の有無を検出することによって、ＣＤ８の有無を検出すること、
を含む、ＣＤ８の有無を検出する方法。
＜１９＞ 前記抗原結合性構築物が検出可能なマーカーに結合している、＜１８＞に記載の方法。
＜２０＞ 前記抗原結合性構築物を適用することが、前記抗原結合性構築物を対象に投与することを含む、＜１８＞に記載の方法。
＜２１＞ 前記抗原結合性構築物のＣＤ８の結合の有無を検出することが、陽電子放出断層法又は単一光子放射断層撮影のうち少なくとも１つを含む、＜１８＞に記載の方法。
＜２２＞ さらに、二次抗原結合性構築物をサンプルに適用することを含み、前記二次抗原結合性構築物が、前記抗原結合性構築物に特異的に結合する、＜１８＞に記載の方法。
＜２３＞ 前記抗原結合性構築物を前記サンプルと共に２０時間以内の時間インキュベートする、＜１８＞に記載の方法。
＜２４＞ 前記抗原結合性構築物を前記サンプルと共に６時間以内の時間インキュベートする、＜１８＞に記載の方法。
＜２５＞ 前記抗原結合性構築物が宿主に投与され、第１の量の抗原結合性構築物がＣＤ８に結合しておらず、第２の量の抗原結合性構築物がＣＤ８に結合しており、前記第１の量の抗原結合性構築物の少なくとも約８０％が、１２時間以内に除去される、＜１８＞に記載の方法。
＜２６＞ ＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物を対象に投与することを含み、抗原結合性構築物が治療薬と結合している、治療薬をＣＤ８を標的とする治療薬とする方法。

Claims (15)

  1. 配列番号３又は６におけるＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
    配列番号３又は６におけるＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
    配列番号３又は６におけるＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；及び
    配列番号４８におけるＨＦＲ３のアミノ酸配列を含むＨＦＲ３
    を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、
    配列番号９におけるＬＣＤＲ１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
    配列番号９におけるＬＣＤＲ２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び
    配列番号９におけるＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと、
    を含む抗原結合性構築物であって、
    ｃｙｓ−ダイアボディである、ＣＤ８に結合する抗原結合性構築物。
  2. 検出可能なマーカーをさらに含む、請求項１に記載の抗原結合性構築物。
  3. 前記検出可能なマーカーが８９Ｚｒ又は１８Ｆを含む、請求項２に記載の抗原結合性構築物。
  4. 治療薬をさらに含む、請求項１に記載の抗原結合性構築物。
  5. 二重特異性を有する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
  6. 前記ｃｙｓ−ダイアボディが、
    可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続した可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、
    Ｃ末端システインと、
    を含むポリペプチドを含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
  7. 前記ポリペプチドの可変ドメインの順序が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、ＶＨの順序である、請求項６に記載の抗原結合性構築物。
  8. 前記ポリペプチドの可変ドメインの順序が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、ＶＬの順序である、請求項６に記載の抗原結合性構築物。
  9. 可変重鎖（ＶＨ）ドメインが配列番号４８の可変重鎖（ＶＨ）ドメインである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
  10. 可変軽鎖（ＶＬ）ドメインがさらに配列番号４２におけるＬＦＲ１のアミノ酸配列を含むＬＦＲ１を含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
  11. 可変重鎖（ＶＨ）ドメインが配列番号４８の可変重鎖（ＶＨ）ドメインであり、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインが配列番号４２の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインである、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
  12. 請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物をコードする核酸。
  13. 請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物を産生する細胞株。
  14. 請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物、請求項１２に記載の核酸、又は請求項１３に記載の細胞株の細胞のうち少なくとも１つと、
    検出可能なマーカーと、
    を含む、キット。
  15. 癌、炎症、若しくは癌及び炎症以外の疾患の治療のため、又は免疫反応を抑制するために使用され、治療薬と結合している、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物を含む医薬。

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