CN108350079A - 用于治疗神经学和其它病症的结合激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TrkB结合激动剂，并涉及此类激动剂在治疗神经学病症和其它病症中的用途。本发明还涉及包含CDR、可变区、重链和轻链及其变体序列的特异性TrkB结合激动剂。

Description

用于治疗神经学和其它病症的结合激动剂
发明领域
本发明涉及TrkB结合激动剂，并涉及此种激动剂在治疗神经学病症和其它病症中的用途。本发明还涉及包含CDR，可变区，重链和轻链及其变体序列的特异性TrkB结合激动剂。
发明背景
世界范围内神经学病症的发病率和患病率正在增加，因此迫切需要疗法。然而，在家族性和散发性两种形式中神经学病症在表型上都是异质的，并且通常具有未知的病因。因此，靶向单一病理机制不太可能提供具有显著临床益处的疾病修饰，除非病理机制的性质是疾病的关键“驱动因素”。
神经学病症，诸如神经学疾病，包括神经毒性物质的积累、炎症、脂质代谢、氧化应激、自噬、蛋白质降解和线粒体功能障碍等中已经涉及多种机制和途径。然而，它们是疾病的原因还是原发性和/或继发性损害的后果尚不清楚。因此，基于这些单独机制中的一些的疗法尚未取得临床成功。鉴于认为脑中错误折叠的毒性蛋白的积累是某些神经变性疾病的关键致病因子，开发用于神经学疾病的疾病缓解疗法的许多努力遵循了毒性降低方法。然而，通过降低毒性蛋白的临床成功受到限制，诸如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)中的Aβ，尽管最近对轻度疾病患者的试验显示出令人鼓舞的结果。
靶向发病机制(导致疾病状态的生物学机制)可能是防范性或预防性治疗的合适方法；然而，靶向病理生理学(在疾病状态内运行的内源生物学机制)可能是一种用于治疗性干预已存在的神经学病症的更好方法。
可以使用此备选病理生理学治疗方法，通过靶向在神经元存活、功能、可塑性和稳态中起作用的内源神经营养和神经保护途径进行。有证据指示内源机制可以在神经学病症中显著下调。
神经营养因子是调节中枢和外周神经系统(分别为CNS和PNS)的发育、维持和功能的内源生长因子。神经生长因子(NGF)配体家族主要通过高亲和力的Trk受体[对于NGF为TrkA，对于BDNF(脑源性神经营养因子)和NT-4(神经营养蛋白4，NT-4/5)为TrkB，对于NT-3(神经营养因子3)为TrkC]以及也通过与低亲和力泛神经营养因子受体p75NTR结合发出信号。通过Trk受体的信号转导通常增强细胞存活，而在缺乏Trk受体的情况下通过p75NTR的神经营养因子信号传导通常促进凋亡。
有临床前证据支持BDNF-TrkB途径在体外和体内促进CNS神经元的存活和功能中的作用。此外，在ALS中进行了四项使用BDNF的临床试验。此外，由于感觉症状的紧急安全问题，终止了皮下注射TrkB激动剂抗体的健康志愿者的I期双盲安慰剂对照单次递增剂量研究(临床试验NCT01262690，赞助商：Pfizer)(没有发表研究结果)。
总之，仍然需要神经学病症和通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症的治疗。
发明概述
本发明提供了TrkB结合激动剂，其中所述激动剂增强BDNF诱导的和/或NT-4诱导的TrkB激动。在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其中所述激动剂增强BDNF诱导的TrkB激动。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其结合TrkB的D5域的β片层A和G内，和β片层A和A’之间的区域中包含的表位。在此上下文中，术语“表位”指抗原(TrkB)中与TrkB结合蛋白接触的那部分，例如TrkB中以小于或等于接近TrkB结合蛋白的那部分。在一个实施方案中，此TrkB结合激动剂不与BDNF竞争。与TrkB的此区域结合的激动剂可以：
a)与人TrkB的一个或多个以下残基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341；
b)以小于或等于接近选自下组的来自人TrkB的残基：T288,I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、和S375；
c)结合人TrkB，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB相比具有改变的亲和力：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372；
d)结合人TrkB并导致源自含有残基284-291(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
e)结合具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的肽。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其结合包含在TrkB的近膜区(W381-H430)内的表位。在此上下文中，术语“表位”指抗原(TrkB)中与TrkB结合蛋白接触的那部分，例如TrkB中以小于或等于接近TrkB结合蛋白的那部分。在一个实施方案中，此TrkB结合激动剂不与BDNF竞争。结合此区域的激动剂可以：
a)结合人TrkB胞外域，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402；
b)结合人TrkB并导致源自含有残基385-398(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
c)结合具有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的肽。
本发明还提供了与参考抗体竞争结合TrkB的TrkB结合激动剂，所述参考抗体具有：(a)SEQ ID NO:27的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或(b)SEQ ID NO:29的重链序列和SEQ ID NO:30的轻链序列；或(c)SEQ ID NO:31的重链序列和SEQ ID NO:32的轻链序列。在一个实施方案中，此TrkB结合激动剂不与BDNF竞争。本发明还提供了TrkB结合激动剂，其维持细胞表面上的TrkB水平。在一个实施方案中，激动剂在不存在BDNF的情况下激活TrkB。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含(i)选自来自SEQ ID NO:27的CDRH1、CDRH2、CDRH3和/或来自SEQ ID NO:28的CDRL1、CDRL2、CDRL3的CDR中的任何一种或组合；或(ii)(i)的CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，特定CDR如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中所示，而其它CDR为SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:28中所示的那些CDR的变体。在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其包含：
(a)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(c)如SEQ ID NO:27或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含以下CDR中的任一个或组合：(a)SEQ IDNO:6的CDRH1；(b)SEQ ID NO:7的CDRH2；(c)SEQ ID NO:8的CDRH3；(d)SEQ ID NO:3的CDRL1；(e)SEQ ID NO:4的CDRL2；和/或(f)SEQ ID NO:5的CDRL3。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含含有与SEQ ID NO:40的序列至少80％相同的序列的VH区和/或含有与SEQ ID NO:41的序列至少76％相同的序列的VL区。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含：(a)与SEQ ID NO:42至少90％相同的重链(HC)序列；和/或(b)与SEQ ID NO:43至少85％相同的轻链(LC)序列。
本发明还提供了编码如本文所定义的TrkB结合激动剂的一种或多种核酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了编码如本文所定义的TrkB结合激动剂的核酸序列。
本发明还提供一种或多种包含如本文所定义一种或多种核酸序列的表达载体。在一个实施方案中，本发明提供了包含编码如本文所定义的TrkB结合激动剂的核酸序列的表达载体。
本发明还提供了包含如本文所定义的一种或多种核酸序列或如本文所定义的一种或多种表达载体的重组宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了重组宿主细胞，其包含编码如本文所定义的TrkB结合激动剂的核酸序列或包含编码如本文所定义的TrkB结合激动剂的核酸序列的表达载体。
本发明还提供了产生如本文所定义的TrkB结合激动剂的方法，该方法包括在适合于表达所述核酸序列或载体的条件下培养如本文所定义的宿主细胞。在该方法的一个实施方案中，表达并纯化TrkB结合激动剂。
本发明还提供了通过本文所述的方法产生的TrkB结合激动剂。
本发明还提供了药物组合物，其包含如本文所定义的结合激动剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的一种或组合。
本发明还提供了在有此需要的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的TrkB结合激动剂或向所述受试者施用如本文所定义的药物组合物。在一个实施方案中，受试者是人。
本发明还提供了在有此需要的受试者中治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的TrkB结合激动剂或向所述受试者施用如本文所定义的药物组合物。在一个实施方案中，受试者是人。
本发明还提供了治疗有此需要的受试者中的神经学病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的BDNF诱导的TrkB激动的增强剂。在一个实施方案中，受试者是人。
本发明还提供了在有此需要的受试者中治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的BDNF诱导的TrkB激动的增强剂。在一个实施方案中，受试者是人。
本发明还提供了用于治疗的如本文所定义的TrkB结合激动剂或如本文所定义的药物组合物。
本发明还提供了如本文所定义的TrkB结合激动剂或如本文所定义的药物组合物，用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
本发明还提供了如本文所定义的TrkB结合激动剂或如本文定义的药物组合物，用于治疗神经学病症。
本发明还提供了用于治疗的BDNF诱导的TrkB激动的增强剂。
本发明还提供了BDNF诱导的TrkB激动的增强剂，用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
本发明还提供了如本文所定义的TrkB结合激动剂或如本文所定义的药物组合物在制备用于治疗神经学病症的药物中的用途。
本发明还提供了如本文所定义的TrkB结合激动剂或如本文所定义的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
本发明还提供了BDNF诱导的TrkB激动的增强剂在制备用于治疗神经学病症的药物中的用途。
本发明还提供了BDNF诱导的TrkB激动的增强剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
本发明还提供了如本文所述的治疗方法、TrkB结合激动剂或用途，其中治疗包括细胞存活和/或神经元修复和/或神经元可塑性的增强。
附图简述
图1A：随时间在大鼠皮层神经元中BDNF和1G11诱导的TrkB磷酸化和TrkB下游信号传导以及TrkB的细胞表面水平的Western印迹。在37℃如所示用0.8nM BDNF或7.3nM 1G11处理培养的大鼠皮质神经元(体外7天)。在还原条件下在SDS-PAGE上解析细胞裂解物(30μg蛋白质)，并如所示用抗体进行免疫印迹。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部对照。为了测量TrkB的细胞表面水平，在冰上用磺基-NHS-生物素处理用1G11处理后的大鼠皮层神经元1小时，随后裂解并且使用链霉亲合素琼脂糖珠分离生物素化蛋白质。解析分离的蛋白质并用抗TrkB抗体进行免疫印迹。注意：对照，在培养基变化的情况下未处理的零时间对照。
图1B：BDNF和1G11诱导的TrkB细胞表面水平随时间作为总细胞TrkB的比例。在37℃如所示用0.8nM BDNF或7.3nM 1G11处理培养的大鼠皮质神经元(体外7天)。通过光密度测定分析测定TrkB与总TrkB相比的相对表面水平。表面TrkB与总TrkB的比率显示为与在零时间点时未处理的对照相比的倍数变化。
图2：显示具有不同性质的TrkB激动剂抗体的代表性数据：增强剂和非竞争剂(3A3、1G11、8E5)，竞争剂(5D11)，非竞争剂(2A1、3A4、5C7)。100％活性代表在饱和浓度的BDNF，即10nM EC100时的TrkB激活。
图3：基于公布的结构显示各种二级结构(β片层、环、N端“Nt”和C端“Ct”)的BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域之间的结构相互作用。
图4：BDNF/NT-4同二聚体与两个TrkB D5域和1G11之间的结构相互作用。通过丙氨酸扫描鉴定的残基显示在图4A中，并且通过共晶X射线晶体学鉴定的残基显示于图4B中。
图5：BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域和1G11的进一步结构分析显示NT-4/BDNF的N-端潜在突出到TrkB和1G11Fab的重链之间的空间中。
图6：将分子表面添加到BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域和1G11的结构分析显示VκCDR L1和L3和CDRH3与TrkB紧密相互作用，并且在TrkB和CDR H1和H2之间存在裂缝，可以设想所述裂缝潜在容纳BDNF的N端。
图7：BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域和3A3之间的结构相互作用。显示了通过丙氨酸扫描鉴定的残基，其全部位于JM区域中(D5域的C端和跨膜区的N端)。使用β链几何延伸JM残基。
图8：BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域和5D11之间的结构相互作用。显示了丙氨酸扫描鉴定的残基，其位于配体结合位点。
图9显示单独或与1G11复合的源自MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His的TrkB肽之间氘更新(deuterium update)的分数差异。
图10显示单独或与3A3复合的源自MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His的TrkB肽之间的氘更新的分数差异。
发明详述
如本文所用，“TrkB”指天然存在的内源或重组TrkB蛋白。TrkB是配体脑源性神经营养因子(BDNF)或神经营养因子-4(NT-4/NT-4/5)的受体。BDNF和NT-4均可以与TrkB结合，并可以激活许多常见的信号传导途径。非共价同二聚体配体BDNF或NT-4激活TrkB，其是受体酪氨酸激酶。激活的TrkB可以调节(a)细胞存活、(b)神经元修复和/或(c)神经元可塑性。
如上所述，TrkB-BDNF信号传导在促进中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)中细胞的存活、修复和可塑性中发挥重要作用。尽管大多数神经学病症的致病因子/机制不同，但可以经历变性的不同类型细胞的存活和功能依赖于有效的BDNF-TrkB信号传导机制。因此，预期通过使用激动剂激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径以促进细胞存活、神经元修复和神经元可塑性，从而为疾病提供区分治疗。激活TrkB可以介导中枢和外周作用机制两者。
报告了BDNF水平在许多神经学疾病和病理生理学疾病中下降，并且表型/缺陷可归因于此种下降。在TrkB受体水平保持不变的BDNF缺陷病理生理状况下，如果施用的治疗剂可以：(i)激活(激动)TrkB，(ii)不与降低的BDNF水平竞争，(iii)增强由降低的BDNF生理水平诱导的细胞信号传导，和/或(iv)维持TrkB的细胞表面水平(其在其它情况下可以潜在导致对治疗剂的暂时脱敏)，则仍可以引起生理细胞/系统应答。
在本发明的上下文中，术语“TrkB结合激动剂”指在不存在BDNF或NT-4的情况下激动或激活人全长TrkB(具有SEQ ID NO:2所示序列)的分子。当TrkB结合激动剂与受体结合时，它可以产生与天然配体BDNF/NT-4相似的生物学效应。TrkB是受体酪氨酸激酶，因此引发多种细胞信号传导途径。激动可以通过激活TrkB来测量，包括测量增加的TrkB磷酸化水平(pTrkB)、增加的Akt磷酸化水平(p-Akt)、增加的Erk磷酸化水平(p-Erk)和/或增加的Creb磷酸化水平(p-CREB)。例如，TrkB结合激动剂可以在不存在BDNF或NT-4的情况下激活TrkB受体，导致相对于BDNF最大响应(设定为100％)，至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的pTrkB水平。在一个实施方案中，TrkB结合激动剂可以在不存在BDNF或NT-4的情况下激活TrkB受体，导致相对于NT-4最大响应(设定为100％)，至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的pTrkB水平。
亲和力是一个分子(例如TrkB结合激动剂)与另一种(例如其靶抗原)在单个结合位点处结合的强度。可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORETM分析)来测定TrkB结合激动剂对TrkB的结合亲和力。例如，实施例1.1中描述的BiacoreTM法(和表1中的数据)可以用于测量结合亲和力。
本发明的某些TrkB结合激动剂对于人TrkB或(KD)人TrkB ECD表现出100nM或更小、50nM或更小、25nM或更小、或10nM或更小的平衡解离常数。KD数值越小，结合力越强。KD的倒数(即1/KD)是具有单位M-1的平衡结合常数(KA)。技术人员会理解，KA数值越大，结合越强。解离速率常数(kd)或“koff”描述了TrkB结合激动剂:TrkB复合物的稳定性，即每秒衰变的复合物分数。例如，某些TrkB激动剂与人TrkB或人TrkB ECD之间的解离速率常数koff为10x10-4/s或更小、9x10-4/s或更小、8x10-4/s或更小、7x10-4/s或更小、6x10-4/s或更小、5x10-4/s或更小、或4x10-4/s或更小。结合速率常数(ka)或“kon”描述了TrkB结合激动剂:TrkB复合物形成的速率。例如，某些TrkB激动剂与人TrkB或人TrkB ECD之间的结合速率常数kon为3x104/Ms或更多、4x104/Ms或更多、5x104/Ms或更多、6x104/Ms或更多、或7x104/Ms或更多。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂特异性结合全长人TrkB并且不结合人TrkA或人TrkC或人p75NTR。术语“特异性结合”意指TrkB结合激动剂与TrkB结合，而与其它(例如，无关)蛋白质不结合或无显著结合。本文所述的TrkB结合激动剂可以以比其结合TrkA、TrkC和/或p75NTR大至少10、25、50、100、或1000倍的亲和力结合TrkB。会理解的是，这区分这些TrkB结合激动剂与BDNF，其可以激活TrkB和p75NTR两者(其促进细胞死亡)。
本发明的某些TrkB激动剂增强BDNF诱导的和/或NT-4诱导的TrkB激动。“增强”在本文中用于指在TrkB激动剂存在下BDNF诱导的激动和/或NT-4诱导的TrkB激动更有效。可以通过评估TrkB的激活，例如细胞信号传导来测量BDNF诱导的激动。可以使用BDNF或NT-4的饱和浓度(即EC100)来对缺乏TrkB结合激动剂情况下每种配体的TrkB的100％激活设立基准。BDNF诱导的激动的增强可以定义为在TrkB结合激动剂和饱和浓度(EC100)的BDNF存在下，BDNF诱导的TrkB激活超过100％。可以使用的BDNF的饱和浓度是10nM(EC100)。在一个实例中，TrkB的100％激活代表在10nM EC100使用BDNF的TrkB激活。NT-4诱导的激动的增强可以定义为在存在TrkB结合激动剂和饱和浓度(EC100)的NT-4的情况下NT-4诱导的TrkB激活超过100％。可以通过测定TrkB的磷酸化(pTrkB)水平来测量TrkB的激活。与在不存在TrkB结合激动剂的情况下为100％相比，在饱和浓度的BDNF存在下TrkB的磷酸化在存在TrkB结合激动剂的情况下可以为至少110％。例如，与在不存在TrkB结合激动剂的情况下为100％相比，在饱和浓度的BDNF存在下TrkB的磷酸化在TrkB结合激动剂存在下可以是至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、或者至少150％。在存在TrkB结合激动剂的情况下和在存在饱和浓度的BDNF的情况下，pTrkB水平可以为约130％。在存在TrkB结合激动剂的情况下和在存在饱和浓度的BDNF的情况下，pTrkB水平可以为约160％。在存在TrkB结合激动剂的情况下和在存在饱和浓度的BDNF的情况下，pTrkB水平可以为约120％。
应当注意的是，尽管仅可以在存在饱和浓度的BDNF的情况下在体外测量增强效应，但是认为此饱和浓度的BDNF在临床背景中不是必需的。假设TrkB结合激动剂的增强效果应当在任何浓度的BDNF时存在。在TrkB受体水平保持不变的BDNF缺陷病理生理学条件下，如果TrkB结合激动剂可以增强由降低的BDNF生理水平诱导的细胞信号传导，则生理学应答将是有益的。
本发明的某些TrkB激动剂维持细胞表面上的TrkB水平。激活的酪氨酸激酶受体通常经历胞吞作用，然后降解，导致细胞表面受体的下调，从而变得对配体暂时不响应以维持细胞稳态，这对于BDNF对TrkB的激活效应就是如此。在存在激动剂的情况下，TrkB结合激动剂可以随时间维持TrkB的细胞表面水平。例如，可以将TrkB的细胞表面水平维持至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时或至少10小时。在存在激动剂的情况下，TrkB结合激动剂可以随时间增加TrkB的细胞表面水平。例如，可以将TrkB的细胞表面水平增强至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时或至少25小时。TrkB结合激动剂可以增加TrkB的可用细胞表面水平以被激动剂激活；和/或(b)抑制激活的TrkB受体内吞和降解。在TrkB受体水平保持不变的BDNF缺陷病理生理条件下，如果治疗性TrkB结合激动剂可以激活TrkB而不改变TrkB的细胞表面水平(其在其它情况下可以潜在地导致对TrkB激动剂的暂时脱敏)，则生理应答将是有益的。
某些TrkB结合激动剂不与BDNF和/或NT-4竞争结合TrkB。TrkB结合激动剂与BDNF或NT-4之间的竞争可以通过评估TrkB激活的功能测定法来测定，例如通过在存在或不存在BDNF或NT-4的这两种情况下测量TrkB结合激动剂通过TrkB磷酸化对TrkB的激活作用进行。在一个实施方案中，在饱和BDNF浓度(例如10nM，EC100)存在下，不与BDNF竞争的TrkB结合激动剂在增加浓度的激动剂时不引起TrkB磷酸化的改变。在存在饱和BDNF浓度(例如10nM，EC100)的情况下，确实与BDNF竞争的TrkB结合激动剂会在增加浓度的激动剂时引起TrkB磷酸化减少。在一个实施方案中，TrkB结合激动剂不与BDNF竞争，其中存在激动剂和饱和浓度(EC100)BDNF的情况下磷酸化TrkB的总水平与单独存在饱和浓度的BDNF的情况下磷酸化TrkB的水平相似。即总pTrkB(EC100BDNF+激动剂)≈总pTrkB(EC100BDNF)。类似地，在一个实施方案中，TrkB结合激动剂不与NT-4竞争，其中存在激动剂和饱和浓度(EC100)NT-4的情况下磷酸化TrkB的总水平与单独存在饱和浓度的NT-4的情况下磷酸化TrkB的水平相似。即总pTrkB(EC100NT-4+激动剂)≈总pTrkB(EC100NT-4)。认为磷酸化TrkB的水平相似，其中在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB在范围内(在存在饱和水平的BDNF或NT的情况下测量的平均总pTrkB±3个标准差)。在一个实施方案中，在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB在范围内(在存在饱和水平BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB±2个标准差)。在另一个实施方案中，在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB在范围内(在存在饱和水平BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB±1个标准差)。在前述实施方案中，基于至少三个读数计算磷酸化pTrkB的平均总水平，并且使用两个标准差中的较大者(即在存在激动剂的情况下计算的标准差和在不存在激动剂的情况下计算的标准差)。在另一个实施方案中，认为磷酸化的TrkB水平是相似的，其中在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB和在存在饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB 4相差小于10％。在另一个实施方案中，认为磷酸化的TrkB水平是相似的，其中在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB和在存在饱和水平的BDNF或NT-4的情况下测量的平均总pTrkB相差小于5％。不与BDNF或NT-4竞争结合TrkB的TrkB结合激动剂在临床背景中是有益的，因为TrkB激动剂可以激活TrkB并且不与降低的BDNF(或NT-4)水平竞争。因此，除了TrkB结合激动剂之外，BDNF和NT-4可以继续发挥生理作用。
或者，可以通过竞争性ELISA、FMAT或BIAcore测定法测定TrkB结合激动剂和BDNF或NT-4之间的竞争，所述BIAcore测定法设计用于测试TrkB结合激动剂和BDNF是否结合相同或重叠的表位，是否存在结合的空间抑制，或第一分子的结合是否诱导TrkB中的构象改变，所述构象改变阻止或降低第二分子的结合。TrkB结合激动剂与BDNF或NT-4之间竞争结合TrkB可以是无或最小的(即部分的)。在一个实施方案中，可以将TrkB-ECD固定在芯片表面上，并将BDNF或NT-4注射到流动池中。然后注射TrkB结合激动剂，并评估其在存在BDNF或NT-4的情况下对TrkB-ECD的结合能力。竞争可以分类为：在小于20％TrkB激动剂结合的情况下为“无”；在20-60％TrkB激动剂结合的情况下为“部分”；和在超过60％的TrkB激动剂结合的情况下为“是”。
本发明的某些TrkB结合激动剂可以显示人TrkB和来自另一物种的TrkB之间的交叉反应性。例如，TrkB结合激动剂特异性结合人、鼠、大鼠和猕猴TrkB。这是特别有用的，因为药物开发通常需要在药物在人中测试之前在小鼠系统中测试先导药物候选物。提供能结合人、鼠、大鼠和猕猴物种的药物允许在这些系统中测试结果并且使用相同药物对数据进行并排比较。这避免了需要找到例如针对小鼠TrkB起作用的药物和针对人TrkB起作用的不同药物的复杂性，并且也避免了使用不同药物比较结果的需要。某些TrkB结合激动剂在人和大鼠TrkB的磷酸化中表现出小于或等于5倍的EC50差异，或小于或等于2倍的EC50差异。某些TrkB结合激动剂在人和小鼠TrkB的磷酸化中表现出小于或等于5倍的EC50差异，或小于或等于2倍的EC50差异。某些TrkB结合激动剂在人和猕猴TrkB的磷酸化中表现出小于或等于5倍的EC50差异，或小于或等于2倍的EC50差异。在一个实施方案中，EC50值是至少3次实验的平均值。
TrkB结合激动剂可以结合TrkB表位，所述TrkB表位紧邻TrkB的BDNF结合位点，特别是接近结合配体N-端的特异性斑块(patch)。TrkB结合激动剂可以结合TrkB并增强或稳定BDNF和TrkB(激动剂:配体:受体的三聚复合物)之间的进一步结合。TrkB结合激动剂可以是TrkB-BDNF增强剂，其与BDNF是非竞争的。TrkB结合激动剂可以结合包含在TrkB的D5域和/或TrkB的近膜(JM)区域内的特定表位；和/或与参考抗体竞争与TrkB的结合。与这些表位结合可能稳定活性构象的TrkB。TrkB激动剂可以(a)增加TrkB的可用细胞表面水平；和/或(b)抑制激活的TrkB受体内吞作用和降解。
因此，描述了TrkB结合激动剂：(i)在不存在BDNF的情况下激活TrkB，(ii)不与BDNF竞争，(iii)增强BDNF诱导的或NT-4诱导的TrkB激动，和/或(iv)维持TrkB的细胞表面水平。
TrkB一级氨基酸序列在小鼠、大鼠、猕猴和人中高度保守(全长序列间95％)，并且在胞外域(TrkB-ECD)中特别保守。TrkB-ECD包括5个域(D1-D3:C32-C194；D4:G195-V283；D5:H284-G380)和短的近膜JM区域(W381-H430)。TrkB的D5域可以替换全长TrkB以与配体(BDNF/NT-4)结合。在TrkB的配体结合域(LBD)内有两个接触区域：“保守斑块”和“特异性斑块”。在保守斑块中TrkB D5的接触残基来自AB、C’D和EFβ折叠之间的环以及D5域的C端。TrkB的保守斑块与配体(BDNF/NT-4)的茎结合。特异性斑块中TrkB D5的接触残基来自ABEDβ片层层的外表面。TrkB的特异性斑块结合配体(BDNF/NT-4)的N-端，其在无配位的形式为无序的(disordered)，并在与TrkB结合后变得有序。
术语“表位”的大多数定义规定表位是与结合蛋白，如TrkB激动剂接触的抗原部分(参见例如Essential Immunology，第六版，Blackwell Scientific Publishing，1988，Roitt编，第4章)。其它定义指被结合蛋白结合的抗原部分。术语“接触”和“结合”可以暗示表位应当适当地仅由通过非共价相互作用如静电(氢键键合、离子)、范德华力，π-效应和氢键与抗体或片段直接相互作用的残基组成。根据此类严格解释，表位不会包括不相互作用但是在其它方面对于抗原和结合蛋白之间的相互作用关键的残基。例如，可以要求抗原中的某些残基是非常小的(例如甘氨酸)，以允许促进抗原的其它残基和抗体(或片段)之间的直接相互作用所需要的紧密相互作用。类似地，抗原序列可以需要某些残基(例如脯氨酸)来采取正确的构象以允许结合。
实际上，通常为了鉴定“表位”信息而进行的大多数技术未(并且不能)区分相互作用的残基和在其它方面关键的残基。以下技术是常用的：
1.抗体或其片段与源自抗原的肽的结合(其中认为表现出显著结合的肽含有“表位”)。
2.氢氘交换(其中认为与未复合的抗原相比对氘掺入有抗性的源自复合抗原的肽含有“表位”))
3.诱变研究(例如丙氨酸扫描诱变，其中抗原中显著改变与结合蛋白的结合的突变位置视为形成“表位”的部分)。
如技术人员显而易见的是，仅具有原子水平分辨率(例如X射线晶体学、NMR、电子显微术)的技术能够区分相互作用的残基和其它方面重要的残基。然而，尽管这些是能够根据严格定义提供关于表位的信息的唯一技术，但认为其它技术仍然提供关于对于与靶物的结合重要的残基/序列的有用信息。
实施例中描述的TrkB结合激动剂1G11具有如下几种期望的性质：
1.增强BDNF诱导的和NT-4诱导的激动
2.维持TrkB的细胞表面水平
3.与猕猴TrkB的交叉反应性
通过X射线晶体学已显示1G11紧密接近残基T288、F291、K372和E293。T288和T291位于D5β片层A；E293位于D5β片层A和A’之间；K372位于D5β片层G中。例如，TrkB结合激动剂可以结合包含残基T288、F291、K372、E293、F285、T290和D370的表位。F285和T290位于D5β片层A中。D370位于D5β片层G中。因此，“表位”看起来包含在β片层A和G，以及TrkB的D5域的β折叠A和A’之间的区域内。可以预期接触此相同“表位”的其它TrkB结合激动剂具有相似的生物学活性。此类结合蛋白将是高度期望的。
因此，在一个实施方案中，TrkB结合激动剂可以：
a)与人TrkB的一个或多个以下残基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341；
b)以小于或等于接近选自下组的来自人TrkB的残基：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、和S375；
c)结合人TrkB胞外域，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372(根据全长人TrkB编号)；
d)结合人TrkB并导致源自含有残基284-291(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
e)结合具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的肽。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂可以与人TrkB的一个或多个、两个或更多、或三个或更多个以下残基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341。在一个实施方案中，本发明提供了与Glu293和任选与选自下组的一个或多个，或两个或更多个其它残基相互作用的TrkB结合激动剂：Thr290、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341。在另一个实施方案中，本发明提供了与Thr290和Glu293或Glu293和Ser294或Thr290、Glu293和Ser294相互作用的TrkB结合激动剂。
在以上实施方案中，相互作用可以是经由水的间接相互作用或直接相互作用。在一个实施方案中，相互作用是直接相互作用。在本发明的背景下，直接相互作用是TrkB结合激动剂与全长人TrkB的命名残基之间的氢键。然而，应当注意的是，关于相互作用残基的信息不需要源自全长人TrkB。例如，可以使用人TrkB胞外域或人TrkB的D5-JM域。可以通过任何能够进行原子水平分辨的技术来鉴定相互作用残基。在一个实施方案中，通过X射线晶体学来鉴定相互作用残基。
在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其以小于或等于 接近选自下组的来自人TrkB的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个残基：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375。在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其以小于或等于接近Glu293以及任选地一个或多个，或两个或更多个选自下组的其它残基：T288、I289、T290、F291、L292、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、和S375。在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其以小于或等于接近Thr290和Glu293、或Glu293和Ser294、或Thr290、Glu293和Ser294。在上述实施方案中，可以在由能够进行原子水平解析的任何技术，例如X射线晶体学鉴定的结构上进行接近性分析(proximity analysis)。TrkB的残基按照它们在全长人TrkB中编号。然而，应当注意，关于与TrkB结合激动剂的接近性的信息不需要源自全长人TrkB。例如，可以使用人TrkB胞外域或人TrkB的D5-JM域。
在一个实施方案中，本发明提供结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372(根据全长人TrkB编号)。在一个实施方案中，本发明提供结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：E210、T288、F291、E293、D370和K372。在一个实施方案中，本发明提供了结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：F291和E293。可以通过任何合适的方法，例如SPR或ELISA评估结合。可以对TrkB加标签(例如生物素化)以促进结合测定，但是可以不将其序列延长额外的氨基酸。术语“改变的亲和力”指当与人野生型TrkB胞外域相比时，TrkB结合激动剂表现出对突变形式的显著降低或实质性增加的亲和力。亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去1个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去2个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在另一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去3个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少3倍。在另一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少5倍。在又一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少10倍。亲和力的实质性降低是基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上1个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性降低是基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上2个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上3个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少3倍。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少5倍。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少10倍。在一个实施方案中，改变的亲和性指降低的亲和力。
在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合蛋白，所述TrkB结合蛋白结合人TrkB，并导致源自含有残基284-291(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更有抗性。在一个实施方案中，在稀释至氘化缓冲液后15至300秒之间的时间点(例如15、60或300秒之一)评估对氘掺入的抗性。
虽然来自丙氨酸扫描诱变和X射线晶体学的数据指向1G11的不连续表位，但注意到大多数相互作用似乎在该不连续表位的最N端部分。这也是受到最强烈保护而免于氢氘交换的部分。由于此原因，预期仅与1G11表位的此N端区域结合的结合蛋白可以具有与1G11相似的性质。因此，在一个实施方案中，本发明提供了结合具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的肽(包含抗体1G11的不连续表位的N端区域的肽)的TrkB结合激动剂。在此上下文中，术语“结合”需要结合响应实质上大于对源自人TrkB胞外域的等同长度的任何非重叠肽观察到的结合响应。可以通过任何合适的方法，例如ELISA评估结合。可以对肽加标签(例如生物素化)以促进结合测定，但是可以不将序列延长额外的氨基酸。应当注意，结合具有规定序列的肽的要求不一定指结合蛋白可以不与此序列外的残基相互作用，或者例如保护它们免受例如氘摄取，条件是实现“全部或全无”结合响应(即由具有SEQ ID NO:71所示的序列的肽实现的结合水平实质性大于由其它非重叠TrkB肽实现的水平)。在本发明的上下文中，实质性更大的结合响应指下述情况，其中基于至少三个读数含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去1个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在一个实施方案中，基于至少三个读数含有SEQ ID NO:71所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去2个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:71所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去3个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:71所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少3倍。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:71所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少5倍。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:71所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少10倍。
结合相似表位的1G11和TrkB结合激动剂可以结合位于TrkB D5上的表位，其在BDNF/NT4“保守斑块”配体结合位点(AB、C’D和EFβ片层之间的环，以及D5域的C-端)近端，并且接近BDNF/NT4“特异性斑块”配体结合位点(ABEDβ片层的外部面)。BDNF的N-端潜在突出到TrkB和这些TrkB结合激动剂之间的空间中。除了与TrkB结合之外，此类TrkB结合激动剂可能能够与BDNF的N端相互作用，从而可能稳定三元复合物，导致BDNF功能应答的增强。或者，此类TrkB结合激动剂可以通过不在配体结合域处结合，但是与其接近来稳定TrkB与BDNF之间的相互作用。
实施例中描述的TrkB结合激动剂3A3和8E5也能够增强BDNF诱导的激动。丙氨酸扫描诱变鉴定出对于3A3结合至关重要的TrkB中的某些残基。由于3A3和8E5共享某些特性并竞争与TrkB的结合，因此认为它们可以具有重叠的“表位”。基于3A3的数据，“表位”包含残基E398、Y397、D399、Y400、D394、和I396。例如，TrkB结合激动剂可以结合包含残基E398、Y397、D399、和Y400的表位。例如，TrkB结合激动剂可以结合包含残基E398、Y397、D399、Y400、D394、I396、V395、N389、和T402的表位。这些残基落入近膜(JM)区域(W381-H430)中。JM区域在没有任何晶体结构的情况下假定为长的柔性连接区域。认为JM区域对于与配体的结合也可能是重要的。可以预期接触此相同“表位”的其它TrkB结合激动剂具有相似的生物学活性。此类结合蛋白将是非常期望的。
因此，在一个实施方案中，TrkB结合激动剂可以：
a)结合人TrkB胞外域，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402；
b)结合人TrkB并导致源自含有残基385-398(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
c)结合具有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的肽。
在一个实施方案中，本发明提供了结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402(根据全长人TrkB编号)。在一个实施方案中，本发明提供结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：D394、I396、Y397、E398、D399和Y400。在一个实施方案中，本发明提供结合人TrkB胞外域的TrkB结合激动剂，其中选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：Y397、E398、D399和Y400。可以通过任何合适的方法，例如SPR或ELISA评估结合。可以对TrkB加标签(例如生物素化)以促进结合测定，但是可以不将其序列延长额外的氨基酸。术语“改变的亲和力”指当与人野生型TrkB胞外域相比时，TrkB结合激动剂对突变形式表现出实质性降低的或实质性增加的亲和力的情况。亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去1个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去2个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在另一个实施方案中，亲和力的实质性增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD减去3个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的显著增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少3倍。在另一个实施方案中，亲和力的显著增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少5倍。在另一个实施方案中，亲和力的显著增加是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD小至少10倍。亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上1个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上2个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD大于或等于基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD加上3个标准差(应当使用野生型或突变形式的标准差中的较大者)。在一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少3倍。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少5倍。在另一个实施方案中，亲和力的实质性降低是其中基于至少三个读数测量的突变形式的平均KD比基于至少三个读数测量的人野生型TrkB胞外域的平均KD大至少10倍。在一个实施方案中，改变的亲和性指降低的亲和力。
在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合蛋白，其结合人TrkB并导致源自含有残基385-398(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性。在一个实施方案中，在稀释到氘化缓冲液后15至60秒之间的时间点(例如15或60秒之一)评估对氘掺入的抗性。
在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其结合具有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的肽(含有通过丙氨酸扫描诱变鉴定为对于结合抗体3A3重要的所有残基的近膜区内的肽)。在此上下文中，术语“结合”要求结合响应实质性大于对源自人TrkB胞外域的等同长度的任何非重叠肽观察到的结合响应。可以通过任何合适的方法，例如ELISA评估结合。可以对肽加标签(例如生物素化)以促进结合测定，但是可以不将序列延长额外的氨基酸。在一个实施方案中，肽可以具有SEQ ID NO:70所示的序列(较小的肽，仍含有通过丙氨酸扫描诱变鉴定为对于结合抗体3A3重要的残基)。应当注意，结合具有规定序列的肽的要求不一定意味着结合蛋白可以不与此序列外的残基相互作用，或者例如保护它们免受例如氘摄取，条件是达到“全部或全无”结合响应(即，由具有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽实现的结合水平实质性高于由其它非重叠TrkB实现的水平)。在本发明的上下文中，实质性更大的结合响应指下述情况，其中基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去1个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去2个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD小于或等于基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD减去3个标准差(使用对任何肽观察到的最大标准差)。在一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少3倍。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少5倍。在另一个实施方案中，基于至少三个读数，含有SEQ ID NO:69(或70)所示的序列的肽的平均KD比基于至少三个读数测量的非重叠TrkB肽的平均KD低至少10倍。
尽管TrkB JM区表位似乎与TrkB D5表位不同，但重要的是注意TrkB结合激动剂1G11、3A3和8E5可以(至少部分)彼此竞争与TrkB的结合，因此表位可以是重叠。可能的是，近膜(JM)区域的长柔性接头可以实际上非常接近D5β片层A和G以及β片层A和A’之间的区域。可能的是当结合JM区表位的TrkB结合激动剂时，它与BDNF具有一些额外的相互作用(例如通过配体的N端)，和/或类似地稳定受体加配体加激动剂的三元复合物。令人感兴趣的是，近膜区中的残基D394、I396和Y400赋予人TrkB受体特异性，因为这些残基在大鼠TrkB(分别为Glu、Leu、Trp)中不同。可能的是结合相同区域但做出不同接触的其它TrkB结合激动剂可以表现出交叉反应性。
在一些实施方案中，TrkB上的TrkB结合激动剂表位不与BDNF配体结合域(LBD)重叠。TrkB结合激动剂可以结合TrkB上的表位，其允许BDNF与TrkB结合以形成三元复合物(TrkB激动剂结合激动剂+TrkB+BDNF)。
TrkB上的某些TrkB结合激动剂表位可以同与参考抗体结合的TrkB上的表位重叠。在一个实施方案中，本发明提供了与参考抗体竞争结合TrkB的TrkB结合激动剂。在一个实施方案中，TrkB结合激动剂与参考抗体竞争与TrkB的结合，并且不与BDNF竞争与TrkB的结合。参考抗体可以具有(a)SEQ ID NO:27的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或(b)SEQID NO:29的重链序列和SEQ ID NO:30的轻链序列；或(c)SEQ ID NO:31的重链序列和SEQID NO:32的轻链序列。
TrkB结合激动剂可以激动TrkB的细胞信号传导以增强(a)细胞存活，(b)神经元修复和/或(c)神经元可塑性。与不存在激动剂相比，增强是在存在激动剂的情况下改善的生物学功能或响应。
“细胞存活”包括维持或促进表达TrkB的细胞的生长。TrkB在中枢(CNS)和周围神经系统(PNS)中均有表达。在CNS中，在脑皮层、海马、丘脑、脉络丛和小脑、脑干、视网膜和脊髓的颗粒层中表达高水平的TrkB。在PNS中，在颅神经节、前庭系统、下颌下腺和背根神经节中表达TrkB。TrkB在胎儿脑中广泛表达。TrkB也在其它组织如骨骼肌、肾和胰腺中表达。TrkB也在迈斯纳小体(Meissner corpuscle)中表达。在中枢神经系统(CNS)中和骨骼肌中的神经肌肉接口处激活TrkB可以调节脑和脊髓运动神经元存活和祖肌细胞分化。在一个实例中，细胞存活包括神经元细胞存活。
例如，本发明的TrkB结合激动剂可以促进神经元存活，例如稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞系的存活。TrkB结合激动剂1G11、人源化1G11、8E5和3A3可以以浓度依赖性方式促进细胞(在稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞系中)的存活，平均EC50为0.006-0.025nM。
TrkB结合激动剂可以激活大鼠脑和/或脊髓衍生的神经元，小鼠脑衍生的神经元中内源表达的TrkB受体，和/或在CHO细胞中重组表达的猕猴TrkB受体。
TrkB可以调节神经元修复，包括轴突再生和生长、神经突长出、神经髓鞘形成的速率和程度以及肌肉再生。修复可以是生理性的以维持体内稳态(即响应生物学输入维持平衡)，或由于损伤和/或损害。例如，TrkB结合激动剂可以诱导神经突长出，例如稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞系中的神经突长出。TrkB结合激动剂1G11、人源化1G11和8E5以浓度依赖性方式诱导神经突长出(在稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞系中)，平均EC50为0.07-1.58nM。
TrkB可以调节神经元可塑性(神经可塑性)，包括突触可塑性和非突触可塑性两者。神经元可塑性指由于行为、环境、神经过程、思维、情绪以及由损伤和/或损害引起的变化而引起的神经途径和突触的变化。例如，TrkB可以调节突触可塑性功能。在中枢神经系统(CNS)中和骨骼肌中的神经肌肉接口处激活TrkB可以稳定神经肌肉接合(NMJ)，并调节NMJ处的乙酰胆碱(ACh)传递。
TrkB结合激动剂可以是肽、多肽、蛋白质、RNA适体或多糖。例如，TrkB结合激动剂是抗原结合蛋白。如本文所用，术语“抗原结合蛋白”指抗体，以及或者能够结合TrkB的抗体形式。
术语“抗体”在本文中以最广泛使用，指具有免疫球蛋白样域的分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，并且包括单克隆抗体、重组抗体、合成抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、多特异性抗体，包括双特异性抗体和异缀合抗体；单可变域、抗原结合抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、单链Fv、二硫化物物连接的scFv、双抗体，TANDABTM等)和任何前述项的修饰形式。在一个实施方案中，抗体具有IgG或IgA支架。在一个实施方案中，抗体具有IgG支架，其可以是四链或双链抗体。IgG支架可以包含抗体的一些或全部域(即CH1、CH2、CH3、VH、VL)。抗原结合蛋白可以包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG支架。例如，支架可以是IgG1。支架可以由抗体的Fc区或其部分组成或包含抗体的Fc区或其部分。TrkB结合激动剂可以包含失能(disabled)的Fc区。例如，Fc区可以修饰为具有突变L235A和G237A(EU编号)。Fc区的此种修饰减少了抗体与Fcγ受体和C1q的结合，因此降低了抗体通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导TrkB阳性细胞消耗的潜力。这通常描述为Fc失能。应当注意的是，Fc效应器功能对于TrkB结合激动剂的生物学功能并不重要。
术语“域”指不依赖于蛋白质的剩余部分保留其三级结构的折叠蛋白质结构。通常，域对蛋白质的离散功能性质负责，并且在许多情况下可以添加、除去或转移至其它蛋白质，而不丧失蛋白质和/或域的剩余部分的功能。术语“单可变域”指包含抗体可变域特征性序列的折叠多肽域。因此，它包括完整的抗体可变域如VH、VHH和VL以及经修饰的抗体可变域，例如其中一个或多个环已经替换为抗体可变域非特征性的序列，或已经截短或包含N或C端延伸的抗体可变域，以及至少保留全长域的结合活性和特异性的可变域的折叠片段。能够不依赖于不同可变区或域结合抗原或表位的单可变域可以称为“域抗体”或“dAb(TM)”。单可变域可以是人单可变域，但也包括来自其它物种的单可变域，如啮齿类、铰口鲨(nurseshark)和骆驼科动物(Camelid)VHHdAbsTM。骆驼科动物VHH是免疫球蛋白单可变域多肽，其源自包括骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰驼(dromedary)和大羊驼(guanaco)的物种，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。此类VHH域可以根据本领域可用的标准技术人源化，并且认为此类域是“单可变域”。如本文所用，VH包括骆驼科动物VHH域。
另一种抗体形式是其中TrkB结合激动剂的CDR排列在合适的非免疫球蛋白支架或骨架上的抗体形式。非免疫球蛋白支架可以源自下组：CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocalin)、蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z域(Affibody，SpA)、A域(Avimer/Maxibody)的Z域；热休克蛋白如GroE1和GroES；转铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C型凝集素域(Tetranectin)；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ域；LDL受体A类域；EGF域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型域；和纤连蛋白/adnectin。
1G11TrkB结合激动剂的HC和LC域分别在SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中列出。人源化1G11TrkB结合激动剂的VH和VL域分别在SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中列出。
“CDR”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。
SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO 41的CDR区可以通过任何编号惯例，例如Kabat、Chothia、AbM和接触惯例来定义。由每种方法定义的SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO 41的CDR区在表1中列出。注意到，除了通过接触方法定义的CDRH2之外，小鼠1G11和人源化1G11的CDR序列是相同的。在整个说明书中，根据Kabat编号惯例对氨基酸残基进行编号。
表1
1G11TrkB结合激动剂互补位和推测人源化1G11TrkB结合激动剂互补位中的主要结合残基在CDR L1(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：RASQ N LH/SEQ ID NO:3)、L3(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：QQPLT/SEQ ID NO:5)和H3(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：GGALDY/SEQ ID NO:8)内。存在有在内接近表位的CDRH2中的仅两个残基和直接相互作用的仅一个残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：IAPGNTYNEIFKG/SEQ ID NO:7)。存在有CDRH1中接近或(间接)接触表位的唯一且单一残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：SYYIN/SEQ ID NO:6)和CDRL2中接近表位的单一残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：YVSQSIS/SEQID NO:4)。因此，从分级观点看，CDR L1、L3和H3对于结合最重要，接着是CDRH2，然后是CDRL2和CDRH1。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂包含：(a)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；(b)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和(c)如SEQ ID NO:27或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，CDRL1是如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:66，或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:66的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，CDRL1是如SEQ ID NO:3或其变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRL1内的修饰不在残基R28、S30和N32(自SEQ ID NO:28编号)中。在某些实施方案中，除了不修饰R28、S30和N32外，CDRL1内的修饰不在残基I29中或/或不在残基N31中(自SEQ ID NO:28编号)。在一个实施方案中，CDRL1如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:66中所示。在一个实施方案中，CDRL1如SEQ ID NO:3中所示。
在一个实施方案中，CDRL3是如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:68，或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:68的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，CDRL3是如SEQ ID NO:5或其变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRL3内的修饰不在残基N92和S93(自SEQ ID NO:28编号)中。在某些实施方案中，除了不修饰N92和S93外，CDRL3内的修饰不在残基N92和S93中(自SEQ ID NO:28编号)。在一个实施方案中，CDRL3如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:68中所示。在一个实施方案中，CDRL3如SEQID NO:5中所示。
在一个实施方案中，CDRH3是如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:65，或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:65的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，CDRH3是如SEQ ID NO:8或其变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRH3内的修饰不在残基R97,Y99和E100(自SEQ ID NO:27编号)中。在一个实施方案中，CDRH3如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:65中所示。在一个实施方案中，CDRH3如SEQ ID NO:8中所示。
在一个实施方案中，除了包含如上文定义的CDRL1、CDRL3和CDRH3外，TrkB结合激动剂另外包含如SEQ ID NO:27或其变体，或SEQ ID NO:40或其变体所示的CDRH2，其中变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRH2如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:59、SEQID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64，或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰.在另一个实施方案中，CDRH3如SEQ ID NO:7或其变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRH2内的修饰不在残基R50和/或残基Y57中(自SEQ ID NO:27编号)。在一个实施方案中，CDRH2如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQID NO:64中所示。在一个实施方案中，CDRH2如SEQ ID NO:7中所示。
TrkB结合激动剂可以包含CDRL1(SEQ ID NO:3)、CDRL3(SEQ ID NO:5)、和CDRH3(SEQ ID NO:8)。TrkB结合激动剂可以包含CDRL1(SEQ ID NO:3)、CDRL3(SEQ ID NO:5)、CDRH2(SEQ ID NO:7)和CDRH3(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中，除了包含如上文定义的CDRL1、CDRL3、CDRH3和CDRH2外，TrkB结合激动剂另外包含如SEQ ID NO:28或其变体所示的CDRL2，和如SEQ ID NO:27或其变体所示的CDRH1，其中变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，CDRL2如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:67、或SEQ ID NO:4或SEQID NO:67的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰.在另一个实施方案中，CDRL2如SEQ ID NO:4或其变体所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRL2内的修饰不在残基Y50中(自SEQ ID NO:28编号)。在一个实施方案中，CDRL2如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:67中所示。在一个实施方案中，CDRL2如SEQ ID NO:4中所示。
在一个实施方案中，CDRH1如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60或SEQ IDNO:62、或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:62的变体中所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，CDRH1如SEQ ID NO:6或其变体所示，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，CDRH1内的修饰不在残基Y33中(自SEQID NO:27编号)。在某些实施方案中，除了不修饰Y33外，CDRH1内的修饰不在残基S31中(自SEQ ID NO:27编号)。在一个实施方案中，CDRH1如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:62中所示。在一个实施方案中，CDRH1如SEQ ID NO:6中所示。
TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:6的CDRH1；SEQ ID NO:7的CDRH2；SEQ IDNO:8的CDRH3；SEQ ID NO:3的CDRL1；SEQ ID NO:4的CDRL2；和SEQ ID NO:5的CDRL3。
在前述实施方案中，某些CDR可以是具有多达3个氨基酸修饰的变体序列。每个修饰可以独立是取代、添加或缺失。例如变体序列可以具有1个添加、1个缺失或1个取代。在一个实施方案中，每个变体序列具有1个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，每个变体具有多达2个氨基酸修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代，例如如表2中所示。
表2：
CDR L1、L2、L3、H1和H2倾向于从结构上表现出有限数目的主链构象之一。CDR的特定的规范结构类别由CDR的长度和由环填充(loop packing)来定义，所述环填充由位于CDR和框架区两者中的关键位置处的残基(结构确定性残基或SDR)决定。使用簇分析来定义CDR组的规范类别，然后通过分析掩埋的疏水物、氢键键合残基和保守甘氨酸和脯氨酸来鉴定规范模板。可以通过比较序列与关键残基模板并使用同一性或相似性矩阵对每个模板评分来将抗体序列的CDR归入规范类别。
每个CDR、每个可变区、每个重链或轻链可以有多个变体CDR规范位置，并且因此任何取代组合可以存在于TrkB结合激动剂中，条件是维持CDR的规范结构使得激动剂能够结合TrkB。
TrkB结合激动剂CDR变体可以包含：
(a)CDRH1的变体，其具有以下任一种或组合：由I、H、F、T、N、C、E、或D取代的Y32；由V、M或W取代的I34；以及由H、E、Q、S、Y或T取代的N35；和/或
(b)CDRH2变体，其具有由L、V、T、S或N取代的I51；和/或
(c)CDRH3变体，具有由H、V、I、S、D或G取代的Y102；和/或
(d)具有以下任一种或组合的CDRL1变体：由M、V、I或F取代的L33；和由A、G、N、S、V或F取代的H34；和/或
(e)具有由A、T或G取代的V51的CDRL2变体；和/或
(f)具有以下任一种或组合的CDRL3变体：由S、G、F或L取代的Q89；由H或N取代的Q90；由P、Y、R、I、W或F取代的L96。
TrkB结合激动剂可以包含：人源化VH区或人源化重链(HC)序列；和/或人源化VL区或人源化轻链(LC)序列。
TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:40或其变体所示的VH区，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和/或如SEQ ID NO:41或其变体所示的VL区，该变体具有多达10个氨基酸修饰。TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:40或其变体所示的VH区，其变体具有多达10个氨基酸修饰；和如SEQ ID NO:41所示的VL区或其变体，该变体具有多达10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体VH区具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体VL区具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:42或其变体所示的HC，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和/或如SEQ ID NO:43或其变体所示的LC区域，该变体具有多达10个氨基酸修饰。TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:42或其变体所示的HC，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和如SEQ ID NO:43或其变体所示的LC区，该变体具有多达10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体HC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体LC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
对VH、VL、HC和LC的修饰可以独立是取代、添加或缺失，使得任何特定的变体序列可以包含取代、添加和缺失。通常，变异是取代，特别是保守取代，例如如上表2中所示。
在某些实施方案中，对VH、VL、HC和LC的修饰可以排除CDR，使得CDR是完整的并且变异位于VH、VL、HC或LC序列的剩余部分中。变体序列基本上保留了未修饰的TrkB结合激动剂的生物学特性。
TrkB结合激动剂可以包含含有与SEQ ID NO:40的序列至少80％相同的序列的VH区和/或含有与SEQ ID NO:41的序列至少76％相同的序列的VL区。在一个实施方案中，VH区包含与SEQ ID NO:40的序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一个实施方案中，VL区包含与SEQ ID NO:41至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。
TrkB结合激动剂可以包含VH区，其中位置47是Cys或Ser。TrkB结合激动剂可以包含VH区，其中位置47是Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
查询序列与主题序列之间的“百分比同一性”可以使用以百分比表示的“同一性”值来计算，所述百分比当进行成对BLASTP比对后主题氨基酸序列与查询氨基酸具有100％的查询覆盖率时通过BLASTP算法计算。可以通过使用国家生物技术研究院中心(NationalCenter for Biotechnology Institute)网站上可用的BLASTP算法的默认设置来进行查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的此类成对BLASTP比对，其中关闭低复杂性区域的滤器。
查询序列可以与主题序列100％相同，或者它可以包括与主题序列相比达到某个整数数目的氨基酸或核苷酸改变，使得如上阐述，％同一性小于100％。此类改变包括至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之间的任何位置，个别散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸中或散布在查询序列内的一个或多个连续组中。
可以在包括CDR的查询序列的整个长度上测定％同一性。或者，％同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列100％相同并且％同一性变异在查询序列的剩余部分(即SEQ IDNO:40或SEQ ID NO:41)中，使得CDR序列是固定的/完整的。或者，CDR序列如前述任一实施方案中所述，并且在查询序列的剩余部分上计算％同一性变异。变体序列基本上保留未修饰的TrkB结合激动剂的生物学特征。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含：(a)SEQ ID NO:40的VH区；和/或(b)SEQID NO:41的VL区。在一个实施方案中，本发明提供了TrkB结合激动剂，其包含：(a)SEQ IDNO:40的VH区和(b)SEQ ID NO:41的VL区。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含：(a)与SEQ ID NO:42至少90％相同的重链(HC)序列；和/或(b)与SEQ ID NO:43至少85％相同的轻链(LC)序列。在一个实施方案中，HC包含与SEQ ID NO:42的序列至少95％相同、至少97％相同、至少98％、或至少99％相同的序列。在一个实施方案中，LC包含与SEQ ID NO:42的序列至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％、或至少99％相同的序列。
TrkB结合激动剂可以包含HC区，其中位置47是Cys或Ser。TrkB结合激动剂可以包含HC区，其中位置47是Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
如上所述计算“百分比同一性”。同样，可以在查询序列的整个长度(包括CDR)上测定％同一性。或者，％同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列100％相同并且％同一性变异在查询序列的剩余部分(即SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41)中，使得CDR序列是固定的/完整的。或者，CDR序列如前述任一实施方案中所述，并且在查询序列的剩余部分上计算％同一性变异。变体序列基本上保留未修饰的TrkB结合激动剂的生物学特性。
本发明还提供了TrkB结合激动剂，其包含：(a)SEQ ID NO:42的重链(HC)序列；和/或(b)SEQ ID NO:43的轻链(LC)序列。在一个实施方案中，本发明还提供TrkB结合激动剂，其包含：(a)SEQ ID NO:42的重链(HC)序列；和(b)SEQ ID NO:43的轻链(LC)序列。
3A3TrkB结合激动剂的HC和LC域分别在SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中列出。人源化3A3TrkB结合激动剂的VH和VL域分别在SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出。
TrkB结合激动剂可以包含选自下组的CDR的任一种或组合；来自SEQ ID NO:29的CDRH1、CDRH2、CDRH3和/或来自SEQ ID NO:30的CDRL1、CDRL2、CDRL3，或CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2或3个氨基酸修饰。例如，TrkB结合激动剂可以包含1、2、3、4、5、或6个选自下组的CDR：来自SEQ ID NO:29的CDRH1、CDRH2、CDRH3，和/或来自SEQ ID NO:30的CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，特定的CDR存在于SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中，而其它CDR是存在于SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中的那些CDR的变体。在一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种以下CDR的TrkB结合激动剂：
(a)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(c)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(d)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(e)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(f)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂包含选自以下的至少两个CDR、至少三个CDR、至少四个CDR或至少五个CDR或全部六个CDR：
(a)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(c)如SEQ ID NO:30或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(d)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(e)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(f)如SEQ ID NO:29或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在涉及3A3的实施方案中，某些CDR可以是具有多达3个氨基酸修饰的变体序列。每个修饰可以独立是取代、添加或缺失。例如，变体序列可以具有1个添加、1个缺失和1个取代。在一个实施方案中，每个变体CDR可以具有1个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，每个变体序列具有多达2个氨基酸修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代，例如如上表2所示。
TrkB结合激动剂可以包含以下CDR中的任一个或组合：SEQ ID NO:12的CDRH1；SEQID NO:13的CDRH2；SEQ ID NO:14的CDRH3；SEQ ID NO:9的CDRL1；SEQ ID NO:10的CDRL2；和/或SEQ ID NO:11的CDRL3。例如，TrkB结合激动剂可以包含1、2、3、4、5或6个选自下组的CDR：SEQ ID NO:12的CDRH1；SEQ ID NO:13的CDRH2；SEQ ID NO:14的CDRH3；SEQ ID NO:9的CDRL1；SEQ ID NO:10的CDRL2；和/或SEQ ID NO:11的CDRL3。TrkB结合激动剂可以包含SEQID NO:12的CDRH1；SEQ ID NO:13的CDRH2；SEQ ID NO:14的CDRH3；SEQ ID NO:9的CDRL1；SEQ ID NO:10的CDRL2；和SEQ ID NO:11的CDRL3。
TrkB结合激动剂可以包含：人源化VH区、或人源化重链(HC)序列；和/或人源化VL区或人源化轻链(LC)序列。
TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:40或其变体所示的VH区，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和/或如SEQ ID NO:41或其变体所示的VL区，该变体具有多达10个氨基酸修饰。TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:40或其变体所示的VH区，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和如SEQ ID NO:41或其变体所示的VL区，该变体具有多达10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体VH区具有1、2 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体VL区具有1、2 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:42或其变体所示的HC，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和/或如SEQ ID NO:43或其变体所示的LC区域，该变体具有多达10个氨基酸修饰。TrkB结合激动剂可以包含：如SEQ ID NO:42或其变体所示的HC，该变体具有多达10个氨基酸修饰；和如SEQ ID NO:43或其变体所示的LC区，该变体具有多达10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体HC具有1、2 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在一个实施方案中，变体LC具有1、2 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
对VH、VL、HC和LC的修饰可以独立地是取代、添加或缺失，使得任何特定的变体序列可以包含取代、添加和缺失。通常，变异是取代，特别是保守取代，例如如上表2所示。
TrkB结合激动剂可以包含含有与SEQ ID NO:46的序列至少80％相同的序列的VH区和/或含有与SEQ ID NO:47的序列至少80％相同的序列的VL区。在一个实施方案中，VH区包含与SEQ ID NO:46的序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一个实施方案中，VL区包含与SEQ ID NO:47至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:46的VH区；和/或SEQ ID NO:47的VL区。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:46的VH区；和SEQ ID NO:47的VL区。
TrkB结合激动剂可以包含：与SEQ ID NO:48至少80％相同的重链(HC)序列；和/或与SEQ ID NO:49至少80％相同的轻链(LC)序列。在一个实施方案中，VH区包含与SEQ IDNO:48的序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。在一个实施方案中，VL区包含与SEQ ID NO:49至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:48的重链(HC)序列；和/或SEQ ID NO:49的轻链(VL)序列。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:48的重链(HC)序列；和SEQ ID NO:49的轻链(VL)序列。
在涉及3A3的实施方案中，如上所述计算“百分比同一性”。同样，可以在查询序列的整个长度(包括CDR)上确定％同一性。或者，％同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列100％相同，并且％同一性变异在查询序列的剩余部分(即SEQ ID NO:46、47、48或49)中，使得CDR序列是固定的/完整的。或者，CDR序列如前述涉及3A3的任何实施方案中所述，并且在查询序列的剩余部分上计算％同一性变异。变体序列基本上保留未修饰的TrkB结合激动剂的生物学特性。
8E5TrkB结合激动剂的HC和LC域分别在SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中列出。
TrkB结合激动剂可以包含选自下组的CDR的任一种或组合：来自SEQ ID NO:32的CDRH1、CDRH2、CDRH3和/或来自SEQ ID NO:32的CDRL1、CDRL2、CDRL3或CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2或3个氨基酸修饰。例如，TrkB结合激动剂可以包含1、2、3、4、5、或6个选自下组的CDR：来自SEQ ID NO:31的CDRH1、CDRH2、CDRH3和/或来自SEQ ID NO:32的CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，特定的CDR如存在于SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32中，而其它CDR是存在于SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32中的那些CDR的变体。在一个实施方案中，本发明提供了包含以下CDR中的一个或多个的TrkB结合激动剂：
(a)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(c)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(d)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(e)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH2，所述变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(f)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂包含选自下组的至少两个CDR、至少三个CDR、至少四个CDR或至少五个CDR或全部六个CDR：
(a)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(c)如SEQ ID NO:32或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(d)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(e)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH2，所述变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(f)如SEQ ID NO:31或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
在涉及8E5的实施方案中，某些CDR可以是具有多达3个氨基酸修饰的变体序列。每个修饰可以独立地是取代、添加或删除。例如，变体序列可以具有1个添加、1个缺失和1个取代。在一个实施方案中，每个变体CDR可以具有1个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，每个变体序列具有多达2个氨基酸修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代，例如如上表2所示。
TrkB结合激动剂可以包含以下CDR中的任何一个或组合：SEQ ID NO:18的CDRH1；SEQ ID NO:19的CDRH2；SEQ ID NO:20的CDRH3；SEQ ID NO:15的CDRL1；SEQ ID NO:16的CDRL2；和/或SEQ ID NO:17的CDRL3。例如，TrkB结合激动剂可以包含1、2、3、4、5、或6个选自下组的CDR：SEQ ID NO:18的CDRH1；SEQ ID NO:19的CDRH2；SEQ ID NO:20的CDRH3；SEQ IDNO:15的CDRL1；SEQ ID NO:16的CDRL2；和/或SEQ ID NO:17的CDRL3。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:18的CDRH1；SEQ ID NO:19的CDRH2；SEQ ID NO:20的CDRH3；SEQ ID NO:15的CDRL1；SEQ ID NO:16的CDRL2；和SEQ ID NO:17的CDRL3。
TrkB结合激动剂可以包含：人源化VH区或人源化重链(HC)序列；和/或人源化VL区或人源化轻链(LC)序列。
TrkB结合激动剂可以包含：与SEQ ID NO:31至少80％相同的重链(HC)序列；和/或与SEQ ID NO:32至少80％相同的轻链(LC)序列。在一个实施方案中，HC包含与SEQ ID NO:48的序列至少85％、至少90％、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同的序列。在一个实施方案中，LC包含与SEQ ID NO:49的序列至少85％、至少90％、至少95％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同的序列。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:31的重链(HC)序列；和/或SEQ ID NO:32的轻链(LC)序列。TrkB结合激动剂可以包含SEQ ID NO:31的重链(HC)序列；和SEQ ID NO:32的轻链(LC)序列。
在涉及8E5的实施方案中，如上所述计算“百分比同一性”。同样，可以在查询序列的整个长度(包括CDR)上确定％同一性。或者，％同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列100％相同，并且％同一性变异在查询序列的剩余部分(即SEQ ID NO:31和32)中，使得CDR序列是固定的/完整的。或者，CDR序列如前述涉及8E5的任何实施方案中所述，并且在查询序列的剩余部分上计算％同一性变异。变体序列基本上保留未修饰的TrkB结合激动剂的生物学特性。
可以通过许多常规技术中的任何一种来产生TrkB结合激动剂。例如，TrkB结合激动剂可以从天然表达它们的细胞中纯化(例如，抗体可以从产生它的杂交瘤纯化)，或者通过重组表达系统产生。通常，用编码期望TrkB结合激动剂的重组表达载体转化宿主细胞。
还描述了编码TrkB结合激动剂的一个或多个核酸序列。对于涉及1G11的实施方案，单核酸序列可以包含编码重链的SEQ ID NO:44；和/或编码轻链或SEQ ID NO:44的SEQID NO:45。或者，本发明提供了包含编码重链的SEQ ID NO:44的核酸；和/或包含编码轻链的SEQ ID NO:45的分开的核酸。在一个实施方案中，单核酸序列可以包含编码重链的SEQID NO:50；和/或编码轻链的SEQ ID NO:51。在备选实施方案中，本发明提供了包含编码重链的SEQ ID NO:50的核酸；和/或包含编码轻链的SEQ ID NO:51的分开的核酸。
还描述了包含编码TrkB结合激动剂的核酸序列的表达载体。还描述了包含核酸序列或表达载体的重组宿主细胞。宿主细胞可以是分离的宿主细胞。宿主细胞通常不是多细胞生物体(例如植物或动物)的一部分。宿主细胞可以是非人宿主细胞。可以使用一大批宿主细胞，包括原核生物(包括革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌属种(Bacillisp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)、棒状杆菌属种(Corynebacterium sp.))，真核生物，包括酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，真菌(例如曲霉属种(Aspergillussp.))或高等真核生物，包括昆虫细胞和哺乳动物来源的细胞系(例如CHO、Perc6、HEK293、HeLa，NS0)。合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞，如CHO(例如CHOK1和CHO-DG44)。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体以及克隆方法是本领域已知的。
描述了产生TrkB结合激动剂的方法，该方法包括在适合于表达核酸序列或载体的条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，将TrkB结合激动剂纯化(例如通过常规蛋白质纯化程序)。还描述了通过此方法产生的TrkB结合激动剂。因此，本发明提供了基本上同质的TrkB结合激动剂群体，其基本上不含污染物质。
在表达和产生TrkB结合激动剂后，可以发生翻译后修饰。这可以包括某些前导序列的切割、以各种糖基化模式添加各种糖部分、脱酰胺化(例如在天冬酰胺或谷氨酰胺残基处)、氧化(例如在甲硫氨酸、色氨酸或游离半胱氨酸残基处)、二硫键混乱(disulfide bondscrambling)、异构化(例如在天冬氨酸残基处)、C-末端赖氨酸剪切(例如从一个或两个重链)和N端谷氨酰胺环化(例如在重链和/或轻链中)。TrkB激动剂可以已经受到或已经经历一种或多种翻译后修饰。修饰可发生在CDR、可变框架区或恒定区中。修饰可以导致分子电荷的改变。
脱酰胺化是主要以约3:1比率将天冬酰胺(N)转化为异天冬氨酸(异天冬氨酸)和天冬氨酸(天冬氨酸)(D)的酶促反应。因此，此脱酰胺化反应与天冬氨酸(D)异构化为异天冬氨酸有关。天冬酰胺的脱酰胺化和天冬氨酸的异构化均涉及中间体琥珀酰亚胺。在小得多的程度上，以类似的方式可以用谷氨酰胺残基进行脱酰胺化。脱酰胺化可发生在CDR中、Fab(非CDR区)或Fc区中。
在生产和贮存期间(即在存在氧化条件的情况下)可以发生氧化，并导致蛋白质的共价修饰，其由活性氧物质(reactive oxygen species)直接诱导或通过与氧化应激的次生副产物反应间接诱导。氧化主要在甲硫氨酸残基的情况下发生，但可以发生在色氨酸和游离半胱氨酸残基上。氧化可以发生在CDR中、Fab(非CDR)区域中或Fc区域中。
在生产和基本贮存条件下可以发生二硫键混乱。在某些情况下，二硫键可以断裂或不正确形成，导致不成对的半胱氨酸残基(-SH)。这些游离(不成对)的硫氢基(-SH)可以促进改组(shuffling)。
重链和/或轻链中的N-末端谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(谷氨酸)(E)可能通过环化形成焦谷氨酸(pGlu)。大多数pGlu形成发生在生产生物反应器中，但它可以非酶促形成，这取决于加工和贮存条件的pH和温度。通常在天然人抗体中观察到N-末端Q或E的环化。
C-末端赖氨酸剪切是由羧肽酶催化的酶促反应，并且通常在重组和天然人抗体中观察到。此过程的变体包括由于来自重组宿主细胞的细胞酶而从一个或两个重链除去赖氨酸。将TrkB结合激动剂施用于人受试者/患者可能导致除去人体内任何剩余的C-末端赖氨酸。
在本发明中，上述一级氨基酸序列中的翻译后修饰和变化通常不导致抗原结合亲和力、生物活性、PK/PD、聚集、免疫原性或与Fc受体的结合的显著变化。
可以将TrkB结合激动剂掺入用于治疗人疾病的药物组合物中。在一个实施方案中，药物组合物包含任选地与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂和/或稀释剂组合的TrkB结合激动剂。药物组合物的实例可以包括缓冲剂、盐、氨基酸、多元醇、糖、表面活性剂、去污剂、抗氧化剂、和/或螯合剂中的一种或组合。
可以以推注或间歇(例如通过注射或通过使用持续释放配制剂)或通过连续输注来施用药物组合物。施用的路径包括但不限于静脉内、鞘内、腹膜内、皮内、皮下、表面、经鼓膜、耳蜗内、眼内、玻璃体内、肌肉内和门静脉内。药物组合物可以适用于表面施用(其包括但不限于表皮(epicutaneous)、吸入、鼻内或眼施用)或肠施用(其包括但不限于口服或直肠施用)。例如，组合物适用于静脉内或鞘内注射。在另一个实施方案中，组合物适合玻璃体内施用。
药物组合物可以包含1mg至10g的TrkB结合激动剂，例如5mg至1g的抗原结合蛋白。或者，组合物可以包含5mg至500mg，例如5mg至50mg。
施用TrkB结合激动剂的有效剂量和治疗方案可以取决于诸如患者的年龄、重量和健康状况以及待治疗的疾病等因素。药物配制剂可以是速释配制剂和持续释放配制剂。持续释放配制剂对于经鼓膜和耳蜗内递送是特别理想的。
药物组合物可以包含TrkB结合激动剂以及其它药物，任选地具有使用说明书的试剂盒。为了方便，试剂盒可以包含预定量的试剂和使用说明书。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，如灵长类，例如猕猴、绒猴或猴。在另一个实施方案中，受试者是人。
TrkB结合激动剂也可用于疗法中，例如用于治疗或预防的方法中。治疗包括减轻或减少或治愈病症的至少一个方面或症状或生物学表现。
例如，治疗包括：(1)改善病症的一种或多种生物学表现；(2)干扰(a)导致或造成病症的生物级联中的一个或多个点；或(b)疾病的一种或多种生物学表现，(3)减轻与病症相关的一种或多种症状或效应，(4)减缓病症的进展或病症的一种或多种生物学表现，和/或(5)减少病症的严重程度或病症的生物学表现的可能性。
预防包括预防性施用药物以降低病症或其生物学表现发作的可能性或延迟病症或其生物学表现发作，例如通过干扰生物学级联中导致或造成病症的一个或多个点。
TrkB结合激动剂以对于描述的方法有效的量使用。TrkB结合激动剂的治疗有效量是有效改善或减轻病症的一种或多种症状或预防或治愈病症的量。
TrkB激动剂可用于增强：细胞存活、和/或神经元修复、和/或神经元可塑性，在中枢于CNS和在外周于PNS。
TrkB激动剂可以用于治疗或预防神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径可以受益的其它病症。考虑到BDNF-TrkB途径的作用机制以及TrkB在CNS和PNS中广泛表达，TrkB结合激动剂可以为患有神经学病症、神经变性病症、发育病症和其它病症的受试者提供疗法。这些是预期TrkB激动有益的疾病。
例如，TrkB结合激动剂可以在神经肌肉接合(NMJ)处激动TrkB细胞信号传导并增强NMJ发育、稳定性和维持。TrkB结合激动剂可以激动骨骼肌中的TrkB细胞信号传导并调节骨骼肌祖细胞的增殖和分化。这可能是有益的，例如，在肌肉损伤和变性之后。TrkB结合激动剂可以激发许旺细胞(Schwann cell)中的TrkB细胞信号传导并增强轴突再生和生长。这可能是有益的，例如，在神经损伤和变性之后。
病症包括疾病、状况、综合征、症状和体征。神经学病症包括神经学病症、状况、综合征、症状和体征。神经学病症可以包括中枢和外周神经系统组成的结构或功能中有破坏的病症，所述组成包括脑、脊髓、颅神经、末梢神经、神经根、自主神经系统、神经肌肉接合和/或肌肉。神经学病症可以是表型异质的，并且通常具有未知的病因。几种机制和途径已经牵涉神经学病症如神经学疾病。在这些疾病中，特定的症状和结构/功能关系导致了对潜在病因的理解。
病症也可以通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径可以受益的病症。例如，在涉及表达TrkB的细胞的变性或功能障碍的那些病症中。
TrkB结合激动剂可用于治疗或预防本文所述的病症的方法中。更具体地，TrkB结合激动剂可用于治疗本文所述的病症的方法中。病症包括神经变性疾病、视神经病和视网膜变性状况、听觉丧失病症、精神病症、神经发育病症、体重调节病症、肌肉病症和其它CNS病症。
神经变性疾病包括：肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病(AD)、运动神经元病(包括进行性肌萎缩)、帕金森氏病、朊病毒疾病，包括克雅二氏病(CJD)、Lewy体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆(包括额颞叶痴呆)和tau病变。更特别的神经变性疾病包括ALS、亨廷顿氏病和运动神经元疾病。
在一个实例中，ALS的治疗包括促进运动神经元存活和功能。TrkB结合激动剂可以具有神经保护作用和/或神经修复作用。
在一个实例中，提及痴呆或阿尔茨海默氏病的治疗意味着：减缓认知功能衰退的进展。TrkB结合激动剂可以增强细胞存活、促进神经突长出和/或调节突触可塑性。TrkB结合激动剂可以预防或延缓阿尔茨海默氏病和其它痴呆中的神经元功能障碍。
在一个实例中，提及亨廷顿氏病的治疗意味着减缓疾病进展，包括但不限于减缓认知功能衰退的进展。TrkB结合激动剂可以增强细胞存活，促进神经突长出和/或调节突触可塑性。TrkB结合激动剂可以预防或延缓亨廷顿氏病中的神经元功能障碍。
视神经病包括例如影响视网膜神经节细胞(RGC)和/或视神经的状况。特定的视神经病包括：青光眼(例如开角型青光眼、宽角性青光眼、闭角型青光眼(急性和慢性)、正常眼压性青光眼)、前部缺血性视神经病(AION)(例如非动脉性缺血性视神经病))、后部缺血性视神经病、放射视神经病(radiationoptic neuropathy)、压迫性视神经病(例如视盘水肿)、浸润性视神经病、创伤性视神经病、线粒体视神经病、毒性视神经病、遗传性视神经病(例如常染色体显性视神经萎缩(ADOA；视神经萎缩型Kjer)，莱伯遗传性视神经病(Leberhereditary optic neuropathy)、Rosenberg Chutorian综合征、Wolfram综合征，视神经发育不全)、视神经炎(例如视神经脊髓炎，视盘炎)。视网膜变性病症包括遗传性营养不良(例如视网膜色素变性)或包括年龄相关性黄斑变性(湿性和干性)的获得性状。在一个实施方案中，视神经病包括例如影响视网膜神经节细胞(RGC)和/或视神经的状况。特定的视神经病包括：青光眼(例如开角型青光眼、宽角性青光眼、原发性闭角型青光眼、正常眼压性青光眼)、前部缺血性视神经病(AION)、非前部缺血性视神经病(NAION)、创伤性视神经病和莱伯遗传性视神经病。视网膜变性病症包括遗传性或获得性状况，包括年龄相关性黄斑变性(湿性和干性)。
听觉丧失病症包括感音神经性听觉丧失(SNHL)(双侧、单侧和未规定)和复合听觉丧失(其中存在感音神经性和传导性丧失元件；双侧、单侧和未规定)。感音神经性听觉丧失包括感觉(耳蜗相关)或神经(第8神经相关)听觉丧失。感音神经性听觉丧失可能由终末器官损害引起。与感音神经性听觉丧失相关的终末器官损害包括：听觉创伤(由于噪音大于例如85分贝(db))，病毒性淋巴迷路炎，梅尼埃尔氏病(Meniere’s disease)，第8神经的小脑桥脑角肿瘤、第8神经神经节的细菌或病毒性感染(例如耳部带状疱疹)，由急性中耳炎引起的化脓性迷路炎，化脓性脑膜炎，慢性中耳炎，突发性耳聋(包括病毒来源的突发性耳聋)，例如由病毒引起的病毒性内淋巴迷路炎，包括腮腺炎，麻疹，流感，水痘，单核细胞增多症和腺病毒，和短暂性缺血性耳聋，延伸到中耳并破裂鼓膜和可能地听骨链的颞骨骨折，影响耳蜗的骨折和听神经瘤，其一般是源自第8神经的听觉或前庭分裂的施万细胞来源的肿瘤。末端器官损伤视觉丧失可以是先天性的，诸如由下列各项引起：风疹、出生期间缺氧、由于分娩期间的创伤而流血入内耳中、施用于母体的耳毒性药物、胎儿成红细胞增多症以及遗传性状况，包括瓦尔登布尔(Waardenburg)氏综合征和赫尔勒(Hurler)氏综合征。或者，感音神经性听觉丧失可以与年龄有关，例如，老年性耳聋(presbycusis)(包括老年性聋(presbyacusia))，其是作为衰老的正常部分发生的感音神经性听觉丧失。感音神经性听觉丧失可以是耳毒性听觉丧失(影响内耳的听觉部分，特别是Corti器官的听觉丧失，其源自耳毒性药物(如某些抗生素、某些化疗剂、某些水杨酸盐化合物-特别是阿司匹林-某些利尿剂-普通袢利尿剂和某些奎宁))。还包括突发性感音神经性听觉丧失、隐性听觉丧失(hidden hearing loss)(认为源自内耳中突触和听觉纤维丧失)和耳鸣(可能源自对Corti器官的损害)。
精神病症包括：焦虑、心境障碍、抑郁(包括严重抑郁障碍)、惊恐障碍，创伤后应激障碍(PTSD)、注意缺陷多动障碍(ADHD)，双相型障碍和精神分裂症。
神经发育病症包括：Angelman综合征、Prader-Willi综合征、孤独性障碍和Rett综合征。
能量平衡取决于控制摄食行为的两个中心环路的调节：中枢神经系统(CNS)必须协调和整合食欲、寻求食物的行为和温度调节；并且与饱腹感(例如来自肠道)和整体能量平衡有关的信号必须在外围转换并反馈给CNS。因此，体重调节病症包括：神经性厌食症，恶病质，不想要的体重减轻(包括与癌症治疗有关和/或由癌症治疗引起的不想要的体重减轻)、少肌症、肥胖症和阿片样物质诱导的呕吐。
肌肉病症包括少肌症。
其它CNS病症包括：糖尿病性神经病、癫痫、多发性硬化、偏头痛、神经损伤(包括创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤和周围神经损伤)、周围神经病、神经肌肉疾病(包括重症肌无力和肌无力综合征)、睡眠障碍和中风。在一个实方案中，周围神经病包括化疗诱导的周围神经病(CIPN)。CIPN是许多抗癌药物的主要剂量限制副作用。
TrkB结合激动剂可以用作神经学病症和其它病症的治疗，其将显著减缓/阻止/延迟病症进展，增强日常生活功能并延长受试者的寿命。
在一个实施方案中，TrkB结合激动剂用于治疗以下病症中的任一种：肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、中风、脊髓损伤、阿尔茨海默氏病(AD)、运动神经元病症、创伤性脑损伤(TBI)、痴呆症、tau病变、周围神经病、神经损伤、周围神经损伤、帕金森氏病、朊病毒疾病(包括克雅氏病(CJD))、精神病症、精神分裂症、多发性硬化、Rett综合征、Lewy体病、多系统萎缩、重症肌无力、糖尿病性神经病、视网膜变性、青光眼、听觉丧失、体重调节、神经性厌食症、恶病质、神经肌肉疾病、情绪和抑郁病症、创伤后应激病症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、双相型障碍、焦虑、孤独性障碍、疼痛、涉及体重调节的病症、神经性厌食症、恶病质、不想要的体重减轻、和阿片样物质诱导的呕吐。
当用于治疗或预防上文所述的病症时，可以与一种或多种活性剂，例如批准用于治疗或预防特定病症的活性剂，更具体地认为形成目前的护理标准的试剂一起施用TrkB结合激动剂。在涵盖组合疗法的情况下，可以在一种或多种药物组合物中同时、分开或依次施用活性剂。
在本发明的TrkB结合激动剂用于治疗阿尔茨海默氏病的实施方案中，它可以与胆碱酯酶抑制剂和/或美金刚组合使用。
在本发明的TrkB结合激动剂用于治疗ALS的实施方案中，其可以与利鲁唑组合使用。
在本发明的TrkB结合激动剂用于治疗青光眼的实施方案中，其可以与以下一种或多种组合使用：前列腺素类似物、β阻滞剂、α激动剂和碳酸酐酶抑制剂。在本发明的TrkB结合激动剂用于治疗青光眼的另一个实施方案中，其可以与选择性激光小梁成形术(SLT)和氩激光小梁成形术(ALT)组合使用。
在一个实施方案中，本发明的TrkB结合激动剂可以与耳蜗植入物组合使用，作为治疗感音神经性听觉丧失的共疗法。在另一个实施方案中，本发明的TrkB结合激动剂可以与类固醇组合用于治疗感音神经性听觉丧失。在另一个实施方案中，本发明的TrkB结合激动剂可以与基因疗法例如ATOH1基因疗法组合用于治疗感音神经性听觉丧失。
在一个具体的实施方案中，将TrkB结合激动剂与耳毒性剂组合施用。技术人员将认识到，可以防止源自耳毒性剂的听觉损伤，并且可以进一步允许将更高剂量的耳毒性剂施用于患者。
本发明还具有以下实施方案：
实施方案1.TrkB结合激动剂，其中所述激动剂增强BDNF诱导的TrkB激动。
实施方案2.实施方案1的TrkB结合激动剂，其中所述激动剂不与BDNF竞争对TrkB的结合。
实施方案3.实施方案1或2的TrkB结合激动剂，其中BDNF诱导的TrkB激动的增强效果是通过与不存在TrkB结合激动剂相比在存在TrkB结合激动剂的情况下在饱和浓度的BDNF存在下增加的TrkB激活来测量的。
实施方案4.实施方案3的TrkB结合激动剂，其中增加的TrkB激活是通过增加的TrkB磷酸化水平来测量的。
实施方案5.实施方案4的TrkB结合激动剂，其中在饱和浓度的BDNF存在下TrkB的磷酸化在不存在TrkB结合激动剂的情况下为100％，相比之下在存在TrkB结合激动剂的情况下为至少110％。
实施方案6.实施方案4或5的TrkB结合激动剂，其中在饱和浓度的BDNF存在下TrkB的磷酸化在不存在TrkB结合激动剂的情况下为100％，相比之下在存在TrkB结合激动剂的情况下为至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％或至少150％。
实施方案7.TrkB结合激动剂，其不与BDNF竞争对TrkB的结合，并且结合TrkB的D5域的β片层A和G内，和β片层A和A’之间的区域中包含的表位。
实施方案8.根据实施方案7的TrkB结合激动剂，其中所述表位包含残基T288、F291、K372、和E293。
实施方案9.TrkB结合激动剂，其不与BDNF竞争对TrkB的结合，并且结合TrkB的近膜区(W381-H430)内包含的表位。
实施方案10.根据实施方案9的TrkB结合激动剂，其中所述表位包含残基E398、Y397、D399和Y400。
实施方案11.TrkB结合激动剂，其不与BDNF竞争对TrkB的结合，并且与参考抗体竞争对TrkB的结合，所述参考抗体具有：(a)SEQ ID NO:27的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或(b)SEQ ID NO:29的重链序列和SEQID NO:30的轻链序列；或(c)SEQ ID NO:31的重链序列和SEQ ID NO:32的轻链序列。
实施方案12.实施方案7-11中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述TrkB结合激动剂加强BDNF诱导的TrkB激动。
实施方案13.TrkB结合激动剂，其中所述激动剂在缺乏BDNF的情况下激活TrkB，并且维持细胞表面上的TrkB水平。
实施方案14.根据前述实施方案中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述TrkB结合激动剂不结合TrkB的配体结合域。
实施方案15.TrkB结合激动剂，其包含：
(a)(i)选自下组的CDR中的任一种或组合：来自SEQ ID NO:27的CDRH1、CDRH2、CDRH3，和/或来自SEQ ID NO:28的CDRL1、CDRL2、CDRL3；或
(ii)(i)的CDR变体，其中所述变体在每个CDR中具有1、2、或3个氨基酸修饰；或
(b)包含与SEQ ID NO:40的序列至少80％相同的序列的VH区和/或包含与SEQ IDNO:41的序列至少80％相同的序列的VL区。
实施方案16.TrkB结合激动剂，其包含以下CDR中的任一种或组合：
(a)SEQ ID NO:6的CDRH1；
(b)SEQ ID NO:7的CDRH2；
(c)SEQ ID NO:8的CDRH3；
(d)SEQ ID NO:3的CDRL1；
(e)SEQ ID NO:4的CDRL2；和/或
(f)SEQ ID NO:5的CDRL3。
实施方案17.根据实施方案15或16的TrkB结合激动剂，其中结合激动剂包含CDRL1、CDRL3、和CDRH3。
实施方案18.根据实施方案17的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂另外包含CDRH2。
实施方案19.根据实施方案15–18中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂包含：
(a)人源化VH区或人源化重链(HC)序列；和/或
(b)人源化VL区或人源化轻链(LC)序列。
实施方案20.根据实施方案15-19中任一项的TrkB结合激动剂，其中VH位置47是Cys,Ser,Gly,Ala,Val,Thr或Asn。
实施方案21.TrkB结合激动剂，其包含：
(a)SEQ ID NO:40的VH区；和/或
(b)SEQ ID NO:41的VL区。
实施方案22.根据实施方案15-21中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂包含：
(a)与SEQ ID NO:42至少80％相同的重链(HC)序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:43至少80％相同的轻链(LC)序列。
实施方案23.TrkB结合激动剂，其包含
(a)SEQ ID NO:42的重链(HC)序列；和/或
(b)SEQ ID NO:43的轻链(LC)序列。
实施方案24.根据实施方案15-23中任一项的TrkB结合激动剂，其激动人TrkB受体，不与BDNF竞争，并且加强BDNF诱导的TrkB激动。
实施方案25.根据前述实施方案中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述Fc区是失能的。
实施方案26.根据前述实施方案中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂包含合成序列、人源化序列、或嵌合序列。
实施方案27.核酸序列，其编码如前述实施方案中任一项所定义的TrkB结合激动剂。
实施方案28.根据实施方案27的核酸序列，其中所述序列包含编码重链的SEQ IDNO:44；和/或编码轻链的SEQ ID NO:45。
实施方案29.表达载体，其包含如实施方案27或28中定义的核酸序列。
实施方案30.重组宿主细胞，其包含如实施方案27或28中定义的核酸序列或如实施方案29中定义的表达载体。
实施方案31.产生如实施方案1-26中任一项所定义的TrkB结合激动剂的方法，所述方法包括在适合于表达所述核酸序列或载体的条件下培养如权利要求30的宿主细胞，从而表达并纯化TrkB结合激动剂。
实施方案32.通过实施方案31的方法产生的TrkB结合激动剂。
实施方案33.药物组合物，其包含如实施方案1-26或实施方案32中任一项所定义的TrkB结合激动剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的一种或其组合。
实施方案34.如实施方案1-26或实施方案32中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如实施方案33所定义的药物组合物，其用于治疗。
实施方案35.如实施方案1-26或实施方案32中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如实施方案33所定义的药物组合物，其用于治疗神经学病症。
实施方案36.如实施方案1-26或实施方案32中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如实施方案33所定义的药物组合物，其用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
实施方案37.根据实施方案35或36使用的TrkB结合激动剂，其中所述病症是：神经变性疾病、视神经病、视网膜变性状况、累及听觉丧失的病症、精神病症、神经发育病症、体重调节病症、肌肉病症和另一种CNS病症。
实施方案38.根据实施方案37使用的TrkB结合激动剂，其中所述病症是：肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病(AD)、运动神经元病、帕金森氏病、朊病毒病、Lewy体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆和tau病变、青光眼、前部缺血性视神经病(AION)、非前部缺血性视神经病(NAION)、创伤性视神经病、莱伯遗传性视神经病、年龄相关性黄斑变性、神经性聋、耳蜗性聋、耳鸣、感音神经性听觉丧失、复合性听觉丧失、焦虑、心境障碍、抑郁、惊恐障碍、创伤后应激障碍(PTSD)、注意缺陷多动障碍(ADHD)、双相型障碍、精神分裂症、Angelman综合征、Prader-Willi综合征、孤独性障碍、Rett综合征、神经性厌食、恶病质、不想要的重量减轻、少肌症、肥胖、阿片样物质诱导的呕吐、少肌症、糖尿病神经病变、癫痫、多发性硬化、偏头痛、神经损伤、周围神经病、神经肌肉疾病、睡眠障碍和中风。
实施方案39.实施方案34、35、36、37或38中任一项的TrkB结合激动剂，其中治疗包括细胞存活、和/或神经元修复、和/或神经元可塑性的增强。
实施方案40.BDNF诱导的TrkB激动的增强剂，其用于治疗。
实施例
1.TrkB激动剂
通过用重组人TrkB胞外域(以下称为TrkB-ECD、SEQ ID NO:1、D1-D2-D3-D4-D5-JM、C32-H430，399个氨基酸)免疫Balb/c小鼠产生针对TrkB受体的小鼠单克隆抗体，所述重组人TrkB胞外域是使用HEK293-6E细胞系表达和纯化来产生的。用于免疫的TrkB-ECD经由GSA接头进行FLAG标记，并且在C端具有His标签(5个His残基)(FLAG标签-GSA-C32-H430-His5)。通过选择克隆进行杂交瘤融合克隆(约3000个孔)的筛选，所述克隆显示在(i)直接抗原ELISA(即与TrkB-ECD结合)和(ii)TrkB激活依赖性NFAT启动子驱动的报告物测定法(即TrkB的激动剂)之间的相关性。此选择标准导致鉴定表达鼠激动剂抗体1G11、3A3(与3B3相同的抗体序列)、8E5、5D11(与3E10相同)、5C7(与5E6相同的抗体序列)、3A4和2A1的多种杂交瘤克隆。
1.1亲和力
如通过表面等离振子共振测定，1G11表明以约42nM(kon＝5.66x104/Ms、koff＝0.00239/s)的亲和力与人TrkB-ECD结合。表3中显示了1G11的亲和力以及所鉴定的其它激动剂抗体的亲和力。
1.2受体选择性
在表达TrkA或TrkB或TrkC的CHO-K1细胞中使用Trk激活依赖性NFAT启动子驱动的报道物测定法评估1G11针对Trk受体家族的选择性揭示1G11在测试浓度(0.00006-125nM)选择性诱导表达TrkB受体的细胞中，但不诱导在TrkA或TrkC受体表达细胞中的报道基因表达。作为对照，关联配体(对于TrkA为NGF，对于TrkB为BDNF以及对于TrkC为NT-3)在相应的Trk受体表达细胞中诱导相当水平的报道基因表达。还测试了1G11结合泛神经营养因子受体p75NTR的能力。基于细胞的结合测定显示1G11与p75NTR受体没有可检测的结合。表3中总结了TrkB激动剂的受体选择性。
1.3物种交叉反应性
1G11结合并激活啮齿类(鼠，大鼠)、猕猴和人TrkB受体。2A1和5D11也激活大鼠、小鼠和人TrkB受体。令人感兴趣的是，3A3和8E5仅激活人TrkB受体，但不激活啮齿类TrkB受体。使用异源细胞系或源自相应物种的原代细胞或人iPSC衍生细胞中重组表达的TrkB受体测试物种交叉反应性。表3总结了TrkB激动剂的种类选择性。
1.4激活TrkB
当用1G11处理时稳定表达人全长TrkB受体(SEQ ID NO:2)的CHO-K1导致TrkB激活，如通过磷酸化的TrkB水平(pTrkB，Y515)所测量的，平均EC50为3.1±2.1nM(平均值±SD，n＝8)。表3中总结了TrkB激动剂的TrkB激活作用。1G11自身将TrkB受体激活至关联配体BDNF(以及NT-4)最大应答的约30-40％。
1G11诱导大鼠皮质神经元中TrkB及其下游信号传导途径的持续激活(多达24小时)，指示与BDNF相比，1G11在暴露于TrkB时能使受体长时间维持于激活状态(参见图1A)。机制上，1G11诱导的TrkB激活不同于BDNF。激活的酪氨酸激酶受体通常经历胞吞作用，然后降解，导致细胞表面受体的下调，从而暂时对配体不响应以维持细胞稳态。令人感兴趣的是，1G11不改变大鼠皮层神经元中TrkB的表面水平长达4小时，然而与未处理的对照相比，水平在24小时处升高，尽管如通过细胞表面生物素化所测量的，TrkB受体的总细胞水平降低(参见图1B)。
1.5 BDNF竞争
通过在存在和不存在BDNF的条件下TrkB磷酸化来测定1G11对TrkB受体的激活效应。TrkB激动剂在BDNF存在下的竞争性效应定义为减少的TrkB磷酸化。在存在饱和BDNF浓度(10nM，EC100)的情况下，在过表达全长TrkB受体的CHO细胞中评估不同浓度的1G11对TrkB磷酸化的影响揭示1G11不与BDNF竞争TrkB。鉴定的确实与BDNF竞争的唯一TrkB激动剂是5D11，其将BDNF诱导的TrkB磷酸化减少约50％。表3总结了TrkB激动剂的BDNF竞争结果。
1.6 TrkB激动剂竞争测定
为了分析TrkB激动剂mAb的表位结合特性，建立了竞争测定法以确定哪些TrkB激动剂彼此竞争，以使能够将结合TrkB上相似或重叠表位的那些分组在一起。将TrkB-ECD固定在芯片表面上，并将单一TrkB激动剂mAb注入流动池中以结合TrkB。然后注射第二TrkB激动剂mAb，并评估其在第一TrkB激动剂mAb存在下对TrkB-ECD的结合能力。竞争分类为：在第二TrkB激动剂的小于20％结合的情况下为“无”；在第二TrkB激动剂的20-60％结合的情况下为“部分”；和在第二TrkB激动剂的超过60％结合的情况下为“是”。因此，第二TrkB激动剂的“无”结合得出结论为无竞争，并由此两种TrkB激动剂与非重叠表位结合，或者第一TrkB激动剂的结合改变TrkB-ECD构象，以此种方式使得第二TrkB激动剂无法结合。“部分”和“是”得出结论为两种TrkB激动剂竞争结合TrkB上相似或重叠的表位。
表3总结了TrkB激动剂竞争结果(与1G11或3A3或8E5竞争)。表2显示1G11、3A3和8E5可以一起分组为彼此竞争与TrkB上的相似或重叠表位的结合的TrkB激动剂。
1.7 BDNF增强
通过在BDNF存在下测量TrkB磷酸化水平(pTrkB，Y515)来评估1G11对BDNF诱导的TrkB激动的增强效果。在存在饱和BDNF浓度(10nM，EC100)的情况下，在过表达全长TrkB受体(SEQ ID NO:2)的CHO细胞中评估不同浓度的1G11对TrkB的影响导致处理后30分钟TrkB激活的稳定状态水平的增强，如最大响应(BDNF-100％；BDNF+1G11-约100％-145％)所反映，如图2所示。
如图2所示，在存在饱和BDNF浓度的情况下评估其它TrkB激动剂揭示3A3和8E5也“增强”TrkB受体激活(分别为约100-165％和约100-120％)。表3中总结了这些结果。
令人感兴趣的是，克隆5C7、5E6、3A4和2A1既不竞争也不增强BDNF介导的TrkB受体激活，指示(a)并非所有激动剂抗体都含有增强性质，并且(b)并非所有配体非竞争性抗体都是增强剂。
图2显示了TrkB抗体-增强剂和非竞争剂(3A3、1G11、8E5)、竞争剂(5D11)、非竞争剂(2A1、3A4、5C7)的代表性数据。100％活性代表在饱和浓度的BDNF，即10nM EC100时的TrkB激活。
已经报告了BDNF水平在大多数神经学疾病和病理生理学疾病中下降，并且表型/缺陷归因于此种下降。在TrkB受体水平保持不变的BDNF缺陷病理生理条件下，如果施用的治疗性TrkB激动剂可以：(i)激活TrkB受体(例如1G11、3A3、8E5、5D11、5C7、5E6、3A4和2A1)，(ii)不竞争降低的BDNF水平(例如1G11、3A3、8E5、5C7、5E6、3A4和2A1)，(iii)增强由BDNF降低的生理水平诱导的细胞信号传导(例如1G11、3A3、8E5)，(iv)不改变TrkB的细胞表面水平(例如1G11)(其在其它情况下可以潜在导致对TrkB激动剂的暂时脱敏)，则仍可以引起生理细胞/系统响应。表3中也总结了此数据。
1.8 NT-4增强
类似地，1G11未能与NT-4竞争，并在存在饱和水平的NT-4的情况下显示对NT-4诱导的TrkB激动的“增强”效应(NT-4–100％；NT-4+1G11–约130％；表3)。因此，预期3A3和8E5对NT-4诱导的TrkB激动也具有增强效果。
1.9细胞存活和修复
1G11以浓度依赖性方式在稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞系中促进存活并诱导神经突长出，平均EC50分别为0.025±0.01nM和0.19±0.06nM。1G11激活大鼠脑和脊髓衍生的神经元，小鼠脑衍生的神经元中内源性表达的TrkB受体和在CHO细胞中重组表达的猕猴TrkB。
类似地，8E5和3A3分别以0.09±0.06nM(平均值±SD)和0.006±0.001nM(平均值±SD)的EC50增强细胞存活。
尽管8E5以浓度依赖性方式以1.58±0.34nM(平均值±SD)的EC50诱导神经突长出，但3A3始终表现出随抗体浓度增加的双相轴突长出响应，使得推出准确的EC50是挑战性的。
表3
ND：未测定
2. 1G11、3A3和5D11的测序
通过常规技术对TrkB激动剂进行测序。对于1G11、3A3、8E5和5D11，CDR由Kabat确定，并呈现于表4中(注意表1中呈现了通过不同编号惯例确定的1G11的CDR区)。1G11(SEQID NO:27和28)、3A3(SEQ ID NO:29和30)、8E5(SEQ ID NO:31和32)和5D11(SEQ ID NO:33和34)中的每一个的全长鼠序列(重链和轻链)也在表4中提及。
表4：
2.表位
TrkB一级氨基酸序列在小鼠、大鼠、猕猴和人上高度保守(在全长序列间95％)，并且特别在实施例1中鉴定的所有TrkB激动剂结合的胞外域中保守。为了测定TrkB上的结合表位，使用TrkB ECD(SEQ ID NO:1)通过域缺失和丙氨酸扫描诱变(使用表面等离振子共振)以及X射线晶体学研究来进行表位定位研究。TrkB ECD包含5个域(D1-D3:C32-C194；D4:G195-V283；D5:H284-G380)和短的近膜JM区域(W381-H430)。用于表位定位研究的TrkB-ECD经由GSA接头进行FLAG标记，并且在C端具有His标签(5个His残基)(FLAG标签-GSA-C32-H430-His5)。
产生缺失域变体：D1-D3域变体包括C32-L196(SEQ ID NO:35)；D4-D5-JM域变体包括P197-H430(SEQ ID NO:36)，并且D5-JM域变体包括H284-H430(SEQ ID NO:37)。
对于丙氨酸扫描诱变研究(2.2、2.3和2.5)，在TrkB-ECD(SEQ ID NO:1)中制备单点突变体，如列出的：
N193A；S198A；N200A；L206A；E210A；K212A；S213A；T215A；S217A；D223A；N227A；Y229A；D231A；N234A；V236A；H239A；S244A；T246A；S249A；R251A；Q263A；L271A；Q276A；T288A；F291A；E293A；T296A；D298A；H299A；K308A；K312A；F318A；N325A；K328A；K333A；H335A；H343A；N350A；M354A；K364AE366AE371AK372AQ373AH377AM379A W381A D385A N389AD394A E398AT402A；D406A；T410A；N415A；T420A；D424A；R428A；F285A；T290A；S294A；H300A；S327A；Y329A；C331A；Q347A；D349A；T352A；D370A；D386A；N391A；Y392A；V395A；I396A；Y397A；D399A；Y400A；N405A；D358A；或S375A。
2.1 TrkB和BDNF之间的结合
已知TrkB的D5域(残基286-384)可以替换全长TrkB以与配体(BDNF/NT-4)结合。在TrkB的配体结合位点内有两个接触区：“保守斑块”和“特异性斑块”。TrkB D5在保守斑块中的接触残基来自AB、C'D和EFβ折叠之间的环以及D5域的C端。TrkB的保守斑块与配体(BDNF/NT-4)的茎结合。特异性斑块中TrkBD5的接触残基来自ABEDβ片层的外部面。TrkB的特异性斑块结合配体(BDNF/NT-4)的N端，其在无配体形式中无序，并在与TrkB结合后变得有序。图3中总结了BDNF/NT-4同二聚体和两个TrkB D5域之间的结构相互作用。
2.2 1G11的表位
1G11与不同TrkB域缺失变体的初始表面等离振子共振结合分析揭示了1G11结合TrkB-ECD(C32-H430)、D4-D5域变体(P197-H430)和D5域变体(H284-H430)，但不结合D1-D3域变体(C32-L196)。
1G11与TrkB-ECD中，主要在D4-D5-JM域中的约80个单点丙氨酸突变体的表面等离振子共振结合分析将8个氨基酸鉴定为对于结合是关键的残基，尽管在不同程度上显示是最重要的第一个：F291、E293>K372、E210、T288、D370>F285、T290。所有残基来自TrkB的D5域，除了在D4域中的E210外。
以分辨率与TrkB的D5-JM域(SEQ ID NO:37)复合的1G11嵌合Fab1[来自1G11的可变区与人IgG1的恒定区融合](SEQ ID NO:38和39)的共晶体结构揭示了在TrkB的D5-JM域上与IG11紧密接近的14个残基(使用距离截留)。鉴定的14个残基包括那些也通过丙氨酸扫描分析鉴定的残基(T288、F291、K372、E293)；以及仅通过X射线晶体学鉴定的紧密接近的其它氨基酸残基(I289、T290、L292、S294、K308、D358、E371、Q373、I374、S375)。使用的距离截断在分辨率下，鉴定出7个残基(290、293、294、372、373、374、375)。
使用CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(MolecularOperatingEnvironment)定义表位中涉及的相互作用。选择TrkB的D5-JM域上1G11嵌合Fab1的内的蛋白质残基，然后使用具有默认参数的“配体相互作用”工具来鉴定水分子或来自相互作用分子的残基，其视为与这些残基相互作用。注意，由于此工具设计用于限定小分子配体相互作用而非蛋白质残基，每个选定残基的“配体相互作用”都是单独计算的。由MOE定义的相互作用在Excel中编辑以删除任何链内相互作用，并且除了那些在两条链间形成桥的相互作用外删除所有水相互作用。剩余的相互作用残基如下：
o与1G11嵌合Fab1残基直接相互作用
Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375
o与1G11嵌合Fab1残基的直接相互作用，以及通过水的间接相互作用
Lys372、Gln373
o仅通过水的间接相互作用
Glu341
对共晶体结构的分析和丙氨酸扫描诱变是相互补充和佐证的，并鉴定TrkB的D5-JM域中的残基，其与TrkB激动剂相互作用或通过结构相互作用间接影响结合。
使用丙氨酸扫描数据和X射线数据，看起来K372和E293最少是与1G11结合的TrkB表位的一部分。表5总结了此数据。
E293位于D5β片层A和A'之间；K372位于D5β片层G中。残基T288和T291(通过丙氨酸扫描和接近性分析鉴定)位于D5β片层A中。
通过丙氨酸扫描鉴定的残基显示在图4A中，并且通过共晶X射线晶体学接近性分析鉴定的残基显示于图4B中。在图4中，来自与TrkB D5结合的1G11Fab的共晶体结构的D5TrkB域与来自与NT-4同二聚体结合的人TrkB域D5的公开共晶体结构的相同TrkB域重叠以相对于1G11Fab定向TrkB与配体的结合。随后将来自人BDNF/NT-4异二聚体的BDNF链重叠以显示BDNF上TrkB的潜在结合位点。使用β链几何延伸来自与NT-4同二聚体结合的人TrkB域D5的公布共晶体结构的TrkB D5的C端以连接近膜(JM)区域和直至跨膜区，以证明此缺少的区域的潜在长度，这是由于缺乏公布/可用的晶体结构数据。使用带状草图形式显示结构，并且对于指示为潜在TrkB表位的残基在结构上显示原子。
从图4A和4B可以看出，1G11的表位位于TrkB D5域上，在BDNF/NT4“保守斑块”配体结合位点近端(AB、C’D和EFβ片层之间的环以及D5域的C端)，并接近BDNF/NT4“特异性斑块”配体结合位点(ABEDβ片层的外部面)。更特别地，TrkB域5上的1G11表位看起来沿着D5β片层A，D5β片层A和A’之间的区域以及D5β片层G，接近特异性斑块的ABEDβ片层的外部面。TrkB上的1G11表位与BDNF/NT4配体结合位点不直接重叠的事实推测允许1G11与TrkB结合，并且TrkB也结合BDNF/NT-4以形成三元复合物“TrkB激动剂+TrkB+配体”。
对1G11、TrkB、BDNF/NT-4组分重叠的进一步分析显示NT-4/BDNF的N端潜在突出到TrkB和1G11Fab的重链之间的空间中(参见图5)。将分子表面添加到重叠显示VκCDR L1和L3以及CDRH3与TrkB紧密相互作用，并且在TrkB和CDR H1和H2之间存在裂缝，其可以设想潜在容纳BDNF的N端(见图6)。因此，在存在BDNF的情况下1G11与TrkB的结合还可以包括与BDNF的N末端的结合，并且此种结合可能稳定三元复合物，导致BDNF功能响应的增强。因此，除了TrkB之外，1G11还能够与配体(BDNF/NT-4)的N端相互作用。或者，1G11可以通过不在配体结合位点处结合而是接近它来稳定TrkB和配体之间的相互作用。
通过接近性分析(使用的距离截留)分析共晶体结构并通过使用CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(MolecularOperating Environment)定义与表位相互作用的残基来鉴定参与互补位的残基。互补位中的主要结合残基在CDR L1(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：RASQ N LH/SEQ ID NO:3)、L3(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：QQPLT/SEQ ID NO:5)和H3(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：GGALDY/SEQ ID NO:8)内。存在有在内接近表位的CDRH2中的仅两个残基和直接相互作用的仅一个残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：IAPGNTYNEIFKG/SEQ ID NO:7)。存在有CDRH1中接近或(间接)接触表位的唯一且单一残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：SYIN/SEQ ID NO:6)和CDRL2中接近表位的单一残基(粗体残基代表那些在内接近表位的残基，加下划线的残基代表那些与表位直接或间接(经由水)相互作用的残基：VSQSIS/SEQ ID NO:4)。因此，从排序的观点来看，CDR L1、L3和H3对结合最重要，接着是CDRH2，然后是CDRL2和CDRH1。
2.3 3A3的表位
3A3与在TrkB-ECD中(通常在D4-D5-JM域中)约80个单点丙氨酸突变体的表面等离振子共振结合分析将9个氨基酸鉴定为对于结合关键的残基，尽管程度不同(E398、Y397、D399、Y400>D394、I396>V395、N389、T402)。在表5中总结了这些数据。这些残基全部位于JM区域，其在TrkB的D5域的C-端并且在跨膜区的N端(参见图7-使用β-链几何延伸JM残基)。在没有任何晶体结构的情况下，此近膜(JM)区域假定为长的柔性接头区域。认为JM区对于结合配体也可以是重要的。
尽管与3A3结合的TrkB表位似乎与1G11的表位不同，但重要的是注意3A3与1G11(和8E5)竞争结合TrkB，因此表位可以以某种方式重叠(参见上文实施例1.6)或与JM或D5域结合可以导致构象改变，其改变另一抗体的结合表位。可能的是，近膜(JM)区的长柔性接头可以实际上紧邻D5β片层A、B和G。
3A3还显示了BDNF诱导的TrkB激动的增强(参见上文实施例1.7)。因此，可能的是当3A3与TrkB结合时，它也可以与BDNF/NT-4具有一些额外的相互作用(例如通过配体的N末端)，和/或类似地稳定受体加配体的复合物。
令人感兴趣的是，研究揭示近膜区中的残基D394、I396和Y400赋予人TrkB受体特异性，因为这些残基在大鼠TrkB(分别为Glu、Leu、Trp)中不同，并且3A3不激活大鼠TrkB。
2.4 8E5的表位
尚未进行丙氨酸扫描诱变或晶体学研究以确定8E5的结合表位。然而，重要的是注意8E5与1G11(和3A3)竞争结合TrkB，因此表位可以以某种方式重叠(参见上面的实施例1.6)，或者与JM或D5域的结合可以导致构象改变，其改变另一抗体的结合表位。8E5也显示了BDNF诱导的TrkB激动的增强(参见上文实施例1.7)。8E5是人TrkB特异性的，与3A3相似的事实意味着表位可能位于JM区域，类似于3A3，其中啮齿类和人之间的序列是趋异的(参见表5)。
2.5 5D11的表位
5D11与TrkB-ECD中(通常在D4-D5-JM域)中的约80个单点丙氨酸突变体的表面等离振子共振结合分析将6个氨基酸鉴定为对于结合关键的残基，尽管程度不同(N350>H299、D349>H300、K328、K333)。在表5中总结这些数据。图8显示5D11的表位在配体结合位点处(D5域的AB、C’D和EFβ片层之间的环；以及Dβ片层)。这完全符合5D11与BDNF竞争的事实，如在TrkB磷酸化测定中所测量的。
表5：表位汇总
ND:未测定
2.6增强性抗体
基于实施例1和2的结果，存在(i)结合TrkB表位并且允许结合TrkB的TrkB激动剂，所述TrkB激动剂在BDNF/NT-4的存在下是增强或稳定的，所述TrkB表位极其接近TrkB的BDNF结合位点，特别是接近结合TrkB的N端的特异性斑块：这些是TrkB-BDNF增强剂；(ii)在配体结合位点内或极其接近配体结合位点结合并使受体和配体之间的相互作用脱稳定的TrkB激动剂：这些是BDNF竞争剂；和(iii)结合远离BDNF结合位点的表位的TrkB激动剂，其是不具有增强功能的简单激动剂。
1G11、3A3和8E5是与BDNF非竞争性，并且看起来是与两个表位(尚未确定的8E5表位)结合的增强剂的实例。结合这些表位可能在BDNF存在下使TrkB受体以活性构象稳定化，并且还(a)增加待由抗体激活的TrkB的可用细胞表面水平；和/或(b)抑制激活的TrkB受体内吞作用和降解。
进行SEC-MALS以评估TrkB的ECD的可溶性截短形式(TrkB_H284-H430ECD-6H)与3A3或1G11或BNDF的二元复合物的形成。可以在所有情况下检测到二元复合物的存在。SEC-MALS也用于评估此种TrkB构建体与BDNF和3A3之间，和/或TrkB、BDNF和1G11之间是否形成三元复合物。TrkB、BDNF和3A3实验没有提供三元复合物的存在的清楚证据。在此实验中没有检测到二元或三元复合物，提示复杂的溶液行为和形成通过SEC-MALS不可见的高级种类的可能性。来自TrkB、BDNF和1G11实验的数据也提示形成高于简单的二元复合物。在此种情况下，可以检测到这些大于简单的二元种类中的一些。然而，这些较高分子量种类的成分不能准确测定。因此，仍然可能的是通过这两种抗体的增强可以源自三元复合物的形成。
2.6氢氘交换
使用HDX-MS监测在存在或缺乏多种其它潜在蛋白质配偶体的情况下加his标签的D5-JM TrkB的交换率。通过将单独的组分稀释到50mM磷酸钠，150mM NaCl pH 7.0的非氘化的H2O缓冲液中制备以下蛋白质溶液：
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；1G11mAb(40μM；以确保所有TrkB以二元复合物存在)
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；3A3mAb(40μM；以确保所有TrkB以二元复合物存在)
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；BDNF(40μM；以确保所有TrkB以二元复合物存在)
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；1G11mAb(20μM)；BDNF(20μM)
·TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；3A3mAb(20μM)；BDNF(20μM)
在环境温度在从非氘化的缓冲液到氘化缓冲液(50mM磷酸钠，D2O中的100mMNaCl，pH6.6)稀释20倍的情况下使用标准HDX方法进行HDX标记反应。在4个时间点采集交换样品(1-3个重复)：0秒(即稀释到非氘化缓冲液中)、15秒；60秒和300秒。在4℃用预冷却的低pH和变性淬灭缓冲液(400mM磷酸钠，8M盐酸胍，500mM(三(2-羧乙基)膦)，pH 2.2)将样品淬灭。
在15℃将变性的淬灭样品以240秒的消化时间，100μl/分钟的柱流速和0.2％含水甲酸的消化缓冲液注射到固定的胃蛋白酶消化柱(Waters Enzymate BEH,2.1mm X 30mm,Part no:186007233)。在Acquity UPLC系统上，使用1.0x 100mmUPLC BEH C18柱(Part no186002346)，典型地以15分钟运行时间和流动相A：H2O/甲酸(99.8:0.2v/v)和流动相B：ACN/甲酸(99.8:0.2v/v)以流速40μl/min分析释放的肽。
使用ProteinLynxGlobal SERVER(http://www.waters.com/waters/en_GB/ProteinLynx-Global-SERVER％28PLGS％29/nav.htm？cid＝513821&locale＝en_GB)或Mascot搜索引擎，针对仅包含感兴趣的蛋白质序列的数据库鉴定通过非氘化蛋白质的蛋白水解产生的肽。使用DynamX Analysis Software v3.0(或HD Examiner)通过比较从PLGS导入的未氘化肽列表与氘化样品获得的数据来计算每个时间点和状态的氘掺入。
手动评估每种肽的氘化数据，并从分析中除去产生差的质量的数据的电荷状态或肽。
结果
在存在1G11的情况下的TrkB显示对于TrkB肽观察到的氘交换率的概况的显著变化。分数氘化更新差异图(图9)显示TrkB肽区域284-291的最强的氘化保护。这在研究的所有时间点内得到强烈保护，提示此区域可能对TrkB与1G11的相互作用是重要的。在约316-380的整个TrkB中心区域中看到更微妙(subtle)的交换保护，提示了本文的其它残基可以在相互作用中起作用。
在存在3A3的情况下的TrkB显示对于TrkB肽，但是仅在最早的交换时间点15和60s时观察到的氘交换率的概况的显著变化。分数氘化更新差异图(图10)显示含有区域385-398的TrkB肽的最强的氘化保护。然而，此种保护在300s的交换时间点时丧失。与TrkB的此区域的非常快速的氘化一起，此数据提示此区域可能是溶剂暴露的并且被快速氘化；通过与3A3的相互作用来防止氘化是不完全的，并且虽然减缓速率，但是即使此种较慢的速率也允许在300s内达到饱和氘化。
在存在BDNF的情况下仅TrkB；TrkB-3A3mAb；TrkB-1G11mAb。将BDNF添加到单独的TrkB或TrkB-mAb复合物在TrkB氘化中没有产生强力的变化，因此不可能显示TrkB-mAb-BDNF三元复合物的存在或缺乏。
3.人源化1G11、3A3、5D11
3.1人源化
将1G11、3A3和5D11人源化。序列如下：
人源化1G11可变重(VH)区-SEQ ID NO:40；可变轻链(VL)区-SEQ ID NO:41；重链(HC)-SEQ ID NO:42；轻链(LC)-SEQ ID NO:43；编码HC的DNA-SEQ ID NO:44；编码LC的DNA-SEQ ID NO:45。
人源化3A3可变重(VH)区-SEQ ID NO:46；可变轻链(VL)区-SEQ ID NO:47；重链(HC)-SEQ ID NO:48；轻链(LC)-SEQ ID NO:49；编码HC的DNA-SEQ ID NO:50；编码LC的DNA-SEQ ID NO:51。
人源化5D11可变重(VH)区--SEQ ID NO:52；可变轻链(VL)区-SEQ ID NO:53；重链(HC)-SEQ ID NO:54；轻链(LC)-SEQ ID NO:55；编码HC的DNA-SEQ ID NO:56；编码LC的DNA-SEQ ID NO:57。
使用本领域标准程序将重链和轻链的鼠CDR植入到合适的人框架序列上：在人V基因种系数据库上搜索CDR掩蔽的可变(V)区序列，基于序列相似性选择V和J基因模板序列。根据人和小鼠之间的比较鉴定潜在的回复突变。
将1G11重链的鼠CDR植入到IGHV1_69重链框架上并产生三种人源化重链变体：一种是CDR的直接植入物(H0)，第二种变体在kabat位置47处掺入回复突变(W47C)(H4)和第三变体在位置47处掺入丝氨酸残基(W47S)(H7)。
将1G11轻链的鼠CDR植入到IGKV3_11人框架(Lo1)上；并且植入到Kabat 49位酪氨酸单一回复突变为赖氨酸(Y49K)的IGKV3D-15人框架(Ln1)上。
产生1G11的人源化变体并测试与TrkB-ECD的结合以及在各种功能测定中测试。与Lo1变体相比，Ln1变体显示没有结合的显著差异。
然而，重链的Kabat位置47(W47)处的人框架残基色氨酸的变体(刚好在CDRH2之前)具有与TrkB的结合的显著丧失。重链的Kabat位置47处的色氨酸在人抗体中100％保守，并且位于重链-轻链界面处。当引入W47C/S回复突变时，恢复与TrkB的结合。半胱氨酸和丝氨酸是相似大小的氨基酸，并且这两种突变体均保留人源化1G11的结合和功能特性，与鼠亲本1G11的结合和功能特性相似。因此，预期重链的第47位的其它类似大小的氨基酸也将保留结合和功能。例如，其它可能的取代包括Gly、Ala、Val、Thr或Asn。还预期如果在重链的第47位处维持色氨酸，则可以存在其它框架变化，其将恢复重链-轻链界面结构并因此恢复与TrkB的结合。
人源化1G11是将1G11CDR直接植入到具有Kabat位置47处可变重链中丝氨酸突变引入的人框架(H7，Lo1)上。
人源化1G11含有修改为具有突变L235A和G237A(EU编号)的人IgG1Fc区。IgG1Fc区的此种修饰减少mAb与Fcγ受体和C1q的结合，因此降低mAb通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导TrkB阳性细胞消减的潜力。这通常描述为Fc失能。
通过表面等离振子共振评估人源化1G11与C1q和各种人和猕猴Fc受体(FcRn,FcγR I,FcγR IIaH,FcγR IIaR,FcγR IIb,FcγR IIIaV和FcγR IIIaF)结合的能力。结果证明了如预期，在重链中引入Fc失能性L235A和G237A突变不影响人源化1G11与FcRn的结合，但是确实降低与C1q、FcγR I、FcγR IIaH、FcγRIIaR、FcγR IIb、FcγR IIIaV和FcγR IIIaF的结合。
应当注意的是，人源化1G11是Fc失能的，而鼠1G11不然。Fc效应器功能对于此TrkB激动剂的生物学功能不是关键的。
3.2人源化抗体特性
在许多测定法，包括测量抗体对TrkB的结合亲和力的表面等离振子共振以及TrkB磷酸化测定法中将人源化1G11与鼠1G11进行比较。在这些测定法中，人源化1G11与1G11相当，确认人源化是成功的。如通过表面等离振子共振测量，人源化1G11在1:1结合模式中分别以约55nM和约60nM的亲和力结合重组人和猕猴TrkB-ECD。人源化1G11激活在稳定过表达人全长TrkB受体的CHO-K1细胞中的人TrkB受体，通过测量磷酸化TrkB的水平确定EC50为0.65±0.14nM(平均值±标准差，n＝3)。人源化1G11选择性激活人TrkB受体，而非人TrkA或TrkC受体；并且还与啮齿类(鼠，大鼠)、猕猴和人TrkB受体交叉反应并激活啮齿类(鼠，大鼠)、猕猴和人TrkB受体。
人源化1G11不与BDNF竞争；并且它在CHO-K1细胞中以0.65±0.14nM(平均值±SD，n＝3)的EC50激活人TrkB；保留了增强性质(相对于BDNF的约120％)，即在饱和浓度的BDNF存在下增强TrkB激活水平。
在体外，人源化1G11以浓度依赖性方式以平均EC50为0.007±0.003nM(平均值±SD；1G11＝0.025±0.01nM)增强稳定表达人全长TrkB受体的大鼠PC12成神经细胞瘤细胞中TrkB介导的细胞存活。在稳定表达人全长TrkB受体的相同大鼠PC12成神经细胞瘤细胞中，人源化1G11以浓度依赖性方式增强TrkB介导的神经突长出，平均EC50为0.07±0.02nM(平均值±S.D.；1G11＝0.19±0.06nM)。
4.体内效应
神经元存活的SRA大鼠模型
在大鼠撕脱伤(单侧)诱导的脊髓运动神经元变性模型中评估1G11对神经元存活的体内影响。简言之，通过手术在幼成年sprague-dawley大鼠中撕裂来自腰段4(L4)的腹根，并允许恢复1周，之后静脉内(作为单次推注)或鞘内(连续)用1G11干预。为了连续鞘内输注，将导管通过L4-L5之间的椎间孔插入蛛网膜下腔，其中将另一端连接至Alzet 2002微渗透泵，该微渗透泵在颈后皮下植入。直至抗体干预，将媒介物配制剂加载至泵并以0.5μl/hr的速率递送。
在大鼠SRA模型中连续鞘内输注不同的两剂1G11(60μg或240μg/天)或BDNF(阳性对照；12μg/天)，但非媒介物配制剂(阴性对照)达2周在相似的程度上(即与对侧比较)增强ChAT表达神经元(用抗ChAT抗体染色)的存活，与媒介物处理组相比没有明显的剂量依赖性应答。神经根撕脱后1周静脉内施用1G11(0.03、0.1、0.3、1、3、30mg/kg)或BDNF(阳性对照；12μg/天)，但非同种型对照(IgG1，3mg/kg)或媒介物配制剂(阴性对照)显示如通过ChAT染色显现的脊髓神经元存活的暴露依赖性增强。1G11能够在1mg/kg、3mg/kg和30mg/kg时以不同程度拯救ChAT+神经元，在≤0.3mg/kg时可忽略不计。
总之，1G11在单侧(L4根侧)撕裂的大鼠中在受伤后7天以单次推注静脉内尾静脉注射或通过连续鞘内输注施用时增强了脊髓ChAT+神经元的存活。
步态功能(hSOD1G93A小鼠)
除了1G11对神经元存活的影响(如上文所述)之外，在同基因B6Cg-Tg(hSOD1G93A)1Gur/J转基因小鼠中研究了1G11的功能效应。随疾病形成和进展，hSOD1Tg小鼠在各种步态参数中显示损伤。1G11(0.3mg/kg)，而非媒介物配制剂(阴性对照)在雌性分组(约3.5个月龄)中每2周经由尾静脉推注28天(在干预期期间两次)施用时与hSOD1-媒介物对照相比以不同程度显著改善hSOD1小鼠中的步态特征：运行速度、步调(步/秒)、步幅时间和站立时间，几乎与野生型同窝出生仔相当；相对中等的对步幅长度的影响；以及对摆动速度的影响大大降低。这些结果指示1G11当静脉内施用时可以改善hSOD1G93A转基因小鼠的步态缺陷。
为了进一步评估1G11对步态和神经学评分的影响，根据表6给小鼠(雄性和雌性，约3.5个月龄，在研究开始时每组每个性别至少16只小鼠)给药。实验以随机、安慰剂和同种型对照和双盲方式进行。
表6
载体＝20mM磷酸盐缓冲液，130mM NaCl pH 6.0和0.005％聚山梨醇酯20
iv＝静脉内，ip＝腹膜内
动物在8个时间点使用啮齿类CatWalk系统进行步态分析：第97天(基线)、第99天(第1剂后1天)、第111天(第1剂后13天)、第113天(第2剂后1天)、第125天(第2剂后13天)、第139天(第3次剂后13天)、第146天(第4剂后7天)和第153天(第4剂后13天)。选择六种步态参数(运行速度、步幅长度、步态时间、步幅时间、步调和摆动速度)进行分析。结果显示与IgG1同种型对照相比，对于两种性别，1G11显著改善了hSOD1-G93A小鼠的步态特征，特别是在第125天和第139天。平均而言，高剂量组的步态特征与低剂量组相比有更好的改善。
在整个研究时间段内监测所有hSOD1-G93A动物的神经学评分。时序检验显示，相对于1gG1同种型对照，1mg/kg和0.3mg/kg 1G11均使雌性小鼠的到死亡的中值时间显著延迟。对于雄性小鼠，相对于IgG1同种型对照，0.3mg/kg hSOD1-1G11组显著延迟到死亡的中值时间，而1mg/kghSOD1-1G11组没有显示显著改善。相对于IgG1同种型对照，Wilcoxon检验显示对于雌性小鼠1mg/kg 1G11而非0.3mg/kg 1G11显著延迟到震颤发作的中值时间。相对于IgG1同种型对照，1mg/kg和0.3mg/kg 1G11两者在雄性小鼠中都少量延迟到震颤发作的中值时间。
总之，这些结果指示，1G11在静脉内施用时可以改善hSOD1-G93A转基因小鼠的两种性别中的步态缺陷，延迟两种性别的震颤发作并且仅改善hSOD1-G93A转基因小鼠雌性中的总体“存活”。
运动神经元存活(hSOD1G93A小鼠)
为了评估1G11对脊髓ChAT阳性神经元的影响，按照表7给雄性小鼠(约50天龄，研究开始时每组12只小鼠)给药。实验以随机，安慰剂和同种型对照和双盲方式进行。
表7
载体＝20mM磷酸盐缓冲液，130mM NaCl pH 6.0和0.005％聚山梨醇酯20
iv＝静脉内，ip＝腹膜内
在给药期结束时，将小鼠用异氟烷深度麻醉。用冰冷的0.9％盐水(120mL)对小鼠经心脏灌注以排出血液，随后是60mL 4％低聚甲醛(PFA)。收集脊髓并在4℃在4％PFA中后固定24小时。在IHC自动染色器(Ventana DiscoveryUltra，Roche，USA)上进行胆碱乙酰转移酶(ChAT)的免疫组织化学(IHC)。由ScanScope XT(Leica Biosystems，USA)捕获整个载玻片图像。
对腰脊髓L3-L5中的ChAT阳性细胞进行定量和分析。为了准确计数神经元，将苏木素通道从DAB(ImageScope，版本11，Leica Biosystem)中分开，然后采用覆盖整个腹脊髓的仅DAB图像(10x)用于细胞定量。ChAT阳性MN神经元由独立的观察者以不知情的方式手动计数。为了消除偏差并确保一致性，另一位独立研究人员随机检查图像量化质量。
通过ChAT免疫染色的腰脊髓(L3-L5)分析显示与媒介物处理的野生型小鼠相比，在媒介物处理的hSOD1-G93A转基因小鼠中ChAT阳性运动神经元的高度显著降低(35％降低，p<0.0001)。这些数据指示与野生型小鼠相比，hSOD1-G93A小鼠的脊髓中的运动神经元明显变性。小鼠IgG1(172.6±31.10)和1G11处理组没有表明相对于媒介物的统计学显著性(0.3mg/kg：169.1±17.25；1mg/kg：160.1±28.12)。
序列表
SEQ ID NO:1TrkB-ECD
cptsckcsasriwcsdpspgivafprlepnsvdpeniteifianqkrleiineddveayvglrnltivdsglkfvahkaflknsnlqhinftrnkltslsrkhfrhldlselilvgnpftcscdimwiktlqeaksspdtqdlyclnesskniplanlqipncglpsanlaapnltveegksitlscsvagdpvpnmywdvgnlvskhmnetshtqgslritnissddsgkqiscvaenlvgedqdsvnltvhfaptitflesptsdhhwcipftvkgnpkpalqwfyngailneskyictkihvtnhteyhgclqldnpthmnngdytliakneygkdekqisahfmgwpgiddganpnypdviyedygtaandigdttnrsneipstdvtdktgreh
SEQ ID NO:2TrkB全长序列
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
SEQ ID NO:3 1G11和人源化1G11CDR L1(Kabat,Chothia,AbM)
RASQRISNNLH
SEQ ID NO:4 1G11和人源化1G11CDR L2(Kabat,Chothia,AbM)
YVSQSIS
SEQ ID NO:5 1G11和人源化1G11CDR L3(Kabat,Chothia,AbM)
QQSNSWPLT
SEQ ID NO:6 1G11和人源化1G11CDR H1(Kabat)
SYYIN
SEQ ID NO:7 1G11和人源化1G11CDR H2(Kabat)
RIAPGNTYYNEIFKG
SEQ ID NO:8 1G11和人源化1G11CDR H3(Kabat,Chothia,AbM)
RGYEGALDY
SEQ ID NO:9 3A3CDR L1(Kabat)
KSSQSLLYSGNQKNYLA
SEQ ID NO:10 3A3CDR L2(Kabat)
WASTRES
SEQ ID NO:11 3A3CDR L3(Kabat)
QQYYSYPYT
SEQ ID NO:12 3A3CDR H1(Kabat)
SYWMH
SEQ ID NO:13 3A3 CDR H2(Kabat)
YINPSTGYTDYNQKFKD
SEQ ID NO:14 3A3 CDR H3(Kabat)
SRAARY
SEQ ID NO:15 8E5 CDR L1(Kabat)
RASSSVSSSYLH
SEQ ID NO:16 8E5 CDR L2(Kabat)
STSNLAS
SEQ ID NO:17 8E5 CDR L3(Kabat)
QQYSGYPLT
SEQ ID NO:18 8E5 CDR H1(Kabat)
TYGMS
SEQ ID NO:19 8E5 CDR H2(Kabat)
TVSTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO:20 8E5 CDR H3(Kabat)
GGYSFAY
SEQ ID NO:21 5D11 CDR L1(Kabat)
RASQSVSTSFYSYMH
SEQ ID NO:22 5D11 CDR L2(Kabat)
YASNLQS
SEQ ID NO:23 5D11 CDR L3(Kabat)
QHSWEIPWT
SEQ ID NO:24 5D11 CDR H1(Kabat)
NYLIE
SEQ ID NO:25 5D11 CDR H2(Kabat)
VINPGSGGTNYNDKFKG
SEQ ID NO:26 5D11 CDR H3(Kabat)
GGNDYGDY
SEQ ID NO:27 1G11 HC
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:28 1G11 LC
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:29 3A3 HC
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTDYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSRAARYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:30 3A3 LC
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:31 8E5 HC
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWVRQTPDKGLEWVATVSTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGGYSFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:32 8E5 LC
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGVSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:33 5D11HC
QVHLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNDKFKGKAILTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGGNDYGDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:34 5D11LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVFIKYASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEDDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:35D1-D3域缺失变体C32-L196
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGL
SEQ ID NO:36D4-D5-JM域缺失变体P197-H430
PSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
SEQ ID NO:37D5域缺失变体H284-H430
HFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
SEQ ID NO:38 1G11嵌合Fab1[来自1G11的可变区(VH)与来自人IgG1的恒定区(CH1)融合]
QVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYINWIKQRPGQGLECIGRIAPGNTYYNEIFKGKAILTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSGVYFCARRGYEGALDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
SEQ ID NO:39 1G11嵌合Fab1[来自1G11的可变区(VL)与来自人IgG1的恒定区(CL1)]
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQRISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:40人源化1G11VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:41人源化1G11VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:42人源化1G11HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYYINWVRQAPGQGLESMGRIAPGNTYYNEIFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYEGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:43人源化1G11LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:44编码人源化1G11HC的DNA
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTACTACATCAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGAGCATGGGCAGGATCGCCCCCGGCAACACCTACTACAACGAGATCTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACTGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGGGGCTACGAGGGCGCCCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO:45编码人源化1G11LC的DNA
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACTCTGAGCCTGAGCCCAGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCAGGGCCTCCCAGAGGATCAGCAACAACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCAAATACGTGAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTCTAACAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO:46人源化3A3VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:47人源化3A3VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:48人源化3A3HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSTGYTDYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRAARYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:49人源化3A3LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:50编码人源化3A3HC的DNA
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCTCCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCACCGGCTACACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCAGGGCTGCCAGGTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO:51编码人源化3A3LC的DNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGTACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACTGGGCTAGCACAAGGGAGAGCGGCGTGCCTGATAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACTACTCCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO:52人源化5D11VH
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SEQ ID NO:53人源化5D11VL
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SEQ ID NO:54人源化5D11HC
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SEQ ID NO:55人源化5D11LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSTSFYSYMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWEIPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:56编码人源化5D11HC的DNA
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTCAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACCTGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGTGATCAATCCCGGCAGCGGCGGCACCAACTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACTGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGGCGGGAACGATTACGGCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO:57编码人源化5D11LC的DNA
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATTAACTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCACCAGCTTCTACTCCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCAAATACGCCAGCAACCTCCAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCAGGCTCCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAGATCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO:58 1G11和人源化1G11CDRH1(Chothia)
GYTFTSY
SEQ ID NO:59 1G11和人源化1G11CDRH2(Chothia)
APGN
SEQ ID NO:60 1G11和人源化1G11CDRH1(AbM)
GYTFTSYYIN
SEQ ID NO:61 1G11和人源化1G11CDRH2(AbM)
RIAPGNTY
SEQ ID NO:62 1G11和人源化1G11CDRH1(接触)
TSYYIN
SEQ ID NO:63 1G11CDRH2(接触)
CIGRIAPGNTY
SEQ ID NO:64人源化1G11CDRH2(接触)
SMGRIAPGNTY
SEQ ID NO:65 1G11和人源化1G11CDRH3(接触)
ARRGYEGALD
SEQ ID NO:66 1G11和人源化1G11CDRL1(接触)
SNNLHWY
SEQ ID NO:67 1G11和人源化1G11CDRL2(接触)
LLIKYVSQSI
SEQ ID NO:68 1G11和人源化1G11CDRL3(接触)
QQSNSWPL
SEQ ID NO:69
DGANPNYPDVIYEDYGTAAN
SEQ ID NO:70
NPNYPDVIYEDYGT
SEQ ID NO:71
HFAPTITFLESP
SEQ ID NO:72TRKB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
283-291的肽
GHFAPTITF
SEQ ID NO:73TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
284-291的肽
HFAPTITF
SEQ ID NO:74TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
292-316的肽
LESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQ
SEQ ID NO:75TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
316-324的肽
QWFYNGAIL
SEQ ID NO:76TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
317-324的肽
WFYNGAIL
SEQ ID NO:77TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
318-324的肽
FYNGAIL
SEQ ID NO:78TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
347-361的肽
QLDNPTHMNNGDYTL
SEQ ID NO:79TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
349-358的肽
DNPTHMNNGD
SEQ ID NO:80TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
351-368的肽
PTHMNNGDYTLIAKNEYG
SEQ ID NO:81TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
363-378的肽
AKNEYGKDEKQISAHF
SEQ ID NO:82TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
377-395的肽
HFMGWPGIDDGANPNYPDV
SEQ ID NO:83TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
379-385的肽
MGWPGID
SEQ ID NO:84TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
379-395的肽
MGWPGIDDGANPNYPDV
SEQ ID NO:85TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
379-396的肽
MGWPGIDDGANPNYPDVI
SEQ ID NO:86TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
379-397的肽
MGWPGIDDGANPNYPDVIY
SEQ ID NO:87TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
379-398的肽
MGWPGIDDGANPNYPDVIYE
SEQ ID NO:88TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His
418-435的肽
PSTDVTDKTGREHHHHHH
序列表
<110> 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司
<120> 用于治疗神经学和其它病症的结合激动剂
<130> PB65743
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人TrkB-胞外域
<400> 1
Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
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100 105 110
Ile Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr
165 170 175
Val Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp
180 185 190
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195 200 205
Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile
210 215 220
Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile
260 265 270
Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr
275 280 285
Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His
290 295 300
Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro
305 310 315 320
Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr
325 330 335
Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly
340 345 350
Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp
355 360 365
Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn
370 375 380
Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His
385 390 395
<210> 2
<211> 822
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
690 695 700
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
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740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
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Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
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820
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L2 (Kabat, Chothia, AbM)
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L2 (Kabat, Chothia, AbM)
<400> 4
Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L3 (Kabat, Chothia, AbM)
<400> 5
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H1 (Kabat)
<400> 6
Ser Tyr Tyr Ile Asn
1 5
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H2 (Kabat)
<400> 7
Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly
1 5 10 15
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H3 (Kabat, Chothia, AbM)
<400> 8
Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR L1 (Kabat)
<400> 9
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR L2 (Kabat)
<400> 10
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR L3 (Kabat)
<400> 11
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR H1 (Kabat)
<400> 12
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR H2 (Kabat)
<400> 13
Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 3A3 CDR H3 (Kabat)
<400> 14
Ser Arg Ala Ala Arg Tyr
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR L1 (Kabat)
<400> 15
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR L2 (Kabat)
<400> 16
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR L3 (Kabat)
<400> 17
Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR H1 (Kabat)
<400> 18
Thr Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR H2 (Kabat)
<400> 19
Thr Val Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 8E5 CDR H3 (Kabat)
<400> 20
Gly Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR L1 (Kabat)
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Phe Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR L2 (Kabat)
<400> 22
Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR L3 (Kabat)
<400> 23
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR H1 (Kabat)
<400> 24
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR H2 (Kabat)
<400> 25
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5D11 CDR H3 (Kabat)
<400> 26
Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 440
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly
50 55 60
Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
210 215 220
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
305 310 315 320
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
325 330 335
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
370 375 380
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
405 410 415
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
420 425 430
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 28
<211> 125
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 28
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe
1 5 10 15
Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly
20 25 30
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
35 40 45
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
50 55 60
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
65 70 75 80
Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp
85 90 95
Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu
100 105 110
Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
115 120 125
<210> 29
<211> 439
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 30
<211> 220
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
145 150 155 160
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
180 185 190
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
195 200 205
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215 220
<210> 31
<211> 440
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
210 215 220
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
305 310 315 320
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
325 330 335
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
370 375 380
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
405 410 415
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
420 425 430
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 32
<211> 215
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 32
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 33
<211> 441
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 33
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 34
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Phe Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Phe Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人TrkB D1-D3域缺失变体C32-L196
<400> 35
Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu
100 105 110
Ile Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu
165
<210> 36
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人TrkB D4-D5-JM域缺失变体P197-H430
<400> 36
Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val Glu Glu Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro Val Pro Asn Met
20 25 30
Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met Asn Glu Thr Ser
35 40 45
His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser Ser Asp Asp Ser
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val Gly Glu Asp Gln
65 70 75 80
Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe Leu
85 90 95
Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro Phe Thr Val Lys
100 105 110
Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu
115 120 125
Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val Thr Asn His Thr
130 135 140
Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn
145 150 155 160
Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys
165 170 175
Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala
180 185 190
Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly Thr Ala Ala
195 200 205
Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu Ile Pro Ser Thr
210 215 220
Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His
225 230
<210> 37
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人TrkB D5域缺失变体H284-H430
<400> 37
His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His
1 5 10 15
His Trp Cys Ile Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu
20 25 30
Gln Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys
35 40 45
Thr Lys Ile His Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln
50 55 60
Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala
65 70 75 80
Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met
85 90 95
Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val
100 105 110
Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr
115 120 125
Asn Arg Ser Asn Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly
130 135 140
Arg Glu His
145
<210> 38
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11嵌合Fab1 [来自1G11的可变区(VH)与来自人IgG1的恒定区(CH1)融合]
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly
50 55 60
Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11嵌合Fab1 [来自1G11的可变区(VL)与来自人IgG1的恒定区(CL1)]
<400> 39
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11 VH
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11 VL
<400> 41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11重链
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11轻链
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 44
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码人源化1G11重链的DNA
<400> 44
caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgaa gtcaaaaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc tcctactaca tcaactgggt gaggcaggct 120
cccggacagg gcctggagag catgggcagg atcgcccccg gcaacaccta ctacaacgag 180
atcttcaagg gcagggtgac catcactgcc gacaagagca ccagcaccgc ctacatggaa 240
ctgtctagcc tgaggagcga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagaag gggctacgag 300
ggcgccctgg actattgggg ccagggcaca ctagtgaccg tgtccagcgc cagcaccaag 360
ggccccagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgcc 420
ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gaaccggtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540
ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgtaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgtgac 660
aagacccaca cctgcccccc ctgccctgcc cccgagctgg ccggagcccc cagcgtgttc 720
ctgttccccc ccaagcctaa ggacaccctg atgatcagca gaacccccga ggtgacctgt 780
gtggtggtgg atgtgagcca cgaggaccct gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagccc agggaggagc agtacaacag cacctaccgg 900
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaagga gtacaagtgt 960
aaggtgtcca acaaggccct gcctgcccct atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc 1020
cagcccagag agccccaggt gtacaccctg ccccctagca gagatgagct gaccaagaac 1080
caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgat 1200
ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac 1260
gtgttcagct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca gaagagcctg 1320
agcctgtccc ctggcaag 1338
<210> 45
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11轻链的DNA
<400> 45
gagatcgtgc tgacccagag ccccgccact ctgagcctga gcccaggcga aagggcaacc 60
ctgagctgca gggcctccca gaggatcagc aacaacctgc actggtacca gcagaagccc 120
ggccaggccc ccaggctgct gatcaaatac gtgagccaga gcatcagcgg catccccgcc 180
aggtttagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccattagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtctacta ctgccagcag tctaacagct ggcccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tcgagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化3A3 VH
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化3A3 VL
<400> 47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 48
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化3A3 HC
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 49
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化3A3 LC
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 50
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码人源化3A3 HC的DNA
<400> 50
caggtccagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ccggcagctc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttctcc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cccggacagg gcctggagtg gatgggctac atcaacccca gcaccggcta caccgactac 180
aaccagaagt tcaaggacag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actattgcgc caggagcagg 300
gctgccaggt actggggcca gggcacacta gtgaccgtgt ccagcgccag caccaagggc 360
cccagcgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgaa ccggtgaccg tgtcctggaa cagcggagcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc cagcagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgtaacgtg 600
aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgtgacaag 660
acccacacct gccccccctg ccctgccccc gagctggccg gagcccccag cgtgttcctg 720
ttccccccca agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg 780
gtggtggatg tgagccacga ggaccctgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcaca atgccaagac caagcccagg gaggagcagt acaacagcac ctaccgggtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 960
gtgtccaaca aggccctgcc tgcccctatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag 1020
cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cctagcagag atgagctgac caagaaccag 1080
gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgatggc 1200
agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260
ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gagcctgagc 1320
ctgtcccctg gcaag 1335
<210> 51
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码人源化3A3 LC的DNA
<400> 51
gacatcgtga tgacccagag ccccgactct ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctcctg tacagcggca accagaagaa ctacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc aaactgctga tctactgggc tagcacaagg 180
gagagcggcg tgcctgatag gttcagcgga agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
attagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gccagcagta ctactcctac 300
ccctacacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaagc gtacggtggc cgcccccagc 360
gtgttcatct tcccccccag cgatgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgt 420
ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtgacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540
ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgt 600
gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaaccg gggcgagtgc 660
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化5D11 VH
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化5D11 VL
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Phe Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化5D11重链
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 55
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化5D11轻链
<400> 55
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Phe Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 56
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码人源化5D11重链的DNA
<400> 56
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtcaagaagc ccggcagctc cgtgaaggtg 60
agctgcaaag ccagcggcta cgccttcacc aactacctga tcgagtgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggagtg atcaatcccg gcagcggcgg caccaactac 180
aacgacaagt tcaagggcag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctcag gagcgaggac actgccgtgt actattgcgc caggggcggg 300
aacgattacg gcgactactg gggccagggc acactagtga ccgtgtccag cgccagcacc 360
aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgaaccgg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgt 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gacaagaccc acacctgccc cccctgccct gcccccgagc tggccggagc ccccagcgtg 720
ttcctgttcc cccccaagcc taaggacacc ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc 780
tgtgtggtgg tggatgtgag ccacgaggac cctgaggtga agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgtaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020
ggccagccca gagagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gcagagatga gctgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gatggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcagatg gcagcagggc 1260
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 1320
ctgagcctgt cccctggcaa g 1341
<210> 57
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人源化5D11轻链的DNA
<400> 57
gacatcgtga tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
attaactgca gggccagcca gagcgtgagc accagcttct actcctacat gcactggtac 120
cagcagaaac ccggccagcc ccccaaggtg ctgatcaaat acgccagcaa cctccagagc 180
ggcgtgcccg acaggttcag cggctcaggc tccggcaccg acttcacact gaccatcagc 240
agcctgcagg cagaggacgt ggccgtctac tactgccagc acagctggga gatcccctgg 300
accttcggcc agggaaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 360
atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420
aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480
ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540
agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600
acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1 (Chothia)
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH2 (Chothia)
<400> 59
Ala Pro Gly Asn
1
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1 (AbM)
<400> 60
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Asn
1 5 10
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH2 (AbM)
<400> 61
Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1 (接触)
<400> 62
Thr Ser Tyr Tyr Ile Asn
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11 CDRH2 (接触)
<400> 63
Cys Ile Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化1G11 CDRH2 (接触)
<400> 64
Ser Met Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH3
<400> 65
Ala Arg Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL1 (接触)
<400> 66
Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL2 (接触)
<400> 67
Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile
1 5 10
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL3 (接触)
<400> 68
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
1 5
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 源自人TrkB的肽
<400> 69
Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn
20
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 源自人TrkB的肽
<400> 70
Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 源自人TrkB的肽
<400> 71
His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro
1 5 10
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 283-291的肽
<400> 72
Gly His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 284-291的肽
<400> 73
His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe
1 5
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 292-316的肽
<400> 74
Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro Phe Thr Val
1 5 10 15
Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln
20 25
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 316-324的肽
<400> 75
Gln Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 317-324的肽
<400> 76
Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 318-324的肽
<400> 77
Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu
1 5
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 347-361的肽
<400> 78
Gln Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu
1 5 10 15
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 349-358的肽
<400> 79
Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp
1 5 10
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 351-368的肽
<400> 80
Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Gly
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 363-378的肽
<400> 81
Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe
1 5 10 15
<210> 82
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 377-395的肽
<400> 82
His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Val
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 379-385的肽
<400> 83
Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp
1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 379-395的肽
<400> 84
Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Val
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 379-396的肽
<400> 85
Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Val Ile
<210> 86
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 379-397的肽
<400> 86
Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Val Ile Tyr
<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 379-398的肽
<400> 87
Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Val Ile Tyr Glu
20
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His 418-435的肽
<400> 88
Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His His His His
1 5 10 15
His His

Claims (55)

1.TrkB结合激动剂，其中所述激动剂增强BDNF诱导的和/或NT-4诱导的TrkB激动。
2.TrkB结合激动剂，其维持细胞表面上的TrkB水平。
3.TrkB结合激动剂，其结合TrkB的D5域的β片层A和G内，和β片层A和A’之间的区域中包含的表位。
4.TrkB结合激动剂，所述TrkB结合激动剂：
a)与人TrkB的一个或多个以下残基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341；
b)以小于或等于接近选自下组的来自人TrkB的残基：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374、和S375；
c)结合人TrkB胞外域，其中将选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372(根据全长人TrkB编号)；
d)结合人TrkB并导致源自含有残基284-291(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
e)结合具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的肽。
5.TrkB结合激动剂，其结合包含在TrkB的近膜区(W381-H430)内的表位。
6.TrkB结合激动剂，所述TrkB结合激动剂：
a)结合人TrkB胞外域，其中将选自下组的残基突变为与没有突变的人TrkB胞外域相比具有改变的亲和力：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402；
b)结合人TrkB并导致源自含有残基385-398(根据全长人TrkB编号)的序列的部分或全部的人TrkB的肽，其与源自未复合的人TrkB的相应肽相比对氘掺入更具抗性；或
c)结合具有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的肽。
7.与参考抗体竞争结合TrkB的TrkB结合激动剂，所述参考抗体具有：
(a)SEQ ID NO:27的重链序列和SEQ ID NO:28的轻链序列；或
(b)SEQ ID NO:29的重链序列和SEQ ID NO:30的轻链序列；或
(c)SEQ ID NO:31的重链序列和SEQ ID NO:32的轻链序列。
8.TrkB结合激动剂，其包含：
(a)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(c)如SEQ ID NO:27或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
9.根据权利要求8的TrkB结合激动剂，其包含：
(a)如SEQ ID NO:3或其变体中所示的CDRL1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；
(b)如SEQ ID NO:5或其变体中所示的CDRL3，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(c)如SEQ ID NO:8或其变体中所示的CDRH3，该变体具有1、2或3个氨基酸。
10.根据权利要求8或权利要求9的TrkB结合激动剂，其中CDRL1内的修饰不在残基R28、S30和N32(自SEQ ID NO:28编号)中，其中CDRL3内的修饰不在残基N92和S93(自SEQ ID NO:28编号)中，并且其中CDRH3中的修饰不在残基R97、Y99和E100(自SEQ ID NO:27编号)中。
11.根据权利要求10的TrkB结合激动剂，其中所述CDRL1内的修饰不在残基I29中。
12.根据权利要求10的TrkB结合激动剂，其中所述CDRL1内的修饰不在残基N31中。
13.根据权利要求10的TrkB结合激动剂，其中所述CDRL3内的修饰不在残基S91和W94中。
14.根据权利要求9的TrkB结合激动剂，其包含：
(a)如SEQ ID NO:3中所示的CDRL1；
(b)如SEQ ID NO:5中所示的CDRL3；和
(c)如SEQ ID NO:8中存在的CDRH3。
15.根据权利要求8至14中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂另外包含如SEQ ID NO:27或其变体中所示的CDRH2，或SEQ ID NO:40或其变体中所示的CDRH2，其中所述变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
16.根据权利要求15的TrkB结合激动剂，其中CDRH2如SEQ ID NO:7或其变体中所示，所述变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
17.根据权利要求15或权利要求16的TrkB结合激动剂，其中CDRH2内的修饰不在残基R50(自SEQ ID NO:27编号)中。
18.根据权利要求17的TrkB结合激动剂，其中CDRH2内的修饰不在残基Y57(自SEQ IDNO:27编号)中。
19.根据权利要求16的TrkB结合激动剂，其中CDRH2如SEQ ID NO:7中所示。
20.根据权利要求8至19中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述结合激动剂另外包含：
(a)如SEQ ID NO:28或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰，和
(b)如SEQ ID NO:27或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
21.根据权利要求20的TrkB结合激动剂，其中：
(a)如SEQ ID NO:4或其变体中所示的CDRL2，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰；和
(b)如SEQ ID NO:6或其变体中所示的CDRH1，该变体具有1、2或3个氨基酸修饰。
22.根据权利要求20或权利要求21的TrkB结合激动剂，其中CDRL2中的修饰不在残基Y50(自SEQ ID NO:28编号)中，并且其中CDRH1中的修饰不在残基Y33(自SEQ ID NO:27编号)中。
23.根据权利要求20或权利要求21的TrkB结合激动剂，其中CDRH1中的修饰不在残基S31(自SEQ ID NO:27编号)中。
24.根据权利要求21的TrkB结合激动剂，其中：
(a)CDRL2如SEQ ID NO:4中所示；和
(b)CDRH1如SEQ ID NO:6中所示。
25.TrkB结合激动剂，其包含含有与SEQ ID NO:40的序列至少80％相同的序列的VH区和/或含有与SEQ ID NO:41的序列至少76％相同的序列的VL区。
26.TrkB结合激动剂，其包含：
(a)与SEQ ID NO:42至少90％相同的重链(HC)序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:43至少85％相同的轻链(LC)序列。
27.根据权利要求25或26的TrkB结合激动剂，其中对应于SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42的位置47是Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
28.根据权利要求25至27中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述CDR序列如权利要求8至24中任一项所定义。
29.根据权利要求25至27中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述CDR序列如权利要求8至24中任一项所定义，并且其中所述百分比同一性是在排除所述CDR的序列上计算的。
30.根据权利要求25的TrkB结合激动剂，其包含：
(a)SEQ ID NO:40的VH区；和/或
(b)SEQ ID NO:41的VL区。
31.根据权利要求26的TrkB结合激动剂，其包含：
(a)SEQ ID NO:42的重链(HC)序列；和/或
(b)SEQ ID NO:43的轻链(LC)序列。
32.根据权利要求2至31中任一项的TrkB结合激动剂，其不与BDNF和/或NT-4竞争对TrkB的结合。
33.根据权利要求3至31中任一项的TrkB结合激动剂，其中所述激动剂增强BDNF诱导的和/或NT-4诱导的TrkB激动。
34.根据权利要求1或权利要求33的TrkB结合激动剂，其中BDNF诱导的或NT-4诱导的TrkB激动的增强效果是通过与不存在TrkB结合激动剂相比在存在TrkB结合激动剂的情况下在饱和浓度的BDNF或NT-4存在下增加的TrkB激活来测量的。
35.根据权利要求34的TrkB结合激动剂，其中增加的TrkB激活是通过增加的TrkB磷酸化水平来测量的。
36.根据权利要求35的TrkB结合激动剂，其中在饱和浓度的BDNF或NT-4存在下TrkB的磷酸化在不存在TrkB结合激动剂的情况下为100％，相比之下在存在TrkB结合激动剂的情况下为至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％或至少150％。
37.根据权利要求1或权利要求3至36中任一项的TrkB结合激动剂，其维持细胞表面上的TrkB水平。
38.根据前述权利要求中任一项的TrkB结合激动剂，其在人和猕猴TrkB的磷酸化中表现出小于或等于5倍的EC50差异。
39.一种或多种核酸序列，其编码如前述权利要求中任一项所定义的TrkB结合激动剂。
40.根据权利要求39的一种或多种编码TrkB结合激动剂的核酸序列，其包含编码重链的SEQ ID NO:44；和/或编码轻链的SEQ ID NO:45。
41.一种或多种表达载体，其包含如权利要求39或40中定义的一种或多种核酸序列。
42.重组宿主细胞，其包含如权利要求39或40中定义的一种或多种核酸序列或如权利要求41中定义的一种或多种表达载体。
43.产生如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂的方法，所述方法包括在适合于表达所述核酸序列或载体的条件下培养如权利要求42的宿主细胞。
44.药物组合物，其包含如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的一种或其组合。
45.如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如权利要求44所定义的药物组合物，其用于治疗。
46.如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如权利要求44所定义的药物组合物，其用于治疗神经学病症。
47.如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如权利要求44所定义的药物组合物，其用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
48.在有此需要的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如权利要求44所定义的药物组合物。
49.在有此需要的受试者中治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂或如权利要求44中定义的药物组合物。
50.如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂在制备用于治疗神经学病症的如权利要求44所定义的药物组合物中的用途。
51.如权利要求1至38中任一项所定义的TrkB结合激动剂在制备如权利要求44所定义的药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗神经学病症或通过激活TrkB来恢复或增强BDNF-TrkB途径能受益的其它病症。
52.根据权利要求46或47使用的TrkB结合激动剂、根据权利要求48或49的方法、或根据权利要求50或51的用途，其中所述病症是：神经变性疾病、视神经病、视网膜变性状况、累及听觉丧失的病症、精神病症、神经发育病症、体重调节病症、肌肉病症和另一种CNS病症。
53.根据权利要求52使用的TrkB结合激动剂、方法或用途、其中所述病症是视神经病。
54.根据权利要求52使用的TrkB结合激动剂、方法或用途、其中所述病症是：肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病(AD)、运动神经元病、帕金森氏病、朊病毒病、Lewy体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆和tau病变、青光眼、前部缺血性视神经病(AION)、后部缺血性视神经病、放射视神经病、压迫性视神经病、线粒体视神经病、毒性视神经病、创伤性视神经病、遗传性视神经病、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、神经性聋、耳蜗性聋、耳鸣、感音神经性听觉丧失、复合性听觉丧失、焦虑、心境障碍、抑郁、惊恐障碍、创伤后应激障碍(PTSD)、注意缺陷多动障碍(ADHD)、双相型障碍、精神分裂症、Angelman综合征、Prader-Willi综合征、孤独性障碍、Rett综合征、神经性厌食、恶病质、不想要的重量减轻、少肌症、肥胖、阿片样物质诱导的呕吐、少肌症、糖尿病神经病变、癫痫、多发性硬化、偏头痛、神经损伤、周围神经病、神经肌肉疾病、睡眠障碍和中风。
55.根据权利要求46至54中任一项的使用的TrkB结合激动剂、方法或用途，其中治疗包括细胞存活和/或神经元修复和/或神经元可塑性的增强。
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