BRPI0707482A2 - métodos para tratar perda indesejada de peso ou distúbios de alimentação por administração de um agonista de trkb, bem como uso de nt-4/5 e de um agonista de trkb - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA TRATAR PERDA INDESEJADA DE PESO OU DISTúRBIOS DE ALIMENTAçãO POR ADMINISTRAçãO DE UM AGONISTA DE TRKB, BEM COMO USO DE NT-415 E DE UM A- GONISTA DE TRKB. A presente invenção refere-se a métodos para tratamento de perda de peso indesejada (tais como associada a caquexia e a envelhecimento), distúrbios de alimentação (tais como anorexia nervosa), ou êmese induzida por opioide por administração periférica de um agonista de trkB. A invenção também refere-se a composições e kits compreendendo um agonista de trkB.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA TRATAR PERDA INDESEJADA DE PESO OU DISTÚRBIOS DEALIMENTAÇÃO POR ADMINISTRAÇÃO DE UM AGON!STA DE TRKB".

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao uso de um agonista de trkB notratamento e/ou prevenção de perda indesejada de peso, distúrbios dealimentação ou êmese induzida por opióide.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Neurotrofinas são uma família de pequenas proteínas,homodiméricas, que desempenham um papel crucial no desenvolvimento emanutenção do sistema nervoso. Membros da família das neurotrofinasincluem fator de crescimento de nervo (NGF)1 fator neurotrófico derivado docérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4/5 (NT-4/5),neurotrofina-6 (NT-6), e neurotrofina-7 (NT-7). Neurotrofinas, similarmenteaos outros fatores de crescimento de polipeptídeos, afetam suas células alvoatravés de interações com receptores celulares. De acordo com oconhecimento atual, dois tipos de glicoproteínas de transmembranas servemcomo receptores de neurotrofinas. Neurônios responsáveis por neurotrofinaspossuem um baixo peso molecular comum (65-80 kDa), receptor com baixaafinidade (LNGFR), também conhecido como 75NTR ou p75, que se liga aNGF1 BDNF, NT-3 e NT-4/5 com um K0 de 2x10 9 M; e grande pesomolecular (130-150 kDa), alta afinidade a receptores (KD na faixa de 10"11M), que são membros da família trk do receptor de tirosina quinases. Osmembros identificados da família do receptor de Trk são trkA, trkB, e trkC.

Ambos o BDNF e a NT-4/5 se ligam aos receptores de trkB ep75NTR com afinidade similar. Entretanto, camundongos com NT-4/5 eBDNF mutantes exibem fenótipos bem contrastantes. Ao passo quecamundongos NT-4/5"'" são viáveis e férteis apenas com um leve déficitsensorial, ratos BDNFv" morrem nas primeiras horas dos estágios pós-nataiscom graves déficits neuronais e sintomas comportamentais. Fan et al., Nat.Neurosci. 3(4):350-7, 2000; Liu et al., Nature 375:238-241, 1995; Conover etal., Nature 375:235-238, 1995; Ernfors et al., Nature 368:147-150, 1994;Jones et ai., Cell 76:989-999, 1994. Diversas publicações informam que NT-4/5 e BDNF têm atividades biológicas distintas in vivo e sugerem que asatividades distintas podem resultar parcialmente da ativação diferencial doreceptor de trkB e suas vias de sinalização fluxo abaixo por NT-4/5 e BDNF.Fan et al., Nat. Neurosci. 3(4):350-7, 2000; Minichiello et al., Neuron. 21:335-45, 1998; Wirth et al., Development. 130(23):5827-38, 2003; Lopez et al.,Program No. 38.6, 2003 Abstract, Society for Neuroscience.

Mostrou-se que BDNF e NT-4/5 têm atividade de controle daglicose do sangue e do lipídeo do sangue e atividade anti-obesidade emanimais modelo de diabete do tipo II, tais como camundongos C57db/db.Pat. U.S. No. 6,391,312; Itakura et al., Metabolism 49:129-33 (2000); Pedidode Pat. U.S. N0 2005/0209148; WO 2005/082401. Também foi mostrado queBDNF possui uma atividade anti-obesidade e atividade no aperfeiçoamentoda resistência a Ieptina em camundongos alimentados com uma dieta de altaingestão de gorduras. Pedido de Pat. U.S. N0 2003/0036512. Kernie et al.relatou que BDNF ou NT-4/5 poderiam transientemente reverter ocomportamento de alimentação e obesidade em camundongos nocauteadoscom BDNF heterozigoto nos quais a expressão genética de BDNF foireduzida. Kernie et al., EMBO J. 19(6): 1290-300, 2000. Tem sido relatadoque a mutação de novo de sentido errado da substituição de Y722C na trkBhumana resulta em um receptor de fosforilação aperfeiçoado e sinalizaçãode uma MAP quinase; e esta mutação parece causar em uma síndromehumana de obesidade hiperfágica única. Yeo et al., Nat. Neurosci. 7:1187-1189(2004).

Níveis circulantes de BDNF em pessoas com obesidade e empacientes com anorexia nervosa têm sido estudados. Monteleone et al.,Psychosomatic Medicine 66:744-748, 2004; Nakazato et al., Biol. Psyehiatry54:485-490, 2003. Contrariamente à previsão baseada nas verficações deque aperfeiçoamentos da produção do BDNF em camundongos estiveramassociados com um aumento de alimento, pequeno gasto com energia, eganho de peso, o BDNF circulante é significativamente reduzido empacientes com anorexia nervosa e significativamente aumentado emindivíduos obesos, se comparado com os controles saudáveis não-obesos.Foi formulada uma hipótese de que na anorexia nervosa, a redução doBDNF por promoção da ingestão de alimentos, tentativas de contraequilibraros comportamentos alterados dos pacientes que levam a um equilíbrionegativo e à obesidade, níveis aumentados do BDNF podem representar ummecanismo adaptativo agindo contra a condição do desequilíbrio de energiapositiva através do estímulo do gasto de energia e diminuição da ingestão dealimentos. Monteleone et al., Psychosomatic Medicine 66:744-748, 2004.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadosaqui são incorporados aqui como referência na sua totalidade para todos ospropósitos na mesma extensão como se cada publicação individual, patenteou pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicadospara serem assim incorporados como referência.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos para o aumento de pesocorporal e/ou ingestão de alimentos por administração periférica de umagonista de trkB, incluindo um agonista seletivo de trkB. Esses métodospodem ser usados para tratamento ou prevenção da perda indesejada depeso (tal como com caquexia ou com envelhecimento), distúrbios dealimentação (tais como anorexia nervosa), e êmese induzida por opióide.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para o aumento dopeso corporal em um primata compreendendo a administração periférica aoprimata de uma quantidade eficaz de um agonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para oaumento da ingestão de alimentos em um primata compreendendo aadministração periférica ao primata de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos paratratamento ou prevenção de caquexia em um primata compreendendo aadministração periférica ao primata de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos paramelhorar, reduzir a incidência de, ou retardar o desenvolvimento ouprogressão da caquexia em um primata compreendendo a administraçãoperiférica ao primata de uma quantidade eficaz de um agonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para otratamento da perda indesejada de peso em um primata compreendendo aadministração periférica ao primata de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto a invenção fornece métodos paraaperfeiçoar, reduzir a incidência de, ou retardar o desenvolvimento ouprogressão da perda progressiva de peso em um primata compreendendo aadministração periférica ao primata de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ouprevenir a anorexia nervosa em um primata compreendendo a administraçãoperiférica ao primata de uma quantidade eficaz de um agonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos paraaperfeiçoar, reduzir a incidência de, ou retardar o desenvolvimento ouprogressão da anorexia nervosa em um primata, que compreende aadministração periférica ao primata de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ouprevenir a êmese induzida por opióide em um indivíduo, compreendendo aadministração periférica ao indivíduo de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos paraaperfeiçoar, reduzir a incidência de, ou retardar o desenvolvimento ouprogressão da êmese induzida por opióide em um indivíduo compreendendoa administração periférica ao indivíduo de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

O agonista de trkB é administrado perifericamente. Por exemplo,o agonista de trkB pode ser administrado por um dos seguintes meios: intra-venosamente, intra-peritonealmente, intra-muscularmente, sub-cutanea-mente, parenteralmente, via inalação, intra-arterialmente, intra-cardiaca-mente, intra-ventricularmente, e trans-dermicamente.

Em alguns modos de execucao, o individuo e um primata. Emalguns modos de execução, o primata é um humano.

O agonista de trkB que pode ser usado para os métodosdescritos aqui inclui, mas não está limitado a, polipeptídeo de BDNF,polipeptídeo de NT-4/5, e anti-agonista de anticorpos de trkB. Em algunsmodos de execução, o agonista de trkB é NT-4/5 humano. Em alguns modosde execução, o agonista de trkB é BDNF humano.Em outros modos deexecução o agonista de trkB é um anti-agonista de anticorpo de trkB,incluindo um anti-agonista do anticorpo de trkB que é seletivo de trkB. Emalguns modos de execução o anticorpo de anti-trkB é humano ouhumanizado.

Em um outro aspecto, a invenção fornece composiçõesfarmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um agonista detrkB, incluindo um agonista seletivo de trkB, e um excipientefarmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem serusadas para tratar ou evitar quaisquer das doenças descritas aqui.

Em um outro aspecto, a invenção fornece kits compreendendoum agonista de trkB para uso em quaisquer dos métodos descritos aqui. Em1 alguns modos de execução, o kit compreende um recipiente, umacomposição compreendendo uma quantidade eficaz de um agonista de trkB,em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, einstruções para usar a composição em quaisquer dos métodos descritosaqui.

Em um outro aspecto, a invenção também fornece métodos paragerar um anticorpo monoclonal que especificamente liga e ativa um receptor,compreendendo as etapas de: (a) imunização de um mamífero hospedeirocom uma molécula imunogênica compreendendo um.domínio extracelular doreceptor por injeção da molécula imunogênica no mamífero pelo menos duasvezes num prazo de cerca de 15 dias. Os métodos ainda podemcompreender as etapas de fusão de células linfóicas do mamífero imunizadocom uma linha celular imortalizada para produzir hibridomas que secretamanticorpos monoclonais; cultivo dos hibridomas sob condições que permitema secreção de anticorpos monoclonais; e seleção de um hibridoma quesecreta um anticorpo monoclonal que liga e ativa o receptor. Em algunsmodos de execução, o receptor é um receptor que requer dimerização paraa ativação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico que mostra o efeito da infusão diária deNT-4/5 no peso corporal em babuínos fêmeas obesas. O eixo X correspondea dias nos quais o peso corporal foi medido e o eixo Y corresponde ao pesocorporal medido como uma porcentagem da linha de base (peso corporalantes de qualquer tratamento). ANOVA dupla (two way) foi usada paracomparar o grupo tratado com NT-4/5 e o grupo tratado com o veículo. Osdados indicaram que o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5 diferiasignificativamente do grupo tratado com o veículo (F=50,71, P<0,0001). Aanálise dos testes posteriores de Bonferroni mostrarou uma diferençasignificativa dos pares entre o grupo tratado com NT-4/5 (triângulos sólidos)e o grupo do veículo (quadrados abertos). * indica P<0,05; ** indica P<0,01;e *** indica P<0,001 conforme indicado no gráfico.

A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito da infusão diária deNT-4/5 na ingestão de alimentos em babuínos fêmeas obesas. O eixo Xcorresponde a dias nos quais a ingestão de alimentos foi medida e o eixo Ycorresponde ao número de biscoitos comidos por um babuíno por dia.ANOVA dupla (two way) foi empregada para comparar o grupo tratado comNT-4/5 com o grupo tratado com o veículo. Dados indicaram que a ingestãode alimento do grupo tratado com NT-4/5 diferia significativamente do grupotratado com veículo (F=262,5, P<0,0001). Os testes posteriores deBonferroni mostraram diferença significativa de pares entre o grupo tratadocom NT-4/5 (triângulos sólidos) e o grupo tratado com o veículo (quadradoaberto). A barra preta sólida no gráfico indica o período quando acomparação dos pares resultou em P<0,05 ou menos.

A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito da infusão de NT-4/5, duas vezes por semana, no peso corporal de babuínos fêmeas obesas.O eixo X corresponde a dias nos quais o peso corporal foi medido e o eixo Ycorresponde ao peso corporal medido como uma porcentagem da linha debase (peso corporal antes de qualquer tratamento). ANOVA dupla (two way)foi empregada para comparar o grupo tratado com NT-4/5 com o grupo doveículo. Os dados indicaram que o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5 difere significativamente do grupo tratado com o veículo (F=34,81,P<0,0001). A análise dos testes posteriores de Bonferroni mostraramdiferença significativa de pares entre o grupo tratado com NT-4/5 (triângulossólidos) e o grupo tratado com o veículo (quadrados abertos). * indicaP<0,05; e ** indica P<0,01.

A Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito da infusão NT-4/5duas vezes por semana na ingestão de alimentos em babuínos fêmeasobesas. O eixo X corresponde a dias nos quais o peso corporal foi medido eo eixo Y corresponde ao número de biscoitos comidos por um babuíno por dia.

A Figura 5 é um gráfico que mostra o efeito da infusão diária deNT-4/5 e semanal peguilada no peso corporal em macacos cinomolgusmagros. O eixo X corresponde a dias quando o peso corporal foi medido e oeixo Y corresponde ao peso corporal medido como uma porcentagem dalinha de base (peso corporal antes de qualquer tratamento). ANOVA duplafoi empregada para comparar o grupo tratado com NT-4/5 ou o NT-4/5peguilado (PEG-NT-4/5) com o grupo tratado com o veículo. Dadosindicaram que o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5, mas o grupotratado com NT-4/5 não peguilado, diferia significativamente do grupotratado com o veículo (F=54,98, P<0,0001). A análise posterior dos testesmostrou uma diferença significativa dos pares entre o grupo tratado com NT-4/5 (triângulos) e o grupo tratado com o veículo (quadrados), mas não entreo grupo NT-4/5 peguilado (triângulos invertidos) e o grupo tratado com oveículo. *** indica P<0,001 como indicado no gráfico.

A Figura 6 é um gráfico que mostra o efeito da ingestão diária deNT-4/5 e a infusão de NT-4/5 peguilado semanalmente na ingestão dealimentos em macacos cynomolgus magros. O eixo X corresponde aos diasnos quais a ingestão de alimento foi medida e o eixo Y corresponde aonúmero de biscoitos comidos por dia. ANOVA dupla foi empregada paracomparar o grupo tratado com NT-4/5 ou o grupo tratado com NT-4/5peguilado (PEG-NT-4/5) com o grupo tratado com o veículo. Os dadosindicaram que o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5, mas não ogrupo tratado com NT-4/5 peguilado, diferia significativamente do grupotratado com o veículo (F=33,82, P<0,0001). Os testes posteriores deBonferroni mostraram uma diferença significativa nos pares (P<0,05 oumenos) entre o grupo tratado com NT-4/5 (triângulos) e o grupo tratado como veículo (quadrados) no dia 15, 16, 17, 19, 22, 23, 25, e 30, mas nenhumadiferença significativa nos pares entre o grupo NT-4/5 peguilado (triângulosinvertidos) e o grupo tratado com o veículo.

A Figura 7 é um gráfico que mostra o efeito de injeção diária deNT-4/5 e injeção diária de NT-4/5 peguilada subcutânea no peso corporal emmacacos cynomolgus magros. O eixo X corresponde a dias quando o pesocorporal foi medido e o eixo Y corresponde ao peso corporal medido comouma porcentagem da linha de base (peso corporal antes de qualquertratamento). ANOVA dupla foi usada para comparar o grupo tratado com NT-4/5 ou com NT-4/5 (PEG-NT-4/5) peguilado com o grupo tratado com oveículo. Os dados indicaram que o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5 diferia significativamente do grupo tratado com o veículo (F=19,10,P<0,0001). A análise posterior dos testes de Bonferroni mostrou umadiferença significativa dos pares entre o grupo tratado com NT-4/5(triângulos) e o grupo tratado com o veículo (quadrados), e entre o grupotratado com NT-4/5 peguilado (triângulos invertidos) e o grupo tratado comveículo. *** indica P<0,001; e ** indica P<0,01.

A Figura 8 é um gráfico que mostra o efeito de uma únicainjeção de NT-4/5 em uma êmese induzida por morfina em furões. O eixo Xcorresponde ao tipo de medicamento injetado, e o eixo Y corresponde aonúmero de ânsias de vômito e vômitos por um período de 60 minutos após ainjeção. ANOVA simples com um pós-teste de Dunnett foi usada paraanálise estatística. Os valores P são indicados no gráfico.

A Figura 9A e a Figura 9B mostram a indução de c-Fos nocérebro posterior de furões por NT-4/5. A Figura 9A mostra o número denúcleos que são manchados por um anticorpo anti-c-Fos na área dapostrema. A Figura 9B mosta o número de núcleos que são manchados peloanticorpo anti-c-Fos no núcleo vagai dorsal.

A Figura 10 mostra o nível de fosforilação de tirosina trkB noteste KIRA por vários anticorpos anti-trkB (36D1, 38B8, 37D12, 19H8(1),1F8, 23B8, 18H6) em comparação com o NT-4/5 humano.

A Figura 11 mostra um gráfico da sobrevivência de neurôniosnodosos suportados por diversos agonistas de anticorpos trkB. O eixo Xrepresenta as diferentes concentrações de anticorpos anti-trkB adicionadosà cultura de neurônios nodosos do dia embriônico 15 (E15) obtida decamundongos suíços Webster. O eixo Y representa o número de neurôniossobreviventes 48 horas após colocação em pratos. Cada ponto é uma médiade quatro determinações e as barras de erro mostram a variância daquelamédia de um desvio padrão. Os dados indicam que alguns dos anticorpostrkB testados podem suportar a sobrevivência dos neurônios nodosos, e quea concentração 50% eficaz (EC50) desses anticorpos, sob esta condição decultura, varia de menos que 0,1 até mais do que 10 pM (Ver tabela 1).

A Figura 12A e a Figura 12B são gráficos que mostram o efeitode injeções intracranianas de anti-agonistas anticorpos trkB no peso corporal(Figura 12A) e na ingestão de alimentos em camundongos. Anticorpos e NT-4/5 foram injetados no dia. O peso corporal e a ingestão de alimentos forammedidos diariamente até o dia 15. *** indica P<0,001 se comparado aocontrole de IgG do camundongo; ** indica P<0,01 se comparado ao controledo IgG do camundongo; e * indica P<0,05 se comparado ao controle IgGcamundongo.

A Figura 13A e a Figura 13B são gráficos que mostram o efeitode injeções intravenosas periféricas anti-agonistas do anti-corpo trkB nopeso corporal (Figura 13A) e a ingestão de alimento (Figura 13B) emmacacos cynomolgus. Anticorpos foram injetados no dia 1. O peso corporalfoi monitorado semanalmente e a ingestão de alimentos foi monitoradadiariamente. *** indica P>0,001 se comparado ao veículo de controle; **indica P>0,01 se comparado ao veículo de controle; e * indica P>0,05 secomparedo ao veículo de controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir aperda indesejada de peso (tal como associada a caquexia, tal comoassociada a envelhecimento), distúrbios alimentícios (tais como anorexianervosa), e êmese induzida por opióide, compreendendo a administração deum agonista de trkB a um indivíduo ou um "objeto de estudo (sujeito)".

I. Técnicas Gerais

A pratica da presente invenção empregará, a menos queindicada de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular(incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular,bioquímica e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Taistécnicas são totalmente explicadas na literatura, tal como, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook, et ai, 1989) Cold SpringHarbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait1 ed., 1984); Methods inMolecular Biologyl Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed.,1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts,1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A.Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of ExperimentalImmunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors forMammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocolsin Molecular Biology (F.M. Ausubel, et ai, eds., 1987); PCfí: The PolymeraseChain Reaction, (Mullis, et ai, eds., 1994); Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wileyand Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a praetical approach (D. Catty., ed.,IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a praetical approach (P.Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Usingantibodies: a Iaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds.,Harwood Academic Publishers, 1995).

II. Definições

Conforme usado aqui, "tratamento" é uma abordagem paraobtenção do benefício ou resultados clínicos desejados. Para os propósitosdesta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, masnão estão limitados a, um ou mais dos seguintes: aperfeiçoamento,diminuição da gravidade, alívio de um ou mais sintomas associados a umadoença. Por exemplo, para o tratamento de caquexia e/ou perda de pesoindesejada, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas nãoestão limitados a, qualquer aperfeiçoamento, diminuição da gravidade e/oualívio de quaisquer um ou mais dos seguintes: perda de peso, lipolise, perdade músculo e proteína visceral, anorexia (i.e., perda de apetite), ingestão dealimentos/calórica reduzida, náusea crônica, fadiga e fraqueza. Para otratamento da anorexia nervosa, resultados clínicos benéficos ou desejadosincluem, mas não estão limitados a, quaisquer um ou mais dos seguintes:melhora do apetite, atenuação da rejeição a comida, ganho de peso,manutenção do status nutricional normal, hidratação e equilíbrio eletrolítico,1 manutenção do peso corporal normal para idade e altura, redução dafreqüência e duração da hospitalização e redução do risco de morte. Para otratamento da êmese induzida por opióide, resultados clínicos benéficos oudesejados incluem, mas não estão limitados a, diminuição da gravidade e/ouredução da duração da náusea e/ou vômito, permitindo assim todos osbenefícios clínicos de alívio da dor induzida por opióide.

"Melhoramento" de uma doença ou de um ou mais sintomas dadoença significa uma diminuição ou melhoria de um ou mais sintomasassociados com a doença se comparado à não administração de umagonista de trkB. "Melhoramento" também inclui o encurtamento ou reduçãona duração de um sintoma.

"Redução da incidência" de uma doença significa qualquerredução da gravidade (que pode incluir a redução da necessidade de e/ouquantidade de (por exemplo, exposição a) outros medicamentos e/outerapias geralmente empregados para esta condição), duração, e/oufreqüência (incluindo, por exemplo, retardar ou aumentar o tempo para opróximo ataque episódico em um indivíduo). Conforme é compreendido poraqueles com conhecimento na arte, indivíduos podem variar em termos desua resposta a um tratamento, e, como tal, por exemplo, um método deredução da incidência de uma doença em um indivíduo reflete aadministração do agonista de trkB baseado em uma expectativa razoávelque tal administração pode causar, tal como uma redução da incidêncianeste indivíduo em particular.

Como usado aqui, "retardar" o desenvolvimento de uma doençasignifica deferir, impedir, tornar mais lento, retardar, estabilizar e/oupostergar a progressão da doença. Este atraso pode ser de vários períodosde tempo, dependendo do histórico da doença e/ou dos indivíduos sendotratados. Como está claro para um especialista na técnica, um atrasosuficiente ou significativo, com efeito, abrange a prevenção, no sentido deque o indivíduo não desenvolve a doença (p.ex., caquexia, anorexianervosa, e êmese induzida por opióide). Um método que "retarda" odesenvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabilidade dedesenvolver o sintoma em um dado espaço de tempo e/ou reduz a extensãodos sintomas em um dado espaço de tempo, quando comparado ao não usodo método. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudosclínicos usando um número estatisticamente significativo de animais.

"Desenvolvimento" ou "progressão" de uma doença significamanifestações iniciais e/ou progressão subsequente do distúrbio. Odesenvolvimento de uma doença pode ser detectável e avaliado usandotécnicas clínicas padrão bastante conhecidas na técnica. Entretanto, odesenvolvimento também se refere à progressão que pode ser nãodetectável. Para o propósito desta invenção, desenvolvimento ou progressãorefere-se ao curso biológico dos sintomas. "Desenvolvimento" inclui aocorrência, recorrência e manifestação. Conforme usado aqui "início" ou"recorrência" de uma doença inclui a manifestação inicial e/ou recorrência.

Conforme usado aqui, uma "dosagem eficaz" ou "quantidadeeficaz" de medicamento, composto, ou composição farmacêutica é umaquantidade suficiente para obter resultados benéficos ou desejados. Parauso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem resultados taiscomo a eliminação ou redução do risco, diminuição da gravidade, ou retardoda manifestação da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicose/ou comportamentais da doença, e suas complicações e fenótipospatológicos intermediários presentes durante o desenvolvimento da doença.

Para uso terapêutico, resultados benéficos ou desejados incluem resultadosclínicos tais como redução da intensidade, duração ou freqüência damanifestação da doença, e diminuição de um ou mais sintomas resultantesda doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suascomplicações e fenótipos patológicos intermediários presentes durante odesenvolvimento da doença, aumentando a qualidade de vida daqueles quesofrem da doença, diminuição da dose de outros medicamentos requisitadospara tratar a doença, aumentando o efeito de outra medicação e/ou retardoda progressão da doença desses pacientes. Uma dosagem eficaz pode seradministrada em uma ou mais administrações. Para os propósitos destainvenção, uma dosagem eficaz de medicamento, composto, ou composiçãofarmacêutica é uma quantidade suficiente para obter tratamento profiláticoou terapêutico tanto diretamente quanto indiretamente. Como écompreendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de ummedicamento, composto ou composição farmacêutica, pode ou não serconseguido em conjunto com outro medicamento, composto, ou composiçãofarmacêutica. Portanto, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada nocontexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um agentesimples pode ser considerado fornecido em uma quantidade efetiva se, emconjunto com um ou mais outros agentes é obtido um resultado desejável.

Um "indivíduo" ou um "objeto de estudo (sujeito)" é ummamífero, mais preferentemente um humano. Mamíferos também incluem,mas não estão limitados a animais de fazenda, animais para esporte,primatas (incluindo humanos), cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.

Um "agonista de trkB" refere-se a um agente que é capaz deligar e ativar um receptor de trkB e/ou via(s) fluxo abaixo mediados pelafunção de sinalização de trkB. Por exemplo, o agonista pode ligar o domínioextracelular de um receptor de trkB e assim causar a dimerização doreceptor, resultando na ativação do domínio intracelular catalítico daquinase. Consequentemente, isto pode resultar na estimulação docrescimento e/ou diferenciação de células que expressam o receptor in vitroe/ou in vivo. Em alguns modos de execução, um agonista de trkB se liga atrkB e ativa uma atividade biológica de trkB.

"Atividade biológica", quando usado em conjunto com o agonistade trkB da presente invenção, geralmente refere-se ao fato de ter acapacidade de ligar e ativar o receptor de trkB e/ou uma via fluxo abaixomediada pela função de sinalização de trkB. Conforme usado aqui,"atividade biológica" abrange uma ou mais funções efetuadoras em comumcom aquelas induzidas pela ação de NT-4/5 e/ou BDNF, o Iigante nativo detrkB, em uma célula que expressa trkBI. Sem limitação, atividades biológicasincluem quaisquer um ou mais dos seguintes: capacidade de ligar e ativartrkB; capacidade de promover e/ou regenerar a dimerização do receptor detrkB; a capacidade de promover o desenvolvimento, sobrevivência, função,manutenção e/ou regeneração de células (incluindo células danificadas) emparticular neurônios in vitro ou in vivo, incluindo neurônios periféricos(simpáticos, sensoriais, motor, e entéricos) e neurônios centrais (cerebrais eda espinha dorsal), e células não-neuronais, por exemplo, leucócitos dosangue periférico, células endoteliais e células musculares lisas vasculares.Uma atividade biológica particularmente preferida é a capacidade deaumentar o peso corporal e/ou a ingestão de comida em um primata quandoadministrada perifericamente, para tratar (incluindo prevenção de) um oumais sintomas de caquexia e anorexia nervosa em um primata, e/ou detratar (incluindo a prevenção de) um ou mais sintomas da êmese induzidapor opióide em um mamífero.

Um "agonista de anticorpo de anti-trkB" (intercambiávelmentedenominado "agonista de anticorpo de anti-trkB") refere-se a um anticorpoque é capaz de ligar e ativar um receptor de trkB e/ou via(s) fluxo abaixomediadas pela função de sinalização de trkB. Por exemplo, o anticorpo deagonista pode ligar-se ao domínio extracelular de um receptor de trkB eassim causar a dimerização do receptor, resultando na ativação do domíniointracelular cataiítico de quinase. Consequentemente, isto pode resultar naestimulação do crescimento e/ou diferenciação de células que expressam oreceptor in vitro e/ou in vivo. Em alguns modos de execução, um agonista deanticorpo anti-trkB liga-se a trkB e ativa uma atividade biológica de trkB.

Conforme usado aqui, "administração periférica" ou"perifericamente administrada" refere-se à introdução de um agente em umsujeito fora do sistema nervoso central (CNS) ou barreira de sangue cerebral(blood brain barrier) (BBB). Administração periférica abrange qualquer via deadministração que não a administração direta para a espinha ou cérebro. Aadministração periférica pode ser local ou sistêmica.

Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de seligar especificamente a um alvo, tal como um carbohidrato, polinucleotídeo,lipídeo, polipeptídeo, etc., em pelo menos um local de reconhecimento deantígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina.

Conforme usado aqui, o termo abrange não somente anticorpos policlonais1 ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tais como Fab,Fab', F(ab')2, Fv), (ScFv) de cadeia simples, seus mutantes, proteínas defusão compreendendo uma porção de anticorpo (tal como anticorpos dedomínio), e qualquer outra configuração modificada da molécula deimunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno.

Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG1 IgA, ouIgM (ou sua sub-classe), e o anticorpo não necessita ser de qualquer classeparticular. Dependendo da seqüência de amino ácido do anticorpo dedomínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem serdesignadas para diferentes classes. Existem cinco maiores classes deimunoglobulinas: IgA1 IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas delas ainda podem serdivididas em subclasses (isótipos), p.ex., IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI elgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem adiferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, epsilon,gama, e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades econfigurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas sãobem conhecidas.

Como empregado aqui, "anticorpo monoclonal" refere-se a umanticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos, i.e., os anticorpos individuais compreendendo a população sãoidênticos exceto por possíveis ocorrências naturais de mutações que podemestar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais sãoaltamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Alémdisso, em contraste a preparações de anticorpo policlonal, que incluemtipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes(epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um únicodeterminante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter doanticorpo como sendo obtido a partir de uma população homogênea deanticorpos, e não deve ser considerado como requerendo a produção doanticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem serpreparados pelo método de hibridoma descrito primeiramente por Kohler eMilstein, 1975, Nature, 256:495, ou podem ser preparados por métodos deDNA recombinante tais como descrito na U.S. Pat. No. 4.816.567. Osanticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagosgeradas usando as técnicas descritas, por exemplo, em McCafferty et al.,1990, Nature, 348:552-554.

Como empregado aqui, anticorpos "humanizados" referem-se aformas de anticorpos não humanos (por exemplo murino) que sãoimunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulinas, ouseus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequênciasde anticorpos Iigadoras de antígeno) que contêm uma seqüência mínimaderivada da imunoglobulina não-humana. A maior parte dos anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nos quaisresíduos de uma região determinante da complementaridade (CDR) dorecipiente são substituídas por resíduos de uma espécie de CDR não-humano (anticorpo doador) tal como um camundongo, rato ou coelhocontendo a especificidade, afinidade, e atividade biológica. Em alguns casos,resíduos (FR) da imunoglobulina humana da região enquadrada Fv sãosubstituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, oanticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontradosnem no anticorpo receptor nem no CDR importado ou seqüênciasenquadradas (framework sequences), mas são incluídos para refinar aindamais e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, etipicamente dois domínios variáveis, sendo que todas ou substancialmentetodas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas deuma seqüência de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpohumanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção deuma região com imunoglobulina constante ou domínio (Fc), tipicamenteaquela de uma imunoglobulina humana. Anticorpos podem ter regiões Fcmodificadas conforme descrito em WO 99/58572. Outras formas deanticorpos humanizados possuem um ou mais CDRs (um, dois, três, quatro,cinco, seis) que são alterados no que se refere ao anticorpo original, que sãotambém denominados um ou mais CDRs "derivados de" um ou mais CDRsdo anticorpo original.

Conforme empregado aqui, "anticorpo humano" significa umanticorpo contendo uma seqüência de amino ácidos correspondendo àquelade um anticorpo produzido por um ser humano, e/ou preparado usandoquaisquer das técnicas de preparação de anticorpos humanos conhecidasna técnica ou nela divulgadas. Esta definição de um anticorpo humano incluianticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo humano de cadeiapesada ou pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia leve. Um talexemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve demurinos e polipeptídeos de cadeia pesada de humanos. Anticorpos humanospodem ser preparados usando várias técnicas conhecidas na técnica. Emum modo de execução, o anticorpo humano é selecionado de uma bibliotecade fagos, onde aquela biblioteca de fagos denota anticorpos humanos(Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al.,1998, PNAS, (EUA) 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol.Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Anticorposhumanos também podem ser preparados introduzindo locais deimunoglobulina humana em animais transgênicos, p. ex., camundongos nosquais gens de imunoglobulina endógenos foram parcialmente oucompletamente desativados. Esta abordagem é descrita nas Patentes U.S.Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016.

Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por imortalizaçãodos linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra umantígeno alvo (tal como linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduoou podem ter sido imunizados in vitro). Ver, p. ex., Cole et al., MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al.,1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e U.S. Patent No. 5,750,373.

Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à regiãovariável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pesadado anticorpo, tanto sozinha como em combinação. As regiões variáveis dacadeia pesada e leve consistem, cada qual, de quatro regiões enquadradas(FR), conectadas por três regiões determinantes de complementaridade(CDRs), também conhecidas como regiões hipervariáveis. Os CDRs emcada cadeia são mantidos juntos em íntima proximidade pelas FRs e, comas CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação deantígenos. Existem pelo menos duas técnicas para a determinação dosCDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade da seqüência dasespécies cruzadas (i.e., Kabat et al. Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2)uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos deantígenos-anticorpos (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)).Conforme usado aqui, um CDR pode se referir aos CDRs definidos tanto poruma das abordagens quanto por uma combinação de ambas as abordagens.

Uma "região constante" de um anticorpo refere-se à regiãoconstante do anticorpo de cadeia leve ou à região do anticorpo de cadeiapesada, tanto sozinho quanto em combinação.

Um epítopo que se "liga preferencialmente" ou se "ligaespecificamente" (usado aqui intercambiavelmente) a um anticorpo ou umpolipeptídeo é um termo bem compreendido na técnica, e métodos paradeterminar uma tal ligação específica ou preferencial também são bastanteconhecidos na técnica. Diz-se que uma molécula exibe uma "ligaçãoespecífica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa maisfreqüentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maiorafinidade a uma célula ou substância em particular do que com células ousubstâncias alternativas. Um anticorpo se liga "especificamente" ou se liga"preferencialmente" ou "seletivamente" a um alvo se ele se liga com maiorafinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele seliga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se ligaespecificamente ou de preferência a um epítopo trkB é um anticorpo que seliga a este epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou commaior duração do que ele se liga a outros epítopos de trkB ou epítopos não-trkB. Também pode ser compreendido a partir da leitura desta definição que,por exemplo, um anticorpo (ou parcela ou epítopo) que se ligaespecificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode se ligar ounão, especificamente ou preferencialmente, a um segundo alvo. Como tal,ligação "específica" ou ligação "preferencial" ou ligação "seletiva" de umanticorpo a trkB não necessariamente requer (apesar de poder incluir)ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, uma referênciaaos meios de ligação de trkB seletiva significa, ligação preferencial (porexemplo, ligação com um IC50 a uma concentração de pelo menos 3, 5, ou,de preferência, pelo menos 10-vezes ou 100-vezes menor para trkB secomparado aos outros receptores).

O termo "região Fc" é empregado para definir uma região C-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada. A "região Fc" pode seruma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc variante. Apesar dascercanias da região Fc de uma imunoglobulina de cadeia pesada podervariar, a região Fc de cadeia pesada humana IgG é usualmente definidacomo se extendendo de um resíduo amino ácido posição Cys226, ou dePro230, para a sua terminação carboxila. A numeração dos resíduos naregião Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat et a!., Sequences ofProteins of Imunological Interest, 5a edição Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de umaimunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3.

Conforme empregado aqui, "receptor Fe" e "FcR" descrevem umreceptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é umaseqüência nativa humana FcR. Além disso, um FcR preferido é um que ligaum anticorpo IgG (receptor gama) e inclui receptores das sub-classes FcyRI,FcyRII, FcyRIII, e FcyRIV, incluindo variantes alélieas e, alternativamente,formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA(um "receptor ativador") e FcyRIIB (Um "receptor inibidor receptor"), que têmseqüências de amino ácido similares que diferem primariamente nos seusdomínios citoplásmicos. FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, 1991, Ann.Rev. Immunol., 9:457-92; Capei et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; deHaas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41; Nimmerjahn et al., 2005,Immunity 23:2-4. "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que éresponsável pela transferência de IgGs maternal para o feto (Guyer et al.,1976, J. Immunol., 117:587; e Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Citotoxidez dependente de complemento" e "CDC" referem-se àIise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação docomplemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistemacomplementar (C1q) a uma molécula (p.ex. um anticorpo) complexado comum antígeno cognato. Para se obter a ativação do complemento, um testeCDC, p.ex. conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.

Uma "região funcional Fe" possui pelo menos uma funçãoefetora de uma região Fc de seqüência nativa. "Funções efetores"exemplares incluem a ligação de C1q; citotoxidez dependente decomplemento (CDC); ligação receptora Fc; citotoxidez mediada por céluladependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo dosreceptores da superfície celular (p.ex. receptor de célula B; BCR), etc. Taisfunções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada comum domínio de ligação (p. ex. um domínio variável de anticorpo) e podemser obtidas empregando vários testes conhecidos na técnica para avaliaçãode tais funções efetoras do anticorpo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende umaseqüência de amino ácidos idêntica à seqüência de amino ácido de umaregião Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreendeuma seqüência de amino ácido que difere daquela de uma região Fc deseqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, mas ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc daseqüência nativa. De preferência, a região variante Fc apresenta pelo menosuma substituição de amino ácido comparado com uma região de seqüêncianativa Fc de um polipeptídeo parente, p. ex., de cerca de uma até cerca dedez substituições de amino ácidos, e de preferência de cerca de uma atécerca de cinco substituições de amino ácidos, em uma região de seqüência1 nativa de Fc ou na região Fc do polipeptídeo parente. A região Fc varianteaqui de preferência possuirá pelo menos cerca de 80% da identidade daseqüência com a região de seqüência nativa Fc e/ou com uma região Fc deum polipeptídeo parente, e mais preferentemente pelo menos cerca de 90%da identidade da seqüência com ela, mais preferentemente, pelo menoscerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelomenos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade da seqüênciacom ela.

Conforme usado aqui "citotoxidez mediada por céluladependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada porcélula na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptoresFc (FcRs) (p.ex. células matadoras naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos)reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subseqüentementecausam Iise da célula alvo. Atividade de ADCC de uma molécula deinteresse pode ser obtida empregando o teste ADCC in vitro, tal comoaquele descrito na Patente U.S.N0 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetorasúteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico(PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividadeADCC da molécula de interesse pode ser obtida in vivo, p.ex., em ummodelo de animal tal como aquele divulgado em Clynes et al., 1998, PNAS(EUA), 95:652-656.

Conforme usado aqui, "carreador farmaceuticamente aceitável"ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que,quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente ativoretenha atividade biológica e seja não reativo com o sistema imunológico deum sujeito. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, quaisquercarreadores farmacêuticos padrão tais como solução salina de fosfatotamponada, água, emulsões tais como emulsão óleo/água, e vários tipos deagentes umectantes. Diluéntes preferidos para administração em aerosol ouadministração parenteral são solução salina tamponada de fosfato (0,9%) ousalina normal (0,9%). Composições compreendendo tais carreadores sãoformuladas por métodos convencionais bastante conhecidos (ver, porexemplo, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. Gennaro,ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science andPractice of Pharmacy 20a ed. Mack Publishing, 2000).

Os termos "polipeptídeos", "oligopepídeos", "peptídeos" e"proteína" são usados intercambiavelmente aqui referindo-se a polímeros deamino ácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ouramificado, ele pode compreender amino ácidos modificados, e ele pode serinterrompido por não- amino ácidos. Os termos também abrangem umpolímero de amino ácido que foi modificado naturalmente ou porintervenção; por exemplo, formação de ligação de disulfeto, glicosilação,lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação oumodificação, tal como conjugação com um componente rotulador. Tambémestão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um oumais análogos dê um amino ácido (incluindo, por exemplo, amino ácidosnão-naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.Compreende-se que, porque os polipeptídeos desta invenção são baseadosem um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ouassociadas.

"Polinucleotídeo," ou "'ácido nucleico," conforme usado aquiintercambiavelmente, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquercomprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdesoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou basesmodificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa serincorporado no polímero por polimerase de DNA ou deRNA. Umpolinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais comonucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação daestrutura do nucleotídeo pode ser iniciada antes ou depois da montagem dopolímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida porcomponentes de não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ainda sermodificado após a polimerização, tal como por conjugação com umcomponente rotulador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo,"caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorremnaturalmente com um análogo, modificações de internucleotídeos tais como,por exemplo, aquelas ligações sem carga (p.ex., metil fosfonatos,fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga(p.ex., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo parcelaspendentes, tais como, por exemplo, proteínas (p.ex., nucleases, toxinas,anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores(p.ex., acridina, psoraléns, etc.), aquelas contendo queladores (p.ex., metais,metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendoalquiladores, aquelas com ligações modificadas (p.ex., ácidos nucleicos alfaanoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeos.

Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presentes nosaçúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, gruposfosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para prepararligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados asuportes sólidos. O OH 5' termina! e 3' termina! pode ser íosforüado ousubstituído por aminas ou parcelas do grupo orgânico capeado de 1 até 20átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivadas degrupos protetores padrão. Polinucleotídeos também podem conter formasanálogas de açúcares ribose ou desoxiribose que são geralmenteconhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-ribose, 2'-0-alil-ribose, 2'-flúor-ribose ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico,açúcares ü-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xilosesou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogosacrílicos e análogos de nucleosídeos abásicos, tais como metil ribosídeo.

Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos deligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas nãoestão limitadas a, modos de execução onde fosfato é substituído, porP(O)Sftioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', COou CH2 ("formacetal"), nos quais cada R ou R' é independentemente H oualquil (1-20 C) substituído ou não substituído, opcionalmente contendo umaligação éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nemtodas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descriçãoprecedente aplica-se a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindoRNA e DNA.

Conforme usado aqui, "substancialmente puro" refere-se a ummaterial que é pelo menos 50% puro (i.elivre de contaminantes), maispreferentemente, pelo menos 90% puro, mais preferentemente, pelo menos95% puro, mais preferentemente, pelo menos 98% puro, maispreferentemente, pelo menos 99% puro.

Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou culturacelular que pode ser ou foi um recipiente para vetor(es) por incorporação deinserções de polinucleotídeos. Células hospedeiras incluem progênie deuma única célula hospedeira, e a progênio pode não necessariamente sercompletamente idêntica (na morfologia ou no complemento do DNAgenômico) à célula parente original devido a mutação natural, acidental, oudeliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo comum polinucleotídeo(s) desta invenção.

Conforme empregado aqui, "vetor" significa uma construção queé capaz de fornecer, e de preferência expressar, um ou mais gene(s) ousequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetoresincluem, mas não estão limitados a, vetores virais, DNA ou vetores deexpressão de RNA nús, plasmídeos, cosmídeos ou vetores fagos, vetores deexpressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensaçãocatiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados emlipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.

Conforme empregado aqui, "seqüência de controle deexpressão" significa uma seqüência de ácido nucleico que dirige atranscrição de um ácido nucleico. Uma seqüência de controle de expressãopode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou um promotorinduzível, ou um realçador. A seqüência de controle da expressão estáoperavelmente ligada à seqüência de ácido nucleico a ser transcrita.

O termo "Κ>η", conforme empregado aqui, é previsto para sereferir à taxa constante de associação de um anticorpo a um antígeno.

O termo "Krff ", conforme empregado aqui, é previsto para sereferir à taxa constante para dissociação de um anticorpo do complexoanticorpo/antígeno.

O termo "KD", conforme empregado aqui, é previsto para sereferir à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação deanticorpo-antígeno.

Conforme empregado aqui, a forma singular de "um", "uma", e"a" inclui referências no plural, a menos que indicado de outro modo.

III. Métodos da invenção

A presente invenção abrange métodos para o aumento do pesocorporal e/ou da ingestão de alimento por administração periférica de umagonista de trkB. Esses métodos podem ser empregados para tratar ouevitar a perda indesejada de peso (tal como caquexia) e distúrbios dealimentação (tal como anorexia nervosa) em primatas, e êmese induzida poropióide em mamíferos. Os métodos vinculam a administração periférica deuma quantidade eficaz de um ou mais agonistas de trkB a um indivíduo comnecessidade deles (várias indicações e aspectos são descritos aqui).

No que se refere a todos os métodos descritos aqui, referência aagonistas de trkB também inclui composições que compreendem um oumais desses agentes. Essas composições ainda podem compreenderexcipientes apropriados, tais como excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, incluindo tamponadores, que são bastante conhecidos natécnica. A presente invenção pode ser empregada sozinha ou emcombinação com outros métodos convencionais de tratamento.

Caquexia que pode ser tratada e/ou evitada pelos métodosdescritos aqui pode ser causada e/ou estar associada com uma ou mais dasseguintes doenças: doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doençacrônica dos rins (CKD), insuficiência cardíaca crônica (CHF),envelhecimento, câncer, e AIDS.

Em alguns modos de execução, os pacientes humanos comcaquexia tratados ou com perda indesejada de peso tratados têm um índicede massa corporal (BMI, calculado como peso corporal por altura em metrosquadrados (kg/m2)) menor do que cerca de aproximadamente 25,0 kg/m2,24,0 kg/m2, 23,0 kg/m2, 22,0 kg/m2, 21,0 kg/m2, 20,0 kg/m2, 19,0 kg/m2, e18,5 kg/m2. Em alguns modos de execução, os pacientes humanos comcaquexia ou perda indesejada de peso tratados têm uma ingestão diária dealimentos menor do que cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cercade 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, oucerca de 10% do nível de ingestão diário normal recomendado ou nível pré-mórbido.

Em alguns modos de execução, os pacientes humanos comanorexia nervosa tratados pelos métodos descritos aqui têm um BMI menordo que qualquer outro, de aproximadamente 18,5 kg/m2, 17,5 kg/m2, e 16,5kg/m2. Em alguns modos de execução, os pacientes humanos com anorexianervosa tratados têm uma ingestão diária de alimentos menor do que cercade 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cercade 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, ou cerca de 10% do nível de ingestãodiário recomendado ou níve! pré-rnórbido.

O agonista de trkB é administrado perifericamente.Compreende-se que, apesar do agente ser administrado perifericamente,uma pequena porcentagem do agente pode passar a barreira do sanguecerebral e resultar no fornecimento ao sistema nervoso central, dependendodas propriedades do agente. Em alguns modos de execução, menos do quecerca de 1%, cerca de 0,5%, cerca de 0,25%, e cerca de 0,1% do agonistade trkB administrado perifericamente (por exemplo, agonista de anticorpo detrkB) ganha acesso ao CNS (sistema nervoso centrai).

O agonista de trkB pode ser administrado a um indivíduo viaqualquer via periférica apropriada. Deveria ser claro para uma pessoaespecializada na técnica que os exemplos descritos aqui não pretendemlimitar, mas ilustrar as técnicas disponíveis. Concordantemente, em algunsmodos de execução, o agonista de trkB é administrado a um indivíduo deacordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, p.ex., como um bolo ou por infusão contínua por um período de tempo, por viaintramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intra-articular, sublingual,intrasinovial, via insuflação, oral, inalação ou tópica. A administração pode1 ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa, ou localizada.

Nebulizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas,incluindo nebulizadores em jato e nebulizadores ultrassônicos, são úteispara administração. Formulações líquidas podem ser diretamentenebulizadas e pó Iiofilizado pode ser nebulizado após reconstituição.

Alternativamente, o agonista de trkB pode ser aerosolizado usando umaformulação de fluorcarbono e um inalador com medidor de dose, ou inaladocomo um pó Iiofilizado e triturado.

Um agonista de trkB pode ser administrado por técnicas defornecimento de fora do CNS ou da barreira de sangue cerebral, via um localespecífico ou local alvo. Exemplos de técnicas de fornecimento localespecífico ou local alvo incluem fontes de depósito de vários implantes doagonista de trkB ou catéteres de fornecimento local, tais como catéteres deinfusão, um catéter de demora, ou um cáteter agulha, enxertos sintéticos,envoltórios adventiciais (adventitials wraps), shunts e stents ou outrosdispositivos implantáveis, carreadores local específicos, injeção direta, ouaplicação direta. Ver, p. ex., Publicação PCT N0 WO 00/53211 e PatenteU.S. N0. 5.981.568.

Várias formulações de agonistas de trkB podem ser empregadaspara administração. Em alguns modos de execução, um agonista de trkBpode ser administrado puro. Em outros modos de execução, um agonista detrkB e um excipiente farmaceuticamente aceitável são administrados epodem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamenteaceitáveis são conhecidos na técnica, e são substâncias relativamenteinertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamenteeficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou agircomo um diluente. Excipientes apropriados incluem mas não estão limitadosa, agentes estabilizadores, agentes umectantes e agentes emulsificantes,sais para variação da osmolaridade, agentes de encapsulação,tamponadores, e promotores de penetração da pele. Excipientes bem comoformulações para fornecimento de medicamento parenteral e não-parenteralsão indicados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a ed.Mack Publishing (2000). Geralmente, esses agentes são formulados paraadministração por injeção (p. ex., intraperitonealmente, intravenosamente,subcutaneamente, intramuscularmente, etc.), apesar de outras formas deadministração também serem empregadas (p.ex., oral, mucosal,transdermal, inalação, etc).

O regime de dosagem particular i.e., dose, tempo e repetição,dependerá do indivíduo em particular e que histórico médico o indivíduopossui, a doença particular (p.ex., caquexia, perda indesejada de peso,anorexia nervosa, e êmese induzida por opióide) a ser tratada, e o agonistade trkB particular. Geralmente qualquer uma das seguintes doses deagonista de trkB (p.ex., NT-4/5, BDNF, e o anticorpo agonista de anti-trkB)podem ser empregados: Uma dose de pelo menos cerca de 50 mg/kg depeso corporal; pelo menos cerca de 20 mg/kg de peso corporal; pelo menoscerca de 10 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 5 mg/kg de pesocorporal; pelo menos cerca de 3 mg/kg de peso corporal; pelo menos cercade 2 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 1 mg/kg de pesocorporal; pelo menos cerca de 750 pg/kg de peso corporal; pelo menoscerca de 500 pg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 250 ug/kg depeso corporal; pelo menos cerca de 100 pg /kg de peso corporal; pelomenos cerca de 50 pg /kg de peso corporal; pelo menos cerca de 10 ug /kgde peso corporal; pelo menos cerca de 1 pg/kg de peso corporal ou mais, éadministrado. Considerações empíricas, tais como a vida-útil, geralmentecontribuirão para a determinação da dosagem. Para administraçõesrepetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamentoé mantido até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorraou até que níveis terapêuticos suficientes sejam obtidos. Por exemplo, dosesde uma até cinco vezes por semana são contempladas. Outros regimes dedosagem incluem um regime de até 1 vez por dia, 1 até 5 vezes por dia, oumenos freqüentemente. Em alguns modos de execução o regime dedosagem de trkB é administrado cerca de uma vez por semana, cerca de 1até 4 vezes por mês. O regime de dosagem intermitente com dosagensalternadas espaçadas por 2 dias até 7 dias ou mesmo 14 dias pode ser1 empregado. Em alguns modos de execução, o tratamento pode ser iniciadocom uma dosagem diária, e mais tarde mudar para dosagem semanal atémesmo anual. O progresso desta terapia é facilmente monitorado portécnicas convencionais e testes.

Em alguns indivíduos, pode ser exigida mais de uma dose. Afreqüência de administração pode ser determinada e ajustada no curso daterapia. Por exemplo, a freqüência de administração pode ser determinadaou ajustada com base no tipo e gravidade da doença a ser tratada, se oagente é administrado com o propósito de prevenção ou terapêutico, ohistórico clínico do paciente e resposta ao agente, e a discrição do clínicogeral. Tipicamente o clínico geral administrará um agonista de trkB até queseja atingida uma dosagem que consiga o resultado desejado. Em algunscasos, formulações de desprendimento contínuo e sustentado do agonistade trkB podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para seobter o desprendimento sustentado são conhecidos na técnica. Por exemplo,agonista de trkB pode ser administrado através de uma bomba mecânica oualeitado em um leito matricial para o desprendimento sustentado ou lento.

Em um modo de execução, dosagens para um agonista de trkBpodem ser determinadas empiricamente em indivíduos que obtiveram umaou mais administrações. Indivíduos obtêm doses incrementais de umagonista de trkB. Para avaliar a eficácia de um agonista de trkB, marcadoresdo estado de doença podem ser monitorados. Ficará claro para umespecialista na técnica que a dosagem variará dependendo do indivíduo, doestágio da doença (tal como caquexia, anorexia nervosa, e êmese induzidapor opióide), e os tratamentos passado e atual praticado.

A administração de um agonista de trkB de acordo com ométodo em A da presente invenção pode ser contínua ou intermitente,dependendo por exemplo da condição fisiológica do recipiente, se opropósito da administração é terapêutico ou profilático, e outros fatoresconhecidos dos praticantes experientes. A administração de um agonista detrkB pode ser efetuada de modo essencialmente contínuo por um período detempo pré-selecionado ou pode ser efetuada em uma série de dosesespaçadas.

Outras formulações incluem formas de fornecimento conhecidasna técnica incluindo, mas não limitadas a, carreadores tais como liposomas.Ver, por exemplo, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Preparadoslipossomais incluem, mas não estão limitados a citofectinas, vesículasmultilamelares e vesículas unilamelares.

A avaliação da doença é realizada usando métodos padrãoconhecidos na técnica, por exemplo, monitorando marcador(es)apropriado(s). Por exemplo, para caquexia, os seguintes marcadores podemser monitorados: peso corporal, albumina do plasma, gordura corporal,massa corporal magra, fadiga, fraqueza e apetite. Para anorexia nervosa, osseguintes marcadores podem ser monitorados: peso corporal, apetite, emedo de ganhar peso. Para êmese induzida por opióide, os seguintesmarcadores podem ser monitorados: náusea, vômito, apetite, peso corporal,e outras complicações médicas associadas.

IV. Composições e Métodos para Preparação das Composições

Os métodos da invenção usam um agonista de trkB, que serefere a qualquer molécula que se liga e ativa um receptor de trkB nativoe/ou vias fluxo abaixo mediadas pela função sinalizadora de trkB. O agonistade trkB inclui qualquer Iigante nativo de um receptor de trkB receptor, talcomo um NT-4/5 e BDNF. O agonista de trkB também inclui Iigante não-nativo (p.ex., polipeptídeos, composto derivado de polipeptídeo, derivado depeptídeo cíclico ou moléculas derivadas de não-peptídeo) de um receptor detrkB que se liga a e ativa um receptor de trkB nativo, imitando assim aatividade biológica de um Iigante nativo do receptor. Um exemplo de Iigantesnão-nativos de um receptor de trkB é um agonista de anticorpo de anti-trkB.Agonistas de trkB também incluem pequenas moléculas ou miméticos depeptídeos (p.ex., miméticos de peptídeo, miméticos de BDNF). Ver, p. ex.,O1Leary et al., J. Biol. Chem. 278:25738-44, 2003. Em alguns modos deexecução, a pequena molécula de agonista de trkB não passasignificativamente a barreira de sangue cerebral quando administradaperifericamente.

O agonista de trkB deveria exibir quaisquer uma ou mais dasseguintes características: (a) se ligar ao receptor de trkB; (b) se ligar aoreceptor de trkB e ativar a(s) atividade(s) biológica(s) da trkB e/ou uma oumais vias fluxo abaixo mediadas pela(s) função(ções) sinalizadoras de trkB;(c) se ligar ao receptor de trkB e aumentar o peso corporal e/ou a ingestãode alimentos em um primata quando administrada perifericamente; (d) seligar ao receptor de trkB e tratar, evitar, reverter, ou melhorar um ou maissintomas de caquexia ou perda indesejada de peso em um primata quandoadministrados perifericamente; (e) se ligar ao receptor de trkB e tratar, evitar,reverter, ou melhorar um ou mais sintomas de anorexia nervosa em umprimata quando administrados perifericamente; (f) se ligar a um receptor detrkB e tratar, evitar, reverter, ou melhorar um ou mais sintomas de êmeseinduzida por opióide em um mamífero quando administradosperifericamente; (g) promover a dimerização e ativação do receptor de trkB;e (h) aumentar a sobrevivência neurona! dependente do receptor de trkBe/ou do desenvolvimento de neuritos. Em alguns modos de execução, oagonista de trkB se liga e ativa o receptor de trkB, mas não ativasignificativamente ou preferencialmente um ou mais outros receptores de trk,tais como trkA e/ou trkC.

O agonista de trkB pode estar na forma de uma composiçãopara uso em qualquer dos métodos descritos aqui. A composição usada nosmétodos da invenção compreende uma quantidade eficaz de um agonista detrkB. A composição ainda pode compreender carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizantes (Remington:The Science and practice of Pharmacy 20a ed. (2000) Lippincott Williams eWilkins, Ed. Κ. E. Hoover.), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluçõesaquosas. Carreadores aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores são não-tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações, e podemcompreender tamponadores, tais como fosfato, citrato e outros ácidosorgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina;preservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto dehexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcoolbutílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos debaixo peso molecular (menor do que cerca de 10 resíduos); proteínas, taiscomo soro albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos taiscomo polivinilpirrolidona; amino ácidos tais como glicina, glutamina,asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monosacarídeos, dissacarídeos, eoutros carbohidratos incluindo glucose, manose, ou dextranos; agentesquelantes tais como EDTA; açúcares tais como sucrose, manitol, trehaloseou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexosmetálicos (p.ex. complexos de proteína Zn); e/ou agentes tenso-ativos não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são descritos aqui posteriormente.Agonistas de trkB descritos aqui podem ser formulados paradesprendimento sustentado. Exemplos apropriados de preparados comdesprendimento sustentado incluem matrizes semi-permeáveis de polímeroshidrófobos contendo agonista de trkB, cujas matrizes estão na forma deartigos moldados, p.ex. filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes comdesprendimento sustentado incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo,poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (U.S. Pat N03.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não-degradáveis, copolímeros de ácido lático-ácido glicólidodegradáveis, tais como o LUPRON DEPOT ™ (microesferas injetáveiscompostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato deleuprolida), isobutirato acetato de sucrose, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Outro exemplo de medicamentos de desprendimentosustentado que pode ser usado é o ATRIGEL® preparado por AtrixLaboratories. Ver, por exemplo Pat. U.S. N0 6.565.874. O sistema defornecimento do medicamento ATRIG EL® consiste de polímerosbiodegradáveis, similares àqueles usados em suturas biodegradáveis,dissolvidos em carreadores biocompatíveis. Agonistas de trkB podem sermisturados neste sistema de fornecimento de líquido no momento dafabricação ou, dependendo do produto, podem ser adicionados mais tardepelo clínico geral no momento do uso. Quando o produto líquido é injetadosubcutaneamente ou intramuscularmente através de uma pequena agulhagauge ou colocado em locais do tecido acessíveis através de uma cânula, odeslocamento do carreador com água nos fluidos do tecido faz com que opolímero precipite para formar um filme sólido ou implante. Agonistas de trkBencapsulados dentro do implante são então desprendidos de uma maneiracontrolada à medida que a matriz polimérica se biodegrada com o tempo.

Dependendo das necessidades médicas do paciente, o sistema Atrigel podefornecer proteínas por um período que varia de dias a meses. Sistemas dedesprendimento sustentado injetáveis, tais como ProLease®, Medisorb®,fabricados por Alkermes, também podem ser usados.

Em alguns modos de execução, a invenção fornececomposições (descritas aqui) para uso em quaisquer dos métodos descritosaqui, tanto no contexto do uso como um medicamento e/ou uso para apreparação de um medicamento.

Polipeptídeos NT-4/5

O agonista de trkB usado nos métodos da invenção inclui ospolipeptídeos NT-4/5. Conforme empregado aqui, o "polipeptídeo NT-4/5"inclui proteína madura que ocorre naturalmente (intercambiavelmentedenominado "NT-4/5") tal como NT-4/ 5 maduro humano mostrado naTabela 1 abaixo e na Publicação do Pedido de Pat. U.S. N0 2005/0209148 ePCT WO 2005/08240 e a Figura 1 na Publicação do Pedido de Pat. U.S. N020030203383 e variantes da seqüência de amino ácidos de NT-4/5 queocorrem naturalmente; variantes da seqüência de amino ácido de NT-4/5;fragmentos de peptídeo maduro NT-4/5 (tal como humano) e variantes deseqüência de amino ácidos; e formas modificadas de NT-4/5 maduro e asvariantes da referida seqüência de amino ácido e fragmentos de peptídeoonde o polipeptídeo ou peptídeo foi covalentemente modificado porsubstituição com uma parcela diferente do amino ácido que ocorrenaturalmente desde que a variante da seqüência de amino ácido, fragmentode peptídeo, e sua forma modificada mostram uma ou mais atividadesbiológicas de um agonista de trkB e/ou de proteína madura NT-4/5 queocorre naturalmente. O agonista de trkB também inclui proteínas de fusão econjugados compreendendo quaisquer dos modos de execução dospolipeptídeos NT-4/5 descritos aqui, por exemplo, um polipeptídeo NT-4/5conjugado ou fundido para uma parcela de extensão da vida útil, tal comouma região IgG Fc de PEG, albumina, ou um peptídeo. As variantes daseqüência de amino ácido, fragmentos de peptídeo (incluindo fragmentos devariantes), ou formas modificadas deles sob consideração não incluiemNGF, BDNF, ou NT-3 de quaisquer espécies animais. Variantes, fragmentosde peptídeo, e formas modificadas de NT-4/5 que ocorrem naturalmente sãodescritos no Pedido de Pat. U.S. Nos 2003/0203383; 2002/0045576;2005/0209148 Pat. U.S. Nos 5.702.906; 6.506.728; 6.566.091; 5.830.858.Polipeptídeos NT-4/5 incluem quaisquer um ou mais modos de execuçãodescritos aqui. Por exemplo, polipeptídeos NT-4/5 compreendem umaseqüência que ocorre naturalmente com uma ou mais inserções de aminoácidos, deleções ou substituições.

Tabela 1. Seqüência de amino ácido de NT-4/5 maduro humano e aseqüência de nucleotídeos humanos que codifica o NT-4/5 maduro humanoSeqüência de Amino ácido (SEQ ID NO:1):

GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETR

CKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWI Rl DTACVC

TLLSRTG RA

Seqüência de Nucleotídeos (SEQ ID NO:2)GGGGTGAGCG

AAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTC

AGTGGCTGGGTGACAGACCGÇCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA

GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCT

CCGCC

AGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGT

GGC

CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGT

ATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCT

GATG

CCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTC

TGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCCTGAG_

Em alguns modos de execução, o polipeptídeo NT-4/5 é umpolipeptídeo NT-4/5 de mamífero que pode ser um polipeptídeo NT-4/5 demamífero que ocorre naturalmente, ou um polipeptídeo NT-4/5 derivado deum NT-4/5 de mamífero que ocorre naturalmente e contendo uma seqüênciaque não coincide com qualquer parte de um NT-4/5 de não mamífero queocorre naturalmente. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo NT-4/5não mamífero é um polipeptídeo NT-4/5 humano que pode ser um NT-4/5humano que ocorre naturalmente, ou polipeptídeo NT-4/5 derivado de umNT-4/5 humano que ocorre naturalmente e contendo uma seqüência quenão coincide com qualquer parte de um NT-4/5 não-humano que ocorrenaturalmente.

Polipeptídeos NT-4/5, incluindo variantes, fragmentos depeptídeos, formas modificadas de polipeptídeos NT-4/5 (incluindo NT-4/5que ocorrem naturalmente), proteína de fusão e conjugado de uma invençãosão caracterizados por quaisquer (uma ou mais) das seguintescaracterísticas: (a) se ligam ao receptor de trkB; (b) se ligam ao receptor detrkB e ativam a(s) atividade(s) biológica(s) de trkB e/ou uma ou mais viasfluxo abaixo mediadas pela(s) função(ões) sinalizadora(s) de trkB ; (c) seligam ao receptor de trkB e aumentam o peso corporal e/ou a ingestão dealimento em um primata quando administrado perifericamente; (d) se ligamao receptor de trkB e tratam, evitam, revertem ou melhoram um ou maissintomas de caquexia em um primata quando administrado perifericamente;(e) se ligam a um receptor de trkB e tratam, evitam, revertem, ou melhoramum ou mais sintomas da anorexia nervosa em um primata quandoadministrado perifericamente; (f) se ligam ao receptor de trkB e tratam,evitam, revertem ou melhoram um ou mais sintomas de êmese induzida poropióide em um mamífero quando administrado perifericamente; (g)promovem a dimerização e ativaçãom do receptor de trkB; e (h) aumentam asobrevivência neuronal dependente do receptor de trkB e/oudesenvolvimento de neurito. Portanto todos os polipeptídeos NT-4/5(incluindo variantes, fragmentos, e formas modificadas) são funcionalmentedescritos acima.

Variantes com atividade biológica podem ser testadas in vitro ein vivo usando métodos conhecidos na técnica e métodos descritos aqui.

Métodos descritos aqui para identificação de agonistas de anti-trkB tambémpodem ser usados. Polipeptídeos NT-4/5 podem ter uma atividadeaumentada ou reduzida se comparados a uma proteína NT-4/5 que ocorrenaturalmente. Em alguns modos de execução, variantes funcionalmenteequivalentes, têm pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, ou 95% de atividade se comparado à proteína NT-4/5 nativa a partir daqual o polipeptídeo NT-4/5 é derivado no que se refere a um ou mais testesbiológicos descritos acima (ou conhecidos na técnica). Em alguns modos deexecução, variantes funcionalmente equivalentes têm um EC5O (metade daconcentração máxima eficaz) menor do que cerca de quaisquer 0,01 nM, 0,1nM, 1 nM, 10 nM, ou 100 nM na ativação do receptor de TrkB in vitro (p.ex.,testes descritos no exemplo 6, e na US 2005/0209148 e PCT WO2005/082401).

Variantes da seqüência de amino ácidos de NT-4/5 incluempolipeptídeos contendo uma seqüência de amino ácido que difere do NT-4/5que ocorre naturalmente em virtude da inserção, deleção e/ou substituiçãode um ou mais resíduos de amino ácidos dentro da seqüência de NT-4/5 queocorre naturalmente (por exemplo, humano maduro NT-4 mostrado naTabela 1). Variantes da seqüência de amino ácido geralmente serão pelomenos, cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,ou 99% idênticas a qualquer NT-4/5 que ocorra naturalmente (tal como NT-4/5 maduro humano mostrado na SEQ ID NO:1). Em alguns modos deexecução, a variante é pelo menos cerca de 70% idêncita à seqüência deamino ácido SEQ ID NO:1. Em alguns modos de execução, a variante é pelomenos, cerca de 85% idêntica à seqüência de amino ácido SEQ ID NO:1.Em alguns modos de execução, a variante é pelo menos cerca de 90%idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO:1. Em alguns modos deexecução, a variante é pelo menos, cerca de 95% idêntica à seqüência deamino ácido da SEQ ID NO:1.

Variantes da seqüência de amino ácido de NT-4/5 podem sergeradas preparando mutações pré-determinadas em um DNA de NT-4/5previamente isolado. Variantes de amino ácido podem ser projetadas egeradas com base na estrutura do cristal do receptor NT-4/5 e receptor deTrkB. Banfield et al., Structure 9: 1191-9 (2001) Por exemplo, amino ácidosque não estão diretamente envolvidos na interação entre monômeros de NT-4/5 e entre NT-4/5 e o receptor de TrkB podem ser mudados, por exemplo,para introduzir local de ligação PEG. Métodos conhecidos na técnica podemser empregados para projetar variantes de polipeptídeos NT-4/5 queapresentam uma ou mais atividades biológicas aumentadas ou reduzidas secomparado à proteína NT-4/5 que ocorre naturalmente.

Existem duas variáveis principais a considerar na preparação detais mutações pré-determinadas: a localização do local da mutação e anatureza da mutação. Em geral, a localização e a natureza da mutaçãoescolhida geralmente dependem da característica de NT-4/5 a sermodificada. Por exemplo, candidatos a antagonistas ou super agonistas NT-4/5 inicialmente podem ser selecionados pela localização de resíduos deamino ácidos que são idênticos ou altamente conservados entre NGF,BDNF, NT-3, e NT-4. Aqueles resíduos podem então ser modificados emséries, por exemplo, por (1) substituição, primeiro com opçõesconservadoras e depois, com seleções mais radicais, dependendo dosresultados obtidos, (2) eliminação do resíduo alvo, ou (3) inserção deresíduos da mesma classe ou de classes diferentes adjacentes ao localdemarcado, ou combinações das opções 1 -3.

Uma técnica util é denominada "varredura de ala". Aqui, umresíduo de amino ácido ou grupo de resíduos alvo são identificados esubstituídos por alanina ou polialanina. Aqueles domínios que demonstramsensibilidade funcional às substituições de alanina são então refinados porintrodução de mais variantes, ou outras variantes, no local ou para os locaisde substituição de alanina.

Obviamente, tais variações que, por exemplo, convertem NT-4/5em NGF, BDNF, ou NT-3 não estão incluídas no âmbito desta invenção.Portanto, enquanto o local para introdução de uma variação da seqüência deamino ácido é pré-determinado, a natureza da mutação per se não precisaser pré-determinada. Por exemplo, para otimizar o desempenho de umamutação em um dado local, a varredura de ala ou mutagênese randômica éconduzida no códon ou região alvo e as variantes NT-4/5 expressas sãomonitoradas para a atividade ótima desejada.

Supressões de seqüência de amino ácidos geralmente variamde cerca de 1 até 30 resíduos, mais preferentemente, cerca de 1 até 10resíduos, e tipicamente são contíguos. Supressões podem ser introduzidasem regiões de baixa homologia entre BDNF, NGF, NT-3, e NT-4/5 paramodificar a atividade de NT-4/5. Supressões de NT-4/5 em áreas dehomologia substancial a BDNF, NT-3, e NGF podem ser capazes demodificar a atividade biológica de NT-4/5 mais significativamente. O númerode supressões consecutivas pode ser selecionado de modo a preservar aestrutura terciária de NT-4/5 no domínio afetado, por exemplo, lâminapregueada em beta ou alfa hélice.

Inserções de seqüência de amino ácidos incluem fusões aminoterminais e/ou carboxil terminais variando em comprimento de um resíduo apolipeptídeos contendo mil ou mais resíduos, bem como inserçõesintrasequenciais de resíduos de amino ácidos únicos ou múltiplos. Inserçõesintrasequenciais (i.e., inserções dentro da seqüência madura NT-4/5) podemvariar geralmente de cerca de 1 até 10 resíduos, mais preferentemente de 1até 5, ainda mais preferentemente de 1 até 3. Um exemplo de uma inserçãoterminal inclui a fusão de uma seqüência de sinal N-terminal heteróloga à1 terminação N da molécula NT-4/5 para facilitar a secreção de NT-4/5 madurodo hospedeiro recombinante. Tais sinais geralmente serão homólogos àcélula hospedeira pretendida e incluem STII ou Ipp para E. coli, fator alfapara levedo, e sinais virais tais como herpes gD para células mamíferas.Outras inserções incluem a fusão de um polipeptídeo nas terminações N ouC de NT-4/5.

Outro grupo de variantes inclui aquelas nas quais pelo menosum resíduo de amino ácido em NT-4/5, e de preferência somente um, foiremovido e um resíduo diferente foi inserido no seu lugar. Um exemplo é asubstituição de arginina e Iisina por outros amino ácidos para produzir o NT-4/5 resistente à proteolise por serina proteases, criando assim uma variantede NT-4/5 que é mais estável. Os locais de maior interesse paramutagênese substitucional incluem locais onde amino ácidos observados emBDNF, NGF1 NT-3, e NT-4 são substancialmente diferentes em termos debojo de cadeia lateral, carga ou hidrofobicidade, mas onde também há umalto grau de homologia no local selecionado dentro de vários análogosanimais de NGF, NT-3, e BDNF (p.ex. entre todos os NGFs animais, todosos NT-3 animais, e todos os BDNFs). Esta análise realçará os resíduos quepodem estar envolvidos na diferenciação da atividade dos fatores tróficos, eportanto variantes que nesses locais podem afetar tais atividades. Exemplosde tais locais em NT-4/5 maduro humano, numerado a partir da extremidadeN-terminal, e substituições de exemplo incluem G77 até Κ, H, QouRe R84até E, F1 Ρ, Y ou W de NT-4/5 da SEQ ID N0:1, respectivamente. Outroslocais de interesse são aqueles nos quais os resíduos são idênticos entretodas as espécies animais BDNF, NGF, NT-3, e NT-4/5, sendo que estegrau de conformação sugere importância na aquisição da atividade biológicacomum a todos os quatro fatores.

Por exemplo, a substituição de um ou mais amino ácidos incluisubstituições conservadoras. Métodos de preparar substituiçõesconservadores são conhecidos na técnica. Por exemplo, ala (A) pode sersubstituído por vai, leu, ile, de preferência por vai; arg (R) pode sersubstituído por lys, gln, asn, de preferência por lys; asn (N) pode sersubstituído por gln, his, lys, arg, de preferência por gln; asp (D) pode sersubstituído por glu; cys (C) pode ser substituído por ser; gln (Q) pode sersubstituído por asn; glu (E) pode ser substituído por asp; gly (G) pode sersubstituído por pro; his (H) pode ser substituído por asn, gln, lys, arg; depreferência por arg; ile (I) pode ser substituído por leu, vai, met, ala, phe,norleucina, de preferência por leu; leu (L) pode ser substituído pornorleucina, ile, vai, met; ala; phe, de preferência por ile; Iys (K) pode sersubstituído por arg; gln, asn, de preferência por arg; met (M) pode sersubstituído por leu; phe; ile, de preferência por leu; phe (F) pode sersubstituído por leu, vai, ile, ala, de preferência por leu; pro (P) pode sersubstituído por gly; ser (S) pode ser substituído por thr; thr (T) pode sersubstituído por ser; trp (W) pode ser substituído por tyr; tyr (Y) pode sersubstituído por trp, phe, thr, ser, de preferência por phe; vai (V) pode sersubstituído por ilé; leu; met; phe, ala; norleucina, de preferência por leu.Locais particularmente apropriados para substituições conservadorasincluem, numerados a partir da terminação N do NT-4 humano maduro (SEQID NO:1), R11, G12, E13, V16, D18, W23, V24, D26, V40, L41, Q54, Y55,F56, E58, T59, G77, R79, G80, H85, W86, A99, L100, T101, W11.0, R111,W112, 1113, R114, 1115, D116, e A118. Resíduos de cisteína não envolvidosna manutenção da conformação própria de NT-4/5 também podem sersubstituídos, geralmente por serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativada molécula e evitar reticulação aberrante. Locais diferentes daquelesindicados neste parágrafo são apropriados para estudos delecionais ou deinserção geralmente descritos acima.

Modificações substanciais na função podem ser obtidas pelaseleção de substituições que diferem significativamente quanto a seu efeitona manutenção (a) da estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na áreada substituição, por exemplo, como uma conformação laminar ou helicoidal,(b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do bojo dacadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em gruposcom base nas propriedades comuns da cadeia lateral (algumas dessaspodem cair em diversos grupos funcionais):

• (1) hidrófobo: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que infuenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

Substituições não-conservadoras englobarão a troca de ummembro de uma dessas classes por outro.

Exemplos de variantes NT-4 incluem: polipeptídeos da SEQ IDNO:1 com mutação de E67 até S ou T (isto adiciona um local de glicosilaçãoligado a N); polipeptídeos do resíduo de amino ácido R83 a Q94, G1 a C61,G1 a C17, C17 a C61, C17 a C78, C17 a C90, C17 a C119, C17 a C121,R11 a R27, R11 a R34, R34 a R53, C61 a C78, R53 a C61, C61 a C119,C61 a C78, C78 a C119, C61 a C90, R60 a C78, K62 a C119, K62 a K91,R79 a R98, R83 a K93, TIOI a Rl 11, Gl a C121 da SEQ !D NO:1;polipeptídeos compreendem V40-C121 da SEQ ID NO:1, por exemplo, V40-C121 da SEQ ID NO:1 fundido a polipeptídeos na terminação N e/outerminação C; polipeptídeos compreendem a SEQ ID NO:1 com supressãode C78, C61, Q54-T59, R60-D82, H85-S88, W86-T101 (supressões daabrangência (span) indicada de resíduos, inclusive); SEQ ID NO:1 commutação de R53 para H1 de K91 para H, de V108 para F, de R84 para Q, H,Ν, Τ, Y ou W, e de D116 para Ε, N, Q, Y, S ou T. Também está incluído NT-4/5 (SEQ ID NO:1) onde a posição 70 é substituída por um resíduo de aminoácido diferente de G1 E, D ou P; posição 71 com outros que não A, P ou M;e/ou posição 83 com outros que não R, D, S ou K; bem como fragmentosNT-4 ciclizados.

Duas seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeos são ditas"idênticas" se a seqüência de nucleotídeos ou amino ácidos nas duasseqüências é a mesma quando alinhadas para a correspondência máximaconforme descrito abaixo. Comparações entre duas seqüências sãotipicamente realizadas por comparação das seqüências através de umajanela de comparação para identificar e comparar regiões locais comsimilaridade de seqüência. Uma "janela de comparação" conformeempregado aqui, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20posições contíguas, usualmente de 30 até cerca de 75, 40 a cerca de 50, naqual uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência demesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências sãootimamente alinhadas.

O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode serconduzido usando o programa Megalign na suite de Lasergene do softwarede bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison1 Wl), usando os parâmetrosdefault. Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritosnas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionarychange in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff,Μ.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National BiomedicalResearch Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; HeinJ., 1990, Unified Approach to Alignrnent and Phylogenes, págs. 626-645Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA;Higgins, D.G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e MullerW., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105;Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. eSokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice ofNumerical Taxonomy, Freeman Press, São Francisco, CA; Wilbur, W.J. eLipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:726-730.

De preferência, a "porcentagem de identidade de seqüência" édeterminada por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas poruma janela de comparação de pelo menos 20 posições, onde a porção daseqüência de polinucleotídeos ou de polipeptídeos na janela de comparaçãopode compreender adições ou supressões (i.e. espaços (gaps)) de 20porcento ou menos, usualmente de 5 até 15 porcento, ou de 10 até 12porcento, se comparado às seqüências de referência (que nãocompreendem adições ou supressões) para o alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada por determinação do número deposições no qual as bases de ácido nucleico idênticas ou resíduos de aminoácido ocorrem em ambas as seqüências produzindo o número de posições"casadas", dividindo-se o número de posições "casadas" pelo número totalde posições na seqüência de referência (i.e., o tamanho de janela) emultiplicando os resultados por 100 para produzir a porcentagem daidentidade da seqüência.

Variantes da seqüência de amino ácidos de NT-4/5 podemocorrer naturalmente ou podem ser preparadas sinteticamente, tal como porintrodução de mudanças apropriadas de nucleotídeos em um NT-4/5 DNApreviamente isolado, ou por síntese in vitro dos polipeptídeos da variantedesejada. Conforme indicado acima, tais variantes podem compreenderdeleções, ou inserções, ou substituições, de um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da seqüência de amino ácido de NT-4/5 maduro (p. ex., aseqüência mostrada na Tabela 1). Qualquer combinação da deleção,inserção, e substituição é feita para chegar a uma variante da seqüência deamino ácidos de NT-4/5, já que os polipeptídeos da variante resultantepossuem uma característica desejada. As mudanças dos amino ácidostambém podem resultar em maiores modificações de NT-4/5 com expressãoem hospedeiros recombinantes, p.ex., introdução ou mudança deglicosilação, ou introdução de seqüências de âncora de membrana (ver,p.ex., PCTWO 89/01041).

Em alguns modos de execução, polipeptídeos NT-4/5compreendem uma seqüência de amino ácido codificada por um ácidonucleico que hibridiza sob condições rigorosas em uma seqüência de ácidonucleico (p.ex., SEQ ID NO:2) que codifica um NT-4/5 humano maduro.

Polinucleotídeos variantes também podem ser, oualternativamente podem ser substancialmente homólogos a um gene nativo,ou uma porção ou seu complemento. Tais variantes de polinucleotídeos sãocapazes de hibridizar sob condições moderadas de rigor formando umaseqüência de DNA que ocorre naturalmente codificando os polipeptídeos (ouuma seqüência complementar).

"Condições moderadamente rigorosas" apropriadas incluem apré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM EDTA (pH8,0); hibridizando a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante a noite; seguido porlavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos cada qual com 2X, 0,5X e 0,2XSSC contendo 0,1% de SDS.

Conforme empregado aqui, "condições altamente rigorosas" ou"condições de alto rigor" são aquelas que: (1) empregam uma baixaresistência iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo cloreto desódio 0,015 M /citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio 0,1% a50°C; (2) emprego durante a hidribização de um agente de desnaturação, talcomo formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% dealbumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50mM desolução tampão de fosfato de sódio ao pH 6,5 com 750 mM de cloreto desódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) emprego de 50% deformamida, 5 χ SSC (NaCI 0,75 Μ, citrato de sódio 0,075 Μ), fosfato desódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5 x,DNA de esperma de salmão sonicado (50 μς/πιΙ), 0,1% de SDS, e 10% desulfato de dextrano a 42°C, com ceras a 42°C em 0,2 χ SSC (cloreto desódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por umalavagem de alto rigor consistindo de EDTA contendo 0,1 χ SSC a 55°C.Outra condição exemplar rigorosa é a hibridização em 50% de formamida,5xSSC, dodecilsulfato de sódio 0,1%, pirofosfato de sódio 0,1%, 50 mM defosfato de sódio pH 6,8, 2x solução de Denhardt1 e 10% de sulfato dedextrano a 42°C, seguido de uma lavagem em 0,1xSSC e 0,1% de SDS a42°C. O especialista na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura,resistência iônica, etc conforme necessário para acomodar fatores tais comoo comprimento da amostra e semelhantes.

Será apreciado por aqueles com conhecimento comum natécnica que, como um resultado da degeneração do código genético existemmuitas seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo conformedescrito aqui. Alguns desses polinucleotídeos comportam uma homologiamínima com a seqüência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. Apesardisto, os polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso do códonsão especificamente contemplados pela presente invenção. Outros alelos1 dos genes compreendendo as seqüências de polinucleotídeos fornecidasaqui estão dentro do âmbito da presente invenção. Os alelos são gensendógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações,tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNAresultante e proteína podem, mas não necessitam, ter uma estrutura oufunção alterada. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão(tais como hibridização, amplificação e/ou comparação da seqüência debanco de dados.

Os agonistas de trkB usados nos métodos da invenção tambémincluem proteínas de fusão compreendendo a seqüência de amino ácidos deNT-4/5 (p.ex., NT-4/5 humano mostrado na Tabela 1) ou um seu fragmentode peptídeo funcional. Polipeptídeos NT-45 biologicamente ativos podem serfundidos com seqüências tais como as seqüências que aumentam areatividade imunológica, facilitam o acoplamento dos polipeptídeos a umexemplo, seqüências codificadoras de epítopos tais como Myc, HA derivadoda hemaglutinina do vírus da gripe His-6, FLAG). Essas seqüências podemser fundidas em polipeptídeos NT-4/5 na extremidade terminal N ou naextremidade terminal C. Além disso, a proteína ou polinucleotídeo podem serfundidos em outros ou polipeptídeos que aumentam sua função ouespecificam sua localização na célula, tal como uma seqüência desegregação. Métodos para a produção de proteínas de fusão recombinantesdescritas acima são conhecidos na técnica. A proteína de fusãorecombinante pode ser produzida, redobrada e isolada por métodos bastanteconhecidos na técnica.

Polipeptídeos NT-4/5 descritos aqui podem ser modificados paraaumentar sua vidas úteis em um indivíduo. Por exemplo, polipeptídeos NT-4/5 podem ser peguilados para reduzir a depuração sistêmica (clearance)com a mínima perda de atividade biológica. A invenção também fornececomposições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo umpolipeptídeo NT-4/5 ligado a uma molécula PEG. em alguns modos derealização, a molécula PEG está ligada aos polipeptídeos NT-4/5 através deuma ligação reversível. A vida útil de um polipeptídeo NT-4/5 peguilado podeser extendida por mais do que cerca de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15vezes, 20 vezes, e 30 vezes a vida útil de polipeptídeos NT-4/5 não-peguilados.

Polímeros de polietilenoglicol (PEG) podem estar ligados avários grupos funcionais dos polipetídeos NT-4/5 empregando métodosconhecidos na arte. Ver, p. ex., Roberts et al., Advanced Drug DeliveryReviews 54:459-476 (2002); Sakane et al. Pharm. Res. 14:1085-91 (1997).PEG pode estar ligado aos seguintes grupos funcionais nos polipeptídeos:grupos amino, grupos carboxila, grupos N-terminais modificados ou naturais,grupos amina, e grupos tiol. Em alguns modos de execução, um ou maisresíduos de amino ácidos de superfície são modificados por moléculas PEG.Moléculas PEG podem ser de vários tamanhos (p.ex., variando de cerca de2 até 40 KDa). Moléculas PEG ligadas a polipeptídeos NT-4/5 podem ter umpeso molecular de cerca de 2.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000,35.000, 40.000 Da. A molécula PEG pode ser simples ou de cadeiaramificada. Para ligar PEG a polipeptídeos NT-4/5, um derivado de PEGcontendo um grupo funcional em uma ou ambas as terminações pode serempregado. O grupo funcional é escolhido baseado no tipo de grupo reativodisponível em polipeptídeos NT-4/5. Métodos de ligação de derivados compolipeptídeos são conhecidos na técnica. Roberts et al., Advanced DrugDelivery Reviews 54:459-476 (2002). A ligação entre os polipeptídeos NT-4/5 e o PEG também pode ser tal que ele possa ser clivado ou se degradanaturalmente em um indivíduo (ligação reversível ou degradável) que podeaperfeiçoar a vida útil, mas minimiza a perda de atividade. O local de ligaçãoPEG no polipeptídeo NT-4/5 também pode ser criado por mutação dosresíduos de superfície em um resíduo de amino ácido contendo um gruporeativo PEG de NT-4% (SEQ ID NO: 1) mudando resíduos de superfície emresíduos de amino ácido contendo um grupo reativo PEG, tal como umacisteína. Por exemplo, os seguintes amino ácidos de NT-4/5 humano (SEQID NO:1) podem ser mutados por ligação com PEG: G1, V2, S3, E4, T5, S9,R10, T25, D26, R28, T29, V31, E37, E39, L41, E43, A46, A47, G48, G49,S50, R53, D64, N65, A66, E67, E68, G69, D82, R83, R84, H85, A104, Q105,G106, R107, V108, S125, e T127. Esses podem ser aplicados aos resíduoscorrespondentes em outras espécies.

Diversos NT-4/5 peguilados têm sido gerados e são mostradosnos Exemplos 6 e 7 do Pedido de Pat. US N0 2005/0209148 e PCT WO2005/082401. Resíduo de serina na posição 50 do NT-4/5 maduro humanopode ser modificado em cisteína para gerar NT4-S50C que é entãopeguilado, sendo que PEG está ligado à cisteína na posição 50. Umexemplo de ligação N-terminal específica para PEG é o de mudar o resíduona posição 1 em uma serina ou treonina, seguido então de peguilação, ondeo PEG está ligado à serina na posição 1.

Polipeptídeos NT-4/5 podem ser preparados por meiosrecombinantes, isto é, por expressão de ácido nucleico codificante dospolipeptídeos NT-4/5. Em cultura celular recombinante, e, opcionalmente,purificação dos polipeptídeos variantes da cultura celular, por exemplo, porbioensaio da atividade da variante ou por adsorção em uma coluna deimunoafinidade compreendendo anticorpos policlonais anti-NT-4/5 de coelho(que se ligará pelo menos a um epítopo imune da variante que também estápresente no NT-4/5 nativo). Pequenos fragmentos de peptídeo da ordem de40 resíduos ou menos, são convenientemente preparados por métodos invitro.

Polipeptídeos NT-4/5 codificadores de DNA podem ser clonadosem um vetor de expressão para expressar a proteína em uma célulahospedeira. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos NT-4/5 são descritos no Pedido de Pat. U.S. N0 2003/0203383. Os polipeptídeosNT-4/5 que codificam o DNA na sua forma madura podem estar ligados asua terminação amino para um sinal de secreção. Este sinal de secreção, depreferência, é a pré-sequência de NT-4/5 que normalmente direciona asecreção de NT-4/5 de células humanas in vivo. Entretanto, sinais desecreção apropriados também incluem sinais de outros NT-4/5 animais,sinais de NGF, NT-2, ou NT-3, sinais virais, ou sinais de polipeptídeossecretados das mesmas espécies ou espécies relacionadas. Qualquer célulahospedeira (tal como E. coli) pode ser usada para expressar a proteína oupolipeptídeos.

Polipeptídeos NT-4/5 expressos podem ser purificados.Polipeptídeos NT-4/5 podem ser recuperados do meio de cultura como umaproteína secretada, eles também podem ser recuperados de Iisatos da célulahospedeira quando expressos diretamente sem um sinal secretório. Métodosde purificação da proteína conhecidos na técnica podem ser usados.Métodos de produção de polipeptídeos NT-4/5 e purificação dospolipeptídeos NT-4/5 expressos são descritos no Pedido de Pat. US N0003/0203383, e Pat U.S. N0 6.184.360. Polipeptídeos NT-4/5 podem serexpressos em E. coli e redobrados de acordo com métodos conhecidos natécnica. NT-4/5 maduros humanos também podem ser obtidoscomercialmente (por exemplo, na R&D Systems, Mineapolis, MN1 Sigma, St.Louis, MO, e Upstate Biotech., Temecula, CA).

Aaonistas anti-trkB de polipeptídeos e anticorpos

O agonista de trkB usado nos métodos da invenção tambéminclui agonistas de polipeptídeos anti-trkB, incluindo anticorpos de agonistaanti-trkB. Um agonista de polipeptídeo anti-trkB (p.ex., um anticorpo) deveriaexibir quaisquer uma ou mais das seguintes características: (a) se ligar aoreceptor de trkB; (b) se ligar ao receptor de trkB e ativar atividade(s)biológica(s) de trkB e/ou uma ou mais vias fluxo abaixo mediadas pela(s)função(ções) de sinalização de trkB; (c) se ligar ao receptor de trkB eaumentar o peso corporal e/ou ingestão de alimento em um primata quandoadministrados perifericamente; (d) se ligar a um receptor de trkB e tratar,evitar, reverter, ou melhorar um ou mais sintomas de caquexia em umprimata quando administrados perifericamente; (e) se ligar ao receptor detrkB e tratar, previnir, reverter, ou melhorar um ou mais sintomas de anorexianervosa em um primata quando administrados perifericamente; (f) se ligar aoreceptor de trkB e tratar, previnir, reverter, ou melhorar um ou mais sintomasda êmese induzida por opióide em um mamífero quando administradosperifericamente; (g) promover a dimerização e ativação do receptor de trkB;e (h) aumentar a sobrevivência neuronal dependente do receptor de trkBe/ou o desenvolvimento de neurito.

Em alguns modos de execução os agonistas anti-trkB depolipeptídeos (p.ex., anticorpo) são multivalentes e se ligam ao domínioextracelular de um receptor de trkB. Mostrou-se que imunoglobulinas quesão capazes de se ligar e reticular ou dimerizar a família da trk de receptoresde neurotrofina ativam esses receptores e produzem conseqüências emneurônios que são similares à exposição a uma neurotrofina. Ver, Pat. US N06.656.465; e PCT WO 01/98361.

Os anticorpos do agonista de trkB podem abranger anticorposmonoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (p.ex., Fab,Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, de cadeia única (ScFv),seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção deanticorpo, e qualquer outra configuração modificada da molécula deimunoglobulina que compreende o local de reconhecimento de um antígenoda especificidade requerida. Os anticorpos podem ser murinos, de rato,humanos ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos humanizados).

Em alguns modos de execução, o polipeptídeo (incluindo oanticorpo) se liga a trkB e não significativamente se submete a uma reaçãocruzada (se liga) com outros receptores de neurotrofina (tais como osreceptores de neurotrofina relacionados, trkA e/ou trkC). O agonista anti-trkBde polipeptídeos pode se ligar a trkB humana. O agonista de polipeptídeoanti-trkB também pode se ligar a trkB humana e de roedores. Em algunsmodos de realização o polipeptídeo anti-trkB de pode ligar trkB humana e decamundongo. Em um modo de realização, o polipeptídeo reconhece um oumais epítopos no domínio extracelular de trkB humano. Em outro modo derealização, o anticorpo é um anticorpo de rato ou de camundongo, quereconhece um ou mais epítopos no domínio extracelular da trkB humana.Em alguns modos de realização, os polipeptídeos se ligam à trkB humana enão se ligam significantivâmente a trkB de outra espécie de mamífero (emalguns modos de execução, espécies de vertebrados). Em alguns modos deexecução, os polipeptídeos se ligam a uma trkB bem como a uma ou maistrkB de outra espécie de mamífero (em alguns modos de realização,espécies de vertebrados). Em outro modo de realização, o polipeptídeoreconhece um ou mais epítopos em uma trkB selecionada de um ou mais:primatas, caninos, felinos, eqüinos, e bovinos.

Em alguns modos de realização, o anticorpo do agonista de anti-trkB tem um EC50 (metade da concentração máxima eficaz) menor do quecerca de qualquer um dos 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50nM, ou 100 nM no receptor de TrkB (p.ex., trkB humana) a ativação in vitro(p.ex., ensaios descritos no Exemplo 6, e na US 2005/0209148 e PCT WO2005/082401).

A afinidade de ligação do agonista de polipeptídeos anti-trkB(p.ex., anticorpo) a trkB pode ser qualquer um dos cerca de 500 nM, cercade 400 nM, cerca de 300 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM,ou cerca de 50 pM até quaisquer dos cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cercade 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, ou cerca de 40 pM. Ern algunsmodos de realização, a afinidade de ligação é qualquer uma de cerca de 100nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cercade 100 pM, ou cerca de 50 pM, ou menos do que cerca de 50 pM. Emalguns modos de realização a afinidade de ligação é menor do que qualquerdas cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cercade 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM. Ainda em outros modos derealização, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cercade 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou maior doque cerca de 40 pM. Como é bem conhecido na técnica, a afinidade deligação pode ser expressa como KD, ou dissociação constante, e uma maiorafinidade de ligação corresponde a um Kd menor.

Uma maneira de determinar a afinidade de ligação de anticorposa trkB é medindo a afinidade de ligação de fragmentos monofuncionais Fabdo anticorpo. Para obter fragmentos monofuncionais Fab, um anticorpo (porexemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expressorecombinantemente. A afinidade de um fragmento Fab anti-trkB de umanticorpo pode ser determinada por ressonância de plásmon superficial1 (Sistema de ressonância de plásmon de superfície BIAcore3000™ (SPR)BIAcore, INC, Piscataway NJ). Lascas de CM5 podem ser ativadas porhidrocloreto de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.Proteína de fusão de trkB-Fc humana ("htrkB") (ou qualquer outra trkB, talcomo trkB de rato) pode ser diluída em 10 mM de acetato de sódio pH 5,0 einjetada no chip ativado a uma concentração de 0,0005 mg/mL. Usando umtempo de fluxo variável através dos canais de lascas individuais, duas faixasde densidade de antígeno podem ser obtidas: unidades de resposta 200-400(RU) para estudos cinéticos detalhados e 500-1000 RU para testes demonitoramento. A lasca pode ser bloqueada com etanolamina. Estudos deregeneração mostraram que a mistura de solução tampão de eluição dePierce (Produto N0 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI 4 M(2:1) remove eficazmente a ligação Fab enquanto mantém a atividade dehtrkB na lasca por mais do que 200 injeções. O tamponador HBS-EP(HEPES 0,01 M1 pH 7,4, 0,15 NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% de agente tensoativo P29) é empregado como um tamponador utilizado para os testesBIAcore. Diluições em série (KD estimado 0,1-1 Ox) de amostras Fabpurificadas são injetadas por 1 minuto a 100 pL/min e tempos de dissociaçãode até 2h são permitidos. As concentrações das proteínas Fab sãodeterminadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando uma Fab deconcentração conhecida (como determinado por análise de amino ácido)como um padrão. Taxas de associação cinética (kon) e taxas de dissociação(Μ (geralmente medidas a 25°C) são obtidas simultaneamente por ajustedos dados a um modelo de ligação Langmuir (Karlsson, R. Roos, H.Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6:99-110) usandoo programa de avaliação BIAevaIuation. Os valores da constante dedissociação de equilíbrio (K0) são calculados como IWkon-

Em alguns modos de execução, o agonista de antl-trkB depolipeptídeos (incluindo o anticorpo) tem uma função efetora aperfeiçoada.Conforme empregado aqui, um anticorpo ou um polipeptídeo contendo uma"função efetora aperfeiçoada" (usada intercambiavelmente com o termo"imunologicamente inerte") refere-se a anticorpos ou polipeptídeos que nãotêm qualquer função efetora ou têm afinidade reduzida ou atividades dafunção efetora (comparado com um anticorpo ou polipeptídeos contendouma região constante não modificada que ocorre naturalmente), p.ex.nãocontendo atividade ou contendo atividade reduzida em qualquer um ou maisdos seguintes: a) acionar Iise mediada por complemento; b) estimularcitotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); e c) ativarmicroglias. A atividade da função efetora pode ser reduzida por cerca dequalquer 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, e100%. Em alguns modos de realização o anticorpo se liga ao receptor detrkB sem acionar significativamente Iise dependente de complemento, oudestruição do alvo mediada por célula. Por exemplo, o local de ligação doreceptor Fc na região constante pode ser modificado ou mutado pararemover ou reduzir a afinidade de ligação a certos receptores de Fc taiscomo FcyRi1 FcyRi í, FcyRI M1 e/ou FcynlV. Em prol da simplicidade, será feitareferência a anticorpos com a compreensão de que modos de realizaçãotambém aplicam-se a polipeptídeos. O sistema de numeração EU (Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5a ed. Public HealthService, National Institutes of Healthy1 Bethesda, Md., 1991) é usado paraindicar que resíduo(s) de aminoácido(s) da região constante (p. ex., indicamque resíduo(s) de amino ácido da região constante (p. ex., de um anticorpoIgG) são alterados ou mudados. A numeração pode ser usada para um tipoespecífico de anticorpo (p. ex., IgGI) ou uma espécie (p.ex., humano) cp, acompreensão de que mudanças similares podem ser feitas através de tiposde anticorpos e espécies.

Em alguns modos de realização, os polipeptídeos (incluindoanticorpos) que se ligam especificamente a um receptor de trkBcompreendem uma região constante de cadeia pesada contendo funçãoefetora aperfeiçoada. A região constante de cadeia pesada pode conter umaseqüência que ocorre naturalmente ou é uma variante. Em alguns modos deexecução a seqüência de amino ácido de uma região constante de cadeiapesada que ocorre naturalmente é mutada, por exemplo, por substituição,inserção e/ou deleção de amino ácido, sendo que a função efetora da regiãoconstante é prejudicada. Em alguns modos de realização, a N-glicosilaçãoda região Fc de uma região constante de cadeia pesada também pode sermodificada, por exemplo, pode ser removida completamente ouparcialmente, sendo que a função efetora da região constante é prejudicada.

Em alguns modos de realização, a função efetora é prejudicadapor remoção da N-glicosilação da região Fc (p. ex., no domínio CH 2 deIgG). Em alguns modos de realização, a N-glicosilação da região Fc éremovida por mutação do resíduo de amino ácido glicosilado ou resíduosflanqueadores que são parte da seqüência de reconhecimento daglicosilação na região constante. As seqüências dos tripeptídeos asparagina-X-serina (N-X-S), asparagina-X-treonina (N-X-T) e asparagina-X-cisteina (N-X-C), onde X é qualquer amino ácido exceto prolina, são as seqüências dereconhecimento para ligação enzimática da parcela de carbohidrato para acadeia lateral de asparagina para N-gücosilação. Mutação de qualqueramino ácido nas seqüências de tripeptídeo na região constante produz umIgG aglicosilado. Por exemplo, local de N-glicosilação N297 do IgGI e lgG3humano pode ser mutado para A, D, Q, K, or H. Ver, Tao et al., J.Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis et al., Immunological Reviews163:59-76 (1998). Foi reportado que IgGI e lgG3 humano com substituiçãode Asn-297 com Gln, His, ou Lys não se ligam ao FctRI humano e nãoativam o complemento com a capacidade de ligação C1q completamenteperdida para IgGI e dramaticamente reduzida para lgG3. Em alguns modosde realização, o amino ácido N nas seqüências de tripeptídeo é mutado paraqualquer um dos amino ácidos A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, T,V, W, Y. Em alguns modos de realização, o amino ácido N nas seqüênciasde tripeptídeo é mutado para uma substituição conservadora. Em algunsmodos de realização, o amino ácido X nas seqüências de tripeptídeo émutado para prolina. Em alguns modos de realização, o amino ácido S nasseqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q,R, V, W1 Y. Em alguns modos de realização, o amino ácido T nasseqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q,R, V, W, Y. Em alguns modos de realização, o amino ácido C nasseqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q,R, V, W, Y. Em alguns modos de realização, o amino ácido que segue otripeptídeo é mutado para P. Em alguns modos de realização, a N-glicosilação na região constante é removida enzimaticamente (tal como N-glicosidase F, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3,e englicosidase Η). A remoção da N-glicosilação também pode serconseguida pela produção do anticorpo em uma linha celular com deficiênciapara N-glicosilação. Wright et al., J Immunol. 160(7):3393-402 (1998).

Em alguns modos de realização, o resíduo de amino ácidointeragindo com oligosacarídeos ligados ao local de N-glicosilação da regiãoconstante é mutado para reduzir a afinidade de ligação a FcyRI. Porexemplo, F241, V264, D265 do lgG3 humano podem ser mutados. Ver, Lundet al., J. Immunològy 157:4963-4969 (1996).

Em alguns modos de realização a função efetora é prejudicadapor modificação das regiões tais como 233-236, 297, e/ou 327-331 do IgGhumano conforme descrito na PCT WO 99/58572 e Armour et al., MolecularImmunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933(2000). Anticorpos descritos na PCT WO 99/58572 e Armour et al.compreendem, além de um domínio de ligação dirigido à molécula alvo, umdomínio efetor contendo uma seqüência de amino ácidos substancialmentehomóloga a uma região totalmente constante ou parcialmente constante deuma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos sãocapazes de se ligar à molécula alvo sem acionar significativamente a Iisedependente de complemento, ou destruição do alvo mediada por célula. Emalguns modos de realização, o domínio efetor tem uma afinidade reduzida aFcyRI, FcyRIIa, e FcyRIII. Em alguns modos de realização, o domínio efetoré capaz de ligar especificamente FcRn e/ou FcYRIIb. Esses são tipicamentebaseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios decadeia pesada de imunoglobulina CH2 humana. Anticorpos modificadosdesta maneira são particularmente apropriados para uso na terapia deanticorpo crônica para evitar reações inflamatórias e outras reações1 adversas à terapia de anticorpo convencional. Em alguns modos deexecução, a região constante do anticorpo de cadeia pesada é uma cadeiapesada humana IgGI com quaisquer das seguintes mutações: 1)A327A330P331 a G327S330S331; 2) E233L234L235G236 aP233V234A235 com G236 deletado; 3) E233L234L235 a P233V234A235; 4)E233L234L235G236A327A330P331 a P233V234A235G327S330S331 comG236 deletado; 5) E233L234L235A327A330P331 aP233V234A235G327S330S331; e 6) N297 to A297 ou qualquer outro aminoácido exceto N. Em alguns modos de execução, a região constante dacadeia pesada do anticorpo é um lgG2 humano de cadeia pesada com asseguintes mutações: A330P331 a S330S331. Em alguns modos deexecução, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é um lgG4humano de cadeia pesada com quaisquer das seguintes mutações:E233F234L235G236 a P233V234A235 com G236 deletado; E233F234L235a P233V234A235; e S228L235 a P228E235.

A região constante também pode ser modificada para prejudicara ativação complementar. Por exemplo, a ativação complementar deanticorpos IgG seguintes à ligação do componente C1 do complemento podeser reduzida por mutação de resíduos de amino ácidos na região constanteem um motivo de ligação C1 (p.ex., motivo de ligação C1q). Tem sidoinformado que a mutação Ala para cada um dos D270, K322, P329, P331 doIgGI humano significativamente reduziu a capacidade do anticorpo se ligar aC1q e ativar o complemento. Para lgG2b murino, o motivo de ligação C1qconstitui os resíduos E318, K320, e K322. Idusogie et al., J. Immunology164:4178-4184 (2000); Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988).

Acredita-se que o motivo de ligação Clq E318, K320, e K322identificados para lgG2b murino é comum a outros isótipos de anticorpo.Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988). A atividade de ligação de C1qpara lgG2b pode ser abolida por substituição de quaisquer resíduos dos trêsespecificados com um resíduo contendo uma funcionalidade não apropriadanas suas cadeias laterais. Não é necessário substituir os resíduos tônicossomente com Ala para abolir a ligação de Clq. Também é possível usaroutros resíduos não iônicos substituídos por alquila, tais como Gly, lie, Leu,ou Vai, ou tais resíduos não-polares aromáticos como Phe, Tyr, Trp e Pro nolugar de quaisquer um dos três resíduos para abolir a ligação de Clq. Alémdisso, também é possível usar tais resíduos polares não iônicos como Ser,Thr, Cys, e Met no lugar de resíduos 320 e 322, mas não 318, para abolir aatividade de ligação de Clq.

A invenção também fornece anticorpos contendo uma funçãoefetora prejudicada onde o anticorpo tem uma região de dobra modificada. Aafinidade de ligação de IgG humano para seus receptores Fc pode sermodulada por modificação da região da dobra. Canfield et al., J. Exp. Med.173:1483-1491 (1991); Hezareh et al., J. Virol. 75:12161-12168 (2001);Redpath et al., Human Immunology 59:720-727 (1998). Resíduos de aminoácidos específicos podem ser mutados ou deletados. A região da dobramodificada pode compreender uma região completa da dobra derivada deum anticorpo de ciasse ou subclasse diferente daquela do domínio CHI. Porexemplo, o domínio constante (CH1) de uma classe de anticorpo IgG podeestar ligado a uma região da dobra de uma classe de anticorpo lgG4.

Alternativamente, a nova região da dobra pode compreender parte de umadobra natural ou uma unidade de repetição na qual cada unidade narepetição é derivada de uma região da dobra natural. Em alguns modos derealização, a região de dobra natural é alterada pela conversão de um oumais resíduos de cisteína em um resíduo neutro, tal como alanina, ou porconversão de resíduos apropriados colocados em resíduos de cisteína, ver,p.ex., Pat U.S. N0 5.677.425. Tais alterações são realizadas usando-se aquímica de proteínas reconhecida na técnica e, de preferência, técnicas deengenharia genética, e como descrito aqui.

Polipeptídeos que se ligam especificamente a um receptor detrkB e fundem em uma região constante de cadeia pesada contendo umafunção efetora prejudicada também podem ser empregados para osmétodos descritos aqui. Um exemplo de tais polipeptídeos de fusão é umaimunoadesina. Ver, p. ex., Pat US N0 6.153.189. Outros métodos parapreparar anticorpos contendo uma função efetora prejudicada conhecidos natécnica também podem ser empregados.

Anticorpos e polipeptídeos com regiões constantes modificadaspodem ser testados em um ou mais ensaios para avaliar o nível de reduçãoda função efetora na atividade biológica comparado com o anticorpo departida. Por exemplo, a capacidade do anticorpo ou polipeptídeos com umaregião Fc alterada de ligar complemento, ou receptores de Fc (por exemplo,receptores de Fc em microglia), ou região da dobra alterada pode seravaliada usando os ensaios divulgados aqui bem como qualquer ensaioreconhecido na técnica. PCT WO 99/58572; Armour et al., MolecularImmunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933(2000); Song et al., Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002).

Os anticorpos agonistas de anti-trkB podem ser preparadosusando imunogenes que expressam um ou mais domínios extracelulares detrkB. Um exemplo de um imunogene são células com alta expressão de trkB,que podem ser obtidas conforme descrito aqui. Outro exemplo de umimunogene que pode ser empregado é uma proteína solúvel (tal como umaimunoadesina trkB) que contem o domínio extracelular ou uma porção dodomínio extracelular do receptor de trkB.

A via e horário de imunização do animal hospedeiro sãogeralmente na manutenção com técnicas bem estabelecidas econvencionais para a estimulação e produção de anticorpo, conformedescrito aqui posteriormente. Técnicas gerais para a produção de anticorposhumanos e de camundongos são conhecidas na técnica e são descritasaqui.

Observa-se que qualquer sujeito mamífero incluindo humanosou células que produzem anticorpos a partir deles podem ser manipuladospara servir como a base para a produção de linhas celulares de hibridomade mamíferos, incluindo humanos. Tipicamente o animal hospedeiro éinoculado intraperitonealmente com uma quantidade de imunogene,incluindo conforme o descrito aqui.

Hbridomas podem ser preparados a partir dos linfócitos ecélulas de mieloma imortalizadas usando a técnica de hibridização de célulasomática geral de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 ouconforme modificado por Buck, D. W. et ai, (1982) In Vitro, 18:377-381.Linhas de mieloma disponíveis, incluindo mas não limitadas a X63-Ag8.653e aquelas do Instituto Salk lnstitute, Cell Distribution Center, San Diego,Calif., EUA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnicaenvolve células de mieloma de fusão e células linfóides usando um fusogental como polietileno glicol, ou por meios elétricos bastante conhecidos pelosespecialistas na técnica. Depois da fusão, as células são separadas do meiode fusão e cultivadas em um meio de crescimento seletivo, tal como meiohipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar células parente nãohibridizadas. Quaisquer dos meios descritos aqui, suplementados com ousem soro, podem ser empregados para hibridomas de cultura que secretamanticorpos monoclonais. Como outra alternativa para a técnica de fusãocelular, células B imortalizadas EBV podem ser empregadas para produziros anticorpos monoclonais anti-trkB do sujeito da invenção. Os hibridomassão expandidos e subclonados, se desejado, e sobrenadantes são testadospara atividade anti-imunogênio por procedimentos de imunoensaioconvencionais (p.ex., imunoensaio de rádio, imunoensaio de enzima, ouimunoensaio de fluorescência).

Hibridomas que podem ser usados como fontes de anticorposabrangem todos os derivados, células de progênio dos hibridomas parentesque produzem anticorpos monoclonais específicos para trkB, ou uma porçãodeles.

Hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser cultivadosin vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticorposmonoclonais podem ser isolados do meio de cultura, ou fluidos do corpo, porprocedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais comoprecipitação em sulfato de amônio, gel eletroforese, diálise, cromatografia eultrafiltração, se desejado. Atividade indesejada pode ser removida, porexemplo, fazendo a preparação sobre adsorventes feitos do imunogênioligado a uma fase sólida e diluindo ou desprendendo os anticorposdesejados do imunogênio. A imunização de um animal hospedeiro com umreceptor de TdkB humano ou de outra espécie, ou um fragmento do receptorde trkB humano ou de outra espécie, ou um receptor de trkB humano ou deoutra espécie, ou um fragmento contendo a seqüência de amino ácido alvoconjugada com uma proteína que é imunogênica nas espécies a seremimunizadas, p. ex., hemocianina de lapa, soro albumina, tiroglobulina bovina,ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou agente dederivatização, por exemplo éster de maleimidobenzoil sulfosucinimida(conjugação através de resíduos de cisteína ), N-hidroxisucinimida (atravésde resíduos de lisina), glitaradeído, anidrido succínico, S0CI2, ouRIN=C=NR, onde Re R1 são grupos alquila diferentes, pode produzir umapopulação de anticorpos {e.g., anticorpos monoclonais). Outro exemplo deum imunogênio são células com uma alta expressão de trkB, que podem serobtidas a partir de meios recombinantes, ou por isolamento ouenriquecimento de células a partir de uma fonte natural que expressa umaíto nível de irkB. Essas células podem ser humanas ou de outra origemanimal, e podem ser empregadas como um imunogênio diretamente isolado,ou podem ser processadas de tal forma que imunogeneidade é aumentada,ou a expressão de trkB (de um fragmento de trkB) é aumentada ouenriquecida. Tal processamento inclui, mas não está limitado a, o tratamentodas células ou seus fragmentos com agentes projetados para aumentar suaimunogeneidade, tal como, p.ex., formaldeído, glutaraldeído, etanol,acetona, e/ou vários ácidos. Além disso, tanto antes ou depois de taltratamento as células podem ser processadas para enriquecer o imunogêniodesejado, neste caso trkB ou seus fragmentos. Essas etapas deprocessamento podem incluir técnicas de fracionamento de membranas, quesão bastante conhecidas na técnica.

Se desejado, o anticorpo anti-trkB (monoclonal ou policlonal) deinteresse pode ser sequenciado e a seqüência de polinucleotídeo podeentão ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A seqüênciacodificadora do anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor emuma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida econgelada para uso futuro. Como uma alternativa, a seqüência depolinucleotídeo pode ser empregada para manipulação genética para"humanizar" o anticorpo ou para aumentar a afinidade, ou outrascaracterísticas do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode serprojetada para se assemelhar a regiões constantes humanas para evitar uma resposta imune se o anticorpo é usado em julgamentos clínicos etratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente aseqüência de anticorpo para obter maior afinidade ao receptor de trkB emaior eficácia na ativação do receptor de trkB. Ficará claro para osespecialistas na técnica que podem ser feitas uma ou mais mudanças nospolinucleotídeos para o anticorpo anti-trkB e ainda manter sua capacidadede ligação ao domínio extracelular de trkB ou epítopos de trkB.

Há quatro etapas gerais para humanizar o anticorpo monoclonal.Essas são: (1) determinação do nucleotídeo e predição da seqüência deamino ácido do anticorpo de partida dos domínios variáveis, leves e pesados(2) projeção do anticorpo humanizado, i.e., decisão de qua! região do quadrodo anticorpo usar durante o processo de humanização (3) asmetodologias/técnicas de humanização atuais e (4) a transfecção eexpressão do anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Patente U.S. N os4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761;5.693.762; 5.585.089; 6.180.370; e 6.548.640. Por exemplo, a regiãoconstante pode ser projetada para se assemelhar mais às regiões humanasconstantes para evitar resposta imunológica se o anticorpo é usado emjulgamentos clínicos e tratamentos em humanos. Ver, por exemplo, PatenteU.S. N os. 5.997.867 e 5.866.692.

Um número de moléculas de anticorpo "humanizadas"compreendendo um local de ligação de antígeno derivado de umaimunoglobulina não-humana foi descrito, incluindo anticorpos quiméricoscontendo regiões V de roedores e suas regiões determinantes decomplementaridade associadas (CDRs) fundidas em domínios humanosconstantes. Ver, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991),Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. JImmunol. 138:4534-4538 (1987), e Brown et al. Câncer Res. 47:3577-3583(1987). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertados emuma região enquadrada de suporte humano (FR) antes da fusão com umdomínio constante do anticorpo humano apropriado. Ver, por exemplo,Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science239:1534-1536 (1988), e Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Outrareferência descreve CDRs de roedores suportados por regiões enquadradasde roedores recombinantemente folheadas (veneered). Ver, por exemplo, aPublicação da Patente Européia N0 519.596. Essas moléculas"humanizadas" são projetadas para minimizar a resposta imunológica emrelação a moléculas de anticorpo anti-humanas de roedores que limita aduração e eficácia de aplicações terapêuticas daquelas parcelas emreceptores humanos. A região constante do anticorpo pode ser projetada talque ela seja imunologicamente inerte, p. ex não acione uma Iise mediadapor complemento ou não estimula citotoxidez mediada por céluladependente de anticorpo (ADCC). Em outros modos de realização, a regiãoconstante é modificada conforme descrito no Eur. J. Immunol. (1999)29:2613-2624; Pedido de Patente PCT N0 PCT/GB99/01441; e/ou Pedido dePatente UK N0 9809951.8.

Ver, por exemplo, PCT/GB99/01441; Pedido de Patente UK N09809951.8. Outros métodos de anticorpos humanizados que também podemser utilizados são divulgados por Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) e nas Patentes U.S. Nos 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867;5.866.692; 6.210.671; 6.350.861; e Publicação PCT No WO 01/27160.

Ainda em outra alternativa, anticorpos totalmente humanospodem ser obtidos pelo emprego de ratos comercialmente disponíveis queforam projetados por engenharia genética para expressar proteínas daimunoglobulina humana específica. Animais transgênicos que são projetadospara produzir uma resposta mais desejável (p. ex., anticorpos totalmentehumanos) ou respostas imunes mais robustas também podem serempregados para a geração de anticorpos humanizados ou humanos.

Exemplos de uma tal tecnologia são Xenomouse ™ da Abgenix, Inc.(Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse™ da Medarex, Inc.(Princeton, NJ).

Em uma alternativa, anticorpos podem ser preparadosrecombinantemente e expressos usando qualquer método conhecido natécnica. Em uma outra alternativa, anticorpos podem ser preparadosrecombinantemente por tecnologia de desdobramento de fagos. Ver porexemplo as Patentes U.S. 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743 e 6.265.150; eWinter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativamente, atecnologia de desdobramento de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e anticorposde fragmentos in vitro, do domínio da variável imunoglobulina (V) a partir derepertórios de gens de doadores não imunizados. De acordo com estatécnica, genes do domínio do anticorpo V são clonados enquadrados tantonum gen de proteína revestida maior ou menor de um bacteriófagofilamentoso, tal còmo M13 ou fd, e dispostos como fragmentos de anticorposfuncionais na superfície da partícula do fago. Porque a partícula filamentosacontem uma cópia de DNA de filamento único do genoma do fago, seleçõesbaseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam naseleção do gen codificador do anticorpo que exibe aquelas propriedades.Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. Odesdobramento de fagos pode ser realizado em uma variedade de formatos;para rever veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Diversas fontes desegmentos de gens V podem ser usadas para desdobramento de fagos.Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolou uma ordenação diversa deanticorpos de anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatorialrandômica de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados.Um repertório de gens V de doadores humanos não imunizados pode serconstruído e anticorpos em um arranjo diverso dos antígenos (incluindoauto-antígenos) pode ser isolado seguindo essencialmente as técnicasdescritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou de Griffith etal., EMBO J. 12:725-734 (1993). Em uma resposta natural imune, genes deanticorpos acumulam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática).Algumas das mudanças introduzidas conferirão maior afinidade, e as célulasB que exibem imunoglobulina com alta afinidade de superfície, e são depreferência replicadas e diferenciadas durante um desafio de antígenosubsequente. Este processo natural pode ser imitado pelo emprego datécnica conhecida como "embaralhamento de cadeia". Marks, et al.,Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticorpos"primários" humanos obtidos por desdobramento de fagos pode seraperfeiçoada por substituição seqüencial de genes da região V com cadeiapesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente(repertórios) dos genes do domínio V obtidos de doadores não-imunizados.Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorposcom afinidades na faixa de pM-nM. Uma estratégia de preparação derepertórios de anticorpos com fagos muito grandes (também conhecidacomo "a mãe-de-todas as bibliotecas") foi descrita por Waterhouse et al.,Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). O embaralhamento de genestambém pode ser empregado para derivar anticorpos humanos deanticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades similares eespecificidades com o anticorpo de partida de roedores. De acordo com estemétodo, que também é referido como "impressão de epítopo", o gene deanticorpos de roedores do domínio V de cadeia leve ou pesada obtidos pelatécnica de desdobramento de fagos é substituído por um repertório de genesdo domínio V humano, criando quimeras de roedores-humanos. A seleçãode antígenos resulta no isolamento de regiões humanas variáveis capazesde restaurar um local de ligação funcional de antígeno, i.e., os epítopos(impressões) governam a escolha de parceiros. Quando o processo erepetido para substituir o domínio V do roedor remanescente, um anticorpohumano é obtido (ver PCT N0 de Publicação WO 93/06213, publicado em 1ode abril de 1993). Diferentemente da humanização tradicional de anticorposde roedores por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorposcompletamente humanos, que não têm um enquadramento ou resíduos deCDR de origem dos roedores. É claro que apesar da discussão acima referir-se a anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveisa anticorpos customizados para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas,eqüinos e bovinos.

O anticorpo pode ser um anticorpo bi-específico, um anticorpomonoclonal que tem especificidades de ligação para pelo menos doisantígenos diferentes, e pode ser preparado usando os anticorpos descritosaqui. Métodos para preparação de anticorpos biespecíficos são conhecidosna técnica (ver, p. ex., Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210).Tradicionalmente, a produção recombinante dos anticorpos biespecíficos foibaseada na co-expressão de duas imunoglobulinas em pares de cadeiapesada-cadeia leve, com as duas cadeias pesadas contendo diferentesespecificidades (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acordo com uma abordagem para preparar anticorposbiespecíficos, domínios com anticorpos variáveis com as desejadasespecificidades de ligação (locais de combinação anticorpo-antígeno) sãofundidos em seqüências de domínio de imunogiobuiina constante. A fusãode preferência é feita com uma imunogiobuiina com um domínio constantede cadeia pesada, compreendendo pelo menos parte, das regiões da dobraCH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada(CH1), contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente empelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeiapesada de imunogiobuiina e, se desejado, a cadeia leve de imunogiobuiina,são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transferidos emum organismo hospedeiro apropriado. Isto fornece grande flexibilidade noajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos emmodos de realização quando proproções desiguais das três cadeias depolipeptídeos usadas na construção fornecem os rendimentos ótimos.

Entretanto, é possível inserir as seqüências de código para duas ou todas astrês cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando aexpressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em iguaisproporções resulta em rendimentos elevados, ou quando as proporções nãotêm nenhuma significância particular.

Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostospor uma imunogiobuiina híbrida de cadeia pesada com uma primeiraespecificidade de ligação em um braço, e uma imunogiobuiina híbrida compar de cadeia pesada-cadeia leve (fornecendo uma segunda especificidadede ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica, com umaimunogiobuiina de cadeia leve em apenas uma metade da moléculabiespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado dascombinações de cadeia de imunogiobuiina indesejadas. Esta abordagem édescrita na Publicação PCT N0 WO 94/04690.

Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorposligados covalentemente, também estão dentro do âmbito da invenção. Taisanticorpos têm sido empregados para atingir células do sistema imunológicoem células indesejadas (Patente U.S. N0 4.676.980), e para tratamento dainfecção por HIV (Publicação PCT Nos WO 91/00360 e WO 92/200373; e EP03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser preparados usandoquaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulaçãoapropriados e técnicas são bastante conhecidos na técnica, e são descritosna Patente US N0 4.676.980.

Anticorpos podem ser preparados recombinantementeprimeiramente isolando os anticorpos preparados de animais hospedeiros,obtendo a seqüência genética, e usando a seqüência genética paraexpressar o anticorpo recombinantemente nas células hospedeiras (p.ex.,células CHO). Outro método que pode ser empregado é o de expressar aseqüência de anticorpo em plantas (p. ex., tabaco), leite transgênico, ou emoutros organismos. Métodos para expressar anticorpos recombinantementeem plantas ou leite foram divulgados. Ver, por exemplo, Peeters et al. (2001)Vaccine 19:2756; Lonberg, N. e D. Huszar (1995) Int.Rev.lmmunol 13:65; ePollock et al. (1999) J Immunol Methods 231:147. Métodos para prepararderivados de anticorpos, por ex., humanizados, de cadeia única, etc. sãoconhecidos na técnica.

Anticorpos quiméricos ou híbridos também podem serpreparados usando métodos conhecidos da química de proteína sintética,incluindo aqueles envolvendo os agentes de reticulação. Por exemplo,imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca dedissulfeto ou por formação de uma ligação de tioéter. Exemplos dereagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Fragmentos Fv de cadeia única também podem ser produzidos,tal como descrito em Iliades et al., 1997, FEBS Letters, 409:437-441. Aligação de tais fragmentos de cadeia única usando vários aglutinantes édescrita em Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433. Umavariedade de técnicas para a produção recombinante e manipulação deanticorpos são bem conhecidas na arte.

Anticorpos podem ser modificados conforme descrito naPublicação PCT N0 WO 99/58572, publicada em 8 de novembro de 1999.Esses anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação dirigido àmolécula alvo, um domínio efetor contendo uma seqüência de amino ácido,substancialmente homóloga a todo ou parte de um domínio constante deuma cadeia pesada de imunoglobulina. Esses anticorpos são capazes de seligar à molécula alvo sem acionamento significativo da Iise dependente decomplemento, ou destruição do alvo mediado por célula. De preferência, odomínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcYRIIb.Esses são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de duasou mais imunoglobulinas humanas de cadeia pesada do domínio CH2.Anticorpos modificados desta maneira são preferidos para uso na terapia deanticorpos crônica, para evitar reações inflamatórias e outras reaçõesadversas à terapia de anticorpo convencional.

Os anticorpos preparados tanto por imunização de um animalhospedeiro ou recombinantemente deveriam exibir quaisquer um ou maisdos agonistas de atividades da trkB descritos aqui.

Imunoensaios e técnicas de seleção do fluxo da citometria taiscomo seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) também podemser empregados para isolar anticorpos que são específicos para trkB.

Os anticorpos podem estar ligados a muitos carreadoresdiferentes. Carreadores podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de1 carreadores bem conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polietileno,dextrano, nylon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas,poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do carreador tanto podeser solúvel ou insolúvel para os propósitos de uma invenção. Aquelesespecialistas na técnica saberão de outros carreadores apropriados paraligar anticorpos, ou serão capazes de verificar isto, usando experimentaçãorotineira.

Anticorpos de agonistas anti-trkB que codificam o DNA podemser sequenciados, como é conhecido na técnica. Geralmente, o anticorpomonoclonal é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentosconvencionais (p. ex., usando amostras de oligonucleotídeo que sãocapazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeiaspesadas e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridomaservem como uma fonte preferida de tais cDNA. Uma vez isolado, o DNApode ser colocado em vetores de expressão (tais como os vetores deexpressão divulgados na Pub. PCT N0 WO 87/04462), que são entãotransfectados nas células hospedeiras tais como células de E. Coli1moléculas de símios COS, células do ovário de hasmter chineses (CHO), oucélulas de mieloma, que de outra forma não produzem proteínaimunoglobulina, para obtenção da síntese de anticorpos monoclonais nascélulas hospedeiras recombinantes. Ver, p. ex., Pub. PCT N0 WO 87/04462.

O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por substituição daseqüência codificadora para domínios de constante humana de cadeiapesada e leves no lugar das seqüências murinas homólogas, Morrison et al.,Proc. Nat. Acad. Sei. 81: 6851 (1984), ou ligando covalentemente àseqüência codificadora de imunoglobulina, toda ou parte da seqüênciacodificadora para um polipeptídeo sem-imunoglobulina. Desta maneira, sãopreparados anticorpos "quiméricos ou "híbridos" que têm a especificidade deligação de um anticorpo monoclonal anti-trkB nele. O DNA que codifica oanticorpo de agonista anti-trkB (tal como um seu fragmento de ligação deantígeno) também pode ser empregado para fornecimento e expressão deanticorpo de agonista anti-trkB em uma célula desejada, conforme descritoaqui. As técnicas de fornecimento de DNA ainda são descritas aqui.

Anticorpos anti-trkB podem ser caracterizados usando métodosbastante conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é o de identificar oepitopo ao qual ele se liga, incluindo dissolver a estrutura de cristal de umcomplexo anticorpo- antígeno, testes de competição, testes de expressão defragmento de gene, e testes à base de peptídeo sintético, conforme descrito,por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Nova Iorque, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento deepítopos pode ser empregado para determinar a seqüência à qual oanticorpo anti-trkB se liga. O mapeamento de epítopos é comercialmentedisponível de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg15, 8219 PH Lelystad, Países Baixos). O epítopo pode ser um epítopo linear,i.e., contido em uma única extensão (stretch) de aminoácidos, ou um epítopoconformacional formado por uma interação tridimensional de amino ácidosque podem estar contidos, mas não necessariamente, em uma únicaextensão. Peptídeos de vários comprimentos (p.ex., pelo menos com 4-6amino ácidos de extensão) podem ser isolados ou sintetizados (p. ex.,recombinantemente) e usados para ensaios de ligação com um anticorpoanti-trkB. Em um outro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo anti-trkB seliga pode ser determinado em uma varredura sistemática usando peptídeosque se sobrepõem, derivados da seqüência extracelular de trkB, edeterminando a ligação pelo anticorpo de anti-trkB. De acordo com os testesde expressão de fragmento de gene, o quadro de leitura aberta que codificatrkB é fragmentado tanto randomicamente ou por construções genéticasespecíficas, e a reatividade dos fragmentos expressos de trkB com oanticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de genes podem, porexemplo, ser preparados por PCR e então transcritos e traduzidos emproteína in vitro, na presença de amino ácidos radioativos. A ligação doanticorpo aos fragmentos de trkB rotulados radioativamente é entãodeterminada por imunoprecipitação e gel eletroforese. Certos epítopostambém podem ser identificados pelo uso de grandes bibliotecas deseqüências de peptídeo randômicas dispostas na superfície das partículasdo fago (biblioteca de fagos).

Ainda um outro método que pode ser usado para caracterizarum anticorpo anti-trkB é o de usar testes de competição com outrosanticorpos que sabidamente se ligam ao mesmo antígeno, i.e., domínioextracelular de trkB, para determinar se o anticorpo anti-trkB se liga aomesmo epítopo como outros anticorpos. Testes de competição são bastanteconhecidos pelos especialistas na técnica. Exemplos de anticorpos úteis nostestes de competição incluem os seguintes: anticorpos 6.1.2, 6.4.1, 2345,2349, 2.5.1, 2344, 2248, 2250, 2253, e 2256. Ver Publ. PCT N0 WO01/98361

O mapeamento de epítopos também pode ser realizado usandomutantes de troca de domínio conforme descrito na Publ. PCT N0 WO01/98361. Geralmente, esta abordagem é útil para anticorpos anti-trkB quenão reagem cruzadamente significativamente com trkA ou trkC. Mutantes detroca de domínio de trkB podem ser preparados por substituição de domíniosextracelulares de trkB com os domínios correspondentes de trkC ou trkA. Aligação de cada agonista de anticorpo anti-trkB a vários mutantes de trocade domínio pode ser avaliada e comparada a sua ligação a trkB do tiposelvagem (nativo) usando ELISA ou outro método conhecido na técnica.Uma outra abordagem, de varredura de alanina, pode ser realizada.Resíduos individuais do antígeno, o receptor trkB, são sistematicamentemutados em outro amino ácido (usualmente alanina) e o efeito dasmudanças é avaliado por teste da capacidade do trkB modificado de se ligara anticorpo usando ELISA ou outros métodos conhecidos na técnica.

Polipeptídeos BDNF

O agonista trkB usado nos métodos da invenção incluempolipeptídeos BDNF. Conforme empregado aqui, "polipeptídeos BDNF"incluem proteína madura que ocorre naturalmente (intercambiavelmentedenominado "BDNF") tal como BDNF maduro humano mostrado na Pat.U.S. N0 5.180.820 e variantes de seqüência de amino ácido de BDNF queocorrem naturalmente; variantes da seqüência de amino ácidos de BDNF;fragmentos de peptídeo de BDNF maduro (tal como humano) e as referidasvariantes da seqüência de amino ácido; e formas modificadas de BDNFmaduro e as referidas variantes de seqüência de amino ácidos e fragmentosde peptídeo onde os polipeptídeos ou peptídeos foram covalentementemodificados por substituição com uma parcela diferente de um amino ácidoque ocorre naturalmente, desde que a variante da seqüência de aminoácido, fragmento de peptídeo, e sua forma modificada mostre uma ou maisatividades biológicas de um agonista de trkB e/ou de proteína de BNFmadura que ocorre naturalmente. Agonistas de trkB também incluemproteínas de fusão e conjugados compreendendo quaisquer dos modos derealização dos polipeptídeos BDNF descritos aqui, p. ex., um polipeptídeo deBDNF conjugado ou fundido em uma parcela de extensão da vida útil, talcomo PEG ou um peptídeo. As variantes da seqüência de amino ácido,fragmentos de peptídeo (incluindo fragmentos de variantes), ou formasmodificadas deies sob consideração não incluem NGF, NT-4/5, ou NT-3 dequalquer espécie animal. Polipeptídeos BDNF incluem qualquer um ou maismodos de execução descritos aqui. Por exemplo, polipeptídeos BDNFcompreendem uma seqüência que ocorre naturalmente com uma ou maisinserção, deleção, ou substituição de amino ácido.

Em alguns modos de execução, o polipeptídeo BDNF é umpolipeptídeo BDNF de mamífero que pode ser um polipeptídeo BDNF demamífero que ocorre naturalmente, ou polipeptídeo de BDNF derivado deum BDNF de mamífero que ocorre naturalmente e contendo uma seqüênciaque não coincide com qualquer parte de um BDNF não-mamífero que ocorrenaturalmente. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo BDNF é umpolipeptídeo BDNF humano que pode ser um BDNF humano que ocorrenaturalmente, ou polipeptídeo BDNF derivado de um BDNF humano queocorre naturalmente e contendo uma seqüência que não coincide comqualquer parte de um BDNF não-humano que ocorre naturalmente.

Polipeptídeos BDNF, incluindo variantes, fragmentos depeptídeo, formas modificadas de polipeptídeos BDNF (incluindo BDNF queocorrem naturalmente), proteína de fusão e conjugados da invenção são1 caracterizados por quaisquer (uma ou mais) das seguintes características:(a) ligar-se ao receptor de trkB; (b) ligar-se ao receptor de trkB e ativa a(s)atividade (s) biológica (s) de trkB e/ou uma ou mais vias fluxo abaixomediadas pela(s) função(ções) de sinalização trkB; (c) ligar-se ao receptorde trkB e aumenta o peso corporal e/ou a ingestão de alimento em umprimata quando administrados perifericamente; (d) ligar-se ao receptor detrkB e tratar, evitar, reverter, ou aperfeiçoar um ou mais sintomas decaquexia em um primata quanto administrado perifericamente; (e) ligar-se aoreceptor de trkB e tratar, evitar, reverter ou melhorar um ou mais sintomasde anorexia nervosa em um primata quando administrado perifericamente;(f) ligar-se ao receptor de trkB e tratar, evitar, reverter, ou melhorar um oumais sintomas da êmese induzida por opióide em um mamífero quandoadministrado perifericamente; (g) promover a dimerização e ativação doreceptor de trkB; e (h) aumentar a sobrevivência neuronal dependente doreceptor de trkB e/ou desenvolvimento de neurito. Assim todos ospolipeptídeos BDNF (incluindo variantes, fragmentos e formas modificadas)são funcionais conforme descrito acima.

A atividade biológica de variantes pode ser testada in vitro e invivo usando métodos conhecidos na técnica e métodos descritos aqui.Polipeptídeos BDNF podem ter uma atividade aumentada ou atividadereduzida se comparados a uma proteína de BDNF que ocorre naturalmente.Em alguns modos de execução, variantes funcionalmente equivalentes têmpelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% deatividade se comparado com a proteína de BDNF nativa a partir da qual opolipeptídeo BDNF é derivado no que diz respeito a um ou mais testesbiológicos descritos acima (ou conhecidos na técnica). Em alguns modos deexecução, variantes funcionalmente equivalentes têm um EC5O (metade daconcentração eficaz máxima) menor do que cerca de aproximadamente 0,01nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, òu 100 nM na ativação do receptor de TrkB in vitro(p.ex., ensaios descritos no Exemplo 6, e no Pedido de Pat. US N02005/0209148 e Publ. PCT N0 WO 2005/082401).

Variantes de seqüência de amino ácido de BDNF incluempolipeptídeos contendo uma seqüência de amino ácido que difere de BDNFque ocorre naturalmente em virtude da inserção, deleção e/ou substituiçãode um ou mais resíduos de amino ácido dentro da seqüência de BDNF queocorre naturalmente (por exemplo, BDNF maduro humano). Variantes deseqüência de amino ácido geralmente serão pelo menos cerca de 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas aqualquer BDNF que ocorre naturalmente (tal como BDNF maduro humano).Em alguns modos de execução, a variante é pelo menos cerca de 70%idêntica à seqüência de amino ácido de BDNF maduro humano. Em algunsmodos de execução, a variante é pelo menos cerca de 85% idêntica àseqüência de amino ácido de BDNF maduro humano. Em alguns modos deexecução, a variante é pelo menos cerca de 90% idêntica à seqüência deamino ácido de BDNF maduro humano. Em alguns modos de execução, avariante é pelo menos cerca de 95% idêntica à seqüência de amino ácido deBDNF maduro humano.

Tais variações que, por exemplo, convertem BDNF em NGF,BDNF, ou NT-3 não estão incluídas dentro do âmbito desta invenção.Portanto, enquando o local para introdução de uma variação de seqüênciade amino ácido é pré-determinado, a natureza da mutação per se nãonecessita ser pré-determinada. Por exemplo, para otimizar o desempenhode uma mutação em um dado local, varredura ala ou mutagênese randômicaé conduzida no códon ou região alvo e as variantes de BDNF expressas sãomonitoradas para a atividade ótima desejada.

Deleções de seqüências de amino ácido geralmente ocorrem nafaixa de cerca de 1 até 30 resíduos, mais preferentemente, cerca de 1 até 10resíduos, e tipicamente são contíguos. Deleções podem ser introduzidas emregiões de baixa homologia entre BDNF, NGF, NT-3, e NT-4/5 paramodificar a atividade de BDNF. Deleções de BDNF em áreas de homologiasubstancial com NT-4/5, NT-3, e NGF podem ser mais provavelmente paramodificar a atividade biológica de BDNF mais significativamente. IO númerode deleções consecutivas pode ser selecionado de modo a preservar aestrutura terciçria de BDNF no domínio afetado, p. ex., laminado dobrado embeta ou alfa helix.

Inserções de seqüências de amino ácidos incluem fusõesamino-terminal e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de umresíduo para polipeptídeos contendo mil ou mais resíduos, bem comoinserções intrasequenciais de resíduos únicos ou múltiplos de amino ácidos.Inserções intrasequenciais ((i.e., inserções dentro da seqüência de BDNFmadura) podem variar geralmente de cerca de 1 até 10 resíduos, maispreferentemente, 1 até 5, mais preferentemente de 1 até 3. Um exemplo deuma inserção terminal inclui fusão de uma seqüência de sinal N-terminalheteróloga na terminação N da molécula de BDNF para facilitar a secreçãode BDNF maduro do hospedeiro recombinante. Tais sinais geralmente serãohomólogos para a célula hospedeira pretendida e incluem STII ou Ipp paraΕ. coli, fator alfa para levedo, e sinais virais tais como herpes gD paracélulas mamíferas. Outras inserções incluem a fusão de polipeptídeos para aterminação N- ou C- de BDNF.

Outro grupo de variantes inclui aquelas nas quais pelo menosum resíduo de amino ácido em BDNF1 e de preferência somente um, foiremovido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Um exemplo é asubstituição de arginina e Iisina por outros amino ácidos para produzir oBDNF resistente a proteólise por serina proteases, criando assim umavariante de BDNF que é mais estável. Os locais de maior interesse paramutagênese substitucional incluem locais onde amino ácidos observados emBDNF, NGF1 NT-3, e NT-4/5 são substancialmente diferentes em termos debojo da cadeia lateral, carga ou hidrofobicidade, mas onde há também umalto grau de homologia no lado selecionado dentro de vários análogosanimais de NGF, NT-3, e NT-4/5 (p.ex. entre todos os NGFs animais, todosos NT-3 animais, e todos os BDNFs). Esta análise realçará resíduos quepodem estar envolvidos na diferenciação da atividade dos fatores tráficos, eportanto, variantes desses locais podem afetar tais atividades. Outros locaisde interesse são aqueles nos quais os resíduos são idênticos entre todos osBDNF, NGF, NT-3, e NT-4/5 de espécies animais, este grau de conformaçãosugerindo importância na obtenção de atividade biológica comum a todos osquatro fatores.

Por exemplo, a substituição de um ou mais amino ácidos incluisubstituições conservadoras. Métodos de preparação de substituiçõesconservadoras são conhecidos na técnica. Por exemplo, ala (A) pode sersubstituído por vai, leu, ile, de preferência por vai; arg (R) pode sersubstituído por lys, gln, asn, de preferência por lys; asn (N) pode sersubstituído por gln, his, lys, arg, de preferência por gln; asp (D) pode sersubstituído por glu; cys (C) pode ser substituído por ser; gln (Q) pode sersubstituído por asn; glu (E) pode ser substituído por asp; gly (G) pode sersubstituído por pro; his (H) pode ser substituído por asn, gln, lys, arg; depreferência por arg; ile (I) pode ser substituído por leu, vai, met, ala, phe,norleucina, de preferência por leu; leu (L) pode ser substituído pornorleucina, ile, vai, met; ala; phe, de preferência por ile; Iys (K) pode sersubstituído por ãrg; gln, asn, de preferência por arg; met (M) pode sersubstituído por leu; phe; ile, de preferência por leu; phe (F) pode sersubstituído por leu, vai, ile, ala, de preferência por leu; pro (P) pode sersubstituído por gly; ser (S) pode ser substituído por thr; thr (T) pode sersubstituído por ser; trp (W) pode ser substituído por tyr; tyr (Y) pode sersubstituído por trp, phe, thr, ser, de preferência por phe; vai (V) pode sersubstituído por ile; leu; met; phe, ala; norleucina, de preferência por leu.

Modificações substanciais na função podem ser obtidas porseleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito namanutenção de (a) a estrutura da estrutura principal dos polipeptídeos naárea da substituição, por exemplo, como um laminado ou conformaçãohelicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) obojo da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos emgrupos baseados nas propriedades comuns da cadeia lateral (algumasdessas podem cair em diversos grupos funcionais):

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não-conservadoras englobarão troca de ummembro de uma dessas classes por outro.

Variantes da seqüência de amino ácidos de BDNF podemocorrer naturalmente ou podem ser preparados sinteticamente, por exemplopor introdução de mudanças de nucleotídeos apropriados em um DNA deBDNF previamente isolado, ou por síntese in vitro dos polipeptídeos davariante desejada. Conforme indicado acima, tais variantes podemcompreender deleções, ou inserções ou substituições de um ou maisresíduos de amino ácido dentro da seqüência de amino ácido de BDNFmaduro (p.ex., a seqüência mostrada na Tabela 1). Qualquer combinação dedeleção, inserção e substituição é feita para chegar em uma variante deseqüência de amino ácido de BDNF desde que os polipeptídeos variantesresultantes possuam uma característica desejada. As mudanças de aminoácidos também podem resultar em maiores modificações de BDNF comexpressão em hospedeiros recombinantes, p.ex. introdução ou mudança delocais, de glicosilação, ou introdução de seqüências âncora de membrana(de acordo com PCT WO 89/01041).

Em alguns modos de execução polipeptídeos BDNFcompreendem uma seqüência de amino ácido codificada por um ácidonucleico que hibridiza sob condições estritas para formar uma seqüência deácido nucleico que codifica BDNF maduro humano.

Polinucleotídeos variantes também podem, ou alternativamente,ser substancialmente homólogos a um gen nativo, ou uma porção oucomplemento dele. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes dehibridizar sob condições moderadamente estritas para formar umaseqüência de DNA que ocorre naturalmente e que codifica polipeptídeos ( ouuma seqüência complementar).

Será apreciado por aqueles com conhecimento comum natécnica que, como um resultado da degeneração do código genético,existem muitas seqüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeosconforme descrito aqui. Alguns desses polinucleotídeos comportam umahomologia mínima com a seqüência de nucleotídeos de qualquer gen nativo.Ainda assim, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso docódon são especificamente considerados pela presente invenção. Alémdisso, alelos dos genes que compreendem as seqüências depolinucleotídeos fornecidos aqui estão dentro do âmbido da presenteinvenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como umresultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ousubstituições de nucleotídeos. O mRNA resultante e proteína podem, masnão necessitam, ter uma estrutura ou função alterada. Alelos podem seridentificados com o uso de técnicas padrão (tais como hibridização,amplificação e/ou comparação com seqüências de bancos de dados).Agonistas de trkB usados nos métodos da invenção tambémincluem proteínas de fusão que compreendem a seqüência de amino ácidode BDNF (p.ex, BDNF humano) ou um seu fragmento de peptídeo funcionai.Polipeptídeos BDNG biologicamente ativos podem ser fundidos comseqüências, que aumentam a reatividade imunológica, facilitam a ligaçãodos polipeptídeos a um suporte ou um carreador, ou facilitam oredobramento e/ou purificação (por exemplo, seqüências codificadoras deepítopos tais como Myc, HA derivado do vírus da gripe hemaglutinina, His-6,FLAG). Essas seqüências podem ser fundidas em polipeptídeos BDNF naextremidade N-terminal ou na extremidade C terminal. Além disso, aproteína ou polinucleotídeo podem ser fundidos em outros ou empolipeptídeos que aumentam sua função, ou especificam sua localização nacélula, tal como uma seqüência de secreção. Métodos para produzirproteínas de fusão recombinantes descritas acima são conhecidos natécnica. A proteína de fusão recombinante pode ser produzida, redobrada eisolada por métodos bastante conhecidos na técnica.

Polipeptídeos BDNF descritos aqui podem ser modificados paraaumentar suas meias vidas em um indivíduo. Por exemplo, polipeptídeosBDNF podem ser peguilados para reduzir o ajuste sistêmico com a perdamínima de atividade biológica. A invenção também fornece composições(incluindo composições farmacêuticas) compreendendo polipeptídeos BDNFligados a uma molécula PEG. Em alguns modos de realização, a moléculaPEG está ligada aos polipeptídeos BDNF através de uma ligação reversível.

A meia vida de polipeptídeos BDNF peguilados pode ser extendida por maisdo que cerca de 2-vezes, 5-vezes, 10-vezes, 15- vezes, 20- vezes, e 30-vezes a meia vida dos polipeptídeos BDNF não peguilados.

Polímeros PEG podem estar ligados a vários grupos funcionaisdos polipeptídeos BDNF pelo uso de métodos conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476(2002); Sakane et al. Pharm. Res. 14:1085-91 (1997). PEG pode estar ligadoaos seguintes grupos funcionais nos polipeptídeos: grupos amino, gruposcarboxila, terminações N modificadas ou naturais, grupos amina, e grupostiol. Em alguns modos de execução, um ou mais resíduos de amino ácido desuperfície são modificados com moléculas PEG. Moléculas PEG podem tervários tamanhos (ρ. ex., variando de cerca de 2 até 40 KDa). Moléculas PEGligadas a polipeptídeos BDNF podem ter um peso molecular de cerca de2000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000 Da. MoléculasPEG podem ser de cadeia simples ou ramificada. Para ligar PEG apolipeptídeos BDNF, um derivado de PEG contendo um grupo funcional emuma ou ambas as terminações pode ser usado. O grupo funcional éescolhido com base no tipo de grupo reativo disponível em polipeptídeosBDNF. Métodos de ligação de derivados aos polipeptídeos são conhecidosna técnica. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476(2002). A ligação entre os polipeptídeos BDNF e PEG também pode ser talque ela pode ser clivada ou naturalmente se degrada (ligação reversível oudegradável) em um indivíduo que pode aperfeiçoar a meia vida masminimiza a perda de atividade. O local de ligação de PEG em polipeptídeosBDNF também pode ser criado por resíduos dé superfície de mutação emum resíduo de amino ácido contendo um grupo reativo PEG, tal como umacisteína.

Polipeptídeos BDNF podem ser produzidos por meiosrecombinantes, isto é, por expressão de ácido nucleico codificador dospolinucleotídeos BDNF. Na cultura de células recombinantes, e,opcionalmente, purificação dos polipeptídeos variantes da cultura celular, porexemplo por bioensaio da atividade da variante ou por adsorção em umacoluna de imunoafinidade compreendendo anticorpos policlonais anti-BDNFde coelho (que se ligarão a pelo menos um epítopo imune da variante quetambém está presente no BDNF nativo). Pequenos fragmentos de peptídeo,da ordem de 40 resíduos ou menos, são convenientemente preparados pormétodos in vitro.

Polipeptídeos BDNF que codificam DNA podem ser clonadospara formar um vetor de expressão para expressar a proteína em uma célulahospedeira. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeosBDNF são descritos no Pedido de Patente U.S. N0 2003/0203383. Ospolipeptídeos BDNF que codificam o DNA na sua forma madura podem estarligados em sua terminação amino a um sinal de secreção. Este sinal desecreção é de preferência a pré-sequência de BDNF que normalmente dirigea secreção de BDNF das células humanas in vivo. Entretanto, sinais desecreção apropriados também incluem sinais de outros BDNF animais, deNGF, NT-2, ou NT-3, sinais virais, ou sinais de polipepetídeos secretados damesma espécie ou espécies relacionadas. Qualquer célula hospedeira (talcomo E. coli) pode ser usada para expressar a proteína ou polipeptídeos.

Polipeptídeos BDNF expressos podem ser purificados.Polipeptídeos BDNF podem ser recuperados do meio de cultura como umaproteína secretada, apesar de também poderem ser recuperados de Iisatosda célula hospedeira quando diretamente expressos sem um sinalsecretório. Métodos de purificação de proteína conhecidos na técnica podemser empregados. Métodos de produção de polipeptídeos BDNF e purificaçãodos polipeptídeos BDNF expressos são conhecidos na técnica.Polipeptídeos BDNF podem ser expressos em E. coli e recobrados deacordo com métodos conhecidos na técnica. BDNF maduro humano tambémpode ser obtido comercialmente (p. ex. de R&D Systems).

Métodos de geração e produção de polipeptídeos NT-4/5também podem ser empregados para gerar e produzir polipeptídeos BDNF.

Identificação de acionistas de trkB

Agonistas de trkB (tais como anticorpos) podem ser identificadosusando métodos reconhecidos na técnica, incluindo um ou mais dosseguintes métodos. Por exemplo, o ensaio de ativação do receptor dequinase (KIRA) descrito nas Patentes U.S. Nos 5.766.863 e 5.891.650 podemser empregados. Este teste do tipo ELISA é apropriado para mediçãoqualitativa ou quantitativa da ativação de quinase por medição daautofosforilação do domínio quinase de um receptor de proteína tirosinaquinase (rPTK, p.ex. receptor de trk), bem como para identificação ecaracterização de agonistas ou antagonistas potenciais de um rPTKselecionado. O primeiro estágio do teste envolve a fosforilação do domínioquinase de um receptor de quinase, no presente caso A um receptor de trkB,sendo que o receptor está presente na membrana celular de uma célulaeucariótica. O receptor pode ser um receptor endógeno ou ácido nucleicocodificador do receptor, ou uma construção de receptor, pode sertransformada na célula. Tipicamente, uma primeira fase sólida (por ex., umacavidade de uma primeira placa de teste) é revestida com uma populaçãosubstancialmente homogênea de tais células (usualmente uma linha celularmamífera) de modo que as células aderem à fase sólida. Normalmente, ascélulas são aderentes e assim aderem naturalmente a uma primeira fasesólida. Se uma "construção de receptor" é empregada, ela usualmentecompreende a fusão de um receptor de quinase e polipeptídeos rotuladores(flag). O polipeptídeo flag é reconhecido pelo agente de captura, comumenteum anticorpo de captura, na parte ELISA do ensaio. Um análito, tal como umagonista candidato, é então adicionado às cavidades contendo as célulasaderentes, tal que o receptor de tirosina quinase (p. ex. receptor de trkB) éexposto ao análito (ou contactado com ele). Este teste permite aidentificação de Iigantes agonistas para o receptor de tirosina quinase deinteresse (por exemplo, trkB). Seguindo a exposição ao análito, aschamadas (calls) de adesão são solubilizadas usando um tampão de Iise(que tem um detergente solubilizante nele) e agitação suave, desprendendoassim o Iisato celular que pode ser submetido diretamente à parte ELISA doteste, sem a necessidade de concentração ou clarificação do Iisato celular.

O Iisato celular assim preparado está então pronto para sersubmetido ao estágio ELISA do teste. Como uma primeira etapa do estágioELISA, uma segunda fase sólida (usualmente uma cavidade de uma placade microtitração ELISA) é revestido com um agente de captura (comumenteum anticorpo de captura) que se liga especificamente ao receptor de tirosinaquinase, ou, no caso de um receptor de construção, aos polipeptídeos flag.O revestimento da segunda fase sólida é executado de modo que o agentede captura adira à segunda fase sólida. O agente de captura é geralmenteum anticorpo monoclonal, mas como é descrito nos exemplos aqui,anticorpos policlonais ou outros agentes também podem ser usados. O Iisatocelular obtido é então exposto a, ou contactado com, o agente de captura deadesão de modo que o receptor ou construção de receptor adira a (ou seja,capturado) na segunda fase sólida. Uma etapa de lavagem é entãoexecutada de modo a remover o Iisato celular não ligado, deixando oreceptor capturado ou construção de receptor. O receptor aderido oucapturado ou construção de receptor é então exposta, ou contactado com,um anticorpo anti-fosfotirosina que identifica resíduos de tirosina fosforiladosno receptor de tirosina quinase. No modo de execução preferido, o anticorpode anti-fosfotirosina è conjugado (diretamente ou inderitamente) a umaenzima que catalisa uma mudança de cor de um reagente de cor nãoradioativo. Concordantemente, a fosforilação do receptor pode ser medidapor uma mudança de cor subsequente do reagente. A enzima pode estarligada ao anticorpo anti-fosfotirosina diretamente, ou uma molécula deconjugação (por exemplo, biotina) pode ser conjugada ao anticorpo de anti-fosfotirosina e a enzima pode subseqüentemente se ligar ao anticorpo deanti-fosfotirosina via a molécula de conjugação. Finalmente, a ligação doanticorpo anti-fosfotirosina ao receptor de captura ou construção receptora émedida, por exemplo, por uma mudança no reagente de cor.

Seguindo a identificação inicial, a atividade agonista de umcandidato (p.ex., um anticorpo monoclonal anti-trkB) ainda pode serconfirmada e refinada por bioensaios conhecidos por testarem as atividadesbiológicas alvo. Por exemplo, a capacidade de um candidato agonizar trkBpode ser testada nos ensaios de desenvolvimento de neurito PC12 usandocélulas PC12 transfectadas com trkB de comprimento total (Jian et al., CellSignal. 8:365-70, 1996). Este teste mede o desenvolvimento de processosde neurito por células feocitocromas de ratos (PC12) em resposta àestimulação por meio de Iigantes apropriados. Essas células expressam trkAendógeno e são portanto responsivas a NGF. Entretanto, elas nãoexpressam trkB endógeno e são portanto transfectadas com a construção daexpressão de trkB para elicitar uma resposta ao agonista de trkB. Depois daincubação das células transfectadas com o candidato, desenvolvimento doneurito é medido e, por exemplo, células com neuritos que excedem 2 vezeso diâmetro da célula são contadas. Candidatos (tais como anticorpos anti-trkB) que estimulam o desenvolvimento de neurito em células PC12transfectadas demonstram atividade agonista de trkB.

A ativação de trkB também pode ser determinada empregando-se vários neurônios específicos em estágios específicos de desenvolvimentoembriônico. Neurônios apropriadamente selecionados podem serdependentes da ativação de trkB para sobrevivência, e assim é possíveldeterminar a ativação de trkB acompanhando a sobrevivência dessesneurônios in vitro. A adição de candidatos a culturas primárias de neurôniosapropriados levará à sobrevivência desses neurônios por um período de pelomenos vários dias, se os candidatos ativam trkB. Isto permite adeterminação da capacidade do candidato (tal como um anticorpo anti-trkB)de ativar trkB. Em um exemplo deste tipo de ensaio, o gânglio nodoso de umembrião de camundongo E15 é dissecado, dissociado, e os neurôniosresultantes são colocados em placas em um prato de cultura de tecido abaixa densidade. Os anticorpos candidatos são então adicionados ao meio eas placas são incubadas por 24-48 horas. Depois deste tempo, asobrevivência dos neurônios é avaliada por quaisquer de uma variedade demétodos. Amostras que receberam um agonista tipicamente exibem umataxa aumentada de sobrevivência sobre amostras que recebem umanticorpo de controle, e isto permite a determinação da presença de umagonista. Ver, p. ex., Buchman et al (1993) Development 118(3):989-1001.

Agonistas de trkB podem ser identificados por sua capacidadede ativar a sinalização fluxo abaixo em uma variedade de tipos celulares queexpressam trkB, tanto naturalmente ou depois da transfecção de trkB quecodifica DNA. Esta trkB pode ser humana ou trkB de outro mamífero (talcomo um roedor ou primata). A cascata de sinalização fluxo abaixo pode serdetectada por mudanças para uma variedade de parâmetros bioquímicos oufisiológicos da célula que expressa trkB, tal como o nível de expressão deproteína ou da fosforilação de proteínas ou mudanças no estado metabólicoou de crescimento da célula (incluindo sobrevivência neuronal e/oudesenvolvimento de neurito, conforme descrito aqui). Métodos de detecçãodos parâmetros bioquímicos ou fisiológicos relevantes são conhecidos natécnica.

V. Kits

A invenção também fornece kits para uso nos presentesmétodos. Kits de uma invenção incluem um ou mais recipientes quecompreendem um agonista de trkB purificado (por exemplo, um NT-4/5 ouBDNF, que ocorrem naturalmente, e um anticorpo de agonista de anti-trkB) einstruções para uso de acordo com quaisquer dos métodos da invençãodescrita aqui. Geralmente essas instruções compreendem a descrição daadministração do agonista de trkB para tratar uma doença, tal comocaquexia, anorexia nervosa, e êmese induzida por opióide, de acordo comquaisquer dos métodos descritos aqui. O kit ainda pode compreender adescrição da seleção de um indivíduo apropriado para tratamento basedo naidentificação de se aquele indivíduo tem a doença e o estágio da doença.

As instruções relativas ao uso do agonista de trkB geralmenteincluem informação sobre dosagem, horário de dosagem, e via deadministração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem serunidades de dose, pacotes de bojo (por exemplo, pacotes de múltiplasdoses) ou sub-unidades de doses. Instruções fornecidas nos kits dainvenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou inserções nopacote (p.ex., uma folha de papel incluída no kit), mas instruções lidas pormáquina (por exemplo, instruções carregadas em um disco magnético ou dearmazenamento ótico) também são aceitáveis.

As inserções da etiqueta ou do pacote indicam que acomposição é usada para tratar uma doença descrita aqui (tal comocaquexia, anorexia nervosa, e êmese induzida por opióide). Instruçõespodem ser fornecidas para a prática de quaisquer dos métodos descritosaqui.

Os kits desta invenção estão em pacotes apropriados. Pacotesapropriados incluem, mas não estão limitados a, frascos, garrafas, jarras,pacotes flexíveis (p. ex., Mylar lacrado ou bolsas plásticas), e semelhantes.Também são contemplados pacotes para uso em combinação com umdispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administraçãonasal (ρ. ex., um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como umaminibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, orecipiente pode ser urna bolsa de solução endovenosa ou um frascocontendo contentor (stopper) penetrável por uma agulha de injeçãohipodérmica). Pelo menos um ingrediente ativo em uma composição é umagonista de trkB. O recipiente ainda pode compreender um segundo agentefarmaceuticamente ativo.

Kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais, taiscomo soluções tampão e informação interpretativa. Normalmente o kitcompreende urri recipiente e um rótulo ou inserção(ões) no pacote, ouassociadas ao recipiente.

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar, mas nãopara limitar a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Infusão diária de NT-4/5 resultou em ganho de peso corporal ehiperfaaia em babuínos obesos

Três babuínos obesos fêmas (faixa de peso corporal 20-30 kg)receberam infusão intravenosa (IV) de NT-4/5 humano de 2 mg/kg uma vezpor dia do dia 1 ao dia 24. Três babuínos obesos fêmas adicionais (faixa depeso corporal 20-30 kg) receberam infusão de veículo IV (PBS) uma vez pordia do dia 1 ao dia 24. A ingestão de alimento foi medida diariamentedurante os primeiros 45 dias. Os animais foram pesados uma vez porsemana durante os primeiros 53 dias e então foram acompanhados nos dias81 e 109 respectivamente.

A figura 1 mostra o efeito de infusão diária de NT-4/5 no pesocorporal de babuínos obesos. Conforme mostrado na figura 1, o pesocorporal· do grupo tratado com NT-4/5 foi significativamente aumentado secomparado com o grupo tratado com veículo;e o peso corporal do grupotratado com NT-4/5 retornou ao nível do peso do grupo tratado com veículono dia 81. Os dados indicaram que a infusão diária com NT-4/5 resultou emganho de peso corporal prolongado porém reversível em babuínos obesos.

A figura 2 mostra o efeito de infusão diária de NT-4/5 naingestão de alimento de babuínos obesos. Conforme mostrado na figura 2, aingestão de alimentos do grupo tratado com NT-4/5 foi significativamenteaumentado se comparado com o grupo tratado com veículo; e a ingestão dealimento do grupo tratado com NT-4/5 retornou ao nível do grupo tratadocom veículo no dia 33. Os dados indicaram que a infusão diária de NT-4/5resultou em hiperfagia reversível em babuínos obesos.Exemplo 2: Infusão duas vezes por semana de NT-4/5 resultou em ganho depeso corporal porém nenhuma hiperfagia em babuínos obesos

Três babuínos obesos fêmeas (faixa de peso corporal 20-30 kg)receberam infusão intravenosa (IV) de NT-4/5 humano de 2 mg/kg duasvezes por semana desde o dia 1 ao dia 39. Três babuínos obesos fêmeasadicionais (faixa de peso corporal 20-30 kg) receberam infusão intravenosa(IV) de veículo (PBS) infusão duas vezes por semana desde o dia 1 ao dia39. A ingestão de alimentos foi medida diariamente durante os primeiros 55dias. Os animais foram pesados semanalmente durante os primeiros 66 diase depois acompanhados no dia 94 e dia 122 respectivamente.

A figura 3 mostra o efeito de infusão duas vezes por semana deNT-4/5 no peso corporal em babuínos obesos. Conforme mostrado na figura3, o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5 foi significativamenteaumentado se comparado com o grupo tratado com veículo; e o peso1 corporal do grupo tratado com NT-4/5 retornou ao nível do grupo tratadocom veículo no dia 94. Os dados indicaram que a infusão duas vezes porsemana de NT-4/5 resultou em ganho de peso corporal reversível embabuínos obesos.

A figura 4 mostra o efeito de infusão duas vezes por semana deNT-4/5 na ingestão de alimentos em babuínos obesos. Conforme mostradona figura 4, a infusão duas vezes por semana de NT-4/5 não modificasignificativamente a ingestão de alimentos em babuínos obesos por analisaANOVA dupla. A análise de dados pós-teste de Bonferroni não mostroudiferenças significativas em pares entre o grupo tratado com NT-4/5(triângulos sólidos) com o grupo de controle tratado com veículo (quadradosabertos).Exemplo 3: Infusão diária de NT-4/5 resultou em ganho de peso corporal ehiperfaaia em macacos cinomolaus magros

Três macacos fêmeas cinomolgus magros (faixas ds pesocorporal 3-5 kg) receberam infusão intravenosa (IV) de NT-4/5 humano de 2mg/kg diariamente a partir do dia 1 ao dia 31. Três cinomolgus magros(faixas de peso corporal 3-5 kg) receberam infusão intravenosa (IV) de NT-4/5 peguilado (NT4-G1S peguilado) de 0,6 mg/kg uma vez por semana dodia 1 ao dia 31. NT-4/5 peguilado foi gerado por introdução de uma mutaçãona posição de glicína 1 da seqüência madura de NT-4/5 humano de serina eligação de um PEG ao primeiro amino ácido serina conforme descrito noExemplo 7 do Ped. de Pat U.S. N0 2005/0209148 e PCT WO 2005/082401.Três macacos fêmeas cinomolgus magros adicionais (faixas de pesocorporal 3-5 kg) receberam infusão intravenosa (IV) de veículo (PBS) umavez por dia a partir do dia 1 ao dia 31. A ingestão de alimentos foi medidadiariamente durante os primeiros 50 dias. Os animais foram pesados umavez por semana até o dia 50.

A figura 5 mostra o efeito de infusão diária de NT-4/5 no pesocorporal de macacos cinomolgus fêmeas magros. Conforme mostrado nafigura 5, o peso corporal do grupo tratado diariamente com NT-4/5, mas nãoo grupo tratado semanalmente com NT-4/5 peguilado, foi significativamenteaumentado se comparado com o grupo tratado com veículo. O peso corporaldo grupo tratado com NT-4/5 não tinha ainda totalmente retornado ao níveldo grupo de veículo. Os dados mostraram que a infusão diária de NT-4/5resultou em um ganho de peso corporal em macacos cinomolgus magros.

A figura 6 mostra o efeito da infusão diária de NT-4/5 naingestão de alimento em macacos cinomolgus magros. Conforme mostradona figura 6, a ingestão de alimentos no grupo tratado diariamente com NT-4/5, mas não o grupo tratado semanalmente com peguilado NT-4/5peguilado foi significativamente aumentada se comparado com o grupotratado com veículo; e a ingestão de alimento no grupo tratado com NT-4/5retornou ao nível do grupo tratado com veículo no dia 38. Os dadosindicaram que a infusão diária de NT-4/5 resultou em uma hiperfagiareversível em macacos cinomolgus magros.

Os efeitos de NT-4/5 e NT-4/5 peguilado no peso corporal foramtambém testados por administração subcutânea. Três macacos fêmeascinomolgus magros (faixa de peso corporal 3-5 kg) receberam injeçãosubcutânea (SC) de NT-4/5 humano de 2 mg/kg diáriamente de dia 1 ao dia21. Três macacos fêmeas cinomolgus magros (faixa de peso corporal 3-5kg) receberam injeção subcutânea (SC) de NT-4/5 peguilado de 1 mg/kguma vez por dia do dia 1 ao dia 21. Três macacos fêmeas cinomolgusmagros adicionais (faixa de peso corporal 3-5 kg) receberam injeçãosubcutânea (SC) de veículo (PBS) uma vez por dia do dia 1 ao dia 21. Osanimais foram pesados uma vez por semana até o dia 21.

A figura 7 mostra o efeito de injeção diária SC de NT-4/5 e NT-4/5 peguilado no peso corporal de macacos fêmeas cinomolgus magros.Conforme mostrado na figura 7, o peso corporal do grupo tratado com NT-4/5 foi significativamente aumentado se comparado com o grupo tratado comveículo. Além disso, o peso corportal do grupo tratado com NT-4/5 peguiladofoi também significativamente aumentado se comparado com o grupotratado com veículo.

Exemplo 4: Injeção diária subcutânea de NT-4/5 nao mostrou nenhum efeitosignificativo no peso corporal e ingestão de alimentos em coelhos NZW

Cinco coelhos da Nova Zelândia Brancos (NZW) machos e cincofêmeas (faixas de peso corporal 3-4 kg) receberam injeção subcutânea (SC)de NT-4/5 humano de 2 mg/kg diariamente do dia 1 ao dia 15. Cinco coelhosda Nova Zelândia Brancos (NZW) machos e cinco fêmeas adicionais (faixasde peso corporal 3-5 kg) receberam injeção subcutânea (SC) de veículo(PBS) uma vez por dia do dia 1 ao dia 15. A ingestão de alimentos foimedida diariamentedurante os primeiros 15 dias. Os animais foram pesadosuma vez por semana até o dia 15.

Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observadaentre o grupo tratado com NT-4/5 e o grupo tratado com veículo quanto apeso corporal e a ingestão de alimentos. As comparações foram efetuadasentre coelhos macho tratados com NT-4/5 e coelhos macho tratyados comveículo,e entre os coelhos fêmea tratados com NT-4/5 e os coelhos fêmeatratados com veículo.

Exemplo 5: injeção simples de NT-4/5 não provocou vômito mas podereduzir vômito induzido por morfina em furões

O efeito de NT-4/5 na êmese foi estudado em furões fêmeaadultos com peso corporal na faixa de 1 kg (Marshall Farm, CT). Um agenteemético (0,05 mg/kg de morfina 6-glucuronida, M6G) foi dadasubcutaneamente como controle positivo para estabelecer a linha de baseantes da administração de NT-4/5. Uma dose crescente de NT-4/5 (0,1, 1,ou 10 mg/kg) foi injetada subcutaneamente a 6 furões (para cada dosagem)somente para testar se NT-4/5 poderia causar algum efeito adverso, talcomo ânsia de vômito ou vômito. Além disso, duas doses, 1 mg/kg e 10mg/kg, de NT-4/5 foram dadas 10 minutos antes de M6G para testar se NT-4/5 poderia suprimir a êmese induzida por M6G. Os animais foramretornados para a gaiola casa e observados quanto a latência, o número deânsias e de vômitos por um período de 60 minutos após injeção.

Conforme mostrado na figura 8, a injeção simples de 0,1, 1 ou10 mg/kg de NT-4/5 apenas não provocou vômitos nos furões, enquanto quea simplkes injeção SC de 0,05 mg/kg de M6G efetivamente induziu a êmese.Ambos 1 mg/kg e 10 mg/kg de NT-4/5 significativamente reduziram o vômitoinduzido por M6G em furões.

Para testar o sítio de ativação de trkB que poderia serresponsável pelo efeito anti-êmese da injeção SC de NT-4/5 nos furões, aativação de c-Fos do trkB no tronco cerebral dos furões foi testada. Umadose única de 10 mg/kg de NT-4/5 foi injetada subcutaneamente, seguidopor injeção intravenosa de 10 mg/kg de cisplatin 5 minutos depois, paracinco furões fêmeas. Uma dose única de injeção de veículo, seguido porcisplatin 5 minutos depois, foi dada a quatro furões fêmeas adicionais comoum controle negativo. Os animais foram sacrificados 1 hora mais tarde compentobarbital de sódio (65 mg/kg ip), fixados por perfusão intracardial com 1L/kg de PBS seguido por 1 L/kg de 4% paraformaldeído, pH7,3. Cortes dotronco cerebral foram cortados a 30 um e seções flutuantes foram incubadasem soro de burro normal 10% (NDS) diluído em 0,1% Triton X-100 (em PBS)durante 1 hora seguido pela incubação em carneiros anti-Fos (1: 1,000, OA-11-824, Genosys Biotechnologies, Carnbridge, UK) em PBS com 0,1% TritonX-100 e 10% NDS por 48 horas a 4°C. Cortes foram lavados em PBS eentão incubados em solução de anticorpo biotinilado anti-carneiro IgGsecundário por 60 minutos à temperature ambiente. Manchas foramreveladas pelo uso de técnica complexa de avidina biotina (Vectastain Eliteavidinbiotin complex (ABC) Kit, Vector). Em resumo, cortes foram incubadosem reagent ABC por 60 minutos à temperature ambiente e então em umasolução contendo 3,3-diaminobenzidina (0,5 mg/ml) por 30-60 segundos.Cortes de tronco cerebral foram então montadas em lâminas para secar por24 horas, desidratar por 4 minutos cada em etanol 50%, 70%, 95%, e 100%,e então clarear em xileno, depois do que eles foram montados e vistos. Oslimites dos núcleos e subnúcleos do núcleo tractus solitarius (NTS) foramavaliados em seções adjacentes manchadas com cresil violeta. O número denúcleos neuronais c-Fos imunoreativos foi determinado bilateralmente para aárea postrema, núcleo doral vagai (DMNX), e todos os subnúcleos do NTSem três níveis ao longo da extensão rostrocaudal do complexo dorsal vagai(DVC), 0,5-1,0 mm rostral e 0,5 mm caudal a obex, e no obex. Três cortespor nível por animal foram contados e tirou-se a média. Os dados foramcomparados empregando ANOVA com pós-teste de Tukey (Prism;GraphPadSoftware, San Diego, CA). Tratamento com NT-4/5 aumentoudramaticamente o número de núcleos c-Fos positivos na área do postremacomparado com os animais injetados com veículo (figura 9A, P=0,0009,teste t de Student). Em contraste, o tratamento com NT-4/5 diminuiusignificativamente o número de núcleos c-Fos positivos no núcleo dorsalvagai se comparado com os animais injetados com veículo (figura 9B,P=0,0047, teste t de Student). Por outro lado, o tratamento com NT-4/5 nãoalterou significativamente o número de núcleos c-Fos positivos em outrosnúcleos do tronco cerebral, incluindo os subnúcleos múltiplos do NTS assimcomo os núcleos paraventriculares do hipotálamo.

A área do postrema, diferentemente da maior parte das outrasareas do cérebro, se situa for a da barreira de sangue cerebral e tem acessototal a macromoléculas em circulação (para um exemplo recente, ver Yang eFerguson, 2003, Regul. Pept. 112(1-3):9-17). A indução de c-Fos é umevento prematuro imediato conhecido de ativação de trkB por seus Iigandostais como BDNF e NT-4/5 (Ip et al. 1993, J. Neurosci. 13(8):3394-405 eMarsh et al. 1993, J. Neurosci. 13(10): 4281-92).

Esses dados em conjunto sugerem que a área do postremaconstitui, pelo menos em parte, um alvo "perifericamente acessível" bonafide de NT-4/5 sistemicamente administrado ou outros agonistas de trkB. Aredução de expressão c-Fos no núcleo dorsal vagai (figura 9B) pode refletira atenuação parcial do circuito de vômito por pré-tratamento com Nt-4/5.Exemplo 6: Geração e varredura de anticorpos de acionista de trkB

Imunização para geração de anticorpos monoclonais anti-Agonistas de trkB: Um camundongo Balb/C único foi injetado 5 vezes emhorários regulares com 8 ug de TrkB humano domínio extracelular comoantígeno. O seu domínio extracelular humano TrkB rotulado (resíduos 31-430) foi expresso usando um vetor pTriEx-2 Hygro (Novagen, Madison Wl)em 293 células. Domínio extracelular TrkB foi purificado usando resina Ni-NTA conforme instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Para asprimeiras quatro injeções, o antígeno foi preparado por misturação de TrkBhumano com sistema adjuvante RIBI e alum. Oito ug total de antígeno foramdados via injeção na nuca do pescoço, as plantas dos pés e IP,aproximadamente a cada 3 dias ao longo de 11 dias. No dia 13, ocamundongo foi sacrificado e o baço foi removido. Linfócitos foram fundidoscom 8653 células para formar clones de hibridoma. Clones foram deixadoscrescer e então selecionados como positivos anti-TrkB por varredura ELISAcom ambos ELISA de TrkB humano e de camundongo.

Varredura ELISA de anticorpos anti-trkB: Sobrenadantes declones de hibridoma em crescimento sofreram varredura quanto a suacapacidade de ligar ambos TrkB humano e de rato. Os testes foramexecutados com places de 96-poços revestidos durante a noite com 100 ulde 0,5 ug/ml de proteína de fusão TrkB-Fc de rato ou humana. Reagentesem excesso foram lavados dos poços entre cada etapa com PBS contendo0,05% Tween-20. Placas foram então bloqueadas com fosfato tamponadosalino (PBS) contendo 0,5% BSA. Sobrenadante foi adicionado às piaces eincubado à temperatura ambiente por 2 horas. Peroxidase de raiz forte(HRP) conjugado com cabra-anti camundongo Fc foi adicionado para ligar osanticorpos de camundongo ligados a TrkB. Tetrametil benzidina foi entãoadicionada como substrato para HRP para detectar a quantidadedeanticorpo de camundongo presente no sobrenadante. A reação foiinterrompida e a quantidade relativa de anticorpo foi quantificada pela leiturada absorbância a 450 nm. Cinqüenta anticorpos se mostraram positivos noteste ELISA. Dentre esses anticorpos, cinco foram ainda mais testados emostraram atividade agonista. Ver tabela 2 abaixo.

Teste KIRA: Este teste foi empregado para fazer a varredura deanticorpos com identificação positiva em ELISA quanto à capacidade deinduzir a ativação de receptor tirosina quinase para TrkB humano. Sadick et.al. (1997) Experimental Cell Research 234(2):354-61. Utilizando uma linhacelular estável transfectada com TrkB humano gD rotulado, anticorposmurinos purificados dos clones de hibridoma foram testados quanto a suacapacidade para ativar o receptor na superfície de células similar à ativaçãoobservada com os Iigandos naturais, BDNF e NT-4/5. Ligandos naturaisinduziram auto fosforilação no domínio quinase do receptor TrkB. Depoisque todas as células foram expostas a várias concentrações de anticorpos,elas foram Iisadas e uma ELISA foi executada para detectar fosforilação doreceptor TrkB. EC50 (mostrado na tabela 2 abaixo e na figura 10) foideterminado para cada agonista de trkB putativo e foi comparado ao doligando NT-4/5 natural.

Teste de sobrevivência de neurônios nodosos E15: Os gângliosde neurônios nodosos obtidos de embriões E15 foram suportados por BDNF,de forma que a concentrações de saturação do fator neurotrófico asobrevivência foi perto de 100% em 48 horas em cultura. Na ausência deBDNF, menos do que 5% dos neurônios sobreviveram em 48 horas.Portanto, a sobrevivência de neurônios E15 nodoso é um teste sensível paraavaliar a atividade agonista de anticorpos anti-TrkB, i.e. anticorpos agonistaspromoverão a sobrevivência de neurônios E15 nodoso.

Camundongos Swiss Webster fêmeas grávidas cornpatíveis-Tempo foram sacrificadas por inalação de CO2. Os cornos uterinos foramremovidos e os embriõesforam extraídos no estágio embriônico E15. Osgânglios nodoso foram dissecados e então tripsinizados, mecanicamentedissociados e colocados em places a uma densidade de 200-300 células porpoço em meio livre de soro definido, em placas de 96 cavidades revestidascom poli-L-ornitina e lamínina. A atividade agonista de anticorpos anti-TrkBfoi avaliada em maneira de resposta de dose triplamente com referência aoBDNF humano. Após 48 horas em cultura as células foram submetidas a umprotocolo automatizado de imunocitoquímica executado em uma estação detrabalho de manipulação de líquido Biomek FX (Beckman Coulter). Oprotocolo incluiu a fixação (4% formaldeído, 5% sucrose, PBS),permeabilização (0,3% Triton X-100 em PBS), bloqueio de locais de ligaçãoinespecíficos (5% soro cabra normal, 0,1% BSA, PBS) e incubaçãoseqüencial com um anticorpo primário e secundário para detectar neurônios.Um anticorpo policlonal de Coelho contra o produto de gen de proteína 9.5(PGP9.5, Chemicon), que foi um marcador neuronal fenotípico estabelecido,foi usado como anticorpo primário. Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho(Molecular Probes) foi usado como reagente secundário juntamente com atintura nuclear Hoechst 33342 (Molecular Probes) para rotular os núcleos detodas as células presentes na cultura. Aquisição e análise de imagem foramexecutadas em um Discovery-1/Genll Imager (Universal ImagingCorporation). Imagens foram automaticamente adquiridas em doiscomprimentos de onda para Alexa Fluor 488 and Hoechst 33342, com amancha nuclear sendo usada como ponto de referência, visto que estápresente em todas as cavidades, para o sistema auto focus baseado emimagem do Imager. Objetivas apropriadas e numerous de locais comimagem feita por cavidade foram selecionados para cobrir a superfície todade cada cavidade. Análise de imagem automatizada foi ajustada para contaro número de neurônios presentes em cada cavidade após 48 horas emcultura baseado em sua mancha específica com o anticorpo anti-PGP9.5. Adelimitação cuidadosa da imagem e a aplicação de filtros de sensibilidadebaseados em morfoíogia e intensidade de fluorescência resultou em umacontagem acurada de neurônios por cavidade. EC50s (mostrado na tabela 2abaixo e figura 11) foram determinados para cada anticorpo de agonista detrkB putativo e foram comparados com aqueles dos Iigandos naturais.

A tabela 2 abaixo mostra os cinco anticorpos anti-trkBidentificados e suas atividades na sobrevivência de neurônios decamundongo e atividade de fosforilação em trkB humano.

<table>table see original document page 94</column></row><table>

Injeções intracranianas de anticorpos agonistas de anti-trkB emcamundongos: Camundongos reprodutores aposentados machos C57B6(idade 8-12 meses) foram obtidos de Charles River Laboratories (Hollisterfacility) e deixados aclimatar em um ambiente com temperatura/humidadecontrolados, com um ciclo de 12 horas luz/escuridão, com acesso ad Iibituma comida e água por pelo menos 5 dias antes da injeção. Cada camundongofoi anestesiado com isoflurano, para cortar uma seção de cabelo acima docrânio. O camundongo foi fixado a um instrumento estereotáxico de cirurgia(Kopf model 900), foi anestesiado, e mantido aquecido com uma manta deaquecimento elétrico ajustada a médio. Betadina foi esfregada na porçãobarbeada do crânio para esterilizar a região. Uma pequena incisão medianalongitudinal de aproximadamente 1 cm de comprimento foi feita acima docrânio começando justamente atrás das orelhas em direção dos olhos. Ocrânio foi revelado, e um espaço circular de aproximadamente 1 cm dediâmetro da superfície do crânio foi limpa com um cotonete para removerqualquer tecido conectivo. A superfície foi limpa com um cotonetemergulhado em peróxido de hidrogênio 30%, para revelar a bregrna. Usandoa ponta da broca como um testador para medir a profundidade do crânio, ocrânio foi ajustado horizontalmente e verticalmente para garantir que eleestava nivelado antes da furação. Desvios de profundidade (zerados nabregma), de 0,5 mm em média comparado com 0,5 mm lateral, assim como0,5 mm anterior comparado com 0,5 mm posterior, foi minimizado para umadiferença dentro de ±0,05 mm. De acordo com o atlas do cérebro decamundongo (Franklin, Κ. B. J. & Paxinos, G., The Mouse Brain inStereotaxic Coordinates. Academic Press, San Diego, 1997), coordenadaspara uma injeção única, lateral, intrahipotalâmica foram conforme o seguinte:1,30 mm posterior do Bregma; -0,5 mm da linha mediana; Profundidade,5,70 mm da superfície do crânio (na bregma). Um pequeno orifício foi furadoatravés do crânio, evitando contacto com o cérebro. A broca foi substituídapor uma agulha biselada 26 gauge conectada a uma seringa Hamilton(modelo 84851) e retornada para as mesmas coordenadas. 2 ul decomposto foram injetados no hipotálamo lateral incrementalmente ao longode 2 minutos. A agulha foi mantida nessa posição por 30 segundos após ainjeção, e então foi levantada 1 mm. Após outros 30 segundos, a agulha foilevantada 1 mm. 30 segundos mais tarde, a agulha foi removidacompletamente. A incisão foi então fechada e mantida fechada com clipesde ferida de 2-9 mm (Autoclip, Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA). Asinjeções foram executadas no dia 0. O peso corporal e a ingestão dealimento foram monitorados diariamente até o dia 15.

Conforme mostrado na figure 12A e figure 12B, injeçõesintracranianas de anticorpo 18H6 e 36D1 nas doses especificadas reduziusignificativamente o peso corporal e a ingestão de alimento emcamundongos. O anticorpo IgG de controle e 23B8, dados na doseespecificada, não afetaram significativamente tanto a ingestão de alimentoquanto o peso corporal. ANOVA dupla com pós-testes de Bonferroni foiempregada para análise estatística. Isso indica que anticorpos de agonistasde anti-trkB têm um efeito no peso corporal e na ingestão de alimentoqualitativamente similar ao do NT-4/5, um agonista natural de trkB, quandoinjetado diretamente no CNS.

Exemplo 7: Injeção periférica de anticorpo de aaonista de trkB resultou emingestão de alimento e peso corporal aumentados em macacos

Macacos cinomolgus adultos magros, fêmeas (pesando 3-5 kgna linha de base) receberam injeções intravenosas de anticorpos deagonista monoclonal de camundongo 38B8 e os outros três animaisreceberam veículo duas vezes por semana. O consumo de alimento foimonitorado diariamente e o peso corporal foi monitorado semanalmente. Asanálises estatísticas foram executadas usando um PRISM (GraphPadSoftware Inc., San Diego, CA). Todos os dados e gráficos foram expressosem média ± desvio padrão da média (SEM). Os dados foram analisatos porANOVA dupla com pós-testes de Dunnet (*P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001).

Os macacos que foram tratados duas vezes por semana cominjeções de 5 mg/kg do anticorpo de agonista de trkB 38B8 exibiramaumento de 40% na ingestão cumulativa de alimento (figura 13A) e 10% deaumento em peso corporal (figura 13B) dentro de duas semanas, indicandoque a ativação específica do receptor de trkB tirosina quinase provocaingestão de alimento aumentado, ingestão calórica aumentada e pesocorporal aumentado.

Acredita-se que os exemplos e modos de realização descritoaaqui são para propósitos apenas ilustrativos e que várias modificações oumudanças à luz deles serão sugeridas a especialistas na técnica e devemser incluídas no espírito e extensão deste pedido de patente.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Pfizer inc.

Lin, Chia-YangRosenthal, ArnonStratton, jennifer κ.

<120> MÉTODO PARA TRATAR PERDA INDESEJADA DE PESO OU DISTÚRBIOS

DE ALIMENTAÇÃO POR ADMINISTRAÇÃO DE UM AGONISTA DE TRKB

<130> PC19516A

<150> US 60/765,410<151> 2006-02-02

<160> 2

<170> Patentln version 3.4

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly vai Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala vai1 5 10 15

Cys Asp Ala vai Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala vai Asp20 25 30

Leu Arg Gly Arg Glu vai Glu vai Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly35 40 45

Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp50 55 60

Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly65 70 75 80

vai Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr85 90 95

vai Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg vai Gly Trp Arg Trp100 105 HO

Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly115 120 125

Arg Ala130

<210> 2

<211> 394

<212> DNA

<213> Horao sapiensggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60

agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120

ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180

tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240

gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300

accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360

tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc tgag 394

Claims (33)

1. Método para tratamento de caquexia em um primata,compreendendo a administração periférica de uma quantidade efetiva deNT-4/5.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primata éum ser humano.

3. Método para tratamento de anorexia nervosa em um primata,compreendendo a administração periférica de uma quantidade efetiva deNT-4/5.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, onde o primata éum ser humano.

5. Método para tratamento de êmese induzida por opioide emum mamífero, compreendendo a administração periférica de uma quantidadeefetiva de NT-4/5.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, onde o primata éum ser humano.

7. Método para tratamento de caquexia em um primata,compreendendo a administração periférica de uma quantidade eficaz de umagonista de trkB.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, onde o primata éum ser humano.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, onde oagonista de trkB é um anticorpo agonista de anti-trkB.

10. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 7-9,onde o agonista é trkB seletivo.

11. Método para tratamento de anorexia nervosa em umprimata, compreendendo a administração periférica de uma quantidadeeficaz de um agonista de trkB.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, onde o primata éum ser humano.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, onde oagonista de trkB é um anticorpo agonista de anti-trkB.

14. Método de quaisquer das reivindicações 11-13, onde oagonista é trkB seletivo.

15. Método para tratamento de êrnese induzida por opioide emum mamífero, compreendendo a administração periférica de uma quantidadeeficaz de um agonista de trkB.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, onde o primata éum ser humano.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, onde oagonista de trkB é um anticorpo agonista de anti-trkB.

18. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 15-17,onde o agonista é trkB seletivo.

19. Emprego de NT-4/5 ou de um seu sal farmaceuticamenteaceitável na preparação de um medicamento para administração periféricapara tratamento de caquexia, anorexia nervosa, perda de peso indesejada,ou êrnese induzida por opióide.

20. Emprego de um agonista de trkB ou de um seu salfarmaceuticamente aceitável na preparação de um medicamento paraadministração periférica para tratamento de caquexia, anorexia nervosa,perda de peso indesejada, ou êmese induzida por opióide.

21. Emprego de acordo com a reivindicação 20, onde o agonistade trkB é seletivo a trkB.

22. Emprego de acordo com a reivindicação 20 or 21, onde oagonista de trkB é um anticorpo agonista de anti-trkB.

23. Método para tratamento de perda de peso indesejada emum primata, compreendendo a administração periférica de uma quantidadeefetiva de NT-4/5.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, onde o primata éum ser humano.

25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, onde aperda de peso indesejada está associada a envelhecimento.

26. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 2, 24ou 25, onde o ser humano tem um índice de massa corporal menor do queaproximadamente 25,0 kg/m2, 24,0 kg/m2, 23,0 kg/m2, 22,0 kg/m2, 21,0kg/m2, 20 kg/m2, 19,0 kg/m2, e 18,5 kg/m2.

27. Método para tratamento de perda de peso indesejada emum primata, compreendendo a administração periférica de uma quantidadeeficaz de um agonista de trkB.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, onde o primata éum ser humano.

29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, onde oagonista de trkB é um anticorpo agonista de anti-trkB.

30. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 27-29,onde o agonista de trkB é seletivo a trkB.

31. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 8-10 ou-28-30, onde o ser humano tem um índice de massa corporal menor do queaproximadamente 25,0 kg/m2, 24,0 kg/m2, 23,0 kg/m2, 22,0 kg/m2, 21,0kg/m2, 20 kg/m2,19,0 kg/m2, e 18,5 kg/m2.

32. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 27-31,onde a perda de peso indesejada está associada com envelhecimento.

33. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 4 ou-12-14, onde o ser humano tem um índice de massa corporal menor do queaproximadamente 18,5 kg/m2, 17,5 kg/m2, ou 16,5 kg/m2.