TW200808352A - Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a TRKB agonist - Google Patents

Description

200808352 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於trkB激動劑在、/台療及/或預防不欲之減重、 飲食異常或類鴉片誘發之α區吐中的用途。 【先前技術】 神經營養素為小型同源二聚體蛋白質家族’其在神經系 統發育及維持中起至關重要之作用。神經營養素家族之成 員包括神經生長因子（NGF)、腦源性神經營養因子 (BDNF)、神經營養素-3(NT-3)、神經營養素-4/5(NT-4/5)、 神經營養素-6(NT-6)及神經營養素_7(NT_7) °神經營養素 類似於其他多肽生長因子經由與細胞表面受體相互作用來 影響其目標細胞。根據現有知識，兩種跨膜糖蛋白充當神 經營養素之受體。神經營養素反應性神經元通常具有低分 子量（6 5-80 kDa)、低親和力受體（LNGFR)(亦稱作p75NTR 或 p75)，其結合具有 2xl(T9 Μ 之 KD 的 NGF、BDNF、NT-3 及NT-4/5 ;及大分子量（130-150 kDa)、高親和力（KD在1(TU Μ範圍内）受體，其為受體酪胺酸激酶之trk家族之成員。 Trk受體家族之經鑑別之成員為trkA、trkB及trkC。 BDNF與NT-4/5結合具有類似親和力之trkB及p75NTR受 體。然而，NT-4/5及BDNF突變小鼠顯示完全相反之表 型。BDNF+小鼠由於若干神經元缺陷及行為症狀而在出 生後早期死亡，而NT-4/5_/_小鼠由於僅有輕微感覺缺陷而 可存活及繁殖。Fan 等人，Nat. Neurosci. 3(4):350-7, 2000 ; Liu等人Nature 375:238-241，1995 ; Conover等人， 118462.doc 200808352

Nature 375:235-238，1995 ; Emfors 等人Nature 368:147-150，1994 ; Jones等人Cell 76:989-999，1994。若干公開案 報導NT-4/5及BDNF具有截然不同之活體内生物活性且提 出該等截然不同之活性部分可由NT-4/5及BDNF對trkB受體 及其下游信號轉導路徑之不同活化作用造成。Fan等人， Nat. Neurosci· 3(4):350-7, 2000 ; Minichiello 等人，

Neuron. 21:335-45，1998; Wirth 等人，Development. 130(23):5827-38，2003 ; Lopez 等人，Program 第 38·6 號， 2003 Abstract，Society for Neuroscience ο 已顯示BDNF及NT-4/5在II型糖尿病模型動物（諸如 C57db/db小鼠)中具有ik糖及ik月旨控制活性及抗肥胖活 性。美國專利第 6,391，3 12 號；Itakura 等人，Metabolism 49:129-33 (2000);美國申請公開案第 2005/0209148 號； WO 2005/0 82401。亦已顯示BDNF在用高脂飲食餵養之小 鼠中具有抗肥胖活性及改善痩素抵抗性之活性。美國公開 案第 2003/0036512號。Kernie等人報導BDNF或NT_4/5可瞬 時逆轉其中BDFE基因表現減少之雜合BDNF剔除小鼠的飲 食行為及肥胖。Kemie等人，EMBO J· 19(6): 1290-300, 2000。已報導取代人類trkB之Y722C的重新誤義突變造成 受損受體磷酸化作用及信號轉導至MAP激酶；且此突變似 乎產生嗜食性肥胖之獨特人類症候群。Yeo等人，Nat· Neurosci. 7:1 187-1 189 (2004)。 已研究在患有肥胖之人群中及患有神經性厭食症之患者 中的 BDFE 之循環含量。Monteleone 等人，Psychosomatic 118462.doc 200808352

Medicine 66:744-748，2004 ; Nakazat0 等人，Bi〇1 Psychiatry 54:485_490, 2003。與基於小鼠中 bDNF產生之 受損已與食物攝入增加、能量消耗減少及增重相關之發現 的預測相反，如與非肥胖性健康對照相比，循環bdnf在 神經性厭食症患者中顯著減少且在肥胖性受檢者中顯著增 加。已假設在神經性厭食症中，藉由促進食物攝入使 BDNF減少而試圖均衡導致負平衡之患者之行為改變；且 在肥胖中，BDNF含量增加可表示藉由刺激能量消耗及減 少食物攝取抵消正能量失衡之條件的適應性機制。

Monteleone 專人，Psychosomatic Medicine 66:744-748, 2004。 本文中所引用之所有專利、專利申請案及公開案皆以引 用方式全部併入本文中。 【發明内容】 本發明提供藉由周邊投予trkB激動劑（包括trkB選擇性激 動劑）來增加體重及/或食物攝入之方法。此等方法可用於 治療或預防不欲之減重（諸如惡病質）、飲食異常（諸如神經 性厥食症)及類鸦片誘發之σ區吐。 在一恶樣中’本發明提供增加靈長類動物之體重之方 法’其包含向该靈長類動物周邊投予有效量之trkB激動 劑。 在另一態樣中’本發明提供增加靈長類動物之食物攝入 之方法’其包含向該靈長類動物周邊投予有效量之打⑸激 動劑。 118462.doc 200808352 在另一態樣中，本發明提供治療或預防靈長類動物之惡 病夤之方法，其包含向該靈長類動物周邊投予有效量之 trkB激動劑。 在 L樣中本發明提供改善靈長類動物之惡病質、 降低其發病率或延緩其發展或進程之方法，其包含向該靈 長類動物周邊投予有效量之trkB激動劑。 在另悲樣中，本發明提供治療或預防靈長類動物之神 U厭食症之方法’其包含向該靈長類動物周邊投予有效 量之trkB激動劑。

在另一態樣中，本發明提供改善靈長類動物之神經性厭 食症、降低其發病率或延緩其發展或進程之方法，其包含 向該靈長類動物周邊投予有效量之trkB激動劑。 S ‘二樣十，本發明&供治療或預防個體 發之口區吐的方法，其包含向該個體周邊投予有效量^1 社力1樣中，本發明提供改#個體之類Μ誘發 吐、降低其發病率或延緩其發展或進程之方法，复勺 該個體周邊投予有效量之刚激動劑。 …向 由係經周邊投與。舉例而言，激動劑可經 式令之-者來投予··靜脈内、腹臈内 皮下、非經腸、經吸入、動腑 ^ 皮。 動脈内、心臟内、心室内及經 在一些實施例中 中，個體為人類。 靈長類動物為人類 在一些實施例 118462.doc 200808352 可用於本文中所述之方法的trkB激動劑包括（但不限 於）：BDNF多肽、NT-4/5多肽及抗_trkB激動劑抗體。在一 些實施例中，trkB激動劑為人類NT-4/5。在一些實施例 中，trkB激動劑為人類BDNF。在其他實施例中，trkB激動 劑為抗- trkB激動劑抗體’包括對trkB有選擇性之抗- 激 動劑抗體。 在另一態樣中，本發明提供包含有效量之trkB激動劑（包 括trkB選擇性激動劑）及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組 合物。該等醫藥組合物可用於治療或預防本文中所述之疾 病中之任一者。 在另一態樣中，本發明提供用於本文中所述之方法中之 任一者中的包含trkB激動劑（包括trkB選擇性抗體）之套 組。在一些實施例中，t亥等套組包含：一容器、包含與醫 藥學上可接受之賦形劑組合的有效量之刚激動劑的組合 物，及在本文中所述之方法中之任—者中使用該組合物之 說明書。 在另-態樣中，本發明亦提供產生特異性結合及活化受 體之激動劑單株抗體之方法，其包含以下步驟：⑷用包含 受體之胞外域之免疫原性分子藉由在約15曰内至少兩次將 該，疫原性分子注射至哺乳動物十使宿主哺乳動物免疫。 5亥專方法可進一步包含以下步· ^ 力驟·使來自經免疫之哺乳動 物之淋巴樣細胞與永生化細胞 肥株融合以產生分泌單株抗體 之融合瘤，·在使單株抗體分泌 徐件下培養融合瘤，及選 擇y刀泌結合及活化受體之單株 机體的融合瘤。在一些實施 H8462.doc -10- 200808352 例中’該受體為對活化而言需二聚作用之受體。 【實施方式】 本發明提供治療或預防不欲之減重（諸如惡病質）、飲食 異常（諸如神經性厭食症）及類鴉片誘發之唱吐的方法，其 包含向個體投予trkB激動劑。 I. 一般技術 除非另外指出，否則本發明之實施將使用熟習此項技術 者已知之分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生 物學、生物化學及免疫學之習知技術。該等技術在以下文 獻中付到充分說明：諸如 Mo/ecw/ar C7cmmg.· d Manual，第 2 版（Sambrook，# 乂，1989) Cold Spring Harbor Press ; (m.JL Gait，編， 1984) Ϊ Methods in Molecular Biology, Humana Press / Cell d (J.E. Cellis，編，1998)

Academic Press ； Animal Cell Culture (R.I. Freshney 5 編， 1987) > Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather 及 P.E. Roberts，1998) Plenum Press ； Cell and Tissue Cw/are·· (A. Doyle，J.B· Griffiths及 D.G. Newell，編，1993-8) J· Wiley及 Sons ; MeMo心 ζ·π Enzymology (Academic Press， Inc.) ; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及 C.C Blackwell ’ 編）；Gwe Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller 及 Μ·Ρ· Calos，編，1987) ; iVoioco/s k (F.M· Ausubel ’ 等人’編 ’ 1987); 118462.doc -11 - 200808352 PCR: The Polymerase Chain Reaction，（Mulhs，等人， 編，1994) ·，Current Protocoh in Immunology (J.E· Coligan 專 k，漏 Y99Y) \ Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及 Sons. 1999) ; /mm關oZHo/og;; (C.A· Janeway及 P· Travers, 1997) ； Antibodies (P. Finch, 1997) i Antibodies: a practical approach (D. Catty.，編，IRL Press， 1988-1989) ； Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及 C· Dean，編，Oxford University Press，2000); Using antibodies: a laboratory manual (Έ, Uaic\Q別反 L· Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)5 The (M. Zanetti 及 J.D. Capra，編，Harwood

Academic Publishers，1995) 〇 II.定義 如本文中所使用，，，治療”為用於獲得有益或所要臨床結 果之方法。為達成本發明之目的，有益或所要臨床、结果包 括（但不限於）以下結果中之一或多種：與疾病相關之一 $ ^ ^ # 於 多種症狀的改善、嚴重程度減輕、緩解。舉例而§ 治療惡病質而言，有益或所要之臨床結果包栝（但不卩艮於） 以下症狀中之任意一或多種的任何改善、嚴重稃度減輕A/ 厭食 或緩解：減重、脂肪分解、肌肉及内臟蛋白損耗、 '兪勞反 (亦即食慾缺乏）、食物/能量攝入減少、慢性噁心、体 虛弱。對於治療神經性厭食症而言，有益或所要之… >游改 果包括（但不限於）以下結果中之任意一或多穆：艮〜 A及電 善、厭食程度減輕、增重、維持正常營養狀況、水口 118462.doc -12- 200808352 解平衡、維持年齡及身高所需之正常體重、減少住院頻率 及持續時間、及減少死亡風險。對於治療類鸦片誘發之嘔 吐而言，有益或所要之臨床結果包括（但不限於）：減輕噁 心及/或嘔吐之嚴重程度及/或縮短其持續時間，進而使達 到類鸦片誘發之疼痛減輕的充分臨床益處。 π改善’’疾病或該疾病之一或多種症狀意謂與未投予忧⑸ 激動劑相比與疾病相關之一或多種症狀得到減輕或改蓋。 π改善π亦包括縮短或減少症狀之持續時間。 疾病之’’發病率降低”意謂降低嚴重程度（其可包括減少對 (例如曝露於）一般用於此病狀之其他藥物及/或治療劑的需 要及/或減少其用量）、持續時間及/或頻率（包括（例如）延緩 或增加至個體之下一間歇性發作之時間）中之任一者。如 熟習此項技術者所瞭解，個體可根據其對治療之反應而改 變，且同樣地（例如）降低個體之疾病之發病率的方法反應 基於該投藥很可能使彼特定個體之發病率降低的合理預期 投予trkB激動劑。 如本文中所使用，”延緩"疾病發展意謂拖延、阻礙、減 緩、延遲、穩定及/或推遲疾錢程。此延緩以視待治 療之疾病及/或個體的病史而定的變化之時間長度。如熟 習此項技術者所顯而易見，充分或顯著延緩實際上可涵苗 個體並未發展上疾病(例如惡病質、神經性厭食症及類： 片誘發之嘔吐)的預防。”延缓"症狀發展之方法為當與未使 用該方法相比時使在特定時段中症狀發展之幾率降低及/ 或使在㈣時段巾症狀之程度降低的方法。該等比較通常 118462.doc -13 - 200808352 基於使用統計學上大量受檢者之臨床研究。 疾病的π發展’’或"進程”意謂病症之最初表現及/或確保該 病症之進程。疾病的發展可使用此項技術中所熟知之標準 臨床技術來偵測及評估。然而，發展亦涉及不可偵測之進 程。為達成本發明之目的，發展或進程係指症狀之生物學 過程舍展包括發生、復發及發作。如本文中所使用， 疾病之，，發作”或，，發生”包括初次發作及/或復發。 如本文中所使用，藥物、化合物或醫藥組合物之，，有效 劑里，或”有效量"為足以達到有益或所要結果之量。對於 預防性使用而言，有益或所要結果包括以下結果：諸如消 除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延緩疾病發 作忒疾病包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症 狀、其併發症及疾病發展期間所呈現之中間病理學表型。 :於…療使用而言’有益或所要結果包括臨床結果，諸如 降：疾病發作之強度、持續時間或頻率；及減少由該疾病 所以成之一或多種症狀（生物化學、組織學及/或行為症 狀）忒疾病包括其併發症及疾病發展期間所呈現之中間 ^予表型，增加罹患疾病之彼等患者的生命品質；減少 ;、、；、病所而之其他藥劑的劑量；增強其他藥劑之作用； 延緩患者之疾病進程。有效劑量可以一或多次投藥 物投予。為達成本發明之㈣，藥物、化合物或醫藥組： :有效劑量為足以直接或間接完成預防性或治療性治 夕：。如臨床情形中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物 效劑量可或不可與其他藥物、化合物或醫藥組合物聯 H8462.doc -14- 200808352 合來達成。因此，可認為”有效劑量"係在投予一或多種治 療劑的情形中，且可認為單一試劑係以當與一或多種其他 試劑聯合時可達成理想結果之有效量給出。 π個體或文檢者’’為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物 亦包括（但不限於）：家畜、變種動物（sport animal)、寵 物、靈長類動物（包括人類）、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。 ”trkB激動劑”係指能結合及活化trkB受體及/或由以⑸信 號轉導功能調節之下游路徑的試劑。舉例而言，該激動劑 可結合trkB受體之胞外域且進而使該受體二聚化，導致細 胞内催化激酶域活化。因此，此可刺激活體外及/或活體 内表現受體之細胞生長及/或分化。在一些實施例中，trkB 激動劑結合trkB且激活trkB之生物活性。 當與本發明之trkB激動劑聯合使用時，”生物活性，’ 一般 係‘具有結合及活化trkB受體及/或由trkB信號轉導功能調 節之下游路徑的能力。如本文中所使用，”生物活性”涵蓋 在trkB表現細胞上與由NT-4/5及/或BDNF(trkB之原生配位 子）之作用所誘導之彼等效應功能相同的效應功能。生物 活性不受限制地包括以下活性中之任意一或多者··結合及 活化trkB之能力；促進trkB受體二聚化之能力；促進細胞 (包括受損細胞）、尤其活體外或活體内神經元（包括周邊 (交感神經、感覺、運動及腸）神經元及中樞（腦及脊髓）神 經元）及非神經元細胞（例如周邊也白細胞、内皮細胞及血 管平滑肌細胞）發展、存活、發揮功能、維持及/或再生的 能力。尤其較佳之生物活性為當周邊投予時增加體重及/ 118462.doc -15- 200808352 或食物攝入以治療（包括預防）靈長類動物之惡病質及神經 性厭食症之一或多種症狀及/或治療（包括預防）哺乳動物之 類鴉片誘發之嘔吐之一或多種症狀的能力。 "激動劑抗-trkB抗體"（可互換地稱作，，抗_trkB激動劑抗體，，) 係指能結合及活化trkB受體及/或由trkB信號轉導功能調節 之下游路徑的抗體。舉例而言，激動劑抗體可結合trkB受 體之胞外域且進而使該受體二聚化，導致細胞内催化激酶 域活化。因此，此可刺激活體外及/或活體内表現受體之 細胞生長及/或分化。在一些實施例中，激動劑抗-trk]3抗 體結合trkB且激活trkB之生物活性。 如本文中所使用，”周邊投藥"或”周邊投予”係指在中樞 神經系統（CNS)或血腦障壁（BBB)外部將試劑引入受檢者 中。周邊投藥涵蓋除直接投予至脊柱或腦以外之任何投藥 途徑。周邊投藥可為局部或全身性的。 π抗體π為能經由位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少 一個抗原識別位點特異性結合目標（諸如碳水化合物、聚 核苷酸、脂質、多肽等）的免疫球蛋白分子。如本文中所 使用’该術浯不僅涵蓋完整多株或單株抗體，且亦涵蓋其 片段（諸如 Fab、Fab，、F(ab，）2、Fv)、單鏈（ScFv)、其突變 體、包含抗體部分（諸如域抗體）之融合蛋白質，及包含抗 原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態。 抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞 類），且該抗體無需為任何特定類別。視其重鏈之恆定域 之抗體胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白指定為不同類 118462.doc -16- 200808352 別。存在五個主要類別之免疫球蛋白：lgA、啡、邮、 IgG及IgM ’且此等類別中之幾者可進一步分成亞類(同 里）例如 IgGl、IgG2、lgG3、lgG4、IgAl 及 IgA2。將對 應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈怪定域分別稱作α、 ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態 係眾所熟知的。 如本文中所使用，”單株抗體，，係指自大體上同種抗體之 群獲彳于之抗體，亦即，包含該群之個別抗體除可以微量存 在之可能天然產生之突變以外為相同的。單株抗體對單一 抗原位點有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定 子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相反，每一單 株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語”單株”指示如 自抗體之大體上同種群所獲得之抗體的特徵，且並不解釋 為需由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明所 使用之單株抗體可由首先由Kohler及Milstein，1975, Nature，256:495所述之融合瘤方法製得，或可由（諸如）美 國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製得。單株抗 體亦可自使用（例如）McCafferty等人，1990，Nature 348:5 52-5 54中所述之技術產生之噬菌體庫分離。 如本文中所使用，”擬人化”抗體係指含有衍生自非人類 免疫球蛋白之最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球 蛋白鍵或其片段（諸如抗體之Fv、Fab、Fab’、F(ab，）2或其 他抗原結合子序列）之非人類（例如鼠類）抗體之形式。對大 部分而言，擬人化抗體為其中來自接受者之互補判定區 118462.doc 17 200808352 (CDR)之殘基經來自具有所要特異性、親和力及生物活性 之諸如小鼠、大鼠或兔之非人類物種（供者抗體）之殘基置 換的人類免疫球蛋白（受者抗體）。在一些情況下，人類免 疫球蛋白之Fv構架區（FR)殘基係經相應非人類殘基置換。 此外，擬人化抗體可包含既非在受者抗體中亦非在引入型 CDR或片段序列中發現，但包括在内以進一步精煉及優化 抗體效能的殘基。一般而言，擬人化抗體將包含大體上全 部至少一個及通常兩個可變域，其中全部或大體上全部 CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等區，且全部或大體 上全部FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等區。擬人化 抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區或域 (Fc)、通常為人類免疫球蛋白之彼恆定區或域。抗體可具 有如WO 99/58572中所述經修飾之以區。擬人化抗體之其 他形式具有一或多個對於原始抗體而改變之Cdr( —個、 兩個、三個、四個、五個、六個），其亦被稱作，，衍生自，，來 自原始抗體之一或多個CDR的一或多個CDR。 如本文中所使用，，，人類抗體”意謂具有對應於由人類所 產生之抗體之彼胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用此 項技術中已知或本文中所揭示之製備人類抗體之技術中之 任-者製得之抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一條 人類重鏈多肽或至少一條人類輕鏈多肽之抗體。一如此之 實例為包含鼠纏鏈及人類重鏈多肽之抗體。人類抗體可 使用此項技術中已知之各 , 種技術采製備。在一實施例申， 人類抗體係選自噬菌體庫，苴中 ，、r後巫滴體庫表現人類抗體 118462.doc > 18- 200808352 (Vaughan等人，1996, Nature Biotechnology，14:309-314; Sheets 等人，1998， PNAS， （USA) 95:6157-6162 ; Hoogenboom及 Winter, 1991，J· Mol· Biol·，227:381 ; Marks 等人，1991，J. Mol. Biol.，222:581)。人類抗體亦可藉由將 人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物（例如其中内源 性免疫球蛋白基因已部分或全部失活之小鼠）中來製得。 此方法係描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、 第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號及 5,661，016號中。或者，人類抗體可藉由使產生針對目標抗 原之抗體的人類B淋巴細胞永生化來製備（該等b淋巴細胞 可自個體回收或可已在活體外經免疫）。參見（例如）c〇le等 人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R· Liss，第 77 頁（1985) ; Boemer 等人，1991，J. Immunol·，147 (1):86-95 ;及美國專利第5,75〇,373號。 抗體之n可變區n係指單獨地或以組合形式之抗體輕鏈之 可變區或抗體重鏈之可變區。重鏈及輕鏈之可變區各自係 由四個構架區（FR)組成，該等構架區係由亦稱作高變區之 互補判定區（CDR)連接。各鏈中之CDR係由FR且與來自其 他鏈之CDR極接近地保持於一起，此有助於形成抗體之抗 原結合位點。存在至少兩種判定CDR之技術：（1)基於跨種 序列異性之方法（亦即Kabat等人Sequences of Proteins of

Immunological Interest，（第 5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD));及（2)基於抗原-抗體複合物之 結晶學研究之方法（A卜lazikani等人（1997) J. Molec Biol. 118462.doc -19- 200808352 273:927-948)。如本文中所使用，CDR可指由任一方法或 由兩種方法之組合所界定之CDR。 抗體之"恆定區’’係指單獨地或以組合形式之抗體輕鏈之 恆定區或抗體重鏈之恆定區。 優先結合”或’’特異性結合在本文中可互換使用）抗體 或多肽之抗原決定基為此項技術中充分暸解之術語，且判 定該特異性或優先結合之方法在此項技術中亦眾所熟知。 若分子與特定細胞或物質比與替代性細胞或物質更頻繁、 更快速、以更長持續時間及/或以更高親和力反應或締 合，則稱該分子顯示，，特異性結合”或，，優先結合"。若抗體 與其結合其他物質相比以更高親和力、親和性、更容易及/ 或以更長持續時間結合，則該抗體”特異性結合，，或，，優先 結合”目標。舉例而言，特異性結合或優先結合trkB抗原 決定基之抗體為與其結合其他trkB抗原決定基或非“四抗 原決定基相比以更高親和力、親和性、更容易及/或以更 長持、、、ί日守間結合此抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦 瞭解’例如’特異性或優先結合第一目標之抗體（或部分 或抗原決定基）可或不可特異性結合或優先結合第二目 標。同樣地，”特異性結合”或”優先結合，，未必需要（儘管可 匕括）排外性結合。一般但未必，提及結合意謂優先結 合。 術語"FC區"係用於定義免疫球蛋白重鏈之c末端區。，，以 區可為原生序列以區或變異以區。儘管免疫球蛋白重鍵 之F c區之m , 心還界可變化，但人類1§〇重鏈以區通常係界定為 118462.doc -20- 200808352 自位置Cys226或自Pro230處之胺基酸殘基伸展至其羧基末 端。Fc區中之殘基編號為如Kabat. Kabat等人，Sequences of Proteins of Imunological Interest，第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda. Md., 1991 中之EU索引之彼編號。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個 恆定域：CH2及CH3。 如本文中所使用，"Fc受體f’及"FcR"描述結合抗體之Fc 區的受體。較佳之FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳 之FcR為結合IgG抗體（γ受體）且包括FcyRI、FcyRII、 FcyRIII及FcyRIV亞類之受體（包括對偶基因變異體）及此等 受體之可變剪接形式的FcR。FcyRII受體包括具有主要在 其細胞質域方面不同之類似胺基酸序列的FcyRIIA (π活化 受體’’）及FcyRIIB (π抑制受體π)。FcR係論述於Ravetch及 Kinet，1991，Ann. Rev. Immunol·，9:457-92 ; Capel 等人 1994，Immunomethods，4:25-34 ; de Haas 等人，1995. J. Lab. Clin. Med·，126:330-41 ; Nimmerjahn 等人，2005, Immunity 23:2-4中。’’FcR”亦包括負責將母體之IgG轉移至 胎兒之新生受體（FcRn)(Guyer 等人，1976，J. Immunol.， 1 17:587 ；及 Kim等人，1994, J. Immunol·，24:249) ° π補體依賴性細胞毒性”及’’CDC”係指在補體存在下目標 之溶解。補體活化路徑係藉由補體系統（Clq)之第一組份 與同源抗原複合之分子（例如抗體）結合來引發。為評估補 體活化，可進行（例如）Gazzano-Santoro等人，J. Immunol· Methods，202:163 (1996)中所述之CDC檢定。 118462.doc -21 - 200808352 π功能性Fc區n擁有原生序列Fc區之至少一種效應功能。 例示性π效應功能”包括C1 q結合；補體依賴性細胞毒性 (CDC) ; Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)，呑兔作用；細胞表面受體（例如B細胞受體’ BCR)之下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例 如抗體可變域）組合且可使用用於評估該等抗體效應功能 的在此項技術中已知之各種檢定來評估。 ’’原生序列Fc區”包含與天然發現之Fc區的胺基酸序列相 同的胺基酸序列。”變異Fc區”包含由於至少一個胺基酸修 飾而不同於原生序列Fc區之彼胺基酸序列，但仍保留原生 序列F c區之至少一種效應功能的胺基酸序列。較佳地，變 異Fc區與原生序列Fc區或與親本多肽之Fc區相比具有至少 一個胺基酸取代，例如在原生序列Fc區中或在親本多肽之 Fc中有約一個至約十個胺基酸取代及較佳約一個至約五個 胺基酸取代。本文中之變異Fc區較佳將擁有與原生序列Fc 區及/或親本多肽之Fc區約80%之序列一致性，及甚佳與之 至少約90%之序列一致性，更佳與之約95%、至少約 96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致 性。 如本文中所使用，”抗體依賴性細胞介導之細胞毒性”及 "ADCC”係指細胞介導之反應，其中表現Fc受體（FcR)之非 特異性細胞毒性細胞（例如天然殺傷（NK)細胞、嗜中性白 血球及巨嗤細胞）識別目標細胞上之結合性抗體且隨後使 目標細胞溶解。所關注之分子之ADCC活性可使用（諸如） 118462.doc -22- 200808352 美國專利第5,500,362號或第5,821，337號中所述之活體外 ADCC檢定來評估。用於該等檢定之適用效應細胞包括周 邊血液單核細胞（PBMC)及NK細胞。其他或另外，所關注 之分子之ADCC活性可（例如）在（諸如）Clynes等人，1998, PNAS (USA)，95:652-656中所揭示之動物模型中於活體内 評估。 如本文中所使用，”醫藥學上可接受之載劑，，或，，醫藥學 上可接受之賦形劑”包括當與活性成份組合時使成份保留 生物活性且與受檢者之免疫系統不起反應的任何物質。實 例包括（但不限於）：諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、 水、乳液（諸如油/水乳液）及各種類型之濕潤劑的標準醫藥 載劑中之任一者。用於喷霧或非經腸投予之較佳稀釋劑為 磷酸鹽緩衝生理食鹽水或一般（0·9%)生理食鹽水。包含該 等載劑之組合物係由眾所熟知之習知方法來調配（參見（例 如）Remington’s Pharmaceutical Sciences，第]^版，k

Gennaro，編，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990 ;及 Remington，The Science and Practice of Pharmacy 第 2Q版

Mack Publishing，2000) 〇 術語"多肽"、”寡肽”、”肽，，及”蛋白質”在本文中可互換 使用以指代任何長度之胺基酸之聚合物。該聚合物可為線 性或分枝的，其可包含經修飾之胺基酸且可由非胺基酸中 斷。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入來修飾之胺基酸序 列；例如，雙硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化 作用、磷酸化作用，或任何其他操作或修飾（諸如與標記 118462.doc -23 - 200808352 之組份共軛）。亦包括於定義中的為（例如）含有胺基酸（包 括（例如）非天然胺基酸等）之一或多個類似物之多肽以及此 項技術中已知之其他修飾。當然，由於本發明之多肽係基 於抗體，因此該等多肽可以單鏈或經締合之鏈的形式= 現。 如本文中可互換使用，"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長 度之核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧 核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或 其類似物，或可由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之任何 受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷 酸及其類似物。若存在，則可在裝配聚合物之前或之後對 核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可由非核苷酸組 斷。聚核苦酸可在聚合後（諸如）藉由與標記組份共軛來進 步修飾。其他類型之修飾包括（例如）："帶帽”；經類似 物取代天然產生之核㈣中之—或多I ;核苦酸間修飾， 諸如具有不帶電鍵（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸醯胺 酯、胺基甲酸酯等）及具有帶電鍵（例如硫代磷酸酯、二硫 代構酸S旨等）之彼等修飾、含有侧位部分（諸如蛋白質（例如 核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等）之彼等修 飾 '具有散合劑（例如W、補骨脂素等）之彼等修飾、含 有螯合劑（例如金屬 '放射性金屬、侧、氧化性金屬等）之 彼等修飾、含有烧化劑之彼等修飾、具有經修飾之鍵(例 如α變旋異構核酸等)之彼等修飾；以及未經修飾形式之聚 核芽酸。另外，—般存在於糖中之經基之者可（例 118462.doc -24- 200808352 經膦酸酯基、磷酸酯基置換，受標準保護基保護，或經活 化以製備與其他核苷酸之其他鍵或可與固體載體共軛。5, 及;V末端OH可經麟酸化或經1至20個破原子之胺或有機帶 帽基部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷 酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或脫氧核糖的類似 形式，包括（例如）2’-0-甲基-、烯丙基、2’-氟-或2·-疊 氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖 (諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖）、旅喃糖、吱喃糖、景天 庚酮糖（sedoheptulose)、無環類似物及阿巴辛核苷（abasic nucleoside)類似物（諸如曱基核糖苷）。一或多個構酸二酯 鍵可經替代性鍵聯基置換。此等替代性鍵聯基包括（但不 限於）：其中磷酸酯經P(0)S (’’硫酯，’）、P(S)S (，，二硫酯π)、 (o)nr2 (”醯胺酯’’）、p(o)r、P(〇)〇R*、CO或CH2 (，，曱縮醛，，) 置換之實施例，其中各R或R’獨立地為Η或視情況含有醚（-0-) 鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基之經取代或未 經取代之烷基（1-20 C)。聚核苷酸中並非所有鍵均需相 同。上述描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括 RNA及 DNA。 如本文中所使用，’’大體上純”係指至少50%純（亦即無污 染物）、更佳至少90%純、更佳至少95%純、更佳至少98% 純、更佳至少99%純之物質。 π宿主細胞’’包括可為或已為用於合併聚核苷酸插入物之 載體之受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一 宿主細胞之子代’且該子代由於天然、偶然或有意突變而 118462.doc -25 - 200808352 可不必與原始親本細胞完全相同（在形態或基因組DNA補 體方面）。宿主細胞包括經本發明之聚核苷酸活體内轉染 之細胞。 如本文中所使用，”載體”意謂能傳遞及較佳表現宿主細 胞中所關注之一或多個基因或序列的構築體。載體之實例 包括（但不限於）：病毒載體、裸Dna或RNA表現載體、質 體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子型縮合劑相關之dna 或RNA表現載體、囊封於脂質體中之dna或rna表現載 體，及某些真核細胞（諸如生產細胞）。 如本文中所使用，”表現對照序列”意謂引導核酸轉錄之 核馱序列。表現對照序列可為啟動子（諸如組成性或誘導 丨欠動子)或強化子。表現對照序列可操作性連接至待轉 錄之核酸序列。 如本文中所使用 速率常數。 術語nkQn，’意欲指代抗體與抗原締合之 本文中所使用，術語，，W，意欲指導抗體自抗體/抗原 複a物解離之速率常數。 如本文中所使用， 付〜'kd”意欲指代抗體—抗原相互作 用之平衡解離常數。 除非另外指出，否則單數形式 及 如本文中所使用 π該π包括複數參考 III.本發明之方法 本叙明涵盍藉由周 物攝入之方法。此等 TtrkB激動劑以增加體重及/或食 去用於治療或預防靈長類動物不 118462.doc -26 - 200808352 、咸重（諸如心病質）及飲食異常（諸如神經性厭食症）及 二礼動物之類鴉片誘發之嘔吐。該等方法需要將有效量之 ::多種㈣激動劑周邊投予有此需要之個體(各種適應症 及恶樣係描述於本文中）。 關於本文中所述之所有方法，提及刚激動劑亦包括包 '此等試劑中之-或多者的組合物。此等組合物可進一步 2合適之賦形劑’諸如此項技術中熟知之包括緩衝劑的 醫樂學上可接受之賦形劑。本發明可單獨或與其他習知治 療方法組合使用。 可由本文中所述之方法治療及/或預防之惡病質可由以 :；丙中之或夕者引起或與之相關：慢性阻塞性肺病 (COPD)、性腎病（CKD)、慢性心臟衰竭、老齡 :、癌症及AIDS。在一些實施例中，患有所治療之惡病 質之人類患者具有小於約25.〇 kg/m2、24 〇 、Μ』 kg/m2、22.0 kg/m2、21〇 kg/m2、2〇 〇 kg/m2、19 〇 及18.5 kg/m2之身體質量指數（BMI，以體重/以公尺計的身 高之平方(kg/晌計算）。在一些實施例中，患有所治療之 惡病質之人類患者具有小於約9〇%、約8〇%、約7〇%、約 6〇%、約5G%、約術。、⑽％、約2()%或約咖之正常推 薦之日攝入量或發病前量的日食物攝入。 在-些實施例中，患有由本文中所述之方法治療之神經 性厭食症之人類患者具有小於約18 5 kg/m2、ΐ7·5 kg/m2及 16.5 kg/m2中之任—者之BMI。在一些實施例中，患有所 治療之神經性厭食症之人類患者具有小於約9〇%、約 118462.doc -27- 200808352 80%、約 70%、約 60%、約 5〇%、約 4〇%、約 3〇%、約 2〇% 或約10%之正常推薦之日攝入量或發病前量的日食物攝 入0 trkB激動劑係經周邊投予。當然，儘管該試劑係經周邊 才又予，但視試劑特性而定，少量試劑可穿過血腦障壁且使 知傳遞至中輕神經系統中。在一些實施例中，小於約 1 /〇 、力〇·5 /〇、約〇·25%及約0.1%中之任一者之經周邊投予 之trkB激動劑（例如trkB激動劑抗體）可進入cNS。 trkB激動劑可經由任何合適之周邊途徑投予個體。熟習 此f技術者應顯而易見，本文中所述之實例並不意欲限制 而疋口兄明可利用之技術。因此’在一些實施例中，以⑸激 動劑係根據已知之方法好個體，該等方法係諸如靜脈内 杈藥(例如經某一時段以團式或藉由連續輸注卜藉由肌肉 内、腹膜内、皮下、關節内、舌下、滑膜内、經由吹入、 經口、吸入或局部途徑。投藥可為全身性的(例如靜脈内 投藥）或局部的。包括喷嘴式喷霧器及超音式喷霧器的用 於液體調配物之市售喷霧器適用於投藥。液體調配物可直 接進行噴霧且㈣乾之粉劑可在復水後進行喷^或者， trkB激動劑可使用氟碳調配物及定劑量之吸人器來霧化， 或以經凍乾及經研磨之粉劑形式吸入。 trkB激動劑可經由位特 ^ 吁，、『生次靶向局部傳遞技術在 CNS或i腦障壁外部投予。 術之^^ 奴于u特異性或耙向局部傳遞技 何之貝例包括trkB激動劑之各 4 j植入積存源或局部傳遞 寺吕，诸如輸注導管、留置導管戍 吕次針刺導官、合成移植 118462.doc -28- 200808352 物、外膜包覆、分流及血管支架，或其他可植入裝置、位 點特異性載劑、直接注射或直接塗佈。參見（例如）pcT公 開案第觸〇〇/53211號及美國專利第5,981，568號。 trkB激動劑之各種調配物可用於投藥。在一些實施例 中，嫩激動劑可以純形式投予。在其他實施例中，㈣ 激動劑及醫藥學上可接受之賦形劑經投予且可在各種調配 物中。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中已知且為有 利於杈予藥理學上有效之物質的相對惰性物質。舉例而 a，賦形劑可賦^形狀或稠度或充#稀釋劑。合適之賦形 劑包括（但不P艮於）：穩定劑、濕潤劑及乳化劑、改變容積 渗透濃度之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚穿透增強劑。用於 非經腸及經腸藥物傳遞之賦形劑以及調配物係陳述於

Remington，The Science and Practice 〇f pharmacy%iQf^

Mack Publishing (2000)中。儘管亦可使用其他投藥形式 (例如經口、經黏膜、經皮、吸入等），但一般而言，此等 試劑經調配用於藉由注射（例如腹膜内、靜脈内、皮下、 肌肉内等）來投予。 特定給藥方案（亦即劑量、時間及重複性）將視特定個體 及彼個體之病史、待治療之特定疾病（例如惡病質、神經 性厭食症及類鴉片誘發之嘔吐）及特定trkB激動劑而定。一 般而言，可使用trkB激動劑（例如NT-4/5、BDNF及抗七⑸ 激動劑抗體）之以下劑量中之任一者：至少約5〇體重 之劑ΐ ,至少約2〇 mg/kg體重；至少約1〇 mg/kg體重；至 少約5 mg/kg體重；至少約3 mg/kg體重；至少約2 mg/kg體 118462.doc -29- 200808352 重’至少約1 mg/kg體重；至少約75〇 yg/kg體重；至少約 500 pg/kg體重，至少約25〇 yg/kg體重；至少約1〇〇 體重，至少約50 pg/kg體重；至少約1〇 pg/kg體重；至少 約1 pg/kg體重或更高經投予。經驗性考慮（諸如半衰期）一 般將有助於確定劑量。對於經幾曰或更長時間之重複投藥 而吕，視病狀而定，持續治療直至出現疾病症狀之所要抑 制或直至達成充分治療程度。舉例而言，預期一週給藥一 至五次。其他給藥方案包括多達每日丨次、每週丨至5次或 更少頻率之方案。在一些實施例中，約每週一次、約每月 1至4次投予trkB激動劑。可使用具有由2日至7日或甚至“ 日間隔之交錯劑量的間歇給藥方案。在一些實施例中，治 療可以每日給藥起始且稍後變成每週甚至每月給藥。此治 療進程易於由習知技術及檢定來監控。 在-些個體中，可需要—次以上給藥。可較投率頻率 且在治療過程中調整。舉例而言，可讀定投藥頻率或基於 待治療之疾病的類型及嚴重程度、投予試劑以用於預防或 治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對試劑之反應及 主治醫師之判斷來調整。通常，臨床醫師將投予咖激動 劑直至達到達成所要結果之劑量。在—些狀況下，⑽B激 動:之持續性連續釋放調配物可為適#的。達成持續釋放 周配物及裝置在此項技術中已知。舉例而言，放b = 投予床中用於持續或緩慢釋 在一實施例中 在已給予一 或夕^投藥之個體中可以經 118462.doc -30- 200808352 驗性確定trkB激動劑之劑晋认 W里給予個體以trkB激動劑之遞 增之劑量。為評估trkB激動 ^ ^ 双勒^之功效，可監控疾病狀況之 指標。熟習此項技術者所顯而；目 ^^ 吓·、、貝而易見，劑量將視個體、疾病 (諸如惡病質、神經性厭食症及類鳩片誘發之唱吐）之階段 及所使用之過去及並行療法而改變。 舉例而言，基於接受者之生理狀況、投藥目的為治療性 或預防性及熟練之開業醫師已知之其他因t，根據本發明 之方法投予㈣激動劑可為連續或間歇性的。刚激動劑 之投予在預選之時段中可基本上為連續的或可為一系列間 隔之給藥。 其他調配物包括此項技術中已知之合適的傳遞形式，包 括（但不限於）載劑，諸如脂質體。參見（例如）Mahat〇等人 (1997)户心⑽.及14:853_859。脂質體製劑包括（但不限 於）··細胞轉染素、多層微脂粒及單層微脂粒。 疾病評估係使用此項技術中已知之標準方法（例如藉由 監控適當指標）來進行。舉例而言，對於惡病質，可監控 以下指標：體重、血漿白蛋白、體脂肪、痩體質、疲勞、 虛弱及食慾。對於神經性厭食症，可監控以下指標：體 重、食慾及對增重之恐懼。對於類鴉片誘發之嘔吐，可監 控以下指標：噁心、嘔吐、食慾、體重及其他相關醫學併 發症。 IV.組合物及製備組合物之方法 本發明之方法使用trkB激動劑’其係指結合及活化原生 trkB受體及/或由trkB信號轉導功能調節之下游路徑的任何 118462.doc -31- 200808352 分子。trkB激動劑包括trkB受體之任何原生配位子，諸如 NT-4/5及BDNF。trkB激動劑亦包括結合及活化原生trkB受 體，進而仿效該受體之原生配位子之生物活性的trkB受體 之非原生配位子（例如多肽、肽衍生之化合物、環狀肽衍 生之分子或非肽衍生之分子）。trkB受體之非原生配位子之 一實例為抗-trkB激動劑抗體。trkB激動劑亦包括小分子或 肽模擬物（例如，BDNF之肽模擬物）。參見（例如）O’Leary 等人，Biol. Chem. 278:25738-44，2003。在一些實施例 中，小分子trkB激動劑當周邊投予時並不明顯穿過血腦障 壁。 trkB激動劑應顯示以下特徵中之任何一或多者：（a)結合 trkB受體；（b)結合trkB受體且激活trkB生物活性及/或由 trkB信號轉導功能調節之一或多個下游路徑；（c)當周邊投 予時結合trkB受體且增加靈長類動物之體重及/或食物攝 入；（d)當周邊投予時結合trkB受體且治療、預防、逆轉或 改善靈長類動物之惡病質之一或多種症狀；（e)當周邊投予 時結合trkB受體且治療、預防、逆轉或改善靈長類動物之 神經性厭食症之一或多種症狀；（f)當周邊投予時結合trkB 受體且治療、預防、逆轉或改善哺乳動物之類鴉片誘發之 嘔吐之一或多種症狀；（g)促進trkB受體二聚化及活化；及 (h)增加trkB受體依賴性神經元存活及/或神經突外生長。 在一些實施例中，trkB結合及活化trkB受體，但不顯著或 優先活化一或多種其他trk受體（諸如trkA及/或trkC)。 trkB激動劑可呈組合物之形式用在本文中所述之任何方 118462.doc -32- 200808352 法中。本發明之方法中所使用之組合物包含有效量之trkB 激動劑。組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、賦 开> 劑或穩定劑（及㈣〜以⑽：77^ ⑽d 〇/ 户/mrmacj;第 20 版，（2000) Lippincott Williams 及 Wilkins， Κ· Ε· Hoover·編輯），其係呈經凍乾之調配物或水溶液形 式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接 文者無毒’且可包含：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及 其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐 劑（諸如氣化十八烷基二甲基苄基銨；氣化六羥季銨；氯 化V烧叙’氣化苄乙氧銨（benzeth〇nium chloride);苯盼、 丁醇或苄醇，對羥基苯甲酸烧酯，諸如對羥基苯曱酸甲酯 或對私基苯甲酸丙酯；兒茶紛（catech〇i);間苯二紛；環己 知，3 -戊醇；及間甲酚；低分子量（小於約i 〇個殘基）多 肽’蛋白質’諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水 性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、 麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙 醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯 合劑，諸如EDTA ;糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或 山梨糖醇；形成鹽之平衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例 如Zn蛋白錯合物）；及/或非離子型界面活性劑，諸如 tween™、pluronics™或聚乙二醇（peg)q醫藥學上可 接受之賦形劑將在本文中進一步描述。 本文中所述之trkB激動劑可經調配用於持續釋放。持續 釋放製劑之合適實例包括含有卜四激動劑之固體疏水性聚 H8462.doc -33 - 200808352 合物之半透性基質，該等基質呈經成形之物品（例如薄膜 或微囊）的形式。持續釋放基質之實例包括：聚醋、水凝 膠（例如，聚（2-羥乙基_曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚 乳酸交酯（美國專利第3,773,919號）、L-麩胺酸與7_乙基-L_ 麵胺酸醋之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酿、可降 解之乳酸·乙醇酸共聚物（諸如LUPRON DEPOTtm (包含乳 酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林（leupr〇Hde 之可 注射微球體））、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚(十3_羥基丁 酸。可使用之持續釋放之藥物傳遞系統的另一實例為由 Atrix Laborat〇riesm製得之ATRIGEL⑧。參見（例如）美國專 利第6,565,874號。ATRIGEL⑧藥物傳遞系統係由溶解於生 物相容性載劑中之類似於可生物降解縫合線中所使用之彼 等聚合物的可生物降解聚合物組成。以⑸激動劑可在製造 時4 口於此液體傳遞系統中，或可視產物而定稍後在使用 時由醫師添加。當液體產物經小型標準針皮下或肌肉内注 射或經套管置放於可達之組織部位中日夺，用組織液中之水 取代載劑使聚合物沉澱以形成固體薄膜或植入物。當聚合 物土貝Ik時間生物降解時，囊封於植人物内之他Β激動劑 Ik後以文控方式釋放。視患者之醫療需要而定，Abigel系 、、充可在數日至數月之範圍内的時段中傳遞蛋白質。亦可使 用可庄射之持續釋放系、统，諸如由Alk_es所製造之

ProLease®、]viedisorb®。 在二只轭例中，本發明提供在用作藥劑及/或用於製 仏藥训之情形中在本文所述之方法之任一者中使用之組合 118462.doc -34- 200808352 物（描述於本文中）。 NT-4/5多肽 在本發明之方法中使用之trkB激動劑包括NT-4/5多肽。 如本文中所使用，"NT-4/5多肽π包括天然產生之成熟蛋白 質（可互換地稱作πΝΤ-4/5π)，諸如下表1中及美國專利申請 公開案第2005/0209148號及PCT WO 2005/08240及美國專 利申請公開案第20030203383號中之圖1中所示之成熟人類 ΝΤ-4/5，及ΝΤ-4/5之天然產生之胺基酸序列變異體；NT-4/5之胺基酸序列變異體；成熟NT-4/5 (諸如人類）之肽片段 及該等胺基酸序列變異體；及成熟NT-4/5及該等胺基酸序 列變異體及肽片段之經修飾之形式，其中多肽或肽已藉由 經除天然產生之胺基酸以外之部分取代來共價修飾，只要 胺基酸序列變異體、肽片段及其經修飾之形式顯示trkB激 動劑及/或天然產生之成熟NT-4/5蛋白質之一或多種生物活 性。trkB激動劑亦包括包含本文中所述之NT-4/5多肽實施 例之任一者的融合蛋白質及共輊物，例如與延長半衰期部 分（諸如PEG、IgG Fc區、白蛋白或肽）共軛或融合之NT-4/5 多肽。在研究中之胺基酸序列變異體、肽片段（包括變異 體之片段）或其經修飾之形式並不包括任何動物物種之 NGF、BDNF或NT-3。天然產生之NT-4/5之變異體、肽片 段及經修飾之形式係描述於美國專利申請公開案第 2003/0203383號、第 2002/0045576號、第 2005/0209148 號，美國專利第5,702,906號、第6,506,728號、第 6,566,091號、第5,830,858號中，其以引用方式全部併入本 118462.doc -35 - 200808352 文中。NT-4/5多肽包括本文中所述之任意一或多個實施 例。舉例而言，ΝΤ-4/5多肽包含具有一或多個胺基酸插 入、缺失或取代之天然產生之序列。 表1 ·成熟人類ΝΤ-4/5之胺基酸序列及編碼該成熟人類 ΝΤ-4/5之人類核苷酸序列

胺基酸序列(SEQIDNO:l) ·· GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQ YFFETR CKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWR WIRIDTACVC TLLSRTGRA_ 才亥苷酸序列(SEQ ID NO:2) GGGGTGAGCG AAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTC AGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCC AGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGC CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGT ATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATG CCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTC TGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCCTGAG 在一些實施例中，NT-4/5多肽為哺乳動物NT-4/5多肽， 其可為天然產生之哺乳動物ΝΤ-4/5，或衍生自天然產生之 哺乳動物ΝΤ-4/5且具有並不與天然產生之非哺乳動物ΝΤ-4/5 之任何部分匹配之序列的ΝΤ-4/5多肽。在一些實施例中， ΝΤ-4/5多肽為人類ΝΤ-4/5多肽，其可為天然產生之人類 ΝΤ-4/5，或衍生自天然產生之人類ΝΤ-4/5且具有並不與天 然產生之非人類ΝΤ-4/5之任何部分匹配之序列的ΝΤ-4/5多 包括本發明之變異體、肽片段、ΝΤ-4/5多肽（包括天然 產生之ΝΤ-4/5)之經修飾之形式、融合蛋白質及共軛物的 118462.doc -36- 200808352 NT-4/5多肽係由以下特徵中之任意（_或 結合trkB受體；士人 ）术表被·（a) ^ , ( )、、、σ合trkB受體且激活trkB生物活性及/或 由trkB信號轉導功能 ^ /b凋即之-或多個下游路徑；⑷當周邊 又.，、，，口/trkB雙體且增加靈長類動物之體重及/或食物攝 入’⑷自周邊投T時結合咖受體且治療、預防、逆轉或 改善靈長類動物之惡病質之一或多種症狀；⑷當周邊投予 時結合t邮受體且治療、預防、逆轉或改善靈長類動物之

神經性厭食症之—或多種症狀；ω當周邊投予時結合trkB 受體且治療、預防、逆轉或改善哺乳動物之類鴉片誘發之 嘔吐之一或多種症狀；（g)促進trkB受體二聚化及活化；及 (h)增加trkB受體依賴性神經元存活及/或神經突外生長。 因此，所有NT-4/5多肽（包括變異體、片段及經修飾之形 式）具如上所述之功能。 變異體之生物活性可使用此項技術中已知之方法及本文 中所述之方法在活體外及活體内測試。亦可使用本文中所 述之用於鑑別抗-trkB激動劑之方法。NT-4/5多肽與天然產 生之NT-4/5蛋白質相比可具有增強之活性或減弱之活性。 在一些實施例中，對於上文所述（或此項技術中已知）之生 物檢定中之一或多者，功能上等效之變異體與衍生出NT-4/5 多肽之原生NT-4/5蛋白質相比具有至少約50%、60%、 70%、75%、80%、85%、90%或95%之活性中之任一者。 在一些實施例中，功能上等效之變異體在活體外trkB受體 活化（例如實例6中及Us 20〇5/02〇9148及PCT WO 2005/082401中所述之檢定）中具有小於約〇·〇1 nM、0.1 118462.doc -37- 200808352 nM、1 nM、10 nM或100 nM中之任一者的EC50(最大有效 濃度之一半）。 NT-4/5之胺基酸序列變異體包括具有由於在天然產生之 NT-4/5(例如表1中所示之成熟人類NT-4)之序列内一或多個 胺基酸殘基的插入、缺失及/或取代而不同於天然產生之 NT-4/5之胺基酸序列的多肽。胺基酸序列變異體一般有至 少約 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%與任何天然產生之NT-4/5(諸如SEQ ID ΝΟ:1中所示之成熟人類NT-4/5)相同。在一些實施例中， 變異體有至少約70%與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸序列相同。 在一些實施例中，變異體有至少約85%與SEQ ID NO: 1之 胺基酸序列相同。在一些實施例中，變異體有至少約90% 與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列相同。在一些實施例中，變 異體有至少約95%與SEQ ID NOH之胺基酸序列相同。 NT-4/5之胺基酸序列變異體可藉由在先前經分離之NT-4/5 DNA中製造預定突變來產生。胺基酸變異體可基於NT-4/5 及trkB受體之晶體結構來設計及產生。BanHeld等人， Structure 9: 1191-9 (2001)。舉例而言，可使並不直接涉及 NT-4/5之單體之間及NT-4/5與trkB受體之間的相互作用之 胺基酸突變（例如）以引入PEG連接位點。此項技術中已知 之方法可用於設計與天然產生之NT-4/5蛋白質相比具有增 強或減弱之一或多種生物活性的NT-4/5多肽之變異體。 在製造該等預定突變中要考慮兩個主要變數：突變位點 之位置及突變之性質。一般而言，所選擇之突變之位置及 118462.doc -38- 200808352 性質一般視待修飾之NT-4/5的特徵而定。舉例而言，候選 NT-4/5拮抗劑或上等激動劑最初可藉由定位在ngf、 BDNF、NT-3及NT_4中相同或高度保守之胺基酸殘基來選 擇。Ik後可（例如）藉由以下選項依次來修飾彼等殘基：（〇 視所達成之結果而定首先用保守選擇物且接著用更多基團 選擇物來取代，（2)使目標殘基缺失，或（3)鄰近經定位之 位點插入相同或不同類別之殘基，或選項丨_3之組合。 項有用之技術係稱作”ala掃描”。此處，胺基酸殘基或 目標殘基之群經鑑別且經丙胺酸或聚丙胺酸取代。經證明 在功能上對丙胺酸取代敏感之彼等域接著係藉由在丙胺酸 取代之位點處或向丙胺酸取代之位點引入另外或其他變異 來改進。 明顯地，（例如）將NT-4/5轉化成NGF、BDNF或NT-3之該 等變化並不包括於本發明之範疇内。因此，儘管引入胺基 酸序列變化之位點經預定，但突變本身之性質無須預定。 舉例而言’為使給定位點處之突變效能最優化，在目標密 碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變且篩檢最佳所要活性 之經表現之NT-4/5變異體。 胺基酸序列缺失一般在約丨至3〇個殘基、更佳約1至1〇個 殘基之範圍内，且通常係鄰近的。可將缺失引入BDNF、 NGF、NT-3及NT-4/5中之低同源性區中以改變NT-4/5之活 性。在與BDNF、NT-3及NGF大體上同源之區中來自NT-4/5之缺失可更有可能更顯著地改變NT-4/5之生物活性。可 遠擇連續缺失之數目以保留受影響之域（例如β折疊片或α H8462.doc -39- 200808352 螺旋）中的ΝΤ_4/5之三級結構。 fe基酸序列插入包括在一個殘基至含有一千個或一千個 以上殘基之多肽之長度範圍内之胺基及/或羧基末端融 合’以及單一或多個胺基酸殘基的序列内插入。序列内插 入（亦即在成熟NT-4/5序列内之插入）一般可在約1至1〇個殘 基、更佳1至5個、最佳1至3個之範圍内。末端插入之一實 例包括異源N末端信號序列與NT-4/5分子之N末端融合以促 進自重組宿主分泌成熟NT-4/5。該等信號一般將與所需之 布主細胞同源且包括大腸桿菌（E. coil)之STII或Ipp、酵母 之α因子，及病毒信號（諸如哺乳動物細胞之疱疹gD)。其 他插入包括多肽與NT-4/5之N末端或C末端融合。 另一組變異體包括其中在NT-4/5中之至少一個胺基酸殘 基及較佳僅一個胺基酸殘基已被移除且不同殘基插入其位 置中的彼等變異體。一實例為精胺酸及離胺酸由其他胺基 酸置換以使NT-4/5對由絲胺酸蛋白酶進行之蛋白質水解有 抗性’進而產生更穩定之NT-4/5之變異體。取代型突變發 生最為關注之位點包括其中在BDNF、NGF、NT-3及NT-4 中所發現之胺基酸在側鍵大小、電荷或疏水性方面大體上 不同，而其中在NGF、NT-3及BDNF之多種動物類似物内 (例如在所有動物NGF、所有動物NT-3及所有BDNF中）在選 定位點處亦存在高度同源性之位點。此分析將突出可涉及 區分營養因子之活性的殘基，且由此在此等位點處之變異 可影響該等活性。自N末端編號的在成熟人類NT-4/5中之 該等位點之實例及例示性取代分別包括SEQ ID NO: 1之NT- 118462.doc -40- 200808352 4/5之G77至K、H、Q或R及R84至E、F、Ρ、γ或W。所關 注之其他位點為其中殘基在所有動物物種BDNF、NGF、 NT-3及NT-4/5中皆相同之彼等位點，此構形度表明在達成 為所有四個因子所共有之生物活性方面的重要性。 舉例而言，一或多個胺基酸之取代包括保守取代。製造 保守取代之方法在此項技術中已知。舉例而言，ala (A)可 經val、leu、ile取代，較佳經val取代；arg (R)可經lys、 gin、asn取代，較佳經lys取代；asn (N)可經gin、his、 lys、arg取代，較佳經gln取代；asp p)可經glu取代；cys (C)可經ser取代；gin (Q)可經asn取代；giu (E)可經asp取 代；gly (G)可經pro取代；his (H)可經 asn、gin、lys、arg 取代’較佳經arg取代；ile (I)可經leu、val、met、ala、 phe、正白胺酸取代，較佳經ieu取代；ieu (l)可經正白胺 酸、ile、val、met、aia、phe取代，較佳經 iie 取代；lys (K)可經arg、gln、asn取代，較佳經arg取代；met (M)可經 leu、phe、ile取代，較佳經leu取代；phe (F)可經leu、 val、ile、ala取代，較佳經leil取代；pro (P)可經gly取代； ser (S)可經thr取代；thr (T)可經ser取代；trp (W)可經tyr 取代，tyr (Y)可經trp、phe、thr、ser取代，較佳經phe取 代 ’ val (V)可經 ile、leu、met、phe、ala、正白胺酸取 代，較佳經leu取代。

尤其適於保守取代之位點包括（自成熟人類NT-4 (SEQ ID N〇：l)之 n 末端編號）ru、G12、E13、V16、D18、 W23、V24、D26、V40、L41、Q54、Y55、F56、E58、 118462.doc -41 - 200808352 T59、G77、R79、G80、H85、W86、A99、L100、T101、 WHO、Rill、W112、I113、RU4、IU5、〇116及八118。 並不涉及維持NT-4/5之適當構形之半胱胺酸殘基亦可經取 代（般經絲胺酸取代）以改良分子之氧化穩定性且防止異 常交聯。除此段所列舉之彼等位點以外之位點適合於上文 一般描述之缺失或插入研究。 在功能上之大體修飾可藉由選擇其對維持（a)在取代區域 中之多肽骨架之結構（例如呈片式或螺旋構形）、在目標 位點處之分子的電荷或疏水性或（c)側鏈之大小的作用方面 顯著不同的取代來完成。基於常見側鏈特性將天然產生之 殘基分組（一些此等殘基可屬於若干官能基）： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性： cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性· asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鍵定位之殘基：giy、pr〇 ;及 (6) 芳族：trp、tyr、phe。 非保守取代將需要將此等類別中之一成員換成另一成 員。 NT-4變異體之實例包括··具有E67至S或T之突變的SEQ ID NO: 1之多肽（此添加經n連接之糖基化作用位點）；自 SEQ ID N〇：l之胺基酸殘基r83至Q94、G1至C61、G1至 C17、C17 至 C61、C17 至 C78、C17 至 C90、C17 至 C119、 C17至 C121 、 R11至 R27 、 R11至 R34 、 R34至 R53 、 C61至 118462.doc -42- 200808352 C78、R53 至 C61、C61 至 C119、C61 至 C78、C78 至 C119、 C61 至 C90、R60 至 C78、K62 至 C119、K62 至 K91、R79 至 R98、R83 至 K93、T101 至 Rill、G1 至 C121之多肽；多肽 包含SEQ ID ΝΟ:1之V40-C121，例如在N末端及/或C末端 處與多肽融合之SEQ ID ΝΟ:1之V40-C121 ;多肽包含具有 C78、C61、Q54-T59、R60_D82、H85-S88、W86-T101 缺 失之SEQ ID ΝΟ:1(所指示之殘基跨度之缺失係包括在 内）：具有 R53至Η，K91至H，V108至 F、R84至Q、H、 N、T、Y或W及D116至E、N、Q、Y、S或T之突變的SEQ ID ΝΟ:1。亦包括其中位置70經除G、E、D或P以外之胺基 酸殘基取代，位置7 1經除A、P或Μ以外之胺基酸殘基取 代，及/或位置83經除R、D、S或Κ以外之胺基酸殘基取代 的NT-4/5 (SEQ ID NQ:1);以及經環化之ΝΤ-4片段。 當如下所述對準最大一致性時若兩個聚核苷酸或多肽序 列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則該兩個序列被稱作 ’’ 一致"。兩個序列之間的比較通常係藉由將該等序列與比 較窗口比較來進行以鑑別及比較序列之局部區之相似度。 如本文中所使用，”比較窗口 •’係指至少約2〇個鄰近位置、 通常30至約75、40至約50個鄰近位置之片段，其中在使兩 個序列最佳對準後可將序列與相同數目之鄰近位置之參考 序列比較。 用於比較之序列的最佳對準可使用生物資訊軟體 (DNASTAR，lnc.，Madis〇n，WI)之 集中之

Megahgn程式、使用預設參數來進行。此程式體現以下文 118462.doc -43 - 200808352 獻中所述之若干對準機制：Dayhoff，Μ.Ο. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff，M.O.(編）Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation，Washington DC 第 5 卷，增刊 3，第 345-358 頁；Hein J·，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第 626-645 頁 Methods in Enzymology 第 1 83 卷，Academic Press，Inc” San Diego，CA ; Higgins. D.G.及 Sharp，Ρ·Μ·，1989，CABIOS 5 :15 1 -1 53 ; Myers，E. W·及 Muller W·，1988，CABIOS 4:11_17 ; Robinson，E.D·，1971， Comb. Theor. 11:105 ; Santou，N·，Nes，M·，1987，Mol· Biol. Evol· 4:406-425 ; Sneath. Ρ_Η·Α·及 Sokal，R.R·，1973,

Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA ; Wilbur，W.J·及 Lipman，D.J·，1983，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730 ° 較佳地，’’序列一致性之百分數”係藉由將兩個經最佳對 準之序列與至少20個位置之比較窗口比較來確定，其中在 比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分與參考序列（其 並不包含添加或缺失）相比可包含20%或更少、通常5%至 15%或10%至12%的添加或缺失（亦即空隙）用於使兩個序列 最佳對準。藉由以下方法來計算百分數：確定兩個序列中 相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現之位置的數目以得到相匹 配之位置的數目，用參考序列（亦即窗口尺寸）中之位置之 118462.doc -44- 200808352 總數除相匹配之位置之數目且用1〇〇乘以結果以得到序列 一致性之百分數。 NT-4/5之胺基酸序列變異體可天然產生或可由合成來製 備（諸如藉由將適當核苷酸變化引入先前經分離2Ντ_4/5 DNA中，或藉由活體外合成所要變異多肽）。如上文所 示，該等變異體可包含在成熟ΝΤ_4/5之胺基酸序列（例如表 1所示之序列）内一或多個胺基酸殘基的缺失或插入或取 代。製造缺失、插入及取代之任何組合以得到]^14/5之胺 基酸序列變異體，其限制條件為所得變異多肽擁有所要特 徵。胺基酸變化亦可在重組宿主中表現後造成1^丁_4/5之進 一步修飾，例如引入或移動糖基化作用位點或引入臈錨定 序列（根據1989年2月9日公開之pCT w〇 89/〇1〇41)。 在一些實施例t，N孓4/5多肽包含由在嚴袼條件下與編 碼成熟人類NT-4/5之核酸序列（例如SEQ m ^^:”雜交的核 酸編碼之胺基酸序列。 變異多肽亦可（或替代地）大體上與原生基因或其一部分 或互補序列同源。該等多肽變異體能在中等嚴格條件下與 編碼多肽（或互補序列）之天然產生之DNA序列雜交。 合適之，，中等嚴格條件”包括在5xssc、0.5% SDS、^ 福EDTA (PH 8.0)之溶液中預洗蘇；在飢价下、 5XSSC中雜交隔夜；接著在价下用含有〇1%⑽之卜 及0.2><ssc中之每一者洗滌兩次歷時2〇分鐘。 如本文中所使用，，，高度嚴格條件"或高嚴格度條件"為 以下條件：⑴使用低離子強度及高溫用於絲，例如在50 118462.doc -45 - 200808352 °C下之G.Gl5 Μ氯化納/(^⑽丨5 M檸檬酸納/()1%十二烧基硫 酸鈉，（2)在雜父期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42 °C下之50% (V/V)甲醯胺與〇1%牛血清白蛋白/〇 ι%

Ficoll/Ο.Ι%聚乙烯吡咯啶酮/pH 65之5〇 mM磷酸鈉緩衝劑 與750 mM氯化鈉、75 mM擰檬酸鈉；或（3)使用在42t：下 之 50〇/〇 甲醯胺、5XSSC (0.75 M NaC1、〇·〇75 M檸檬酸 鈉）、50 mM 磷酸鈉（PH 6.8)、〇·1% 焦磷酸鈉、5xDenhardt 氏溶液、經超音波處理之鮭魚精子（salm〇n sperm)DNA(5〇 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在42 〇c下在 〇.2xSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉）中及在55。〇下在5〇%甲醯胺中 洗滌，接著在55°C下進行由含有EDTA之O.lxSSC組成的高 嚴格度洗條。另一例示性嚴格條件為在42。〇下在5〇%甲醯 胺、5xSSC、0.1%十二烷基硫酸鈉、〇1%焦磷酸鈉、5〇 mM石粦酸鋼（ρΗ 6·8)、2xDenhardt氏溶液及1〇〇/。硫酸葡聚糠 中雜交’接著在42°C下在O.lxSSC及0.1% SDS中洗滌。熟 練技工應瞭解如何調整對適應諸如探針長度及類似因素之 因素所必需之溫度、離子強度等。 般热習此項技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併，所 以存在編碼如本文中所述之多肽的許多核苷酸序列。一些 此等聚核苷酸具有對任何原生基因之核苷酸序列的最小同 源性。儘管如此，由於密碼子選擇的差異而不同之聚核苷 欠特疋’函盘於本發明。此外，包含本文中所提供之聚核皆 欠序列之基因的等位基因係處於本發明之範轉内。等位基 因為由於諸如核苷酸缺失、添加及/或取代之一或多種突 11 S462.doc -46- 200808352 變而改變之内源性基因。所得mRNA及蛋白質可（但並不必 須）具有經改變之結構或功能。等位基因可使用標準技術 (諸如雜交、放大及/或資料庫序列比較）來鑑別。 本發明之方法中所使用之trkB激動劑亦包括包含NT-4/5 (例如表1所示之人類NT_4/5)或其功能性肽片段之胺基酸序 列的融合蛋白質。生物學上有活性之NT-4/5多肽可與序列 融合，該等序列為諸如增強免疫反應性、促進多肽與載體 或載劑偶合或促進再折疊及/或純化之序列（例如，編碼諸 如Myc、衍生自流感病毒血球凝集素之ha、His-6、FLAG 之抗原決定基的序列）。此等序列可與NT_4/5多肽在N末端 或在C末端融合。另外，蛋白質或多肽可與增強其功能或 限疋其在細胞中之定位（諸如分泌序列）之其他蛋白質或多 肽融合。製備上述重組融合蛋白質之方法在此項技術中已 知。重組融合蛋白質可藉由此項技術中所熟知之方法來製 備、再折疊及分離。 本文中所述之NT-4/5多肽可經修飾以增加其在個體中之 半衰期。舉例而言，可使NT_4/5多肽聚乙二醇化以使以生 物活性之最小損失降低全身清除率。本發（亦提供包含與 PEG分子連接之NT-4/5多肽的組合物(包括醫藥㉟合物）。 在-些實施例中，PEG分子經由可逆鍵與抓仍多狀連 接。經聚乙二醇化之NT-4/5多肽之半衰期與未經聚乙二醇 化之NT-4/5多狀之半衰期相比可延長約2倍、5倍、ι〇倍、 15倍、20倍及30倍中之任一者以上。 口 聚乙二醇聚合物（PEG)可使用此項技術已知之方法與 118462.doc -47- 200808352 多肽之多個官能基連接。參見（例如）Roberts等人， Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002); Sakane等人P/mrm. 14:1085-91 (1997)。PEG可與多肽 上之以下官能基連接：胺基、羧基、經修飾或天然N末 端、胺基團及硫醇基。在一些實施例中，一或多個表面胺 基酸殘基係經PEG分子修飾。PEG分子可具有多種尺寸（例 如在約2至40 KDa之範圍内）。與NT-4/5多肽連接之PEG分 子可具有約 2000、10,000、15,000、20,000、25,000、 30,000、3 5,000、40,000 Da中之任一者的分子量。PEG分 子可為單鏈或分枝鏈。為使PEG與NT-4/5多肽連接，可使 用在一或兩個末端處具有官能基之PEG的衍生物。官能基 係基於NT-4/5多肽上之可用反應性基團的類型來選擇。使 衍生物與多肽連接之方法在此項技術中已知。Roberts等 人，Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002) 〇 NT-4/5多肽與PEG之間的鍵亦可為在個體中可裂解或天然 降解（可逆或可降解鍵）之鍵，其可改良半衰期而使活性損 失最小。NT-4/5多肽上之PEG鍵聯位點亦可藉由使表面殘 基突變成具有PEF反應性基團之胺基酸殘基（諸如半胱胺 酸）來產生。舉例而言，可使人類NT-4/5(SEQ ID N0:1)之 以下胺基酸突變用於PEG連接·· G1、V2、S3、E4、T5、 S9、RIO、T25、D26、R28、T29、V31、E37、E39、 L41、E43、A46、A47、G48、G49、S50、R53、D64、 N66 、 A66 、 E67 、 E68 、 G69 、 D82 、 R83 、 R84 、 H85 、 A104、Q105、G106、R107、V108、S125及 T127。此等突 118462.doc -48- 200808352 變可應用於其他物種中之相應殘基。 已產生若干經聚乙二醇化之NT_4/5且其係展示於美國專 利申請公開案第2005/0209148號及PCT WO 2005/082401之 貝例6及7中。可使成熟人類NT-4/5之位置50處之絲胺酸殘 基變成半胱胺酸以產生接著經聚乙二醇化之NT4_S5〇c， 其中PEG與半胱胺酸在位置5〇處連接。即(}之1^末端特異 性連接之一實例為使位置1處之殘基突變成絲胺酸或蘇胺 酸，接著聚乙二醇化，其中PEG與絲胺酸在位置丨處連 接。 NT-4/5多肽可藉由重組方式，亦即藉由表現編碼N孓4/5 多狀之核酸來產生。在重組細胞培養物中及視情況，（例 如）藉由生物檢定變異體之活性或藉由吸附於包含兔類抗· NT-4/5多株抗體（其將結合亦存在於原生NT—4/5中之變異體 的至少一個免疫抗原決定基）之免疫親和性管柱上來自細 胞培養物純化變異多肽。約40個殘基或更少之小型肽片段 係藉由活體外方法便利地製得。 可將編碼NT-4/5多肽之DNA選殖於表現載體中用於在宿 主細胞中表現蛋白質。編碼NT_4/5多肽之核酸之實例係描 述於美國專利申請公開案第2003/0203383號中。編碼呈其 成熟形式之NT-4/5多肽之DNA可在其胺基末端處與分泌信 號連接。此分泌信號較佳為通常引導自人類細胞活體内分 泌NT-4/5的NT-4/5前序列。然而，合適之分泌信號亦包括 來自其他動物NT-4/5之信號，來自NGF、NT-2或NT-3之信 说’病毒信號或來自相同或相關物種之經分泌之多肽的信 118462.doc -49- 200808352 號。任何宿主細胞（諸如大腸桿菌）可用於表現蛋白質或多 肽0 可純化所表現之NT-4/5多肽。儘管nt-4/5多肽當在無分 泌信號的情況下直接表現時亦可自宿主細胞溶解產物回 收，但其可以經分泌之蛋白質形式自培養基回收。可使用 此項技術中已知之蛋白質純化方法。產生NT_4/5多肽及純 化經表現之NT-4/5多肽之方法係描述於美國專利申請公開 案第2〇〇3/〇2〇3383號及美國專利第6，184,36〇號中。ΝΤ·4/5 多肽可根據此項技術中已知之方法在大腸桿菌中表現及再 折疊。亦可購得成熟人類ΝΤ-4/5(例如來自R&D Systems， Sigma and Upstate) 〇 抗-trkB激動劑多肽及抗體 本發明之方法中所使用之trkB激動劑亦包括抗_trkB激動 劑多肽，其包括抗-trkB激動劑抗體。抗__激動劑多肽 (例如抗體）應顯示以下特徵中之任意一或多者：（a)結合 trkB受體；（b)結合trkB受體且激活咖生物活性及/或由 trkB信號轉導功能調節之—或多個下游路徑；⑷當周邊投 予時結合姻受體且增加靈長類動物之體重及/或食物^ 入；⑷當周邊投予時結合刚受體且治療、㈣、逆轉或 改善靈長類動物之惡病質之一或多種症狀；⑷當周邊投予 時結合刚受體且治療、預防、逆轉或改善靈長類動物之 神經性厭食症之-或多種症狀；（f)t周邊投㈣結合咖 受體且治療、預防、逆轉或改善哺乳動物之類鸦片誘發之 °區吐之—或多種症狀；⑷促進咖受體二聚化及活化.及 118462.doc -50- 200808352 (h)增加trkB受體依賴性神經元存活及/或神經突外生長。 在一些實施例中，抗-trkB激動劑多肽（例如抗體）為多價 的且結合trkB受體之胞外域。已顯示能結合及交聯或二聚 化神經營養素受體之trk家族的免疫球蛋白活化此等受體且 在神經元中產生類似於暴露於神經營養素之結果。參見美 國專利第 6,656,465號及 PCT WO 01/98361。 trkB激動劑抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段 (例如Fab、Fab，、F(ab，）2、Fv、Fc等）、嵌合抗體、單鏈 (ScFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白質，及包含 所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他 經修飾之組態。抗體可為小鼠、大鼠、人類或任何其他起 源（包括擬人化抗體）。 在一些實施例中，多肽（包括抗體）結合trkB且並不顯著 與其他神經營養素受體（諸如相關神經營養素受體，trkA及/ 或trkC)交叉反應（結合）。激動劑抗-trkB多肽可結合人類 trkB。激動劑抗-trkB多肽亦可結合人類及齧齒動物trkB。 在一些實施例中，激動劑抗-trkB多肽可結合人類及大鼠 trkB。在一些實施例中，抗-trkB多肽可結合人類及小鼠 trkB。在一實施例中，多肽識別人類忭⑸胞外域上之一或 多個抗原決定基。在另一實施例中，抗體為識別人類trkB 胞外域上之一或多個抗原決定基的小鼠或大鼠抗體。在一 些貫施例中，多肽結合人類trkB且並不顯著結合來自其他 哺乳動物物種（在一些實施例中為脊椎動物物種）之trkB。 在—些實施例中，多肽結合人類trkB以及來自其他嗤乳動 118462.doc -51 - 200808352 物物種（在一些實施例中為脊椎動物物種）之一或多個 trkB。在另一實施例中，多肽識別選自靈長類動物、犬科 動物、貓科動物、馬科動物及牛科動物中之一或多者之 trkB上的一或多個抗原決定基。 在一些實施例中，抗-trkB激動劑抗體在活體外trkB受體 (例如人類trkB)活化（例如實例6中及US 2005/0209148及 PCT WO 2005/082401中所述之檢定）中具有小於約〇 〇1 ηΜ、0·1 nM、0.5 iiM、1 nM、5 nM、10 nM、50 nM或 1〇〇 nM中之任一者的EC”（最大有效濃度之一半）。 抗-trkB激動劑多肽（例如抗體）與trkB之結合親和力可為

約 500 nM、約 400 nM、約 300 nM、約 200 nM、約 1〇〇 nM、約 50 nM、約 10 nM、約 1 nM、約 500 PM、約 1〇〇 PM 或約50 PM中之任一者至約2 PM、約5 PM、約1〇 pM、約 15 pM、約20 PM或約40 PM中之任一者。在一些實施例 中，結合親和力為約1〇〇 nM、約50 nM、約1〇 nM、約！ nM、約500 PM、約1〇〇 pM或約5〇 pM或小於約5〇 pM中之 任一者。在一些實施例中，結合親和力為小於約丨〇〇 、 約 50 nM、約 10 nM、約 1 nM、約 500 pM、約 1〇〇 pM或約 50 PM中之任一者。在又一實施例中，結合親和力為約2 PM、約 5 PM、約 1〇 pM、約 15 pM、約 2〇 pM、約 4〇 pM或 大於約40 PM。如此項技術中所熟知，結合親和力可以Kd 或解離常數表示，且增加之結合親和力對應於降低之Kd。 確定抗體與trkB之結合親和力之一方式係藉由量測抗體 之單功能Fab片段之結合親和力。為獲得單功能Fab片段， 118462.doc -52- 200808352 抗體（例如IgG)可用木瓜蛋白酶裂解或重組地表現。抗體 之抗-trkB Fab片段之親和力可藉由表面電漿共振 (BIAcore3000TM表面電漿共振（SPR)系統，BIAcore，INC， Piscataway NJ)來確定。CM5晶片可根據供應商說明書用 N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二醯亞胺鹽酸鹽 (EDC)及N-經基丁二酸亞胺（NHS)來活化。可將人類trkB-Fc融合蛋白質（nhtrkBn)(或任何其他trkB，諸如大鼠trkB) 稀釋於10 mM乙酸鈉（pH 5.0)中且以0.0005 mg/mL之濃度 經由活化之晶片注射。使用橫越個別晶片通道之可變流動 時間，可達成抗原密度之兩個範圍：對於詳細動力學研究 為200-400個回應單位（RU)且對於篩檢檢定為500-1 000個 RU。晶片可用乙醇胺阻斷。再生研究已顯示Pierce溶離緩 衝劑（產品號 21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)與 4 M NaCl (2:1)之混合物有效移除結合的Fab同時對於超過 200次注射而言保持晶片上之htrkB之活性。HBS-EP緩衝劑 (0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 NaCl，3 mM EDTA， 0.005%界面活性劑P29)係用作BIAcore檢定之電泳緩衝 劑。將經純化之Fab樣品之連續稀釋液（〇·1-1〇χ據估計之 KD)以100 pL/min注射1 min且允許高達2 h之解離時間。 Fab蛋白質之濃度係使用已知濃度（如由胺基酸分析所確定） 之Fab作為標準藉由ELISA及/或SDS-PAGE電泳法來確定。 動力學締合速率（kQn)及解離速率（kQff)( —般在25°C下量測） 係藉由使資料與1:1 Langmuir結合模型擬合（Karisson，R. Roos? H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods I18462.doc -53- 200808352 心6··99-110)使用ΒΙΑ評估程式來同時獲得。平衡 解離常數（KD)值係以1^^/1^。11來計算。 在一些實施例中，抗-trkB激動劑多肽（包括抗體）具有受 損之效應功能。如本文中所使用，具有”受損之效應功能，， (與術語π免疫學上惰性”可互換使用）之抗體或多肽係指不 具有任何效應功能或具有降低之活性或效應功能之活性 (與具有未經修飾或天然產生之恆定區之抗體或多肽相比） 的抗體或多肽，例如在以下功能中之任意一或多者中無活 性或具有降低之活性·· a)觸發補體介導之溶解；b)刺激抗 體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC);及c)活化微神經膠 質細胞。效應功能活性可降低約10%、20%、30%、40%、 5 0%、60%、70%、80%、90%、95%、99%及 100% 中之任 一者。在一些實施例中，抗體結合trkB受體而不激發顯著 的補體依賴性溶解或細胞介導之目標破壞。舉例而言，怪 定區上之Fc受體結合位點可經修飾或突變以移除或降低與 某些 Fc 受體（諸如 FcyRI、FcyRII、FcyRIII及 /或 FcyRIV)之 結合親和力。為簡單起見’在實施例亦應用於多肽的條件 下將參考抗體。EU編號系統（Kabat等人，Sequences of

Proteins of Immunological Interest;第 5版 Public Health Service，National Institutes of Healthy，Bethesda，Md·， 1991)係用於指示恆定區（例如lgG抗體之恆定區）之哪個胺 基酸殘基改變或突變。在可於抗體及物種類型之間進行類 似變化的條件下，編號可用於特定類型之抗體（例如IgG 1) 或物種（例如人類）。 118462.doc -54- 200808352 在一些實施例中，特異性結合trkB受體之多肽（包括抗 體）包含具有受損效應功能的重鏈恆定區。重鏈怪定區可 具有天然產生之序列或為變異體。在一些實施例中，天然 產生之重鏈恒定區之胺基酸序列（例如）係由胺基酸取代、 插入及/或缺失而突變，藉以使恆定區之效應功能受損。 在一些實施例中，亦可使重鏈恆定區之以區之N—糖基化作 用改變（例如，可完全或部分移除），藉以使恆定區之效應 功能受損。 在一些實施例中，效應功能係藉由移除Fc區（例如在IgG 之CH2域中）之N-糖基化作用而受損。在一些實施例中，pc 區之N-糖基化作用係藉由使經糖基化之胺基酸殘基或為恆 定區中之糖基化識別序列之部分的側接殘基突變來移除。 其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸的三肽序列天冬醯胺 酸-X-絲胺酸（N-X-S)、天冬醯胺酸-X-蘇胺酸（Ν_χ_τ)及天 冬醯胺酸-X-半胱胺酸（ΝΚ)為碳水化合物部分與天冬醯 胺酸側鏈酶促連接用於Ν-糖基化作用的識別序列。使在恆 定區中三肽序列中之胺基酸之任一者突變得到經糖基化之 IgG。舉例而言，可使人類IgG1&IgG32N_糖基化作用位 點N297突變成A、D、Q、κ或H。參見Tao等人，J. Immunology 143:2595-2601 (1989);及 Jefferis 等人， Immunological Reviews 163:59-76 (1998)。據報導以 Gin、 His或Lys取代Asn-297之人類igGl及IgG3不結合人類FcyRI 且不活化對IgG 1的Clq結合能力完全喪失及對IgG3之結合 顯著降低之補體。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基 118462.doc -55- 200808352 酸N突變成胺基酸 M Q R 8、丁、乂、〜、丫中之任一者。在-些實施 例中使一肽序列中之胺基酸N突變成保守取代。在一些 實她例中’使二肽序列中之胺基酸x突變成脯胺酸。在一 些κ施例中，使三肽序列中之胺基酸S突變成A、D、E、 F、G、H、I、k、L、M、N、P、q、r、v、W、Y。在一 些實施例中，使三肽序列中之胺基酸τ突變成A、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、q、r、v、W、Y。在-些實施例中，使三肽序列中之胺基酸C突變成A、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、r、v、W、Y。在一 些實施例中’使三肽之後之胺基酸突變成p。在一些實施 例中’酶促移除恆定區中之N_糖基化作用（諸如N-糖苷酶 F、糖苷内切酶F1、糖苷内切酶F2、糖苷内切酶F3及糖苷 内切酶H)。移除N-糖基化作用亦可藉由在具有n-糖基化作 用缺乏之細胞株中產生抗體來達成。Wright等人，J Immunol. 160(7):3393-402 (1998)。 在一些實施例中，使與連接至恆定區之N-糖基化作用位 點之寡醣相互作用的胺基酸殘基突變以降低對FcyRI之結 合親和力。舉例而言，可使人類IgG3之F241、V264、 D265 突變。參見Lund等人，《/· 157:4963-4969 (1996) 〇 在一些實施例中，如PCT WO 99/58572及Armour等人， /仍所㈣40: 585-593 (2003) ; Reddy等人，j /mm關o/ogy 164:1925-1933 (2000)中所述，藉由修飾諸如 118462.doc -56- 200808352 人類IgG之233-236、297及/或327-331之區使效應功能受 損。PCT WO 99/58572及Armour等人中所述之抗體除定位 於目標分子之結合域以外包含具有與人類免疫球蛋白重鏈 之恆定區之全部或部分大體上同源的胺基酸序列之效應 域。此等抗體能結合目標分子而不觸發明顯的補體依賴性 溶解或細胞介導之目標破壞。在一些實施例中，效應域對 FcyRI、FcyRIIa及FcyRIII具有降低之親和力。在一些實施 例中，效應域能特異性結合FcRn及/或FcyRIIb。此等效應 域通常係基於衍生自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈 CH2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適合於在慢性 抗體療法中使用以避免習知抗體療法之發炎及其他不良反 應。在一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具有以下突變 之任一者的人類重鏈IgGl : 1) A327A330P331至 G327S330S331 ; 2) E233L234L235G236 至 G236 缺失之 P233V234A235 ; 3) E233L234L235 至 P233V234A235 ; 4) E233L234L235G236A327A330P331 至 G236 缺失之 P233V234A235G327S330S331 ; 5) E233L234L235A327A330P331 至 P233V234A235G327S330S331 ;及6)N297至A297或除N以外之任 何其他胺基酸。在一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具 有以下突變之人類重鏈IgG2 : A330P331至S330S331。在 一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具有以下突變之任一 者之人類重鏈IgG4 : E233F234L235G236至G236缺失之 P233V234A235 ； E233F234L235 至 P233V234A235 ；及 S228L235至P228E235 。 118462.doc -57- 200808352 恆定區亦可經修飾以使補體活化作用受損。舉例而言， 在結合補體之C1組份後IgG抗體之補體活化作用可藉由使 C1結合性基序（例如Clq結合性基序）中之恆定區中之胺基 酸犬變來降低。據報導對於人類IgG1之D27〇、K322、 Ρ329、Ρ331中之每一者的Ala突變顯著降低抗體結合clq及 活化補體的能力。對於鼠類IgG2b而言，Clq結合性基序構 成殘基E318、K320及K322。Idusogie等人，丄^則⑽/〇灯 164.4178-4184 (2000)，Duncan等人，Nature 322: 738-740 (1988) 〇 咸#對於鼠類IgG2b所鑑別之C1 q結合性基序E3 18、 K320及K322對其他抗體同型而言為常見的。Duncan等 人，Nature 322: 738-740 (1988)。對於 IgG2b 之 Clq 結合活 性可藉由用在其側鏈上具有不當官能度之殘基置換三個指 定殘基中之任一者來消除。並不必要僅用Aia置換離子型 殘基以消除C 1 q結合。亦可能使用其他經烧基取代之非離 子型殘基（諸如Gly、Ile、Leu或Val)或諸如Phe、Tyr、Trp 及Pro之芳族非極性殘基替代三個殘基中之任一者以消除 Clq結合。另外，亦可能使用諸如Ser、Thr、Cys及Met之 極性非離子型殘基替代殘基32〇及322而非318以消除Clq結 合活性。

本發明亦提供具有受損之效應功能之抗體，其中該抗體 具有經修飾之鉸鏈區。人類IgG對於其Fc受體之結合親和 力可藉由修飾鉸鏈區來調節。Canfield等人，J. Me A 173:1483-1491 (1991); Hezareh等人，J.心〇/. 75:12161- 118462.doc - 58- 200808352 12168 (2001)，Redpath等人，⑽ /所所㈣o/ogj； 59:720- 727 (1998)。可使特定胺基酸殘基突變或缺失。經修飾之 鉸鏈區可包含衍生自與CH1域之抗體類別或亞類不同之抗 體類別或亞類之抗體的完整鉸鏈區。舉例而言，IgG類抗 體之恆定域（CH1)可與IgG4類抗體之鉸鏈區連接。或者， 新鉸鏈區可包含天然鉸鏈之一部分或其中重複之每一單元 係竹生自天然欽鍵區的重複單元。在一些實施例中，天然 鉸鏈區係藉由使一或多個半胱胺酸殘基轉化成中性殘基 (諸如丙胺酸）或藉由使經合適置放之殘基轉化成半胱胺酸 殘基而改變。美國專利第5,677,425號。使用技術公認之蛋 白質化學及較佳遺傳工程技術且如本文中所述進行該等改 變。 特異性結合trkB受體及融合至具有受損效應功能之重鏈 恆定區的多肽亦可用於本文中所述之方法。該等融合多肽 之一實例為免疫黏附素。參見（例如）美國專利第0，153,189 亦可使用此項技術中已知之製備具有受損效應功能之抗 體的其他方法。 具有經修飾之恆定區之抗體及多肽可在一或多個檢定中 貝J戈以。平估與起始抗體相比在生物活性中效應功能下降之 程度。舉例而言，具有經改變之Fc區之抗體或多肽結合補 體或FC受體（例如微神經膠質細胞上之Fc受體）或經改變之 、鏈區的此力可使用本文中所揭示之檢定以及任何技術公 '忍之檢定來評估。PCT W0 99/58572 ’· Armour等人， 118462.doc -59- 200808352

Molecular Immunology 40: 585-593 (2003) ； Reddy^ A. ^ J

Immimology 164:1925-1933 (2000) ; Song等人，π/ec"州 and Immunity 70:5177-5184 (2002) 〇 抗-trkB激動劑抗體亦可使用表現trkB之一或多個胞外域 的免疫原來製得。免疫原之一實例為trkB高度表現之細 胞，其可如本文中所述來獲得。可使用之免疫原之另一實 例為可溶蛋白質（諸如trkB免疫黏附素），其含有trkB受體 之胞外域或該胞外域之一部分。 如本文中進一步描述，使宿主動物免疫之途徑及方案一 般與用於抗體刺激及產生之經建立及習知技術保持一致。 產生人類及小鼠抗體之一般技術在此項技術中已知且描述 於本文中。 預期包括人類之任何哺乳動物受檢者或來自其之抗體產 生細胞可經操作以充當產生哺乳動物（包括人類）融合瘤細 胞株之基礎。通常，用一定量之免疫原（包括如本文中所 述）腹膜内接種宿主動物。 融合瘤可使用 Kohler，B.及 Milstein，c· (1975) 25 6:495-497之一般體細胞雜交技術自淋巴細胞及永生化骨 趙瘤細胞來製備或如Buck，D. w·等人，（1982) h 18:377-381來修飾。包括（但不限於）X63_Ag8 653之可用骨 髓瘤株及來自 Salk Institute，Cell Distributi〇n c如如，s抓 Diego，Calif·，USA•之彼等骨髓瘤株可用於雜交中。一般 口 "亥技術涉及使用融合原（諸如聚乙二醇）或夢由孰習 此項技術者所熟知之電方式使骨髓瘤細胞與淋巴細胞融 118462.doc -60- 200808352 合。融合後’將細胞自融合培養基分離且在選擇性生長培 養基（諸如次黃嘌呤_胺基蝶呤_胸苷（HAT)培養基）中生長以 消除未雜交之本體細胞。用或未用血清補充之本文中所述 之培養基之任一者可用於培養分泌單株抗體之融合瘤。作 為細胞融合技術之另一替代方法，EBv永生化B細胞可用 於產生本發明之抗-trkB單株抗體。必要時，使融合瘤擴展 及次選殖’且藉由習知免疫檢定程序（例如放射性免疫檢 疋、酶免疫檢定或螢光免疫檢定）檢定上清液的抗免疫原 活性。 可用作抗體來源之融合瘤涵蓋產生對trkB有特異性之單 株抗體之親本融合瘤的所有衍生物、子代細胞，或其一部 分。 產生該等抗體之融合瘤可使用已知程序在活體外或活體 内生長。單株抗體必要時可藉由習知免疫球蛋白純化程序 (諸如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾）自培養 基或體液分離。不當之活性若存在可（例如）藉由使製劑在 附著於固相之免疫原製成之吸附劑之上流動且自免疫原溶 離出或釋放出所要抗體來移除。用人類或其他物種之trkB 受體’或人類或其他物種之trkB受體之片段，或含有與在 待免疫之物種中為免疫原性之蛋白質（例如透孔螺血藍蛋 白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制 劑）共#厄的目標胺基酸序列之人類或其他物種之受體或 片段，使用雙功能劑或衍生劑（例如馬來醯亞胺节酸基石盖 酸基丁二醯亞胺酯（經半胱胺酸殘基共軛）、N-經基丁二酸 118462.doc -61 - 200808352 亞胺（經離胺酸殘基）、glytaradehyde、丁二酸gf、SOC12或 R1N=C=NR(其中R及R1為不同烧基））使宿主動物免疫可得 到抗體（例如單株抗體）群。免疫原之另一實例為trkB高度 表現之細胞，其可自重組方式或藉由自表現高含量之trkB 之天然來源分離或富集細胞來獲得。此等細胞可為人類或 其他動物起源，且當直接經分離時可用作免疫原，或可以 使免疫原性增加或trkB表現（或trkB片段表現）增加或富集 的方式來加工。該加工包括（但不限於）：用經設計以增加 細胞或其片段之穩定性或免疫原性的試劑（諸如盤、戊二 酸、乙醇、丙酮及/或多種酸）處理該等細胞或其片段。此 外’在該處理之前或之後，可加工細胞以使所要免疫原 (在此狀況下為trkB或其片段）富集。此等加工步驟可包括 此項技術中熟知之膜分級技術。 必要時，可為所關注之抗-trkB抗體（單株或多株）定序且 接著可將聚核苷酸序列選殖至載體中用於表現或增殖。可 將編碼所關注之抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且 接著可使宿主細胞擴展及冷凍以備將來使用。作為替代方 法，可將聚核苷酸序列用於遺傳操作以使抗體，，擬人化，，或 改良抗體之親和性力或其他特徵。舉例而言，可使恆定區 工程化成更類似人類恆定區以避免當抗體用於人類臨床試 驗及治療時的免疫反應。可需要以遺傳學方式操作抗體序 列以獲得對trkB受體之更高親和力及在活化化⑸受體上之 更大功效。熟習此項技術者將顯而易見，可對抗七⑽抗體 作出一或多種聚核苷酸變化且仍維持其對trkB胞外域或 118462.doc -62- 200808352 trkB之抗原決定基的結合能力。 使單株抗體擬人化有四個一般步驟。其為：（1)確定起 始抗體輕及重可變域之核苷酸及經預測之胺基酸序列；（2) 设計擬人化抗體’亦即決定哪個抗體構架區在擬人化過程 中使用，（3)實際擬人化方法/技術；及（4)轉染及表現擬人 化抗體。參見（例如）美國專利第4,816,567號、第5,8〇7,715 號、第 5,866,692 號、第 6,331，415 號、第 5,530，101號、第 5,693,761 號、第 5,693,762 號、第 5,585,089 號、第 6，180,370號及第6,548,64〇號。舉例而言，可使恆定區工程 化成更類似人類恒定區以避免當抗體用於人類臨床試驗及 治療時的免疫反應。參見（例如）美國專利第5,997,867號及 第 5,866,692號。 已描述包含衍生自非人類免疫球蛋白之抗原結合位點之 許多”擬人化”抗體分子，其包括具有與人類恆定域融合之 齧齒動物或經修飾之齧齒動物V區及其相關互補判定區 (CDR)之嵌合抗體。參見（例如）Winter等人349:293-299 (1991) ; Lobuglio 等人尸π Wi· dead· 6W· 86:4220-4224 (1989); Shaw等人138:4534-4538 (1987);及 Brown 等人 47:3577-3583 (1987)。 其他參考文獻描述在與適當人類抗體怪定域融合前移植至 人類支撐構架區（FR)中之齧齒動物CDR。參見（例 如）Riechmann 等人 332:323-327 (1988); Verhoeyen 等人 239:1534-1536 (1988);及 jones 等人爪 321:522-525 (1986)。另一參考文獻描述藉由經重組修飾之 118462.doc -63 - 200808352 齧齒動物構架區所維持之齧齒動物CDR。參見（例如）歐洲 專利公開案第519,596號。此等，，擬人化，，分子經設計以使限 制彼等部分在人類接受者中之治療應用之持續時間及有效 性的對齧齒動物抗人類抗體分子之不欲之免疫反應敢小 化。抗體恆定區可經工程化以便其在免疫學上為惰性的’ 例如不觸發補體介導之溶解或不刺激抗體依賴性細胞介導 之細胞毒性（ADCC)。在其他實施例中，恆定區係如心广丄 /所廳㈣/· (1999) 29:2613-2624; PCT申請案第 PCT/GB99/ 01441號；及/或UK專利申請案第9809951.8中所述來修 飾。 參見（例如）PCT/GB99/01441 ; UK專利申請案第 980995 1.8號。亦可利用之使抗體擬人化的其他方法係揭 示於 Daugherty 等人，7V^/· 及〜· 19:2471-2476 (1991) 及美國專利第6，180,377號、第6,054,297號、第5,997,867 號、第 5,866,692號、第 6,210,671號、第 6,350,861號及 PCT 公開案第WO 01/27160號中。 在又一替代方法中，可藉由使用已經工程化以表現特定 人類免疫球蛋白之市售小鼠獲得完全人類抗體。經设计以 產生更合需要（例如完全人類抗體）或更穩固之免疫反應的 轉殖基因動物亦可用於產生擬人化或人類抗體。該技術之 實例為來自 Abgenix，Inc.(Fremont，CA)之 XenomouseTMA 來自 Medarex，Inc.(Princeton，NJ)之 HuMAb-Mouse® 及 TC Mouse™ o 在一替代方法中，抗體可使用此項技術中已知之任何方 118462.doc -64- 200808352 法以重組方式製得及表現。在另一替代方法中，抗體可藉 由噬菌體呈現技術以重組方式製得。參見（例如）美國專利 第 5,565,332 號、帛 5,580,717 號、第 5,733,743 號及第 6.265J50號，·及 Winter等人，」_•細 ^顧―12:433-455 (1994)。或者，噬菌體呈現技術（McCafferty等人， TVa仏π 348:552-553 (1990))可用於自來自未經免疫之供體 之免疫球蛋白可變（V)功能部位基因譜型，於活體外產生 人類抗體及抗體片段。根據此技術，於讀碼框内選殖抗體 V功能部位基因至絲狀噬菌體之主要或次要鞘蛋白基因（諸 如Μ13或fd)中，且以功能性抗體片段之形式呈現於噬菌體 粒子之表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股 DNA複本，因此依據抗體功能特性選拔結果，亦選拔到編 碼顯示彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體會模擬8細 胞之一些特性。噬菌體可依多種形式進行呈現；其概述可 參見（例如）J〇hnson，Kevin S·及 Chiswell，David J·， 少 3，564_57i (1993)。v基因片 段之若干來源可用於噬菌體呈現。clacks〇n等人，π 352:624-628 (1991)自衍生自經免疫小鼠之脾的ν基因之小 型隨機組合庫分離抗噁唑酮抗體之不同陣列。基本上可按 照 Mark等人，/· Μο/ϋ/ 222:581-597 (1991)4Griffith等 人，丄12:725-734 (1993)所述之技術建構來自未經 免疫之人類供體之V基因譜型且分離出針對不同陣列抗原 (包括自體抗原）之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因以 高速累積突變（體細胞超突變）。所引入之一些變化會賦予 118462.doc -65 - 200808352 較局親和力，且呈現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞在 隨後抗原對抗期間優先複製及分化。此天然過程可藉由使 用稱作”鏈改組，，之技術來仿效。Marks，等人， 们⑽/· 10:779_783 (1992)。在此方法中，藉由噬菌 體呈現所獲得之”初級”人類抗體之親和力可藉由用自未經 免疫之供體所獲得之V功能部位基因之天然產生之變異體 (譜型）的譜型相繼置換重鏈及輕鏈v區基因來改良。此技 術得以產生在pM-nM範圍内具有親和力之抗體及抗體片 段。製造極大的噬菌體抗體譜型（亦稱作”所有母庫的策 略已由Waterhouse等人說明於愚c/ 士油21:2265- 2266 (1993)。基因改組亦可用於自齧齒動物抗體衍生人類 抗體，其中该人類抗體具有與起始齧齒動物抗體類似之親 和力及特異性。根據亦稱作”抗原決定基印記，，之此方法， 用人類V功能部位基因譜型置換藉由噬菌體呈現技術所獲 知之齧齒動物抗體之重鏈或輕鏈V功能部位基因，產生齧 齒動物-人類嵌合體。選拔抗原之結果得以分離能夠恢復 功能性抗原結合位點之人類可變區，亦即抗原決定基支配 (印記）搭配物的選擇。當使過程重複以置換其餘齧齒動物 V功能部位時，即獲得人類抗體（參見PCT公開案第w〇 93/06213號，公開於1993年4月la)。與傳統上藉由CDR移 植使齧齒動物抗體擬人化之方法不同，此技術提供完全人 類抗體’其不具有源自齧齒動物之架構或CDR殘基。顯 然’儘管上述論述係關於擬人化抗體，但所論述之一般原 則可應用於定製抗體以用於（例如）犬科動物、貓科動物、 118462.doc -66- 200808352 靈長類動物、馬科動物及牛科動物。 抗體可為雙特異性抗體，對至少兩種不同抗原具有結合 特異性之單株抗體可使用本文中所揭示之抗體來製備。製 備雙特異性抗體之方法在此項技術中已知（參見（例 如）Suresh等人，1986, 心仏—叮厂則/〇灯 121:210)。 傳統上’重組產生雙特異性抗體係基於共同表現兩個免疫 球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩個重鏈具有不同特異性 (Millstein及 Cuello，1983, 305，537-539)。 根據製備雙特異性抗體之一方法，使具有所要結合特異 性（抗體··抗原組合位點）之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域 序列融合。該融合較佳具有包含至少一部分之鉸鏈、cH2 及CH3區之免疫球蛋白重鏈恆定域。較佳使含有為輕鏈結 合所必需之位點的第一重鏈恆定區（CH1)存在於融合之至 J 一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合及必要時免疫球蛋 白輕鏈之DNA插入分離的表現載體中，且共同轉染至合適 之侣主生物體中。當在構建中所使用之三個多肽鏈的不等 比率提供最佳產率時，此提供在實施例中調整三個多肽片 段之相互比例的極大靈活性。然而，f等比率之至少兩個 多肽鏈的表現造成高產率或當比率並非特別重要時，可能 將兩個或全部三個多狀鏈之編碼序列插人—表現載體中。 在方法中，雙特異性抗體一方面包含具有第一結合特 異性之雜交免疫球蛋白重鏈，且另一古品a人 夏鏈且为方面包含雜交免疫球 鏈·輕鏈對（提供第二結合特異性）。僅在-半雙特異 刀子中具有免疫球蛋白輕鏈之不對稱結構有利於自不欲 118462.doc -67- 200808352 之免疫球蛋白鏈組合分離所要的雙特異性化合物。此方法 係描述於1994年3月3日公開之PCT公開案第WO 94/04690 號中。 包含兩個共價連接之抗體的雜共軛抗體亦處於本發明之 範疇内。該等抗體已用於使免疫系統細胞靶向不欲之細胞 (美國專利第4,676,980號），且用於治療HIV感染（PCT公開 案第 WO 91/00360 號及第 WO 92/200373號，及 EP 03089)。 雜共軛抗體可使用任何便利之交聯方法製得。合適之交聯 劑及技術在此項技術中係熟知的，且描述於美國專利第 4,676,980號中。 抗體可藉由首先分離自宿主動物所製成之抗體，獲得基 因序列且使用該基因序列以在宿主細胞（例如Ch〇細胞）中 重組地表現抗體來以重組方式製得。可使用之另一方法為 在植物（例如煙草）、轉殖基因牛奶或其他生物體中表現抗 體序列。已揭示在植物或牛奶中重組地表現抗體之方法。 參見（例如）Peeters 等人（2001) 19:2756;L〇nberg， Ν·及 D· Huszar (1995) /此心v. /_龍〇/ 13:65 ;及 p〇u〇ck 等人（I999) «7 /mm關〇/ Me Ao心2：31:147。製備抗體之衍生 物（例如擬人化、單鏈等）之方法在此項技術中已知。 嵌合或雜交抗體亦可使用合成蛋白質化學之已知方法 (包括涉及交聯劑之彼等方法）於活體外製備。舉例而言， 免疫毒素可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵來建 構。為達成此目的，合適之試劑之實例包括亞胺基硫醇醋 及曱基-4-巯基丁醯亞胺酯。 118462.doc -68 - 200808352 亦可產生單鏈Fv片段，諸如niades等人，1997， 409:437-441中所述。使用各種鍵聯劑使該等單鏈 片段偶合係描述於Kortt等人，1997，Proiek £叩/邮 10:423-433中。用於重組製造及抗體操作之多種技術在此 項技術中係熟知的。 抗體可如1999年11月18日公開之PCT公開案第W0 99/58572號中所述來修飾。此等抗體除定位於目標分子之 結合域以外包含具有與人類免疫球蛋白重鍵之恒定域之全 部或部分大體上同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能 結合目標分子而不觸發顯著的補體依賴性溶解或細胞介導 之目標破壞。較佳地，效應域能特異性結合FcRn及/或

FqRIIb。此等效應域通常係基於衍生自兩個或兩個以上 人類免疫球蛋白重鏈CH2域之嵌合域。以此方式修飾之抗 體較佳係在杈性抗體療法中使用以避免習知抗體療法之發 炎及其他不良反應。 措由使宿主動物免疫或以重組方式製得之抗體應顯示本 文中所述之trkB激動劑活性中之任意一或多種。 免疫檢定及流式細胞儀分選技術（諸如榮光活化細胞分 選（FACS))亦可用於分離對咖有特異性之抗體。

抗》體可結合至許& I PI "载別。載劑可有活性及/或惰 性。熟知載劑之實例包括聚 ^ ^ α 円卹來本乙烯、聚乙烯、葡 水糖、耐綸（nylon)、澱粉酶、 素、聚丙烯醯胺、瓊F糖 …經修飾之纖維 的㈣填曰糖及磁鐵礦。為達成本發明之目 的，載劑之性質可為^月之目 个j /合的。熟習此項技術者會 118462.doc -69- 200808352 瞭解結合抗體之其他合適載劑，或將能夠使用常規實驗確 定該等載劑。 編碼激動劑抗_trkB抗體之DNA可如此項技術中所知來 疋序。一般而吕，單株抗體易於使用習知程序（例如，藉 由使用月b特異性結合編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的 寡核苷酸探針）來分離及定序。融合瘤細胞係充當該〇]〇1^八 之較佳來源。一旦分離，則可將DNA置於表現載體（諸如 PCT公開案第WO 87/04462中所揭示之表現載體）中，接著 將其轉染至並不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞（諸如大 腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CH0)細胞或骨 髓瘤細胞）中以獲得在重組宿主細胞中合成單株抗體。參 見（例如）PCT公開案第W0 87/04462號。DNA亦可藉由（例 如）用人類重鏈及輕鏈恆定域的編碼序列取代同源氣類序 列（Morrison等人，尸roc· Λ/βί/αΙ 5W· 81: 6851 (1984))¾ 藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或部分與免疫 球蛋白編碼序列共價連接來修飾。以彼方式，所製備之 Π叙合"或π雜交"抗體具有本文中之抗-trkB單株抗體的結合 特異性。如本文中所述，編碼激動劑抗七kB抗體（諸如其 抗原結合片段）之DN A亦可用於在所要細胞中傳遞及表現 激動劑抗-trkB抗體。DNA傳遞技術將在本文中進一步描 述。 抗-trkB抗體可使用此項技術中所熟知之方法來表徵。舉 例而言，一方法為鑑別其所結合之抗原決定基，包括確定 抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭檢定、基因片段表現 118462.doc -70- 200808352 檢定及基於合成肽之檢定，如（例如）Harlow及Lane，[/以·％ Antibodies， a Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999之第 11章中所述。在另一實例中，抗原決定基定位可用於確定 抗-trkB抗體所結合之序列。抗原決定基定位可購自多種來 源，例如 Pepscan Systems(Edelhertweg 15，8219 PH Lelystad，The Netherlands)。抗原決定基可為線性抗原決 定基（亦即包含於胺基酸之單一伸展段中）或由並不必需包 含於單一伸展段中之胺基酸的三維相互作用所形成之構形 抗原決定基。可（例如重組地）分離或合成不同長度（例如長 度為至少4-6個胺基酸）之肽且將其用於使用抗-trkB抗體之 結合檢定中。在另一實例中，抗-trkB抗體所結合之抗原決 定基可在系統性篩檢中藉由使用衍生自trkB細胞外序列之 重疊肽且由抗-trkB抗體確定結合性來確定。根據基因片段 表現檢定，隨機或由特定遺傳構造使編碼trkB之開放閱讀 框架分段且確定trkB之經表現之片段與待測試之抗體的反 應性。舉例而言，可藉由PCR產生基因片段且接著在放射 性胺基酸存在下活體外轉錄及翻譯至蛋白質中。抗體與經 放射性標記之trkB片段的結合隨後係藉由免疫沉殿反應及 凝膠電泳法來確定。某些抗原決定基亦可藉由使用在噬菌 體粒子（噬菌體庫）表面上呈現之隨機肽序列之大型庫來鑑 另|J ° 可用於表徵抗-trkB抗體之另一方法為使用用已知結合相 同抗原（亦即trkB胞外域）之其他抗體進行的競爭檢定以確 118462.doc -71 - 200808352 定抗-trkB抗體是否結合與其他抗體相同之抗原決定基。競 爭檢定為熟習此項技術者所熟知。適用於競爭檢定之抗體 之實例包括以下抗體··抗體6.1.2、6.4.1、2345、2349、 2.5.1、2344、2248、2250、2253 及 2256 〇 參見 PCT 公開案 第 WO 01/98361 號。 抗原決定基定位亦可使用如PCT公開案第WO 01/98361 號中所述之功能部位交換突變來進行。一般而言，此方法 適用於不顯著與trkA或trkC交叉反應的抗-trkB抗體。trkB 之功能部位交換突變體可藉由用來自trkC或trkA之相應域 置換trkB之胞外域製得。各激動劑抗-trkB抗體與各種功能 部位交換突變體之結合可使用ELISA或此項技術中已知之 其他方法來評估且與其與野生型（原生）trkB之結合進行比 較。在另一方法中，可進行丙胺酸掃描。使抗原之個別殘 基，trkB受體系統性突變成另一胺基酸（通常為丙胺酸）， 且藉由使用ELISA或此項技術中已知之其他方法測試經修 飾之trkB結合抗體的能力來評估該等變化之作用。 BDNF多肽 在本發明之方法中所使用之trkB激動劑包括BDNF多 肽。如本文中所使用，’’BDNF多肽”包括天然產生之成熟 蛋白質（可互換稱作nBDNF”）（諸如美國專利第5，180,820號 中所示之成熟人類BDNF)及BDNF之天然產生之胺基酸序 列變異體；BDNF之胺基酸序列變異體；成熟BDNF (諸如 人類）之肽片段及該等胺基酸序列變異體；及成熟BDNF及 該等胺基酸序列變異體及肽片段之經修飾之形式，其中多 118462.doc -72- 200808352 肽或肽已藉由用除天然產生之胺基酸以外之部分取代來共 價修飾，只要胺基酸序列變異體、肽片段及其經修飾之形 式顯示trkB激動劑及/或天然產生之成熟BDNF蛋白質之一 或多種生物活性。trkB激動劑亦包括包含本文中所述之 BDNF多肽實施例中之任一者的融合蛋白質及共軛物，例 如與延長半衰期部分（諸如PEG或肽）共軛或融合之BDNF多 肽。在研究中之胺基酸序列變異體、肽片段（包括變異體 之片段）或其經修飾之形式不包括任何動物物種之NGF、 NT-4/5或NT-3。BDNF多肽包括本文中所述之任意一或多 個實施例。舉例而言，BDNF多肽包含具有一或多個胺基 酸插入、缺失或取代之天然產生之序列。 在一些實施例中，BDNF多肽為哺乳動物BDNF多肽，其 可為天然產生之哺乳動物BDNF，或衍生自天然產生之哺 乳動物BDNF且具有不與天然產生之非哺乳動物BDNF之任 何部分匹配之序列的BDNF多狀。在一些實施例中，BDNF 多肽為人類BDNF多肽，其可為天然產生之人類BDNF，或 衍生自天然產生之人類BDNF且具有不與天然產生之非人 類BDNF之任何部分匹配之序列的BDNF多肽。 包括本發明之變異體、肽片段、BDNF多肽（包括天然產 生之BDNF)之經修飾之形式、融合蛋白質及共軛物之 BDNF多肽係由以下特徵中之任意（一或多者）來表徵：（a) 結合trkB受體；（b)結合trkB受體且激活trkB生物活性及/或 由trkB信號轉導功能調節之一或多個下游路徑；（c)當周邊 投予時結合trkB受體且增加靈長類動物之體重及/或食物攝 118462.doc -73 - 200808352 入；（d)當周邊投予時結合trkB受體且治療、預防、逆轉或 改善靈長類動物之惡病質之一或多種症狀；（e)當周邊投予 時結合trkB受體且治療、預防、逆轉或改善靈長類動物之 神經性厭食症之一或多種症狀；（f)當周邊投予時結合trkB 受體且治療、預防、逆轉或改善哺乳動物之類鴉片誘發之 嘔吐之一或多種症狀；（g)促進trkB受體二聚化及活化；及 (h)增加trkB受體依賴性神經元存活及/或神經突外生長。 因此，所有BDNF多肽（包括變異體、片段及經修飾之形 式）具如上所述之功能。 變異體之生物活性可使用此項技術中已知之方法及本文 中所述之方法在活體外及活體内測試。BDNF多肽與天然 產生之BDNF蛋白質相比可具有增強之活性或降低之活 性。在一些實施例中，對於上述（或此項技術中已知）之一 或多種生物檢定，功能上等效之變異體與衍生出BDNF多 肽之原生BDNF蛋白質相比具有至少約50%、60%、70%、 75%、80%、8 5%、90%或95%之活性中之任一者。在一些 實施例中，功能上等效之變異體在活體外trkB受體活化（例 如實例 6 中及 US 2005/0209148及 PCT WO 2005/082401 中所 述之檢定）中具有小於約〇·〇1 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM 或100 nM中之任一者的EC5G(最大有效濃度之一半）。 BDNF之胺基酸序列變異體包括具有由於在天然產生之 BDNF (例如成熟人類BDNF)之序列内一或多個胺基酸殘基 的插入、缺失及/或取代而不同於天然產生之BDNF之胺基 酸序列的多肽。胺基酸序列變異體一般將有至少約65%、 118462.doc -74- 200808352 70%、75%、80% ' 85%、90%、95% ' 96%、97%、98% 或 99%與任何天然產生之BDNF (諸如成熟人類BDNF)相同。 在一些實施例中，變異體有至少約70%與成熟人類BDNF 之胺基酸序列相同。在一些實施例中，變異體有至少約 85%與成熟人類BDNF之胺基酸序列相同。在一些實施例 中，變異體有至少約90%與成熟人類BDNF之胺基酸序列 相同。在一些實施例中，變異體有至少約95%與成熟人類 BDNF之胺基酸序列相同。 明顯地，（例如）將BDNF轉化成NGF、BDNF或NT-3之該 等變化不包括於本發明之範疇内。因此，儘管引入胺基酸 序列變化之位點經預定，但突變本身之性質無須預定。舉 例而言，為使給定位點處之突變效能最優化，在目標密碼 子或區處進行ala掃描或隨機突變發生且篩檢最佳所要活性 之經表現之BDNF變異體。 胺基酸序列缺失一般係在約1至30個殘基、更佳約1至10 個殘基之範圍内，且通常為鄰近的。可將缺失引入 BDNF、NGF、NT-3及NT-4/5中之低同源性區中以修飾 BDNF之活性。在與NT-4/5、NT-3及NGF大體上同源之區 中來自BDNF之缺失更有可能更顯著地修飾BDNF之生物活 性。可選擇連續缺失之數目以保留受影響域中之BDNF的 三級結構（例如β折疊片或α螺旋）。 胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一千個或一千個 以上殘基之多肽的長度範圍内之胺基及/或羧基末端融 合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列内插入。序列内插 118462.doc -75- 200808352 入（亦即在成熟BDNF序列内插入）一般可在約1至1〇個殘 基、更佳1至5個、最佳1至3個之範圍内。末端插入之一實 例包括異源N末端信號序列與BDNF分子之N末端融合以促 進自重組宿主分泌成熟BDNF。該等信號一般將與所需宿 主細胞同源且包括大腸桿菌之STII或ipp、酵母之α因子， 及病毒信號（諸如哺乳動物細胞之疱疹gD)。其他插入包括 多肽與BDNF之N末端或C末端融合。 另一組變異體包括其中在BDNF中之至少一個胺基酸殘 基及較佳僅一個胺基酸殘基已被移除且不同殘基插入其位 置中的彼等變異體。一實例為精胺酸及離胺酸經其他胺基 酸置換以使BDNF對由絲胺酸蛋白酶進行之蛋白質水解有 抵抗性，進而產生更穩定之BDNF變異體。取代型突變發 ，生所最為關注之位點包括其中在BDNF、NGF、NT-3及NT-4/5 中所發現之胺基酸在侧鏈大小、電荷或疏水性方面大體上 不同，而其中在NGF、NT-3&NT-4/5之各種動物類似物内 (例如在所有動物NGF、所有動物NT-3及所有BDNF中）在選 定位點處存在高度同源性之位點。此分析將突出涉及區分 營養因子之活性的殘基，且由此在此等位點處之變異將影 響該等活性。所關注之其他位點為其中殘基在所有動物物 種BDNF、NGF、NT-3及NT-4/5中皆相同之彼等位點，此 構形度表明達成為所有四個因子所共有的生物活性之重要 性。 舉例而§，一或多個胺基酸之取代包括保守取代。製造 保守取代之方法在此項技術中已知。舉例而言，ala (Α)可 118462.doc '76- 200808352 經val、leu、ile取代，較佳經val取代；arg (r)可經lys、 gin、asn取代，較佳經iys取代；asn (n)可經gin、his、 lys、arg取代’較佳經gin取代·，aSp (〇)可經giu取代；cys (C)可經ser取代’ gin (Q)可經aSn取代；giu (e)可經asp取 代 ’ gly (G)可經 pro取代；his (H)可經 asn、gin、lys、arg 取代’較佳 Ik arg取代，iie (!)可經 ieil、val、met、ala、 phe、正白胺酸取代’較佳經leu取代；卜以（L)可經正白胺 酸、lie、val、met、ala、phe取代，較佳經 ile取代；lys (K)可經arg、gin、asn取代，較佳經arg取代；瓜以（m)可經 leu、phe、ile取代，較佳經leu取代；phe (F)可經丨叫、 val ile 取代，較佳經ieu取代；卩⑺（p)可經取代； ser (S)可經thr取代；thr (T)可經ser取代；trp (w)可經tyr 取代；^厂〇〇可經化1)、131^、比^以取代，較佳經1)1^取 代’ val (V)可經、leu、⑽t、pk、ala、正白胺酸取 代，較佳經leu取代。 在功能上㈤實胃性㈣可藉由選擇其對維持⑷在取代區 域中之夕肽月架之結構(例如呈片式或螺旋構形）、⑻在目 標位點處之分子的電荷或疏水性或⑷韻之大小的作用方 面』著不同的取代來完成。基於常見側鏈特性將天然產生 之殘基分組(其中一些殘基可屬於若干功能組” ⑴正爪水陡·正白胺酸、met、ala、va卜leu、ile ; (2) 中性親水性·· cys、咖、f (3) 酸性·· asp、giu ; ⑷驗性：asn、gln、his、lys、arg; 118462.doc -77- 200808352 (5) 影響鏈定位之殘基：gly、pro ;及 (6) 芳族·· trp ' tyr、phe。 非保守取代需要將此等類別中之一成員換成另一成員。 BDNF之胺基酸序列變異體可為天然產生的或可由合成 來製備（諸如藉由將適當核苷酸變化引入先前經分離之 BDNF DNA中或藉由活體外合成所要變異多肽）。如上文所 才曰不，该等變異體可包含在成熟BDNF之胺基酸序列（例如 表1所示之序列）内一或多個胺基酸殘基的缺失或插入或取 代。製造缺失、插入及取代之任何組合以得到bdnf之胺 基酸序列變異體，其限制條件為所得變異多肽擁有所要特 徵。胺基酸變化亦可造成在重組宿主中表現❹卿的進 步修飾，例如引入或移動糖基化作用位點或引入膜錨定 序列（根據1989年2月9日公開之PCT WC) 89/〇1〇41)。 在一些實施例中，BDNF多肽包含由在嚴袼條件下與編

碼成熟人類BDNF之核酸序列雜交的核酸編碼之胺基酸序 列。 變異體聚核苷酸亦可（或替代地）與原生基因或其一部分 或互補序列大體上同源。該等聚核㈣變異體能在中等嚴 格條件下與編碼多肽（或互補序列）之天然產生之D财序列 -般熟習此項技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併，因 此存在編碼如本文t所述之多肽的許多核*酸序列。此等 聚核普酸中之-些對任何原生基因之核㈣相有最小同 源性。儘管如此，由於密碼子選擇的差異而不同之聚核普 H8462.doc -78- 200808352 酸仍然特定涵蓋於本發明中。此外，包含本文中所提供之 聚核苷酸序列之基因的等位基因係處於本發明之範疇内。 等位基因為由於諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代之一 或多種突變而改變的内源性基因。所得mRNA及蛋白質可 (但並不必須）具有經改變之結構或功能。等位基因可使用 標準技術（諸如雜交、放大及/或資料庫序列比較）來鑑別。 本發明之方法中所使用之trkB激動劑亦包括包含BDNF (例如人類BDNF)之胺基酸序列或其功能性肽片段的融合 蛋白質。生物學上有活性之BDNF多肽可與序列融合，該 等序列為諸如增強免疫反應性、促進多肽與載體或載劑偶 合或促進再折疊及/或純化之序列（例如編碼諸如My C、衍 生自流感病毒A球凝集素之HA、His-6、FLAG之抗原決定 基的序列）。此等序列可與BDNF多肽在N末端或在c末端融 合。另外，蛋白質或聚核苷酸可與增加其功能之其他蛋白 貝或多肤1^虫合或指疋其在細胞中之定位（諸如分泌序列）。 氣備上述重組㈤合蛋白質之方法在此項技術中已知。重組 融合蛋白質可藉由此項技術中所熟知之方法來製備、再折 疊及分離。 本文中所述之BDNF多肽可經修飾以增加其在個體中之 半衰期。舉例而言，可使BDNF多肽聚乙二醇化以降低全 身清除率而生物活性損失最小。本發明亦提供包含與PEG 分子連接之BDNF多肽的組合物（包括醫藥組合物）。在一 些實施例中，PEG分子經由可逆鍵與BDNF多肽連接。經 聚乙二醇化之BDNF多肽之半衰期與未經聚乙二醇化之 118462.doc -79- 200808352 BDNF多肽之半衰期相比可延長約2倍、5倍、10倍、15 倍、20倍及3 0倍中之任一者以上。 聚乙二醇聚合物（PEG)可使用此項技術已知之方法與 BDNF多肽之各種官能基連接。參見（例如）Roberts等人， Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002)；

Sakane等人及以.14:1085-91 (1997)。PEG可與多肽 上之以下官能基連接：胺基、羧基、經修飾或天然N末 端、胺基團及硫醇基。在一些實施例中，一或多個表面胺 基酸殘基經PEG分子修飾。PEG分子可具有多種尺寸（例如 在約2至40 KDa之範圍内）。與BDNF多肽連接之PEG分子 可具有約 2000、10,000、15,000、20,000 > 25,000、 30,000、35,000、40,000 Da中之任一者之分子量。PEG分 子可為單鏈或分枝鏈。為使PEG與BDNF多肽連接，可使 用在一或兩個末端具有官能基之PEG的衍生物。官能基係 基於BDNF多肽上之可用反應性基團的類型來選擇。使衍 生物與多肽連接之方法在此項技術中已知。Roberts等人， Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002) 〇 BDNF多肽與PEG之間的鍵亦可為在個體中可裂解或天然 降解（可逆或可降解鍵）之鍵，其可改良半衰期而使活性損 失最小。BDNF多肽上之PEG連接位點亦可藉由使表面殘 基突變成具有PEF反應性基圑之胺基酸殘基（諸如半胱胺 酸）來產生。 BDNF多肽可藉由重組方式，亦即藉由表現編碼BDNF多 肽之核酸來產生。在重組細胞培養物中及視情況，（例如） 118462.doc -80- 200808352 藉由生物檢定變異體之活性或藉由吸附於包含兔類抗_ BDNF多株抗體（其將結合亦存在於原生bdNF中之變異體 的至少一個免疫抗原決定基）之免疫親和性管柱上來自細 胞培養物純化變異多肽。約40個殘基或更少之小型肽片段 係藉由活體外方法便利地製得。 可將編碼BDNF多肽之DNA選殖至表現載體中用於在宿 主細胞中表現蛋白質。編碼BDNF多肽之核酸之實例係描 述於美國專利申請公開案第2003/0203383號中。編碼呈其 成熟形式之BDNF多肽之DNA可在其胺基末端處與分泌信 號連接。此分泌信號較佳為通常引導自人類細胞活體内分 泌BDNF之BDNF前序列。然而，合適之分泌信號亦包括來 自其他動物BDNF之信號，來自NGF、NT-2或NT-3之信 號’病毒信號或來自上述或相關物種之經分泌之多肽的信 號。任何宿主細胞（諸如大腸桿菌）可用於表現蛋白質或多 狀。 可純化所表現之BDNF多肽。儘管BDNF多肽當在無分泌 信號的情況下直接表現時可自宿主細胞溶解產物回收，但 其可以經分泌之蛋白質形式自培養基回收。可使用此項技 術中已知之蛋白質純化方法。產生BDNF多肽及純化經表 現之BDNF多肽之方法在此項技術中已知。BDNF j肽可根 據此項技術中已知之方法在大腸桿菌中表現及再折疊。亦 可購得成熟人類BDNF (例如來自R&D Systems， Minneapolis，ΜΝ) 〇 一般而言，產生及製備NT-4/5多肽之方法亦可用於產生 118462.doc -81 - 200808352 及製備BDNF多肽。 鑑別trkB激動劑 trkB激動劑（諸如抗體）可使用包括以下方法之一或多種 的此項技術公認之方法來鑑別。舉例而言，可使用美國專 利第5,766,863號及第5,891，650號中所述之激酶受體活化 (KIRA)檢定。此ELISA型檢定適合於藉由量測受體蛋白質 酪胺酸激酶（rPTK，例如trk受體）之激酶域的自體磷酸化作 用來定性或定量量測激酶活化作用，以及鑑別及表徵選定 之rPTK之可能的激動劑或拮抗劑。檢定之第一階段涉及在 trkB受體存在的狀況下使激酶受體之激酶域磷酸化，其中 該受體存在於真核細胞之細胞膜中。受體可為内源性受體 或編碼受體之核酸，或受體構築體可轉型至細胞中。通 常，將第一固相（例如第一檢定盤之孔）用該等細胞（通常為 哺乳動物細胞株）之大體上均勻之群塗佈以使細胞黏著於 固相上。通常，細胞有黏著性且進而天然黏附於第一固 相。若使用”受體構築體”，則該階段通常包含激酶受體與 標遠、多狀的融合。標諸多狀在檢定之ELIS A部分中由捕捉 劑、通常捕捉抗體來識別。接著將諸如候選激動劑之分析 物添加至具有黏著性細胞之孔中以使酪胺酸激酶受體（例 如trkB受體）曝露於（或接觸）分析物。此檢定能鑑別所關注 之酪胺酸激酶受體之激動劑配位子（例如trkB)。在曝露於 分析物後，使用溶解緩衝劑（其中具有溶解之清潔劑）及溫 和攪動使黏著細胞溶解，進而釋放細胞溶解產物，可使該 細胞溶解產物直接經受檢定之ELISA部分而無需濃縮及淨 118462.doc -82- 200808352 化細胞溶解產物。 由此所製備之細胞溶解產物接著即將經受檢定之Elis a 階段。作為ELISA階段中之第一步驟，將第二固相（通常為 ELISA微s滴定盤之孔）用特異性結合酪胺酸激酶受體或 (在受體構築體的狀況下）特異性結合標誌多肽之捕捉劑（通 常為捕捉抗體）塗佈。進行第二固相之塗佈以使捕捉劑黏 著於第二固相。捕捉劑一般為單株抗體，但如本文之實例 中所述，亦可使用多株抗體或其他試劑。接著將所獲得之 細胞溶解產物曝露於或接觸黏著捕捉劑以使受體或受體構 築體黏著於（或捕捉於）第二固相。接著進行洗滌步驟以移 除未結合之細胞溶解產物，留下經捕捉之受體或受體構築 體。接著將黏著或經捕捉之受體或受體構築體曝露於或接 觸鑑別酪胺酸激酶受體中之經磷酸化之酪胺酸殘基的抗磷 酸化絡胺酸抗體。在較佳實施例中，使抗_磷酸化酪胺酸 抗體與催化非放射性顯色試劑之顏色變化之酶（直接或間 接）共軏。因此，可藉由隨後試劑顏色變化來量測受體之 填酸化作用。可使酶與抗磷酸化酪胺酸抗體直接結合，或 可使共輛分子（例如生物素）與抗磷酸化酪胺酸抗體共軛且 隨後可使酶與抗磷酸化酪胺酸抗體經由該共軛分子結合。 最後’（例如）藉由顯色試劑之顏色變化來量測抗磷酸化酪 胺酸抗體與經捕捉之受體或受體構築體的結合。 初始鑑別之後，可藉由生物檢定進一步證實及精煉候選 物（例如抗-trkB單株抗體）之激動劑活性，已知用於測試經 革巴向之生物活性。舉例而言，可在PC 12神經突外生長檢定 118462.doc -83 - 200808352 中使用經全長trkB轉染之PC 12細胞測試候選物使trkB興奮 的能力（Jian等人，心//义义⑽/ 8:365_7〇，1996)。此檢定量 測回應適當配位子刺激之大鼠嗜鉻細胞瘤細胞（pc丨2)之神 、、二犬外生長過程。此等細胞表現内源性trkA且由此對ngf 有反應。然而’其不表現内源性trkB且由此經trkB表現構 築體轉染以引起對trkB激動劑之反應。將經轉染之細胞與 候選物一起培養後，量測神經突外生長且計數（例如）具有 起出細胞直位2倍之神經突的細胞。刺激在經轉染之p ◦ 12 細胞中神經突外生長之候選者（諸如抗_trkB抗體）顯示trkB 激動劑活性。 trkB之活化作用亦可藉由在胚胎發育之特定階段使用各 種特定神經元來確定。經適當選擇之神經元可視存活用之 trkB活化作用而定，且因此可能藉由按照活體外此等神經 元的存活來確定trkB之活化作用。若候選物活化trkB，則 添加候選物至適當神經元之初級培養物中會使此等神經元 存活至少幾天。此允許確定候選物（諸如抗七kB抗體）活化 trkB之能力。在此類型檢定之一實例中，將來自e丨5小鼠 胚胎之節狀神經節剖開、解離，且將所得神經元以低密度 塗佈於組織培養孤中。接著將候選抗體添加至培養基中且 將盤培養24-48小時。此後，藉由多種方法中之任一者評 估神經元的存活。接受激動劑之樣品將通常比接受對照抗 體之樣品顯示增加之存活率，且此允許確定激動劑之存 在。參見（例如）Buchman 等人（1993) Devel〇pment 118(3): 989-100卜 118462.doc -84 - 200808352 trkB激動劑可由其在天然或在轉染編碼trkB之DN A後表 現trkB之多種細胞類型中活化下游信號轉導的能力來鑑 別。此trkB可為人類或其他哺乳動物（諸如齧齒動物或靈長 類動物）trkB。下游信號級聯可藉由改變trkB表現細胞之多 種生物化學或生理學參數（諸如蛋白質表現之程度或蛋白 質之蛋白質磷酸化程度）或改變細胞之代謝或生長狀況（如 本文中所述，包括神經元存活及/或神經突外生長）來偵 測。偵測相關生物化學或生理學參數的方法在此項技術中 已知。 V. 套組 本發明亦提供在本發明方法中使用之套組。本發明之套 組包括一或多個包含經純化之trkB激動劑（例如，天然產生 之NT-4/5或BDNF，及抗-trkB激動劑抗體）的容器及根據本 文中所述之本發明之方法中之任一者的用法說明書。一般 而言，此等說明書包含根據本文中所述之方法中之任一者 投予職動劑以治療諸如惡病質、神經性厭食症及類鸦 片誘發之喔吐的疾病之描述。該套組可進一步包含基於鑑 別個體是否具有疾病及處於疾病階段來選擇適合於治療之 個體的描述。 興使用trkB激動劑相關 瓶栝關於用於所欲 治療之劑量、給藥進度及投藥途徑的資訊。容器可為單位 劑量、散裝（例如多劑量包裝）或子單位劑量。在本發明之 套組中所提供之說明書通常為在棹 ^ 仕铋織或包裝插頁（例如包 括於套、、且中之紙張）上的書面說明 曰 但钱裔、可碩說明書 118462.doc -85- 200808352 (例如在磁性或光學儲存碟片上所栽有之說明書)亦可接 受0 標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療本文中所述之疾 病（諸如惡病質、神經性厭食症及類鴆片誘發之喂吐）。可 提供用於實施本文中所述之方法之任—者的說明書。 本發明之套組係呈合適之包裝。合適之包裝包括(但不 限於)：小瓶、罐、廣口瓶、可撓性包裝(例如密封之聚醋 薄臈或塑膠袋）及類似物。亦涵蓋與特定裝置（諸如吸入 益）經鼻投藥裝置（例如霧化器）或輪注裝置（諸如微型D 組合使用之包裝。套組可具有無菌入口 (例如容器可為靜 ，内溶液袋或具有彳由皮下注射針刺穿之塞子的小旬。 容器亦τ具有無菌入口（例如容器可為靜脈内溶液袋或具 有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶）。組合物中至少二 種活性劑為trkB激動劑。容器可進一步包含第二醫藥活性 劑。 套組可視情況提供其他組份，諸如緩衝劑及說明性資 訊。通常，套組包含容器及在該容器上或與之相關之標籤 或包裝插頁。 提供以下實例以說明而非限制本發明。 實例 實例1 :每日NT-4/5輸注引起肥胖狒狒增重及暴食 二隻肥胖雌性狒狒（體重在20-30 kg範圍内）自第i曰至第 24曰母曰一次以2 mg/kg接受靜脈内（jv)輸注人類。 另外三隻肥胖雌性狒狒（體重在20-30 kg範圍内）自第工曰至 118462.doc -86- 200808352 第24曰每曰一次接受1V媒劑（PBS)輸注。對於第一個45 日，每日量測食物攝入。對於第一個53日，每週一次稱重 動物，且接著在第8 1曰及第1 〇9曰分別稱重動物。 圖1展示每日NT-4/5輸注對肥胖狒狒之體重的影響。如 圖1所示，經NT-4/5治療之組的體重與媒劑組相比顯著增 加；且經NT-4/5治療之組的體重至第81日回到媒劑組之水 平。數據指示每日NT-4/5輸注引起肥胖狒狒之長期但可逆 之增重。 圖2展示每日NT_4/5輸注對肥胖狒狒之食物攝入的影 響。如圖2所示，經>^丁_4/5治療之組的食物攝入與媒劑組 相比顯著增加；且經NT_4/5治療之組的食物攝入至第33日 回到媒劑組之水平。數據指示每日1^1_4/5輸注引起肥胖狒 狒之可逆性暴食。 實例2 :每週兩次NT_4/5輸注引起肥胖狒狒增重而非暴食 一又肥胖雌性狒狒（體重在2〇_3〇 kg範圍内）自第【曰至第 39日每週兩次以2 mg/kg之量接受靜脈内㈣輸注人類财_ 4/5 \另外三隻肥胖雌性狒狒（體重在2〇_3〇 kg範圍内）自第工 曰至第39日每週兩次接受1¥媒劑（pBS)輸注。對於第一個 55日’每日量測食物攝入。對於第一個“日，每週一次稱 重動物，且接著在第94日及第122日分別稱重動物。 圖3展示每週兩次NT_4/5輸注對肥胖狒狒之體重的影 響。如圖3所示，經NT_4/5治療之組的體重與媒劑組相比 顯者增加；且經NT_4/5治療之組的體重至第％日回到媒劑 組之水平。數據指示每週兩次NT_4/5輪注引起肥胖拂拂之 118462.doc -87- 200808352 可逆性增重。 圖4展不每週兩次NT_4/5輸注對肥胖狒狒之食物攝入的 影響。如圖4所示，藉由雙因子AN〇VA分析得出，每週兩 次NT-4/5輸注並不顯著改變肥胖狒狒之食物攝入。數據之 B〇nferroni後測分析不顯示NT_4/5組（實心三角形）與媒劑對 照組（空心正方形）之間的顯著成對差異。 實例3 :每日NT-4/5輸注引起痩獼猴增重及暴食 三隻痩雌性獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第！日至第31曰 母曰以2 mg/kg之量接受靜脈内（iv)輸注人類Ντ_4/5。三隻 痩雌性獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第1日至第31日每週一 次以0·6 mg/kg之量輸注接受IV聚乙二醇化NT-4/5 (聚乙二 醇化NT4-G1S)。，如美國公開案第2005/0209148號及PCT WO 2005/082401之實例7中所述，藉由引入人類nt-4/5成 熟序列之甘胺酸1位至絲胺酸的突變且將PEG與第一胺基 酸絲胺酸連接來產生聚乙二醇化NT-4/5。另外三隻痩雌性 獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第1日至第31日每日一次接受 IV媒劑（PBS)輸注。對於第一個50曰，每日量測食物攝 入。每週一次稱重動物直至第50曰。 圖5展示每日NT-4/5輸注對痩雌性獼猴之體重的影響。 如圖5所示，經每日NT-4/5治療之組的體重，而非每週一 次聚乙二醇化NT-4/5治療之組的體重與媒劑組相比顯著增 加。經NT-4/5治療之組的體重尚未完全回到媒劑組之水 平。數據指示每日NT-4/5輸注引起痩獼猴增重。 圖6展示每日NT-4/5輸注對痩獼猴之食物攝入的影響。 118462.doc -88- 200808352 如圖6所示，經每日NT-4/5治療之組而非每週一次聚乙二 醇化NT-4/5治療之組的食物攝入與媒劑組相比顯著增加； 且經NT-4/5治療之組的食物攝入至第38日回到媒劑組之水 平。數據指示每日NT-4/5輸注引起痩獼猴的可逆性暴食。 NT-4/5及聚乙二醇化NT-4/5對體重的影響亦係藉由皮下 投藥來測試。三隻痩雌性獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第i 曰至第21曰每曰以2 mg/kg之量接受皮下（SC)注射人類^^^4/5。 三隻痩雌性獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第1日至第21曰每 曰一次以1 mg/kg之注射接受SC注射聚乙二醇化NT-4/5。 另外三隻痩雌性獼猴（體重在3-5 kg範圍内）自第}日至第21 曰每日一次接受SC注射媒劑（PBS)。每週一次稱重動物直 至第21日。 圖7展示每日SC注射NT-4/5及聚乙二醇化NT_4/5對痩雌 性獼猴之體重的影響。如圖7所示，經NT-4/5治療之組的 體重與媒劑組相比顯著增加。另外，經聚乙二醇化nt_4/5 治療之組的體重與媒劑組相比亦顯著增加。 實例4 :每曰皮下注射NT_4/5顯示對NZW兔之體重及食物 攝入無顯著影響 五隻雄性及五隻雌性紐西蘭白（NZW)兔（體重在3_4 “範 圍内）自第1曰至第IS日每曰以2 mg/kg之量接受皮下（sc)注 射人類NT-4/5。另外五隻雄性及五隻雌性Nzw兔（體重在 5 kg範圍内）自第1曰至第1 5曰每曰一次接受SC注射媒劑 (PBS)。對於第一個15曰，每曰量測食物攝入。每週一次 稱重動物直至第15日。 118462.doc -89- 200808352 對於體重或食物攝人在經NT_4/5治療之組與媒劑組之間 未觀測到統計學上顯著之差異。在經NT_4/5治療之雄性兔 與媒劑雄性兔之間及在經NT_4/5治療之雌性兔與媒劑雖性 兔之間進行比較。 實例5 ·單’主射NT_4/5不引起雪貂嘔吐但可減少嗎啡誘 發之u區吐 在具有約1 kg體重之成年雌性雪貂（Marshall Farm，CT) 中研究NTM/5對呕吐的影響。皮下給與催吐劑（㈣5 mg/kg 嗎啡6-葡萄糖苷酸，M6G)作為陽性對照以在投予nt_4/5之 前建立基線。將漸增劑量2NT-4/5(〇1、“戈⑺mg/kg)單 獨皮下注射至6隻雪貂（對於每一劑量）中以測試N丁_4/5是否 "T引起任何不良反應（諸如σ惡心或。區吐）。另外，在M6G之 刖10分鐘給與兩種劑量（1 mg/kg及1〇 mg/kg)之ΝΤ_4/5以測 試ΝΤ-4/5是否可抑制M6G誘發之嘔吐。使動物回到家籠中 且在注射後60 min之時段中觀測潛伏期之噁心及嘔吐之次 數。 如圖8中所示，單獨單一注射〇·ι、1或1〇 mg/kg νίμ/5 不引起雪貂嘔吐，而單一SC注射0·05 mg/kg以6(3有效誘發 嘔吐。1 mg/k§與10 mg/kg之NT-4/5顯著降低雪貂之M6G誘 發之p區吐。 為測試可能為形成雪貂中SC注射NT-4/5之抗嘔吐作用之 原因的trkB活化位點，測試在雪貂腦幹中trkB之c-]F〇s活化 作用。將單一劑量之10 mg/kg NT_4/5皮下注射至五隻雌性 雪紹中，接著在5分鐘後靜脈内注射10 mg/kg順鉑 118462.doc -90- 200808352 (cisplatin)。向另外四隻雌性雪紹注射單一劑量之媒劑、 接著5分鐘後注射順鉑作為陰性對照。1小時後藉由戊巴比 妥納（pentobarbital sodium)(65 mg/kg腹膜内）使動物喪生， 藉由以1 L/kg PBS、接著1 L/kg 4%聚甲醛（pH7.3)心臟内灌 注來固定。切割30 μπι之腦幹切片且將漂浮切片在於0.1 % Triton Χ-100(於PBS)中稀釋1小時之10%正常驢血清（NDS) 中培養，接著在4°C下在於PBS中之綿羊抗-Fos(l:l，000, OA-.11-824，Genosys Biotechnologies，Cambridge，UK)中與 0.1% Triton X-100及 10% NDS— 起培養 48 h。將切片在 PBS中洗滌，且接著在室溫下在經結合生物素之抗綿羊 IgG二次抗體溶液中培養60 min。藉由使用抗生蛋白生物 素複合技術（Vectastain Elite抗生蛋白生物素複合（ABC)套 組，Vector)顯現染色。簡言之，將切片在室溫下在ABC試 劑中培養60 min，且接著在含有3,3-二胺基聯苯胺（0.5 mg/ml)之溶液中培養30-60 s。接著將腦幹切片固定於載片 上以乾燥24 h，各自在50%、70%、95%及100%乙醇中脫 水4分鐘，且接著在二甲苯中使其清晰，其後將其固定及 觀察。在用曱酚紫染色之相鄰切片中估計孤束核（NTS)之 核及亞核的邊界。在沿背側迷走神經複合體（DVC)、0.5-1 ·0 mm嚷側及0.5 mm尾側至腦閂之嗓尾範圍之三個平面處 及在腦閂處雙向確定NTS之最後區、背側迷走神經核 (DMNX)及所有亞核之c-Fos免疫反應性神經元核之數目。 計數每隻動物每一平面之三個切片且將其平均化。藉由使 用以 Tukey 氏後測（Prism; GraphPadSoftware，San Diego, 118462.doc -91 - 200808352 CA)進行的AVOVA來比較數據。NT-4/5療法與經媒劑注射 之動物相比顯著增加最後區中c-Fos陽性核的數目（圖9A， Ρ=0·0009，學生_試）。相反，nt-4/5療法與經媒劑注射 之動物相比顯著降低背側迷走神經核中c-Fos陽性核的數 目（圖9B ’ Ρ=〇·〇〇47，學生_試）。另一方面，NT-4/5療法 不顯著改變其他腦幹核（包括NTS之多個亞核以及下丘腦之 室旁核）中c-Fos陽性核的數目。 與大多數其他腦區不同，最後區係位於血腦障壁外部且 對循環巨分子具有全通性（對於最近實例，參見Yang及

Ferguson，2003, RegUl· pept· 112(1-3):9-17)。c-Fos之誘導 為由trkB之配位子（諸如BDNF及NT-4/5)活化該trkB之已知 直接早期事件（Ip 等人 1993，J· Neurosci. 13(8):3394-405 及 Marsh專人 1993，J. Neurosci· 13(10): 4281-92) 〇 此等數據共同表明最後區至少部分構成經全身傳遞之 NT-4/5或其他trkB激動劑之真正”周邊可達”之目標。在背 侧迷走神經核中C-F〇s表現之減少（圖9B)可反映由NT-4/5預 治療使嘔吐循環部分減少。 實例6 :產生及篩檢trkB激動劑抗體 對於產生單株抗-trkB激動劑抗體的免疫：氬炝f说遂良 將單一 Balb/C小鼠用8 pg作為抗原之人類trkB胞外域注射5 次。使用載體pTriEx-2 Hygro (Novagen，Madison WI)在 2 93細胞中表現經His標記之人類trkB胞外域（殘基31-43〇)。使用Ni-NTA樹脂經由製造商說明書（Qiagen， Valencia，CA)純化trkB胞外域。對於第一個4次注射，藉由 118462.doc -92- 200808352 將人類trkB與RIBI佐劑系統及礬混合來製備抗原。經11曰 之過程，大約每3日一次，經由注射將總共8 pg抗原給與 頸背、腳墊及腹膜内。在第13日，對小鼠施以無痛致死 術，且移除脾。使淋巴細胞與8653細胞融合以獲得融合瘤 純系。使純系生長，接著藉由使用人類與鼠類trkB ELIS A 之ELISA篩檢將其選作抗-trkB陽性物。 五|為:drU為；# ··對來自生長中之融合瘤純系之 上清液篩檢其結合人類與大鼠trkB的能力。用經100 μΐ之 0.5 pg/ml大鼠或人類ti:kB-Fc融合蛋白質隔夜塗佈之96孔盤 進行檢定。在各步驟之間用含有0.05% Tween-20之PBS將 過量試劑自孔洗去。接著用含有0.5% BSA之磷酸鹽缓衝生 理食鹽水（PBS)使盤阻斷。將上清液添加至盤中且在室溫 下培養2小時。添加與山羊抗小鼠Fc共軛之辣根過氧化物 酶（HRP)以結合結合至trkB之小鼠抗體。接著添加四甲基 聯苯胺作為HRP之受質以偵測存在於上清液中之小鼠抗體 的量。使反應停止且藉由讀取450 nm處之吸光度來量化抗 體之相對量。五十個抗體在ELISA檢定中顯示陽性。在此 等抗體中，進一步測試其中5個且顯示具有激動劑活性。 參見下表2。

尺定··此檢定係用於篩檢在ELISA中發現為陽性之 抗體誘導人類trkB之受體酪胺酸激酶活化的能力。Sadick 等人（1997) Experimental Cell Research 234(2):354-61。利 用經gD標記之人類trkB轉染之穩定細胞株，測試來自融合 瘤純系之經純化之鼠類抗體的類似於用天然配位子（BDNF 118462.doc -93 - 200808352 及NT-4/5)所見之活化作用來活化細胞表面上之受體的能 力。天然配位子誘導trkB受體之激酶域的自體磷酸化作 用。在將細胞暴露於各種濃度之抗體後，將其溶解且進行 ELIS A以彳貞測trkB受體之填酸化作用。對每一假定之化拉 激動劑確疋EC50(下表2及圖1〇所示）且與天然配位子Ντ_ 4/5之彼EC50比較。 五7«5夢欢’#，經元存活檢定··藉由bdnF維持自E15胚胎所 獲得之節狀神經節神經元以使在神經營養因子之飽和濃度 下在培養物中至48小時為止存活率接近1〇〇%。在無bdnF 的情況下’至48小時為止小於5%之神經元存活。因此， E1 5節狀神經元的存活為評估抗-trk]B抗體之激動劑活性的 靈敏檢定’亦即激動劑抗體將促進E15節狀神經元存活。 藉由吸入C〇2對時配性懷孕swiss Webster雌性小鼠施以 無痛致死術。移除子宮角且提取胚胎階段E1 5之胚胎。將 節狀神經節剖開，接著胰蛋白酶化，機械解離且以μοβ 00個細胞 /孔之 密度塗 於以聚_L_鳥胺 酸及昆 布胺酸 塗佈之 96孔盤中的經界定之無血清培養基中。以劑量回應方式三 次重複根據人類BDNF來評估抗—trkB抗體之激動劑活性。 48小日守後在培養物中使細胞經受在Bi〇rnek FX液體處理工 作站（Beckman Coulter)上所進行之自動化免疫細胞化學方 案。該方案包括固定（4%曱醛，5%蔗糖，PBS)、滲透（於 PBS中之0.3% Triton X-100)、阻斷非特異性結合位點（5% 正常山羊血清，〇·1% BSA，PBS)及相繼與一次抗體及二 次抗體一起培養以偵測神經元。抗蛋白質基因產物9·5 118462.doc -94- 200808352 (PGP9.5，Chemicon)之兔類多株抗體（其為經建立之神經元 表型標記物）係用作一次抗體。Alexa Fluor 488山羊抗兔 (Molecular Probes)連同標記存在於培養物中之所有細胞之 核的核染料 Hoechst 33342 (Molecular Probes)—起用作二 次試劑。在Discovery-1/GenII Imager (Universal Imaging Corporation)上進行影像擷取及影像分析。對Alexa Fluor 48 8及Hoechst 33 342在兩個波長處自動擷取影像，其中對 於影像器之基於影像之自動聚焦系統，由於核染色存在於 所有孔中，因此該核染色係用作參考點。選擇適當物鏡及 每孔所成像之位點數以覆蓋每一孔之整個表面。設定自動 化影像分析以基於其用抗-PGP9.5抗體進行之特異性染色 計數48小時後在培養物中存在於各孔中之神經元的數目。 小心定限影像及應用基於形態及螢光強度之選擇性過濾器 得到每孔神經元之精確計數。確定每一假定之trkB激動劑 抗體的EC5G(下表2及圖11所示）且與天然配位子之彼EC50比 較。 下表2展示經鑑別之五個抗-trkB抗體及其對小鼠神經元 存活之活性及對人類trkB之磷酸化活性。 表2

純系 人類TrkB ELISA 大鼠TrkB ELISA 小鼠神經元存活檢 定 (經評估之ec50)) 人類KIRA檢定 (EC5〇) 18H6 + + 0.01 pM 0.5 nM 38B8 + + 0.2 pM 5nM 36D1 + + 5 ρΜ 5nM 37D12 + + 50 pM 56 nM 23B8 + + 11 ρΜ 50 nM 118462.doc -95- 200808352 對小鼠顱内注射抗_trkB激動劑抗體··色 Laboratories (H〇llister facility)獲得雄性 C57Bg 育小鼠 (年齡8-12個月）且在注射前以12小時光/暗循環、以隨意進 食及水歷時至少五日使其適應溫度/濕度受控之環境。用 異氟烷使各小鼠麻痹以在顱骨上方剪取毛髮切片。將小鼠 固定於立體定位手術器械（Kopf型號9〇〇)上，使其麻醉且 用設定於中間值之電加熱襯墊保持溫暖。用優峨 (Betadine)擦拭顱骨之經剃削之部分以消毒該區域。在頭 骨上方以耳朵正後方起始向眼睛方向獲得約丨cm長之小中 型縱向切口。展露顱骨，且用棉簽清潔顱骨表面之直徑約 1 cm之圓形空間以移除任何結締組織。用浸於3〇%過氧化 氳中之棉簽清潔表面以展露前囪。使用鑽尖作為探針以量 測顱骨深度，水平及垂直調整頭骨以確保其在鑽孔前為水 平。使0.5 mm中部與〇·5 mm側部以及〇.5 mm前部與〇·5 mm 後部之深度（在前囪處為零）偏差最小化至士0 05 mm之差值 内。根據小氣月自圖谱（Franklin，Κ· B. J.及 Paxinos，G·，77ze

Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press San Diego, 1997)，用於單一、侧面、下丘腦内注射之候選 物係如下：自前囪向後1.30 mm :距中線-0.5 mm ;深度， 距顱骨表面5.70 mm(在前囪處）。將一小孔鑽穿顱骨，避 免與腦接觸。將鑽子用與Hamilton注射器（型號8485 1)連接 且回到同一^座;1^之斜2 6號標準針置換。將2 μ 1化合物經2分 鐘遞增式注射至侧面下丘腦中。注射後使針保持於此位置 處歷時3 0秒，接著提高1 mm。又3 0秒後，將針提高1 118462.doc -96- 200808352 mm。30秒後，將針完全移除。接著將切口閉合且用2_9 mm創緣夾（Autoclip，Braintree Scientific，Inc)固持於一 起。在第0日進行注射。每日監測體重及食物攝入直至第 15日。 如圖12A及圖12B所示，以特定劑量顱内注射抗體18H6 及3 6D1顯著降低小鼠體重及食物攝入。以特定劑量給與之 對照IgG抗體及23B8不顯著影響食物攝入或體重。以 Bonferroni後測進行之雙因子ANOVA係用於統計分析。此 指示抗-trkB激動劑抗體當直接注射至CNS時對體重及食物 攝入具有性質上類似於NT-4/5(天然trkB激動劑）之作用。 實例7 :周邊注射trkB激動劑抗體引起猴子食物攝入及體 重增加 成年痩、雌性獼猴（在基線處重3-5 kg)每週兩次接受靜 脈内注射小鼠單株激動劑抗體38B8且其他三隻動物接受媒 劑。每日監測食物消耗且每週監測體重。藉由使用PRISM (GraphPad Software Inc.，San Diego. CA)進行統計分析。 所有數據及曲線圖皆以平均值土平均值之標準誤差（sem)表 示。藉由以Dunnet氏後測進行之雙因子ANOVA分析數據（* P<0_05，** Ρ<0·01，*" Ρ<0·001) ° 每週兩次注射5 mg/kg trkB激動劑抗體38Β8所治療之狼 子顯示在兩週内累積食物攝入增加40% (圖13 A)及重量增 加10% (圖1 3B)，指示trkB絡胺酸激酶受體之特異性活化 調節促食作用且減少體重。 應瞭解，本文中所述之實例及實施例僅為達成說明之目 118462.doc -97- 200808352 的且據此多種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括 於本申請案之精神及範疇内。本文中所引用之所有公開 案、專利及專利申請案出於所有目的藉此以引用方式全部 併入本文中達到與特定及個別指示以引用方式併入每一個 別公開案、專利或專利申請案之相同程度。 【圖式簡單說明】 圖1為展示每日NT-4/5輸注對肥胖雌性狒狒體重之影響 的圖。X軸對應於量測體重之天數且γ軸對應於作為基線 (任何治療前之體重）之百分數所量測之體重。雙因子 ANOVA係用於將經ΝΤ_4/5治療之組與媒劑組比較。數據指 示、、二NT 4/5冶療之組之體重顯著不同於媒劑組， Ρ 0·0001)。Bonferroni後測分析顯示經NT-4/5治療之組（實 心三角形）與媒劑組（空心正方形）之間的顯著成對差異。如 圖所示，指示Ρ<0·05 ;，，**，,指示p<〇〇1 ;且，，*"，，指示 Ρ<0·001 〇 圖2為展示每日ΝΤ_4/5輸注對肥胖雌性狒狒食物攝入之 汾曰的圖。X軸對應於量測食物攝入之天數且Υ轴對應於 每日由狒狒所攝取之餅乾數。雙因子AN0VA係用於將經 NT-4/5治療之組與媒劑組比較。數據指示經nt_4/5治療之 組的食物攝入顯著不同於媒劑組（F=262 5，ρ<〇〇〇〇ι)。 B〇nf⑽〇ni後測顯示經NT_4/5治療之組（實心三角形）與媒劑 4 ( &方形}之間的顯著成對差異。圖中實心黑條指示 當成對比較造成ρ<0·05或更小時之時段。 圖3為展示每週兩次NT-4/ϋ^、、+ 可心』人iN 4/：)輸注對肥胖雌性狒狒體重之 118462.doc -98- 200808352 影響的圖。X軸對應於量測體重之天數且γ軸對應於作為 基線（任何治療前之體重）之百分數所量測之體重。雙因子 ANOVA係用於將經ΝΤ-4/5治療之組與媒劑組比較。數據指 示經ΝΤ-4/5治療之組之體重顯著不同於媒劑組（F = 34.81， Ρ<0·0001)。Bonferroni後測分析顯示經NT-4/5治療之組（實 心三角形）與媒劑組（空心正方形）之間的顯著成對差異。 指示 Ρ<〇·〇5 ;且，，**"指示 Ρ<〇·〇ι。 圖4為展示每週兩次ΝΤ-4/5輸注對肥胖雌性狒狒食物攝 入之影響的圖。X軸對應於量測食物攝入之天數且γ軸對 應於每日由狒狒所攝取之餅乾數。 圖5為展示每日ΝΤ-4/5及每週聚乙二醇化ΝΤ-4/5輸注對 痩獼猴體重之影響的圖。X軸對應於量測體重之天數且γ 軸對應於作為基線（任何治療前之體重）之百分數所量測之 體重。雙因子ANOVA係用於將經ΝΤ-4/5治療之組或聚乙二 醇化NT-4/5 (PEG-NT-4/5)與媒劑組比較。資料指示經ΝΤ- 4/5治療之組而非經聚乙二醇化ντ-4/5治療之組的體重顯著 不同於媒劑組（F = 54.98，Ρ<0·000 1)。Bonferroni後測分析 顯示經NT-4/5治療之組（三角形）與媒劑組（正方形）之間而 非聚乙二醇化NT-4/5組（倒三角形）與媒劑組之間的顯著成 對差異。如圖所示，”***”指示ρ<〇·〇〇1。 圖6為展示每日ΝΤ-4/5及每週聚乙二醇化ΝΤ-4/5輸注對 痩獼狼食物攝入之影響的圖。X軸對應於量測食物攝入之 天數且Υ軸對應於每日由猴子所攝取之餅乾數。雙因子 ANOVA係用於將經ΝΤ·4/5治療之組或聚乙二醇化νίμ/5 118462.doc -99- 200808352 (PEG-NT-4/5)與媒劑組比較。資料指示經nt_4/5治療之組 而非經聚乙二醇化NT-4/5治療之組的體重顯著不同於媒劑 組（F=33·82 ’ ρ<0·0001)。Bonferroni後測顯示在第 15、 16、17、19、22、23、25及30曰經NT-4/5治療之組（三角 形）與媒劑組（正方形）之間的顯著成對差異（p<〇 〇5或更 小）’而聚乙二醇化NT_4/5組（倒三角形）與媒劑組之間無顯 著成對差異。 圖7為展示每日NT-4/5及每日聚乙二醇化NT-4/5皮下注 射對痩獼猴體重之影響的圖。X軸對應於量測體重之天數 且Y軸對應於作為基線（任何治療前之體重）之百分數所量 測之體重。雙因子ANOVA係用於將經NT-4/5治療之組或聚 乙二醇化NT-4/5 (PEG-NT-4/5)與媒劑組比較。數據指示經 NT-4/5治療之組之體重顯著不同於媒劑組（F=191〇， Ρ<0·0001)。Bonferroni後測分析顯示經NT-4/5治療之組（三 角形）與媒劑組（正方形）之間及聚乙二醇化]SfT-4/5組（倒三 角形）與媒劑組之間的顯著成對差異。”***，，指示Ρ<0·001 ; 且 ”**π指示 Ρ<0·01。 圖8為展示單一注射ΝΤ-4/5對雪貂之嗎啡誘發之嘔吐之 影響的圖。X軸對應於所注射之藥物類型；且γ轴對應於 注射後60 min之時段中的嚼心及u區吐之次數。Dunnett氏後 測之單因子ANOVA係用於統計分析。p值係指示於圖中。 圖9A及圖9B展示由NT-4/5誘導雪貂後腦中之c-F〇s。圖 9A展不在最後區中由抗-c-Fos抗體染色之核的數目。圖9b 展示在背侧迷走神經核中由抗-c-Fos抗體染色之核的數 118462.doc -100- 200808352 目。 圖10展示與人類NT-4/5相比在KIRA檢定中由多種抗_ trkB 抗體（36D1、38B8、37D12、19H8(1)、iF8、23B8、 18H6)使trkB酪胺酸鱗酸化之程度。 圖11展示由若干trkB激動劑抗體維持之節狀神經元存活 的圖。X軸表示添加至自Swiss Webster小鼠獲得之胚胎第 15曰（E15)節狀神經元培養物中之抗_trkB抗體之不同濃 度。Y軸表示塗佈後4 8小時神經元存活之數目。每一點為 四個測定值之平均值且誤差槓顯示與一標準差之彼平均值 的差異。數據指示一些所測試之trkB抗體可維持節狀神經 元存活且在此培養條件下此等抗體之5〇%有效濃度（ec5 〇) 係在小於0.1至高於1〇 PM之範圍内（參見表丨）。 圖12A及圖12B為展示顧内注射抗_1：1^]3激動劑抗體對小 鼠體重（圖12A)及食物攝入（圖12B)之影響的圖。在第〇曰 注射抗體及NT-4/5。每日量測體重及食物攝入直至第j 5 曰。與小鼠IgG對照相比指示puoi ;與小鼠對 照相比指示Ρ<〇·〇1 ;且與小鼠IgG對照相比"*，，指示 Ρ<0·05 ° 圖13Α及圖13Β為展示周邊靜脈内注射抗七沾激動劑抗 體對獮猴體重（圖13Α)及食物攝入（圖13Β)之影響的圖。在 第1日注射抗體。每週監測體重且每日監測食物攝入。與 對照媒劑相比”***”指示Ρ>〇,〇〇1 ;與對照媒劑相比，，**，，指 不Ρ>0.01 ;且與對照媒劑相比指示p>〇 〇5。 118462.doc -101 - 200808352 序列表 <11〇>美商雷那特神經科學股份有限公司 <120>藉由投予TRKB激動劑以治療不欲之減重或飲食異常之方法 <130> PC19516A <140> 096103977 <141> 2007-02-01 <150> US 60/765,410 <151> 2006-02-02 <160> 2 <170> patentin version 3.4 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> 智乂 <400> 1 Gly val Ser Glu Thr Ala Pro Ala ser Arg Arg Gly GTw Leu Ala val 1 5 l〇 15 Cvs ASP Ala val $er Gly Trp val Thr Asp Arg Arg Thr Ala val Asp 20 25 扣 Leu Arg Gly Arg Glu val Qlu Val Leu <3ly Glu val Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr cys Ly$ aU Asp 50 55 60 Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly cys Arg Gly val A$p Arg Arg His Trp val ser Glu cys Lys Ala Lys Gin ser Tyr Val Arg Ala wu Thr Ala Asp Ala G招 Gly Arg val Gly 挪 Arg 丁「p Xle Arg He Asp Thr Ala cys val Cys Thr Leu Leu ser Arg Thr <3ly 1Ϊ5 120 丄 ao 13 A1)>^>> 9 m X Γ 2222 118462.doc 200808352 ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60 agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120 ttgggggagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180 tgc^ggctg atetacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240 gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300 accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360 tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc tgag 394 -2 - 118462.doc

Claims (1)

1. 200808352 十、申請專利範圍： 1 · 一種以NT-4/5於製造供治療靈長類動物 7 <惡病質之攀物 的用途。 内貝<糸物 2·如請求項1之用途，其中該靈長類動物為人類。 3· 一種以NT-4/5於製造供治療靈長類動物 夕益此 < 神經性厭食症 之樂物的用途。 4.如請求項3之用途，其中該靈長類動物為人類。 5· 一種以NT_4/5於製造供治療哺乳動物之_ 买貝牙鳥片誘發之嘔 吐之樂物的用途。 6·如請求項5之用途，其中該哺乳動物為人類。 7· 種以trkB激動劑於製造供治療靈長類動物 ^ u 7 <怒'病質之 糸物的用途。 8·如請求項7之用途，其中該靈長類動物為人類。 9.如請求項7或8之用途，其中該刚激動劑為抗_㈣激動 劑抗體。 10·如明求項7或8之用途，其中該激動劑為化⑸選擇性。 U·—種以刚激動劑於製造供治療靈長類動物之神經性厭 食症之藥物的用途。 12·如請求項n之用途，其中該靈長類動物為人類。 13. :睛求項11或12之用途，其中該咖激動劑為抗址b激 動劑抗體。 14. 如Μ求項11或12之用途，其中該激㈣為咖選擇性。 15. -種以咖激動劑於製造供治療哺乳動物之類鴉片誘發 之嘔吐之藥物的用途。、 118462.doc 200808352 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 如睛求項1 5之用途，其中該哺乳動物為人類。 如請求項15或16之用途，其中該trkB激動劑為抗_trkB激 動劑抗體。 如請求項15或16之用途，其中該激動劑為trkB選擇性 的。 一種以NT-4/5於製造供治療靈長類動物之不欲之減重之 藥物的用途。 如請求項19之用途，其中該靈長類動物為人類。 如請求項19或20之用途，其中該不欲之減重係與老齡化 相關。 如請求項2或20之用途，其中該人類的身體質量指數小 於約 25.0 kg/m2、24.0 kg/m2、23.0 kg/m2、22·〇 kg/m2、 21.0 kg/m2、20 kg/m2、19·0 kg/m2及 18·5 kg/m2 中之任一 者。 一種以trkB激動劑於製造供治療靈長類動物之不欲之減 重之藥物的用途。 如睛求項23之用途，其中該靈長類動物為人類。 如晴求項23或24之用途，其中該忱跎激動劑為抗七跎激 動劑抗體。 如明求項23或24之用途，其中該激動劑為以⑸選擇性 的。 如印求項8或24之用途，其中該人類的身體質量指數小 於約 25.0 kg/m、24.0 kg/m2、23.0 kg/m2、22.0 kg/m2、 21·〇 kg/m、20 kg/m2、19 〇 kg/m2及 18 5kg/m2 中之任一 118462.doc 200808352 者。 28. 如請求項23或24之用途，其中該不欲之減重係與老齡化 相關。 29. 如請求項4或12之用途，其中該人類的身體質量指數小 於約 18·5 kg/m2、17.5 kg/m2或 16.5 kg/m2 中之任一者。 118462.doc