CN101909647A - TrkB抗体用于治疗呼吸病症的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了TrkB抗体，其用于开发用于治疗、预防或减轻呼吸病症的新的疗法。本发明还涉及治疗、预防或减轻所述状况的方法和用于其的药物组合物，以及鉴定对于治疗与呼吸病症相关的状况有治疗用途的化合物的方法。

Description

TrkB抗体用于治疗呼吸病症的用途
发明背景
酪氨酸激酶受体B(TrkB)属于单跨膜受体酪氨酸激酶家族，该家族还包括TrkA和TrkC。这些酪氨酸激酶受体(trks)介导神经营养蛋白的活性。神经营养蛋白是神经元的存活和发育所必需的，其通过调节神经元结构和突触可塑性来调控突触传递。神经营养蛋白包括但不限于：神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)(Lo，KY et al.，(2005)J.Biol.Chem.，280：41744-52)。
TrkB是BDNF的高亲和性受体(Minichiello，et al.，Neuron 21：335-45(1998))，其在脑中，特别是新皮层、海马、纹状体和脑干中高水平表达；还在肌肉组织中发现了同种型。神经营养蛋白与trk结合，活化受体，使得受体细胞内结构域上的特定酪氨酸残基二聚化并且自磷酸化(Jing，etal.，(1992)Neuron 9：1067-1079；Barbacid，(1994)J.Neurobiol.25：1386-1403；Bothwell，(1995)Ann.Rev.Neurosci.18：223-253；Segal andGreenberg，(1996)Ann.Rev.Neurosci.19：463-489；Kaplan and Miller，(2000)Curr.Opinion Neurobiol.10：381-391)。这些磷酸酪氨酸残基作为细胞内信号级联元件的停靠点发挥作用，导致对神经元死亡的抑制(suppression)、对神经突(neurite)长出的促进作用以及神经营养蛋白的其它作用。例如，Shc、FRS-2、SH2B、rAPS和PLCγ通过磷酸化的酪氨酸残基与TrkB发生相互作用。这些衔接分子与活化的TrkB的联结导致信号途径(包括有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径)的启动，由此介导神经营养蛋白的作用(Lo，KY et al.，(2005)J.Biol. Chem.，280：41744-52)。
雷特综合征(RTT)最初由Dr.Andreas Rett于1966年鉴定出来，其是来自晚期神经发育缺陷的破坏性的CNS病症。其几乎仅仅影响所有种族的女童，发病率为1/10,000-15,000出生人口。一些患有RTT的个体在童年时死亡，但是，很多可以活到成年阶段并高度残障。高达25％的患者死于心脏//呼吸衰竭。迄今为止对该疾病没有有效治疗。
表观正常发育期之后，受到影响的女童在6至18个月期间发展出RTT症状，症状在未来数年来不断恶化。症状包括：出生时正常头围之后头部生长减速；获得性语言能力丧失；交流障碍；认知受损；有目的的手部技能被刻板的手部运动代替(扭曲绞手、洗手(hand washing)、拍手(clapping)、轻拍(patting)等)；受损或变差的运动能力(步态共济失调(gait ataxia)、缺乏柔性(stiffness)等)；清醒时呼吸困难；从婴儿期早期开始受损的睡眠模式；异常肌肉紧张伴肌肉消瘦和肌张力失常；外周血管舒缩障碍；进行性脊柱侧凸或驼背和生长迟缓。
该病症特征还在于中枢自主功能障碍，并且Rett患者显示出下述症状中的一些或全部：由屏气、浅呼吸、换气过度、延长的呼吸暂停期构成的多种呼吸节律障碍；心律不齐伴随基线心迷走紧张的降低；h和心压力感受器反射敏感性。这些症状威胁生命，并且使得Rett患者处于猝死风险中。他们显示出脑干不成熟，并且在觉醒期间缺乏心肺网络中的和来自下丘脑或边缘皮层的综合抑制。此外，在Rett患者中报道了脑干神经营养蛋白信号(NGF和BDNF)的改变，以及单胺(5-羟色胺、去甲肾上腺素)和神经肽(物质P)水平的降低。
RTT是单基因型疾病，在绝大多数情况下，是X染色体连锁的基因mecp2的突变导致的，该基因编码转录阻遏子MeCP2(甲基-CpG胞嘧啶结合蛋白2)。MeCP2与甲基化的DNA优先结合。
神经营养蛋白因子BDNF是MeCP2的已知的直接靶标，是去甲肾上腺素和5-羟色胺神经元的重要营养性因子。令人惊奇地，Mecp2-KO小鼠是脑BDNF缺陷的，脑BDNF的遗传过量表达可增加其寿命，并且弥补其运动缺陷。目前需要寻找BDNF治疗策略，包括用于雷特综合征和其它呼吸病症等状况的策略；此类策略包括靶向BDNF的此类结合伴侣，例如酪氨酸激酶受体TrkB。
发明内容
本发明提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如，雷特综合征(RTT))的方法，所述方法包括施用酪氨酸激酶受体B(TrkB)的经分离的抗体激动剂(在本文中还称为“TrkB激动性抗体”、“TrkB结合分子”等)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在其它实施方式中，抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，并且不与其它物种的TrkB结合。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能与其它物种的TrkB结合(即，能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。
在一些实施方式中，抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式中，抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下述竞争抗体针对与TrkB的结合竞争，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：7的重链可变区和包含SEQ ID NO：8的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：11的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：15的重链可变区和包含SEQ ID NO：16的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的重链可变区和包含SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：16的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ IDNO：4的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能例如重现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。
在一些实施方式中，抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式中，抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，在一些实施方式中，抗体与下述竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ IDNO：5的重链可变区和包含SEQ ID NO：6的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：9的重链可变区和包含SEQ ID NO：10的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：13的重链可变区和包含SEQ ID NO：14的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：13的重链可变区和包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：14的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
TrkB激动性抗体与TrkB相互作用，其因此能调节TrkB功能。TrkB激动性结合分子可用于促进TrkB途径信号传递；因此，TrkB激动性结合分子可用于例如诊断、改善与异常低的TrkB途径信号传递水平相关的呼吸病症(例如，由于患病受试者中TrkB或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的)，提供保护以抵抗所述呼吸病症以及治疗所述呼吸病症。与对TrkB信号传递异常下调相关的病症的非限制性例子(例如，由于TrkB或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的)是(i)雷特综合征(RTT)，其特征在于编码MeCP2(与BDNF直接结合)的基因中的突变；和(ii)由于TrkB功能丧失突变导致的严重肥胖和发育迟缓(Giles，S.，et al.(2004)Nature Neuroscience 7：1187-9)。
本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))的方法，所述方法包括施用包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物还包含能治疗、诊断、预防和/或改善呼吸性窘迫的症状(例如呼吸困难)的分开的、独立的试剂，例如去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂：AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。
在一些实施方式中，向个体施用与TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)组合的治疗和/或预防有效量的有效治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的第二种试剂。在一些实施方式中，第二种试剂和TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)作为混合物施用。在一些实施方式中，第二种试剂选自下述物质构成的组：去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂：AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。
本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸窘迫(例如通常随呼吸病症发现的那些)的方法，所述方法包括施用TrkB激动性抗体(或包含其的药物组合物)。所述症状包括但不限于：呼吸困难(例如喘鸣或喘息，屏气、浅呼吸、换气过度、延长的呼吸暂停)、不良或减少的血氧(例如青紫)(例如，由于氧吸收受损、不足的肺血液灌注等导致的)、降低的去甲肾上腺素(NE)含量、髓质中表达酪氨酸羟化酶的神经元减少以及胸痛。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用治疗或预防有效量的酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体激动剂。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体。在一些实施方式中，个体有一种或多种呼吸病症和/或正在经历一种或多种呼吸窘迫的症状。在一些实施方式中，个体对呼吸窘迫的症状易感。在一些实施方式中，个体具有雷特综合征。
本发明提供了抑制神经细胞死亡的方法，所述方法包括施用TrkB激动性抗体(或包含其的药物组合物)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中，抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。在一些实施方式中，抗体不与神经营养蛋白受体p75NR结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能结合其它物种的TrkB(即能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。
在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。
在多种实施方式中，本发明提供了用调节(或促进)TrkB的一种或多种生物功能的TrkB激动性抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫症状的方法，或抑制神经细胞死亡的方法。例如，TrkB激动剂抗体可调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言，TrkB激动剂抗体可初始化TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径)，由此导致对神经元死亡的抑制、对神经突长出的促进和神经营养蛋白的其它作用。
TrkB激动性抗体包括，例如，与TrkB结合(例如，在TrkB的特定结构域或表位内，例如，与TrkB的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外)的抗体和包括此类抗体的抗原结合部分的多肽。TrkB激动性抗体还包括下述分子：其中，结合部分并不源于抗体，例如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的TrkB激动性抗体，并且，其中，通过随机化、选择和亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造，以与TrkB结合。
在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的方法，所述抗体能结合人TrkB内的表位并且能与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与啮齿类物种的TrkB(例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与人TrkA或TrkC交叉反应。
在其它一些实施方式中，本发明提供了用下述TrkB抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的方法，所述抗体与人TrkB内的表位结合，但是不与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与啮齿类物种的TrkB(例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与人TrkA或TrkC或神经营养蛋白受体p75NR交叉反应。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分与线性表位结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分与非线性表位结合。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低于1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的解离常数(KD)与TrkB结合。
在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能结合其它物种的TrkB(即能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低于0.3nM的KD与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB结合。
在多种实施方式中，所述抗原结合部分以等于或低于0.5nM的KD与小鼠TrkB结合。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体是人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是嵌合(例如，人源化、人工程化)抗体。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。
本发明方法的TrkB激动性抗体包括例如，抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或Fv片段。
在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施方式中，TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的Fab片段。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括单链Fv。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括双抗体(例如单链双抗体或具有两条多肽链的双抗体)。
在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂的抗原结合部分源于下述同种型之一的抗体：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述抗体的抗原结合部分源于IgA或IgE同种型的抗体。
本发明方法的TrkB激动剂抗体可以展示出大量生物活性中的一种或多种。在多种实施方式中，TrkB激动剂抗体抑制TrkB与BDNF、与神经营养蛋白4(NT-4)和/或与神经营养蛋白5(NT-5)的结合。例如，相对于对照而言(例如，相对于不存在TrkB激动剂抗体的情况下的结合而言)，TrkB激动剂抗体将TrkB与BDNF、NT-4和/或NT-5的结合抑制至少5％、10％、15％、25％或50％。在其它一些实施方式中，TrkB激动剂抗体不抑制TrkB与BDNF、NT-4和/或NT-5的结合，并且不以任何方式与其竞争。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体与BDNF竞争结合TrkB，由此调节TrkB途径信号传导的生物活性和后果。非限制性地举例而言，本发明方法的TrkB激动剂抗体能活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导(例如通过与BDNF竞争结合TrkB)。在一些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体与TrkB配体结合结构域结合，由此与BDNF竞争结合TrkB。
在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能，例如，重现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。
在其它一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合结构域，并且不与BDNF竞争结合TrkB，但是其仍然可调节TrkB信号途径(例如活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导)。
在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的方法，所述抗体能调节通常由TrkB以直接或间接方式调节的下游生物活性。所述活性的非限制性例子包括：调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上酪氨酸残基的自身磷酸化；启动TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径)；以及抑制神经元死亡、促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作用。例如，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，本发明方法的TrkB激动剂抗体将神经元死亡抑制至少5％、10％、15％、25％或50％。进一步举例而言，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，所述TrkB激动剂抗体将TrkB蛋白水平稳定至少5％、10％、15％、25％或50％。
在多种实施方式中，本发明提供了用非抗体TrkB激动性分子来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的方法。非抗体TrkB激动剂分子包括下述TrkB结合结构域，其具有源于非抗体多肽的免疫球蛋白样(Ig样)折叠的氨基酸序列，例如下述之一：生腱蛋白(tenascin)、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白(titin)、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白(telokin)的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白(neuroglian)、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白(thaumatin)。通常，TrkB结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列而言有所改变，使得TrkB结合结构域与TrkB特异性结合(即，其中免疫球蛋白样折叠不与TrkB特异性结合)。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％相同(例如至少65％、75％、80％、85％或90％相同)。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％、65％、75％、80％、85％或90％相同：生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域以等于或低于1nM的KD与TrkB结合(例如0.5nM、0.1nM)。
在一些实施方式中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig样折叠(例如III型纤连蛋白的模块10的Ig样折叠)。
本发明还涉及使用包括本文所述的TrkB激动剂抗体的药物组合物的方法。所述组合物包括，例如TrkB激动剂抗体和可药用载体。
在一个方面，本发明涉及通过施用治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括将组织或生物样品(例如表达TrkB的神经元细胞)与治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)相接触，由此活化和/或稳定TrkB信号途径，以及针对神经营养蛋白(例如BDNF)的作用提供保护。TrkB激动剂抗体(或含有其的药物组合物)可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。
在一些实施方式中，所述方法涉及腹膜内注射施用TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)。
本发明一个或多种实施方式的细节在附图和下文说明书中详细示出。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。
附图简述
图1图示了在施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中观察到的体重和食物摄入的下降。在图1A中，最顶上的线(白色方块示出数据点)代表施用盐水的Mecp2野生型小鼠。次顶部的线(黑色方块示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野生型小鼠。次底部的线(白色圆圈示出数据点)代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。最底部的线(黑色圆圈示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。图1B中，白色的条形代表施用盐水的Mecp2野生型小鼠。黑色的条形代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野生型小鼠。浅灰色条形代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。深灰色的条形代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。图1B左边部分代表在6周龄时进行的测量，右边部分代表在8周龄时进行的测量。
图2A和2B分别图示了施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中握力和体脂肪组成的改善。图2中，方块示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的野生型(WT)小鼠；圆圈示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的敲除(KO)小鼠。图2A的左边部分代表后肢测量，右边是前肢测量。图2B的左边代表体脂肪含量，右边是瘦肉质含量。
图3图示了施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中观察到的增加的寿命。图3A中，敲除小鼠被描述为KO，野生型描述为WT。SAL表示施用盐水，C20表示施用TrkB激动剂抗体。图3B中，敲除小鼠被描述为KO，TrkB激动剂抗体描述为C20。如图3所示，TrkB激动剂mAb处理过的敲除小鼠(KO-C20)存活时间是盐水处理的KO小鼠的至少两倍。
发明详述
本发明提供了用酪氨酸激酶受体B(TrkB)的经分离的抗体激动剂(本文中也被称为“TrkB激动性抗体”等等)治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))的方法。
所述方法可利用任何TrkB激动剂抗体，具体列出的那些被认为是非限制性的实施方式。
本发明提供了与TrkB结合的分子(“TrkB激动性抗体”)，特别是人抗体或其部分，其能与人TrkB结合并调节其功能。还提供了TrkB的表位和结合这些表位的试剂。
全长人TrkB序列以
Figure BPA00001162230600121
检索号AAB33109(GI：913718)发现，其有822个残基。其由
Figure BPA00001162230600122
检索号S76473(GI：913717)的mRNA序列编码。TrkB是在脑中广泛分布的神经营养蛋白受体。其是多结构域跨膜蛋白，由细胞外配体结合结构域(LBD)、跨膜区域和细胞内酪氨酸激酶结构域构成。TrkB是BDNF的高亲和性受体，其也能结合神经营养蛋白4(NT-4)。
在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中，抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，并且不与其它物种的TrkB结合。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能与其它物种的TrkB结合(即，能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。
在一些实施方式中，抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式中，抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下述竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：7的重链可变区和包含SEQ ID NO：8的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQID NO：11的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：15的重链可变区和包含SEQ IDNO：16的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的重链可变区和包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：16的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能例如重现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。
在一些实施方式中，本发明的TrkB激动剂抗体结合TrkB配体结合位点和/或与BDNF竞争结合TrkB。与TrkB的配体结合位点结合的示例性抗体是抗体A10F18.2(在本文中还被称为“A10F18”或“A10”)。抗体A10的重链可变区在SEQ ID NO：3中例示，抗体A10的轻链可变区在SEQID NO：4中例示。
因此，本发明提供了与包含含SEQ ID NO：3的重链可变区以及含SEQID NO：4的轻链可变区的抗体竞争结合TrkB的激动剂抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：3和/或4的互补决定区(CDRs)中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下，我们认为，CDR3在抗体A10的结合中具有显著作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs：7和/或8。但是，CDR1和/或CDR2也在结合中具有作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs：11和/或12或15和/或16。
在一些实施方式中，抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式中，抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下述竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：5的重链可变区和包含SEQ ID NO：6的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：9的重链可变区和包含SEQ ID NO：10的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：13的重链可变区和包含SEQID NO：14的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：13的重链可变区和包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：14的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ IDNO：2的轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合位点和/或不与BDNF竞争结合TrkB。不结合TrkB的配体结合位点的示例性抗体是抗体C20.i.1.1(本文中还被称为“C20.i1”、“C20.I1”和“C20”)。抗体C20的重链可变区在SEQ ID NO：1中示例。因此，本发明提供了激动剂抗体，其与包含含SEQ ID NO：1的重链可变区以及含SEQID NO：2的轻链可变区的抗体竞争结合TrkB。在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：1和/或2的互补决定区(CDRs)中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下，我们认为，CDR3在抗体C20的结合中具有重要作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs：5和/或6。但是，CDR1和/或CDR2也在结合中具有作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs：9和/或10或13和/或14。
TrkB激动性抗体与TrkB相互作用，由此能调节TrkB功能。TrkB激动性结合分子可用于促进TrkB途径信号传导；因此，TrkB激动性结合分子可用于例如诊断、改善下述呼吸病症，提供保护以抵挡下述呼吸病症以及治疗下述呼吸病症，所述呼吸病症是与异常低水平的TrkB途径信号传导相关的(例如，由于患病受试者中TrkB或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的)。与对TrkB信号传导异常下调相关的病症的非限制性例子(例如，由于TrkB或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的)是雷特综合征(RTT)，其特征在于编码MeCP2(与BDNF直接结合)的基因中的突变。
本发明还提供了用包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体的药物组合物治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))的方法。在一些实施方式中，药物组合物还包含能治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症的症状(例如呼吸困难)的分开的、独立的试剂，例如去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂：AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。
所述方法可利用包含治疗或预防有效量的任何TrkB激动剂抗体的药物组合物，具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。
本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸窘迫症状(例如通常随呼吸病症发现的那些)的方法。所述症状包括但不限于：呼吸困难(例如喘鸣或喘息，屏气、浅呼吸、换气过度、延长的呼吸暂停)、不良或减少的血氧(例如青紫)(例如，由于氧吸收受损、不足的肺血液灌注等导致的)以及胸痛。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用治疗或预防有效量酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体激动剂。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体。在一些实施方式中，个体有一种或多种呼吸病症和/或正在经历呼吸窘迫的一种或多种症状。在一些实施方式中，个体对呼吸病症的症状易感。在一些实施方式中，个体具有雷特综合征。
所述方法可利用任何TrkB激动剂抗体(或包含任何TrkB激动剂抗体的药物组合物)，具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。
在一些实施方式中，向个体施用与TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)组合的治疗和/或预防有效量的第二种有效治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))的试剂。在一些实施方式中，第二种试剂和TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)作为混合物施用。在一些实施方式中，第二种试剂选自下述物质构成的组：去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂：AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。
在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。
在多种实施方式中，本发明提供了用能调节(或促进)TrkB的一种或多种生物功能的TrkB激动性抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫症状的方法。例如，TrkB激动剂抗体可调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言，TrkB激动剂抗体能启动TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径)，由此导致对神经元死亡的抑制、对神经突长出的促进和神经营养蛋白的其它作用。
TrkB激动性抗体包括，例如，与TrkB结合(例如，在TrkB的特定结构域或表位内，例如，与TrkB的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外)的抗体和包括此类抗体的抗原结合部分的多肽。TrkB激动性抗体还包括下述分子：其中，结合部分并不源于抗体，例如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的TrkB激动性抗体，并且，其中，通过随机化、选择和亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造，以与TrkB结合。
在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体能结合人TrkB内的表位并且能与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与啮齿类物种的TrkB(例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与人TrkA或TrkC交叉反应。
在其它一些实施方式中，本发明提供了用下述TrkB抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体与人TrkB内的表位结合，但是不与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与啮齿类物种的TrkB(例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与人TrkA或TrkC或神经营养蛋白受体p75NR交叉反应。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分与线性表位结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分与非线性表位结合。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低于1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的解离常数(KD)与TrkB结合。
在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能结合其它物种的TrkB(即能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。
在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低于0.3nM的KD与非人灵长类(例如，猕猴或黑猩猩)的TrkB结合。
在多种实施方式中，所述抗原结合部分以等于或低于0.5nM的KD与小鼠TrkB结合。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体是人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是嵌合(例如，人源化、人工程化)抗体。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。
本发明方法的TrkB激动性抗体包括例如，抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或Fv片段。
在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施方式中，TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的Fab片段。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括单链Fv。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括双抗体(例如单链双抗体或具有两条多肽链的双抗体)。
在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体的抗原结合部分源于下述同种型之一的抗体：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述抗体的抗原结合部分源于IgA或IgE同种型的抗体。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体与BDNF竞争结合TrkB，由此调节TrkB途径信号传导的生物活性和后果。作为非限制性实例，本发明方法的TrkB激动剂抗体可活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导(例如通过与BDNF竞争结合TrkB)。在一些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体与TrkB配体结合结构域结合，由此与BDNF竞争结合TrkB。
在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能，例如，重现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。
在其它一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合结构域，并且不与BDNF竞争结合TrkB，但是其可调节TrkB信号途径(例如活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导)。
在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体能调节通常由TrkB以直接或间接方式调节的下游生物活性。所述活性的非限制性例子包括：调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上酪氨酸残基的自身磷酸化；启动TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径)；以及抑制神经元死亡、促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作用。例如，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，本发明方法的TrkB激动剂抗体将神经元死亡抑制至少5％、10％、15％、25％或50％。进一步举例而言，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，所述TrkB激动剂抗体将TrkB蛋白水平稳定至少5％、10％、15％、25％或50％。
在多种实施方式中，本发明提供了用非抗体TrkB激动性分子来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法。非抗体TrkB激动剂分子包括下述TrkB结合结构域，其具有源于非抗体多肽的免疫球蛋白样(Ig样)折叠的氨基酸序列，例如下述之一：生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白。通常，TrkB结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列而言有所改变，使得TrkB结合结构域与TrkB特异性结合(即，其中免疫球蛋白样折叠不与TrkB特异性结合)。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％相同(例如至少65％、75％、80％、85％或90％相同)。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60％、65％、75％、80％、85％或90％相同：生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白。
在多种实施方式中，TrkB结合结构域以等于或低于1nM的KD与TrkB结合(例如0.5nM、0.1nM)。
在一些实施方式中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig样折叠(例如III型纤连蛋白的模块10的Ig样折叠)。
本发明还涉及使用包括本文所述的TrkB激动剂抗体的药物组合物的方法。所述组合物包括，例如TrkB激动剂抗体和可药用载体。
在一个方面，本发明涉及通过施用治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括将组织或生物样品与治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)相接触，由此活化和/或稳定TrkB信号途径。TrkB激动剂抗体(或含有其的药物组合物)可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。
在一些实施方式中，所述方法涉及腹膜内注射施用TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物)。
根据本发明的方法可使用任何类型的TrkB激动剂抗体。通常，使用的抗体是单克隆抗体。可通过本领域已知的任何方法来产生单克隆抗体(例如使用杂交瘤、重组表达和/或噬菌体展示)。不加限制的情况下，本发明的方法中可使用来自任何下述专利和非专利公开文献的TrkB激动剂抗体：Qian，M.，et al.(2006)Journal of Neurosci.26(37)；9394-9403；美国专利号5,910,574(及其任何相关的同族专利)；PCT专利公开号WO06/133164(及其任何相关的同族专利)。
定义
在本文中使用时，术语“呼吸病症”包括但不限于：肺不张、囊性纤维化、雷特综合征(RTT)、哮喘、呼吸暂停(例如睡眠呼吸暂停)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、急性呼吸困难、呼吸急促、端坐呼吸、类风湿性肺病、肺充血或水肿、慢性气道阻塞性疾病(例如肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘和支气管扩张)、换气不足、匹克威克综合征、肥胖换气不足综合征、婴儿猝死综合征(SIDS)和呼吸过度。
此外，“呼吸病症”还包括人类中已知与遗传缺陷有关的状况，例如沙-马-图病、Cheyne-Stokes呼吸病、Willi-Prader综合征、婴儿猝死综合征、先天性中枢性肺换气不足、弥漫性间质性疾病(例如结节病、尘肺病、过敏性肺炎、细支气管炎、古德帕斯丘综合征、特发性肺纤维化、特发性肺含铁血黄素沉着症、肺泡蛋白沉着症、脱屑性间质肺炎、慢性间质性肺炎、纤维化肺泡炎、哈-里综合征、肺嗜酸性粒细胞增多症、弥漫性间质性纤维化、韦格纳肉芽肿病、淋巴瘤样肉芽肿和脂质性肺炎)或肿瘤(例如支气管原癌、细支气管肺泡癌、支气管类癌、错构瘤和间质瘤)。
在本文中使用时，“调节”表示直接或间接控制或影响的能力，作为非限制性实例，或者可表示抑制或刺激、激动或拮抗、阻碍或促进以及加强或削弱。
“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”的本发明的TrkB激动性抗体可分别预防疾病症状(例如，与异常低的TrkB水平或TrkB的突变拷贝相关的病症的症状)的发作或者使得这些症状的严重性降低。所述术语还可分别促进或增加疾病无症状期的频率和持续时间。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”还可分别预防或改善由于患TrkB相关病症或呼吸病症导致的受损或残障。
术语“受试者”意欲包括遭受或患有与异常TrkB信号途径相关的疾病、病症或状况的生物，例如真核生物。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方式中，受试者是人，例如，遭受本文所述的呼吸病症或状况(例如雷特综合征(RTT))、处于遭受本文所述的呼吸病症或状况(例如雷特综合征(RTT))的风险中或可能遭受本文所述的呼吸病症或状况(例如雷特综合征(RTT))的人。
术语“抗体”在本文中使用时表示完整的抗体或抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链(即轻链或重链)。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区域可进一步细分为：被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有被称为构架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列的三个CDRs和四个FRs构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语抗体的“抗原结合部分”在本文中使用时表示完整抗体中保留有与给定抗原(例如TrkB)特异性结合的能力的一条或多条片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子包括Fab片段——由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；F(ab)2片段——包含通过二硫桥在铰链区相连的两条Fab片段(通常一条来自重链，一条来自轻链)的二价片段；Fd片段——由VH和CH1结构域构成；Fv片段——由抗体单臂的VL和VH结构域构成；单结构域抗体(dAb)片段(Ward et al.，1989Nature 341：544-546)——其由VH结构域构成；以及经分离的互补决定区(CDR)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域——VL和VH是不同基因编码的，但是可使用重组方法通过人工肽接头将其连接起来，使得它们被制造为单条蛋白链，其中，VL和VH区域配对形成单价分子(也被称为单链Fv(scFv)；见，例如，Bird et al.，1988Science 242：423-426；and Huston et al.，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体包括抗体的一个或多个“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，以与完整抗体相同方式筛选这些片段的效用。
抗原结合部分还可掺入单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微型抗体、胞内抗体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(见，例如Hollinger and Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植到基于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的骨架中(见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体(monobodies))。
抗原结合部分可掺入包含串联Fv区段对(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子，与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.，1995Protein Eng.8(10)：1057-1062和美国专利号5,641,870)。
术语“骆驼抗体(camelid antibody)”在本文中使用时表示从骆驼和单峰驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员(包括新世界的成员，例如美洲驼物种(Lama paccos、Lama glama和Lamavicugna))获得的完整抗体的一个或多个片段。骆驼抗体的小的单可变结构域(被鉴定为VHH)区域可通过遗传工程获得，以产生具有针对靶标的高度亲和性的小蛋白，从而产生被称为“骆驼纳米抗体”的低分子量的、源于抗体的蛋白。见美国专利号5,759,808；还见Stijlemans et al.，2004 J.Biol. Chem.279：1256-1261；Dumoulin et al.，2003Nature 424：783-788；Pleschberger et al.，2003 Bioconjugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo et al.，2002Int.J.Cancer 89：456-62和Lauwereys.et al.，1998 EMBO J.17：3512-3520。
“经分离的TrkB激动剂抗体”在本文中使用时指这样的结合分子，其基本上没有具有针对非TrkB的抗原的抗原特异性的分子(例如，经分离的抗体，其特异性结合TrkB，但是基本上没有特异性结合非TrkB的抗原的抗体)。但是，经分离的特异性结合TrkB的结合分子可具有对其它抗原(例如，来自其它物种的TrkB分子)的交叉反应性。如果结合分子基本上不含细胞物质，那么该结合分子是“经纯化的”。
在本文中使用时，术语“人工程化抗体”表示结合相同表位但是序列不同的抗体。示例性技术包括通过Kalobios的人工程化技术生产的人工程化抗体，其中，抗原结合区域的序列是通过例如突变获得的，而非由于保守氨基酸置换获得。
在本文中使用时，“特异性结合TrkB”的TrkB激动剂抗体(例如抗体或其抗原结合部分)意欲表示以1x10-7M或更低的KD与TrkB结合的TrkB激动剂抗体。与“抗原交叉反应”的TrkB激动剂抗体(例如，抗体或其抗原结合部分)意欲表示以1x10-6M或更低的KD与抗原结合的TrkB激动剂抗体。“不与”给定抗原“交叉反应”的TrkB激动剂抗体(例如，抗体或其抗原结合部分)意欲表示这样的TrkB激动剂抗体，其与给定抗原的结合无法检测到，或者其以1x10-5M或更高的KD与给定抗原结合。在某些实施方式中，不与抗原交叉反应的此类结合分子在标准结合测定中展示出基本上检测不到的针对这些蛋白的结合。
术语“单克隆抗体组合物”在本文中使用时表示单种分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示出针对特定表位的单结合特异性和亲和性。
术语“人抗体”在本文中使用时意欲包括具有可变区的抗体，其中，构架和CDR区源于人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也源于此类人序列，例如，人种系(germline)序列或人种系序列的突变形式。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变体外引入或通过体细胞突变体内引入的突变)。但是，术语“人抗体”在本文中使用时不包括下述抗体：其中，源于另外的哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指这样的抗体，其展示出单结合特异性，具有可变区，其中，构架区和CDR区域都源于人序列。在一种实施方式中，人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括：与永生化细胞融合的从转基因非人动物(例如，转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)获得的B细胞。
术语“重组人抗体”在本文中使用时包括通过重组手段制备、表达、制造或分离的任何人抗体，例如，从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体；从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如从转染瘤(transfeetoma))分离的抗体；从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分与另外的DNA序列剪接的任何其它手段制备、表达、制造或分离的抗体。此类重组人抗体具有下述可变区，其中，构架和CDR区源于人种系免疫球蛋白序列。但是，在某些实施方式中，此类重组人抗体可经历体外诱变(或者当使用对人Ig序列转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)，由此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：虽然源于人种系VH和VL序列及与其相关，但可不天然存在于人的人抗体种系的全部组成部分(repertoire)中。
在本文中使用时，“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体类(例如IgM、IgE、IgG，例如IgG1或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”或“对抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
在提到蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)与......免疫反应”指这样的结合反应，其能确定蛋白质在异源蛋白群或其它生物制剂中的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，指出的抗体以背景至少两倍的水平与特定蛋白结合，并且基本上不以显著的量与样品中存在的其它蛋白结合。在此类条件下与抗体的特异性结合可能需要针对其与特定蛋白的特异性选择出的抗体。这种选择可通过扣除与例如TrkA或TrkC或神经营养蛋白受体p75NR交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可用于选择能与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择能与蛋白特异性免疫反应的抗体(关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，见例如Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1998))。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更典型地，超过背景10-100倍以上。
术语“抗体激动剂”指这样的抗体，其能活化受体以诱导出完全或部分的受体介导的应答。例如，TrkB的激动剂与TrkB结合，并且诱导TrkB介导的信号传导。在一些实施方式中，可通过其接触SH-SY5Y细胞时结合TrkB并诱导神经突长出的能力，或按照本文所述，来鉴定针对激动剂的TrkB抗体。
本发明的多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构、调控或生物化学功能。多肽的活性的例子包括直接活性和间接活性。示例性的直接活性是与多肽直接相互作用的结果，包括配体结合，例如，BDNF与配体结合结构域(LBD)的结合。
在本文中使用时，提到IgG抗体时，术语“高度亲和性”表示抗体针对靶抗原具有10-9M或更低的KD。
如果核苷酸序列被改变，以使用在生产细胞或生物(通常是真核细胞，例如，酵母(例如毕赤酵母(Pichia))的细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子来编码氨基酸序列的话，该核苷酸序列就被称为“经优化的”。经优化的核苷酸序列被工程改造，以编码与原始起始核苷酸序列编码的氨基酸序列(也被称为“亲本”序列)相同或几乎相同的氨基酸序列。
下文章节中更详细地描述了本发明的多个方面。
用于评估分子结合多个物种的TrkB(特别是TrkB的表位)的能力的标准测定法是本领域已知的，其包括，例如ELISAs和western印迹。可利用肽表位竞争测定法，来测定TrkB激动剂抗体是否结合TrkB的特异性表位。例如，将TrkB激动剂抗体与对应于感兴趣的TrkB表位的肽在肽的饱和浓度下一起孵育。针对与固定化的TrkB的结合，对经预孵育的TrkB激动剂抗体进行测试，例如通过
Figure BPA00001162230600271
分析来进行。与肽预孵育对TrkB结合的抑制表明，TrkB激动剂抗体与肽表位结合(见，例如，美国专利公开20070072797)。还可通过本领域已知的标准测定法来评估结合动力学，例如通过
Figure BPA00001162230600272
分析，或通过FACS分析来评估表观结合。下文中详细描述了评价TrkB激动性抗体对TrkB功能性质的影响的测定法。
因此，按照本领域已知的和本文描述的方法测定时，“抑制”这些TrkB功能性质(例如，生物化学、细胞、生理或其它生物活性等等)中一种或多种的TrkB激动剂抗体将被理解为：相对于在不存在结合分子的情况下(例如，当存在无关特异性的对照分子时)观察到的而言，特定功能性质产生统计学上显著减少。抑制TrkB活性的TrkB激动剂抗体能实现将测定参数统计学上显著减少至少5％。在某些实施方式中，拮抗抗体或其它TrkB激动剂抗体可使得选择的功能性质较之对照减少至少10％、20％、30％或50％。
识别或促进TrkB活性的TrkB激动剂抗体实现将测量的参数统计学上显著地增加至少5％。在某些实施方式中，TrkB激动剂抗体或其部分可使得选择的功能性质较之对照增加至少10％、20％、30％或50％。
抗体
本文描述的抗TrkB抗体包括人单克隆抗体。在某些实施方式中，与TrkB结合的抗体的抗原结合部分(例如VH和VL链)是“混合并匹配的”，以产生其它抗TrkB激动性抗体。可使用前文所述的结合测定(例如ELISAs)来测试此类“混合并匹配的”抗体的结合。当选择VH与特定VL序列混合并匹配时，典型地，选择的VH与其在和该VL的配对中置换的VH结构上相似。类似地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列通常被结构上相似的全长重链序列置换。类似地，来自特定VH/VL配对的VL序列应当被结构上相似的VL序列置换。类似地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当被结构上相似的全长轻链序列置换。本文上下文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在其它方面，本发明提供了以多种组合包含一种或多种TrkB结合抗体的重链和轻链CDR1s、CDR2s和CDR3s的抗体。鉴于这些抗体每条都可结合TrkB，并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区域提供，VHCDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列可“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDRs可混合并匹配)。可使用本文描述的结合测定(例如ELISAs)来测试此类“混合并匹配的”抗体的TrkB结合。当VH CDR序列结合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当被结构上相似的CDR序列置换。类似地，当VL CDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当被结构上相似的CDR序列置换。本文上下文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在本文中使用时，如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因作为序列来源的系统获得的话，人抗体包含重或轻链可变区或全长重或轻链，其是特定种系序列“的产物”或“源于”特定种系序列。在一种此类系统中，人抗体是在携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生的。用感兴趣的抗原(例如，TrkB的表位)免疫转基因。或者，通过提供在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库并且用感兴趣的抗原(例如TrkB的表位)筛选该文库，来鉴定人抗体。
可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较，并选择序列上与人抗体的序列最接近(即，最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定是人种系免疫球蛋白序列“的产物”的或“源于”其的人抗体。是特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”的或“源于”其的人抗体较之种系编码的序列可含有氨基酸差异，所述差异例如由于天然存在的体细胞突变或人工定点突变导致的。但是，选择的人抗体典型地具有与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列，并且含有当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠种系序列)比较时将人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有至少60％、70％、80％、90％或至少95％同一性，或者甚至至少96％、97％、98％或99％同一性。
两条序列间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同位置#/总位置#x100)，其中要考虑到空位数量和每个空位的长度，需要引入这些空位以对两条序列进行最优比对。使用E.Meyers和W.Miller的算法(1988 Comput.Appl.Biosci.，4：11-17)，来比较序列并且测定两条序列间的百分比同一性，该算法已被整合到ALIGN程序(版本2.0)，其中使用PAM120权重残值表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
典型地，源于特定人种系序列的人抗体的VH或VL将展示出与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体的VH或VL可展示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过5个或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
骆驼抗体
已在大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面，对从骆驼和单峰驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员(包括新世界的成员，例如美洲驼物种(Lamapaccos、Lama glama和Lama vicugna))获得的抗体蛋白进行了表征。自然界中在该家族的哺乳动物中发现的某些IgG抗体缺少轻链，并且由此在结构上与来自其它动物的抗体典型的具有两条重链和两条轻链的四链四级结构有所不同。见WO 94/04678。
骆驼抗体的小的单可变结构域(被鉴定为VHH)区域可通过遗传工程获得，以产生具有针对靶标的高度亲和性的小蛋白，从而产生被称为“骆驼纳米抗体”的低分子量的源于抗体的蛋白质。见美国专利号5,759,808；还见Stijlemans et al.，2004 J.Biol.Chem.279：1256-1261；Dumoulin et al.，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger et al.，2003Bioconj ugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo et al.，2002Int.J.Cancer 89：456-62和Lauwereys.et al.，1998EMBO J.17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库可商业获得，例如从Ablynx，Ghent，Belgium获得。和非人来源的其它抗体一样，骆驼抗体的氨基酸序列可被重组改变，以获得更接近于人序列的序列，即，纳米抗体可以是“人源化的”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可被进一步降低。
骆驼纳米抗体具有大约是人IgG分子十分之一的分子量，该蛋白具有仅数纳米的物理直径。小尺寸的一种后果是骆驼纳米抗体能结合对于较大抗体蛋白来说功能上不可见的抗原位点，即，骆驼纳米抗体可用作为试剂，以检测使用经典免疫技术检测不到的抗原，以及可用作为可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是，由于与靶蛋白的沟或窄缝中的特异性位点结合，骆驼纳米抗体可抑制靶蛋白，以及由此可以以比典型抗体更接近典型低分子量药物的功能的能力发挥作用。
低分子量和紧凑的大小进一步导致骆驼纳米抗体极其热稳定、对极端pH和对蛋白水解消化稳定，和更少的抗原性。另一结果是，骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进组织，并且甚至穿过血脑屏障，因此可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步协助药物运输穿过血脑屏障。见2004年8月19日公开的美国专利公开号20040161738。这些特征与在人中的低抗原性组合表明了极大的治疗潜力。此外，这些分子可在原核细胞，例如大肠杆菌中完全表达。
因此，本发明的特征是具有针对TrkB的高度亲和性的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。在本文某些实施方式中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼动物中天然产生的，即，使用本文所述针对其它抗体的技术，用TrkB或其肽片段进行免疫之后由骆驼产生的。或者抗TrkB的骆驼纳米抗体是工程化的，即，通过选择，例如，使用淘选方法，用本文描述的TrkB或TrkB表位作为靶标，从展示经合适诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库进行选择，来生产抗TrkB的骆驼纳米抗体。可通过遗传工程对经工程化的纳米抗体进行进一步定制，以将接受的受试者中的半寿期从45分钟增加至2周。
双抗体
双抗体是二价的、双特异性的分子，其中，VH和VL结构域在单条多肽链上表达，它们通过短到不允许相同链上两个结构域间配对的接头相连。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点(见例如，Holliger et al.，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak et al.，1994Structure 2：1121-1123)。可通过在相同细胞中表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链，来产生双抗体。它们中的大多数可以以可溶形式在细菌中表达。
单链双抗体(scDb)是通过用大约15个氨基酸残基的接头将两条形成双抗体的多肽链连接起来而产生的(见Holliger and Winter，1997Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：128-30；Wu et al.，1996Immunotechnology，2(1)：21-36)。scDb可以以可溶的活性单体形式在细菌中表达(见Holliger and Winter，1997Cancer Immunol.Immunother.，45(34)：128-30；Wu et al.，1996Immunotechnology，2(1)：21-36；Pluckthun and Pack，1997Immunotechnology，3(2)：83-105；Ridgway et al.，1996Protein Eng.，9(7)：617-21)。
双抗体可与Fc融合，产生“双双抗体”(见Lu et al.，2004J.Biol.Chem.，279(4)：2856-65)。
经工程化和修饰的抗体
可使用具有一条或多条VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，对经修饰的抗体工程化，来制备本发明的抗体，其中所述经修饰的抗体具有与起始抗体不同的性质。可通过修饰一个或全部两个可变区(即，VH和/或VL)中(例如，一个或多个CDR区域中和/或一个或多个构架区中)的一个或多个残基，来对抗体工程化。此外或备选地，可通过修饰恒定区内的残基，来对抗体进行工程化，例如，以改变抗体的效应功能。
可进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链CDRs中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各抗体间CDRs内的氨基酸序列要比CDRs外的序列更具多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此可通过构建下述表达载体，来表达模拟特异性的天然存在的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上的、来自特异性的天然存在的抗体的CDR(见，例如Riechmann et al.，1998Nature 332：323-327；Jones et al.，1986Nature 321：522-525；Queen et al.，1989Proc.Natl.Acad. See.U.S.A.86：10029-10033；美国专利号5,225,539和美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
构架序列可从公开的DNA数据库或公开的文献(包括种系抗体基因序列)中获得。例如，针对人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在“VBase”人种系序列数据库(可在Internet上于www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)中找到，以及在Kabat et al.，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson et al.，1992 J.Mol.Biol.227：776-798和Cox et al.，1994Eur.J.Immunol.24：827-836中找到；它们每篇的内容都通过引用明确并入本文。
VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列可被移植到下述构架区上，所述构架区具有与构架序列来源的种系免疫球蛋白基因中所发现的相同的序列，或者CDR序列可被移植到较之种系序列而言含有一处或多处突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况下，在构架区内突变残基以保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(见，例如，美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
还可将CDRs移植进并非免疫球蛋白结构域的多肽的构架区中。合适的骨架形成构象上稳定的构架，其展示移植的残基，使得它们形成局部表面，并且结合感兴趣的靶标(例如TrkB)。例如，可将CDRs移植到骨架上，其中，构架区基于纤连蛋白、锚蛋白(ankyrin)、脂质运载蛋白(lipocalin)、neocarzinostain、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域或tendramisat(见例如Nygren and Uhlen，1997Current Opinion in Structural Biology，7，463-469)。
另一种类型的可变区修饰是对VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的氨基酸残基加以突变，由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和性)，这被称为“亲和性成熟”。可进行位点定向诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，可在本文所述的体外或体内测定中评价对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响。可引入保守修饰。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，典型地，在CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
本发明的经工程化的抗体包括在VH和/或VL中的构架残基中进行了修饰的那些，例如，以改善抗体的性质。典型地，进行此类构架修饰，以减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变(backmutated)”成相应的种系序列。更具体地，经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的构架残基。可通过将抗体构架序列与抗体所源于的种系序列加以比较，来鉴定此类残基。为将构架区序列返回至其种系构型，可通过，例如，位点定向诱变或PCR介导的诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变”的抗体也是本发明所包括的。
另一类型的构架修饰包括对构架区内或者甚至一个或多个CDR区域内的一个或多个残基加以突变，以除去T-细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法还被称为“去免疫化”，在Carr et al.的美国专利公开号20030153043中对其有更详细的描述。
除了构架或CDR区域中进行的修饰之外，或备选地，可对本发明的抗体进行工程化，以在Fc区域内包括修饰，典型地，用于改变抗体的一种或多种功能性质，例如，血清半寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可被化学修饰(例如，可向抗体连接一个或多个化学部分)，或被修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。
在一种实施方式中，对CH1的铰链区加以修饰，使得铰链区的半胱氨酸残基的数量被改变，例如，增加或减少。该方法由Bodmer et al.进一步描述于美国专利号5,677,425中。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，以例如促进轻链和重链的装配，或者增加或减少抗体的稳定性。
在另一实施方式中，抗体的Fc铰链区被突变，以减少抗体的生物半寿期。更具体地，一个或多个氨基酸突变被引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得抗体较之天然Fc-铰链结构域SpA结合而言具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该手段在Ward et al.的美国专利号6,165,745中被更详细地描述。
在另一实施方式中，抗体被修饰，以增加其生物半寿期。多种方法是可能的。例如，美国专利号6,277,375描述了在IgG中增加其体内半寿期的如下突变：T252L、T254S、T256F。或者，为了增加生物半寿期，可在CH1或CL区域中对抗体加以改变，以含有取自IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环的挽救受体结合表位，如Presta et al.的美国专利号5,869,046和6,121,022所述。
在另外一些实施方式中，通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区域，以改变抗体的效应功能。例如，可用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的针对效应配体的亲和性，但是仍然保留亲本抗体的抗原结合能力。针对其的亲和性被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter et al.的美国专利号5,624,821和5,648,260中被更详细地描述。
在另一个实施方式中，可用不同的氨基酸残基置换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消失的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie et al.的美国专利号6,194,551中更详细地描述。
在另一实施方式中，对一个或多个氨基酸残基加以改变，从而改变抗体的补体固定能力。该方法在Bodmer et al.的WO 94/29351中被更详细地描述。
在另一实施方式中，通过修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域加以修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和性。该方法在Presta的WO 00/42072中被更进一步地描述。此外，人IgG1上针对FcγRl、FeγRII、FcγRIII和FeRn的结合位点已被作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(见Shields，R.L.et al.，2001 J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
在再一种实施方式中，对抗体的糖基化加以修饰。例如，可产生非糖基化的抗体(即，所述抗体缺乏糖基化)。可对糖基化加以改变，例如以增加抗体对抗原的亲和性。可例如通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点，来完成此类碳水化合物修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，由此消除该位点的糖基化。此类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和性。此类方法在Co et al.的美国专利号5,714,350和6,350,861中被更详细地描述。
此外或备选地，产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如，具有降低量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足的抗体，或者具有增加的二分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已被证实能增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过，例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中被描述过，其可用作为宿主细胞，其中，表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang et al.的EP 1，176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在此类细胞系中表达的抗体展示出岩藻糖基化不足。Presta的PCT Pub.WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)相连的碳水化合物上的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体岩藻糖基化不足(还见Shields，R.L.et al.，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana et al.的WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的二分GlcNac结构，这导致抗体增加的ADCC活性(还见Umana et al.，1999Nat.Biotech.17：176-180)。
本发明包括的对本文中抗体的另一修饰是聚乙二醇化。可对抗体聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如血清)半寿期。为对抗体进行聚乙二醇化，典型地，用聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，与抗体或其片段反应，该反应在一个或多个PEG部分与抗体或抗体片段连接的条件下进行。可使用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)，通过酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。在本文中使用时，术语“聚乙二醇”意欲包括已被用于衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，例如，单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇马来亚酰胺。在某些实施方式中，将被聚乙二醇化的抗体是非糖基化的抗体。用于对蛋白进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的，其可应用于本发明的抗体。见，例如，Nishimura et al.的EP 0 154 316和Ishikawa et al.的EP 0 401 384。
此外，可通过引入非天然氨基酸，在本发明的TrkB结合多肽的任何部分实现聚乙二醇化。可通过Deiters et al.，J Am Chem Soc125：11782-11783，2003；Wang and Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang et al.，Science 292：498-500，2001；Zhang et al.，Science 303：371-373，2004或美国专利号7,083,970描述的技术引入某些非天然氨基酸。简言之，这些表达系统中的一些涉及位点定向诱变，以向编码本发明的多肽的可读框中引入无义密码子，例如，琥珀TAG。然后再将此类表达载体引入可利用对引入的无义密码子来说具有特异性的tRNA的宿主，并装载选择的非天然氨基酸。对将部分与本发明的多肽缀合的目的有益的特定的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮化物侧链的那些。然后可在蛋白中这些选择的位点上对含有这些新的氨基酸的多肽进行聚乙二醇化。
对抗体进行工程化的方法
如上文所讨论的，可使用抗TrkB抗体，通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与其连接的恒定区来产生新的抗TrkB抗体。例如，可将抗体的一个或多个CDR区域与已知的构架区和/或其它CDRs重组组合，以产生新的、经重组工程化的抗TrkB抗体。其它类型的修饰包括前文章节中描述的那些。用于工程化方法的起始材料是VH和/或VL序列中的一条或多条或者其一个或多个CDR区域。为制造经工程化的抗体，并不一定要实际制备出具有VH和/或VL序列中的一条或多条或者其一个或多个CDR区域的抗体(即，作为蛋白质表达)。而是，用序列中含有的信息作为起始材料，以制造源于原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。
可使用标准分子生物学技术来制备和表达改变的抗体序列。改变的抗体序列编码的抗体是保留了其所源于的抗TrkB抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性质包括但不限于：与TrkB特异性结合、干扰TrkB结合神经营养蛋白(例如BDNF)的能力以及调节TrkB二聚化和在其细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力，如本文所述。可使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定法(例如ELISAs)来评估改变的抗体的功能性质。
在本发明的对抗体进行工程化的方法的某些实施方式中，在抗TrkB抗体编码序列的全部或部分上随机或选择性引入突变，可针对结合活性和/或其它功能性质(与TrkB特异性结合、干扰TrkB结合神经营养蛋白(例如BDNF)的能力以及调节TrkB二聚化和在其细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力，如本文所述)，对得到的经修饰的抗TrkB抗体加以筛选。突变方法在本领域中已有描述。例如，Short的PCT公开WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar et al.的WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法来优化抗体的物理化学性质的方法。
非抗体TrkB激动性抗体
本发明还提供了展示出抗体的功能性质但是其构架和抗原结合部分源于其它多肽(例如并非是抗体基因编码的那些，也不是抗体基因体内重组产生的那些的多肽)的TrkB激动性抗体。这些结合分子的抗原结合结构域(例如TrkB结合结构域)是通过定向进化方法产生的。见，美国专利号7,115,396。具有与抗体的可变结构域类似的总体折叠(“免疫球蛋白样”折叠)的分子是合适的骨架蛋白。适合得到抗原结合分子的骨架蛋白包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白。
非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可具有小于10kD或大于7.5kD的分子量(例如，7.5-10kDa之间的分子量)。用于获得抗原结合结构域的蛋白是天然存在的哺乳动物蛋白(例如人蛋白)，较之其源于的蛋白的免疫球蛋白样折叠而言，抗原结合结构域包括多达50％(例如，多达34％、25％、20％或15％)的经突变的氨基酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域通常由50-150个氨基酸(例如，40-60个氨基酸)构成。
为产生非抗体结合分子，产生克隆文库，其中，对骨架蛋白中形成抗原结合表面的区域(例如，在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白折叠的CDRs类似的区域)中的序列进行随机化。针对与感兴趣的抗原(例如TrkB)的特异性结合以及针对其它功能(例如抑制TrkB的生物功能)，对文库克隆加以测试。选择的克隆可用作为基础，用于进一步的随机化和选择，以产生对抗原有更高亲和力的衍生物。选择方案的一个例子被描述于美国专利号6,207,446中。
产生高度亲和性结合分子，例如，使用纤连蛋白III的第10个模块(10Fn3)作为骨架。针对10FN3的三个CDR样环中的每一个，在残基23-29、52-55和78-87处构建文库。为构建每种文库，通过寡核苷酸合成对编码与每个CDR样区域重叠的序列的DNA区段随机化。用于产生可选择10Fn3的文库的技术被描述于美国专利号6,818,418和7,115,396；Roberts and Szostak，1997Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：12297；美国专利号6,261,804；美国专利号6,258,558和Szostak et al.WO98/31700中。
非抗体结合分子可作为二聚体或多聚体产生，以增加对靶抗原的亲合力。例如，抗原结合结构域作为与抗体的恒定区(Fc)的融合物表达，其形成Fc-Fc二聚体。见例如美国专利号7,115,396。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的TrkB激动性抗体的核酸分子。核酸可存在全细胞中、细胞裂解物中，或可以是经部分纯化的或基本上纯的形式的核酸。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术)纯化去除其它细胞组分或其它污染物，例如，其它细胞核酸或蛋白质时，核酸就是“经分离的”或“使得为基本上纯的”。见F.Ausubel，et al.，ed.1987 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是，例如，DNA或RNA，并且可以含有或可以不含内含子序列。在一种实施方式中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体中，例如噬菌体展示载体或重组质粒载体中。
可使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于通过杂交瘤(按照下文进一步描述的，从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，可通过标准PCR扩增或eDNA克隆技术，获得编码通过杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的eDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，可从是文库成员的多个噬菌体克隆回收编码抗体的核酸。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，可通过标准重组DNA技术，对这些DNA片段进行进一步操作，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与另外的DNA分子或编码另外的蛋白质的片段(例如抗体恒定区或柔性接头)有效连接。术语“有效连接”在本文上下文中使用时意欲表示两条DNA片段以功能性方式相连，例如，使得两条DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读码框，或者使得蛋白在想要的启动子的控制下表达。
可通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外的DNA分子有效连接，将编码VH区域的经分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat et al.，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另外的DNA分子有效连接。
可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外的DNA分子有效连接，将编码VL区域的经分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat et al.，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另外的片段有效连接，使得VH和VL序列可作为连续的单链蛋白表达，其中VL和VH区域通过柔性接头相连(见，例如，Bird et al.，1988Science 242：423-426；Huston et al.，1988Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，1990Nature348：552-554)。
单克隆抗体产生
可通过多种技术，包括传统单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975Nature，256：495)的标准体细胞杂交技术，或使用文库展示方法，例如噬菌体展示，来产生单克隆抗体(mAbs)。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已良好建立的方法。免疫方案和用于分离经免疫的脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可基于按照上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列，来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可从感兴趣的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术对其加以人工改造，使其含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区相连(见例如Cabilly et al.的美国专利号4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域已知的方法，将鼠CDR区域插入人构架。见，例如，美国专利号5,225,539和美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370。
在某实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠，来产生针对TrkB的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，它们被合称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure BPA00001162230600411
(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座，其编码未经重排的人重(μ和γ)链和K轻链免疫球蛋白序列，以及使得内源μ和K链基因座失活的靶向突变(见，例如Lonberg et al.，1994Nature368(6474)：856-859)。因此，小鼠展示出小鼠IgM或K的降低的表达，并且应答于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和性的人IgGK单克隆(Lonberg，N.et al.，1994supra；reviewed in Lonberg，N.，1994Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.，1995Intern.Rev.Immunol.13：65-93和Harding，F.and Lonberg，N.，1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。Taylor，L.et al.，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.et at.，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi et al.，1993Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.et al.，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.，1994J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.，1994International Immunology 579-591和Fishwild，D.et al.，1996Nature Biotechnology 14：845-851中进一步描述了HuMAb小鼠的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰，这些文献的所有内容都通过引用整体明确并入本文。还见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661，016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani et al.的美国专利号5,545,807；Lonberg and Kay的PCT公开号WO92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman et al.的PCT公开号WO 01/14424。
在另一实施方式中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，来产生本发明的人抗体。此类小鼠在本文中被称为“KM小鼠”，在WO 02/43478中有详细描述。
此外，本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物体系，它们可用于产生本发明的抗TrkB抗体。例如，可使用被称为
Figure BPA00001162230600421
(Abgenix，Inc.)的备选的转基因系统。此类小鼠被描述于例如Kucherlapati et al.的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6，150,584和6,162,963中。
此外，本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物体系，它们可用于产生本发明的抗TrkB抗体。例如，可使用携带人重链染色体和人轻链染色体两者的小鼠，它们被称为“TC小鼠”；此类小鼠描述于Tomizuka et al.，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa et al.，2002Nature Biotechnology 20：889-894)，它们也可用于产生本发明的TrkB抗体。
还可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法，来制备本发明的人单克隆抗体。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法是本领域中已经建立的。见例如Ladner et al.的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower et al的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty et al.的美国专利号5,969,108和6,172,197以及Griffiths et al.的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。筛选文库与全长TrkB或TrkB的特定表位的结合。
还可使用SCID小鼠(已向其中重建了人免疫细胞，使得免疫时可产生人抗体应答)来制备本发明的人单克隆抗体。此类小鼠被例如描述于Wilson et al.的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
在人Ig小鼠中产生人单克隆抗体
可将在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如HEK293细胞)中表达的经纯化的重组人TrkB用作为抗原。可将蛋白与载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH))缀合。
使用HuMab转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17品种和转基因转染色体小鼠的KM品种(每种都表达人抗体基因)，来制备TrkB的完全人单克隆抗体。在每种这些小鼠品种中，可按照Chen et al.，1993 EMBOJ.12：811-820所述，纯合破坏内源小鼠κ轻链基因，以及可按照WO01109187的实施例1所述，纯合破坏内源小鼠重链基因。这些小鼠品种中的每种携带κ轻链转基因KCo5，如Fishwild et al.，1996Nature Biotechnology 14：845-851所述。HCo7品种携带HCo7人重链转基因，如美国专利号5,545,806、5,625,825和5,545,807所述。HCo12品种携带HCo12人重链转基因，如WO 01/09187的实施例2所述。HCo17品种携带HCo17人重链转基因。KNM品种含有SC20转染色体，如WO 02/43478所述。
为产生针对TrkB的完全人单克隆抗体，用经纯化的重组TrkB、TrkB片段或其缀合物(例如TrkB-KLH)作为抗原，对HuMab小鼠和KM小鼠加以免疫。用于HuMab小鼠的一般免疫方案被描述于Lonberg，N.et al.，1994 Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.，1996Nature Biotechnology 14：845-851和WO 98/24884中。首次输注抗原时，小鼠为6-16周龄。用抗原的经纯化的重组制备物(5-50μg)在腹膜腔内、皮下(Sc)或通过足垫注射免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原，以腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫(FP)的方式，对转基因小鼠进行两次免疫，接着用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原，进行3-21天的IP、Sc或FP免疫(可多达总共11次免疫)。通过眼窝后采血，监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆，用具有足够抗TrkB人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。在处死和移除脾脏前3天和2天，用抗原对小鼠进行静脉内强化。典型地，每种抗原进行10-35次融合。针对每种抗原对若干打小鼠进行免疫。用TrkB对总共82只HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠品种进行免疫。
为选择产生结合TrkB的抗体的HuMab或KM小鼠，按照Fishwild， D.et al.，1996所述，通过ELISA测试来自经免疫小鼠的血清。简言之，用经纯化的重组TrkB(1-2μg/ml，PBS中)以50μl/孔包被微量滴定板，4℃孵育过夜，然后用PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清以200μl/来封闭。将来自经TrkB免疫小鼠的血浆的稀释液加入到每个孔中，在环境温度孵育1-2小时。用PBS/Tween洗板，然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体室温下孵育1小时。洗涤之后，用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)处理板，通过分光光度计在OD 415-495进行分析。产生最高效价的抗TrkB抗体的小鼠的脾细胞被用于融合。进行融合，通过ELISA测试杂交瘤上清液的抗TrkB活性。
基于标准方案，用PEG将从HuMab小鼠和KM小鼠分离出的小鼠脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系。然后针对抗原特异性抗体的产生，对得到的杂交瘤加以筛选。用50％PEG(Sigma)，将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与四分之一量的SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞以1x105/孔接种到平底微量滴定板上，接着在选择培养基中孵育大约2周，所述培养基含有10％胎牛血清、10％P388D 1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、DMEM中的3-5％(IGEN)(Mediatech，CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)加5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50g/ml庆大霉素和lx HAT(Sigma，CRL P-7185)。大约1-2周后，在用HT代替HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA，针对人抗TrkB单克隆IgG抗体来筛选各孔。一旦出现广泛的杂交瘤生长，在10-14天之后对培养基加以监测。对分泌抗体的杂交瘤重复涂板，再次筛选，如果仍然对人IgG呈阳性，则通过有限稀释将抗TrkB单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体，用于进一步表征。
产生生产人单克隆抗体的杂交瘤
为产生生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可从经免疫的小鼠分离脾和/或淋巴结细胞，将其与合适的永生细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可针对抗原特异性抗体的生产，对得到的杂交瘤加以筛选。例如，可用50％PEG，将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将细胞以大约2x 145涂布于平底微量滴定板上，接着在选择性培养基中进行2周孵育，所述培养基含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％
Figure BPA00001162230600452
(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0：055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50g/ml链霉素、50g/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；HAT在融合后24小时加入)。大约2周后，可在用HT代替HAT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA，针对人单克隆IgM和IgG抗体，对各细胞加以筛选。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后对培养基加以观察。对分泌抗体的杂交瘤重复涂板，再次筛选，如果仍然对人IgG呈阳性，则通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可在两升旋转瓶中培养选择的杂交瘤，用于单克隆抗体纯化。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG，以确保纯度。可将缓冲液交换进PBS，可使用1.43的消光系数，通过OD280来测定浓度。单克隆抗体可等分，并贮藏于-80℃。
产生生产单克隆抗体的转染瘤
还可使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合(如本领域已知的)(例如Morrison，1985Science 229：1202)，在宿主细胞转染瘤中生产本发明的抗体。
例如，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤，进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNAs，并可将DNAs插入表达载体，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在本文上下文中，术语“有效连接”意欲表示抗体基因连接进载体，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥其预期调节抗体基因的转录和翻译的功能。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体，或者更典型地，两个基因插入相同表达载体。通过标准方法将抗体基因插入表达载体(例如，将抗体基因片段与载体上的互补限制性位点连接，或者如果不存在限制性位点的话，进行平末端连接)。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，这可如下实现：将它们插入已经编码希望的同种型的重链恒定和轻链恒定区的表达载体，使得VH区段与载体中的CH区段有效连接，以及VL区段与载体中的CL区段有效连接。此外或备选地，重组表达载体可编码信号肽，其协助抗体链从宿主细胞分泌。抗体链基因可被克隆进载体，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端以符合读码框的方式相连。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷化信号)。此类调控序列例如被描述于Goeddel(Gene Expression Technology.1990Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA)中。本领域技术人员将理解，对表达载体的设计，包括对调控序列的选择，可根据下述因素来进行，例如，对将被转化的宿主细胞的选择，想要的蛋白的表达水平等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如，源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可使用非病毒调控序列，例如，泛素启动子或P-珠蛋白启动子。另有，由来自不同来源的序列构成的调控元件，例如SRa启动子系统，其含有SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复(Takebe et al.，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因协助对已引入载体的宿主细胞的选择(见，例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017，全部都是Axel et al.的)。例如，典型地，选择标记基因对引入载体的宿主细胞赋予对药物，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(使用甲氨喋呤选择/扩增，用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进宿主细胞。术语“转染”的多种形式意欲包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论了在真核细胞中特别是在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为此类真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更易于装配和分泌经正确折叠的并且具有免疫活性的抗体。已有报道称，抗体基因的原核生物表达对于生产高产率的活性抗体是无效的(Boss and Wood，1985Immunology Today6：12-13)。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，Urlaub and Chasin，1980Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77：4216-4220描述的，使用DHFR选择标记，例如，按照Kaufman and Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621所述)，NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，使用NS0骨髓瘤细胞时，另一表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中显示的GS基因表达系统。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或者抗体分泌进培养宿主细胞的培养基中。可使用标准的蛋白质纯化方法，从培养基中回收抗体。
双特异性分子
在另一方面，本发明涉及包含本发明的TrkB激动剂抗体的双特异性分子(例如，抗TrkB抗体或其片段)。本发明的TrkB激动性抗体可被衍生化至或连接至另外的功能分子，例如，另外的肽或蛋白(例如，另外的抗体或受体的配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的TrkB激动性抗体事实上可衍生化至或连接至超过一个其它功能分子，产生与超过两个不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也意欲被本文使用的术语“双特异性分子”所包括。为产生本发明的双特异性分子，可将本发明的抗体与一个或多个其它结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性相连(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合等等)，使得产生双特异性分子。
因此，本发明包括下述双特异性分子，其包含对TrkB的至少一个第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。
在一种实施方式中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或者其任何最小片段，例如Fv，或者单链构建体，如Ladner et al.美国专利号4,946,778所述，该文献的内容通过引用明确并入本文。
可通过使用本领域已知的方法缀合组成性的结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每种结合特异性可分别产生，然后互相缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联或交联试剂进行共价缀合。交联试剂的例子包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-SMCC)(见例如Karpovsky et al.，1984J.Exp.Med.160：1686；Liu et al.，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus，1985 Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan et al.，1985Science229：81-83和Glennie et al.，1987J.Immunol.139：2367-2375中描述的。缀合试剂是SATA和硫代-SMCC，两者都可从Pierce Chemical Co. (Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，可通过对两条重链C-末端铰链区的硫巯基键合来缀合它们。在一个具体的实施方式中，铰链区被修饰，以在缀合前含有奇数个巯基残基，例如一个。
或者，两个结合特异性可在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达并装配。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性抗体。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法被描述于例如美国专利号5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5,091,513、5,476,786、5,013,653、5,258,498和5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western印迹测定来验证。这些测定法每种通常通过利用带有对感兴趣的复合物特异的经标记试剂(例如抗体)，来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。
药物组合物
在一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其中含有与可药用载体配制的本发明的TrkB激动性抗体(例如单克隆抗体，或其抗原结合部分)之一或组合。此类组合物可包括(例如两个或多个不同的)结合分子之一或组合。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合的或具有互补活性的抗体或试剂的组合。
本发明的药物组合物还可以组合疗法施用，即，与其它试剂组合。例如，为治疗呼吸病症，组合疗法可包括与至少一种其它试剂组合的TrkB激动剂抗体。可用于组合疗法的治疗试剂的例子包括但不限于去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)。
在本文中使用时，“可药用载体”包括生理相容的任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。载体应当是适于口服、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)的。取决于施用途径，活性化合物可包衣在材料中，以保护化合物免遭酸的作用和可能使得化合物失活的其它自然条件。
本发明的药物组合物可包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保持亲本化合物的想要的生物活性并且不带来任何不想要的毒性作用的盐(见例如Berge，S.M.，et al.，1977J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源于无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等等)以及源于无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸和二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等等)的那些。碱加成盐包括源于碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等等)的那些以及源于无毒有机胺(例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等)的那些。
本发明的药物组合物还可包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子包括：水可溶的抗氧化剂，例如，抗坏血酸、半胱氨酸盐酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油溶性抗氧化剂，例如-抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。
可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防微生物存在可通过上文的灭菌步骤以及通过向组合物中加入多种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等)两者来确保。还可能想要向组合物中加入等张剂，例如糖、氯化钠等等。此外，可通过包括进延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来实现可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌的水溶液或分散剂以及无菌粉末，用于即制无菌可注射溶液或分散剂。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，设想其用于本发明的药物组合物中。补充性的活性化合物也可掺入组合物中。
治疗组合物典型地在生产和贮藏条件下应当是无菌并且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。可例如通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。在很多情况下，可在组合物中加入等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括进延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，来实现可注射组合物的延长吸收。
可通过将需要量的活性化合物与上文列举的成分之一或组合(如需要)掺入合适的溶剂，接着进行微滤灭菌，来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自上文列出的需要的其它成分的无菌载体，来制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分的粉末，再加上来自之前其经过滤灭菌的溶液的任何额外的想要的成分。
可与载体材料组合产生单剂量形式的活性成分的量根据被治疗的受试者以及特定的施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将在大约0.01％至大约99％的活性成分，大约0.1％至大约70％，或者大约1％至大约30％的活性成分，与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最想要的应答(例如治疗应答)。例如，可施用单次推注，可随时间施用若干分开的剂量，或者剂量可按照治疗情况的紧急性成比例降低或增加。尤其有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物以易于施用和使得剂量均匀。本文中使用的剂量单位形式指物理上离散的单位，适于被治疗的受试者用作为单一的剂量；每个单位含有经计算的预定量的活性化合物以与需要的药物载体结合产生想要的治疗效果。用于本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特性质和想要获得的特定治疗效果以及配制此类活性化合物用于治疗个体敏感性领域的内在限制决定，并且直接依赖于它们。
示例性的治疗方案包括每周施用两次、每周一次、每两周一次或者每月一次。用于本发明的TrkB激动性抗体的剂量方案包括：通过腹膜内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用下述剂量方案之一来给予抗体：例如，每周一次1mg/kg体重，持续4周，接着在剩余治疗期保持每周一次3mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种结合分子(例如单克隆抗体)，这种情况下，施用的每种抗体的剂量都落在指出的范围内。TrkB激动剂抗体通常以多次施用。单次剂量间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中TrkB结合分子的血液水平所指示的，间隔还可以是不规则的。在一些方法中，对剂量加以调节，以获得TrkB激动剂抗体合适的血浆浓度。
或者，TrkB激动剂抗体可作为持续释放的制剂施用，这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率根据患者中TrkB激动剂抗体的半寿期变化。通常，人抗体显示最长的半寿期，次之是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而改变。在预防性应用中，以相对不频繁的间隔在较长时间内施用相对低的剂量。一些患者余生都持续接受治疗。在治疗性应用中，一些时候需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直到疾病进展降低或者终止，或者直到患者显示出疾病的症状部分或完全减轻。之后，可对患者施用预防性方案。
活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可有所变化，以获得能有效实现针对特定患者、组合物和施用方式而言想要的治疗应答并且对患者没有毒性的活性成分量。选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括利用的本发明特定组合物的活性，或其酯、盐或酰胺，施用途径，施用时间，利用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，用于与利用的特定组合物组合的其它药物、化合物和/或材料，被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和之前的医疗史以及医药领域公知的其他因素。
可使用本领域已知的数种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据想要的结果而变化。本发明TrkB激动性抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓内或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。短语“肠胃外施用”在本文中表示并非肠道和局部施用的施用方式，通常通过注射来进行，其包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外或胸骨内注射和输注。
或者，本发明的TrkB激动性抗体可通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道内、直肠内、舌下或局部。
可用将保护化合物免于快速释放的载体来制备活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法已申请专利或是本领域技术人员通常已知的。见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可用本领域已知的医药装置来施用治疗组合物。例如，在一种实施方式中，本发明的治疗组合物可用无针头皮下注射装置施用，例如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556所示的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其示出了可植入的微输注泵，用于以受控速率分散药剂；美国专利号4,486,194，其示出了用于通过皮肤施用药剂的治疗设备；美国专利号4,447,233，其示出了用于以精确输注速率递送药剂的药剂输注泵；美国专利号4,447,224，其示出了可变流速的可植入输注装置，用于连续药物递送；美国专利号4,439,196，其示出了具有多个腔室的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其示出了一种渗透性药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。很多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中，可对本发明的TrkB激动性抗体加以配制，以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了很多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗组合物穿过BBB(如果需要的话)，可例如将其配制于脂质体中。关于生产脂质体的方法，见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可包含选择性运输进特定细胞或器官由此增强靶向药物递送的一种或多种部分(见例如V.V.Ranade，1989J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括：叶酸或生物素(见例如Low et al.的U.S.Pat.5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，1988Biochem. Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.，1995FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，1995Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe et al.，1995Am.J. Physiol.1233：134)；p120(Schreier et al.，1994J.Biol.Chem.269：9090)；还见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994FEBSLett.346：123；J.J.Killion； I.J.Fidler，1994Immunomethods 4：273。
小鼠模型
Mecp2KO(Mecp2-敲除)雄性和Mecp2HT(杂合体)雌性是用于研究雷特综合征(RTT)的非常有用的模型系统，因为这些生物显示出与受到RTT影响的女童相似的症状。Mecp2-KO雄性在4周时成为有症状的，展示出任何数量的下述症状：生长下降；降低的脑生长和神经元大小；震颤；运动受损；活动减退(癫痫发作)；呼吸不规则；增加的焦虑；驼背；刻板的前肢运动；以及后肢抱握。
小鼠中的Mecp2缺陷已知与BDNF低内源水平相关，并且破坏小鼠呼吸系统，并且具体地与去甲肾上腺素和5-羟色胺含量的进行性缺乏相关，导致对延髓呼吸系统的错误调控(Viemari et al.，(2005)J Neuroscience；25：11521)。所述破坏和呼吸困难显示比在Mecp2-KO小鼠中程度要大。在这些小鼠中观察到的中枢自主功能障碍包括：进行性恶化的呼吸失调(不稳定的呼吸型式，可变的周期和频繁的呼吸暂停)，导致在约2月龄时出现致命呼吸骤停；延长的心脏QT间隔；以及脑干髓质中酪氨酸羟化酶、去甲肾上腺素和5-羟色胺的剧烈降低，导致调节延髓呼吸网络的抑制性系统不平衡。
Mecp2HT雌性显示出相似但是延迟的表型(发病＝3月)，其被削弱并且没有快速恶化。它们能存活9-12个月。但是雌性Mecp2-HT也显示出下述特征的呼吸表型：更大的潮气量和肺容量，呼吸抑制，延长的呼吸暂停接着换气过度以及对缺氧的更强烈应答(Bissonnette and Knopp，(2006)Pediatric Research；59：513)。
本发明已被完整描述，将通过下述实施例和权利要求(阐述性而非进一步限制)对其进行进一步阐述。本领域技术人员将认识到或者使用不超过常规的实验，能够确定本文所述的具体步骤的多种等同方案。此类等同方案也在本发明和权利要求的范围内。本申请通篇中提到的所有参考文献，包括公布的专利和公开的专利申请都通过引用并入本文。
实施例
实施例1：施用TrkB激动剂抗体(C20)至Mecp2小鼠
每周两次，以3mg/kg体重的剂量，向4(早期症状)至8周(晚期症状)龄的Mecp2-KO和野生型雄性腹膜内给予TrkB激动剂抗体(C20)或盐水，对动物测试6至8周。每组测试9-14只小鼠，总共四组(施用盐水的野生型，施用mAb的野生型，施用盐水的敲除动物以及施用mAb的敲除动物)。Mecp2敲除小鼠购自Jackson Labs(品系
Figure BPA00001162230600571
Mecp2tm1.1Bird/J(#003890))。
如图1A所示，当施用TrkB激动剂mAb时，小鼠显示出体重降低。最顶上的线(白色方块示出数据点)代表施用盐水的Mecp2野生型小鼠。次顶部的线(黑色方块示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野生型小鼠。次底部的线(白色圆圈示出数据点)代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。最底部的线(黑色圆圈示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。如图1A所示，当施用TrkB激动剂抗体时，Mecp2小鼠在两种情况下都减轻体重。
在测试中，24小时周期测量下，6周(图1B左边)和8周(图1B右边)时，施用TrkB激动剂mAb的小鼠都显示出食物和水摄入的减少。
此外，如图1所示，当施用TrkB激动剂mAb时，小鼠还显示出体重减轻。最顶上的线(白色方块示出数据点)代表施用盐水的Mecp2野生型小鼠。次顶部的线(黑色方块示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野生型小鼠。次底部的线(白色圆圈示出数据点)代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。最底部的线(黑色圆圈示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。如图1所示，当施用TrkB激动剂抗体时，Mecp2小鼠在两种情况下都减轻体重。
此外，施用TrkB激动剂mAb能改善受处理的KO小鼠的前肢和后肢握力强度。这在图2A中展示，其中，方块示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的野生型(WT)小鼠；圆圈示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的敲除(KO)小鼠。此外，给予TrkB激动剂抗体的小鼠显示出体脂肪的降低以及瘦肉质含量的上升。这在图2B中显示，其中，方块示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的野生型(WT)小鼠；圆圈示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过的敲除(KO)小鼠。
施用TrkB激动剂mAb还能增加Mecp2-KO小鼠的寿命。已知Mecp2-KO小鼠大概在8至10周间死亡，但给予TrkB激动剂mAbs时能够活得更长。这至少在图3A中显示，其中，施用盐水的KO小鼠(KO/SAL)在8-10周龄左右死亡，而给予TrkB激动剂mAb的KO小鼠存活到23周龄(KO/C20)；在图3中，其中野生型小鼠被描述为WT，敲除小鼠被描述为KO，TrkB激动剂抗体被描述为C20。如图3所示，TrkB激动剂mAb-处理过的小鼠(KO/MAB)能存活至盐水处理的KO小鼠年龄的至少两倍。Mecp2-KO小鼠的致命呼吸失调被认为可通过用TrkB激动剂抗体刺激延髓呼吸网络系统中表达的TrkB来挽救；当Mecp2不存在和/或突变时，所述系统在小鼠和人类中被负面影响。
此外，TrkB激动剂抗体被认为能接近延髓呼吸系统的神经元，由此恢复KO小鼠的酪氨酸羟化酶(去甲肾上腺素合成的限速酶)、去甲肾上腺素和5-羟色胺的正常水平，从而预防呼吸缺陷以及延长寿命。已对这些呼吸和相关缺陷进行了研究，它们与延髓呼吸系统的去甲肾上腺素和5-羟色胺调节相关(Viemari et al.，(2005)J Neuroscience；25：11521)。用去甲肾上腺素再吸收抑制剂地昔帕明进行慢性治疗可挽救该表型，并显著延长Mecp2KO小鼠的寿命(Roux et al.(2007)Eur.J.Neuroscience；25：1915)。或者，TrkB激动剂抗体被认为能与包含颈动脉体的神经元上的TrkB受体结合，并重建被破坏的向脑(即皮质或下丘脑)中高级功能的传递(调节呼吸模式)。最后，TrkB激动剂抗体被认为作用于结节性脑感受神经节的TrkB受体上，并补偿该结构中报道的BDNF的减少，其对于于心脏呼吸内稳态来说是关键的(Ogier et al.，(2007)J.Neuroscience；27：10912)。
本发明方法中的TrkB激动剂抗体可以通过相同或相似的机制，以相同方式发挥作用(例如，可作用于重建这些神经递质在脑干延髓中的正常水平和平衡)。用[3H]标记的TrkB激动剂抗体进行放射成像可进一步验证这些发现，并且可进一步阐明可能的机制。如本文他处所述，本发明方法的TrkB激动剂抗体在一些实施方式中可与地昔帕明组合用于得到加性效果。
实施例2：向Mecp2小鼠施用TrkB激动剂抗体(C20)
为测试呼吸暂停，可使用Buxco Research Systems设计的系统进行全身体积描记法。将有知觉的、不受限的小鼠置于体积描记腔(垂直的树脂玻璃筒，直径4英寸，高5英寸)。保持空气流，以确保新鲜空气恒定交换进腔，提供食物、垫层和水。为精确评估呼吸暂停的频率，小鼠需要适应体积描记腔。一旦它们完全适应，以多种间隔进行气道应答记录，无须将动物从腔中移出。适应期和记录期不应超过2小时；因此，小鼠将在腔中一次不超过两小时。
在相同小鼠中，以每周不超过两次进行体积描记记录。一旦完成了体积描记记录，将小鼠返回其自己的笼子。如果在体积描记腔中小鼠显示出严重受限的呼吸或者明显的焦虑病征，可将它们从腔中移出并返回其自己的笼子。

Claims (45)

1.治疗、诊断、预防或改善呼吸病症相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的TrkB结合分子。
2.权利要求1的方法，其中所述TrkB结合分子是TrkB激动性抗体。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
4.权利要求2的方法，其中所述抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。
5.权利要求2的方法，其中所述抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
6.权利要求2的方法，其中所述抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
7.权利要求2的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
8.权利要求2的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
9.权利要求2的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：5、SEQID NO：9和SEQ ID NO：13中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
10.权利要求2的方法，其中所述抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
11.权利要求2的方法，其中所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
12.权利要求2的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
13.权利要求2的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
14.权利要求2的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：11和SEQ ID NO：15中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
15.治疗、诊断、预防或改善呼吸窘迫的症状的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的TrkB结合分子。
16.权利要求15的方法，其中所述TrkB结合分子是TrkB激动性抗体。
17.权利要求16的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
18.权利要求16的方法，其中所述抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。
19.权利要求16的方法，其中所述抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
20.权利要求16的方法，其中所述抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
21.权利要求16的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
22.权利要求16的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
23.权利要求16的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：5、SEQID NO：9和SEQ ID NO：13中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
24.权利要求16的方法，其中所述抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
25.权利要求16的方法，其中所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
26.权利要求16的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
27.权利要求16的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
28.权利要求16的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：11和SEQ ID NO：15中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
29.治疗、诊断、预防或改善与雷特综合征(RTT)相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的TrkB结合分子。
30.权利要求29的方法，其中所述TrkB结合分子是TrkB激动性抗体。
31.权利要求30的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
32.权利要求30的方法，其中所述抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。
33.权利要求30的方法，其中所述抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
34.权利要求30的方法，其中所述抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
35.权利要求30的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
36.权利要求30的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：1的重链可变区和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。
37.权利要求30的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：5、SEQID NO：9和SEQ ID NO：13中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
38.权利要求30的方法，其中所述抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。
39.权利要求30的方法，其中所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。
40.权利要求30的方法，其中所述抗体与竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
41.权利要求30的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：3的重链可变区和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。
42.权利要求30的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：11和SEQ ID NO：15中一个或多个的重链可变区，以及包含SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中一个或多个的轻链可变区。
43.治疗、诊断、预防或改善与呼吸病症相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体。
44.治疗、诊断、预防或改善呼吸窘迫的症状的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体。
45.治疗、诊断、预防或减轻与雷特综合征(RTT)相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体。
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