BRPI0810551A2

BRPI0810551A2 - moléculas e métodos para modulação da pró-proteína convertase subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)

Info

Publication number: BRPI0810551A2
Application number: BRPI0810551A
Authority: BR
Inventors: Longdon Yowe David; Mikhailov Dmitri; Fleming Tony
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2019-09-03
Also published as: AU2008237940A1; EP2137218A2; KR20100019440A; AR066042A1; MX2009010957A; CO6231040A2; JP2010523135A; ECSP099688A; IL201194A0; WO2008125623A2; US20100233177A1; ZA200906489B; TN2009000410A1; CN101679527A; TW200906439A; CA2681428A1; MA31304B1; EA200901376A1; GT200900264A; PE20090145A1

Abstract

patente de invenção: "moléculas e métodos para modulação da pró-proteína convertase subtilisinaiquexina tipo 9 (pcsk9)". a presente invenção refere-se a epitopos de pró-proteína convertase subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9), a composições que se ligam à pcsk9 e epitopos de pcsk9 a métodos de uso das composições.

Description

Relatório Descritivo da Patente da Invenção para ’’MOLÉCULAS

E MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DA PRÔ-PRDTBNA CONVERTASE

SUBTILISINA/QUEXINA TIPO 9 (PCSK9)”.

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antlgeno, epitopos ligados por essas moléculas e métodos para uso das molécu las.

Antecedentes

A pró-proteína convertase subtílisína/quexina tipo 9 (PCSK9) 10 (também conhecida como convertase 1 regulada por apoptose neural ou

NARC-1} é um membro da subfamília tipo subtilisina secretora de proteinase K de sennas proteases {Naureckiene e outros, 2003 Am. β/bcfiem. Brophys, 420:55-67). A PCSK9 é uma proteína secretada expressa principalmente nos rins, fígado e intestinos. Ela tem três domínios: um pré-dominio inibidor 15 (aminoácidos 1-152; incluindo uma sequência da sinal nos aminoácidos 130). um domínio serina protease (aminoácidos 153-448) e um domínio C~ terminal de 210 resíduos de comprimento (aminoácidos 449-692), que é rico em resíduos cisteína. A PCSK9 é sintetizada em um zimogénic que sofre divagem autacatalítica entre o pró-domimo e domínio catalítico no reticulo 20 endoplasmãtino. O pré-domínio permanece ligado à proteína madura após divagem, e o complexo é secretado.. O domínio rico em cisteína pode desempenhar um papel análogo aos domínios P (processamento) de outras serinas proteases tipo Furina/Quexina/Subtiíisína, que parecem ser essenciais para dobra e regulagem da protease ativada. Mutações em PQSK9 estão 25 associadas com níveis anormais de colesterol de lipoproteins de baixa densidade (LDL-c) no plasma sanguíneo (Horton e outros, 2005 Trends. H.bchem. Sd, 32(2):71-77).

Sumário

A presente invenção refere-se a epitopos de PCSK8, moléculas 30 de ligação à PCSK9 e métodos de uso das moléculas. Moléculas de ligação à PCSK9 interagem com PCSK9 e modulam funções de PCSK9. Moléculas de Ügação à PGSK9 podem ser usadas para aumentar os níveis de receptor de LDL (LDL-R) e reduzir níveis de colesterol.

Em várias aspectos, a invenção provê moléculas de ligação à PCSK9 que modulam (por exemplo, inibem) orna nu mais funções biológicas de PCSK9. Por exemplo, uma molécula de ligação à PCSK9 pode inibir ati5 vidade proteolítica de PCSK9 (por exemplo, proteolise do pró-dominio de PCSK9) e/ou interação entra PCSK9 e receptor de PCSK9 (por exemplo, ligação de PCSK9 à LDL-R). PCSK9 sub-regula LDL-R de uma maneira póstranscrípcíonal. Então, inibição de PCSK9 resulta em níveis de LDL-R aumentados. Níveis aumentados de LDL-R m vivo permitem absorção mediada 10 por LDL-R aumentada de LDL-c. Então, moléculas de ligação que interferem com regulagem de PQSK9 de LDL-R por fim reduzem níveis de LDL-c em circulação.

Moléculas de ligação à PCSK9 incluam, por exemplo, anticorpos que se ligam à PCSK9 (por exemplo, dentro de um domínio ou epitopo partí15 calar da PCSK9, tal como o domínio catalítica ou do domínio rico em çisteína) e polipeptídeos que incluem porções de ligação de antígeno de tais anticorpos. Moléculas de ligação é PCSK.9 também incluem, moléculas onde a porção de ligação não é derivada de um anticorpo, por exemplo, moléculas de ligação à PCSK9 derivadas de polípeptidios que têm uma dobra tipo imu- noglobulina, e onde a porção da ligação de antígeno é projetada para se ligar à PCSK9 através de aleatorizaçào, seleção e maturação de afinidade.

Daste modo, em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação à PCSK9 incluindo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga (por exemplo, especifícamente se liga) a uma 25 PCSK9, onde a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do domínio catalítico de PCSK9 humana (SEQ ID NO:1) dentro ou sobrepondo (por exemplo, compreendendo ou consistindo em todos ou uma porção) a um dos que seguem: (a) aminoácidos 168-177 de SEQ ID NO'.1 (isto è, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue: YRA-

DEYQPPDGG (SEQ ID NO:4); (b) aminoácidos 187-202 da SEQ ID NO.1 (isto é, um epltcpo dentre ou sobrepondo à sequência que segue: TSIQSDHREÍEGRVMV (SEQ ID NO:5)); (C) aminoácidos 206-219 da SEQ ID NO:1 (Isto é, um epitopo dentro ou e sobrepondo á sequência que segue; ENVPEEDGTR.FHRQ (SEQ ID NO:6); (d) aminoácidos 231-246 de SEQ ID NQ:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue: AGVVSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7)); (e) aminoácidos 277-283 da SEQ ID

NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue: VQPVGPL (SEQ ID NO:8)); (f) aminoácidos 336-349 da SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo á sequência que segue: VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9)): (g) aminoácidos 368-383 da SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentre ou sobrepondo à sequência que segue: II10 GASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO: 10)); ou (h) aminoácidos 426-439 da SEQ

ID NO:1 (isto é. um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue: EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO: 11)).

Por exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 166-171, 169-174 cu 172-177 da SEQ ID 15 NO:1; a porção de ligação de antígeno se liga a um epitepo dentro dos aminoácidos 187-193, 191-196, 194-199 ou 197-202 da SEQ ID NO:1; a porção de ligação de antígeno se liga a um epitepo dentro dos aminoácidos 206211, 209-214, 212-217, 215-219 da SEQ ID NQ:1; a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 231-2.37, 235-240, 20 238-243, 241-246 da SEQ ID NQ:1; a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 277-282 ou 279-283 da SEQ ID NO:1; a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 336-341, 339-343, 341-346 ou 344-349 da SEQ ID NO:1: a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 368-374, 25 3'7'2-377, 3'75-380 nu 378-383 da SEQ ID NO:1, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 426-431, 429-434, 432437 ou 435-439 da SEQ ID NG:1),

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação à PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antígeno 30 de um anticorpo que se liga (por exemplo, se hga espeçificamente a uma POSK9. onde a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do domínio rico am cisteína de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo a um dos que seguem: (a) aminoácidos 443-500 da SEQ ID NO:1; (b) aminoácidos 557-590; ou (c) aminoácidos 636-678.

Em várias modalidades, a porção de ligação de antigeno se liga específicamente a um epitopo de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo 5 dentro ou sobrepondo a um dos que seguem: (a) aminoácidos 443-458 da SEQ ID NQ:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo á sequência que segue; ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO; 1.2)).; (b) aminoácidos 459-478 da SEQ ID NO;1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue; TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO; 13)); (o) aminoácidos 488-500 10 da SEQ ID NO:1 {isto ê, um epitopo dentro ou sobrepondo â seguinte sequência: CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO; 14)); (d) aminoácidos 557-573 da SEQ ID NO:1 (isto ê, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue; HVI..TGCSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO:15)); (e) aminoácidos 577590 da SEQ ID NQ;1 (isto ê, um epitopo dentro ou sobrepondo â sequência 15 que segue; PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO: 18)); (f) aminoácidos 636645 da SEQ ID NQ:1 (isto ê, um epitopo dentro ou sobrepondo à sequência que segue; SALPGTSHVL (SEQ ID NO: 17)); (g) aminoácidos 659-677 da SEQ ID NQ;1 (isto é, um epitopo dentro eu sobrepondo á sequência que segue: RDVSTTGSTSEEAVTAVAl (SEQ ID NO: 18)).

Por exemplo, a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 443-449, 447-452, 450-455, 453-458 da SEQ ID NO:1; a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 459-465, 463-468, 468-471, 469-474 ou 47.2-476 da SEQ ID NQ:1; a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro dos ami25 ncãddos 486-491, 489-494, 492-497 ou 495-500 da SEQ ID ΝΟ.Ί: a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro des aminoácidos 557583, 561-568, 564-569, 567-572 ou 569-573 da SEQ ID NO:1; a porção de ligação de antigens se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 577-582, 580-585, 583-588 ou 586-590 da SEQ ID NQ:1; a porção de ligação de anti30 gene sa liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 636-643 ou 640-645 da SEQ IO NO;1; a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 659-665, 863-668, 685-670, 668-673 ou 671-677 da SEQ

IDNO:1.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula da ligação ã PCSK9 isolada incluindo uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especifícamente a) a uma PCSK9, onde a porção de ligação de antigeno se liga a um epitope dentro do prá-dominio de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo aos aminoácidos 89-134 da SEQ ID NO: 1,

Em várias modalidades, a porção de ligação de antigeno se liga especificamente a um epítopo de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo ao que segue: (a) aminoácidos 89-101 da SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobrepondo á sequência que segue: SQSERTARRLQAO (SEQ ID NO:2)); nu (b) aminoácidos 106-134 da SEQ ID NO:1 (isto é, um epítopo dentro ou sobrepondo á sequência que segue: GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3)). Por exemplo, a porção de ligação de antigeno se liga especifícamente a um epítopo dentro dos aminoácidos 123131 da SEQ ID NON.

Por exemplo, a porção de ligação de antigeno se liga a. um epitopo dentro dos aminoáoidos 89-94 , 92-97 ou 95-101 da SEQ ID NO:1; a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo dentro dos aminoácidos 106-111, 109-114, 112-117, 115-120, 116-123, 121-128, 124-129 ou 127134 da SEQ IDNO:1.

Em uma modalidade particular, a porção de ligação de antigeno se liga especificamente a um epitopo dentro do pró-dominio de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo aos aminoácidos 101-107 da SEQ ID NQ:1 (aminoácidos QAARRGY).

Em outra modalidade, a porção de ligação de antigeno se liga especifíoamente a um epitopo dentro do pré-dominio de PCSK9 dentro ou sobrepondo aos aminoácidos 123-132 da SEQ IO NO:1 (aminoácidos LVKMSGDLLE). Esses aminoácidos se encontram dentro dos aminoácidos 106-134 do prô-dominio de PCSK9 (SEQ ID NO:3; GYLTKILHVFHGLI..PGFLVKMSGDLLELA).

Em outra modalidade, a porção de ligação de antigeno se liga espeoificamsnte à PCSK9 com os aminoácidos 101-132 da SEQ ID ΝΟ.Ί (isto é, se liga a um epitope dentro da SEQ ID NO.2, um epitopo dentro da

SEQ ID NO: 3 ou um epitope que sobrepõe às SEQ ID NOs:2 e 3, Isto é. inclui pelo menos um amínoácido da SEQ ID NO:2 e da SEQ ID NO:3,

Em outra modalidade, a porção de ligação de antígeno se liga espeoificamente a uma PCSK9 dentro dos aminoácidos 101-132 da SEQ ID NÜí1 e compreende pelo menos um amínoácido da SEQ ID NO;2 (por exemplo, glutamina) e pelo menos um amínoácido da SEQ ID NO:3 (por exemplo, glicina e/ou tirosina).

Em outra modalidade,, a porção de ligação de antígeno se liga especifícamente à PCSK9 dentro dos aminoácidos 101-132 da SEQ IO NO:1 e compreende pelo menos um aminoácido da SEQ IO NQ:2 (por exemplo, glutamina) e pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO:3 (por exemplo, gíicína e/ou tirosi na).

Em outra modalidade, a porção de ligação de antígeno se liga específicamente á PCSK9 am um epitope que sobrepõe a pelo menos um aminoáoido da SEQ ID NO:2 (por exemplo, glut.am.ina) e pelo menos um aminoácido da SEQ. ID NO:3 (por exemplo, glicina e/ou tirosina).

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação à PCSK9 isolada que compete em caizamento (cross-compefíng) para ligação com qualquer uma das moléculas de ligação á PGSK9 acima mencionadas. Deste modo,, tais moléculas de ligação de competição cruzada podem, por exemplo, interferir com ligação (por exemplo, de um anticorpo ou outra molécula de ligação á PCSK9 compreendendo uma porção da ligação de antígeno de um anticorpo que se liga) a aminoácidos 101-107 ou 123-132 da SEQ ID NO:1 através de ligação a epitopos espacialmente próximos.

Em várias modalidades, a molécula de ligação à PCSK9 (por exemple, a molécula de ligação á PCSK9 que se liga a um epitopo dentro do domínio catalítico, dentro do domínio rico em cisteína ou dentro do prôdomlnio) é reativa cruzada com uma PCSK9 de um primata não-humano (por exemplo, um macaco cinomólogo ou um macaco rbesi/s). Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno é reativa cruzada com uma

PCSK9 de .uma espêde .de roedor, (por exemplo, PCSK9. de murino, PCSK9 de rata).

Em várias modalidades, a porção de ligação de antigens se liga a um epitopo iinear.

Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear. Em um exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear incluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de cada um dos epitopes lineares que seguem: (a) aminoácidos 89-101 da SEQ ID NQ:1; e (b) aminoácidos 106-134 da SEQ ÍD NO:1. Em outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo nãolinear incluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de cada um dos epitopos lineares que seguem: (a) aminoácidos 166-177 da SEQ ID ΝΟ.Ί; e (b) aminoácidos 443-458 da SEQ ID NO:1. Em ainda outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear incluindo, ou consistindo em, pelo manos uma porção de dois ou três dos epitopes lineares que seguem: (a) aminoácidos 187-202 da SEQ ÍD NO:1; (b) aminoácidos 231-246 da SEQ ID NO:1; e (c) aminoácidos 368- 383 da SEQ ID NO:1. Em outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo nàolinear incluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de cada um dos epitopes Imeares que seguem: (a) aminoácidos 206-219 da SEQ ÍD NO:1; e (b) aminoácidos 277-283 da SEQ ID NO:1. Em outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear mcluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de cada um dos epitopos lineares que segue: (a) aminoácidos 336-349 da SEQ ID NQ: 1; e (b) aminoácidos 426'439 da SEQ ID NO:1. E.m outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear incluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de dois ou três dos epitopos lineares que seguem: (a) aminoácidos 459-476 da SEQ ID NQ:1: (b) aminoácidos 486-509 da SEQ ID WO:1; e (c) aminoácidos 557-573 da SEQ ID NO:1, Em outro exemplo, a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear incluindo, ou consistindo em, pelo menos uma porção de dois ou três dos epitopos lineares: (a) aminoácidos 577-590 da SEQ ID NQ:1; (b) aminoácidos 636-645 da SEQ ID NO:1; e (c) aminoácidos 659-677 da SEQ ID ΝΟ.Ί.

Em uma modalidade particular, a porção de ligação de antígenos e liga a um epitope não-línear (por exemplo, um epitope conformaoional) compreendendo todos ou uma porção de (a) aminoácidos 101-10? da SEQ

ID NCH; e (b) aminoácidos 123-132 da SEQ ÍD NO:1,

Em várias modalidades, a eficácia de ligação das moléculas de ligação â PCSK9 se relaciona com a localização de ligação dentro de um domínio particular ou epitope de PCSK9.

Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno da molécula de ligação à PCSK5 se liga à PCSK9 com uma constante de dissociação (Ko) igual a ou menos do que 10 nM, 1 nM, 9,5 nM. 0,25 nM ou 0,1 nM.

Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno da molécula de ligação á PCSK9 se liga à PCSK9 de um primata nâo-humano (por exemplo, macaco cinemòlogo ou chimpanzé) com uma Kq igual a ou menos do que 0,3 nM.

Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno se liga à PCSK9 de camundongo com uma Ko igual a ou menos do que 0,5 nM..

O anticorpo pode ser um anticorpo quimérica (por exempla, humanizada) ou um anticorpo humano ou anticorpo humanizada.

Em outra modalidade, a porção de ligação de antígeno é uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo humano.

A porção de ligação de antígeno pode ser uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

A molécula de ligação à PCSK9 incluí, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um F(ab’);>, nu um fragmento Fv do anticorpo.:

Em uma modalidade, a molécula de ligação â PCSK9 é um anticorpo humano.

Em uma modalidade, a molécula de ligação à PCSK9 inclui um Fv de cadeia simples.

Em uma modalidade, a molécula de ligação à PCSK9 inclui um díacurpo (por exemplo, um diaccrpc de cadeia simples uu um diacorpo tendo ililililililililllililililililiiliill duas cadeias de polipeptídeo).

Em algumas modalidades, a porção de ligação de antigens do anticorpo é derivada de um anticorpo de um dos isotipos que seguem; IgG 1, lgG2, lgG3 ou ígG4. Em algumas modalidades, a porção de ligação de anil5 geno do anticorpo é derivada de um anticorpo do isotipo IgA ou IgE

A molécula de ligação â PCSK9 (por exemplo, a molécula de ligação à PCSK9 que se liga a um epitopo dentro do domínio catalítico, dentro do domínio rico em cisteina ou dentro do pró-domlnio) pode exibir uma ou mais de várias atividades biológicas. Em várias modalidades, a molécula IG de ligação à PCSK9 inibe ligação de PCSK9 a um ligante de PGSK9. Em algumas modalidades, a molécula de ligação à PCSK9 inibe ligação a ligante de PCSK9 em pH 7-8. Em algumas modalidades, a molécula de ligação à PCSK9 Inibe ligação em um pH abaixo de pH 7 (por exemple, em pH 5-7). Por exemplo., a molécula de ligação à PCSK9 inibe ligação de PGSK9 ao 15 ligante de PCSK9 em pelo menus 5%, 10%, 15%, 25% ou 50% com relação a um controle (por exemplo, com relação à ligação na ausência da molécula de ligação de PCSK9).

Por exemplo, a molécula de ligação á PGSK9 pode inibir ligação de PCSK9 a um receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) (por 20 exemplo, a molécula de ligação à PCSK9 Inibe ligação de PCSK9 a LDL-R em pH 7 e pH menor, por exemplo, pH 5-7).

O pró-domínío de PCSK9 é clivado a partir do, e permanece não-covalentemente associado com o, polipeptídío de PCSK9 maduro. Em uma modalidade, uma molécula de ligação à PCSK9 compete cem um pró25 domínio de PCSK9 para ligação ac dominie catalítico ou rico em cisterna (ou vice-versa) e inibe uma atividade biológica de PCSK9.

Em algumas modalidades, a molécula de ligação à PCSK9 inibe atividade proteolítíca de PCSK9 (por exemplo, proteólise do prò-dominio de PCSK9 ou de outro substrato de PCSK9). Por exemplo, a molécula de tiga30 ção â PCSK9 inibe a atividade proteulítica de PCSK9 em pelo menos 5%, 10%, 15%, 25% ou 50%, com relação a um controla (por exemplo, com relação à atividade na ausência da molécula de ligação rí PCSK9).

Em algumas modalidades, a molécula de ligação à PCSK9 inibo uma diminuição dependente de PCSK9 de LDL-R (por exemplo, degradação dependente de PCSK9 de LDL-R) em uma célula, por exemplo, um hepatúoito. Por exemplo., a molécula de ligação à PCSK9 inibe uma diminuição dependente de PCSK9 de LDL-R em pelo menos 5%. 10%, 15%, 25% ou 50% com relação a um controle (por exemplo, com relação à diminuição de LOLR na ausência de molécula de ligação de PCSK9). Nessas modalidades, um aumento no nível de LDL-R indica que a molécula de ligação à PCSK9 inibe a diminuição dependente de PCSK9 de LDL-R,

Em certas modalidades, uma molécula de ligação á PCSK9.. quando contatada com uma célula, por exempla, um bepatóoife, sob condições onde PCSK9 está presente, aumenta a absorção de LDL~c pelo hepatócito, com relação à absorção de LDL-C pelo hepatócito na ausência da molécula de ligação de PCSK9, Por exempla, a molécula de ligação à PCSK9 aumenta a absorção de LDL-c em pelo menos 5%, 10%, 15%, 25% ou 50%, oom relação a um controle (por exemplo, com relação à ligação na ausência de molécula de iigaçâo de PCSK9).

A molécula de Iigaçâo à PCSK9 pode se ligar à PCSK9 na presença de LDL-c e/ou ela pode se ligar à PCSK9 na presença de soro (por exemplo, na presença de pelo menos 1%. 5%, 10%, 25% ou 50% de soro).

A invenção refere-se também a moléculas de ligação à PCSK9 de não-a ntioorpo. Uma molécula de ligação ã PCSK9 de não-anticorpo inclui um domínio de ligação ã PCSK9 que tem uma sequência de aminoácido derivada de uma dobra tipo imunoglobulina (tipo Ig) de um polipeptídeo de nãoanticorpo, tai como um dos que seguem; tenasclna, N-oaderina, E~caderina, ICAM, títina, receptor de GCSF, receptor de cítocína, inibidor de glicosidasa, cromoproteina antibiótica, molécula de adesão à membrana mielína P0, CD6, CD4, CD2. MHC de classe 1, receptor de antígeno de célula T. domínio SET CD1 < CD2. e l de VCAM, domínio de imunoglobulina SE T l da proteína de ligação da míosína, domínio da imunoglobulina SET I de proteína de ligação à miosina H, domínio de imunoglobulina SET l de Te/ofeh”, NCAM, 7mtc/?/n^w, neuroglia, receptor de hormônio do crescimento, receptor de eri tropoietlna, receptor da prolactins, receptor de interferon -game, βgalactosidase/glucuronidase, β-gíucumnidase, transglutaminase, receptor de antígeno de célula T, superoxide dismutase, domínio de fator de tecido, citocroma F, proteína fluorescente verde, GroEL ou taumatina. Em geral, a sets quêneia de aminoácido do domínio de ligação à PCSK9 é alterado, com relação á sequência de aminoácido da dobra do tipo imunogiobulina, de modo que o domínio de ligação à PCSK9 espeoificamente se liga ã PCSK9 (isto ê, onde a dobra do tipo imunogiobulina não se liga especificamente à PCSK9)..

Em várias modalidades, a sequência de aminoácido do domínio 10 de ligação à PCSK9 é pelo menos 60% idêntica (por exemplo, pelo menos 66%, 75%, 80%, 85% ou S0% idêntica) a uma sequência de aminoácido de uma dobra do tipo imunogiobulina de uma flbronectina, um receptor de citocina ou uma caderina.

Fim várias modalidades, a sequência de aminoácido do domínio 15 de ligação à PCSK9 ê pelo menos 60%, 65%, 75%, 80%, 85% ou 90% idêntica a uma sequência de aminoácido de uma dobra do tipo imunogiobulina de um dos que seguem: tenascina, N-caderina., E-caderina, ICAM, titina, receptor de GCSF, receptor de citocina, inibidor de glioosídase, cromoproteina antibiótica, molécula de adesão á membrana da mieíina P0, CD8, CD4, CD2, 20 MHC classe I, receptor de antígeno de célula T, domínios SET CD1, CD2 e I de VCAM-1, dominio de imunogiobulina SET I da proteína de ligação da mi~ ocina C< domínio de imunogiobulina SET I da proteína de ligação à mlosina H, domínio de imunogiobulina SET I de Wo&írP, NCAM, Wãcbm neuroglia. receptor de hormônio do crescimento, receptor de eritropoietina, recep25 tor de prolactina, receptor de interferon-gama, β-gaíaotosídsse/glucuronidase, β-glucuronídase, transglutaminase, receptor de antígeno de célula T. superóxido dismutase, domínio de fator de tecido, cítocroma F, proteína fluorescente verde, GroEL ou traumatína.

Em várias modalidades, o dominio de ligação ã PCSK9 se liga á 30 PCSK9 com uma iguaí a ou menos dc que 10 nM (por exemplo, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 πΜ).

Em algumas modalidades, a dobra típo Ig é uma dobra tipo Ig de uma fibronectins, por exemplo, uma dobra tipo Ig de fibronectina tipo lit (por exemplo, uma dobra tipo Ig de módulo 10 de fibronectina III),

A invenção também provê peptídeos correspondendo a epítopos antigêninos de PCSK9. Em um aspecto, a invenção refere-se a um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a uma das sequências de aminoácido que seguem: YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4); TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NO:5); ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6); AGWSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO7); VQPVGPL (SEQ ID NO:8); VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9): HGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO: 10); EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO: 11); ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO: 12); TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO: 13); CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO: 14); HVLTGOSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO: 15); PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO: 16); SALPGTSHVL (SEQ ID NO: 17); RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO: 18); SQSERTARRLQAQ {SEQ ID NO:2); ou GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3).

Em outro aspecto, a invenção provê composiçóes para elícitaçâo de anticorpo que se ligam especitloamente á PCSK9 quando a composição é administrada a um animai. A composição inclui, por exemplo, um dos peptídeos que seguem: YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO.4); TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NO:5): ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6); AGWSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7); VQPVGPL (SEQ ID NO:8); VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9); HGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO: 10): EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO. 11); ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO: 12): TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO: 13), CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO: 14); HVLTGOSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO: 15); PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO: 16); SALPGTSHVL (SEQ ID NO; 17); RDVSTTGSTSEEAVTAVAl (SEQ ID NO: 18); SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2); ou GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3); um peptídeo da mesma com menos do que 5 mudanças de aminoácido; ou um fragmento da mesma (por exemplo, fragmentos contenda 5, 8, 7, 8, 9, 10., 11 ou 12 aminoácidos). O peptídeo pude ser modificado para aumentar a antigenicidade, por exemplo, através de acoplamento a uma proteína carreadora.

A Invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que incluí uma molécula de ligação à PCSK9 descrita aqui. A composição inclui, por exemplo, uma molécula de ligação à PCSK9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção refere-se também a métodos de uso de moléculas de ligação à PCSK9 descritas aqui.

Por exemplo, em um aspecto, a invenção refere-se a um método de aumento dos níveis de LDL-R em uma célula, por exemplo, um hepatócito. O método mclui contato do hepatòcíto com uma molécula de ligação ã PCSK9 (por exemplo, uma molécula de ligação à PCSK9 incluindo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma PÜSK9), deste modo reduzindo a sub-regulagem de LDL-R pela PCSK9 e aumentando os níveis de LDL-R no hepatocíto.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de aumento da absorção de LDL-c por uma célula, por exemplo, um hepatócito, Q método inclui contato do hepatocíto com uma molécula de ligação à PCSK9 (por exemplo, uma molécula de ligação à PCSK9 incluindo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga espeoibcamente a uma PCSK9), deste modo reduzindo a sub-regulagem de LDL-R por PCSK9 e aumentando a absorção de LCL-c pelo hepatocito.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método da modulação de atividade de PCSK9 em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo uma molécula de ligação â PCSK9 (por exemplo, uma molécula de ligação á PCSK9 incluindo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma PCSK9) que modula uma atividade biológica da PCSK9. A molécula de ligação á PCSK9 exibe uma ou mais das atividades que seguem: (a) inibição da ligação de PCSK9 a uma LDL-R: (b) inibição da atividade proteolítica da PCSK9; (o) inibição da diminuição dependente de PCSK9 de LDL-R em um hepatôcito; e (d) inibição da degradação dependente de PCSK9 de LDL-R em células hepáticas.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de redução de colesterol no plasma em um indivíduo, O método incluí administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica incluindo uma molécula de ligação á PCSK9 descrita aqui em uma quantidade eficaz para reduzir colesterol na plasma no indivíduo, A quantidade pode ser uma quantidade eficaz para reduzir LDL~c. A concentração de LDL-c no plasma do indivíduo pede ser reduzida em pelo menos 5%, com relação ac LDL-c no plasma antes da administração da composição (por exemplo, a concentração de LDL-c no plasma é reduzida em pelo menos 10%, 15% ou 20%), Em algumas modalidades, o indivíduo também está recebendo terapia com um segundo agente de redução de colesterol, tal como urna astatine.

Em várias modalidades, o indivíduo tem, ou está sob risco de, um distúrbio de lipideo (por exemplo, hiperlipidemía, hípedipidemia tipo 1, tipo lí, tipo III, tipo IV ou tipo V, hipertriglicendemía secundária, hipercolesterolemia, xantomatose, deficiência de colesterol acetiltransferase), Por exemplo, o indivíduo é hipercolesterolêmico ou está sob risco de hipercoiesterolemía, o indivíduo tem, cu està sob risco de, atercsclerose; o indivíduo tem ou està sob risco de, um distúrbio cardiovascular.

Em algumas modalidades, o indivíduo ê intolerante á estatina (por exemplo, o indivíduo sofre de efeitos colaterais adversos quando toma um fármaco de estatina) e/ou o indivíduo é resistente à terapia com estatina (por exemplo, a terapia cem estatina não causa redução de colesterol no indivíduo).

Em algumas modalidades, o nível de colesterol no plasma total do indivíduo é 200 mg/di ou mais, antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, o nível de LDL-c no plasma do indivíduo é 160 mg/dl ou mais, antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, a composição é administrada intravenosamente;

Em algumas modalidades, as moléculas de ligação à PCSK9 pedem ser usadas para preparar um medicamento para o tratamento de doença associada com níveis de colesterol altos.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são mostrados nos desenhos acompanhantes e no relatório descritivo abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão aparentes a partir da relatório descritivo e desenho e a partir das reivindicações.

Descrição dos Desenhos

A FIGURA 1 ê um diagrama esquemàtico de PCSK.9 humana, indicando a localização da peptídeo de sinal pró-dominio, domínio catalítica e dominie C-terminal (rico em cisteína) na sequência linear.

A FIGURA 2 ê uma mostra de um modelo estrutural tridimensional de PCSK9 humana. Os números indicam a localização de epitopos listados na Tabela 2..

A FIGURA 3 mostra os resultados dos estudas de afinidade de ligação Biacore de RI-Fab se ligando à PCSK9. Os sensogramas (linhas pretas denteadas) são as curvas de ligação de Hl-Fab em concentrações de 0,78. 1,56, 3,12, 6,25 e 12,5 nM. O ajuste global 1:1 (linhas preta lisas) dâ os parâmetros de ligação que seguem: ~ 3_;41 x 10'* (1/s), k₃ ~ 3,23 x 10'’ (1/Ms eKu™ 1,05e 1O'^S{M).

As FIGURAS 4A-C ilustram que H1-Fab pode (4A) romper a interação hPCSK9/l,DL-R e levar a (4B) níveis de LDL-R na superfície aumentados e (4C) absorção de LDL aumentada por células HepG2.

As FIGURAS 5A-C mostram c esquema de conexão de fluido de um sistema de espectrometria da massa de troca de deutério automático (DXMS). Posições de válvula para fase de proteôlise de carragamentofem linha, estágio de desolínização e estágio de separação do experimento são ilustradas nas FIGURAS 5A_; 5B e 5C, respectivamente,

A FIGURA 6 é um esquema mostrando os experimentos de trona de Hidrogênio/Deutério (H/D) complementares (isto é, experimentos de proteção, controle e ίπ-Π^Ο) e resultados esperados.

As FIGURAS 7A-B mostram a mudança observada em deuteração como uma função de número de resíduo de hPCSK9 para (A) os experimentos de proteção e (B) as experimentos In-D^O realizados em hPCSKS e complexo hPCSK9:H1.

A FIGURA 8 mostra o desenho da estrutura de cristal de hPCSK9 com as duas extensões de aminoácido (isto é, resíduos de amineãcido 101-107 (QAARRGY) e 123-132 (LVKMSGDLLE)) previstas para formar um epitopo não-linear.

Doscricão Detalhada

A presente invenção provê moléculas que se ligam â PCSK9 (“moléculas de ligação à PCSK9), particularmente anticorpos humanos e porções dos mesmos que se ligam à PCSK9 humana e modulam suas funções, Epitopos de PCSK9 e agentes que se ligam a esses epitopos são 10 também providos aqui.

A sequência de comprimento completo de PCSK9 humana (hPCSKG) é encontrada sob o Numero de Acesso Geobank® Gi: 119627065. gb|EAX06660.1, e ê mostrada na Tabela 1 como SEQ ID NO:1. Uma sequência de mRNA codificando hPCSK9 é encontrada sob o Número de A15 cesso GI; 31317306, NMJ 74936,

Tapeia 1. Sequência de Aminoácido de PCSK9 Humana

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDG LAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYWVLKEETHLSQ5ERTARRLQAQA ARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSÍP

WhILERÍTPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFE

NVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGWSGRDAGVAKGASMRSLRVL.NC QGKGTVSGTUGLEFiRKSQLVQPVGPLWLLPLAGGYSRVLNAACQRLARA GWLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRG VDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAE 25 LRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVW

SAHSGPTRMATAIARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRA HNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTG CSSHWEVEÜLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHR.EASIHASQCHAPGLECKV KEHGÍPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCWRSRDV 30 STTGSTSE EAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ (SEQ ID NO: 1)

As localizações do peptídeo de sinal prá-dominio, domínio catelitioo e domínio rico em cisteína O-terminaí na sequência linear de SEQ ÍD

N0:1 são mostradas na FIGURA 1, POSK9 humana é N-glicosilada em N533. Ela é sulfatada em ¥53 e no domínio catalítico (protease). A concentração de hPCSK9 em plasma humano varia de a partir de 50-600 ng/ml (Lagace e outros, 2008, J. Ctín. fox. 116(11):2995-3005), Certas mutações 5 em hPCSKO estão associadas com níveis no plasma elevados e reduzidos de LDL-c (Horton e outros, 2006 /tends. Srochem. Ser. 32(2):71-77). As mutações que seguem estão associadas com LDL-c elevada: S127R, F216L, □374Y, N425S e R496W. As mutações que seguem estão associadas com LDL-c reduzida: R46L ÁR97, G1Ô6R, Y142Y, L253F, A443T e C679X.

Sequências de aminoácido de PCSK9 de chimpanzé previstas são encontradas no Genbank^ sob No. de Acesso Gl: 114556790, XP_001154126: e No. de Acesso Gl: 114556788, XP„513430. A sequência de aminoácido de PCSK9 de camundongo é encontrada sob No. de Acesso Gi:23956352, NP 705793. A sequência de aminoácido de PCSK9 de rato é 15 encontrada sob No. de Acesso Gl .77020250, NP_954862. A sequência de aminoácido de hPCSK9 é 98,75¾ idêntica à PCSK9 de chimpanzé, 79,5% idêntica à PCSK9 de rato e 78,9% idêntica á PC5K9 de camundongo.

As sequências de aminoácido de epitopos de antígeno de hPCSKO e sua posição dentro da sequência de hPOSKO da SEQ ID NO:1 20 são listadas na Tabela 2.

Mete 2. .Egitg^rosantígênk;psde.hPCSK9

No.	sequência de aminoácido	SEQ ID NO:	domínio	posição
Ilill'	SQSERTARRLQAQ	\|\|\|ili\|\|\|	Pro	89-101
lllll	GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDL- LEt.A	llllfillll	Pro	100-134
lllll	YRADEYQPPDGG	4	Gat	166-177
lllll	TSIQSDHREIEGRVMV	llliilll	Cat	187-202
\|\|\|\|\|	ENVPEEDGTRFHRQ	6	Cat	206-219
6	AGWSGRDAGV.AK.GAS	7	Cat	231-246
lllll	VQPVGPL	8	Cat	277-283
8	VGATNAQDQPVTLG	9	Cat	336-349
9	HGASSDCSTCFVSQS	10	Cat	368'383

10	í EAWFPEDQRVLTPN	\| 11	; Cat	I 426-439

11	I ALPPSTHGAGWQLFCR	1 12	' Aafçr\|^ .	l 443-458
	í TVWSAHSGPTRMATAIAR
12	1 13	\| Crd	I 459-476

13	\| CSSFSRSGKRRGERM	14	: Crd	I 486-500
	....................................................................
14	\| HVLTGCSSHWEVEDLGT	i 15	I Crd	557-573
..........
15	I PVLRPRGQPNQCVG	I 16	I Crd	I 577-590
	-E··'··'·—-....................................................................		......3..............................
16	I SALPGTSHVL		I Crd	i 636-645
17	I RDVSTTGSTSEEAVTAVAl		\| Crd	659-677

pro-prô-dominie, caf~dnminio catalítico, crd-dominio rico em cisteína

A FIGURA 2 é uma mostra de um modelo estrutural tridimensional de hPCSKO. Qs conjuntos de epítopos lineares que seguem são próximos no modelo tridimensional: região 1 no pró-domínío (SEQ ID NO:2 e SEQ. ID NO:3)', região 2 no domínio catalítico e no domínio oatalítino/rico em cisteína (SEQ ID NQ:4 e SEQ ID NO: 12); região 3 no domínio catalitic-o (SEQ ID NO:5, SEQ ID NQ7 e SEQ ID NO:10); região 4 no domínio catalítico (SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8): região 5 no domínio catalítico (SEQ ID NO;9 e SEQ ID NO: 11); região 6 no domínio rico em cisteína (SEQ ID NOUS, SEQ 10 NO; 14 e SEQ ID NO:15); a região 7 no domínio rico em cistelna (SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO;17 e SEQ ID NQ.18),

Resíduos de aminoácidos nesses conjuntos de epítopos formam epítopos não-lineares.

O termo anticorpo” conforme aqui usado refere-se a um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação de antigeno (isto é, ’’porção de ligação de antigeno) ou cadeia simples (isto é, cadeia leve ou pesada) do mesmo. Um anticorpo intacto é uma gllcoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) ínteroonectadas por ligações dissutíetc. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como V_H) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, OH2 e CH3.. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VQ e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domí nio, Ct. As regiões V_H e podem ser subdivididas mais em regiões de hipervariabílidade. chamadas regiões de determinação de complementaridade (COR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura principal (FR). Cada Vh e Vi é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal amino para terminal oarbõxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico,

O termo porção de ligação de antigeno de um anticorpo, conforme aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retêm a habilidade em especifícamente se ligarem a um dado antigens (por exemplo, hPCSK9), Funções de ligação de antigeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo porção de ligação de antigeno de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios V_t, V_H e CH-,; um fragmento F(ab)₂, um fragmento bívalente compreendendo dois fragmentos Fab (geralmente um de uma cadeia pesada e um de uma cadeia leve) ligados por uma ponte dissulfeto na região coneofora; e fragmenta Fd consistindo nos dominies e CH1: um fragmento Fv consistindo nos domínios Vç e V_M de um braço único de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio simples (dAb) (Ward e outros, 1939 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio V^: e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).

Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv, V_L e \4h sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, através de um ligante de peptídeo artificial que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína única onde as regiões V_t e Vh emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (sc-Fv): vide, por exemplo, Bird e outros, 1988 Science

242:423-426; e Huston e outros, 1988 Proc. Natt Acad. Set 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única incluem uma ou mais “porções de ligação de antigeno'¹ de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidas usondo técnicas convencionais conhecidas daqueles versados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à atividade da mesma maneira que es anticorpos intactos.

Porções de ligação de antígeno podem ser também incorporadas a anticorpos de domínio única, maxicorpos, minícorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bís-scFv (vide, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005. Waters Sfotec/mofogy, 23, 9, 1126-1136). Porções de ligação de antígeno de anticorpos podem ser enxertadas em motecute mafnz (soaffofos^ baseados em polipeptídeos tal como Fibronectins tipo III (Fn3) (vide Patente U.S, No. 8.703,199. que descreve monocorpos de polipeptldio de fibronectína).

Porções de ligação de antígeno podem ser incorporadas a moléculas de cadeia única compreendendo um par de segmentos Fv em tandem (Vh“CH1-Vh-CH1) que, junto com polípeptidios de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígeno (Zapata e outros, 1995. ProfefoEng. 8(10):1057-1062: e Patente U.S. No, 5.641.870).

Uma molécula de ligação á PCSK.9 isolada”, conforme aqui usado, refere-se a uma molécula de ligação que é substancialmente livre de moléculas tendo especificidades antigénicas para antígenos outros que não POSK9 (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga á hPCSK9 é substanciaimente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos outros que não hPCSKS). Uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente é hPCSKG pode no entanto, ter reatividade cruzada para outros antígenos. tal como moléculas PCSK9 de outras espécies. Uma molécula de ligação é purificada” se ela for substancíalmente livre da material celular.

O termo composição de anticorpo monoclonal'¹ conforme aqui usado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra es pecifíoidade e afinidade de ligação únicas para um epitopo particular.

O termo anticorpo humano, conforme aqui usada, pretende incluir anticorpo tendo regiões variáveis onde ambas a estrutura principal e as regiões CDR sâo derivadas de sequências de origem humana. Ainda, se 5 o anticorpo contiver uma região constante, a região constante é também derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linha germínativa humana, ou versões matadas de sequências de linha germínativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de amínoácido não-codíficados por sequências humanas (por exemplo, muta10 ções introduzidas por mutagênese aleatória ou especifica de sitio /n v/fro ou por mutação somática in wvo). No entanto, o termo anticorpo humano, conforme usado aqui, não pretende inclui anticorpos onde sequências de QDR derivadas da linha germínativa de outras espécies de mamífero, tal como camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura principal huma15 na.

O termo anticorpo monoclonal humano refere-se a um anticorpo mostrando uma especificidade de ligação única que tem regiões variáveis onde ambas a estrutura principal e as regiões de CDR são derivadas de sequências humanas.. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal humano é 20 produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico (por exemplo, um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humano) fundida a uma célula imortalizada.

O termo anticorpo humano recombinante, conforme aqui usa.25 do, Incluí qualquer anticorpo humano que é preparado, expresso, criado ou isolado através de meios recombinantes, tal como um anticorpo isolado de urn animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromessomaí para genes da imunogíobuíina humana ou um hibridoma preparado a partir dete; um anticorpo isolado de uma célula hospedeiro iransfarma30 da para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma: um anticorpo isolado de uma biblioteca de anticorpo humano combinatorial recombinante; e um anticorpo preparada, expresso, criado ou isolado atra vês de outros meios que envolvem união de toda ou uma porção de uma sequência de gene da imuncglobulina humana com outra sequência de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis onde a estrutura principal e regiões de CDR sãc derivadas de sequências de ímunoglobulina de linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto. tais anticorpos humanos recembinantes podem ser submetidos ã mutagõnese ré vréo (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humanas for usado, mutagênese somática ré v/vo) e então as sequências de aminoácido das regiões e Vl dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas cem sequências e Vi da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpo humano em um humano.

Conforme aqui usado, “isotipo refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgGI ou lgG4) que é codificado pelo gene de região constante de cadeia pesada.

As expressões 'um anticorpo reconhecendo um antígeno” e um anticorpo específico para um antígeno são usadas intercomutavelmente aqui com o termo um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno.

Conforme aqui usado, uma molécula de ligação à PCSK9 (por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo) que específicamente se liga à PCSK9 pretende se referir a uma molécula de ligação á PCSK9 que se liga à PCSK9 com uma K-de 1 χ 1(Γ M ou menos. Uma molécula de ligação à PCSK9 (por exemplo, um anticorpo) que reage com cruzamento com um antígeno pretende se referir a uma molécula de ligação à PCSK9 que liga esse antígeno com uma de 1 χ 10'⁶ M ou menos. Uma molécula de ligação à PCSK9 (por exemplo, um anticorpo) que não reage com cruzamento com um dado antígeno pretende se referir a uma molécula de ligação à PCSK9 que não se hga detestavelmente ao dado antígeno ou se Hga com uma de 1 x 10^<J M ou mais. Em certas modalidades, tais moléculas de ligação que não reagem com cruzamento com o antígeno exibem ligação essencraímente não-deieotável contra essas proteínas em ensaios de ligação padrão.

Conforme aqui usado, o termo feita afinidade, quando se referindo a um anticorpo IgG, indica que o anticorpo tem uma Kn de 10 ^s M ou menos para um antígeno alvo.

Conforme aqui usado, o termo um epitopo dentro ou scbrepon5 do a” residues de aminoácido particulares refere-se a um epitopo que compreende, consiste em ou sobrepõe a todos ou uma porção de tais resíduos.

O termo epitopo ou determinante antigêníco refere-se a um sitio em um antígeno ao qual uma molécula de ligação à PCSK9 da invenção se liga especificamente. Epitopos podem ser formados ambos a partir de 10 aminoácidos contíguos ou aminoácidos nãn-contiguos justapostos por dobra terciária de uma proteína. Epitopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes desnaturantes, enquanto epitopes formados por dobra terciária são tipicamente perdidos em tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo inclui tipicamente pelo menos 3, 15 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. 12. 13. 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação de conformação espacial de epitopos incluem técnicas no campo e aqueles descritos aqui, por exemplo, cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear 2 dimensional (vide, por exemplo, Ep/fápe Mapping Pmícco/s in Mefoods in Mo/ecu/a.r B.fofogy, Vol.

86, G.E. Morris, Ed. (1996)).

Também compreendidas pela presente invenção são moléculas de ligação ã PCSK9 que se ligam ao (isto è. reconhecem) mesmo epitopo que as moléculas de ligação à PCSK9 descritas aqui. Moléculas de ligação á PCSK9 que se íigam ao mesma epitopo podem ser identificadas por sua ha25 bilídade em competir com cruzamento com (isto é, competitivamente inibir ligação de) uma molécula de ligação á PCSK9 de referência para um ante geno alvo de uma maneira estatisticamente significante. Inibição competitiva pode acontecer, por exemplo, se as moléculas de ligação à CPSK9 se ligarem a epitopos idênticos ou estruturalmente similares (por exemplo, epitopos 30 de sobreposição) ou epitopos espaoialmente proximais que, quando ligados, causa impedimento estérico entre os anticorpos.

Inibição competitiva pode ser determinada usando ensaios de rotina onde a molécula de ligação à PCSK9 sob teste inibe ligação específica de uma molécula de ligação à PCSK9 de referência a um antígeno comum, Vários tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radíoimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoen5 saio da enzima direto ou Indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição sanduíche (vide Stahli e outros, Metoods m Enzymofogy 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide Kirkland e outros, J. Immunol 137:3614 (1986)); ensaio rotulado direto de fase sólida, ensaio sanduíche rotulado direto de fase sólida (vide Harlow e Lane, Antfooc/tes.· A Laboratory 10 Mantra/, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de rotulação direta em fase sólida usando rotulador 1-125 (vida Morei e outros, Moi Immunol, 25(1):7 (1988); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (Cheung e outros, Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto (Moldenhauer e outros, Scand d Immuno/,. 32:77 (1990)).. Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno 15 purificado ligado a uma superfície sólida ou células carregando qualquer um desses, uma molécula de ligação à PCSK9 de teste não-rotulada e uma molécula de ligação á PCSK9 de referência rotulada. Inibição competitiva é medida através da determinação da quantidade de rotulador ligado á superfície sólida ou células na presença da molécula de ligação à PCSK9 de teste. Ge20 raiments a molécula de ligação à PCSK9 de teste está presente em excesso. Geralmente, quando uma molécula de ligação á PCSK9 de competição está presente em excesso, ela vai inibir ligação especifica de uma molécula de ligação à PC8K9 de referência a um antigens comum em pelo menos 5055%, 55-60%, 60-85%, 05-70%, 70-75% ou mais.

Outras técnicas incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epitopo, tal como análises de raio x de cristais de antígeno: complexos de molécula de ligação à PCSK9 que provê resolução atômica do epitopo. Outros métodos monitoram a ligação da molécula de ligação á PCSK9 a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno onde perda de liga30 ção devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epitopo. Ainda, métodos oombinatorlais computacionais para mapeamento de epitopo podem ser também usados. Esses métodos se aposam na habilidade da molécula de ligação á PCSK9 de interesse em isolar por afinidade peptídees curtes específicos de bibliotecas de peptídeo de exibição em faço combinatoriais. Qs peptídeos são então considerados como os mais importantes para a definição do epitopo correspondendo à molécula de ligação â PCSK9 usada para avaliar a biblioteca de peptídeo. Para mapeamento de epitopo, algoritmos computacionais foram também desenvolvidos, os quais foram mostrados mapear epitopos descontínuos conformacionais.

Conforme aqui usado, o termo indivíduo inclui qualquer animai humano ou nãc-humano.

Q termo animal nào-humano” inclui todos os vertebrados nãohumanos, por exemplo, mamíferos e não-mamiferos, tal como primates nãohumanos, roedores, coelhos, ovelha, cachorros, gatos, cavalos, vacas, aves, 15 anfíbios, répteis, etc.

Uma sequência de nucleotídeo é dita ser otimizada se ela tiver sido alterada para codificar uma sequência de aminoácido usando códons que são preferidos na célula ou organismo produtor, geralmente uma oélula eucariotica por exemplo, uma célula de levedura tal como Picfóa, uma célula 20 de inseto, uma célula de mamífero tal como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHQ) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídéu otimizada é projetada para codificar uma sequência de aminoácido idêntica ou quase idêntica â sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucieotideo de partida inicial, que é também conhecida como a sequência ’Me ori25 gem”.

Conforme aqui usada, o termo anticorpos projetadas humanas significa anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo, mas diferem em sequência. Tecnologias de exemplo incluem anticorpos projetados humanos produzidos por tecnologia de projeção humana de Kalobios. onde a sequên3Q cia da região de ligação de antígeno é derivada através de, por exemplo, mutação, ac invés de devido a substituições de aminoácido conservatives (vide, por exemplo. W02004/072266, W02005/069970).

Vários aspectos de invenção sào descritos em detalhes adicionais nas subseções que seguem.

Ensaios padrão para avaliar a habilidade de moléculas em se ligarem à PCSK9 de várias espécies, em particular epitopos de PCSK9, são 5 conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs e western blots. Determinação de se uma molécula de ligação á PC5K9 se liga a um epitopo específico de PCSK9 pode empregar um ensaio de competição de epitopo de peptídeo. Por exemplo, uma molécula de ligação à PCSK9 é incubada com um peptídeo correspondente a um epítopo de PCSK9 de interesse em 10 concentrações de saturação de peptídeo. A molécula de ligação à PCSKS pré-incubada è testada quanto à ligação ã PCSK9 imobilizada, por exemplo, através de análise Biacoré”'. Inibição da ligação á PCSK9 através da préincubaçâc com o peptídeo indica que a molécula de ligação à PCSKS se hga ao epitopo de peptídeo (vide, por exemplo. Publicação de Patente U.S. 15 20070072797). Cinétíca de ligação pode ser também avaliada através de ensatos padrão conhecidos na técnica, tal como análise Biacom?''. Ensaies para avaliar os efeitos de moléculas de ligação à PCSK9 sobre propriedades funcionais de PCSK9 são descritos em mais detalhes abaixo.

Deste modo, uma molécula de ligação à PCSK9 que inibe uma ou 20 mais dessas propriedades funcionais de PCSK9 (per exemplo, bioquímica, celular, fisiológica ou outras atividades biológicas ou similar), conforme determinado de acordo com metodologias conhecidas da técnica e descritas aqui, sem compreendida produzir uma diminuição estatisticamente significant© na propriedade funcional particular com relação àquela vista na au25 sência da molécula de ligação (por exemplo, quando uma molécula controle de especificidade irrelevante está presente). Uma molécula de ligação à PCSK9 que inibe atividade de PCSKS afeta tal diminuição estatisticamente significante em pele menos 5% dc parâmetro medido. Em certas modalidades, um anticorpo ou outra molécula de ligação â PCSK9 pode produzir uma 30 diminuição na propriedade funcional selecionada de pele menos 10%, 20%, 30% ou 50% comparado com controle. Em algumas modalidades, inibição de PCSK9 é determinada através da medição dos níveis de LDL-R. Um au.......................................................................................................................................................... ............ ..................................

mento nos níveis de LDL-R na presença de uma molécula de ligação à PCSK9 indica que a molécula de ligação à PCSK9 inibe PCSK9.

Anticorpos

Os anticorpos anti-PCSKS descritos aqui incluem anticorpos monoclonais humanos, Em algumas modalidades, as porções de ligação de antígeno de anticorpos que se ligam à PCSK9 (por exemplo, cadeias Vh e Vt) são misturadas e combinadas para criar outras moléculas de ligação anti-PCSK9. A ligação de tais anticorpos misturados e combinados pode ser testada usando os ensaios de ligação acima mencionados (por exemplo, 10 ELISAs). Quando selecionando uma Vh para misturar e combinar com uma sequência particular, tipicamente uma pessoa seleciona que ê estruturalmente similar à VQ que ela substitm no empa rei hamento com aquela V^. Da mesma maneira, uma sequência de cadeia pesada de comprimento integrai de um emparelhamento de cadeia pesada de comprimento inte15 gral/cadeia leve de comprimento integral particular é geralmente substituída com uma sequência de cadeia pesada de comprimento completo estruturalmente similar, Da mesma maneira, uma sequência Vl de um par particular deve ser substituída com uma sequência V< estruturalmente similar, Da mesma maneira, uma sequência de cadeia leve de comprimento completo 20 de um par de cadeia pesada da comprimento integral/oadeia leve de comprimento integral particular deve ser substituída com uma sequência de cadeia leve de comprimento integral estruturalmente similar. Identificação de similaridade estrutural neste contexto é um processe bem conhecido na técnica.

Em outros aspectos, a invenção provê anticorpos que compreendem a cadeia pesada e a cadeia leve CDRls, CDR2s e CDR3s de um ou mais anticorpos de ligação à PCSK9, em várias combinações. Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar à PCSK9 e que especificidade de ligação de antígeno é provida phncipaImente pelas regiões CDR1,2 e 3, as 30 sequências CDR1, 2 e 3 de e as sequências CDR1, 2 e 3 de Vj. podem ser misturadas e combinadas (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas). Ligação à PCSKO de tais anticorpos misturados e combinados pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos aqui (por exemplo. ELiSAs). Quando as sequências CDR de V_Ksão misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de V« particular deve ser substituída cem uma sequência(s) 5 CDR estruturalmente similar. Da mesma maneira, guandu sequências CDR de V_tsâo misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência V, particular deve ser substituída com sequência(s) de CDR estruturalmente similares. Identificação de similaridade estrutural neste contexto è um processo bem conhecido na técnica.

'10 Conforme aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves da comprimento integral que sâo ^í!c produto de” ou derivadas de uma sequência de linha germinativa particular se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento integral dc anticorpo forem obtidas a partir de um sistema que 15 usa genes de imunoglobulina de linha germinativa humana na fonte das sequências. Em tal sistema, um anticorpo humano é criado em um camundongo transgénico carregando genes da imunoglobulina humana. O transgõnico é imunizado com o antígeno de interesse (por exemplo, um epitope de hPSCKS descrito aqui). Altemativamente. um anticorpo humano è identifica20 do ao prover uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana exposta em tags e avaliação da biblioteca com o antígeno de interesse (por exemplo, hPCSKS ou um epitopo de hPCSKS descrito aqui).

Um anticorpo humano que è o produto de” ou derivado de uma sequência da imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser 25 identificado como tal através de comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências de aminoácido de imunoglobulinas de Imha germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana que é mais próxima em sequência (isto é, identidade % maior) da sequência do anticorpo humano, Um anticorpo humano que 30 é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido comparado com a sequência codificada com a linha germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou mutações direcionadas ao sítio artificiais. No entanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente tem uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido codificada por um gene da imunoglobulina da linha 5 germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linha germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo 10 menos 95% ou até mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácido à sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina de linha germinativa.

A identidade percentual entra duas sequências è uma função do número de posições de identidade compartilhadas pelas sequências (isto é, 15 % de identidade ~ No. de posições de identldade/total de Nu. de posições x

100), levando em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre duas sequências são determinadas usando o algoritmo de 20 E. Meyers e W. Miller (1988 Compuf. Appí Bíoscí.. 4:11-17) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.

'Tipicamente. uma V_K ou V_t de um anticorpo humano derivado de 25 uma sequência de linha germinativa humana particular vai mostrar diferenças de não mais do que 10 aminoácidos da sequência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certos casos, a V_H ou do anticorpo humano pode mostrar diferença de não mais do que 5, ou até mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1. aminoácidos da se30 quência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa.

Ant/corpos de oameddeo

Proteínas de anticorpo obtidas de membros das famílias camelo e dromedário (Came/os bacbwws e Carérés dromedários), incluindo membros do Novo Mundo tal como espécies ihama (Lama paccos, tame g/ama e Lama vicugna), foram caracterizadas com ralação ao tamanho, complexida5 de estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG encontrados na natureza nesta família de mamíferos não têm cadeias leves, e são então estruturalmente distintos da estrutura quaternária da quatro cadeias tendo duas cadeias pesadas e duas leves típicas para anticorpos de outros animais. Vide WO 94/04678.

Uma região do anticorpo de camelideo que é o domínio variável único, pequeno, identificada como Vhh pode ser obtida através de projeção genética para dar uma proteína pequena tendo alta afinidade para um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo, de peso molecular baixo., conhecida como nanocorpo de camelideo’. Vide Patente U.S. No.

5.759.808; vide também Stijlemans e outros, 2004 J. Sré/.. Criem.. 279: 12561281: Dumoulin e outros, 2003 Afafure 424:783-788; Pleschberger e outros, 2003 Srôconfogafe Chem.. 14: 440-448; Ccrtez-Retamozo e outros, 2002 rét J, Cancer 80: 456-52; e Lamvereys e outros, 1998 0480 J. 17: 3512-3520. Bibliotecas projetadas de anticorpos e fragmentos de anticorpo da camelideo 20 estão comercia Imente disponíveis, por exemplo, da Ablynx, Ghent, Bélgica.

Como com outros anticorpos de origem não-humana, uma sequência de aminoâcído de um anticorpo de camelideo pode ser alterada recombinantemente para obter uma sequência que lembra mais proximamente urna sequência humana, isto é, o nanocorpo pode ser humanizado. Então a antl25 genicidade baixa natural de anticorpos de camelideo para humanos pode ser reduzida mais.

O nanocerpo de camelideo tem um peso molecular aproximadamente um décimo daquele de uma molécula IgG humana, s a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanometres. Uma consequência 30 do tamanho pequeno é a habilidade de nanocorpos de camelideo em se ligarem a sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis para proteínas de anticorpo maiores, isto é, nanocorpos de camelideo sãc úteis como rea31 gentes para detectar antígenos que são de outro modo crípticcs usando técnicas imunológicas clássicas, e como possíveis agentes terapêuticos. Então, ainda outra consequência de tamanho pequeno é que um nanocorpo de camelldeo pode inibir cerno um resultado de ligação a um sitio específico em 5 uma ranhura ou fissura estreita de uma proteína alvo, e então pode servir em uma capacidade que lembra mais proximamente a função de um fármaoo de peso molecular baixo clássico do que aquela de um anticorpo clássico.

peso molecular baixo e o tamanho compacto resultam ainda em nanocorpos de camelideo sendo extremamente termoesteveis, estáveis 10 a pH extremo e à digestão proteolífica e pobremente antigénicos. Outra consequência é que nanocorpos de camelideo se movem prontamente do sistema circulatório para tecidos e mesmo através da barreira sangue-cérebro e podem tratar distúrbios que afetam o tecida nervoso. Nanocorpos podem ainda facilitar transporte de fármaco através da barreira sangue cérebro. Ví15 de Publicação de Patente U.S. No. 20340161738 publicada em 19 de agosto de 2004. Essas características combinadas com a antigenicidade baixa em humanos indica maior potencial terapêutica. Ainda, essas moléculas podem sei íntegralmente expressas em células procariòticas tal como E cu/À

Desta modo, uma característica da presente invenção é um anti 20 corpo de camelideo ou nanocorpo de camelideo tendo alta afinidade para PCSK9. Em certas modalidades aqui, o anticorpo ou nanocorpo de camelídeo é naturalmente produzida na animai camelideo. isto é, é produzido pelo camelideo seguindo imunização com PCSK9 nu um fragmento de peptldeo da mesma, usando técnicas descritas aqui para outras anticorpos. Altemati25 vamente, o nanocorpo de camelideo anti--PCSK9 é projetado, isto ê, produzida através de seleção, por exemplo, a partir de uma biblioteca de fago mostrando proteínas de nanocorpo de camelideo apropriadamente mutagenaízadas usando procedimentos de panning” cam PCSK9 au epitopo de PCSK9 descrito aqui como um alvo. Nanocarpos projetados podem ainda 30 ser customizados através de projeção genética para aumentar a meia-vida em um indivíduo recipiente de 45 minutes a duas semanas.

Diacorpos

Diacorpos são moléculas biespecificas, bivalentes, onde domínios V_H e Vt sâo expressos em ume cadeia de poiipeptídio única, conectados por um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios V_H e Vt emparelham corn do5 minios complementares de outra cadeia, deste modo criando dois sítios de hgação de antígeno (vide, por exemplo, Holliger e outros, 1993. Proc. NaF Acad. Scl USA 90:6444-6448; Poljak e outros 1994, Structure 2:1121-1123). Diacorpos pedem ser produzidos expressando duas cadeias de polipeptídeo ou oom a estrutura Vha-Vub © Vns-VtA (configuração V_H-V;.) eu Vla-Vls (confí10 guração V_l-Vh) dentro da mesma célula. A maioria deles pode ser expressa em forma solúvel em bactérias.

Diacorpos de cadeia simples (scDb) são produzidos através de conexão de duas cadeias de poiipeptídio de formação de diacorpo com ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácido (vide Hollífer e Wín15 ter, 1997 Cancer frnmunof, frnmunother,, 45(3-4): 128-30; Wu e outros, 1996 /ntmunofechno/ogy, 2(1): 21-36). scDb pude ser expresso em bactérias em forma monomérica ativa, solúvel, (vide Holliger e Winter, 1997 Cancer Immuno;'. tmmunofher., 45 (34): 128-30; Wu e outras, 1996 /mmunofec/mo/ogy, 2(1): 21-38; Plucktbun e Pack, 1997 /n?munofechno/ngy, 3(2): 83-105; Ridg20 way e outros, 1996 Prote/r? Eng,, 9(7): 617-21),

Um diacorpo pode ser fundido a Fc para gerar um “dí-díacerpo (vide Lu e outros, 2004 J. Biol. Chem., 279(4); 2856-65).

Anticorpos projetados e modificadas

Um anticorpo da invenção pode ser preparado usando um anti25 corpo tendo uma ou mais sequências V_H e/ou como material de partida para projetar um anticorpo modificado, anticorpo modificado que pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida, Um anticorpo pode ser projetado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, Vh e/ou V<), por exemplo, dentro de uma ou 30 mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura principal, Adicionalmente ou altematívamente, um anticorpo pode ser projetado através da modificação de residues dentre da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, pare alterar a(s) funçãc(ões) efetora(s) do anticorpo.

Um tipo de projeção de região variável que pode ser realizado é enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis CDRs de cadeias pesada e leve. Por esta razão, as sequências de aminoaside dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências fora das CDRs. Devido ao fato das sequências de CDR serem responsáveis pela maioria das interações anlicorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural especifico enxertarias em sequências de estrutura principal de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann e outros. 1998 Nature 332: 323-327; Jones o outros, 1986 Nature 3.21: 522-525; Queen e outros, 1989 Proc. Naf/, Acad Sc/. U.S.A. 86:10029-16033: Patente U.S. No. 5.225.539 e Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5 585.089: 5.693.762 e 6.180.370).

Sequências de estrutura principal podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo de linha germmativa. Por exemplo, sequências de DNA de linha germinativa para genes de região variável de cadeias pesada e leve humanas podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinativa humana VBase” (disponível na Internet no www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat e outros, 1991 Sequences of Prote/ns of /mmuno/og/ca/ /nferest, Quinta Edição, U.S. Department of Hea/th and Human Sendees. N/H Pubf/caf/on No. 91-3242: Tomlinson e outros, 1992, J. Mo/. 8/o/. 22.7:776-798: e Cox e outros, 1994 Ear. J. /mmuno/. 24: 827-836: os conteúdos de cada um são aqui expressamente incorporados a titulo de referência.

As sequências CDR.1, 2 e 3 de V_K e as sequências CDR1, 2 a 3 de V_t podem ser enxertarias em regiões de estrutura principal que têm a sequência idêntica áqueia encontrada no gene de imunogiobulina de linha germinativa da qual a sequência de estrutura principal ê derivada, ou as sequências de COR podem ser enxertadas em regiões de estrutura principal que contêm uma ou mais mutações comparado com as sequências de linha germinativa. Por exemplo, foi constatado que em certos casos ê benéfico mutar resíduos dentro das regiões de estrutura principal para manter ou aumentar a habilidade de ligação de antigeno do anticorpo (vrde, por exemplo. Patentes U.S, Nos. 5.530.101: 5.585,089; 5.693.762 e 6,180,370)..

CDRs podem ser também enxertadas em regiões de estrutura principal de polipeptídios outras que não domínios de imunoglobuíina, Mo/écu/a matnz (scaffb/ds7 apropriados formam uma estrutura principal confermacíonalmente estável que mostra os resíduos enxertados de modo que eles formam uma superfície localizada e ligam o alvo de interesse (por exemplo, PCSK9). Por exemplo, CDRs podem ser enxertadas em um scaWd onde as regiões de estrutura principal são baseadas em fibronectina, anquirina_t íipocalina, neocarzinostaína, citocroma b, dedo de zinco CP1, PST1, coiled coll, LACI-D1, domínio Z ou tendramisate (vide, por exemplo, Nygren e Uhlen, 1997 Current Op/n/on in Structural Biology, 7, 463-469),

Ostro tipo de modificação de região variável é mutação de resíduos de aminoácído dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de V_H e/ou V_t para então melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como maturação de afinidade. Mutagènase direcionada a sítio ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutaçãofões), e o efeito sobre ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaies /?? vitro ou ir? vivo conforma aqui descrito. Modificações conservatives podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoáoido. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco residues dentro de uma região de CDR são alterados.

Qs anticorpos projetados da invenção incluem aqueles onde modificações foram feitas em resíduos da estrutura principal dentro de e/ou W, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo, Tipicamente tais modificações da estrutura principal são feitas para diminuir a imu~ nogenicidade do anticorpo. Por exemplo, urna abordagem é retromutar um ou mais resíduos de estrutura principal para a sequência de linha germínativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação 5 somática pode conter resíduos de estrutura principal que diferem da sequência de linha germinatíva da qual o anticorpo ê derivado. Tais residues podem ser identificados através da comparação das sequências de estrutura principal do anticorpo com as sequências de linha germinatíva da qual o anticorpo è derivado, Para retomar as sequências de região de estrutura prin10 cipal para sua configuração de linha germlnativa, as mutações somáticas podem ser retromutadas para a sequência da linha germlnativa através de_;por exemplo, mutagênese direcionada ao sitio ou mutagênese mediada por PCR, Tais anticorpos retromutados pretendem também ser compreendidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de estrutura principal enveive mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura principal, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epitopos de célula T para então reduzir imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é também referida como ’’desimunização” e é descrita em mais deta20 lhes na Publicação da Patente U.S. No, 20030153043 de Can e outros.

Em adição ou alternativa às modificações feitas dentro das regiões de estrutura principal ou CDR, anticorpos da invenção podem ser projetados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, taí como meia-vida no 25 soro, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citofoxidez celular dependente de antígeno. Ainda, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo., uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, nova mente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo.

Em uma modalidade, a região de união de CHI è modificada de modo que o número de resíduos cisteína na região de união é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita ainda na Pa36 tente U.S. Ne. 5.677.425 de Bodmer e outros, O número de resíduos cisteína na região de união de CH1 ê alterado para, por exemplo, facilitar montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de união de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de união de Fc de modo que o anticorpo tem ligação de proteína A Stopby/ococcyf (SpA) prejudicada com relação à ligação de SpA do domínio de união de Fc nativo. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente U.S. No. 6.165.745 de Ward e outros.

Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, a Patente U.S. No. 6.277.376 descreve as mutações que seguem em um IgG que aumenta sua meia-vida in vivo: T252L, T254S, T256F. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epitopo de ligação de receptor selvagem obtido de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de um IgG, conforme descrito nas Patentes U.S, Nos. 5.889.046 e 6.121.022 de Presta e outros.

Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido cem um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções afetaras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um lígante efetor, mas retém a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo de origem. O lígante efetor para o qual afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc nu a componente C1 de complementa. Esta abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 5.624,821 a 5.648,260, ambas para Winter e outros.

Em outra modalidade, um nu mais aminoácidos selecionados de residues de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tem ligação com C1q alterada e/ou citoxicidade complemerUo-dependente (CDC) reduzida ou abolida. Esta a~ bordagem é descrita em mais detalhes na Patente U.S. No. 6.194.551 de

Iduscgie e outras.

Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para então alterar a habilidade do anticorpo em fixar complemento. Esta abordagem é descrita mais no WO 94/29351 de Bodmer e outros.

Em ainda outra modalidade, a região Fc è modificada para au10 rnentar a habilidade do anticorpo em mediar citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita mais no WO 00/420'72 de Presta. Além disso, os sítios de ligação em lgG1 humano para FcyRI, FcyRII, FoyRíll e FcRn foram mapea15 dos e variantes oom ligação aperfeiçoada foram descritas (vide Shields, R.l.

e outros, 2001 J, Sfo/, Chem. 270:0591-6604).

Em ainda outra modalidade, a glicosílaç-ão de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosiiado pode ser feito (isto é, o anticorpo não tem glicosílação). Gliccsilação pode ser alterada, por exemplo.

para aumentar a afinidade do anticorpo para um antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas através de. por exemplo, alteração de um ou mais sitios de glicosllação dentro da sequência de anticorpo. Por exempto, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas que resultam em eliminação de um ou mais sítios de glicosllação de estrutural prin25 oipai de região variável para então eliminar glicosllação neste sitio. Tal aglioosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6,350.861 de Co e outros.

Adicionalmente cu aiternativamente, um anticorpo pode ser feito.

o qual tem tipo da glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosiia ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac divididas aumentadas. Tais padrões de glicosilação alie redos foram demonstrados aumentar a habilidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas através de, por exemplo, expressão do anticorpo na célula hospedeiro com mecânica de glicosilaçâo alterada. Células com mecânica de glicosilação alterada foram 5 descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiro onde expressar anticorpos reoombinantes da invenção para então produzir um anticorpo com gliocsilaçâo alterada. Por exemplo, a EP 1,178,195 de Hang e outros descreve uma cepa de célula com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucoslí transferase, de modo que os anticorpos 10 expressos em tal cepa celular exibem hipofuoosilação, A Publicação PCT

WO 03/035836 da Presta descreve uma cepa de célula CHO variante, células Lecl3, com habilidade reduzida em ligar fucose a carboidrates ligados a Asn(297), também resultando em hípofucosilaçâo de anticorpos expressos nesta célula hospedeiro (vide também Shields, R.L. e outros, 2002, J. a/o/.

Chem, 277'. 26733-20740). O WO 99/54342 de Umana e outros descreve cepas de célula projetadas para expressar glicosil transferases de modificação de glicuproteína (por exemplo, beta(1,4)-N acetílglicosaminlltransferase III (GnTIll)) de modo que os anticorpos expressos nas cepas de célula projetadas exibem estruturas GlcNac divisoras que resultam em atividade ADCC 20 aumentada dos anticorpos (vide também Umana e outros, 1999 Nat, Biotech. 17:176-180).

Outra modificação dos anticorpos aqui que è compreendida pela invenção é peguilaçâo. Um anticorpo pode ser pegulíado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pe25 guilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivada de aldeido de PEG, sub condições onde uma ou mais porções de PEG ficam ligadas ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilaçâo pode ser realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação som 30 uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em âgua reativo análogo). Conforme aqui usado, o termo polietileno glicul pretende compreender qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C1Q) alcòxí- ou arilõxi-poiietilenu glicol ou pulietileno glicol maleimída. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peg ui lado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos no campo e podem ser aplicados aos anticorpos da in5 venção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimura e outros e EP 0 401 384 de Ishikawa e outros,

Ainda, peguilação pode ser conseguida em qualquer parte de um polipeptidio de ligação â PCSK9 da invenção através da introdução de um aminoácido não-natural. Certos aminoácidos não-naturais podem ser 10 introduzidos através da tecnologia descrita em Deiters e outros, J. Am, Chem. Soc. 125:11782-11783, 2003; Wang e Schultz, Sc/ence 301:964-967, 2003: Wang e outros, Sc/ence 292:498-500, 2001; Zhang e outros, Sc/ence 303: 371-373, 2004 ou na Patente U S, No. 7.083,970. Em suma, alguns dos sistemas de expressão envolvem mutagênese direcionada a sítio para intro15 duzir um còdon de não-sentido, tal como um TAG âmbar, na estrutura de leitura aberta codificando um polipeptidio da invenção. Tais vetares de expressão são então introduzidos em um hospedeiro que pode utilizar um tRNA especifico para o códon de não-sentido introduzido e carregada com o aminoácido nãanatural de escolha, Aminoácidos não-naturais particulares 20 que são benéficos para propósito de conjugação de porções ao polipeptidio da invenção incluem aqueles com cadeias laterais acetiieno e azido. Os polipeptideos contendo esses aminoácidos novos podem então ser peguilados nesses sítios escolhidos na proteína.

Métodos de projeção de anticorpos

Conforme acima discutido, anticorpos anti~PCSK9 podem ser usados para criar novos anticorpos de PC8K9 através da modificação de sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve de comprimento integral, sequências Vh e/ou Vi., ou a(s) regíãotões) constante(s) Hgada(s) a elas. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos podem ser combinadas reccmbi30 nantemante com regiões de estrutura principal conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-PCSK9, recombinantemente projetadas, novos. Outras tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para 0 método de projeção é uma 00 mais das sequências e/ou V_L, ou uma nu mais regiões CDR das mesmas. Para criar 0 anticorpo projetado, não è necessário realmente preparar (isto é. expressão como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências Vh 5 e/ou Ví., ou uma nu mais regiões de CDR das mesmas. Ao invés, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como o material de partida para criar uma sequênoka(s) de segunda geração derivada da(s) sequêncía(s) onginal(aís) e então a(s) saquência(s) de segunda geração é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.

Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas pam preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) è um que retém uma, algumas ou todas das propriedades funcionais do anticorpo anti-PCSKO do qual ele é derivado, propriedades funcionais que incluem, mas não estão limitadas a, 15 especificamente ligação à PCSK9, inibição de divagem autocatalítica. inibição de ligação â LDL-R, inibição da degradação de LDL-R. As propriedades funcionais dos anticorpos alterados pode ser avaliada usando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritas aqui (por exemplo, ELISAs).

Em certas modalidades dos métodos de projeção de anticorpos da ín20 venção, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente uu seletivamente aa longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-PCSKO e cs anticorpos aotí-PCSK9 modificados resultantes podem ser avaliados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais (por exemplo., inibição de divagem autocataíitice, inibição de ligação á LDL.25 R, inibição de degradação de LDL-R) conforme aqui descrito. Métodos mutaoionais foram descritos na técnica. Por exemple, a Publicação PCT 02/092780 de Short descreve métodos para criação e avaliação de mutações de anticorpo usando mutagénese por saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação das mesmas. Altemativamente. o WO 30 03/074679 de Lazar e outros descreve métodos de uso de métodos de avaliação computacional para otimizar propriedades físico-químicas de anticorpos.

Moléculas de ligação à PCSK9 não-anticorpo

A invenção provê ainda moléculas de ligação à PSCK9 que exibem propriedades funcionais de anticorpos, mas derivam sua estrutura principal e porções de ligação de antígeno de outros polipeptídíos (por exemplo, outros 5 polipeptldeos que não aqueles codificados por genes de anticorpo ou gerados pela recombinação de genes de anticorpo fn vivo). Os domínios de ligação de antígeno (por exemplo, domínios de ligação à PCSK9) dessas moléculas de ligação são gerados através de um processo de evolução direto. Vide Patente U.S. No. 7.115.396. Moléculas que têm uma dobra geral similar 10 àquela da um dominio variável de um anticorpo {uma dobra tipo imunogiobulina) são proteínas scaffotó apropriadas. Proteínas soaffo/d adequadas para derivação de moléculas de ligação de antígeno Incluem fibroneotina ou um dímero de fibronectina, tenascina, N-caderina, E-caderina, ICAM, títina, receptor de GCSF, receptor de cífocina, inibidor de glicosidase, cromoprotei15 na antibiótica, molécula de adesão em membrana de míelina PO, CD8.CD4, CD2, MHC classe I, receptor de antígeno de célula T. domínios SET CD1, CD2 e I de VCAM-1, domínio de imunogiobulina SE T I de proteína C de ligação à míosína, domínio de imunogiobulina SET I ou proteína H de ligação à miosina, dominio de imunogiobulina SET í de tefofer?, NOAM, telcrifon, neu20 rõgiia, receptor da hormônio do crescimento, receptor de eritropoietina. receptor de prolactins, receptor de ínterferon-gama, p-gaíactosidase/ glucuronidase, β-glucuronídase, transglutaminase, receptor de antígeno de célula T, superoxide dismutase, dominio de fator de tecido, citocroma F, proteína verde fluorescente, GroEL e taumatína,

O dominio de ligação de antígeno (por exemplo, a dobra tipo imunoglobulina) da molécula de ligação a não-anticorpo pode ter uma massa molecular de menos do que 10 kD ou maior do que 7,5 kD (por exemplo, uma massa molécula?' entre 7,5-10 kD), A proteína usada para derivar o dominio de ligação de antígeno é uma proteína de mamífero de ocorrência natural 30 (por exemplo, uma proteína humana), e o dominio de ligação de antígeno inclui até 50% (por exempla, até 34%, 25%, 20% ou 15%) de aminoácidos mutados comparado com a dobra do tipo imunogiobulina da proteína da qual ela é derivada. 0 domínio tendo a dobra do tipo imunogiobuiina consiste em

50-150 aminoácidos (por exemplo, 40-60 aminoácidos).

Para gerar moléculas de ligação não-antícorpo. uma biblioteca de clones é orlada onde sequências em regiões da proteína scabb/d que formam 5 superfícies de ligação de antígeno (por exemplo, regiões análogas em posição e estrutura a CDRs de uma dobra de imunogiobuiina de domínio variável de anticorpo) são aleatorizadas. Clones de bibliotecas são testados quanto à ligação específica ao antígeno de interesse (por exemplo, ÓPCSK9) e para outras funções (por exemplo, inibição de atividade biológica de PCSK9), 10 Clones selecionados podem ser usados como a base para aleatorização adicional e seleção para produzir derivados de afinidade maior para o antígeno.

Moléculas de ligação de alta afinidade são geradas, por exemplo, usando o décimo módulo de fibronectins III (^í0Fn3) come a scaWd. Uma bi15 blioteca é construída para da uma das três alças tipo CDR de '°Fn3 nos resíduos 23-29, 52-55 e 78-87. Para construir cada biblioteca, segmentos de DNA codificando sequência sobrepondo cada região tipo CDR são aleatorizadas através de síntese de oligonucleotideo. Técnicas para produção de bibliotecas de ^:<JFn3 selecionáveis são descritas nas Patentes U.S. Nos.

6.818.418 e 7.115.396; Roberts e Szostak, 1997 Proc. A/af/. Acad. Sc/. USA

94:12297; Patente U.S. No. 6.261.804; Patente U.S. No. 8.258.558; e Szostak e outros WO 98/31700.

Moléculas de ligação nào-anticorpo podem ser produzidas como dímeros ou muítimeros para aumentar avidez para o antígeno alvo. Por exem25 pio, o domínio de ligação de antígeno é expresso como uma fusão com uma região constante (Fc) de um anticorpo que forma dimeros Fc-Fc. Vide, por exemplo. Patente U.S. No. 7.115.396,

Moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos da invenção

Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucle30 ico que codificam as moléculas de ligação à PCSK9 da invenção. Os ácidos nucleícos podem estar presentes em células inteiras, em um llsato de célula cu podem ser ácidos nuoleicos em uma forma parciaimen.te purificada ou substanciaímente pura. Um ácido nucleico è isolada ou tornado substanciaímente puro quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, Associação 5 de CsCÍ, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose é outros bem conhecidos na técnica. Vide, F, Ausubel e outros, ed. 1987 Current Profoco/s in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova York. Um ácido nucleico da invençàc poda ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nu10 cíeico é uma molécula de cDNA. O ácido nucleico pode estar presente em um vetor tal como um vetor da exposição em fago ou em um vetor de piasmideo recombinante.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibrido15 mas (por exemplo, híbridomas preparados a partir de camundongos transgênicos carregando genes de imuncglobuhna humana conforme descrito mais abaixo), cDNAs codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo feito pelo hibrídoma podem ser obtidos através de técnicas de amplificação de PCR padrão ou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma .20 biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnica de exposição em fago), ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperado de vários clones de fago que são membros da biblioteca,

Uma vez fragmentos de DNA codificando segmentos de V_H e V₅. sendo obtidos, esses fragmentos de DNA pode ser manipulados mais atra25 vés de técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento integral em ganes de fragmento Fab ou em gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA codificando ou Vh é operativamente ligado a outra molécula de DNA, ou a um fragmento codificando outra proteína, tal 30 como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível O termo operativamente ligado, conforme usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira funcional, por exemplo, de modo que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem em estrutura ou de modo que a proteína é expressa sub controle de um promotor desejado.

O DNA isolado codificando a região Vr pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento integral ligando operativamente o DNA codificando Vh em outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat e outros, 1991 Sequences of Proteins of immunologies/ /.aterest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, N/H Pu'bifoafion No. 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI, lgG.2, lgG3, lgG4. IgA, IgE. IgM ou IgD. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando V_H pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA codificando apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

O DN.A isolado codificando a região Vi. pode ser convertida em um gene de cadeia leve de comprimento integral (bem como em um gene de cadeia leve de Fab) ligando operativamente o DNA codificando V_t em outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat e outros, 1991 Sequences of Proteins of /mmuno/ogícaf interest, Quinta Edição, U.S. Department of Hea/itr end Human Services, NIH Pub/icatfen No. 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essas regiões podem ser obfidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

Para criar um gene scFv. os fragmentes de DNA codificando Vh e Vl são operativamente ligados a outra fragmento codificando um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4-Ser)3, de modo que as sequências de V_K e V_L podem ser expressas como uma pro45 tains da cadeia simples contígua, com as regiões V_L a Vh unidas pelo lígante flexível (vide, por exemplo, Bird e outros, 1988 Defence 242:423-426: Huston e outros, 1988 Proc. AO. Acad. Stri, USA 85:5879-5883; McCafferty e outros, 1998 Nature 348:552-554).

Geração de Anticorpo Monoclonal

Anticorpos monoclonais (mAhs) podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia da anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milsteln (1975 Nature, 256:495) ou usando métodos de 10 exposição de biblioteca, tal como exposição em fago.

Um sistema animal para preparação de híbrídomas é o sistema de murino. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esptenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de 15 fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparado conforme acima descrito. DNA codificando as imuno20 globulinas da cadeias pesada e leve pode ser obtido do hibridoma de murino de interesse e projetado para conter sequências de imunoglobulina de nãomurino (por exemplo, humanas) usando técnicas da biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando méto25 dos conhecidos na técnica (vide, per exemplo. Patente U.S. No. 4.816.567 para Cabiliy e outros). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de murino pedem ser inseridas em uma estrutura principal humana usando métodos conhecidos na técnica.. Vida, por exemplo, Patente U.S. No. 5.225.539 e Patentes U.S. Nos. 5.530.101: 5.585.089; 5.693.762 e 30 6.180.370.

Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dire46 cionados contra PCSK9 podem ser gerados usando oamundongos transgênicos ou franscromossõmicos carregando partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos e transoromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camunden5 gos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como camundongo Ig humano.

O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém mtof/ocf de gene de imunoglobuíina humana que codificam sequências de imunoglobuíina de cadeias pesada (p ey) e leva K humanas rearranjadas. junto com muta10 goes alvo que inativam os toei de cadeias u e K endógenas (vide, por exemplo, Lonberg e outros, 1994 Nature 368(6474): 856-859). Deste modo, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM de camundongo ou K, e em resposta á imunização, cs transgenes de cadeias pesada e leve humanos introduzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar 15 monoclonal gGK humano de alta afinidade (Lonberg. N. e outros, 1994 supra; revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook ef Expenmenfa/Pharmaco/ogy 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 totem. Rev; fmmunol. 13:65-93 e Harding, F. e Lonberg, N., 1995, Ano. N. ¥. Acad. Ser 764:536-546). A preparação e o uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômicas 20 carregadas por tais camundongos, são descritos mais em Taylor, L. e outros, 1992 Nuc/e/c Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. e outros. 1993 totemattonat totmunotogy 5:647-656; Tuaillon e outros, 1993 Pnoc. Nat/. .Acad. Set. USA 94:3720-3724; Choi a outros, 1993 Nature tJenettos 4:117-123; Chen, J. e outros, 1993 EMBO d. 12:821-830; Tuaillon e outros. 1994 J. /.mmuno/..

152:2912-2920; Taylor, L. e outros, 1994 totemaftoast toimmofogy 579-591;

e Fishwild. D. e outros, 1996 Nature Btotecto?o/ogy 14:845-851, os conteúdos de todos são aqui especificamente incorporados a titulo de referência em sua totalidade.. Vide ainda Patentes U.S. Nos. 5.545.896; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318;

5.874.2.99 e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. No. 6.545,807 para Surani e outros: Publicações PCT Nos. WO 92103918. WO 93/12227. WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, to47 das para Lonberg e Kay; e Publicação PCT Na. WO 01/14424 para Korman e outros.

Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podem ser criados usando um camundongo que carrega sequências de ímunoglo5 bulina humana em transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que carrega um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossomo de cadeia teve humana. Tais camundongos, referidos aqui corno camundongos KM, são descritos em detalhes no WO 02/43478.

Ainda, sistemas animais transgênicos alternativos expressando 10 genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti~PCSK9 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse® (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.939.598; 0.075.181; 6.114.598; 6.150.548 e 6.162.963 para Ku15 chedapati e outros.

Além disso, sistemas animais transcmmossõmicos alternativos expressando genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-PC-SK9 da invenção. Por exemplo. camundongos carregando ambos o transcromossomo de cadeia 20 pesada humana e um transcromosscmo de cadeia teve humana, referidos como camundongos TC podem ser usados; tais camundongos são descrito sem Tomlzuka e outros, 2000 Proc, Naif. Acad. Sei. USA 97:722-727. Ainda, vacas carregando transcromossomos de cadelas pesada e teve humanas foram descritas na técnica (Kurolwa e outros, 2002 A/atore Btofeuhr?o/ogy 25 20;889~894) e podem ser usadas para criar anticorpos anti~PCSK9 da invenção.

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser também preparados usando métodos de exibição em fago para avaliação de bibliotecas de genes da imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição 30 em fago para isolamento de anticorpos humanas são estabelecidos na técnica. Vide, por exemplo; Patentes U.S. Nos, 5,223.409; 5.403.484: e 5,571.698 para Ladner e outros: Patentes U.S. Nos. 5.427.908 e 5,580.717 para Dower e outros; Patentee U.S, Nos. 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty a outros; e Patentes U.S. Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731:

6.555.313: 6.582.915 e 6.593,081 para Griffiths e outros. Bibliotecas podem ser avaliadas quanto à ligação á PCSK9 de comprimento integral ou a um epitopo particular de PCSK9.

Qs anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser também preparados usando camundongos SCID onde células imunes humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada quando da imunização. Tais camundongos são descritos 1Q nas, por exemplo. Patentes U.S. Nos. 5.478.996 e 5,698.767 para Wilson e outros.

Geração de anticorpos monoclonais humanos em Camundongo íq Humanos

PCSK9 humana recombinante purificada expressa em células procarióticas (per exemplo, B co.fo ou células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, por exemplo, células HEK293) pode ser usada como o antigeno. A proteína pode ser conjugada a um veículo, tal como hemocianina de caromq/d (KLH - keyhote vmpef).

Anticorpos monoclonais .integralmente humanos para PCSK9 são preparados usando cepas HCo7, HCo12 e HCo17 de camundongos transganicos HuMab e a cepa KM de camundongos transcromossômicos fransgèniccs, cada um dos quais expressa genes de anticorpo humano. Em cada uma dessas cepas de camundongo, o gene da cadeia teve kappa da camundongo endógeno pode ser homoziguamente rompido conforme descrito em Chen e outros, 1993 EF1BO J. 12:811 -820 e e gene de cadeia pesada de camundongo endogeno pode ser homoziguamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 do WO 01109187. Cada uma dessas cepas de camundongo carrega um transgene de cadeia leve kappa humano, KCo5, con30 forme descrito em Fishwild e outros, 1996 Afetoro 8fotechno/ogy 14:845-851. A cepa HCo7 carrega o transgene de cadeia pesada humana HCo7 conforme descrito nas Patentes U.S. No.s 5.545.806; 5.625,825; e 5.545.807, A cepa HCo12 carrega o transgene de cadeia pesada humana HCo12 conforme descrito no Exemple 2 do WO 01/09187. A cepa HCo17 carrega o transgene de cadeia pesada humana HCo17, A cepa KNM contém o transcromossomo SC20 conforme descrito no WO 02/43478.

Para gerar anticorpos monocionais integralmente humanos para PCSK9, camundongos HuMab e camundongos KM são Imunizados com PCSK9 reoombinante purificada, fragmento de PCSK9 ou um conjugado dos mesmos (por exemplo. PCSK9-KLH) como antígeno. Esquemas de imunização gerais para camundongos HuMab são descritos em Lonberg, N, e outros 1994 Nature 388(6474): 856-859; Fishwild. D. e outros, 1996 Nature E/ofechofogy 14:845-851 e WO 98/24884. Os camundongos são de 6-16 semanas de idade quando da primeira infusão de antígeno, Uma preparação recombinante purificada (5-50 pg) da antígeno é usada para imunizar os camundongos HuMab e camundongos KM na poço peritoneal, subeutanearneate (Sc) ou através de injeção no coxim da pata.

Camundongos transgênicos são imunizados duas vezes com antígeno em adjuvants de Freund completo ou adjuvante Ribi ou na poço peritoneal (IP), subeutaneamente (Sc) ou através do coxim da pata (FP), seguido por 3-21 dias de imunização IP, Sc ou FP (até um total de 11 imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund incompleto ou Ribi. A resposta imune é monitorada através de sangramentos retro-orbitais. O plasma é avaliado através de ELISA, e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-PCSK9 são usados para fusões. Camundongos são reforçados intravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes de sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, 10-35 fusões para cada antígeno são realizadas. Várias dúzias de camundongos são imunizadas para cada antígeno. Um total de 82 camundongos das cepas de camundongos HCo17, HCo12, HCo17 e KM são imunizados com PCSK9.

Para selecionar camundongos HuMab ou KM produzindo anticorpos que se ligam à PCSK9, soros de camundongos imunizados podem ser testados através de ELISA conforme descrito por Físbwild, D. e outros, 1996.. Em suma, placas de mícrotítulaçào são revestidas com PCSK9 re combinante purificada a 1-2 pg/ml em PBS, 50 μΙ/poços incubadas a 4* C da unite para o dia então bloqueadas com 200 μΙ/poço de sore de galinha 5% em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma de camundongos imunizados com PCSK9 são adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas em 5 temperatura ambiente. As placas são lavadas com PBS/Tween e então incubadas com um anticorpo peliclonal Fc IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) per 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagem, as planas são desenvolvidas com substrato ARTS (Sigma, A-1888. 0.22 mg/ml) e analisadas através de espectrómetrc em OD 10 415-495. Esplenócitos de camundongos que desenvolveram os títulos mais altos de anticorpos antí-PCSK9 são usados para fusões. Fusões são realizadas e sobrenadantes de hibridoma são testados quanto á atividade de PCSK9 através de ELISA.

Os esplenódtos de camundongo, isolados dos camundongos 15 HuMab e camundongos KM, são fundidos com PEG a uma oepa de célula de mieloma de camundongo com base em protocoles padrão. Os hibridomas resultantes são então avaliados quanto à produção de anticorpos especificas de antígeno. Suspensões de célula simples de linfócitos esplénicos de camundnngos imunizados são fundidas a um quarto do número de células de 20 mieloma de camundongo de não-secreção SP2/0 (ATCC. CRL 1581) oom PEG 50% (Sigma). As células são pastas em placa em aproximadamente 1x10 /poço em placas de microtitulaçãu de fundo plano, seguido por cerca de duas semanas de incubação em meio seletivo contendo soro bovino fetal 10%, meio condicionado P388D 1 10% (ATCC, CRL TIB-63), Origen® 3-5% 25 (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com muita glicose. L~glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES 5 mM, 2-mercaptcetanol 0,055 mM. gentamicins 50 pg/ml e HAT 1x (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células são culturadas em meio ande a HAT é substituído com HT. Poças individuais sâc então avaliadas através de ELISA quanto a anticorpos IgG mono30 danais arrti-PCSK9 humanos. Uma vez crescimento de hibridoma extensivo tendo acontecido, meio é monitorado geralmente após 10-14 dias. Os hibridomas de secreção de anticorpo são pastos em placa nevamente, avaliados novamente e, se asnda positivos para IgG humano, anticorpos monoclonais anti-PCSK9 são subclanados em pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Os subclones estáveis são então culturados /n vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecido para ca5 raster izaçâo adicional.

Geração de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais humanos

Para gerar hibridomas produzindo anticorpos monoclonaís humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de nô linfàtico de camundon10 gos imunizados podem ser isolados e fundidos em uma cepa de célula imortalizada apropriada, tai como uma cepa de célula de mieluma de oamundongo. Os hibridomas resultantes podem ser avaliados quanto à produção de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, suspensões de célula simples de linfôcitos asplênicos de camundongos imunizados podem ser fundi15 das a um sexto do número de células de mieluma de camundengo de nãosecreção P3X63-Ag8.553 (ATCC, CR1 1580) com PEG 50%. As células são pastas em placa em aproximadamente 2 x 145 em placas de mícrotitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo Soro de Clone fetal 20%, meio condicionada ”653 18%, Ori20 gen'® 5% (IGEN). L-glutamina 4 mM, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetancl 0,:055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomieina, 50 pg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma: o MAT é adicionado 24 horas apôs a fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cuíturadas em melo onde o HAT é substituído com HT. Poços 25 individuais podem ser então avaliadas através de ELISA quanto a anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez crescimento de hibridoma exten sivo acontecendo, meio pode ser observado geralmente apôs 10-14 dias. Os hibridomas de secreção de anticorpo podem ser postos em placa novamente, avaliados novamente e se ainda positivas para IgG, os anticorpos mono30 clonals podem ser subclonados pelo menos duas vezes através de diluição límítante. Os subclones estáveis podem então ser cuíturadas /n vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanas, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascas giratórias de dais litros para purificação de anticorpo monoclonal, Sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia da afinidade com proteína A-sefarose (Pharmaoia, Piscataway, NJ.), IgG eluido pode ser checado através de eletrofarese em gel e cromatografia líquida de alta performance para assegurar pureza, A solução tampão pode ser trocada para PBS, e a concentração pode ser determinada através da OD₂so usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos manaclonais podem ser separados em alíquotas e armazenados a -SO'⁵ C.

Geração de transfectpmas produzindo anticorpos monoclonais

Os anticorpos da invenção podem ser também produzidas em um transfectoma de célula hospedeiro usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é bem conhecido na técnica (por exempla, Morrison, 1985 Sa/ence 229:1202),

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DMAs codificando cadeias leves e pesadas de cumprimenta parcial ou integral, podem ser obtidos através de técnicas de biologia molecular padrão (por exempla, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibrídoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos nos vetores de expressão de modo que os genes são operativamente ligados a sequências de controle transcripcional e traducianal. Nesta contexto, o termo operatívamente ligado pretende significar que um gene de anticorpo é íigado a um vetar de mudo que sequências de controle transcripcional e traducional dentro do vetor servem sua função pretendida de reguíagem da transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor da expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeiro de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridas em vetar separada au, mais tipicamente, ambos os ge~ nes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios da restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor ou ligação de extremidade abrupta se quaisquer sítios de res5 tríção estiverem presentes). As regiões variáveis de cadeias leve e pesada dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento integra! de qualquer ísotlpo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressão já codificando regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve do isotipo desejado de modo que o seg10 mento V_H està operativamente ligado ao(s) segmento(s) OH) dentro do vetor s o segmento V=. está operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. .Adicionalmente ou altemativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeiro. O gene da cadeia de anticorpo 15 pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo de sinal é ligado em estrutura ao terminai amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunogiobuiina ou um peptídeo de sinal heteróiogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína de nãoimunoglobulina).

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeiro, O termo sequência reguladora pretende incluir promotores, aumentado.res e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, 25 sinais de poíisdenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exempíO: em Goeddel (Gene Expression Techno/ogy, 1990 Methods ré Enzymotogy 185, Academic Press. San Diego. CA). Serà compreendido por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a 30 seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeiro a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências reguladoras para expressão de célula hospedeiro do mamífero incluem elementos vireis que direcionam niveis altos de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou aumentadores derivados de cítomegaluvírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovirus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e políoma. Alternativamente, sequências reguladoras não-víraís podem ser usadas, tal coma o promotor da ublquitina ou promotor da Pglobína. Aínda, elementos reguladores compostos de sequências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor de SRs, que contêm sequências do promotor precoce de SV40 e a repetição terminal longa de vírus da leucemia tipo 1 de célula T humana (Takebe e outros, 1988 Moí Ce//, Bfo/. 8:466-472).

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar sequências adicionais, tal como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiro (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis, O gene rotuíador selecionável facilita seleção de células hospedeiro onde o vetor foi introduzido (vide, por exempla, Patentes U.S. Nos. 4,399.216; 4.634,665; e 5.179.017, todos da Axel e outros). Por exemplo, tipicamente o gene rotuíador selecionável confere resistência a fármacos, tal como G418, higromicína ou metotrexato, em uma célula hospedeiro na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis incluam o gene da díhidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiro de dhfr com seleção/ampíificaçao de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Para expressão das cadelas leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias pesadas e leves é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeiro através de técnicas padrão. As várias formas do termo Transfecção pretendem compreender uma ampla variedade de técnicas geralmente usadas para a introdução de DNA exúgeno em uma célula hospedeira procaríàtica ou eucariôtica, por exemplo, eletrupuração, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e similar, É teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiro ou proc-ariéticas ou eucarióticas. Expressão de anticorpos em células eucariéticas.

em particular células hospedeira de mamífera, ê discutida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que células procaríôticas de se reunirem e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. Expressão procariótíca de genes de 5 anticorpos foi relatada ser ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss a Wood, 1985 /mmuno/ogy Today 6:12-13),

Células hospedeiro de mamífero para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhr- CHO, descritas em Uriaub e Chasin, 1980 Free, 10 ,Naff. Acad, Scf USA 77:4218-4220 usadas com um rotulador selecionâvel de DH FR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, 1982 Mo/, B/o/, 159:601-621, células de mieloma de NOS, células COS e células SP2, Em particular, para usa com células de mieloma NOS, outro sistema de expressão é o sistema de expressão de gene GB mostrado no WO 87/04462, 15 no WO 89/01036 e na EP 338,841, Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo sâo introduzidas em células hospedeiro de mamífero, os anticorpos são produzidas através de cultura das células hospedeiro por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiro ou secreção do anticorpo no meio de 2Q cultura onde as células hospedeiro são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão,

Maléçulas biespeçifiças

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a moléculas 25 biespecificas compreendendo uma molécula de ligação á PCSK9 (par exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 ou um fragmento do mesmo) da invenção, Uma molécula de ligação à PCSK9 da invenção pode ser dedvatizada ou ligada a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptideo eu proteina (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma 30 molécula biespecifioa que se liga a pelo menus dois sitias de ligação diferentes ou moléculas alvo, A molécula de ligação à PCSK9 da invenção pode na verdade ser derivatizada ou ligada a mais de uma outra molécula para gerar moléculas multiespenífinas que se ligam a mais do que dois sities de ligação e/ou moléculas alvo diferentes; tais moléculas multiespeoificas pretendem ser compreendidas pelo termo molécula biespeclfica conforme aqui usado. Para criar uma molécula bíespedfiea da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covaiente ou de outro medo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que uma molécula biespecifica resulta.

Deste modo, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especifioidade de ligação para PCSK9 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo.

Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menus um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', Ffab’)?, Fv ou um Fv de cadeia simples. G anticorpo pode ser também um dImero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou um censtmto de cadeia úmca conforme descrito em Ladner e outros, Patente U.S. No. 4.946.778, cujos conteúdos estão aqui expressamente incorporados a título de referência.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exempla, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugadas uma à outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento nu reticulação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodíimída, N-succínímil-S-acetiltioacetato (SATA), ácido 5,5’-ditiobis{2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodímaleimida (oPDM), Ν-5ηαάηίπι^ΙΙ-3-(2-ρΐΓ^ΙΙ1ίο)ρΓορΙοη^ίο (SPGP) e sulfossuccinimil 4-(N-mateímídomefil) cíol-hoexano-l-aarboxilatu (sulfo-SMCC) (vi57 de, por exemplo, Karpovsky e outros, 1984 J. Exp. Med. 160:1686: Liu e outros, 1985 Pros. Watf. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aquotes descritos em Paulus, 1985 Behring Inst. Mitt. 78, 118-132; Brennan e outros, 1985 Science 229:81-83) e Glennie e outros, 1987 J. /mmunaf.

139:2367-2375). Agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugadas através de Itgação sulfidrila das regiões de união Ctermlnais das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particuiar, a regí10 ão de união é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um. antes da conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeiro. Este método é particularmente útil onde a molécula bioespecifi16 ca for uma mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab‘)₂ ou ligante x proteína de fusão de Fab. Uma molécula biespecffica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única a um determinante de ligação, ou uma molécula biespedfica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespedficas podem 20 compreender peio menos duas moléculas de cadeia única.. Métodos para preparação de moléculas biespecificas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.268.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858.

Ligação das moléculas biespecificas a seus alvos específicos 25 pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado á enzima (ELISA), radíoimunoensaío (REA), análise FACS. bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio IVesfem B/oí. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteina-anticorpo de interesse particular empregando um reagente rotulado (por exemplo, um an30 ticorpo) específico para o complexo de interesse.

Ensaios funcionais

As características funcionais de moléculas de ligação a PCSK9 podem ser testadas m vrtrc e rn viva Por exemplo, moléculas de ligação podem ser testadas quanto à habilidade em inibir interação de PCSK9 com

LDL-R, inibição de efeitos dependentes de PSCK9 sobre LDL-R (por exemplo, absorção mediada por LDL-R de LDL-c), inibição de atividade proteoliti5 ca de PCSK9 e diminuição de LDL-c m vivo.

Ligação de PGSK9 ã LDL-R pode ser detectada usando Biacoré*' através da imobilização de LDL-R para um apoio sólido e detecção de PCSK9 solúvel se ligando à LDL-R. Alternativamente, PCSK9 pode ser imobilizada e ligação a LDL-R pode ser detectada. Ligação de PCSK9/LDL-R 10 pode ser também analisada através de ELISA (por exemplo, através da detecção de PCSK9 se ligando à LDL-R imobilizada) ou através de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Para realizar FRET, PCSK9 rotulada com fluoròforo se ligando à LDL-R em solução pode ser detectada (vide, por exempla, Patente U.S, No. 5.631.169).

PGSK9 se ligando à LDL-R foi detectada através de coimunoprecipitaçào (Lagace e outros, 2006 J. Clín. fav. 116(11):2995-3005). Para examinar PCSK9-LDL-R se ligando desta maneira, células HepG2 são culturadas em meio sem esterol por 18 horas. PCSK9 purificada é adicionada ao meio na presença de cloroquina a 0,1 mM a as células são incubadas por 20 uma hora. As células são lisadas em detergente suave (digitonina 1% pN).

PCSK9 ou LDL-R é imunoprecipitada de lisatos de célula, separada através de SDS-PAGE e énmrmob/odeó para detectar a presença de LDL-R ou PCSK.9 ceimunoprecipltada, respectivamente (Lagace e outros, 2006 J, C/m. /av. 116(11):2995-3005). Esses ensaios podem ser conduzidos com uma 25 forma mutante de PCSK9 que se liga à LDL-R com uma avidez maior (por exemplo, KPCSK9 D374Y) (Lagace e outros, 2006, supra).

Hepatéoitus expressam LDL-R na superfície celular. Adição de PCSK9 purificada a células hepãticas culturadas (por exemplo, células HepG2, ATCC, HB-8065) produz uma diminuição na expressão de LDL-R da 30 urna maneira dependente da dose e do tempo (Lagace e outros, 2006 >Z C/m. /nv. 116(11):2995-3005). Moléculas de ligação à PCSK9 podem, ser testadas quanto à habilidade em aumentar os níveis de LDL-R per hepatéci tos. Pen exemplo, células HepG2 são culturadas em meio sem esters! (DMEM suplementado com penicilina 100 U/ml. 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina e 1 g/l de glicose, soro deficiente em líproproteína de bezerra recém-nasado 5% (vol/veí) (NCLPDS), 10 pM de ccmpaotina de sòdiu e 50 pM de mevalonate de sódio) por 18 horas para induzir expressão de LDL-R. PCSK9 purificada (5 pgml) é adicionada ao meio. Níveis de LDL-R em células coletadas em 0, 0,5, 1, 2 e 4 horas apôs adição de PCSK9 são determinados (Lagace e outros, 2006. J. C/in, /nv. 118(11):2995-3005). Niveis de LDL-R podam sar determinados através de citomefria da fluxo, FRET, Pnmrmob/orifog ou outros meios.

Absorção de LDL-c por células (por exemplo, células HepG2) pode ser medida usando LDL-c fluorescentemente rotulada. Dil-LDL (3,3díoctadecilindocarbocianina-lipaproteina de densidade baixa) conforme descrito por Stephan e Yurachek (1993, J. Lrprò' Res. 34:325-330). Em suma, as células são incubadas em cultura com Dil-LDL (20-100 pg de proteína/ml) a 37° C por 2 horas. As células são lavadas, Usadas a a concentração de DilLDL internalizada è quantificada usando um espectrufíucrómetro. Absorção de LDL-c pode ser medida em células contatadas com um agente de ligação à PCSK9 (antes do e/ou durante o periodo onde Dil-LDL está presente na cultura celular).

Atividade proteoiítica de PCSK9 pude ser medida in vitro usando substratos de peptídeo sintéticos. Vide, por exemplo, Seidah e outros, 2003 Rroc. NatL Acad. Sei. USA, 100(3):928-933. Em um método exemplar, PCSK9 purificada é incubada a 37° C por 3-18 horas com 50 μΜ de SueRPFHLLVY-MCA (4-mefilcaumarin-7-arnida) em Tris/Mes 25 mM, pH 7.4 * CaCh 2,5 a mM e SDS 0,5%. Análise de fluorescência e tempo de voo de ionízação por dessorção a laser assistida por matriz dos produtos é usada para detectar produtos de divagem (Seidah e outros, 2003 Proc. Nat/. Acad. Sor. USA, 100(3):928-933: Basak e outros, 2092 FESS Left. 514:333-339). Este ensaio pode ser usado para detectar diferenças em eficiência de divagem na presença de moléculas de ligação à PCSK9.

Camundongos transgênicus superexpressando PCSK9 humana em fígado têm níveis aumentados de LDLc no plasma com relação a camundcngos não-transgênicos {Lagace e outros, 2006 J. C//h. fov. 116(11):2905-3006). Vide também Maxwell e Bresíow, 2004 Froc. Λ/art Ασβοί. Sd. USA, 101:7100, descrevendo superexpressão de PCSK9 usando 5 um vetor de adenovirus em camundongos. Camundongos PCSKO® foram produzidos (Rashid e outros, 2005 Proc. NW Acad. Sc/. 102(5):5374-5379). Esses camundongos podem ser geneticamente modificados para expressar um transgene hPCSKS, Moléculas de ligação à PCSK9 pedem ser testadas em qualquer um desses modelos, ou em animais que não são geneticamen10 te modificados, quanto à habilidade em remover ou reduzir colesteml total e/ou LDL-c.

A cinètjca de remoção de LDL de plasma pode ser determinada injetando animais com LDL rotulado com (⁵²¾ obtendo amostras de sangue em 0, 5, 10. 15 e 30 minutos após injeção e quantificação de LDL-f^lj nas 15 amostras (Rashid e outros, 2005 Pmc. Λ/ert Acad. Sc/. 102(5):5374-5370). A taxa de remoção de LDL é aumentada em camundongos PCSK9com relação aos camundongos do tipo selvagem (Rashid e outros, 2005 supra). Remoção de LDL aumentada em animais administrados com uma molécula de ligação à PCSK9 indica que o agente inibe atividade de PCSK9 m vàro.

Diminuições no cclesterol no plasma, triglicerideos no plasma ou

LDL-n total em resposta a tratamento com uma molécula de ligação à PGSK9 são indicativas de eficácia terapêutica da molécula de ligação à PCSK9. Pedis de cclesterol e lipideo podem ser determinados através de meios ccíorimétricos. cromatogrãficos gãs-llquido eu enzimátícos usando 25 estojos comercialmente disponíveis.

Comõp^íçées.jãrnjagêutiças

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo uma ou uma combinação de moléculas de ligação á PCSK9 (por exemplo, anticorpos monoclo30 nais ou porçào(ôes) de ligação de antígeno dos mesmos), da presente invenção, formulados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exempla, duas ou mais diferentes) moléculas de ligação. Por exemple, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos ou agentes que se ligam a epitopos diferentes no antígeno-aívo ou que têm atividades complementares,

As composições farmacêuticas da invenção podem ser também administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pude incluir um anticorpo anti-PCSKS combinado com pelo menos outro agente de redução de colesterol. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia 10 de combinação são descritos em mass detalhes abaixo na seção de usos dos agentes da invenção.

Conforme aqui usado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngícos, agentes isotônicos e de retardo de 15 absorção e similar que são fisíologicamente compatíveis, O veículo deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subeutânea, parenteral, espinhai ou epidermal (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido em um material para proteger u composto da ação de ácidas e outras condi20 ções naturais que podem ínativar o composto.

Os compostas farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis, Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um saí que retém a atividade biológica desejada do composto de origem e não causa quaisquer efeitos toxícológicos (vide, por exemplo, 25 Berge, S,M. e outros. 1977 J, Pharm. Scí 66:1-19), Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácidos o sais de adição de base, Saís de adição ácidas incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicas nãa-tõxicos, tais cama clorídrica, nitrico, fosfórico. sulfúrico, bromidríca, iodídrico, fosforoso e similar, bem como de ácidas orgânicos não-tóxicos tal como ácidos mono- e di30 carboxilicas alifáticos, ácidas alcanóioos substituídos por fenila, ácidos hidròxi alcanêicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similar.. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alca lino-terrosas, tal coma sódio, potássio, magnésio, cálcio e similar, hem come de aminas orgânicas não-tóxicos, tal como Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, Nmetílglucamina, cloroprocalna_t ceiina, dietanolamina, etilenodiamina, procalna e similar.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxsdante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfeto de sódio e similar; antioxidantes solúveis em óleo, tal 10 como palmitate de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitína, propil gaiato, alfa-tocoferol e similar; e agentes de quelaças de metal, tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acétioo (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similar.

Exemplos de veicules aquosos e não-aquosos adequadas que 15 podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, poíióis (tais como glioemi, propileno glicol, poiietileno glicol e similar) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de 20 revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos.

Essas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção de presença de micro-organ ismos pode ser assegura25 da ambos através da procedimentos de esterilização, supra, e através da inclusão de vários agentes antibacteríanos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol ascórbico e similar. Pode ser também desejável incluir agentes ísotõnícos, tal como açúcares, cloreto de sódio e similar nas composições. Ainda, absorção prolongada da forma farmacêutica 30 injetável pode ser conseguida através da inclusão de agentes gue retardam absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou disfô3 persões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto atè o ponto que qualquer meio ou agente convencionai for incompatível com o composto ativo, uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é compreendido. Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados às composições.

Composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsâo, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para concentração alta de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, palio! (por exemplo, glicerol, propHeno glicol e polietileno glicol liquido e similar) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso do dispersão e através do uso de tensoativos. Em muitos casos, uma pessoa pode incluir agentes isotõnicos, por exemplo, açúcares, poliãlcoois tal coma manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por miorofiltragem de esterilização. Em geral, dispersões são preparadas através da Incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contêm um meio de dispersão básico e cs outros Ingredientes requeridos daqueles enumerados acima, No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem com congelamento (íiofilização) que dão um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril de mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única vai variar dependendo do indivíduo sendo tratado e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veiculo para produzir uma forma de dosagem única vai geralmente ser aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral. de cem par cento, esta quantidade vai variar de a partir de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de a partir de cerca de 0,1 par cento a cerca de 70 por cento ou de a partir de çerça de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo úhíc-c pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenteraís em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem conforme aqui usado refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas comp dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contem uma quantidade predeterminada de composto atívo calculada para produzir o efeito terapêutico desejada em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de unidade de dosagem da invenção Sxão ditadas por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser atingido e as limitações inerentes na técnica de composição tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos..

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg Ag e mais geralmente 0.01 a 5 mg/kg do peso do corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso do corpo, 1 mg/kg de peso do oorpo, 3 mg/kg de peso do corpo, 5 mg/kg de peso do corpo ou 10 mg/kg de peso do corpo ou dentro da faixa de

1-10 mg/kg, Um regime de tratamento exemplar exige administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três se5 manas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem para molécula de ligação à PCSK9 da invenção incluem 1 mg/kg de peso do corpo ou 3 mg/kg de peso do corpo através de administração intravenosa, oom o anticorpo sendo dado usando um dos programas de dosagem que seguem: 10 a cada quatro semanas para seis dosagens, então a oada três meses: a cada três semanas: 3 mg/kg de peso do corpo uma vez seguido por 1 mg/kg de peso do corpo a cada três semanas.

Em alguns métodos, duas ou mais moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos monoclonais) com especificidades de ligação diferentes 15 são administradas simultaneamente, casos onde a dosagem de cada anticorpo administrada se encaixa nas faixas indicadas, A molécula de ligação à PCSK9 é geralmente administrada em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dcsagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem ser também irregulares 20 conforme indicado através da medição de níveis sanguíneos de molécula de ligação à PCSK9 no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração no plasma da molécula de ligação à PCSK9 de seroa de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 pg/ml.

Aítemativamente, uma molécula de ligação à PCSK9 pode ser administrada como uma formulação de liberação sustentada, caso onde administração menos frequente é requerida. Dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida da molécula de ligação ã PCSK9 no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos projetados humanizados, anticorpos 30 quiméricos e anticorpos não-humanes. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profilãtícas, uma dosagem relativamente baixa é ad~ ministrada em intervalos relativamente infrequentes durante um periodo de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos retativamente curtos é algumas vezes requerida atê progres5 são da doença ser reduzida ou terminada ou até o paciente mostrar melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Em seguida, o paciente pode ser administrado com um regime profilêtico.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a 10 obter uma quantidade do ingrediente ativo que è eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado vai depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas. 15 ou do éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo da administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história média anterior do paciente sendo 20 tratada e fatores similares bem conhecidos na técnica médica.

Uma dosagem terapeutícamante eficaz de molécula de ligação à PCSK9 da invenção pude resultar em uma diminuição na severidade de sintomas de doença (por exemplo, uma diminuição em oclesterol no plasma ou uma diminuição em um sintoma de um distúrbio relacionado com colaste25 rol), um aumento em frequência e duração de períodos livres de sintoma de doença ou uma prevenção de debilidade ou incapacidade devido à aflição da doença.

Uma composição da presente invenção pede ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma 30 variedade de métodos conhecidos na técnica. Cerno serà compreendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração vão variar dependendo dos resultados desejados. Vias da administração para moléculas de ligação à PCSK9 da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenterais, per exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão administração parenteral conforme aqui usado significa modos de administração 5 outros que não administrações enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão íntravenosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradermaís. intraperitoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intraarticulares, subcapsulares, subaraquinôides, intra-espinhais, epidurals e in10 trasternais,

Alternativamente, uma molécula de ligação à PCSK9 da invenção pode ser administrada através de uma via não-parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidermal ou mucosal, por exemplo, intranasaimente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou toplcamen15 te.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que vão proteger o composta contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais e sistemas de aplicação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, bíocom20 patlveis, podem ser usados, tal como acetato de etileno viníla, poliamdndos, ácido políglicólico, colágeno, poliortoèsteres e ácido polilàctíco. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos daqueles versados na técnica. Vide, par exempla, Sustained and Conteo/ted Re/ease Dmg Defmery Systems, J..R, Robinson, ed,, Marcei Dek25 ker, inc„ Nova York, 1978.

Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidas na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sen? agulha, tal como os dispositivos 30 mostrados na Patente U.S. No. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.864.413;

4.941,880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. No. 4,487.683, que mostra uma bomba de microínfusão implantável para aplicação de medicação em uma taxa controlada; a Patente U.S. No. 4.486.194, que mestra um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4.447.233, que mostra urna bomba de infusão de medicamento para aplicação de medicação em uma taxa de infusão precisa;

Patente U.S. No. 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para aplicação de fármaco continua; Patente U.S. No. 4.439.196, que mostra um sistema de aplicação de fármaco osmotíco tendo compartimentos de câmara múltiplos; e Patente U.S. No. 4.475.196, que 10 mostra um sistema de aplicação de fármaco osmôtico. Essas patentes são aqui incorporadas a titula de referência Muitos outros tais implantes, sistemas de aplicação e módulos sàu conhecidos daqueles versados na técnica.

Em certas modalidades, as moléculas da ligação à PCSK9 da Invenção podam ser formuladas para assegurar distribuição apropriada to 16 vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebru (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílícos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exempto, em lipossomas. Para métodos de fabricação de iipessomas, vide Patentes US, Nos. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os Üpossomas po26 dam compreender uma ou mais porções que são seletivarnente transportadas para células ou órgãos específicos, então aumentam a aplicação de fármaco direcionada (vide,, por exemplo, V.V.. Ranade, 1969 J.. Qme PharmacoA 29:685). Porções direcionadas exemplares incluem folate ou biotina (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.416.016 para Low e outros); manosideos 25 (Umezawa e outros, 1988 Btochem. 8/bphys. Res Common. 153:1038)-, anticorpos (P.G. Blueman e outras, 1996 FEBS Left· 357:140; M. Owais e outras, 1995 Anf/microb. Agente Chemofher: 39.186); receptor de proteína A tensoativo (Briscoe e outras, 1995 Am. J. Physfo/. 1233:134); p120 (Sabreier e outros, 1994 J. Bfol. Cnem. 269:9090): vide também K. Keínanen; M.L 30 Laukkanen, 1994 FEES Left 346:123; JJ. Killian; M. Fidler, 1994 fmmunm merhads 4:273.

Usas e métodos da invenção

As moléculas de hgaçâo à PCSK9 descritas aqui têm utilidades de diagnóstico e terapêuticas ré vif.ro e ré vivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo, ré vrén ou ré v/vo, ou em um indivíduo, por exemplo, ré révo. para tratar, prevenir ou diag5 nosticar uma variedade de distúrbios, Moléculas de ligação à PCSK9 são partlcularmente adequadas para tratamento de pacientes humanas tendo, ou sob risco de, colesterol elevado ou uma condição associada com colesterol elevado, per exemplo, um distúrbio de lipídeo (por exemplo, hiperiipidemia, hiperiipidemia tipo I, tipo il, tipo HI, tipo IV ou tipo V, hipertrigiíceridemia se10 cundâria, hipercalesterolemia, xantomatose, deficiência de colesterol acetiltransferase), Moléculas da ligação ã PCSK9 são também adequadas para tratamento de pacientes humanos tendo condições ateroscleróticas (por exemplo, aterosclercse), doença da artéria coronária, doença cardiovascular e pacientes sob risco desses distúrbios, por exempla, devido à presença de 15 um ou mais fatores de risco (por exemplo, hipertensão, fumo de cigarro, diabetes, obesidade ou hiper-homocisteinemia),

Quando moléculas de ligação à PCSK9 são administradas junto com outro agente, os dois podem ser administrados seqüencíalmente em qualquer ardem ou simultaneamente. Em algumas modalidades, uma malé20 cuia de ligação á PC5K9 é administrada a um indivíduo que está também recebendo terapia com um segundo agente (por exempla, um segundo agente de redução de colesterol). Agentes de redução de colesterol incluem estatinas, sequestrardes de ácido da bile, niacina, derivados de ácido fibrica e ácidos alfa-õmega dicarbcxíllcos de cadeia longa, Estatinas inibem síntese 25 de colesterol ao bloquear HMCSCoA, uma enzima-chave em biossintese de colesterol. Exemplos de estatinas sâa lovastatins, pravastatins, atorvsstatina, cerivastatina, fluvastatiaa e simvastatins. Sequestrastes de ácido de bile interrompem a reciclagem de ácidas de bife s partir do intestino para o fígado, Exemplos desses agentes sâo cnlestiramsna e cloridrato de colestipol 30 Exemplos de derivados do ácido fíbricc são clcfibrato e gemfibrozil. Ácidas alfa, âmega-dioarbcxílicos de cadeia longa são descritos, por exemplo, por Bisgaier e outros, 1998, J. Lipid Res, 39:17-30; WO 98/30530; Patente U,S,

Να. 4.689.344; WQ 99/60116; Patente U.S. No. 5.756.344; Patente U.S. Να.

3.773.946; Patente U.S. Να. 4.689.344; Patente U.S. No. 4,689,344; Patente

U.S. No. 4.689.344; e Patente U.S. No. 3.930,024); éteres (por exemplo, Patente U.S No. 4.711.896; Patente U.S. Na. 5.756.544; Patente U.S. No.

6.506.799). Fosfates de dollcol (Patente U.S. Na. 4.613,593) e derivados de azolidinodiona (Patente U.S. No. 4.287.200) podem ser também usados para reduzir níveis de colesterol.

Um regime de terapia de combinação pode ser aditivo ou ele pode produzir resultados sinérgioos (por exemplo, redução em colesterol W mais do que esperado para o uso combinado dos dois agentes). Em algumas modalidades, terapia de combinação com uma molécula de ligação à PCSK9 e uma astatine produz resultados slnérgicos (por exemplo, reduções sinérgicas em colesterol). Em alguns indivíduos, isto pode permitir redução em dosagem de estatína para atingir os níveis de colesterol desejados,

Moléculas de ligação à PCSK9 são úteis para indivíduos que são intolerantes à terapia com outro agente de redução de colesterol ou para quem terapia com outro agente de redução de colesterol produziu resultados inadequados (por exemplo, indivíduos que sentem redução de LDL~c insuficiente sob terapia com estatína).

Uma molécula de ligação à PCSK9 descrita aqui pode ser administrada a um indivíduo com colesterol elevado (por exemplo, um indivíduo humane com níveis de colesterol no plasma totais de 200 mg/dl ou mais, um indivíduo humano com níveis de LDL-c de 160 mg/dl ou mais).

E.m uma modalidade, as moléculas de ligação da invenção po25 dem ser usadas para detectar níveis de PCSK9. isto pude ser conseguido, per exemplo, através de contato de uma amostra (tal como uma amostra m W/ro) e uma amostra controle com a molécula de ligação à PCSK9 sob certas condições que permitem rs formação de um complexo entre a molécula de ligação de PCSK9. Quaisquer complexos formados entre a molécula e 30 PCSK9 são detectados e comparados na amostra e o controle. Por exemplo, métodos de detecção padrão, bem conhecidos no campo, tal como ensaios ELISA e crtometria de fluxo, podem ser realizados usando as composições da invenção.

Deste modo, em um aspecto, a invenção provê ainda métodos para detenção da presença de PCSK9 (por exemplo. hPCSKG) em uma amcstra, ou medição da quantidade de PCSK9. compreendendo contato da 5 amostra, e uma amostra controle, com uma molécula de ligação à PCSK9 (por exemplo, um anticorpo) da invenção, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e PCSK9. A formação de um complexo é então detectada, onde uma diferença em formação de complexo entre a amostra comparado com a amostra controle é 10 indicativa da presença de PCSK9 na amostra.

Também dentro do escopo da invenção estão estojos consistindo nas composições da invenção e instruções para uso. O estojo pode conter ainda pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemple, um anticorpo tendo uma atividade com15 plementar que se liga a um epitopo no antigeno-alvo diferente do primeiro anticorpo). Estojos tipicamente incluem um rótulo indicando o uso pretendido dos conteúdos do estojo. O termo rótulo inclui qualquer material de escrita cu gravada fornecido no ou com o estojo ou que de outra modo acompanhe α estojo.

A invenção tendo sido integralmente descrita é ilustrada mais pelos exemplas e reivindicações que seguem, que são ilustrativos e não pretendem ser mais límitantes. Aqueles versados na técnica vãa reconhecer ou serão capazes de averiguar, usando não mais do que experimentação de rotina, vários equivalentes para os procedimentos específicos descritos aqui.

Tais equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção e reivindicações. Os teores de todas as referências, incluindo patentes emitidas e pedidos de patente publicados, mencionados em todo o presente relatório descritivo são aqui incorporados a titulo de referenda.

EXEMPLOS

Exemplo 1, Geração de anticorpos humanas através de exibição do fago

Para a geração de anticorpos contra hPCSK9, seleções com a biblioteca de exibição de fago MorphoSys HuCAL GOLD® são realizadas.

HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab baseada no conceito de HuCAL® onde todas as seis CDRs são diversificadas, e que emprega a tecnologia

CysDisplay® para ligação de fragmentes Fab à superfície do fago (Knappik e outros, 2000 J. Mot Biol 296:57-86: Krebs e outros, .2001 J. ImmunaL Methods 254:67-84; Rauchenberger e nutras, 2003 J. Βίοι Cbem. 276(40):38194-38205: WO 01/05950, Lôhning, 2001),

Resgate da fagemídeo, ampHTicaçâo de fago e purrftesção

A biblioteca HuCAL GOLD® é amplificada em meto 2x¥T con10 tendo 34 pg/ml de ctoranfemcnl e 1% de glicose (2x¥T-CG), Apôs infecção com fagos auxiliares hiperfago em um de 0,5 (30 minutos a 37° C sem agitação; 30 minutas a 37^ü C com agitação a 250 rpm), as células são giradas (4120 g; 5 minutos; 4^o C). ressuspensas em 2x ¥1734 pg/ml de clorantenicol / 50 pg/ml de canamicina / IPTG 0,25 mM e cultivadas da noite 15 para o dia a 22° C, Fagos são precipitados com PEG duas vezes a partir do sobrenadante, ressuspensos em PBS / glicerol 20% e armazenados a -80° llllllllllllllllllllll

Amplificação de fago entre duas rodadas de panning¹¹ é conduzida como segue: células TG1 de £ cnli de fase mid-log são infectadas com 20 fagos eluidos e pastas em placa em LB~ágar suplementado com 1 % de glicose e 34 pg/ml de cioranfenicol (placas LB-CG), Após incubação da noite para c dia a 30° C, as colônias TG1 são raspadas das placas de ágar e usadas para ínccular 2x YT-CG até um ODses-^ de 0,5 ser atingido e fagos auxiliares hiperfago adicionados.para infecção conforme acima descrito.

panning^ oom HuCAL· GOLD®

Para a seleção de anticorpos reconhecendo hPCSK9 duas estratégias de panning* diferentes foram aplicadas, Sumarizando, anticorpos de fago HuCAL GOLD® são divididos em quatro grupos compreendendo combinações diferentes de genes máster VH (grupa 1: VH1/5 λκ, grupo 2: 30 VH3 λκ, grupa 3: VH2/4/6 λκ, grupo 4: VH1-6 λκ). Esses grupos são individualmente submetidos a três rodadas de 'panning* em fase sólida em hPCSKO humana diretamente revestida em placas Maxisorp e ainda três de panmngfe de solução em hPGSK9 biotinilada.

A primeira variante de panning” é panning em fase sólida contra hPCSK9: 2 poços em uma placa Maxisorp (F96 Nunc-lmmunoplate) são revestidas com 390 pl de 5 pg/ml de hPCSK'9-cada uma o/n a 4^Ç! C, Os po5 ços revestidos são lavadas 2x com 350 yl de PBS e bloqueadas com 350 pl de MPBS 5% per 2 horas em temperatura ambiente em um agitador de placa de microtitulaçâo. Para cada panning” cerca de 10ⁿ anticorpos de fago HuCAL GOLD são bloqueados com volume igual de PBST/MP 5% per 2 boras em temperatura ambiente. Os poços revestidos são lavadas 2x com 350 10 pl de PBS apôs bloqueio. 300 pl de anticorpos de fago HuCAL GOLD® prébloqueados são adicionados a cada poço revestido e incubados por 2 horas em temperatura ambiente em um agitador. Lavagem é realizada adicionando cinco vezes 350 pi de PBS/Tween 0,05%, seguido por lavagem mais quatro vezes com PBS. Eluição de fago a partir da placa è realizada com 300 pl de 15 DTT 20 mM em Tris/HC110 mM pH 8 por poço por 10 minutos. O eluato de fago DTT è adicionado a 14 ml de TGI de E. co/í que são cultivadas para um ODf-oo de 0,5-0,8 a 37° G em meie 2YT e incubadas em tubos plásticos de 50 ml por 45 minutos a 37* C sem agitação para infecção de fago. Após centrifugação por 10 minutes a 5001) rpm, os pèletes baeforianos são cada 20 um ressuspensos em 500 pl de meio 2x YT, postos em placa em planas de ágar 2x ¥T-CG e incubados da noite para o dia a 30° G, Colônias são então raspadas das placas e os fagos foram resgatados e amplificados conforme acima descrito. As segunda e terceira rodadas do panning em fase sólida em hPCSKS diretamente revestida são realizadas de acordo com o protocolo 25 da primeira rodada, mas com estringência aumentada nu procedimento de lavagem.

A segunda variante de panning” è panning” de solução contra PPCSK9 humana biotiniiada: para c fo&nmng de solução, usando hPCSKS blctinilada acoplada a Dynabeads M-2SÔ (Dynai), u protocolo que segue é 30 aplicada: tubos Eppendorf de 1,5 ml são bloqueados com 1,5 ml de albumina de soro bovino 1% em PBS da noite para o dia a 4^o C. 200 pl de Dynabeads M-280 (Oynal) magnéticas revestidas com estreptavidina são lavadas 1x som 200 μί de PBS e ressuspensas em 200 pl de lx Chemiblocker (diluído em 1x PBS). Bloqueio de contes é realizado em tubos pré-bluqueados da noite para o dia a 4° C. Fagos diluídos em 500 pl de PBS para cada condição de são misturados com 500 pl de 2x Chemibiocker / Tween

0,1% 1h em temperatura ambiente (rotator). Pré-adsorção de fagos è realizada duas vezes: 50 μί de cantas magnéticas de Estreptavidina bloqueadas são adicionados aos fagos bloqueados e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente em um rotator. Apôs separação de contas com um dispositivo magnético (Dynaí MPC-E) o sobrenadante de fago (-1 ml) é transferi10 da para um novo tuba bloqueada e pré-adsarção foi repetida em 50 pi de contas bloqueadas por 30 minutas. Então, hPCSKO biotinilada 200 mM é adicionada a fagos bloqueados em um novo tubo de 1,5 ml bloqueado e incubada por 1 hora em temperatura ambiente em um rotator. 100 pl de contas magnéticas de estreptavidina bloqueadas são adicionados a cada grupo 15 de fago de ^í!par?nmg^M e incubados 10 minutos em temperatura ambiente em um rotator. Fagos ligados à hPCSKS são imobilizados para as cantas magnéticas e coletados com um separador de partícula magnética (Dynaí MPCE). As contas são então lavadas 7x em PBS/Tween 0<05% usando um rotator, seguido por lavagem mais outras três vezes oom PBS. Eluição de fago 20 das Dynabeads ê realizada adicionando 300 pi de DTT 20 mM em Tris/HCí mM pH 8 a cada tubo por 10 minutes. As Dynabeads são removidas pelo separador de partícula magnética e o sobrenadante ê adicionado a 14 ml de uma cultura de TG-1 de E co/í cultivada para OD§e^_m de 0,8-0,8. As contas são então lavadas uma vez com 200 pl de PBS e junta com fagos adicio25 nalmente removidos o PBS fui adicionado aos 14 ml de cultura de TG-1 de

E co/ή Para infecção de fago. a cultura é incubada em tubos plásticos de 50 mi por 45 minutos a 37* C sem agitação. Após centrifugação par 10 minutos a 5000 rpm, os pêletes bacterianos são suspensos, cada um. em 500 μί de meio 2x YT, pastas em placa em placas de âgar 2x ¥T CG e incubadas da noite para o dia a 30* C. As colônias são raspadas das planas e os fagos são resgatadas e amplificados conforme acima descrito.

As segunda e torneira rodadas do pannmg” de solução em hPCSK9 biotinilada são realizadas da acordo com o protocolo da primeira rodada, exceto com estringência aumentada no procedimento de lavagem.

Subcfonaqem e expressão de fragmentos Fab solúveis

Qs insertos codificando Fab dos fagemídeos de HuCAL GOLD® 5 selecionados são subclonados no vetor de expressão pMORPH^XGJfob ..F'H para facilitar expressão rápida e eficiente de Fabs solúveis. Para este propósito, o DNA de plasmídeo dos clones selecionados é digerido com Xbal e EcoRl, deste modo exclsando o inserto codificando Fab (ompA-VLCL e phoA Fd) e ctonado no vetor de expressão digerido corn Xbel/EçoRI pMOR10 PH^XO Fab FH. Fabs expressos a partir deste vetor carregam deis marcadores C-terminais (FLAG® e 6xHis, respectivamente) para ambos, detecção e purificação.

M/croexpressão de anticorpos Fab de HuCAL GOLD® em E. cofi

Colônias simples resistentes a ciomnfenicol obtidas após sub15 clonagem dos Fabs selecionados no vetor de expressão pMORPH®X$)_Fab_FH são usadas para inocuiar os poços da uma placa de microtitulação de 96 poços estéril contenda 100 pl de meio 2xYT-CG por poça e cultivadas da noite para o dia a 37° C. 5 pl de cada cultura de TG-1 de E. co/f são transferidos para uma placa de microtítuiação de 06 poços estéril fres- ca, preenchida com 100 pl de meia 2x YT suplementado com 34 pg/ml de oloranfenicol e glicose 0.1% por poço. As placas de microtitulação são incubadas a 30° C agitando a 400 rpm em um agitador de microplaca até que as culturas estejam levemente turvas (-2-4 horas) com um OD^w de ~0,5.

Para essas placas de expressão. 20 pl de melo x2 YT suplemen25 lado com 34 pg/ml de cioranfenicol e IPTG 3 mM (isopropil-0-Dtiogalactopiranosldeo) são adicionados por poço (concentração finai IPTG 0,5 mM). as placas de microtitulação são vedadas com uma fita permeável a gás e as placas são incubadas da noite para o dia a 30^f! C agitando a 400 rpm.

Geração de lisatos de célula integral (extratos BEL): Deletes de células bacterianas foram congelados em gelo seco e então ressuspensos em PBS contendo 1 mg/ml de llsozima. MgCL 2 mM e benzenase e incuba- dos por 1 hora em agitador. Os lisatos foram bloqueados através da adição de BSA am concentração final de 1% e lisatos limpos foram adicionados a placas ELISA apropriadamente revestidas para avaliar a ligação à PCSK9.

Os extratas BEL. foram usadas para análise de ligação através de ELISA.

Técnicas de Ensaio imunoabsorvente L/gedo ã Enzima (EL/SA) pg/ml de hPCSKO recombinants humana em PBS são revestidos em placas Maxíscrp de 384 poç-cs (Nunc-lmmunoplate) a/r? a 4^o C. Após revestimento, os poços são lavadas uma vez. com PBS / Tween 0_:05% (PBS-T) e 2x com PBS. Então os poços são bloqueados com PBS-T com 10 BSA 2% per 2 horas em temperatura ambiente. Em paralelo, 15 pl de extrata

BEL e 15 gl de PBS-T oom BSA 2% são incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As placas Maxíscrp bloqueadas são lavadas 3.x com PBS-T antes de 10 pl dos extratos BEL bloqueados serem adicionados aas poços e incubados par 1 hora em temperatura ambiente. Para detecção dos anticor15 pos Fab primários, os anticorpos secundários que seguem são aplicados: fragmento F(ab^!)s AffiniPure conjugado à fosfatase alcalina (AP), IgG antíhumano, -anti-camundongo ou anti-ovelha de cabra (Jackson Immuno Research). Para a detecção de conjugadas AP substratos fluorogênicos tal como AttoPhos (Rache) são usadas de acordo com as instruções do fabrican20 te. Entre todas as etapas de incubação, as poços da placa de microtitulaçãa são lavadas com PBS-T três vezes e três vezes apôs a incubação final com anticorpo secundário. Fluorescência pode ser medida usando leitura de pisca Thermo Multiskam

Expressão de anticorpos Fab de HuCAL GOí# em E, cofi e 25 purificação

Expressão de fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9~Fab-FH em células TG-1 é realizada em culturas de frasco de agitador usando 750 ml de meio 2x YT suplementado com 34 gg/ml de cloranfenlcal. As culturas são agitadas a 3CP C até que o atinja 0,5. Expres30 são é induzida através da adição de IPTG 0,75 mM por 20 horas a 30° C. As células são rompidas usando lisezima e fragmentos Fab isolados através de cromatografia Ni-NTA (Qiagen, Hílden, Alemanha). Concentrações de proteina podem ser determinadas através de espectrometria UV (Krebs e outros.

J. taí/no/, Methods 254_; 67-84 (2091).

Exemplo 2: Maturação por afinidade da Fabs anti-PCSKB selecionados através de troca paralela de cassetes LCDR3 e HCDR2

Geração de bfb/fofecas d& Fab para maturação por afinidade

A fim de aumentar a afinidade e atividade inibidora dos anticorpos anti-PCSKS identificados, clones de Fab são submetidos â maturação por afinidade. Para este propósito, regiões CDR são otimizadas por mutagênese de cassete usando mutagênese direcionada a tnnucleotldeo (Virnekas 10 e outros, Mucfeè Acids Res 22, 5600-5607, 1994).

O parágrafo que segue descreve rapidamente um protocolo que pode ser usado para clonagem das bibliotecas de maturação e otimização de Fab. Fragmentes Fab do vetor de expressão pMORPH^XS JFab__FH são cloaados no vetor de fagemideo pMORPH®25 (Patente U.S. No. 6,753.138). 15 Duas estratégias diferentes são aplicadas em paralelo para otimizar ambas, a afinidade e a eficácia dos Fobs de origem.

Bibliotecas de Fab de anticorpo de fago são geradas onde a LCDR3 de seis candidatos de maturação selecionados (clones de origem) é substituída por um repertório de sequências de CDR3 de cadeia leve indi28 viduais. Em paralelo, a região HCDR2 de cada clone de origem é substituída por um repertório de sequências de CDR2 de cadela pesada individuais. Bibliotecas de maturação de afinidade são geradas através de procedimentos de clonagem padrão e transformação dos clones diversificados em células TOP1 OF' de E, co/r eietrocompetentas (Invitrogen). Fagos apresentando Fab 25 são preparados conforme descrito no Exemplo 1. Grupos de maturação correspondendo a cada biblioteca são formados e mantidos separados durante o processo de seleção subsequente.

Estratégias de panning de maturação

Tanníngfe usando os quatro grupas de anticorpo são realizados 30 em hPCSK9 recombinante biotinilada em solução para três rodadas, respaçtivarnente conforme descrito no Exemplo 1, panning de solução contra hPCSKG biotinilada. A estringênoia de seleção é aumentada através da re~ dução de antígeno biotinilado de rodada de panwhgT para rodada de pann/ng, através de etapas de lavagem prolongadas e através da adição de antígeno não-bíotinilado para dissociação (ofbrate sefecfior?).

Anã/tee de l/gação baseada em e/efroqu/m/o/um/ncscênc/a (B&5 Vens) para detecção de Fab se bgando â APCSK9 em feitos de bactérias

Ligação de anticorpos Fab otimizados em lisat.es de E co// (extratos BEL) à hPCSKâ é analisada em BioVeris M-SERIES* 384 Analyzer BioVeris, Europa, Witney, Oxforfshire, UK). Extratos BEL são diluídos em tampão de ensaio (PBS/Tween 20 0,05%/BSA 0,5%) para uso em avaliação 10 de BioVeris. hPCSKO biotínílada é acoplada a contas paramagnéticas revestidas com estreptavídína, (Fab) s anti-humano (Dlanova) foi rotulado com ruténlo usando o BV-tag® (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK). Este anticorpo secundário é adicionado ás contas acopladas á hPCSKQ antes da medição no BioVeris M-SERÍES*¹' 384 Analyzer, Análise de sequência des15 ses pedaços da avaliação de BioVeris é conduzida para identificar clones de Fab, Anticorpos Fab selecionados são subclonados em formato lgG1.

Determinação ate afm/dades pfemo/ares usando T/tu/açãa de Eqm7/brio de So/ução (SEF)

Para determinação de K», frações de monômero (teor de monô20 mero de pelo manos 90%,. analisado através de SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab são usadas. Determinação de afinidade baseada em eletroquimioluminescência (ECL) em solução e avaliação de dados podem ser realizadas essencialmente conforme descrito par Haenel e outros, 2005. Urna quantidade constante de Fab é equilibrada com ooncen25 trações diferentes (diluições 3* seriais) de hPCSKO recombinante em solução. hPCSKS biotiniiada acoplada a contas paramagnétioas (Estreptavídína M-230, Dynal) e (Fab)E anti-humano (Dianova) rotulado com BV-tag^ (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) são adicionados e a mistura incubada por 30 minutos, Subseqüentemante, a concentração de Fab não-ligado é 30 quantificada através de detecção ECL usando o analisador M-SERIES® 384 (BioVeris Europe).

Determinação de afinidade para PCSK9 de outra espécie (por exemplo, chimpanzé ou cinomólogo) em solução é feita essencialmente conforme acima descrito, substituindo a PCSK9 humana com PCSK9 de chimpanzé ou cinomólogc. Para detecção do Fab livre, hPCSK9 biotinilada acoplada a contas paramagnéticas é usada. Afinidades são calculadas de aaor5 do com Haenel e outros (2005 Anal. Sfoc/tom. 339,182-184).

Exempla 3> Geração de Fab Antí~CPSK9 através de Exibição de Fago

Fab anti-POSK9 foi gerado usando as técnicas de exihiç-ão de fago que seguem. PCSK9 humana purificada foi rotulada com biotma PEO4 (Pierce. 21329) usando o protocolo do fabricante usando uma razão molar 10 20:1 de biotina:PCSK$). Razões molares baixas asseguram modificação limitada da proteína sendo rotulada e a escolha do ligante PEO4 separa a porção biotina da proteína e aumenta a hidrofilicídade geral da proteína biotiniíada. PCSK9 humana biotinilada foi usada para revestir contas de estreptavidina Dynal M280 e a biblioteca Morphosys Hucal foi panned por 3 roda15 das usando técnicas de panning padrão. Após três rodadas iterativas de panning, o DNA de plasrnídeo das 3 rodadas agrupado foi purificado e digerido com enzimas de restrição EcoRI e Xbal. ONA de plasmídeo foi separado através de eletroforese em gel de agarose e o inserto de 1,5 kB contendo dois segmentos de gene (cadeia pesada de imunoglobulina (VH/CH) e 20 cadeia leve (VL/CL)) foi excisado e purificado. Este fragmento de 1,5 kB (inserto Fab) foi subcíonado no vetor de expressão Morphosys pMORPHX9_FH e transformado em células TG-1 eletrocompetentes. Colônias individuais foram escolhidas e placas master foram preparadas. Placas filhas inoculadas das placas mãster foram novamente cultivadas em melo com 25 pouca glicose e expressão de Fab foi induzida através de cultura na presença de IPTG da noite para o dia. Péletes de célula foram congelados, lisados com lisozima e lisatos limpos foram avaliados através de ELISA em placas revestidas ocm PCSK9 biotinilada com PEG revestidas em poços revestidas com neutravídina (controles negativos neutravidina sozinha). ELISA positivos 30 foram testados novamente seguindo a nova realização de listras de placa mâster em placas de ágar e seleção de 3 colônias individuais para novo teste. DNA de plasmídeo de clones de PCSK9 foi também preparado para se80 qüènciamento de DNA. Proteína Fab de clones únicos foi preparada ern culturas de escala em litro induzidas com IPTG e então purificada sequencialmente por IMAC e cromatografia de exclusão de tamanha. Concentrações de proteína foram determinadas através do ensaio Bradford acoplado com

SDS-PAGE,

Exemplo 4: ELISA Competitivo de PCSK8

PCSK9 humana purificada rotulada com NHS-PEQ4-biotina (Pierce, 21329) foi usada para revestir placas Nunc Maxísorp revestidas com neutravidína. Seguindo o bloqueio de ligação não-especifica com BSA, po10 ços revestidos com PCSK9 foram incubadas primeiro com urna concentração de saturação de Feb PCSK9 anti-humano (Fab controle positivo) ou com tampão sozinha. Seguindo ligação do Fab controla positivo (ou tampão sozinho), Fabs PCSK9 anti-humano alternados (Fab teste) foram adicionados a ambas aos poços tratados com tampão sozinho e Fab PCSK9 anfehumano. 15 Apos etapas de incubação e lavagem, fragmentas de anticorpo ligados à PCSK9 humana ligada à placa foram detectados usando um coquetel de anticorpos de cadeia leve anti-humanos de cabra, conjugados com peroxidase, oom substrato de 3, 3‘, 5, 5’-tetramet.ilbenzidina (TMB). Fabs que competem com sítios de ligação similares ou de sobreposição em PCSK9 huma20 na falham em elicítar sinais de ligação adicionais (isto é. competição de ligação para sitias similares ou de sobreposição em PCSK9 humana) comparada com Fab controle positivo sozinho. Altemativamente, Fabs que se ligam índependentemente do Fab controle positivo exibem sinais de ligação aumentados conforme refletido por níveis altos de conversão de substrato TMB 25 (isto è, ligação não-competitíva de Fabs e PCSK9 humana). Usando esta estratégia, Fabs foram agrupados com base na habilidade de membros em bloquear a ligação uns dos outros à PGSK9 humana. Caracterização inicial com H1-anti-PCSK9-Fab como o Fab controle positivo dividiu os anticorpos em dois grupos: inibidos por H1 (grupa 1) ou não-inibidas por H1 (grupo 2). 30 Experimentos de competição de ligação adicionais demonstraram que Fabs dentro de cada grupa inibiram a ligação de outros membros daquele grupo. A partir desses estudos, urn terceira grupa de Fabs (grupo 3) foi identificado em virtude de não-competição com Fobs ou do grupo 1 ου grupo 2. Agrupamento de Fab foi utilizado como um guia para determinar quais dos Fabs antí-PCSK9 caracterizar para afinidade de ligação, habilidade em romper o hPCSK9/LDL--R e os efeitos sobre células HepG2. O sitio de ligação preciso em PCSK9 humana de Fabs com propriedades desejadas ã? wfru, tal como

H1, foram então mapeadas usando técnicas biofísicas tal como DXMS, conforme ilustrado no Exemplo 4.

Exemplo 5: Análise Funcional dê Fab AnthPCSKO

Neste exempla, as propriedades funcionais do Fab Hl-anti10 PCSK9 foram examinadas, incluindo afinidade de ligação, habilidade em romper o hPCSK9/lX)l.-R e os efeitos sobre células HepG2.

1.. Afinidade de Ligação

Ensaios de ligação Biacore foram realizados a 25^β C em um instrumento TI 00. HBS-P-rCa (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, P-20 15 0,005%, CaCb a 2 mM) foi usado como o tampão de ativação. Para imobilização, ÕPCSK9 foi diluida em acetato pH 5,5 a 30 pg/ml um pouco antes do uso. Cerca de 200 RU de hPCSKS foram imobilizados em um sensor chip CM5 (Série S) seguindo o protocolo de acoplamento de amina padrão.. Solu ções de Fab (0-20 nM, diluido no tampão de ativação) foram injetadas na 20 PCSK9 e superfície de referência (acoplamento de amina vazio) em uma taxa de fluxo de 30 plfmln. Superficie de PCSK9 foi regenerada com uma injeção de 60 segundos de NsOH a 1 mM e NaCI a 1M,

Todas as análises de dados foram feitas usando um sofovaro BlAevluation. Curvas de ligação foram corrigidas com referência dupla, primei25 ro com a curva de ligação da célula de referência, seguida pela curva de ligação do vazio do tempão de ativação. Então os dados foram analisados globalmente dentro de um modelo 1:1 de ligação para extrair constante de ligação Ko (nM), constante de taxa de associação (foj, 1/Ms) e dissociação (fe. 1 /s).

Foi determinado que H1-Fab exibia uma k_s de 3,23 x 10 (1/Ms), kc de 3,41 x 10³ (1/s) e Ko de 1,05 x 10'^s M (Figura 3).

2.Hab//?dade do Fab Hf~AntèPCSK9 em Romper

Um ensaio da rompimento FRET de PCSK9-LDL-R foi realizado como segue para avaliar a habilidade de Hi-Fab em romper a interação hPCSK9-LDL.-R. O domínio extracelular de LDL-R (Ala 22-Arg 788) (R&D 5 System) foi rotulado com criptato de europerém (LDL-R-Eu) (Perkin Elmer) e proteína purificada de PCSK9 foi rotulada com Alexa Flúor 647 (PCSK9Alexa) (Invitrcgen). O tampão de ensaio consistia em HEPES a 20 mM (pH 7,0), NaCI a 150 mM, CaCI₂ a 2 mM, Tween 20 0,1% e BSA 1 mg/ml, O Fab foi pré-incubado com PCSK.9~Alexa em temperatura ambiente por 30 minu10 tos antes de LDL-R-Eu ser adicionada. A concentração final de PCSK9Alexa e LDL-R Eu era 8 nM e 1 nM, respectivamente. Após duas horas de incubação, a placa foi lida em Envision (Perkin Elmer) com os ajustes que seguem: excitação a 330 nm e emissões em cerca de 620 nm e 665 nm. 100 pS de retarde entre a excitação e as leituras. A razão de leitura a 666 nm 15 sobre leitura a 620 nm é normalizada e relatada na Figura 4.

Conforme mostrado na Figura 4A, H1-Fab rompeu a interação hPCSK9/LDL-R.

3. Efeito sobre cé/u/as HepG2

Absorção de LDL foi medida usando citometria de fluxo. Células 20 HepG2 (ATCC) foram mantidas em DMEM com soro bovino fetal (FBS) 10% (V/V). As células foram semeadas em uma placa de 96 poços revestida com colágeno em 96 peços (BD Bioscience), na noite anterior a tratamento Ab de PCSK9. 200 nM de proteína PCSK9 foram pnè-íncubados oom Fab antiPCSK9 em concentrações indicadas por 30 minutos antes da adição a cêlu25 ias.

Após tratamento de PCSK9 e Fab por 3 horas, di LDL (Intracel) foi adicionada diretamente a cada poço para uma concentração final de 5 ug/ml e incubada por uma hora adicional a 37° C, CO₂ 5%. As células foram tripnizadas, coletadas e células positivas para dí-LDL foram medidas através 30 de citometria de fluxo (LSRII,. BD Bioscience).. Médias geométricas foram analisadas usando software FlowJo 5.7.2, normalizadas para controle de tampão, e relatadas na Figura 4.

LDL na superfície foi também medida usando c-itcmetria de fluxo (Figura 48). Células HepG2 foram tripnizadas, semeadas em placa revestida cem colágeno a incubadas da noite para o dia a 37* C com CO? 5% para permitir a recuperação de expressão de LDL-R. Ne dia seguinte, proteína 5 PCSK9 e Fab PCSK9 foram prè-místurados 30 minutos antas da incubação com células por 4 horas. As células foram coletadas com Versene (Invito gen) e bloqueadas com soro de burro (Jackson Immunoresearch Laboratories) antes do fingimento com um anticorpo pollclonal LDL-R anti-Humano de coelho (Fitzgerald) e subsequentemente com anticorpo IgG anticoelho de 10 burro conjugado com APC (Jackson Immunoresearch Laboratories). Apos lavagem, as células foram fixadas com paraformaldeído 2% e submetidas à análise de cítometria de fluxo em um citõmetro BD LSR-ll. As médias de médias geométricas foram calculadas usando sofbvam FlowJe 5.7.2 e relatadas na Figura 4.

Conforme mostrado na Figura, Hl-Fab levou a uiveis da LDL-R na superfície aumentados (Figura 48) e absorção de LDL aumentada palas células Hep2 (Figura 4C).

Exempla 8: Mapeamento de Epitopo

Neste exemplo, espectrametria de massa de troca de deutério 20 (DXMS) foi usada para determinar o(s) epitopo(s) reconhecidos por H1-Fab como segue.

A. Mafena/s

Diluente de proteína (Hj?O ou D^O) era fosfato de sódio a 20 mM, pH 7.3 com NaCI a 150 mM. A solução de extinção foi ácido trifluoraacético 25 0,5% (v/v) (TFA) em água. Todos outros agentes químicos foram compradas da Sigma e solventes de grau HPLC eram da Fisher Scientific. Incubações de Proteina.Fab foram preparadas e deixadas incubar por pelo menos 2 horas a 4° C.

8. Troca de Hidmg0.toa43eut0rio (H/D) em So/ução

Experimentos de espectrcmetna de massa de troca de H/D automatizados foram realizados com um ajuste similar e maneira similar conforme descrito na literatura. (Anaí Chem. 2006, 78, 1005-1014). Em suma, uma distribuidor de líquido LEAP Technologies Pai NTS (LEAP Technologies, Carrboro, NC) foi usado para todas as operações de dístribuiçãode liquido. Q distribuidor de líquido foi controlado através de instruções de automação escritas em LEAP Shell que foram codificadas pelo fabricante. O robô foi 5 alojado em um espaço fechado refrigerado mantido a 2^o C. Placas para amostra, diluente e solução de extinção foram carregados nas bandejas de distribuidor de líquida antes do início de uma sequência experimental. Uma válvula de injeção de 6 portas e uma estação de lavagem foram também montadas no trilho do distribuidor de liquido e facilitam injeção de amostra IO no sistema cromatográfico e lavagem de seringa, respectivamente. O sistema cromatográfico consistia em duas válvulas adicionais, uma coluna da enzima, um cartucho de aprisionamento de fase reversa e uma coluna analítica fai alojada em uma câmara separada construída em casa e mantida a 2® C par pilhas pettier. As conexões de fluido e ajuste do cartucho de aprisic15 namento de fase reversa, de pepsina imobilizada, e coluna analítica para as válvulas são ilustradas na Figura 5. Válvulas e colunas foram configuradas de modo a permitir digestão de proteína em linha, dessalinização de peptldeo e cromatografia de fase reversa antes da introdução da amostra na fonte de íonização por eietropulverizaçâa (ESI) do espectrômetro de massa. As 20 correntes de fluido requeridas para operação foram providas por dois sistemas de HPLC Agilent separadas (Agilent 1100, Paio Alto, CA). A primeira bomba de HPLC (bomba de carregamento) liberou ácido trifluoroacético (TFA) 0,05% (v/v) em água a 125 pl/min. As posições da válvula durante a fase de carregamento são ilustradas na Figura 5A. Neste fase a amostra é 25 transferida da alça de amostra através do cartucho de pepsina imobilizada (2 mm x 20 mm, gentilmente provido pelo Prof. Virgil Woods de UCSD) para um cartucho de aprisionamento de fase reversa (1 mm x 8 mm, Michrom Bioresources Inc.. Auburn, CA). Subsequentemente, válvula auxiliar 2 foi mudada de modo que a segunda bomba de HPLC (bomba de gradiente) II38 berou um gradiente através da cartucho de aprisionamento de fase reversa e a coluna analítica na válvula auxiliar 3. O cartucho de enzima imobilizado foi isolado para refugo nesta posição. A válvula auxiliar 3 fai programada para desviar fluxo para refugo por um período de tempo predeterminado para dessalinização (Figura 5B) da amostra carregada no cartucho de aprisionamento. Após ο período de dessalinlzação, a válvula foi mudada de modo a permitir que o fluxo da bomba de gradiente atingisse a fonte de ion do es5 pectrômetra de massa (após passagem pelo cartucho de aprisionamento e pela coluna analítica, Figura SC). A bomba de gradiente liberou um gradiente de 0 a 40% de fase móvel B durante 55 minutos a 50 pL/min (fase móvel A”ácido fórmico Q,2% em água, B-âcido fórmico 0,2% em acetonitrila).

C, Especfrometos de Massa

Espectrometria de Massa em Tandem com lonízação por Eletropulvenzação de Cromatografia Líquida (LC-ESl-MS) foi realizada em urn QTof Ultima Global (Waters, Milford, MA) operado em modo V. Dois experimentos de mudança MS/MS dependentes de dados foram realizados para coletar espectros de massa em tandem para o propósito de identificação das sequências dos peptideos geradas através de proteôlíse or?-ifoe. Aquisições realizadas para o propósito de determinação do nível de deuteração foram apenas MS (varreduras de 5 s em m/z 400-1500).

D, Experimentes da Troca de H/dmgénfo/Deuteno (H/D) Compíementâr&s

A proteína (hPCSKS e seu pró-domlnlo PD) foi submetida a várias condições de troca ativada e desativada (on-and o/f-exchange) com o resultado liquido esperada sendo uma rotulação de qualquer epitopo potencial através de um aumento nos níveis de deuteração com relação ao controle no experimento de proteção (descrito abaixa) e uma redução em nível de 25 deuteração com relação ao controle no experimento In-D^-Q (descrito abaixa),

Deuteração, que é a troca de hídrogéníos de amida na proteína com deutério, é uma ferramenta especiaímente útil para o teste de estrutura e funcionamento de proteínas porque rotulação com deutério não muda a 30 estrutura qu funcionamento da proteína rotulada. O deutério é um isótopo de hidrogênio que tem duas vezes a massa do hidrogênio, indicado na Figura 6 por estreias. Isto está ern contraste total com outros métodos de rotulação que ligam porções novas a grupos funcionais existentes em proteínas.

f.Expertmento de Proteção

No experimento de proteção, solução de proteção doutorada foi preparada através da incubação da noite para o dia da proteína em fosfato 5 de sódio 20 mM, pH 7,3 com NaCI a 150 mM em D?O. No experimento controle, proteínas deuteradas foram diluídas com HjO e após períodos de tempo variáveis de troca off (por exemplo, 5 minutos) solução extinta foi adicionada. Isto foi seguido por digestão on-ftee com pepsina e LCMS conforme anima descrito. Troca off do complexo proteína:Fab foi realizada através de 10 diluição da solução de proteína doutorada com uma quantidade equimolar de solução Fab (não-deuterada, vide Figura esquemática 6, coluna à direita) e incubação por 15 minutos para formar o complexo proteína (deuterada):Fab. Após formação do complexo a mostra foi tratada conforma descrito abaixo para o controle.

A coluna à esquerda da Figura 6 ilustra a sequência experimentai para o experimento de proteção, que começa com PCSK9 deuterada Deuterado” significa que os hídrogênios amida da proteína foram substituídos com deuteric através da incubação da proteína em tampão de deutério por um período de várias horas. Conforme ilustrado na segunda fileira na coluna 20 à esquerda da Figura 6, a ligação do Fab a seu epitope na proteína PCSK9 deuterada vai bloquear parte da superfície de PCSK9 em tomo da área do epitope, O bloqueio da superfície também reduz acesso a solvente, que è critico para troca de hideogênio/deutério acontecer. Na terceira fileira na coluna ã esquerda da Figura 6 o efeito de incubação de complexo PCSKO/Fab .25 deuterada em tampão não-deuterade é ilustrado.

Conforme mostrado na Figura 6, níveis de deuteraçâo sobre PCSK9 são rapidamente reduzidos nas áreas acessíveis a solvente porque troca da H/D pede acontecer livremente. Em contraste, c acesso de solvente reduzido à área do epifopo devido à ação de bloqueio do Fab que converte a 30 superfície faz com que a trona H/D sep deixada mais lenta, isto resulta na preservação da maior parte da deuteraçâo na área do epitopo.

É possível localizar os níveis aumentados de deuteraçâo (mar cando o epitope) ac longo da sequência de proteína ao cortar o complexo proteína Fab em pedaços menores com uma enzima e medição do nível de deuteração de cada um dos fragmentos com um espectrômetro de massa.

Isto ê possível parque a mudança de massa que acontece resulta de deute5 ração uma vez que o deutério è mais pesado da que o hidrogênio. Reunião da informação coletada dos fragmentos permite que uma pessoa derive a distribuição da deutério em toda a sequência da proteína.

2. Contro/e

Devido ao fato dos níveis de deutério variarem muito em toda a sequência de proteína devido à estrutura da proteína e a variação resultante em acessibilidade de solvente bem como a diferenças em taxas de troca H/D observadas para ligações amida formadas entre aminoácidos diferentes, ê impossível concluir apenas a partir de um nível de deuteração elevado observado no experimento de proteção (descrito pela coluna à esquerda da 15 Figura 6) sobre a presença de um epitopo. Felizmente, a variação natural de níveis de deuteração cancela em um experimento diferente, O experimenta diferencial consiste na medição dos níveis de deuteração na presença e na ausência (experimento controle, coluna do centro da Figura 6) do Fab e cálculo da diferença em deuteração. As diferenças observadas em nível de 20 deuteração são atribuíveis apenas aos efeitos do Fab e valores altos serão indicativos da presença e localização de epítopos,

3. Experimento

Ainda, experimento diferencial complementar (isto ê, um experimento in-D^O) ilustrado na coluna à direita da Figura 6 pode ser realizado e 25 o resultado esperado deduzida usando legíca similar àquela proposta para o experimento da coluna à esquerda. A diferença principal sendo que a diferença observada em deuteração para o experimento da coluna à direita deve ser oposta em sinal àquela da coluna à esquerda e provê então evidência complementar quanto á presença e localização de um epitopo potencial bem 30 como validação de resultados uns contra os outros.

Em um experimento fn-D?O típico (vide Figura 8 esquemática, colunas do meio e à direita) proteína (controle) ou alternativamente complexo protema.Fab é diluído em tampão de D₂G· Apôs um período fixo de troca on a mistura é diluída mais com tempão da H₅O para causar troca off e finalmente extinta com tampão de extinção. Uma vez misturada, a solução extinta é totalmente automaticamente proteolisada. separada e analisada através 5 de LCMS conforme acima descrito. Vários períodos de incubação de D₂O (por exemplo. 45s) foram usados no experimento para otimizar as diferenças observadas em deuteração entre controle (proteína apenas) e a amostra de proteina.’Fab. A mudança média em deuteração entre amostra e controle foi calculada como a diferença entre os níveis de absorção da deutério da a10 mostra e controle, onda níveis de absorção de deutério foram determinados conforme descrito abaixo sob processamento de dados.

E. Processameríto de Dados

Aquisições MS em tandem foram reduzidas para listas de pico usando MassLynx (Waters. Milford. MA) e pesquisadas contra a sequência 15 de proteína usando Mascot (Matrix Sciences, Londres. UK). Uma liste de identificações da sequência de peptídeo prováveis retomada através da pesquisa ao banco de dados foi manualmente validada. MassLynx foi usado para gerar cromatogramas de ion único das massas de lon de precursoras validadas. Espectros de massa das distribuições isotópicas de cada precur20 sor foram somados através do pico cromatográfico, estabilizados e centrados de moda a determinar o nível de absorção de deutério. Para designar um nível de absorção de deutério para cada resíduo da sequência de proteína o procedimento abaixo foi seguido. Os resíduos foram indicados com a absorção de deutério normalizada dos peptídeos que os cobriam. Se mais 25 de um peptídeo cobrisse o mesmo resíduo a média da absorção de deutério normalizada de todos os peptideos cobrindo este resíduo seria usada. A absorção de deutério normalizada para cada paptideo foi calculada dividindo o nivel de deuteraçâo observado pelo número de aminoácidos neste peptídeo.

F. mu/tados

A mudança média observada em deuteração para os experimentos de proteção e In-DsO realizados em hPCSKO e complexo hPCSK9;H1Fab como uma função de número de resíduo de hPCSKO (pró-domínio incluw ído, domínio rico em cisteína è excluído uma vez que ele não foi coberto pelos experimentos) é mostrada na Figura 7. As sequências de aminoácido das regiões mostrando o comportamento esperado de um epitopo potencial são também mostradas na Figura 7.

A Figura 7A mostra a mudança em deuteração para o experimento de proteção. A mudança em deuteração é definida oomo a diferença entre o nível de deuteração do experimento ilustrada na Figura 6 (Figura à esquerda, com Fab presente) e seu controle (coluna do meio, sem Fab), A mudança em deuteração é posta em gráfico como a mudança de massa média 10 por resíduo sobre o número de residue de residues de aminoácido 40 a 420 da sequência PCSK9 (começando cem o pró-domínio e excluindo o domínio rico em cisteína), Um valor alto para a mudança em deuteração (indicado como uma mudança de massa positiva por resíduo) é indicativo de um epitope. A região de resíduos 123-132 (sequência explicada em gráficos) so15 bressai cam relação a isso e é então considerada cobrir iodo ou parte de um epitopo.

Os dados complementares do experimenta in-D₂O (ilustrado na coluna à direita na Figura 6) são postos em gráfica na Figura 7A. Comparação dos dois gráficos mostrados na Figura 7 revela que a extensão de ami20 nuácidas 123-132 LVKMSGDLLE mostra a mudança antecipada de níveis de deuteração para um epitopo conforme esperado da elaboração experimental (Figura 6). A região 123-132 (LVKM8GDLL.E) na estrutura em cristal de PCSK9 (vide Figura 8) cobre parte de uma hélice e alça e faz sentido físico como um epitopo potencial uma vez que eia é altamente acessível.

Não imediatamente óbvios a partir dos dados mostrados na Figura 7 são resíduos de extensão 101-107 da segunda região (QAARRGY) (vide Figura 8), que é uma subseção de uma região maior gue também mostra o camportamenta de complementaridade esperada em níveis de deuteração na Figura 7 que seria característico de um epitopo potencial, O método usa30 do para mapeamento para trás (mapping back) da mudança em nível de deuteração da deuteração dos peptídeos observados na sequência primária tem um efeito fortemente estabílizante, o que é desejável uma vez que as flutuações observadas na medição sàc bem grandes.

Por outro lado, esta deslocalização de níveis de deutèrío toma mais difícil detectar a participação provável da região coberta pelos resíduos

101-107 no epitopo a partir dos dados como é posto em gráfico na Figura 7.

Ainda, inspeção detalhada dos peptídeos observados cobrir a região maior permite que a maior parte da troca seja atribuída à região muito curta 101 107.

Ainda, é importante notar na estrutura em cristal que esta região mais curta está espaeialments localizada à direita proximo à região 123-132, 10 o que sugere que ambas as extensões formam o epitopo não-linear de H1Fab em hPCSKO. Importante, as duas extensões de aminoácidos implicadas pelos dados da Figura 7 formam um epítopo não-linear para H1-Fab, o que se relaciona com as sequências de aminoácido SEQ ÍD NOs: 2 e 3 previstas para epitopos antigênicos de hPCSKS (Tabela 2).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao polipeptídeo da pró-proteína convertase subiilisina /quexina tipo 9 (PCSK9) isolada compreendendo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma

5 PCSK9, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do domínio catalítico de PCSK9 humana (SEQ ID NO1) dentro ou sobrepondo a um dos que seguem.

(a) aminoácidos 166 a 177 da SEQ ID NO:1;

(b) aminoácidos 187 a 202 da SEQ ID NO:1;

10 (c) aminoácidos 206 a 219 da SEQ ID NO: 1:

(d) aminoácidos 231 a 246 da SEQ ID NQ.:1;

(e) aminoácidos 277 a 283 da SEQ ID NQ:1;

(f) amlnoáoidos 336 a 349 da SEQ ID NO: 1;

(g) aminoácidos 368 a 383 da SEQ ID NO:1; ou

15 (h) aminoácidos 426 a 439 da SEQ ID NO: 1.
2. Molécula de ligação á PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma PCSK9, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do domínio rico em cisteína de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo

20 a um dos que seguem:

(a) aminoácidos 443 a 500 da SEQ ID NO; 1;

(b) aminoácidos 557 a 590 da SEQ ID NO: 1: ou (c) amincáoidos 636 a 678 da SEQ ID NQ: 1.
3. Molécula de lígaçãc à PCSK9 isolada compreendendo uma

25 porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma PCSK9, onde a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do pró-dominio de PCSK9 humana ou sobrepondo aos aminoácidos 89-134 da SEQ ID NO:1.
4. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com qualquer uma 30 das reivindicações 1 a 3, em que a porção de ligação de antígeno é reativa cruzada com uma PCSK9 de um primata não-humano.
5.. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a porção de ligação de antígeno é reativa cruzada com uma PDSK.9 de uma espécie de roedor.
6. Molécula de ligação á PCSK9 de acorde com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um

5 epitopo linear.·
7. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear.
8. Molécula de ligação à PCSK
9 de acordo com a reivindicação
10 7, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo nâo-linear consistindo em pelo menos uma porção de nada um dos epitopos lineares que seguem;

(a) aminoácidos 89-101 da SEQ ID NO:1; e (b) aminoácidos 106-134 da SEQ ID NO:1.

15 9. Molécula de ligação â PCSK9 de acordo com a reivindicação

7, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear consistindo em pelo menus uma porção de cada um dos epitopos lineares que seguem;

(a) aminoácidos 166-177 da SEQ ID NO:1; e

20 (b) aminoácidos 443-458 da SEQ ID NO:1.

10. Molécula de ligação â PCSK9 de acordo com a reivindicação 7, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não-linear consistindo em pelo menos uma porção de dois ou três epitopes lineares que seguem:

25 (a) aminoácidos 187-202 da SEQ10 NO:1:

(b) aminoácidos 231-246 da SEQ ID NQ:1; e (c) aminoácidos 368-383 da SEQ IO NO:1.
11. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

7, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo não -linear 30 consistmdo em pelo menos uma porção de cada um dos epitopos lineares que seguem:

(a) aminoácidos 266-219 da SEQ ID NO;1; e (b) aminoácidos 277-283 da SEQ ID NQ.1.
12. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 7, em que a porção de iígação de antígeno se liga a um epitope nao-linear consistindo em pelo menos uma porção de cada um dos epitopos lineares

5 que seguem;

(a) aminoácidos 336-349 da SEQ ID NQ;1; e (b) aminoácidos 426-439 da SEQ ID NQ:1.
13. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 7. em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitope não-linear

10 consistindo em pelo menos uma porção de cada um dos três epitopos lineares que seguem;

(a) aminoácidos 459-476 da SEQ ID NO.1;

(b) aminoácidos 486-500 da SEQ ID NO:1; e (c) aminoácidos 557-573 da SEQ ID NQ:1,
15 14. Molécula de ligação â PCSK9 de acordo com a reivindicação

7, em que a porção de ligação de antígeno se iiga a um epitopo não-linear consistindo em pelo menos uma porção de dois ou três dos epitopos lineares que seguem :

(a) aminoácidos 577-590 da SEQ ID NO:1;

20 (b) aminoácidos 636-645 da SEQ ID NO:1; e (c) aminoácidos 659-677 da SEQ ID NO:1,

15. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

2, em que a porção de ligação de antígeno se liga especificamente a um epitopo de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo dentro ou sobrepondo a um

25 dos que seguem:

(a) aminoácidos 443-458 da SEQ ID NO;1;

(b) aminoácidos 459-476 da SEQ ID NO:1;

(o) aminoácidos 486-500 da SEQ ID NQ:1;

(d) aminoácidos 557-573 da SEQ ID NO:1;

30 (e) aminoácidos 577-590 da SEQ ID NO: 1:

(f) aminoácidos 636-645 da SEQ ID NO:1; ou (g) aminoácidos 659-677 da SEQ ID NO:1.
16, Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 3, em que a porção de ligação de antígeno se liga especificamente a um epitopo de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo a um dos que seguem, (a) aminoácidos 89-101 da SEQ ID NO:1: ou

5 (b) aminoácidos 108-184 da SEQ II) NO:1.
17, Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16. em que a porção de ligação de antígeno se liga à PCSK9 com uma constante de dissociação (Ku) igual a ou menor do que 10 nM.

10 18, Molécula de ligação à PCSK9 de acorda com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a porção de ligação de antígeno se liga à PCSK9 com uma constante de dissociação (Kp) iguaí a ou menor do que 1 riM,

19.. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

15 18, em que a porção de ligação de antígeno se liga à PCSK9 com uma Kq igual a ou menor do que 0,5 nM,

20. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com a reivindicação 19, em que a porção de ligação de antígeno se liga á PCSK9 com uma igual a ou menor do que 0,1 nM,

20 21. Molécula de ligação á PGSK9 de acordo com a reivindicação
18, em que a porção de ligação de antígeno se liga à PCSK9 de um primata nãô-humano com uma Ko igual a ou menor do que 0,3 nM.

22. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com a reivindicação

18.. em que a porção de ligação de antígeno da mesma se liga à PCSK9 ccm

25 uma K» igual a ou menor do que 0,5 nM.

23. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que a porção do ligação de antígeno é uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo humano,

24. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

30 2.3, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou humanizado.

25.. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que a porção de ligação de antígeno é uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo monoclonal .26. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo corn a reivindicação

23_s em que a porção de ligação de antígeno é uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo poíicíonal.

5 27. Molécula de ligação â PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, em que a molécula de ligação à PCSK9 é um anticorpo quimérica.

28. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, em que a molécula de ligação à PCSK9 compreen-

10 de um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um F(ab^!)₂ ou fragmento Fb do anticorpo.

29. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, em que a molécula de ligação à PCSK9 compreende um Fv de cadeia simples.

15 30. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, em que a molécula de ligação à PCSK.9 compreende um diacorpo.

31. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em que a porção de ligação de antígeno é deríva-
20 da de um anticorpo de um dos isotipos que seguem: ígG1, ígG2, lgG3 ou lgG4.

32. Molécula dé ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, em que a molécula de ligação à PCSK9 inibe ligação de PCSK9 a um ligante de PCSK9.
25 33. Molécula de ligação à PGSK9 da acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que a molécula de ligação à PCSK9 inibe ligação de PCSK9 a um receptor de lipoproteins de baixa densidade (LDL-R).

34. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, em que ã molécula de ligação â PCSK9 inibe ati-

39 vidade proteolitica de PCSK9..

35. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

34, em que a molécula de ligação â PCSKô inibe prateúlise de prú-daminío de PCSK9.

36. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, em que a molécula de ligação á PCSK9 inibe a diminuição dependente de CPSK9 de LDL-R em um hepatóclto.

37. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 36, em que a molécula de ligação à PCSK9 inibe degradação dependente de CPSK9 de LDL-R em hepatócitos.

38. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, em que a molécula de ligação à PCSK9, quando contatada com um bepatòcito sob condições em que PCSK9 está presente, aumenta a absorção de coiesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDLc) pelo hepatóclto, com relação à absorção de LDL~c pelo hepatóclto na ausência da molécula de ligação ã PCSK9.

39. Molécula de ligação à POSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38. em que a molécula de ligação à PCSK9 se liga à PCSK9 na presença de LDL-c.

40. Molécula de ligação ã PCSK9 de acorda cam qualquer uma das reivindicações 1 a 39. em que a molécula de ligação à PCSK9 se liga à PCSK9 na presença de soro.

41. Molécula de ligação ã PCSK9 compreendendo um dominie de ligação à PCSK9, em que a sequência de aminoácido do dominio de ligação à PCSK9 ê pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminaàcido de uma dobra tipo imunoglobulina de uma fibronectins, um receptor de citocina ou uma caderina, e em que a sequência de aminoácido do domínio da ligação à PCSK9 é alterada, com ralação à sequência de aminoácido da dobra tipo imunoglobulina, de modo que o domínio de ligação á PCSK9 se liga especificamente à PCSK9,

42. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 41. em que o domínio de ligação à PGSK9 se liga à PCSK9 com uma Kq igual a ou menor do que 10 nM.

43. Molécula de ligação à PCSK9 de acorda com a reivindicação 41, em que o domínio de ligação à PCSK9 se liga à PCSK9 com uma Ka igual a õu menor do quo 1 nM.

44. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação 41₁ em que a dobra tipo Ig é uma dobra tipo lg de uma fibronectins.

45. Molécula de ligação á PCSK9 de acordo com a reivindicação

5 44, em que a dobra tipo IgG é uma dobra tipo IgG de fibronectina tipo III.

46. Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação á PCSK9 como definida em qualquer uma das reivindicações 1-45.

47 Método de aumento dos níveis de LDL-R em um hepalòdto, o método compreendendo contato do hepatócito com uma molécula de iigação 10 é PCSK9.

48. Método de aumento da absorção de LDL-c por um hepatócito. o método compreendendo contato do hepatócito com uma molécula de ligação á PCSK9, deste modo reduzindo a suh-regulagem de LDL-R por PCSK9 e aumentando a absorção de LDL-c pelo hepatócito.

18 49. Peptideo consistindo em uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a uma das sequências de aminoácido que seguem. YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4);

TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NQ;5): ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6):

20 AGWSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NQ:7);

VQPVGPL (SEQ ID NO:8):

VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9);

IÍGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO: 10); EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO; 11);

25 ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NQ: 12);

TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO:13);

CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO: 14);

HVLTGCSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO: 15);

PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO: 16);

30 SALPGTSHVL (SEQ ID NO: 17);

RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO: 18);

SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2); ou GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3).

50. Método de modulação de atividade de PCSK9 em um indivíduo. o método compreendendo administrar ao indivíduo uma molécula de ligação â PCSK9 que moduía uma atividade biológica da PGSK9, em que a

5 molécula de ligação à PCSK9 exibe uma ou mais das atividades que seguem:

(a) Inibição da ligação de PCSK9 a uma LDL-R.

(b) inibição da atividade proteolítica da PCSK9, (o) inibição da diminuição dependente de PCSK9 de LDL-R em 10 um hepatòcíto, e (d) inibição de degradação dependente de PQSK9 de LDL-R em células hepátioas.

51. Método de redução do colesterol no plasma em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo a composição como defi-

15 nído na reivindicação 46 em uma quantidade eficaz para reduzir oclesteroí no plasma no indivíduo.

52. Método de acordo com a reivindicação 51. em que a quantidade é eficaz para reduzir LDL-e.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que a concern

20 tração do indivíduo de LCL~e no plasma é reduzida em pelo menos 5%, com relação à LDL-o no plasma antes da administração da composição..

54. Método de acordo com a reivindicação 51. em que o indivíduo está também recebendo terapia com um segundo agente de redução de colesterol.

25 55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o segundo agente de redução de colesterol é uma estatína.

56. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o indivíduo tem, ou estã sob risco de, um distúrbio de lípidec.

57.. Método de acordo com a reivindicação 56, em que o indivíduo

30 é hipercolesterolêmíco ou estâ sob risco de hipercolesterolemía.

58. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o indivíduo tem, ou está sob risco de, aterosclerose.

59. Método de acordo com a reivindicação 51 , em que o indivíduo tem, ou está sob risco de, um distúrbio cardiovascular.

60. Método de acordo com a reivindicação 51 < em que o indivíduo è intolerante à estatina.

5 61, Método de acordo com a reivindicação 51. em que o indivíduo è resistente à terapia com estatina.

62. Método de acordo com a reivindicação 51, em que, antes da administração da composição, o nível de colesterol no plasma total do indivíduo é 200 mg/dl ou mais.

10 S3. Método de acordo com a reivindicação 51, em que antes da administração da composição, o nível de LDL-c no plasma do indivíduo è 160 mg/dl ou mais.

64, Método de acordo com a reivindicação 51, em que a composição é administrada íntravenosamente.

15 85, Molécula de ligação à PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo que se hga especiflcamente a uma PCSK9, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do prõ-domínio de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo a um dos que seguem:
26 (a) aminoácidos 101-107 da SEQ ID NO: 1; ou (b) aminoácidos 123-132 da SEQ ID NO: 1.

66. Molécula de ligação à PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 65, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do pró-domínio de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo aos amínc-

25 ácidos 101-107 da SEQ ID ΝΟ.Ί.

67. Molécula de ligação à PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 65, em que a porção de ligação de antígeno se liga a um epitopo dentro do prô-dominio de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo aos aminoácidos 123-132 da SEQ ID NO1.
30 88, Molécula de ligação à PCSK9 isolada que compete com cruzamento para ligação â PCSK9 com uma molécula de ligação à PCSK9 que se liga a um epitopo dentro do pró-ctomínia de PCSK9 humana dentro ou sobrepondo a um dos qua seguem:

(a) aminoácidos 101-107 da SEQ ID NO: 1; ou (b) aminoácidos 123-132 da SEQ ID NO: 1.

69. Molécula de ligação à CPSK9 de acordo com qualquer uma 5 das reivindicações 65-67. em que a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo não-línear.

70.. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com a reivindicação

69, em que a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo não-linear compreendendo todos ou pelo menos uma porção de cada um dos epitopos 10 que seguem:

(a) aminoácidos 101-107 da SEQ ID NO:1; e (b) aminoácidos 123-132 da SEQ ID NO.1.

71. Molécula de ligação à PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo que se liga especificamente

15 a uma PCSK9, em que a porção de ligação de antigeno se liga dentro dos aminoácidos 101-132 da SEQ ID NO;1.

72, Molécula de ligação á PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 71, em que a porção de ligação de antigeno se liga dentro dos aminoácidos 101-132 da SEQ ID NO:1 e compreende pelo menos um ami-

20 noácido da SEQ ID NO:2 e pelo menos um aminoácido da SEQ ID NQ:3,

73, Molécula de ligação à PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo que se liga especifícamente a uma PCSK9, em que a porção de ligação de antigeno se liga a um epítopo que sobrepõe a pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO:.2 e a pelo menos

25 um aminoácido da SEQ ID NQ:3.

74. Molécula de ligação à PCSK9 isolada compreendendo uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo que se liga especifícamente a uma PGSK9, em que a porção de ligação de antigeno se liga a um epitopo selecionado do grupo consistindo em um epítopo dentro da SEQ ID NO.2.

30 um epitopo dentro da SEQ ID NQ:3 ou um epitopo que sobrepõe a pelo menos um aminoácido da SEQ ID NO:2 e a pelo menos um aminoácido da SEQ ÍD NO:3.

75, Molécula de ligação à PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 73 ou 74, em que o aminoácido da SEQ ID NO:2 é glutamina.

76, Molécula de ligação à PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 73 ou 74, em que a porção de ligação de antigeno sobrepõe a

5 pelo menos dois aminoácidos da SEQ ID NO:3,

7'7, Molécula de ligação à PCSK9 isolada de acordo com a reivindicação 76, em que os aminoácidos são gliolna e tirosina,

78, Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-67 e 69-77, em que o anticorpo è um anticorpo huma-

10 no, humanizado, humanizado ou químérico,

79. Molécula de ligação ã PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-67 e 69-7'7, em que a porção de ligação de antigeno é uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo monoclonal ou policional,

15 80. Molécula de iigação á PCSK9 de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-77, em que a molécula de ligação à CPSK9 compreende um fragmento Fab, um Fv de cadeia única, um fragmento Fab‘, um F(ab% um diacorpo ou um fragmento Fv do anticorpo.

81. Molécula de ligação à PCSK9 de acordo com qualquer uma

20 das reivindicações 65-67 e 69-77, em que a porção de ligação de antigeno é derivada de um anticorpo de um dos isotlpos que seguem: IgGl lgG2, lgG3 ou lgG4,

82, Uso de uma molécula de ligação à PCSK9 de qualquer uma das reivindicações anteriores para preparar um medicamento para o trata-

25 mento de doença associada com niveis de coíesterol altos.