JP2013509591A - Pcsk9イムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
a)生体試料収集装置、
b)コーティングもしくは捕捉抗体および検出抗体を含む、イムノアッセイを構成する組成物、および
c)試料中のPCSK9抗原とイムノアッセイにおける抗体との間の反応を検出するための手段
を含む。
a)生体試料収集装置、
b)コーティングもしくは捕捉抗体および検出抗体を含む、イムノアッセイを構成する組成物、および
c)試料中のPCSK9抗原とイムノアッセイにおける抗体との間の反応を検出するための手段
を含む、生体試料中の循環PCSK9レベルを測定するためのキットに関し、この際、コーティングもしくは捕捉抗体は、AX213であり、検出抗体は、AX1である。
BSA:ウシ血清アルブミン
ddH2O 二重蒸留水
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
IPTG:イソプロピル−β−d−チオガラクトピラノシド
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PBSTまたはPBS−T:Tweenを含有するリン酸緩衝生理食塩水
TBS−T:Tweenを含有するトリス緩衝生理食塩水
このアッセイで使用されるPCSK9アンタゴニストは、抗体AX213およびAX1である。AX213およびAX1は、2009年10月30日出願の、同時係属出願第61/256,732号および同第61/256,720号に開示され、これらはその全文が本明細書に援用される。
AX213
AX213全長軽鎖タンパク質[配列番号1]
AX213全長軽鎖核酸[配列番号2]
AX213−VL[配列番号3]、CDRに下線
AX213−VL[配列番号4]
AX213 FD鎖(Fab用)タンパク質[配列番号5]
AX213 FD鎖(Fab用)核酸[配列番号6]
AX213−VH[配列番号7]、CDRに下線
AX213−VH[配列番号8]
AX213 IGG2重鎖タンパク質[配列番号9]
AX213 IGG2重鎖核酸[配列番号10]
AX213全長軽鎖タンパク質[配列番号11]
IGG2核酸と対になったAX213 IGG軽鎖[配列番号12]
AX1
AX1全長軽鎖タンパク質[配列番号13]
AX1全長軽鎖核酸[配列番号14]
AX1−VL[配列番号15]、CDRに下線
AX1−VL[配列番号16]
AX1 FD鎖(Fab用)タンパク質[配列番号17]
AX1 FD鎖(Fab用)核酸[配列番号18]
AX1−VH[配列番号19]、CDRに下線
AX1−VH[配列番号20]
AX1 IGG2重鎖タンパク質[配列番号21]
AX1 IGG2重鎖核酸[配列番号22]
AX1全長軽鎖タンパク質[配列番号23]
IGG2核酸と対になったAX1 IGG軽鎖[配列番号24]
TG1細胞からのFabタンパク質の発現および精製:2YT/2%グルコース/カルベニシリン100μg/ml中の個々のクローンに対して50mlの一晩培養物を、37℃シェーカーインキュベーターで増殖させた。第2日目、750mL〜1Lの2YT/0.1%グルコース/100ug/mLカルベニシリンを、5〜10mlの一晩培養物を移すことによって各々のクローンに接種した。培養物を、30℃にて振盪しながら約3〜4時間、OD600が約1となるまで増殖させた。終濃度が0.1〜0.5mMに達するようにIPTGを培養物に添加した。22℃で一晩IPTG誘導した後、細胞ペレットを、10,000rpmで10〜15分間の遠心分離により収集して、周辺質調製に進んだ。
このアッセイは、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ(DELFIA)時間分解蛍光測定(TRF)法を用いる。DELFIA TRFアッセイは、長い蛍光減衰時間および大きいストークスシフトを可能にするランタニドキレート標識の蛍光特性に依存する。図1A〜Bを参照されたい。長い蛍光減衰時間は、バックグラウンド蛍光が鎮まった後に使用者が蛍光を測定することを可能にし、通常試料に伴うバックグラウンド発光を効果的に低減させる。その上、このアッセイは長いストークスシフト(360nM励起/620nM発光)を有し、ピークおよびピークショルダーに干渉することなく、クリーンなピーク蛍光検出を可能にする。DELFIA TRFのこれらの特徴は、バックグラウンド発光を、測定感度の増加を可能にするレベルまで効果的に低減する。
供給元:マイクロプレート接着膜(USA Scientificカタログ番号2920−0000);1.5mLマイクロチューブ(エッペンドルフ、カタログ番号022363204);黒色高結合アッセイプレート(Costar3295番);ピペット用チップ;血漿収集のためのEDTAバキュテイナチューブ(BD、カタログ番号366643)
試薬:(1)DELFIA成分(パーキンエルマー)[ストレプトアビジン/ユウロピウム(100μg/mL)、4℃にて貯蔵(カタログ番号1244−360);DELFIAアッセイバッファー、4℃にて貯蔵(カタログ番号1244−111);DELFIAエンハンス、4℃にて貯蔵(カタログ番号1244−105)]、(2)抗体[AX213(ヒトPCSK9に対するモノクローナルAb)捕捉抗体、4℃にて貯蔵、およびAX1(ヒトPCSK9に対するモノクローナルAb)ビオチン化二次抗体、4℃にて貯蔵]、(3)ヘテロ親和性ブロッキング試薬1(HBR1、精製)、Scantibodies Laboratory、カタログ番号3KC533約20mg/mL、(4)10%Tween−20室温貯蔵(バイオ・ラッド、カタログ番号161−0781)、(5)MSDブロッカーA:4℃にて貯蔵(メソスケールディスカバリー、カタログ番号R93AA−1)、(6)TBS−T洗浄バッファー(シグマ、カタログ番号T−9039)[1包を1リットルMilli−Q等級の水に混合、終濃度:1000mL中50mMトリス緩衝生理食塩水、0.05%Tween−20、室温貯蔵]、(7)1Xリン酸緩衝生理食塩水溶液(Fluka、カタログ番号79383)[5.0mL 10X PBSを45mLのMilli−Q等級の水に希釈、終濃度:1X]、(8)コーティング溶液[使用直前に次の通り調製:5.00μLのAX213(ストック=10.05mg/mL)を5995μlの1X PBSに入れる、コート溶液は8.375μg/mL AX213]、(9)ブロッキング溶液[実験当日に次の通り調製:900mgのMSDブロッカーA(BSA)を30.0mLのTBS−T洗浄バッファーに入れる、終濃度:3%]、(10)アッセイバッファー(AB)[実験当日に下の表1中の通り調製]:
Claims (21)
- 生体試料中の循環PCSK9レベルを測定する方法であって、被験体から入手した生体試料でイムノアッセイを実施する段階、および前記試料中のPCSK9のレベルを既知濃度のPCSK9を有する標準物質と比較する段階を含み、コーティングもしくは捕捉抗体がAX213であり、検出抗体がAX1である、方法。
- AX213およびAX1が全長抗体である、請求項1に記載の方法。
- AX213が、配列番号3を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号7を含む重鎖可変(「VH」)配列を含み、かつ、AX1が、配列番号15を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号19を含む重鎖可変(「VH」)配列を含む、請求項1に記載の方法。
- AX213が、配列番号1または配列番号11を含む軽鎖と、配列番号9を含む重鎖を含み、AX1が、(a)配列番号13または配列番号23を含む軽鎖と(b)配列番号21を含む重鎖を含む、請求項1に記載の方法。
- イムノアッセイを実施する段階が、(a)固定化された抗PCSK9抗体AX213を有する支持体に、生体試料を付着させること、(b)その上に該生体試料を付着させた該支持体と、検出可能な標識を有する抗PCSK9抗体AX1を接触させること、および(c)該標識を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 該イムノアッセイが固相イムノアッセイである、請求項1に記載の方法。
- 該固相イムノアッセイが、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ(DELFIA)である、請求項6に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該血液、血漿または血清がヒト由来である、請求項8に記載の方法。
- 推定PCSK9アンタゴニストと接触させた生体試料でイムノアッセイを実施する方法であって、(a)固定化された抗PCSK9抗体AX213を有する支持体に該生体試料を付着させる段階、(b)その上に該生体試料を付着させた該支持体と、検出可能な標識を有する抗PCSK9抗体AX1を接触させる段階、(c)該標識を検出する段階、および(d)前記試料中のPCSK9の該レベルを既知濃度のPCSK9を有する標準物質と比較する段階を含む、方法。
- AX213およびAX1が全長抗体である、請求項10に記載の方法。
- AX213が、配列番号3を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号7を含む重鎖可変(「VH」)配列を含み、AX1が、配列番号15を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号19を含む重鎖可変(「VH」)配列を含む、請求項10に記載の方法。
- AX213が、配列番号1または配列番号11を含む軽鎖と、配列番号9を含む重鎖を含み、AX1が、(a)配列番号13または配列番号23を含む軽鎖および(b)配列番号21を含む重鎖を含む、請求項10に記載の方法。
- 該イムノアッセイが固相イムノアッセイである、請求項10に記載の方法。
- 該固相イムノアッセイが、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ(DELFIA)である、請求項14に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 該血液、血漿または血清がヒト由来である、請求項16に記載の方法。
- 生体試料中の循環PCSK9レベルを測定するためのキットであって、
a)生体試料収集装置と、
b)コーティングもしくは捕捉抗体および検出抗体を含む、イムノアッセイを構成する組成物と、
c)該試料中のPCSK9抗原と該イムノアッセイにおける抗体との間の反応を検出するための手段とを含み、
該コーティングもしくは捕捉抗体がAX213であり、該検出抗体がAX1である、キット。 - AX213およびAX1が全長抗体である、請求項18に記載のキット。
- AX213が、配列番号3を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号7を含む重鎖可変(「VH」)配列を含み、AX1が、配列番号15を含む軽鎖可変(「VL」)配列と、配列番号19を含む重鎖可変(「VH」)配列を含む、請求項19に記載の方法。
- AX213が、配列番号1または配列番号11を含む軽鎖と、配列番号9を含む重鎖を含み、AX1が、(a)配列番号13または配列番号23を含む軽鎖および(b)配列番号21を含む重鎖を含む、請求項20に記載の方法。
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