JPWO2020179224A1 - Ａｐｐ６６９−７１１の測定方法、及び測定用キット - Google Patents

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Abstract

APP669-711のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化する固定化工程と；前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程と；前記試料中のAPP669-711を固定化された前記第１の抗体と接触させ、APP669-711を前記第１の抗体に結合させる第１反応工程と；結合していない前記試料を除去する試料の除去工程と；固定化された前記第１の抗体に結合したAPP669-711にAPP669-711のＣ末端に免疫特異的に結合する第２の抗体を接触させ、前記第２の抗体をAPP669-711に結合させる第２反応工程と；結合していない前記第２の抗体を除去する第２抗体の除去工程と；APP669-711に結合した前記第２の抗体の存在を検出する検出工程と；を含むAPP669-711の測定方法。

Description

本発明は、ＡＰＰ６６９−７１１の測定方法、及び測定用キットに関する。
アルツハイマー病（Alzheimer's disease；ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０−６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０４０年には８１００万人に達すると推定される。アルツハイマー病の発症にはＡβが深く関わっていると考えられている。Ａβは、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される。Ａβの線維化を伴う凝集により老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、極度の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０mer（Ａβ１−４０）と４２mer（Ａβ１−４２）からなることが古くから知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ移行することもわかっている。また、血液中へも移行する可能性も示唆されている。さらに近年では、Ａβ１−４０とＡβ１−４２とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦ中にも存在することが知られている。
Ａβについては、最近の研究で、本発明者らによって、Ａβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）の一つであるＡＰＰ６６９−７１１とＡβ１−４２との比が血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１，特許文献１：国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８）。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を行うことにより定量されている。
さらに、本発明者らによって、特許文献２：国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９には、Ａβ及びＡβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）についての３つの比、Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群より選ばれる２以上の比を数学的手法で組み合わせた数値が血液バイオマーカーとして有望であることが開示されている。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を行うことにより定量されている。
このように、本発明者らによって、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いて、Ａβ関連ペプチドの一つであるＡＰＰ６６９−７１１とＡβ１−４２との比が血液バイオマーカー候補として有望であることが発見された。そして、その比ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２と、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２の比とを組み合わせたcomposite biomarkerは脳内アミロイド蓄積を高精度に推定できることを日本とオーストラリアの多検体で示し、信頼性と汎用性のあるバイオマーカーであることが、本発明者らによって報告されている（非特許文献２）。
ＡＰＰ６６９−７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）は有用である。一方、その他の分析技術として、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、有用な分析技術となり得る。
現在、血漿中のＡβ１−４０やＡβ１−４２を分析可能なＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、各メーカー（和光純薬、ＩＢＬ等）から市販されている。
図１は、Ａβ１−４０のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。図１を参照して、Ａβ１−４０のＮ末端は、マイクロプレート上に固相化されたＡβ１−４０のＮ末端を特異的に認識する抗体に捕捉されており、Ａβ１−４０のＣ末端には、Ａβ１−４０のＣ末端を特異的に認識する検出抗体が結合している。検出抗体を検出することにより、Ａβ１−４０が測定される。
図２は、Ａβ１−４２のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。図２を参照して、Ａβ１−４２のＮ末端は、マイクロプレート上に固相化されたＡβ１−４２のＮ末端を特異的に認識する抗体に捕捉されており、Ａβ１−４２のＣ末端には、Ａβ１−４２のＣ末端を特異的に認識する検出抗体が結合している。検出抗体を検出することにより、Ａβ１−４２が測定される。
特許文献３：特開２００５−１７０９５１号公報では、アミロイドβのＮ端部（Ａβ１−１６）を認識するモノクローナル抗体BAN-52aおよびBAN-50aや、アミロイドβのＣ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体BA-27a、BS-85およびBC-05aが開示されており、Ａβ１−４０やＡβ１−４２に特異的なサンドイッチＥＩＡが開示されている。
特許文献４：特開２０１４−２０８６７８号公報では、Ａβ１１−ｘを特異的に認識する抗体が開示され、Ａβ１１−４０に対するサンドイッチＥＬＩＳＡや、Ａβ１１−ｘに対するウェスタンブロットが開示されている。
しかし、ＡＰＰ６６９−ｘを免疫学的測定方法で分析する手段は知られていない。
国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８ 国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９ 特開２００５−１７０９５１号公報 特開２０１４−２０８６７８号公報
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014; 90(9): 353-364. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018; 554 (7691): 249-254.
ペプチド特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを構築するためには、それぞれＮ末端とＣ末端を特異的に認識する抗体が必要となる。ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端はＡβ１−４０（すなわち、ＡＰＰ６７２−７１１）のＣ末端と同じであり、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を特異的に認識する抗体は存在する。しかし、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識する抗体は存在しない。
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体が存在しないため、ＡＰＰ６６９−７１１を特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡ法で分析する手段がない。
そこで、本発明の目的は、アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体、及びＣ末端を認識する抗体を用意し、ＡＰＰ６６９−７１１を特異的に定量する測定方法［特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）］を提供することにある。また、本発明の目的は、ＡＰＰ６６９−７１１測定用キット［特に、サンドイッチＥＬＩＳＡキット］を提供することにある。
本発明者は、鋭意検討の結果、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）結合合成ペプチドVKMCをマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。この抗体を用いてＡＰＰ６６９−７１１を特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。これにより、ＡＰＰ６６９−７１１のＥＬＩＳＡキットを構成した。
本発明は、まず、新規な抗体である、ＡＰＰ６６９−７１１ペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体に基づいている。
本発明の第１の態様は、試料中のＡＰＰ６６９−７１１を測定する方法であって、
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化する固定化工程と、
前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程と、
前記試料中のＡＰＰ６６９−７１１を固定化された前記第１の抗体と接触させ、ＡＰＰ６６９−７１１を前記第１の抗体に結合させる第１反応工程と、
結合していない前記試料を除去する試料の除去工程と、
固定化された前記第１の抗体に結合したＡＰＰ６６９−７１１にＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端に免疫特異的に結合する第２の抗体を接触させ、前記第２の抗体をＡＰＰ６６９−７１１に結合させる第２反応工程と、
結合していない前記第２の抗体を除去する第２抗体の除去工程と、
ＡＰＰ６６９−７１１に結合した前記第２の抗体の存在を検出する検出工程と、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定方法に関する。
本発明の第２の態様は、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）、及び
ブロッキング剤、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定用キットに関する。
本発明によれば、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識する抗体を用いて、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ免疫測定法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法が提供される。
本発明によれば、また、ＡＰＰ６６９−７１１の測定用キット、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための試薬キットが提供される。ＡＰＰ６６９−７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）は有用であるが、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、さらに有用な分析技術と言える。
図１は、Ａβ１−４０のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。 図２は、Ａβ１−４２のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。 図３は、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。 図４は、実験例１−２において、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図５は、実験例１−２において、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図６は、実験例１−２において、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図７は、実施例１において、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の固相化工程において、捕捉抗体溶液の濃度を変化させた場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフである。横軸は、ＡＰＰ６６９−７１１標準液の濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。 図８は、実施例２において、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の固相化工程において、捕捉抗体溶液のｐＨを９．６、又は７．４とした場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はＡＰＰ６６９−７１１標準液の濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。 図９は、実施例３において、ＡＰＰ６６９−７１１についての結果であり、サンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度を０，１０，３０，１００，３００，１０００，又は３０００ｎｇ／ｍＬとした場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はサンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。 図１０は、実施例３において、Ａβ１−４０についての結果であり、サンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度を０，３０００ｎｇ／ｍＬとした場合のＡβ１−４０ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はサンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
［１．ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体］
本発明において用いられるＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）は、ＡＰＰ６６９−７１１ペプチドのＮ末端を免疫特異的に認識するものである。
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ結合合成ペプチドVKMC（配列番号５）をマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。より詳細な抗体作成は、実施例で述べられる。
この抗体は、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を認識する抗体であるので、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）を含むＡＰＰ６６９−ｘに属する種々のペプチドのＮ末端を特異的に認識することができる。このＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−７１１と前記ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを免疫反応させることができる。
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２−７１１とＡβ１−４０とは同じペプチドを表す（配列番号１）。ＡＰＰ６７２−７１３とＡβ１−４２とは同じペプチドを表す（配列番号２）。ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）は、ＡＰＰ６６９−ｘに属するものであり、ここで、ｘは、下限については６６９よりも大きく、例えば６７７よりも大きく、また、上限については、特に限定されることはなく、７７０またはそれよりも小さい。しかしながら、本発明の趣旨、すなわち、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体が、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識することができ、免疫反応させることができるということからすれば、ｘの上限値は特に限定されることはない。例示すれば、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドには、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）、ＡＰＰ６６９−７０９、ＡＰＰ６６９−７１０、ＡＰＰ６６９−７１３などが挙げられる。
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＫＬＨ結合合成ペプチド（配列番号５）：
VKMC
［２．免疫測定法］
本発明の第１の態様は、試料中のＡＰＰ６６９−７１１を測定する方法であって、
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化する固定化工程と、
前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程と、
前記試料中のＡＰＰ６６９−７１１を固定化された前記第１の抗体と接触させ、ＡＰＰ６６９−７１１を前記第１の抗体に結合させる第１反応工程と、
結合していない前記試料を除去する試料の除去工程と、
固定化された前記第１の抗体に結合したＡＰＰ６６９−７１１にＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端に免疫特異的に結合する第２の抗体を接触させ、前記第２の抗体をＡＰＰ６６９−７１１に結合させる第２反応工程と、
結合していない前記第２の抗体を除去する第２抗体の除去工程と、
ＡＰＰ６６９−７１１に結合した前記第２の抗体の存在を検出する検出工程と、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定方法に関する。
本発明の態様のサンドイッチ型免疫測定法においては、前記ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）を用いることができる。
図３は、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を模式的に表す図である。図３を参照して、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端は、マイクロプレート上に固相化されたＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識する抗体（第１の抗体）に捕捉されており、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端には、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を特異的に認識する検出抗体（第２の抗体）が結合している。検出抗体を検出することにより、ＡＰＰ６６９−７１１が測定される。
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端は、Ａβ１−４０のＣ末端と同じであり、このようなＣ末端を認識可能な抗体（第２の抗体）は市販されている。
前記サンドイッチ型免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）等が挙げられる。
前記サンドイッチ型免疫測定法において、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化（固相化）する固定化工程を行う。
前記固定化工程においては、通常の手法に従い、前記第１の抗体を含む第１抗体溶液を支持体表面に接触させて、第１の抗体を支持体に固相化するとよい。
前記第１抗体溶液中の前記第１の抗体の濃度は、特に限定されないが、例えば、２．５〜２５μｇ／ｍＬ、あるいは５〜２０μｇ／ｍＬとするとよい。また、前記第１抗体溶液のｐＨは、例えば７〜１０付近の中性又は弱アルカリ性とするとよい。例えば、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、又はリン酸バッファー緩衝液（ｐＨ７．４）を用いることができる。
固定化に用いた第１抗体溶液を支持体から除去して、適宜洗浄するとよい。固定化のための温度、時間などは通常の手法に従うとよい。
前記固定化工程の後に、前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程を行う。ブロッキングは、支持体表面への目的ペプチドの非特異的結合を低減するために行う。
前記ブロッキング工程において、前記第１の抗体が固定化された支持体表面に、前記ブロッキング剤を含むブロッキング溶液を接触させて、支持体表面に前記ブロッキング剤を吸着させるとよい。
前記ブロッキング工程において、通常用いられるブロッキング剤を用いることができる。前記ブロッキング剤としては、例えば、牛血清タンパク質、乳タンパク質などが挙げられる。これらのうち、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定法においては、乳タンパク質が好ましい。
前記ブロッキング溶液中における前記乳タンパク質の濃度は、特に限定されないが、例えば、２ｍｇ／ｍＬ以上、あるいは２．５〜１０ｍｇ／ｍＬとするとよい。１０ｍｇ／ｍＬを超える濃度、例えば、１５ｍｇ／ｍＬ、又は２０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度としてもよい。
ブロッキングに用いたブロッキング溶液を支持体から除去して、適宜洗浄するとよい。ブロッキングのための温度、時間などは通常の手法に従うとよい。
前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記第１反応工程の前に、前記試料に乳タンパク質を添加する乳タンパク質の添加工程を行ってもよい。試料中に乳タンパク質を添加しておくことにより、支持体表面への目的ペプチドの非特異的結合を低減させることができ、ブロッキング工程の補助的役割を担い得る。
前記乳タンパク質添加工程において、前記試料を、前記乳タンパク質を２ｍｇ／ｍＬ以上、あるいは２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいる希釈液で希釈するとよい。４ｍｇ／ｍＬを超える濃度、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ、又は２０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度としてもよい。希釈率については、検量線を作成するための標準物質の希釈であれば吸光度などの測定データと標準物質濃度との関係を直線または曲線で表せる希釈率を使用し、生体試料の場合は吸光度などの測定データが検量線の範囲内に収まる希釈率を使用してもよい。
さらに、前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記第１反応工程の前に、さらに、前記試料にＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を添加する抗原親和性物質の添加工程を行ってもよい。
この場合、前記試料への乳タンパク質の添加工程と、前記試料への前記抗原親和性物質を添加工程の順序はいずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。
試料に標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を添加することにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドをより高感度で検出及び定量できる。
前記抗原親和性物質は、標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１に親和性を有し結合可能な物質であればよく、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマー等が挙げられる。ここでの結合とは、静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、双極子相互作用、分散力などの分子間相互作用による結合が含まれる。標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１のコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられるものであればよい。
前記抗原親和性物質としての抗体としては、前記第１の抗体及び前記第２の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ抗体を用いるとよい。
前記抗原親和性物質としてのペプチドとしては、２〜１２アミノ酸残基からなるペプチドを用いるとよく、例えば、Ａβに結合するペプチドであれば、ｉＡβ５（５アミノ酸）、Ｄ３（１２アミノ酸）、NH2-D-Trp-Aib-OH（２アミノ酸）等が例示される。
前記抗原親和性物質としての低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物を用いるとよく、例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。Ａβに結合する低分子化合物であれば、Scyllo-inositol等が例示される。各種の阻害剤（例えば、Stemolecule TM 低分子化合物の各種）も挙げられる。
前記抗原親和性物質としての核酸アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等が挙げられる。
前記抗原親和性物質の添加量は、試料中の標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１の量、及び抗原親和性物質の種類にもより、特に限定されることはなく、標的ポリペプチドに結合して該標的ポリペプチドのコンフォメーションを変化させられる量とすればよい。例えば、前記抗原親和性物質の添加量は、標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１を含んでいる試料中の濃度として、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬ程度とするとよい。
この場合には、前記抗原親和性物質が、標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものが好ましい。標的ポリペプチドに対して、前記抗原親和性物質と前記第１の抗体との競合や阻害が起こることは好ましくないし、前記抗原親和性物質と前記第２の抗体との競合や阻害が起こることも好ましくない。
より具体的には、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。さらに、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端から６残基部位からＣ末端から６残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。
標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、前記第１の抗体としての標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
本発明のサンドイッチ型免疫測定法では、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などにも適用できる。
本発明のサンドイッチ型免疫測定法の基本的操作は、試料に抗原親和性物質を添加する場合も、公知の操作に従って行なうことができる。
本発明において、標的ＡＰＰ６６９−７１１ペプチドは生体試料に含まれる。生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
［３．免疫測定用キット］
本発明の第２の態様は、ＡＰＰ６６９−７１１の測定用キットであって、
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）、及び
ブロッキング剤、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定用キットに関する。
測定用キットは、さらに、ＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を含んでもよい。また、前記ブロッキング剤が乳タンパク質であることが好ましい。
また、キットには、サンドイッチ型免疫測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。
［実験例１：ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の作成］
［実験例１−１：モノクローナル抗体の作成］
合成ペプチドVKMC（配列番号４）のＣ末端のCysを、二価反応性試薬を用いてキャリアタンパク質（ＫＬＨ）に結合させた。
このＫＬＨ結合合成ペプチドをFCA（フロインドコンプリートアジュバンド）と注射筒を用いて混和して乳化させ、BALB/cマウス１匹に対して２００μｇを尾根部筋肉内に注射（免疫）した。さらに抗原をFICA（フロインドインコンプリートアジュバンド）を混和して乳化させ、二週間間隔で２回、マウス１匹に対して５０μｇを皮下に注射（追加免疫）した。その後、マウス１匹に対して１００μｇを腹腔に最終免疫した。
最終免疫より３日後に脾臓を採取し、リンパ球を分離した後、−８０℃で凍結保存した。また、マウスより全採血を実施し、血液から血清を分離後、−４０℃で凍結保存した。
得られたリンパ球とマウスミエローマを５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を実施した。融合細胞を９６ウェルマイクロプレート８枚に分注して培養した。細胞融合から８日後、９６ウェルマイクロウェルプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングした。その後、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性クローンのハイブリドーマを凍結保存した。
取得したハイブリドーマ（クローン20-1A, 24-6G, 34-6E）は高密度無血清培養を行った。その培養上清からProtein Aを用いて抗体を精製した。
［実験例１−２：直接ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体の特異性の確認］
ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eの特異性を直接ＥＬＩＳＡで評価した。直接ＥＬＩＳＡは以下のように行った。
合成ペプチドＡＰＰ６６９−７１１（ペプチド研）、Ａβ１−４０（ペプチド研）、又はＡＰＰ６６８−６７７（配列番号４）（東レリサーチセンター）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５０，又は５００ｐｍｏｌ／ｍＬの各濃度に希釈した。合成ペプチドの配列は表１に示す。各合成ペプチド溶液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、２時間インキュベーションすることで固相化した。また、ブランクウェルも用意した。プレート中の溶液を除去し、４倍希釈ブロックエース（ＤＳファーマ）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ（0.05% Tween20 in PBS）３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間インキュベートした。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで４０００倍希釈したＨＲＰ標識−抗マウスIgG抗体（ZYMED）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
これらの結果を図４〜６に示す。すなわち、図４は、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図５は、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図６は、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図４〜６において、横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
図４〜６より、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の全てのクローン20-1A, 24-6G, 34-6Eで、ＡＰＰ６６９−７１１に反応することを確認した。一方、Ａβ１−４０やＡＰＰ６６８−６７７には全く反応性が確認されなかった。ＡＰＰ６６９−７１１はＮ末端側３アミノ酸がＡβ１−４０よりも長いだけで他のアミノ酸配列はＡβ１−４０と同じであるが、Ａβ１−４０には反応を示さなかったことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端側３アミノ酸を認識することを示している。また、ＡＰＰ６６８−６７７はＡＰＰ６６９−７１１よりもＮ末端側に１アミノ酸だけ長いだけだが、クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eは反応しなくなった。このことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識していることを示している。
以上の結果により、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の３種類のクローンは、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識していることを確認できた。
Figure 2020179224
［実施例１：捕捉抗体の濃度検討］
捕捉抗体（第１の抗体）の適切な濃度を決めるために、捕捉抗体溶液の濃度を変化させて支持体表面に固相化（固定化）した場合のＥＬＩＳＡ反応性を評価した。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２．５，５，１０，又は２０μｇ／ｍＬの各濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。プレート中の抗体溶液を除去し、２０％ Blocking One（ナカライテスク）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液を反応液（２００ｎｇ／ｍＬ抗Ａβ抗体クローン4G8を含む５％Blocking One in PBST）で希釈し、種々の濃度のＡＰＰ６６９−７１１標準液を調製した。プレート中の２０％ Blocking Oneを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液をプレートへ５０μLずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｈｕｍａｎ βＡｍｙｌｏｉｄ（１−４０）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（和光純薬）に含まれるＣ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
これらの結果を図７に示す。図７は、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の固相化工程において、捕捉抗体溶液の濃度を変化させた場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はＡＰＰ６６９−７１１標準液の濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）の濃度を２．５μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬに上げると、ＡＰＰ６６９−７１１濃度８０ｆｍｏｌ／ｍＬにおける吸光度は４３％上昇した（図７）。さらに、５μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬに上げた場合では、９％と僅かな上昇であった。このことから、Ｎ末端認識抗体の濃度は５μｇ／ｍＬ以上が好ましい。
［実施例２：捕捉抗体の固相化におけるｐＨの検討］
捕捉抗体溶液のｐＨを９．６、又は７．４として捕捉抗体（第１の抗体）を支持体表面に固相化（固定化）した場合のＥＬＩＳＡ反応性を評価した。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、又はリン酸バッファー緩衝液（ｐＨ７．４）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。プレート中の抗体溶液を除去し、２０％ Blocking One（ナカライテスク）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、又はＡβ１−４０標準液をサンプル希釈液（２００ｎｇ／ｍＬ抗Ａβ抗体クローン4G8を含む５％ Blocking One in PBST）で希釈し、種々の濃度のＡＰＰ６６９−７１１標準液を調製した。プレート中の２０％ Blocking Oneを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液をプレートへ５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｃ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
これらの結果を図８に示す。図８は、ＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体の固相化工程において、捕捉抗体溶液のｐＨを９．６、又は７．４とした場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はＡＰＰ６６９−７１１標準液の濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
Ｎ末端認識抗体を固相化するときの抗体溶液のｐＨは９．６でも７．４でも、吸光度に影響は認められなかった。つまり、抗体溶液が中性でも弱アルカリ性でもＮ末端認識抗体の固相化は可能であることが確認された（図８）。
［実施例３：サンプル希釈液への抗Ａβ抗体添加の効果］
抗原ＡＰＰ６６９−７１１が含まれるサンプルを希釈する希釈液に、抗原親和性物質として抗Ａβ抗体を添加した場合のＥＬＩＳＡ反応性を評価した。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。プレート中の抗体溶液を除去し、２０％ Blocking One（ナカライテスク）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、又はＡβ１−４０標準液をサンプル希釈液（種々の濃度の抗Ａβ抗体クローン4G8を含む５％Blocking One in PBST）で希釈し、種々の抗Ａβ抗体濃度のＡＰＰ６６９−７１１標準液（ＡＰＰ６６９−７１１濃度１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）、又はＡβ１−４０標準液（Ａβ１−４０濃度１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。プレート中の２０％ Blocking Oneを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、又はＡβ１−４０標準液をプレートへ５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液、又はＡβ１−４０標準液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｃ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、８時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
これらの結果を図９及び図１０に示す。図９は、ＡＰＰ６６９−７１１についての結果であり、サンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度を０，１０，３０，１００，３００，１０００，又は３０００ｎｇ／ｍＬとした場合のＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はサンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。図１０は、Ａβ１−４０についての結果であり、サンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度を０，３０００ｎｇ／ｍＬとした場合のＡβ１−４０ ＥＬＩＳＡの反応性を示すグラフであり、横軸はサンプル希釈液中の抗Ａβ抗体クローン4G8の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
サンプル希釈液に抗Ａβ抗体4G8を加えない場合（つまり、０ｎｇ／ｍＬ）に比べて、抗Ａβ抗体4G8を加えた方が吸光度は上昇した（図９）。サンプル希釈液に抗Ａβ抗体4G8を加えた場合の、Ａβ１−４０との交差性を調べたが、交差反応は見られなかったため、ＡＰＰ６６９−７１１特異的であることが確認された（図１０）。以上の結果から、サンプル希釈液への抗Ａβ抗体4G8の添加は、ＡＰＰ６６９−７１１のＥＬＩＳＡ反応性向上に有用であった。
［実施例４：ブロッキング剤の検討］
ブロッキング剤として２種類の試薬、牛血清タンパク質を含むBlocking One（ナカライテスク）、又は乳タンパク質を含むブロックエース（雪印）を用いた場合の血漿サンプル中の干渉物質が測定結果に及ぼす影響を、添加回収試験で調べた。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。プレート中の抗体溶液を除去し、２０％ Blocking One、又は、１０ｍｇ／ｍＬブロックエースを１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液を２種類の各サンプル希釈液（１２０ｎｇ／ｍＬ抗Ａβ抗体クローン4G8を含む５％ Blocking One in PBST、又は、４ｍｇ／ｍＬブロックエース in PBST）でそれぞれ希釈し、検量線のＡＰＰ６６９−７１１標準液を調製した。また、ヒト血漿を２種類の各サンプル希釈液でそれぞれ４倍希釈したサンプル、及び、その血漿サンプルに種々の濃度のＡＰＰ６６９−７１１を添加したサンプルを調整した。プレート中のブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルをプレートへ５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｃ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
血漿にＡＰＰ６６９−７１１を既知濃度添加したときの理論値に対する実測値から、添加回収率を求めた（表２）。その結果、Blocking Oneでは回収率平均は６７％であったのに対して、ブロックエースは９０％であった。このことから、牛血清タンパク質を含むBlocking Oneよりも乳タンパク質を含むブロックエースの方が、血漿中の干渉物質による定量値への影響を抑えることができることがわかった。
Figure 2020179224
［実施例５：ブロッキング工程のブロッキング剤濃度の検討］
ブロッキング工程における、ブロッキング溶液中のブロックエース（雪印）の適した濃度を評価するために、ブロッキング溶液の濃度を変化させて添加回収試験を行った。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。プレート中の抗体溶液を除去し、２．５，５，又は１０ｍｇ／ｍＬのブロックエースを１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液をサンプル希釈液（１２０ｎｇ／ｍＬの抗Ａβ抗体クローン4G8を含む４ｍｇ／ｍＬブロックエース in PBST）で希釈し、検量線のＡＰＰ６６９−７１１標準液を調製した。また、ヒト血漿をサンプル希釈液で４倍希釈したサンプル、及び、その血漿サンプルに種々の濃度のＡＰＰ６６９−７１１を添加したサンプルを調整した。プレート中のブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルをプレートへ５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｃ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
血漿にＡＰＰ６６９−７１１を既知濃度添加したときの理論値に対する実測値から、添加回収率を求めた（表３）。その結果、いずれのブロッキング溶液中のブロックエース濃度においても回収率平均は９０％以上であり、問題なく定量できていることが確認された。
Figure 2020179224
［実施例６：サンプル希釈液のブロッキング剤濃度の検討］
サンプル希釈液中のブロックエース（雪印）の適した濃度を評価するために、サンプル希釈液中のブロックエースの濃度を変化させて添加回収試験を行った。
捕捉抗体としてのＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識抗体（クローン34-6E）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに抗体溶液を５０μＬずつ加え、４℃、６時間インキュベーションすることで、捕捉抗体を固相化した。
プレート中の抗体溶液を除去し、１０ｍｇ／ｍＬのブロックエースを１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ＡＰＰ６６９−７１１標準液をサンプル希釈液（１２０ｎｇ／ｍＬの抗Ａβ抗体クローン4G8を含む１，２，又は４ｍｇ／ｍＬブロックエース in PBST）で希釈し、検量線のＡＰＰ６６９−７１１標準液を調製した。また、ヒト血漿をサンプル希釈液で４倍希釈したサンプル、及び、その血漿サンプルに種々の濃度のＡＰＰ６６９−７１１を添加したサンプルを調整した。プレート中のブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。ＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルをプレートへ５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。プレート中のＡＰＰ６６９−７１１標準液、及び、ヒト血漿サンプルを除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで３回洗浄した。
Ｃ末端を認識するＨＲＰ標識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで５回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での１５分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
血漿にＡＰＰ６６９−７１１を既知濃度添加したときの理論値に対する実測値から、添加回収率を求めた（表４）。その結果、サンプル希釈液中のブロックエースの濃度を下げるほど、回収率平均も下がる傾向だった。
Figure 2020179224
（１）
試料中のＡＰＰ６６９−７１１を測定する方法であって、
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化する固定化工程と、
前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程と、
前記試料中のＡＰＰ６６９−７１１を固定化された前記第１の抗体と接触させ、ＡＰＰ６６９−７１１を前記第１の抗体に結合させる第１反応工程と、
結合していない前記試料を除去する試料の除去工程と、
固定化された前記第１の抗体に結合したＡＰＰ６６９−７１１にＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端に免疫特異的に結合する第２の抗体を接触させ、前記第２の抗体をＡＰＰ６６９−７１１に結合させる第２反応工程と、
結合していない前記第２の抗体を除去する第２抗体の除去工程と、
ＡＰＰ６６９−７１１に結合した前記第２の抗体の存在を検出する検出工程と、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定方法。
（２）
前記ブロッキング工程において、前記ブロッキング剤が乳タンパク質である、上記（１）に記載の方法。
（３）
前記ブロッキング工程において、前記第１の抗体が固定化された支持体に、前記ブロッキング剤を含むブロッキング溶液を接触させる、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）
前記ブロッキング工程において、前記ブロッキング剤が乳タンパク質であり、前記ブロッキング溶液中における前記乳タンパク質の濃度が２．５〜１０ｍｇ／ｍＬである、上記（３）に記載の方法。
（５）
前記第１反応工程の前に、さらに、前記試料に乳タンパク質を添加する乳タンパク質の添加工程を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
前記乳タンパク質添加工程において、前記試料を、前記乳タンパク質を２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいる希釈液で希釈する、上記（５）に記載の方法。
（７）
前記固定化工程において、前記第１の抗体を含む第１抗体溶液を支持体に接触させる、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
前記第１抗体溶液中の前記第１の抗体の濃度が５〜２０μｇ／ｍＬである、上記（７）に記載の方法。
（９）
前記第１抗体溶液のｐＨが中性、又は弱アルカリ性である、上記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）
前記第１反応工程の前に、さらに、前記試料にＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を添加する抗原親和性物質の添加工程を含む、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）
前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）
ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）、及び
ブロッキング剤、
を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定用キット。
（１３）
さらに、ＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を含む、上記（１２）に記載のキット。
（１４）
前記ブロッキング剤が乳タンパク質である、上記（１２）又は（１３）に記載のキット。

Claims (14)

  1. 試料中のＡＰＰ６６９−７１１を測定する方法であって、
    ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端に免疫特異的に結合する第１の抗体を支持体に固定化する固定化工程と、
    前記第１の抗体が固定化された支持体をブロッキング剤でブロッキングするブロッキング工程と、
    前記試料中のＡＰＰ６６９−７１１を固定化された前記第１の抗体と接触させ、ＡＰＰ６６９−７１１を前記第１の抗体に結合させる第１反応工程と、
    結合していない前記試料を除去する試料の除去工程と、
    固定化された前記第１の抗体に結合したＡＰＰ６６９−７１１にＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端に免疫特異的に結合する第２の抗体を接触させ、前記第２の抗体をＡＰＰ６６９−７１１に結合させる第２反応工程と、
    結合していない前記第２の抗体を除去する第２抗体の除去工程と、
    ＡＰＰ６６９−７１１に結合した前記第２の抗体の存在を検出する検出工程と、
    を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定方法。
  2. 前記ブロッキング工程において、前記ブロッキング剤が乳タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ブロッキング工程において、前記第１の抗体が固定化された支持体に、前記ブロッキング剤を含むブロッキング溶液を接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ブロッキング工程において、前記ブロッキング剤が乳タンパク質であり、前記ブロッキング溶液中における前記乳タンパク質の濃度が２．５〜１０ｍｇ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第１反応工程の前に、さらに、前記試料に乳タンパク質を添加する乳タンパク質の添加工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記乳タンパク質添加工程において、前記試料を、前記乳タンパク質を２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいる希釈液で希釈する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記固定化工程において、前記第１の抗体を含む第１抗体溶液を支持体に接触させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第１抗体溶液中の前記第１の抗体の濃度が５〜２０μｇ／ｍＬである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１抗体溶液のｐＨが中性、又は弱アルカリ性である、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記第１反応工程の前に、さらに、前記試料にＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を添加する抗原親和性物質の添加工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−７１１ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、
    ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）、及び
    ブロッキング剤、
    を含むＡＰＰ６６９−７１１の測定用キット。
  13. さらに、ＡＰＰ６６９−７１１に結合可能な抗原親和性物質を含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 前記ブロッキング剤が乳タンパク質である、請求項１２又は１３に記載のキット。
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