KR20040030088A - 길항성 항-ｈＴＮＦＳＦ13ｂ 인간 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TNFSF13b 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 hTNFSF13b에 대해 높은 친화성 (예컨대, KD= 10-8M 이하), TNFSF13b 해리에 대한 늦은 해리 속도 (예컨대, Koff= 10-3s-1이하)를 가지고, TNFSF13b 활성을시험관내및생체내중화시킨다. 본 발명의 항체는 hTNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 인간 대상에서 TNFSF13b 활성 억제를 위한 일 실시양태에서 유용하다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 뿐만 아니라, 이들을 발현시키기 위한 벡터 및 숙주 세포도 본 발명에 속한다.
Description
증식, 세포독성, 항-바이러스 활성, 면역조절 활성, 및 수개의 유전자의 전사 조절을 포함하는 다수의 세포 반응을 포함하는 대부분의 다면발현 사이토카인 중에 TNF 족 리간드가 공지되어 있다. 사이토카인의 TNF 족 및 수용체는 대량 EST 서열분석의 출현과 함께 최근 수년 동안 매우 확장되었다. TNFSF13b는 BLyS, TALL-1, BAFF, THANK, 뉴트로카인-α, 및 zTNF에 대한 TNF 학술회에 의해 채택된 사무 명칭이다 (개관용 [Locksley et al. Cell 2001 104:487] 참고). 인간 TNFSF13b (hTNFSF13b)는 가용성 및 막 결합 단백질 모두에 존재하게 할 수 있는 N-말단 절단 부위를 소유한 285 개의 아미노산 유형 II 막-결합 단백질이다. 기능적으로, TNFSF13b는 B 세포 및 일부 T 세포 면역 반응을 조절하는 것으로 보인다.
패혈 쇼크 증후군 및 염증 사이토카인의 과생성으로부터 발생하는 다른 질병의 연구는 병을 앓고 있는 숙주가 가용성 사이토카인 수용체를 유리하거나 또는 고-친화성 항-사이토카인 항체를 합성하여 종종 높은 사이토카인 수준에 종종 대항한다는 것을 밝혀냈다. 이러한 천연 반응을 모방하는 치료 방법이 사이토카인-매개 질환을 완화시키기 위한 실행가능 치료 접근법으로서 고려된다. 따라서, 고 친화성에 의한 세포 면역 과정의 조절과 관련되고 표적 사이토카인의 활성의시험관내및생체내길항능을 갖는 사이토카인, 예컨대 TNFSF13b에 결합하는 인간 항체에 대한 충분한 인지가 필요하다.국제 특허 출원 WO 00/50597에 비-서술적으로 TNFSF13b에 관한 항체가 개시되어 있지만, 이러한 항체의 구조적 또는 기능적 특성을 서술적으로 기재하지 않고 있다.
본 발명은 항-hTNFSF13b 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명의 항체는 TNFSF13b 폴리펩티드에 대한 고 친화성 결합, 저속 분리 동역학, 및 TNFSF13b 폴리펩티드와 회합되는 하나 이상의시험관내및(또는)생체내활성의 길항능에 의해 특성화된다.
본 발명은 또한 서열 번호 2에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 4에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 6에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 8에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 10에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 12에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 14에 나타낸 폴리펩티드 및 서열 번호 16에 나타낸 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 항-hTNFSF13b 인간 항체를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 hTNFSF13b 폴리펩티드에 결합하고 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이 Koff속도 상수 1 X 10-4s-1이하로 hTNFSF13b 폴리펩티드로부터 해리되거나, 또는시험관내중화 분석에서 IC501 x 10-8M 이하로 TNFSF13b 유도 증식을 억제하는 단리된 항-hTNFSF13b 인간 항체를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은
a)시험관내중화 분석에서 IC501 x 10-8M 이하로 TNFSF13b 유도 증식을 억제하고;
b) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지고;
c) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 가지는 특성을 갖는 단리된 항-hTNFSF13b 인간 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체의 투여를 포함하는, 자가면역 질병, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및(또는) 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 B 세포 및 일부 T 세포 활성과 관련된 급성 또는 만성 질환 또는 증상의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체를 코딩하는 서열, 항-hTNFSF13b 인간 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 항-hTNFSF13b 인간 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시킨 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 항-hTNFSF13b 인간 항체를 포함하는 제제 및 그의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체가 결합하는 항원의 에피토프를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 자가면역 질병, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및(또는) 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 B 세포 및 일부 T 세포 활성과 관련된 급성 또는 만성 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 에피토프에 결합하여 그에 의해 TNFSF13b 활성을 중화시키는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신 및 위치 105의 글루탐산을 포함하는 TNFSF13b의 에피토피를 결합시켜 항체가 중화시키는 것을 지시하며 TNFSF13b 활성을 중화시키는 복용 형태의 투여를 제공하는 포장 삽입물을 포함하는 포장재, 및 상기 포장재 내에 함유된, TNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 인간 대상을 치료 또는 예방하기 위해 TNFSF13b 활성을 중화시키는 항체를 포함하는 제조품을 포함한다.
도 1.인간 항체 4A5-3.1.1-B4에 의한 T1165.17 세포의 hTNFSF13b 억제 및 IL-1 유도 증식을 나타내는 그래프.
도 2.항-IgM로 자극시킨 1차 인간 B 세포 중에서 인간 항체 4A5-3.1.1-B4에 의한 hTNFSF13b 유도 증식의 중화를 나타내는 그래프.
본 발명을 더 용이하게 이해하기 위해, 특정 용어를 우선 정의한다.
항체는 이황화물 결합에 의해 서로 연결된 2 개의 중쇄 (H) (약 50 내지 70 kDa) 및 2 개의 경쇄 (L) (약 25 kDa)인 4개의 폴리펩티드 연쇄로 이루어진 면역글로불린 분자이다. 경쇄는 카파 및 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체"의 아이소타입을 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 각각 정의한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR로서 본원에서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로서 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD 및 IgA의 경우 3 개의 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어지고, IgM 및 IgE의 경우 4 개의 도메인 CH1, CH2, CH3, CH4로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR로서 본원에서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로서 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1 개의 도메인 CL로서 이루어진다. HCVR 및 LCVR 지역은 추가로 초변이성 지역, 더 보존성인 지역이 산재된 용어 상보성 결정 지역 (CDR), 용어 틀구조 지역 (FR)으로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 하기의 순으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 정렬되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은 잘 공지된 방식에 따른다 [Kabat,et al,Sequecnes of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia,et al.,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia,et al.,Nature342:878-883 (1989)]. 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적 특성은 CDR에 의해 결정된다.
본 개시내용에서 용어 "항체"는 모노클로날 항체를 본질적으로 칭한다. 모노클로날 항체는 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 또는 단일쇄 FV 단편일 수 있다. 바람직하게는 용어 "항체"는 인간 항체를 칭한다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 상응하는 가변성 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 치료용 비-인간 및 키메라 항체보다 더 몇몇 장점을 가진다. 예를 들면, 인간 항체의 이펙터 부분은 인간 면역계의 다른 부분과 더 양호하게 상호작용할 수 있다 (예컨대, 상보성-의존 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존 세포 세포독성 (ADCC)에 의해 더 효율적으로 표적 세포가 파괴됨). 또다른 장점은 인간 면역계가 인간 항체를 외래물로서 인식하지 않아서 이러한 주사된 항체에 대한 항체 반응이 전체 외래 비-인간 항체 또는 부분 외래 키메라 항체에 대한 것보다 덜하다는 것이다. 또한, 주사된 비-인간 항체는 인간 항체의 반감기보다 인간 순환계에서 매우 더 짧은 반감기를 가진다는 것이 보고되었다. 주사된 인간 항체는 자연 발생 인간 항체와 실질적으로 동일한 반감기를 가져서 투여되는 복용량이 더 적거나 복용량 회수가 더 작을 것이다.
용어 "hTNFSF13b"는 국제 특허 출원 WO98/18921 및 WO00/50597에 기재된 리간드의 종양 괴사 인자 족의 일원의 인간형을 칭한다 (뉴트로카인-α로서 본원에서 칭함). 용어 "TNFSF13b"는 hTNFSF13b 뿐만 아니라 다른 종으로부터 유도된 hTNFSF13b의 동족체를 포함한다. 용어 "hTNFSF13b" 및 "TNFSF13b"는 표준 재조합 발현 방법으로 제조하거나 또는 시판 구입할 수 있는 형태 (Research Diagnostics Inc. Catalog No. RDI-3113, rhuBAFF, Flanders, N.J.) 뿐만 아니라 합성 생성된 형태를 포함한다.
본 발명의 항체에 관련된 어구 "생물학적 특성", "생물학적 특징", 및 용어 "활성"은 호환적으로 본원에 사용되고, 에피토프 친화성 및 특이성 (예컨대, hTNFSF13b에 대한 항-hTNFSF13b 인간 항체의 결합), 표적화된 폴리펩티드 활성 (예컨대, TNFSF13b 활성)의 길항능, 항체의생체내안전성, 및 항체의 면역성을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 식별가능 생물학적 특성 또는 당업계에 인지되는 항체 특징은 예를 들면 (즉, 일반적으로 표적화된 폴리펩티드의 비-인간 동족체 또는 다른 단백질 또는 조직과의) 교차-반응성, 및 포유류 세포에서 단백질의고 발현 수준의 유지능을 포함한다. 상술된 특성 또는 특징은 ELISA, 경쟁성 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분석,시험관내및생체내중화 분석 (예컨대, 실시예 2), 및 인간, 영장류, 또는 필요에 따른 임의의 다른 공급원을 포함하는 상이한 공급원으로부터의 조직 구획을 사용하는 면역조직화학법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계-인지 기술을 사용하여 관찰하거나 또는 측정할 수 있다. 항-hTNFSF13b 인간 항체의 특정 활성 및 생물학적 특성은 하기 실시예에 추가로 상세히 설명된다.
어구 "접촉 위치"는 항원과 접촉하는 아미노산에 의해 발생되는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중의 아미노산 위치를 포함한다. CDR 아미노산이 항원과 접촉하는 경우, 그 아미노산은 이어서 접촉 위치를 점유하는 것으로 간주된다.
"보존성 치환" 또는 "보존성 아미노산 치환"은 자연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 아미노산 치환을 칭하며, 여기서 이러한 치환에 의해 생성되는 항체는 본원에 개시된 항체로서 실질적으로 동일한 (또는 개선되거나 또는 감소된 (바람직할 경우)) 활성(들)을 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 지역을 칭한다. "면역성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용되는 용어 "결합"은 일반적으로 항원의 에피토프에 대한 항체의 상호작용을 칭한다. 더 구체적으로, 용어 "결합"은 항원의 에피토프에 대한 항체의 친화성과 관련된다. 친화성은 KD로 측정된다.
용어 "억제" 또는 "억제함"은 질환 또는 상태의 진행 또는 중증도를 중화, 방해, 차단, 제한, 저지, 정지, 또는 역행시키는 것을 포함하는 일반적으로 허용되는 의미를 포함한다.
항-TNFSF13b 항체 또는 어구 "TNFSF13b 활성을 길항하는 항체"와 관련된 용어 "중화" 또는 "길항"은 항체 또는 항체 단편이 TNFSF13b에 결합하여 TNFSF13b 폴리펩티드에 의해 유도된 생물학적 활성을 억제하는 것을 의미한다. TNFSF13b 생물학적 활성의 억제는 TNFSF13b-유도 증식, TNFSF13b-유도 면역글로불린 분비, B 세포 아포프토시스의 TNFSF13b-유도 차단, 또는 TNFSF13b 수용체 결합 분석에서의 수용체 결합의 억제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 TNFSF13b 생물학적 활성의 하나 이상시험관내또는생체내지시자를 측정하여 평가될 수 있다. TNFSF13b 생물학적 활성의 지시자는 당업계에 공지된 몇몇시험관내또는생체내분석 중 하나 이상을 사용하여 평가할 수 있다. (예를 들면, 문헌 [Moore, P.A., et al., Science, 285:260-263 (1999); Schneider, P.,et al.,J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Shu, H.,et al., J. Leuko. Biol., 65:680-683 (1999); Mukhopadhyay, A.,et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999); Mackay, F.et al., J. Exp. Med., 190:1697-1710 (1999); Gross, J.A.,etal., Nature, 404:995-999 (2000); 및 실시예 2] 참고). 바람직하게는, TNFSF13b 활성에 대한 항체의 중화능 또는 길항능은 실시예 2에 나타내는 바와 같이 B 세포 증식 억제로평가된다.
본원에 사용되는 용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터 항체를 해리하는 해리 속도 상수를 칭한다.
본원에 사용되는 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수 또는 "결합" 속도로 나눈 "해리" 속도를 칭한다. 본 발명의 목적을 위해 KD는 실시예 4에 나타내는 바와 같이 측정된다.
"단리된" 항체는 동정되고, 그의 천연 환경 성분으로부터 분리되고(거나) 회수하는 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단상 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 보통, 단리된 항체는 하나 이상 정제 단계로 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 항체를 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정하여 항체 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로 정제하고, (2) 쿠마시에 블루 (Coomassie blue), 또는 바람직하게는, 실버 스테인 (silver stain)을 사용하여 감소 또는 비감소된 조건 하에 SDS-PAGE로 균질하게 정제한다. 바람직하게는, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (예컨대, hTNFSF13b 폴리펩티드 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없이 hTNFSF13b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체)이다.
어구 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
hTNFSF13b 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예컨대, HCVR, LCVR, CDR3) 코딩 핵산과 관련하여 본원에 사용되는 어구 "단리된 핵산 분자"는 항체, 또는 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다른 서열이 인간 게놈 DNA 중의 핵산 측면에 천연적으로 위치할 수 있고 hTNFSF13b 폴리펩티드 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 항-hTNFSF13b 인간 항체의 HCVR 지역을 코딩하는 본 발명의 단리된 핵산은 hTNFSF13b 폴리펩티드 이외의 항원에 결합하는 HCVR을 코딩하는 다른 서열을 함유하지 않는다.
용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또다른 유형은 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예컨대, 박테리아 복제 원점 (origin)을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙죽 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 본원에서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 대부분 통상 사용되는 벡터이기 때문에 서로 호환 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을제공하는 발현 벡터의 이러한 다른 형태, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
핵산은 또다른 핵산 서열과의 기능적 관계 내로 배속될 경우 "작동적으로 연결된다". 예를 들면, 프리서열 (presequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여된 프리단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서 (enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결됨"은 연결되는 DNA 서열이 분비 리더의 경우 인접하고, 해독 틀에서 인접한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 편리한 제한효소 절단부위에서 결찰시킴으로써 연결은 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 편리한 방법에 따라 사용된다.
항체에 관련된 용어 "재조합"은 재조합 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함한다. 대표적인 실시예는 숙주 세포 내로 형질감염되는 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체, 재조합으로부터 단리한 항체, 조합 인간 항체 라이브러리, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이전된 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱과 관련된 임의의 수단에 의한 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터유도된 가변성 및 불변 영역을 가진다.
어구 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손에 인용되는 것으로 이해되어야 한다. 특정 개질이 돌연변이 또는 환경 영향 때문에 차후 세대에서 발생될 수 있으므로 이러한 자손은 사실 부모 세포와 동일할 수 없지만 본원에 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위에 여전히 포함된다.
재조합 인간 항체가 또한시험관내돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자이전된 동물이 사용되는 경우,생체내체세포 돌연변이유발)되고, 따라서 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 지역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 HCVR 및 LCVR 서열에 관련된 것으로부터 유도되지만 인간 항체 생식세포주 레퍼토리 내에 천연적으로생체내존재할 수 없는 서열이다.
내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 면역화시에 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자이전 동물 (예컨대, 마우스)를 사용할 수 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이 마우스 중의 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 배열의 이동은 항원 접종 시에 인간 항체를 생성할 것이다 (예컨대, 문헌 [Jakobovits,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, (1993); Jakobovits,et al., Nature, 362:255-258, (1993; Bruggemann,et al., Year in Immun.,7:33 (1993);Nature148:1547-1553 (1994),Nature Biotechnology14:826 (1996); Gross, J.A.,et al., Nature, 404:995-999 (2000); and U.S. patents nos. 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016, 5,633,425, 5,625,126,5,569,825, and 5,545,806] 참조 (모든 목적을 위해 이들 각각은 본원에 참고로 완전히 인용됨)). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 (phage diplay libraries) [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks,et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]로 생성될 수 있다. 콜 (Cole) 등 및 뵈르너 (Boerner) 등의 기술이 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용될 수 있다 [Cole,et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therap, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner,et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)].
"용기"는 제약 생성물의 저장, 적재, 분배 및(또는) 취급에 적합한 임의의 그릇 및 경계를 의미한다.
"포장재"는 편리한 투여를 가능하게 하는 소비자-친근성 장치 및(또는) 배달, 교육, 및(또는) 투여를 조력하는 보조 장치를 의미한다. 포장재는 환자에 대한 항체 투여를 개선하고(거나), 환자에 대한 교육 명령 시간을 감소 또는 개선시키고(거나), 개선된 건강 경제 연구에 대한 기반을 제공하고(거나) 분포 채널 작업부하를 제한할 수 있다. 또한, 포장재는 종이-기재 포장, 수축 포장 (shrink wrapped package), 시-쓰루 탑 (see-through top) 포장, 시용 쿠폰, 교육 자재, 보조 공급물, 및(또는) 전달 장치를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"포장 삽입물"은 의사, 약사, 및 환자가 생성물 사용에 관한 정보에 근거하여 결정하기 위해 요구되는 안전성 및 효율성과 함께 생성물 관리법의 설명, 및(또는) 환자 교육 정보를 제공하는 제품 동봉 정보를 의미한다. 포장 삽입물은 일반적으로 제약품용 "라벨"로 간주된다.
"대상"은 포유류; 바람직하게는 치료가 필요한 인간을 의미한다. 본 발명에 관해 치료가 필요한 대상은 TNFSF13b 활성이 해로운 질병, 예를 들면 자가면역 질환, 및 염증 질환을 포함하는 면역 질환을 앓고 있거나 또는 앓는 경향이 있는 포유류가 포함된다. 바람직한 질병은 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 천식, 알레르기 질환, 건선, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 감염 질환, 기생충 질환, 여성 불임증, 자가면역 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 하시모토병, 쇼그렌 증후군, 및 암, 특히 B 또는 T 세포 림프종 또는 골수종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 각종 측면은 하기 소구분에서 추가로 상세하게 설명된다.
본 발명은 생활성 hTNFSF13b 폴리펩티드에 특이적이고 이를 중화시키는 인간 모노크로날 항체에 관한 것이다. 또한, TNFSF13b 폴리펩티드에 매우 특이적이고 결합할 때 이를 중화시키는 항체 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 개시한다. 이 고 특이성은 항-hTNFSF13b 인간 항체, 및 유사한 특이성을 갖는 인간 모노클로날 항체로 TNFSF13b 관련 질환을 면역치료할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16에 나타낸 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, TNFSF13b 폴리펩티드 에피토프와 고 친화성으로 결합하고, 결합 TNFSF13b 폴리펩티드로부터 낮은 Koff속도 상수 1 x 10-4s-1이하로 해리되고, TNFSF13b 폴리펩티드 활성의 길항능을 갖는 단리된 인간 항체를제공한다. 일 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드; 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드;서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드; 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드; 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 4 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드; 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 5 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드; 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드; 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드; 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드 중의 폴리펩티드를 포함한다.
더 바람직하게는, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 2에 나타낸 경쇄 가변 영역 (LCVR) 폴리펩티드 또는 서열 번호 10에 나타낸 중쇄 가변 영역 (HCVR) 폴리펩티드를 포함한다. 더더욱 바람직하게는, 항-hTNFSF13b 인간 항체는 서열 번호 2에 나타낸 LCVR 폴리펩티드 및 서열 번호 10에 나타낸 HCVR 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 인간 항체는 결합 TNFSF13b 폴리펩티드로부터 Koff속도 상수 5 x 10-5s-1이하로 해리되고, TNFSF13b 유도 증식을시험관내중화 분석에서 IC501 x 10-7M 이하로 억제한다. 더 바람직한 실시양태에서, 단리된인간 항체는 결합 TNFSF13b 폴리펩티드 에피토프로부터 Koff속도 상수 1 x 10-5s-1이하로 해리되고, TNFSF13b 유도 증식을시험관내중화 분석에서 IC501 x 10-8M 이하로 억제한다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, 단리된 항-TNFSF13b 인간 항체는 결합 hTNFSF13b 폴리펩티드로부터 Koff속도 상수 5 x 10-6s-1이하로 해리되고, TNFSF13b 유도 증식을시험관내분석에서 IC501 x 10-9M 이하로 억제한다. 상술된 동역학 및 중화 판단기준에 부합하는 항-hTNFSF13b 인간 항체의 실례는 4A5-3.1.1-B4 항체를 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 항-hTNFSF13b 인간 항체는 본원에서 4A5-3.1.1-B4를 칭한다. 4A5-3.1.1-B4는 서열 번호 2 및 서열 번호 10에 각각 나타낸 LCVR 및 HCVR 폴리펩티드 서열을 가졌다. 4A5-3.1.1-B4의 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 폴리-뉴클레오티드 서열을 서열 번호 1 및 서열 번호 9에 각각 나타낸다. 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체의 특성은 실시예에 구체적으로 개시되어 있다. 4A5-3.1.1-B4에 의해 나타난 TNFSF13b 폴리펩티드에 대한 고 친화성, 서행 해리 동역학, 및 TNFSF13b 폴리펩티드 활성의 고 길항능이 특히 주목할 만하다.
항-hTNFSF13b 인간 항체의 Koff는 일반적으로 실시예 4에 기재하는 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 나타낼 수 있다. 일반적으로, 표면 플라즈몬 공명 분석은 리간드 (바이오센서 매트릭스 상에 고정된 재조합 TNFSF13b 폴리펩티드) 및분석물 (용액 중의 항체) 간의 실-시간 결합 상호작용을 BIAcore 시스템 (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 측정하였다. SPR 분석은 또한 분석물 (바이오센서 매트릭스 상의 항체)을 고정시키고 리간드 (용액 중의 재조합 TNFSF13b)를 제공함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 또한 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체를 생산하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주의 단리는 당업계에 공지된 통상의 스크리닝 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체를 생산하는 하이브리도마는 본원에 개시된 바와 같이 ATCC (ATCC PTA-3674)에 기탁되어 있다.
박테리아, 효모, 베큘로바이러스, 식물, 및 포유류 발현 시스템 (뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템)을 포함하는 광범위한 숙주 발현 시스템이 본 발명의 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 박테리아 발현 벡터의 실례는 pUC119 (Sfi)이다. 다른 항체 발현 시스템도 또한 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 숙주 세포에서 재조합 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시켜 경쇄 및 중쇄를 숙주 세포에서 발현시킨다. 바람직하게는, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양되는 배지로부터 분비되고, 배지로부터 항체가 회수될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터 내에 도입시키고, 벡터를 숙주 세포 내에 도입시킨다.
HCVR-코딩 DNA을 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2, 및 CH3)을 코딩한 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 HCVR 지역을 코딩하는 단리된 DNA는 완전-길이 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있고, 이들 지역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역 및 문헌 [Kabat,et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]에 기재된 바와 같이 본원의 임의의 알로타입 (allotype) 변종일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1, 또는 IgG4 불변 영역이다. 달리, 항체 부분은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 또는 단일쇄 FV 단편일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, HCVR-코딩 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.
LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 LCVR 지역을 코딩하는 단리된 DNA는 완전-길이 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있고, 이들 지역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFV 유전자를 생성시키기 위해, HCVR- 및 LCVR-코딩 DNA 단편은 유연성 링커, 예컨대 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또다른 단편에 작동적으로 연결되어, HCVR 및 LCVR 서열이 유연성 링커에 의해 결합된 LCVR 및 HCVR 지역을 갖는 인접한 단일-연쇄 단백질로서 발현될 수 있다 (예컨대, [Birdet al.Science242:423-426 (1988); Huston,et al.,Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty,et al.,Nature348:552-554 (1990)] 참조).
본 발명의 항체를 발현시키기 위해, 부분 또는 완전-길이 경쇄 및 중쇄를 코딩하고 상술된 바와 같이 수득한 DNA를 발현 벡터 내에 삽입시켜 유전자를 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결시킨다. 항체 유전자는 벡터 내에 결찰되어 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역 조절에 대한 그의 의도된 기능을 제공한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 더 전형적으로 유전자 모두가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한효소 절단부위 결찰, 또는 제한효소 절단부위가 부재인 경우 평활 말단 결찰)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 또한, 또는 달리, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항-hTNFSF13b 인간 항체 쇄 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항-hTNFSF13b 인간 항체 쇄 유전자는 벡터 내로 클로닝되어 신호 펩티드가 틀내로 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결될 수 있다. 신호 펩티드는면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 쇄 유전자의 발현을 숙주 세포에서 조절하는 조절 서열을 가진다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 다른 발현 조절 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인이 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존적일 수 있다는 것은 당업자에게 인식될 것이다. 포유류 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현에 관한 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예컨대, 아데노바이러스 메이저 레이트 (major late) 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및(또는) 인핸서를 포함한다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예컨대, 복제의 원점) 및 선택가능 마커 유전자를 가질 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다. 예를 들면, 전형적으로 선택가능 마커 유전자는 약제, 예컨대 G418, 하이그로마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 수여한다. 바람직한 선택가능 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하는 dhfr-숙주 세포용) 및neo유전자 (G418 선별용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현의 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)은 숙주 세포 내로 표준 기술에 의해 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 각종 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입시키기 위해 통상적으로 사용되는 광범위한 기술, 예컨대, 전기충격법, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하지만, 이러한 진핵 세포, 특히 포유류 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비하는 것이 진핵 세포보다 더 유사하기 때문에 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국산 햄스터 난소 (CHO 세포)(dhfr-CHO 세포를 포함함, 문헌 [Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 77:4216-4220 (1980)]에 기재됨, DHFR 선택가능 마커를 사용함, 예컨대 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp,Mol. Biol., 159:601-621 (1982)]에 기재됨), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내에 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체가 발현되거나 또는 더 바람직하게는 항체를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비되기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
숙주 세포는 또한 무손상 항체 부분, 예컨대 scFV 분자의 Fab 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법에 대한 변법이 본 발명의 범위 내에 속한다고 이해될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄 (하지만, 모두는 아님)를 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 hTNFSF13b에 결합하는 데 필요없는 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 모두를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 일부절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 본 발명의 항체의 재조합 발현 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터는 dhfr-CHO 세포 내로 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 유전자의 고 수준의 전사를 유도하기 위해 인핸서/프로모터 조절 요소 (예컨대, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유도된 요소, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 각각 작동적으로 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하는 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있는 DHFR 유전자를 가진다. 선별된 형질전환 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 배양되고, 무손상 항체는 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술은 재조합 발현 벡터의 제조, 숙주 세포의 형질감염, 형질감염물 선별, 숙주 세포의 배양 및 배양 배지로부터의 항체 회수에 사용된다. 본 발명의 그의 항체 또는 항원-결합 부분은 인간 면역글로불린 유전자가 유전자이전된 동물 (예컨대, 마우스)에서 발현될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Taylor, L.D.,et al. Nucl. Acid Res., 20:6287-6295(1992)] 참고). 식물 세포는 또한 본 발명의 그의 항체 또는항원 결합 부분을 발현하는 유전자이전 식물을 생성하기 위해 개질될 수 있다.
상기를 고려하여, 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항체 및 항체 부분의 재조합 발현을 위해 사용될 수 있는 핵산, 벡터, 및 숙주 세포 조성물에 관련한다. 바람직하게는, 본 발명은 4A5-3.1.1-B4의 CDR, 또는 4A5-3.1.1-B4의 완전 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 중쇄 CDR3을 코딩하는 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 중쇄 CDR2를 추가로 코딩한다. 더 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 중쇄 CDR1을 추가로 코딩한다. 더더욱 바람직하게는, 단리된 핵산은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 (4A5-3.1.1-B4의 완전 HCVR 지역)을 코딩한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 경쇄 CDR3을 코딩하는 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 경쇄 CDR1을 추가로 코딩한다. 더더욱 바람직하게는, 단리된 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 (4A5-3.1.1-B4의 완전 LCVR 지역)을 추가로 코딩한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는4A5-3.1.1-B4 경쇄 CDR3을 코딩하는 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 4A5-3.1.1-B4 경쇄 CDR1을 추가로 코딩한다. 더더욱 바람직하게는, 단리된 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 (4A5-3.1.1-B4의 완전 LCVR 지역)을 코딩한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인 (즉, 4A5-3.1.1-B4 HCVR CDR3)을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 이 핵산은 단지 CDR3 지역을 코딩할 수 있거나 또는, 더 바람직하게는 전체 항체 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 코딩한다. 예를 들면, 핵산은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 (즉, 4A5-3.1.1-B4 HCVR CDR2) 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인 (즉, 4A5-3.1.1-B4 HCVR CDR1)을 갖는 HCVR을 코딩할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 (즉, 4A5-3.1.1-B4 LCVR)을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직하게는 이 핵산은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 숙련된 당업자는 유전자 코드의 퇴화 때문에 다른 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 핵산은 LCVR에 작동적으로 연결된 단지 LCVR을 코딩하거나 또는 항체 경쇄 불변 영역을 코딩할 수도 있다. 일 실시양태에서, 이 핵산은 재조합 발현 벡터 중에 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는항체 중쇄 가변 영역 (즉, 4A5-3.1.1-B4 HCVR)을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직하게는 이 핵산은 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 숙련된 당업자는 유전자 코드의 퇴화 때문에 다른 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 핵산은 HCVR에 작동적으로 연결되는 단지 HCVR을 코딩하거나 또는 또한 중쇄 불변 영역을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 핵산은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 이 핵산은 재조합 발현 벡터 중에 있다.
당업자는 항체의 아미노산 서열 중의 개질로 인해 항체가 원래 항체에 비해 동등하거나 또는 더 우수한 기능적 특성을 나타낼 수 있다는 것을 인식한다. 본 발명의 항체 중의 개질은 천연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 일부절단, 융합 등을 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 본원에 개시되고 하나 이상 아미노산 치환을 추가로 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 치환된 항체는 본원에 개시된 항체와 실질적으로 동일한 (또는 개선되거나 또는 감소된 (바람직할 수 있는 경우)) 활성(들)을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 CDR은 3 이하의 보존성 치환을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 CDR은 2 이하의 보존성 치환을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 CDR은 하나의 보존성 치환을 가진다. 숙련된 당업자는 보존성 아미노산 치환을 갖는 항체가 당업계에 공지된 다수의 기술에 의해 제조될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, PCR 어셈블리, 쿤켈 (Kunkel) (dut-ung-) 및 티오포스페이트 (아머샴 스쿨프터 키트 (Amersham Sculptor kit)) 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 포함하는 다수의 돌연변이유발 방법을 사용할 수 있다. 중요한 보존성 치환을 바람직한 치환과 함께 하기 표 1에 나타낸다.
본 발명은 또한 서열 번호 2에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 4에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 6에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 8에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 10에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 12에 나타낸 폴리펩티드, 서열 번호 14에 나타낸 폴리펩티드; 및 서열 번호 16에 나타낸 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 일 실시양태에서, 본 발명은
a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 중쇄; 및
b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 경쇄를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일단 발현된 전체 항체, 그의 이량체, 개개의 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 황산 암모늄 침전, 이온 교환, 친화성, 역상, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기-영동 등을 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다. 실질적으로 순수한 면역글로불린의 동질성은 제약 용도를 위해 적어도 약 90 내지 95%가 바람직하고, 또는 98 내지 99%가 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 바람직하게는 동질하게 정제되는 경우, 폴리펩티드는 본원에 관련되어 이어서 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 대상 투여에 적합한 제약 조성물 내에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부분 및 제약상 허용되는 희석제, 담체, 및(또는) 부형제를 포함한다. 투여용 제약 조성물은 투여의 선택된 방식에 적절하게 디자인되고, 제약상 허용되는 희석제, 담체, 및(또는) 부형제, 예컨대 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다.
본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체를 포함하는 제약 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근내, 비강내, 협측, 설하, 또는 좌제 투여에 의한 표준 투여 기술을 사용하여 자가면역 관련 증상 또는 병상, 예컨대 전신 홍반성 루푸스의 위험이 있거나 또는 나타내는 포유류에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 제약 조성물 내에 혼입될 수 있다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달이 바람직하다. 이러한 주사에 적합한 비히클은 간단하다. 또한, 그러나, 투여는 또한 비강 에어로졸 또는 좌제로 점막을 통해 영향을 끼칠 수 있다. 이러한 방식의 투여에 적합한 제제는 당업계에 공지되어 있고, 전형적으로 교차-막 이동을 촉진하는 계면활성제를 포함한다.
제약 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균 및 안정하여야 한다. 따라서, 제약 조성물은 제제 제조 후에 멸균 여과되거나, 또는 달리 미생물학적으로 허용되게 제조될 수 있다. 정맥내 주입에 전형적인 조성물은 용적 250 mL의 유체, 예컨대 멸균 링거 용액, 및 1 내지 100 mg/mL 이상의 항체 농도를 가질 수 있었다. 본 발명의 치료제 모두는 사용 전에 보관을 위해 냉동 또는 동결건조시키고, 적합한 멸균 담체 중에 재구성시킬 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실을 유도할 수 있다 (예컨대, 통상의 면역 글로불린을 사용하는 경우 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 크게 활성을 손실하는 경향임). 복용량은 보충을 위해 조정되어야 할 수 있다. 제제의 pH는 항체 안전성 (화학적 및 물리적)을 균형잡기 위해 선택되고, 투여시에 환자를 위안할 것이다. 일반적으로, 6 및 8 사이의 pH가 허용된다.
TNFSF13b는 면역 및 염증 인자와 관련된 다수의 질환 관련 병상에서 중요한 역할을 수행한다 . 따라서, 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체를 포함하는 제약조성물은 TNFSF13b 활성이 해로운 질병, 예를 들면 자가면역 질환을 포함하는 면역 질환 및 염증 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 질병은 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 천식, 알레르기 질환, 건선, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식 관련 급성 또는 만성 질환, 사르코이드증, 감염 질환, 기생충 질환, 여성 불임증, 자가면역 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 하시모토병, 쇼그렌 증후군, 기관 이식 관련 면역 질환, 사르코이드증, 감염 질환, 기생충 질환, 여성 불임증, 자가면역 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 하시모토병, 쇼그렌 증후군, 및 암, 특히 B 또는 T 세포 림프종 또는 골수종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
더 바람직하게는, 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체 및(또는) 항체 단편을 포함하는 제약 조성물은 전신 홍반성 루푸스의 치료를 위해 사용된다.
TNFSF13b 활성이 해로운 하나 이상의 상술된 질병을 치료하기 위한 의약 제조에서 본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체의 용도도 또한 본원에서 고려된다.
특정 상황에서, 본 발명의 항체는 자가면역 및(또는) 염증 질환의 치료에 사용되는 하나 이상의 추가 치료제와 공동-제제화 및(또는) 공동-투여될 것이다. 이러한 조합 치료법은 더 낮은 복용량의 투여 치료제를 유익하게 사용하므로 가능한 독성 또는 각종 단일치료법과 관련된 합병증을 피할 수 있다. 본 발명의 항체가 조합 치료의 부분으로서 사용되는 경우의 더 낮은 복용량의 항체가 항체 단독으로 대상에게 투여되는 경우보다 더 바람직할 수 있다는 것은 숙력된 당업자에 의해 인식될 것이다 (예컨대, 상승 치료 효과가 조합 치료를 사용하여 달성될 수 있으며, 또한 바람직한 치료 효과를 달성하는 더 낮은 복용량의 항체의 사용을 허용함).
본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 항체의 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량"을 포함할 수 있다. "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하기 위한 복용량 및 필요 기간 동안의 유효량을 칭한다. 항체의 치료 유효량은 인자, 예컨대 개개의 질환 상태, 연령, 성별, 및 중량, 및 개개에서 목적 반응을 유도하는 항체 또는 항체 부분의 능력에 따라 변경될 수 있다. 치료 유효량은 또한 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 해로운 영향보다 치료적으로 유익한 효과가 중대할 경우의 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하기 위한 복용량 및 필요 기간 동안의 유효량을 칭한다. 전형적으로, 예방 복용량이 질환 전 또는 초기에 대상에게 사용되기 때문에 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
복용 섭생은 최적 목적 반응 (예컨대, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 거환이 투여되거나, 몇몇 분리된 복용량이 시간에 따라 투여되거나 또는 복용량이 치료 상황의 급박에 의해 나타내어지는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
hTNFSF13b에 결합하는 능력을 가진 본 발명의 항체는 통상의 면역분석, 예컨대 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (RIA) 또는 조직 면역조직화학법을 사용하며 TNFSF13b 폴리펩티드 (예컨대, 생물학적 샘플, 예컨대 혈청 또는 혈장 중에)를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 접촉시키는 것, hTNFSF13b에 결합된 항체 (또는 항체 부분)또는 결합되지 않은 항체 (또는 항체 부분)을 탐지하여 생물학적 샘플 중의 hTNFSF13b를 탐지하는 것을 포함하는 생물학적 샘플 중의 TNFSF13b의 탐지 방법을 제공한다. 항체는 결합 또는 비결합 항체의 탐지를 용이하게 하기 위해 탐지가능 물질로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 적합한 탐지가능 물질에는 각종 효소, 보조 군, 형광 물질, 발광 물질 및 방사활성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 실례에는 허스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제가 포함되고; 적합한 보조 군 복합체의 실례에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 실례에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 도다민, 디클로로트리아지닐-아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 실례에는 루미놀이 포함되고; 적합한 방사활성 물질의 실례에는125I,131I,35S, 또는3H가 포함된다.
표지 항체와는 달리, TNFSF13b는 생물학적 유체 중에서 탐지가능 물질로 표지된 TNFSF13b 표준 및 비표지된 항-hTNFSF13b 인간 항체를 사용하는 경쟁 면역 분석으로 분석될 수 있다. 이 분석에서, 표지된 TNFSF13b 표준 및 항-hTNFSF13b 인간 항체인 생물학적 샘플을 합하고, 비표지된 항체에 결합한 표지된 TNFSF13b 표준의 양을 측정한다. 생물학적 샘플 중의 TNFSF13b의 양은 항-hTNFSF13b 인간 항체에 결합한 표지된 rTNFSF13b 표준의 양에 역비례한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 TNFSF13b 활성을 TNFSF13b의 에피토프 결합으로 중화시키는 항체의 용도를 제공한다. 에피토프는 실시예 10에 기재되는 바와 같이 동정된다. 참고로, hTNFSF13b의 가용성 부분을 하기와 같이 나타낸다:
신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 hTNFSF13b 아미노산은 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신, 위치 105의 글루탐산, 위치 106의 트레오닌, 위치 107의 루신, 및 위치 109의 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신, 위치 105의 글루탐산, 위치 106의 트레오닌, 위치 107의 루신, 및 위치 109의 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신, 위치 105의 글루탐산, 위치 106의 트레오닌, 위치 107의 루신, 및 위치 109의 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신, 위치 105의 글루탐산, 위치 106의 트레오닌, 위치 107의 루신, 및 위치 109의 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터선택되는 4 이상의 아미노산을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신 및 위치 105의 글루탐산을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 105의 글루탐산; 및 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 및 위치 73의 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 106의 트레오닌; 및 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 및 위치 73의 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 107의 루신; 및 위치 69의 트레오닌, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 및 위치 73의 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 109의 아스파라긴; 및 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 및 위치 73의 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 신규 항-hTNFSF13b 인간 항체 결합에 관련된 아미노산은 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신 및 위치 105의 글루탐산을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하려는 것이지 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1: 항-hTNFSF13b 인간 모노클로날 항체의 생산
모노클로날 항체는 메다렉스 (Medarex)의 HuMAb-마우스 (등록상표) 기술을 사용하며 가용성 hTNFSF13b (아미노산 133 내지 285, RDI (Flanders, NJ)로부터 구입하였음)로 마우스를 면역화시켜 생성시켰다. HCo7 및 HCo12 마우스 모두 사용하였다. 마우스를 RIBI, 프로인트 완전 아주반트 또는 프로인트 불완전 아주반트 중의 가용성 hTNFSF13b 15 ㎍ 내지 50 ㎍으로 면역화시켰다. hTNFSF13b에 대한 혈청 항체 역가를 생산하는 마우스 8 마리에 PBS 중의 hTNFSF13b 10 ㎍을 i.v.로 주사하였다. 비장을 각각의 마우스로부터 3 일 후에 수확하고, 문헌 [Zola, H. Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL. (1987)]에 기재된 방법에 따라 골수종 세포와 융합시켰다.
하이브리도마에 대해 hTNFSF13b에 대한 결합 및 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 확실한 발현을 시험하였다. hTNFSF13b에 대한 항체 결합을 하기와 같이 ELISA로 탐지하였다:
플레이트를 PBS 중의 5 ㎍/ml hTNFSF13b 50 ㎕로 밤새 4 ℃에서 코팅하였다. 플레이트를 이어서 비우고, PBS 100 ㎕ + 0.05% 트윈 20 (PBST) + 5% 닭 혈청으로 1 시간 동안 실온에서 블로킹하였다. PBST로 3 회 세척한 후에, 플레이트에서 물기를 제거하고, 희석된 제2 시약 (HRP-HuIgGFc, Jackson cat#109-036-098 또는 HRP-HuKappa, Bethyl cat#A80-115P; 블로킹 완충액 중에 1:5000) 100 ㎕를 각 웰에첨가하였다. 실온에서 인큐베이션 1 시간 후에 플레이트를 상술된 바와 같이 3 회 세척하였다. 플레이트를 플레이트 당 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 4.0 10 ml , ABTS 80 ㎕, H2O28 ㎕를 사용하여 전개하였다. 실온에서 인큐베이션 30 분 내지 1 시간 후에, 플레이트의 흡광도를 A415-A490에서 판독하였다. hTNFSF13b에 결합하고, huIgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄인 하이브리도마를 서브크로닝을 위해 선별하였다.
서브클로닝한 하이브리도마의 세포 배양 배지를 아미콘 (Amicon) S3Y30 UF 막을 사용하며 아미콘 ProFlux M12 접면 여과 시스템에서 농축하였다. 농축된 배지를 단백질-A 세파로스 컬럼 (5 내지 20 ml 컬럼) 상으로 유속 5 ml/분으로 통과시켰다. 컬럼을 완충액 (PBS, pH 7.4)으로 흡광도가 기준선으로 되돌아갈 때까지 세척하고, 결합한 폴리펩티드를 50 mM 시트르산, pH 3.2로 용리시켰다. 분획을 즉시 1M Tris, pH 8.0으로 중성화시켰다. 분획을 이어서 SDS-PAGE로 분석하였다. 항체를 함유한 분획을 합하고, 울트라프리 (Ultrafree) 원심 필터 단위 (Millipore, 10 kDa 분획 분자량)를 사용하여 농축하였다.
실시예 2: 항-hTNFSF13b 인간 항체의 기능적 활성
본 발명의 항-hTNFSF13b 인간 항체의 활성 중화를 쥐과 Il-1 의존성 B 세포주인 T1165.17을 사용하여 측정하였다. 세포를 분석 배지 (10% FBS, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 x 10-5M 2-머캅토에탄올 및 페니실린, 스트렙토마이신 및 훈기존을 함유한 RPMI1640)로 3 회 세척하여 IL-1을 제거하였다. 세포를 100,000 세포/ml로2.5 ng/ml 가용성 huTNFSF13b를 함유한 분석 배지 중에 재현탁시키고, 5000 세포/웰로 96 웰 플레이트 중에 플레이팅하고, 37 ℃ 및 5% CO2중에서 인큐베이션하였다. ELISA 양성 하이브리도마로부터의 상등액은 1:4 희석에서 포함되었다. 48 시간 후에, 프로메가 셀타이터 96 애쿠어스 원 솔루션 (Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution, Madison, WI) 20 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 5% CO2중에서 5 시간 동안 더 인큐베이션하였다. 흡수도를 A490에서 판독하여 증식을 측정하였다. 하이브리도마 상등액 중 하나인 4A5-3.1.1-B4에 대한 중화 활성의 실시예를 도 1에 나타냈다. 대조군으로, 항체를 IL-1 자극 세포에 첨가하였다. IL-1 자극 증식의 억제를 제외한 단지 hTNFSF13b 자극 증식의 억제에 대한 증거만 있다.
중화 항체에 대해 항-IgM 자극에 대한 반응에서 TNFSF13b 증가 1차 인간 B 세포 증식의 억제능을 시험하였다. MACS 자력 단리 시스템 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 사용하며 CD19 양성 선별을 사용하여 1차 인간 B 세포를 인간 혈액으로부터 단리하였다. B 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 10% FCS를 함유한 완전 RPMI (완전 RPMI는 10 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 및 1 x 10-5M β-머캅토에탄올을 함유한 RPMI1640임) 중의 웰 당 2 x 105세포로 첨가하였다. 웰 일부를 PBS(BD PharMingen, 클론 G20-127) 중의 10 ㎍/ml 항-인간 IgM으로 밤새 4 ℃에서 코팅하고, 사용 전에 PBS로 4 회 세척하였다. 세포 일부를 중화 항-hTNFSF13b 항체 (2.5 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 가용성 hTNFSF13b (25 ng/ml)로 자극시켰다. 도 2는 hTNFSF13b의 자극 영향에 대한 4A5-3.1.1-B4의 중화능을 나타냈다.
실시예 3: 모노클로날 항체의 특성화
중화 항-hTNFSF13b 항체 모두는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4이었다. 또한, 이들에 대해 변성 상태에서 hTNFSF13b에 대한 결합능을 분석하였는데, 즉 hTNFSF13b를 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 상에 블로팅하였다. 중화 항체 모두는 웨스턴 블롯에서 hTNFSF13b에 결합하지 않는 반면 비-중화 항체 몇몇은 결합할 수 있었다.
BIACore 시스템을 사용하는 실험을 수행하여 비-중화 항체 및 중화 항체가 hTNFSF13b 상의 동일 부위에 결합하는지를 결정하였다. 먼저, 4A5-3.1.1-B4를 칩 상에 코팅한 후에 hTNFSF13b를 주사하고 이어서 비-중화 항체의 포화량을 주사하였다. 일단 포화가 달성되면 고농도의 4A5-3.1.1-B4를 칩 상으로 유출시켰다. 비-중화 모노클로날 항체 11 개는 4A5-3.1.1-B4와 같이 동일한 결합 부위에 대해 경쟁할 수 없었다. 하나의 비-중화 하이브리도마는 4A5-3.1.1-B4의 결합을 약 45%까지 블로킹할 수 있으며, 4A5-3.1.1-B4 에피토프 주변의 에피토프를 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
동일한 실험 디자인을 사용하여, 또한 중화 mAb인 4A5-3.1.1-B4가 hTNFSF13b에 대한 수용체 중 하나인 TACI에 대한 동일한 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있다는 것을 입증하였다. 이들 실험은 TACI-Fc 및 4A5-3.1.1-B4가 hTNFSF13b 상의 동일 또는 겹치는 에피토프를 가질 수 있다는 것을 강하게 제시하였다 .
항체 용액을 Co+2와 함께 적하된 IMAC 수지 상으로 통과시킴으로써 4A5-3.1.1-B4를 고체상에 고정화시켰다. 결합 후에 수지를 묽은 과산화물 용액과 인큐베이션함으로써 코발트를 +3 상태로 산화시켰다. 수지 세척후에, 천연 hTNFSF13b 및 개질한 (환원/알킬화 또는 열 변성으로) hTNFSF13b를 컬럼 상으로 통과시켰다. 세척 후에, 결합 단백질을 산성 용액으로 용리시키고, 용리된 단백질을 MALDI MS로 분석하였다. 4A5-3.1.1-B4는 천연 재조합 hTNFSF13b에 결합하지만 화학적 또는 열적 개질된 hTNFSF13b에는 결합하지 않았다. 따라서, 4A5-3.1.1-B4는 가용성 hTNFSF13b 상의 에피토프 구조를 인식하는 것으로 나타났다.
재조합 가용성 hTNFSF13b (RDI)를 4A5-3.1.1-B4 또는 항-TNFSF13b 토끼 폴리클로날 항체 (MoBiTec, Marco Island, FL; hTNFSF13b의 아미노산 254 내지 269에 대해)와 빙상에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 단백질 혼합물을 PBS 중에서 평형화시킨 크기-제외 HPLC (2 개, 앞뒤로 나란히 TosoHaas TSK-GEL G3000PW 컬럼)에 유속 0.25 ml/분으로 가하였다. 단백질을 PBS로 용리시켰다. 대조군으로, 항체 용액 및 hTNFSF13b의 용액을 개별적으로 분석하였다. 인간 TNFSF13b는 TNFSF13b 분자의 3량체와 일관된 위치에서 크기 제외 컬럼으로부터 용리되었다. 3량체 hTNFSF13b의 용리는 4A5-3.1.1-B4에 존재하에 더 이른 시간으로 이동하였지만 항-TNFSF13b 폴리클로날 항체의 존재하에서는 이동하지 않았으며, 이는 4A5-3.1.1-B4 항체에 3량체 hTNFSF13b가 결합한다는 것을 나타낸다. 이 데이타는 중화 mAb 4A5-3.1.1-B4가 hTNFSF13b 상의 에피토프 구조에 결합한다는 것을 제시하고 있다.
실시예 4: BIAcore에 의한 모노클로날 항체의 친화도 측정
hTNFSF13b에 대한 각종 항-hTNFSF13b 인간 항체의 친화도를 BIAcore 2000 인스트루먼트 시스템을 사용하여 측정하였다. 이 시스템은 표면 플라즈몬 공명의 최적 특성을 사용하여 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내의 상호작용 분자의 단백질 농도의 변경을 탐지하였다. 기재된 것을 제외하고는, 모든 시약 및 물질을 BIAcore AB (Upsala, Sweden)로부터 구입하였다. 모든 측정을 25 ℃에서 수행하였다. 샘플을 HBS-EP 완충액 (150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES, pH 7.4) 중에 용해시켰다. 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 아민 커플링 키트를 사용하며 CM5 센서 칩 상의 유동 세포 1 상에 고정화시켰다. 염소 항-인간 IgG (Fc 특이적; Jackson Immunoresearch)를 아민 커플링으로 유동 세포 2 상에 또한 고정화시켰다. 항체 모두를 고정화시켜 700 반응 유닛 각각에 도달시켰다.
재조합 hTNFSF13b (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ)의 결합을 다중 분석 주기를 사용하여 평가하였다. 각각의 주기를 유속 30 ㎕/분에서 수행하고, 하기 단계로 이루어졌다: 4A5-3.1.1-B4 150 ㎕를 20 g/ml으로 주사하고, hTNFSF13b (50 nM에서 개시하고, 각각의 주기에 대해 2 배의 일련 희석을 사용함)250 ㎕를 주사한 15 분 후에 분리하고, 10 mM 글리신 HCl 90 ㎕ , pH 1.5를 사용하여 재생시켰다.
각각의 주기에 대한 회합 및 해리 속도를 BIAevaluation 소프트웨어의 랑무이르 (Langmuir) 1:1 결합 모델을 사용하여 평가하였다. hTNFSF13b에 대한 4A5-3.1.1-B4의 KD는 38 pM로 측정되었다.
실시예 5: 중쇄 및 경쇄
항원 결합 지역의 클로닝 및 서열분석
인간 mAb 4A5-3.1.1-B4 중화에 대한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝하고, 하기 프로토콜을 사용하여 서열분석하였다.
2 x 106하이브리도마 세포로부터 키트와 함께 제공된 마이크로-패스트 트랙 (Micro-Fast Track) 프로토콜 (Invitrogen)을 사용하며 mRNA를 제조하였다. cDNA 사이클 키트 (Invitrogen)를 사용하며 mRNA의 분취량을 30 분 동안 14,000 rpm 및 4 ℃에서 회전시킨 후에 펠렛을 70% 에탄올로 세척함으로써 mRNA의 에탄올 침전물 200 ㎕로부터 cDNA를 제조하였다. 통풍 건조된 펠렛을 멸균수 11.5 ㎕ 중에 재현탁시키고, cDNA를 키트 사용설명서에 따라 제조하였다. cDNA 분석의 최적 제2 순환을 생략하지만 cDNA를 페놀/클로로포름 추출 단계 및 에탄올 침전을 사용하여 청결화시켰다. cDNA 펠렛을 PCR 사용을 위해 TE 30 ㎕ 중에 재현탁시켰다.
불변 영역 중의 3' 프라이머와 쌍인 중쇄 및 경쇄에 대한 가변 영역의 5' 말단의 퇴화 프라이머로 PCR 반응시켰다. 각각의 반응물 50 ㎕에 대해, cDNA 1 ㎕를 사용하였다. PfuI로 사용에 관련된 바와 같이 반응시킨 후에, 20 주기 반응시켰다. 각각의 반응물 5 ㎕를 1% 아가로스 겔 상에 주행시켜 PCR 생성물을 확인하였다. 제로 블런트 (Zero Blunt) TOPO PCR 클로닝 키트 (Invitrogen)를 사용하여 양성 반응물을 클로닝하였다. 양성 클론으로부터의 미니프렙 (Miniprep)을 서열분석하고, 생성 유전자 재배열에 대해 분석하였다. 독립성 PCR 반응 및 다중 클론의 서열분석으로부터의 결과는 하기 기재되는 바와 같이 서열을 나타냈다.
인간 항체 4A5-3.1.1-B4 경쇄 서열 (CDR은 볼드체임).
인간 항체 4A5-3.1.1-B4 중쇄 서열 (CDR은 볼드체이고, 신호 서열은 이탤릭체임).
실시예 6: 비-인간 TNFSF13b과의 항-hTNFSF13b 인간 항체의 종 교차반응성
중화 mAb의 종 교차반응성을 결정하기 위해, 포획 및 탐지 mAb 모두로서 4A5-3.1.1-B4를 사용하며 ELISA를 수행하였다. 인간 재조합 TNFSF13b를 표준 곡선으로서 사용하였다. 인간 TNFSF13b는 hTNFSF13b 발현 벡터로 형질감염된 CHO 세포으로부터의 배양 상등액 중에서, 배양된 인간 단핵세포 또는 인간 혈청 또는 혈장으로부터의 상등액 중에서 탐지할 수 있었다. 쥐과 TNFSF13b 발현 CHO 세포로부터의 상등액을 ELISA로 반응성을 시험하였고, 음성이었다. 4A5-3.1.1-B4는 또한 쥐과 TNFSF13b를 면역침전시킬 수 없지만 인간 TNFSF13b를 면역침전시킬 수 있었다. 쥐과 TNFSF13b를 실시예 2에 기재된 바와 같이 T1165 증식 분석에 사용하였다. 이 증식 분석을 사용한 결과, 4A5-3.1.1-B4는 쥐과 TNFSF13b에 의해 유도된 증식을 중화시킬 수 없었다. 이는 4A5-3.1.1-B4가 쥐과 TNFSF13b를 인식할 수 없다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 중쇄 4A5-3.1.1-B4의 아미노산 서열
HCVR 및 IgG4 불변 영역을 포함하는 중쇄 4A5-3.1.1-B4 항체의 아미노산 서열을 하기에 나타낸다. 인간 IgG4 불변 영역은 위치 231의 세린을 가졌다. 그러나, 이 위치 231의 세린을 프롤린으로 치환시켜 최적 상호-연쇄 이황화물 결합을 얻기 위해 경첩 지역의 구조적 변화를 도입시켰다. 이는 절반 항체의 생성을 감소시켰다. 절반 항체는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로부터 형성되었다.
또한, 위치 237의 페닐알라닌 치환에 대한 알라닌, 및 위치 238의 루신에 대한 알라닌 또는 글루탐산 치환은 항체의 이펙터 기능을 덜하게 만들 수 있었다.
실시예 8: 중쇄 4A5-3.1.1-B4의 아미노산 서열
HCVR 및 IgG1 불변 영역을 포함하는 중쇄 4A5-3.1.1-B4 항체의 아미노산 서열을 하기에 나타낸다.
실시예 9: 경쇄 4A5-3.1.1-B4의 아미노산 서열
LCVR 및 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄 4A5-3.1.1-B4 항체의 아미노산 서열을 하기에 나타낸다.
실시예 10: 4A5-3.1.1-B4에 대한 에피토프의 확인
4A5-3.1.1-B4가 인간 TNFSF13b에 결합하고 중화시키는 에피토프를 결정하였다. 인간 및 쥐과 TNFSF13b 서열을 하기에 나타낸 바와 같이 정렬시켰다:
몇몇 TNF 족 일원에 대한 공지된 결정 구조에 기초하여 인간 TNFSF13b에 대한 상동성 모델을 만들었다. 4A5-3.1.1-B4가 인간 TNFSF13b를 중화시키지만 마우스 TNFSF13b를 중화시키지 않기 때문에 마우스 및 인간 TNFSF13b 간에 상이한 노출된 잔기는 4A5-3.1.1-B4에 대한 가능한 결합 부위이다.
3 개의 가능한 에피토프는 1) K71, T72, Y73, E105; 2) Q26, S29, L139, D140; 및 3) L53, K55, E56, K119로 확인되었다. 인간에서 마우스로 아미노산 서열을 변화시킴으로써 돌연변이유발을 수행하여 키메라 분자를 만들었다. 키메라 A는 L139R, D140N이고; 키메라 B는 K71P, T72I, Y73F이고; 키메라 C는 K71P, T72I, Y73F, E105K이고; 키메라 D는 L53V, K55R, E56Q이고; 키메라 E는 E105K이었다.
실시예 2에 기재된 바와 같이 증식 분석을 사용하여, 키메라 모두를 4A5-3.1.1-B4에 의한 기능적 활성 및 중화에 대해 시험하였다. 키메라 각각 및 인간 TNFSF13b 및 쥐과 TNFSF13b 부모 분자 모두에 대해 293 일시 형질감염으로부터의 상등액을 사용하여 초기 분석을 수행하였다. 키메라 모두는 유사한 증식을 유도하며, 이는 생성된 키메라가 기능적임을 나타낸다. 4A5-3.1.1-B4 6 ㎕/ml를 사용하며, 인간 TNFSF13b 및 키메라 A, B, D 및 E를 사용하는 경우 100% 중화를 관찰하였다. 쥐과 TNFSF13b 또는 키메라 C에 대해서는 중화가 관찰되지 않았다. 정제된 TNFSF13b 돌연변이체를 키메라 A, B, 및 C에 대해 생산하고, 부모 TNFSF13b 또는 키메라 TNFSF13b 각각 11 ng/ml, 및 4A5-3.1.1-B4 1 ㎕/ml를 사용하며 분석을 반복하였다. 결과는 인간 TNFSF13b 및 키메라 A를 사용하는 경우 100% 중화가 관찰되고, 키메라 B를 사용하는 경우 88% 중화가 관찰되고, 쥐과 TNFSF13b 또는 키메라 C에 대해서는 중화가 관찰되지 않았다는 것을 나타냈다.
실시예 11: 4A5-3.1.1-B4를 사용하는 생체내 연구
문헌 [Fox and Solter, Mol. Cell. Biol. 8: 5470, 1988]에 의해 변경된 바와 같이 문헌 [Hogan, B. et al. (1986)Manipulating Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY]에 기재된 바와 같은 확립된 기술을 사용하여 가용성 인간 TNFSF13b를 과발현하는 유전자이전 마우스를 생성시켰다. 간단하게, hTNFSF13b 유전자를 포함하는 DNA 단편을 FVB/N 세포주의 새롭게 수정된 1-세포-단계 배아 (접합자)의 수컷 전핵 내로 미세주사하였다. 배아를 시험관내에서 밤새 배양시켜 2-세포-단계로 발생시켰다. 2-세포 배아를 이어서 가임신 CD-1 세포주 마우스의 난관에 이식시켜 일정 기간으로 발생시켰다. 신생 마우스 중의 이전유전자의 존재에 대해 시험하기 위해, 발가락의 작은 조각을 각각의 동물로부터 떼어내고, 단백질분해효소 K로 소화시켜 핵산을 유리시켰다. 발가락 추출물의 샘플을 이어서 PCR 분석하여 이전유전자-함유 마우스를 동정하였다.
hTNFSF13b 유전자이전 마우스는 주변 B 세포에서 극적인 증가, 일반적으로 연령 및 성별 상대 한 배 새끼에 비해 약 3 배를 나타냈다. 또한, 말초 T 세포에서 약간의 증가가 있었다. hTNFSF13b 유전자이전 마우스를 4A5-3.1.1-B4로 처리하여 hTNFSF13b 중화가 B 세포 수를 정상 수준으로 감소시키는지 여부를 결정하였다. 15 주 생 암컷 hTNFSF13b 마우스에 4A5-3.1.1-B4 또는 아이소타입 대조군 항체 25㎍을 3 주 동안 주 2 회 피하 주사하였다. 항체 주사 4 일 후에, 마우스를 사망시키고, 비장을 분석을 위해 떼어냈다. 유동 세포측정기를 사용하여 B 세포의 경우 CD19+ 세포 백분율 및 T 세포의 경우 CD3+ 세포의 백분율, 및 각각의 비장에 대한 완전 백혈구 계수를 측정하여 B 및 T 세포 수를 계산하였다. 하기에 나타낸 결과는 hTNFSF13b 유전자이전 마우스에 대한 4A5-3.1.1-B4의 생체내 투여가 T 및 B 세포의 정상 수 (평균 ±표준 편차)로 회복시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
| B 세포 (x106) | T 세포 (x106) | |
| 처리 군 | ||
| 야생형 한 배 새끼 | 29 ±11 | 46 ±15 |
| 유전자이전 + 아이소타입 mAb | 122 ±30 | 75 ±14 |
| 유전자이전 + 4A5 mAb | 29 ±5 | 46 ±12 |
본 발명의 서열:
서열 번호 1 → 경쇄 가변 영역 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 2 → 경쇄 가변 영역 코딩 아미노산 서열
서열 번호 3 → 경쇄 CDR1 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 4 → 경쇄 CDR1 코딩 아미노산 서열
서열 번호 5 → 경쇄 CDR2 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 6 → 경쇄 CDR2 코딩 아미노산 서열
서열 번호 7 → 경쇄 CDR3 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 8 → 경쇄 CDR3 코딩 아미노산 서열
서열 번호 9 → 중쇄 가변 영역 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 10 → 중쇄 가변 영역 코딩 아미노산 서열
서열 번호 11 → 중쇄 CDR1 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 12 → 중쇄 CDR1 코딩 아미노산 서열
서열 번호 13 → 중쇄 CDR2 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 14 → 중쇄 CDR2 코딩 아미노산 서열
서열 번호 15 → 중쇄 CDR3 코딩 폴리뉴클레오티드 서열
서열 번호 16 → 중쇄 CDR3 코딩 아미노산 서열
Claims (41)
- a. 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드;b. 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드;c. 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드;d. 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드;e. 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및f. 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 이상의 폴리펩티드를 포함하는 항-hTNFSF13b 인간 항체.
- 제1항에 있어서,a. 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드;b. 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드;c. 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드;d. 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드;e. 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및f. 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 4 이상의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서,a. 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드;b. 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드;c. 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드;d. 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드;e. 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및f. 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 5 이상의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서,a. 서열 번호 4에 나타낸 LCVR의 CDR1 폴리펩티드;b. 서열 번호 6에 나타낸 LCVR의 CDR2 폴리펩티드;c. 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드;d. 서열 번호 12에 나타낸 HCVR의 CDR1 폴리펩티드;e. 서열 번호 14에 나타낸 HCVR의 CDR2 폴리펩티드; 및f. 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항체.
- 서열 번호 2에 나타낸 경쇄 가변 영역 (LCVR) 폴리펩티드 또는 서열 번호 10에 나타낸 중쇄 가변 영역 (HCVR) 폴리펩티드를 포함하는 항-hTNFSF13b 인간 항체.
- 제5항에 있어서, 서열 번호 2에 나타낸 LCVR 폴리펩티드 및 서열 번호 10에 나타낸 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, KD가 1x 10-8M 이하인 TNFSF13b 폴리펩티드로부터 해리되는 항체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Koff속도 상수가 5 X 10-4s-1이하인 것인 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IC50이 1 x 10-8M 이하인 것인 항체.
- 제9항에 있어서, IC50이 1 x 10-9M 이하인 것인 항체.
- 제10항에 있어서, IC50이 1 x 10-10M 이하인 것인 항체.
- 제11항에 있어서, IC50이 1 x 10-11M 이하인 것인 항체.
- a. Koff속도 상수가 5 X 10-4s-1이하이고;b. 서열 번호 8에 나타낸 LCVR의 CDR3 폴리펩티드를 포함하고;c. 서열 번호 16에 나타낸 HCVR의 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 특성을 갖는 항-hTNFSF13b 인간 항체 .
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgE, 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
- 제14항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG1 또는 IgG4인 것인 항체.
- 제15항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG4인 것인 항체.
- 제16항에 있어서, IgG4가 위치 231에서 세린 대신에 치환된 프롤린을 갖는 것인 항체.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
- 제18항에 있어서, 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CDR이 3 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 것인 항체.
- 제20항에 있어서, CDR이 2 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 것인 항체.
- 제21항에 있어서, CDR이 하나의 보존성 아미노산 치환을 갖는 것인 항체.
- 서열 번호 2에 나타낸 LCVR 폴리펩티드 및 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 10에 나타낸 HCVR 폴리펩티드 및 위치 231에서 세린 대신에 치환된 프롤린을 갖는 IgG4 불변 영역을 갖는 중쇄를 포함하는 항-hTNFSF13b 인간 항체.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물.
- 제26항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, TNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 대상에서의 TNFSF13b 활성의 억제 방법.
- 제28항에 있어서, 질병이 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 천식, 알레르기 질환, 건선, 기관 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 사르코이드증, 감염 질환, 기생충 질환, 여성 불임증, 자가면역 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 하시모토병, 쇼그렌 증후군 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 질병이 암인 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 질병이 기관 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환인 것인방법.
- 제29항에 있어서, 질병이 전신 홍반성 루푸스인 것인 방법.
- TNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 대상에 대한 투여용 의약의 제조에서의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- 제33항에 있어서, 질병이 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 천식, 알레르기 질환, 건선, 기관 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 사르코이드증, 감염 질환, 기생충 질환, 여성 불임증, 자가면역 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 하시모토병, 쇼그렌 증후군 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
- 제34항에 있어서, 질병이 기관 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환인 것인 용도.
- 제36항에 있어서, 질병이 암인 것인 용도.
- 제36항에 있어서, 질병이 전신 홍반성 루푸스인 것인 용도.
- TNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 대상에 대한 투여용 의약의 제조에서, 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신 및 위치 105의 글루탐산을 포함하는 TNFSF13b의 에피토피를 결합시켜 TNFSF13b 활성을 중화시키는 항체의 용도.
- 위치 71의 라이신, 위치 72의 트레오닌, 위치 73의 티로신 및 위치 105의 글루탐산을 포함하는 TNFSF13b의 에피토피를 결합시켜 항체가 중화시키는 것을 지시하는 포장 삽입물을 포함하는 포장재, 및상기 포장재 내에 함유된, TNFSF13b 활성이 해로운 질병을 앓고 있는 인간 대상을 치료 또는 예방하기 위해 TNFSF13b 활성을 중화시키는 항체를 포함하는 제조품.
- 제39항에 있어서, 항체가 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체인 것인 제조품.
- 제40항에 있어서, 항체가 서열 번호 2에 나타낸 LCVR 폴리펩티드 및 서열 번호 10에 나타낸 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 것인 제조품.
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