HRP20040147A2 - Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies - Google Patents

Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies Download PDF

Info

Publication number
HRP20040147A2
HRP20040147A2 HR20040147A HRP20040147A HRP20040147A2 HR P20040147 A2 HRP20040147 A2 HR P20040147A2 HR 20040147 A HR20040147 A HR 20040147A HR P20040147 A HRP20040147 A HR P20040147A HR P20040147 A2 HRP20040147 A2 HR P20040147A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
antibody
sequence
disease
hcvr
lcvr
Prior art date
Application number
HR20040147A
Other languages
English (en)
Inventor
Valentina Pavlovna Gelfanova
John Edward Hale
Kristine Kay Kikly
Derrick Ryan Witcher
Radhakrishnan Rathnachalam
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23213094&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HRP20040147(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HRP20040147A2 publication Critical patent/HRP20040147A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Obitelj TNF liganada čini većina plejotropnih citokina koji induciraju velik broj staničnih odgovora, uključujući proliferaciju, citotoksičnost, antivirusnu aktivnost, imunoregulatornu aktivnost i transkripcijsku regulaciju nekoliko gena. Obitelj TNF citokina i receptora u posljednjih nekoliko godina značajno se proširila, s napretkom masovnog EST sekvenciranja. TNFSF13b je službeno ime, usvojeno na TNF Kongresu, za BLyS, TALL-1, BAFF, THANK, neutrokin-α i zTNF (v. pregledni članak Locksley i sur. Cell 2001, 104:487). Ljudski TNFSF13b (hTNFSF13b) je membranski protein tipa II od 285 aminokiselina i posjeduje N-terminalno mjesto cijepanja, što omogućuje postojanje topljivog i membranski vezanog proteina. Funkcionalno, čini se da TNFSF13b regulira imune odgovore B-stanica i nekih T-stanica.
Studije sindroma septičkog šoka i drugih poremećaja, koji se javljaju uslijed prekomjernog stvaranja upalnih citokina, pokazale su da oboljeli domaćin često na visoke razine citokina uzvraća otpuštanjem topljivih citokinskih receptora ili sintetiziranjem anti-citokinskih protutijela visokog afiniteta. Postupci liječenja koji imitiraju takve prirodne odgovore smatraju se održivim terapijskim pristupima za ublažavanje bolesti posredovane citokinima. Tako je prepoznata potreba za ljudskim protutijelima koja vežu citokine, kao što je TNFSF13b, a koji su uključeni u regulaciju staničnih imunih odgovora, s visokim afinitetom i koja imaju kapacitet da djeluju suprotno aktivnosti ciljnog citokina in vitro i in vivo. Iako međunarodna patentna prijava WO 00/50597 nedeskriptivno objavljuje protutijela usmjerena na TNFSF13b, ta prijava specifično ne opisuje strukturne ili funkcionalne osobine takvih protutijela.
Ovaj izum daje anti-hTNFSF13b ljudska protutijela, ili njihove dijelove za vezanje antigena. Protutijela ovog izuma karakterizirana su visokim afinitetom vezanja za TNFSF13b polipeptide, sporom kinetikom disocijacije i mogućnošću pobijanja bar jedne aktivnosti povezane s TNFSF13b polipeptidima, in vitro i/ili in vivo.
Ovaj izum također daje anti-hTNFSF13b ljudska protutijela koja sadrže polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:2, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:4, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:6, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:8, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:10, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:12, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:14 i polipeptida prikazanog u sekvenci id. br.:16.
U drugom ostvarenju, izum daje izolirano anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo koje veže hTNFSF13b polipeptid i disocira tog polipeptida s konstantom brzine Koff od 1×10-4 s-1 ili manje, kako je određeno rezonancijom površinskog plazmona, ili koje inhibira proliferaciju potaknutu TNFSF13b u testu neutralizacije in vitro s IC50 od 1×10-8 M ili manje.
U poželjnom ostvarenju, izum daje izolirano anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sljedećih karakteristika:
a) inhibira proliferaciju potaknutu TNFSF13b u testu neutralizacije in vitro s IC50 od 1×10-8 M ili manje;
b) posjeduje CDR3 teškog lanca s aminokiselinskom sekvencom id. br.:16; i
c) posjeduje CDR3 lakog lanca s aminiokiselinskom sekvencom id. br.:8.
Izum također daje postupke liječenja ili sprečavanja akutnih ili kroničnih bolesti ili stanja povezanih s aktivnošću B-stanica i nekih T-stanica, uključujući, ali bez ograničenja, autoimune bolesti, kao što je sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis i/ili neoplazija, a koji obuhvaćaju primjenu anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela ovog izuma.
U drugom ostvarenju, ovaj izum daje sekvence koje kodiraju nova anti-hTNFSF13b ljudska protutijela, vektore koji sadrže polinukleotidne sekvence koje kodiraju anti-hTNFSF13b ljudska protutijela, stanice domaćine transformirane vektorima s ugrađenim polinukleotidima koji kodiraju anti-hTNFSF13b ljudska protutijela, formulacije koje sadrže anti-hTNFSF13b ljudska protutijela i postupke njihove izrade i upotrebe.
U još jednom ostvarenju, ovaj izum daje epitop antigena za koji se veću nova anti-hTNFSF13b ljudska protutijela. Tako izum također omogućuje upotrebu protutijela koje veže epitop ovog izuma i time neutralizira aktivnost TNFSF13b za liječenje ili sprečavanje akutnih ili kroničnih bolesti ili stanja povezanih s aktivnošću B-stanica i nekih T-stanica, uključujući, ali bez ograničenja, autoimune bolesti, kao što je sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis i/ili neoplazija, a koji obuhvaćaju primjenu anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela ovog izuma.
Izum također obuhvaća proizvod koji sadrži materijal za pakiranje i protutijelo unutar njega, gdje protutijelo neutralizira aktivnost TNFSF13b u cilju liječenja ili prevencije ljudskog bića koje boluje od poremećaja u kojem je aktivnost TNFSF13b štetna, i gdje materijal za pakiranje sadrži umetak koji ukazuje da protutijelo neutralizira vezanjem epitopa TNFSF13b, pri čemu epitop sadrži lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73 i glutaminsku kiselinu na položaju 105; te umetak koji omogućuje primjenu oblika doziranja koji rezultira neutraliziranjem aktivnosti TNFSF13b.
Slika 1. Graf prikazuje inhibiciju proliferacije T1165.17 stanica potaknute hTNFSF13b i IL-1, djelovanjem ljudskog protutijela 4A5-3.1.1-B4.
Slika 2. Graf prikazuje neutralizaciju proliferacije potaknute hTNFSF13b, djelovanjem ljudskog protutijela 4A5-3.1.1-B4 u primarnim ljudskim B-stanicama stimuliranima anti-IgM.
U cilju boljeg razumijevanja ovog izuma, najprije su definirani neki pojmovi.
Protutijelo je molekula imunoglobulina koja se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (heavy, H) lanca (oko 50-70 kDa) i dva laka (light, L) lanca (oko 25 kDa), međusobno povezanih disulfidnim vezama. Laki lanci grupirani su kao kapa i lambda. Teški lanci grupirani su kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon, i definiraju izotip protutijela kao IgG, IgM, IgA, IgD, odnosno IgE. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilne regije teškog lanca (ovdje skraćena kao HCVR) i konstantne regije teškog lanca. Konstantna regija teškog lanca sastoji se od tri domene, CH1, CH2 i CH3 za IgG, IgD i IgA, odnosno četiri domene, CH1, CH2, CH3 i CH4 za IgM i IgE. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilne regije lakog lanca (ovdje skraćena kao LCVR) i konstantne regije lakog lanca. Konstantna regija lakog lanca sastoji se od jedne domene, CL. HCVR i LCVR regije mogu se dalje podijeliti u hipervarijabilne regije, nazvane regijama za određivanje komplementarnosti (CDR), između kojih su konzerviranije regije, nazvane okvirnim regijama (FR). Svaka HCVR i LCVR sastoji se od tri CDR i četiri FR, poredanima od amino-kraja do karboksi-kraja na sljedeći način: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Pripisivanje pojedinih aminokiselina određenim domenama provodi se u skladu s dobro poznatim konvencijama [Kabat i sur., Sequences of Proteins of Immunological Inteerst, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication br. 91-3242 (1991); Chothia i sur., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia i sur., Nature 342:878-883 (1989)]. Funkcionalne osobine protutijela za vezanje određenog antigena određene su putem CDR.
U ovom tekstu, izraz "protutijelo" odnosi se na monoklonsko protutijelo samo po sebi. Monoklonsko protutijelo može biti ljudsko protutijelo, kimerno protutijelo, humanizirano protutijelo, Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 ili jednolančani FV fragment. Poželjno je kad se izraz "protutijelo" odnosi na ljudsko protutijelo.
Izraz "ljudsko protutijelo" uključuje protutijela čije varijabilne i konstantne regije odgovaraju ljudskim osnovnim imunoglobulinskim sekvencama. Ljudska protutijela imaju nekoliko prednosti pred kimernim protutijelima ili protutijelima različitog podrijetla, namijenjenima upotrebi u ljudskoj terapiji. Na primjer, izvršni dio ljudskog protutijela može bolje interagirati s drugim dijelovima ljudskog imunog sustava (npr. učinkovitije razarati ciljne stanice djelovanjem citotoksičnosti ovisne o komplementu (CDC) ili stanične citotoksičnosti ovisne o protutijelu (ADCC)). Druga prednost je utoliko što ljudski imuni sustav ne bi trebao prepoznati ljudsko protutijelo kao strano i prema tome odgovor protutijela na takva injicirana protutijela bio bi slabiji nego protiv potpuno stranih protutijela porijekla različitog od čovjeka, ili djelomično stranih kimernih protutijela. Nadalje, pokazalo se da je poluživot injiciranih protutijela, koja nisu ljudskog porijekla, u ljudskoj cirkulaciji znatno kraći od poluživota ljudskih protutijela. Injicirana ljudska protutijela imat će u biti identičan poluživot kao prirodna ljudska protutijela, što omogućuje davanje manjih i manje učestalih doza.
Izraz "hTNFSF13b" odnosi se na ljudski oblik člana obitelji liganada faktora nekroze tumora, opisanih u međunarodnim patentnim prijavama WO98/18921 i WO00/50597 (gdje se nazivaju neutrokin-α). Izraz "TNFSF13b" obuhvaća hTNFSF13b, kao i njegove homologe iz drugih vrsta. Izrazi "hTNFSF13b" i "TNFSF13b" uključuju i njihove oblike koje je moguće prirediti uobičajenim postupcima rekombinantne ekspresije ili komercijalno nabaviti (Research Diagnostics Inc. Catalog No. RDI-3113, rhuBAFF, Flanders, N.J.), kao i sintetski proizvedene oblike.
Izrazi "biološko svojstvo", "biološka osobina" i izraz "aktivnost", u odnosu na protutijelo ovog izuma, ovdje su korišteni naizmjence i uključuju, ali bez ograničenja, afinitet i specifičnost epitopa (npr. anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo koje veže hTNFSF13b), sposobnost suprotstavljanja aktivnosti ciljnog polipeptida (npr. aktivnosti TNFSF13b), stabilnost protutijela in vivo i imunogena svojstva protutijela. Druga prepoznatljiva biološka svojstva ili osobine protutijela, poznata struci, uključuju, na primjer, kros-reaktivnost (tj. s homolozima ciljnog polipeptida koji nisu ljudskog porijekla, ili općenito s drugim proteinima ili tkivima), te sposobnost očuvanja visokih razina ekspresije proteina u stanicama sisavaca. Spomenuta svojstva ili osobine mogu se primijetiti ili mjeriti upotrebom tehnika poznatih struci, koje uključuju, ali bez ograničenja, ELISA, kompetitivnu ELISA, rezonanciju površinskog plazmona, testove neutralizacije in vitro i in vivo (npr. Primjer 2) i imunohistokemiju s tkivnim prerezima iz različitih izvora, uključujući čovjeka, primata, ili bilo koji drugi izvor po potrebi. Određene aktivnosti i biološka svojstva anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela opisana su detaljnije u Primjerima u nastavku.
Fraza "kontaktni položaj" uključuje aminokiselinski položaj u CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilne regije teškog lanca ili varijabilne regije lakog lanca protutijela, koji je zauzet aminokiselinom koja kontaktira s antigenom. Ukoliko s antigenom kontaktira aminokiselina iz CDR, smatra se da ta aminokiselina zauzima kontaktni položaj.
"Konzervativna supstitucija" ili "konzervativna supstitucija aminokiseline" odnosi se na supstitucije aminokiselina, bilo zbog prirodnih mutacija ili ljudske manipulacije, pri čemu su protutijela dobivena takvim supstitucijama u biti jednake (ili poboljšane ili smanjene, kako je već poželjno) aktivnosti kao ovdje opisana protutijela.
Izraz "epitop", kako je ovdje korišten, odnosi se na regiju proteinske molekule na koju se veže protutijelo. "Imunogeni epitop" definiran je kao dio proteina koji potiče odgovor protutijela kad je cijeli protein imunogen.
Izraz "vezanje", kako je ovdje korišten, odnosi se općenito na interakciju protutijela s epitopom antigena. Specifičnije, izraz "vezanje" odnosi se na afinitet protutijela prema epitopu antigena. Mjera afiniteta je KD.
Izraz "inhibirati" ili "inhibicija" uključuje opće prihvaćeno značenje, što uključuje neutraliziranje, zabranu, sprečavanje, ograničavanje, usporavanje, zaustavljanje ili obrtanje napredovanja ili težine bolesti ili stanja.
Izraz "neutraliziranje" ili "antagoniziranje" u smislu anti-TNFSF13b protutijela ili fraza "protutijelo koje antagonizira aktivnost TNFSF13b" odnosi se na protutijelo ili fragment protutijela čije vezanje za TNFSF13b ima za posljedicu inhibiciju biološke aktivnosti potaknute polipeptidima TNFSF13b. Inhibicija biološke aktivnosti TNFSF13b može se procijeniti mjerenjem jednog ili više indikatora biološke aktivnosti TNFSF13b in vivo, uključujući, ali bez ograničenja, proliferaciju potaknutu TNFSF13b, lučenje imunoglobulina potaknuto TNFSF13b, sprečavanje apoptoze B-stanica potaknuto TNFSF13b ili inhibiciju receptorskog vezivanja u testu vezivanja TNFSF13b receptora. Indikatori biološke aktivnosti TNFSF13b mogu se odrediti jednim ili više testova in vitro ili in vivo, poznatima u struci (v., na primjer, Moore P.A. i sur., Science, 285:260-263 (1999); Schneider P. i sur., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Shu H. i sur., J. Leuko. Biol., 65:680-683 (1999); Mukhopadhyay A. i sur., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999); Mackay F. i sur., J. Exp. Med., 190:1697-1710 (1999); Gross J.A. i sur., Nature, 404:995-999 (2000); kao i Primjer 2). Poželjno je da se sposobnost protutijela da neutralizira ili antagonizira aktivnost TNFSF13b određuje inhibicijom proliferacije B-stanica, kako je prikazano u Primjeru 2.
Izraz "Koff", kako je ovdje korišten, odnosi se na konstantu brzine otpuštanja za disocijaciju protutijela iz kompleksa protutijelo/antigen.
Izraz "KD", kako je ovdje korišten, odnosi se na konstantu brzine disocijacije ili brzinu otpuštanja, podijeljenu s brzinom vezivanja, određene interakcije protutijelo/antigen. U svrhu ovog izuma, KD je određena kako je prikazano u Primjeru 4.
"Izolirano" protutijelo je ono koje je identificirano i izdvojeno i/ili prikupljeno iz komponente njegovog prirodnog okoliša. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okoliša su materijali koji bi interferirali s dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama protutijela, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske i neproteinske otopljene tvari. Uobičajeno je da se pročišćeno protutijelo priprema u bar jednom koraku pročišćavanja. U poželjnim ostvarenjima, protutijelo će se pročistiti (1) više od 95% u odnosu na težinu protutijela, što se određuje Lowry-evom metodom, a još bolje više od 99% težine, i (2) do homogenosti, SDS-PAG elektroforezom, u reducirajućim ili nereducirajućim uvjetima, uz upotrebu Coomassie blue ili, još bolje, bojanja srebrom. Poželjno je da je "izolirano protutijelo" ono koje je u biti čisto od drugih protutijela s različitim antigenim specifičnostima (npr. izolirano protutijelo koje specifično veže hTNFSF13b, u biti čisto od protutijela koja specifično vežu antigene koji su različiti od polipeptida hTNFSF13b).
Fraza "molekula nukleinske kiseline" uključuje molekule DNA i RNA. Molekula nukleinske kiseline može biti jednolančana ili dvolančana, ali poželjno je da je to dvolančana DNA.
Fraza "izolirana molekula nukleinske kiseline", kako je ovdje korištena u odnosu na nukleinske kiseline koje kodiraju protutijela ili fragmente protutijela (npr. HCVR, LCVR, CDR3) koji vežu polipeptid hTNFSF13b, uključuje molekulu nukleinske kiseline u kojoj su nukleotidne sekvence koje kodiraju protutijelo ili njegov dio čiste od drugih nukleotidnih sekvenci koje bi kodirale protutijela ili njihove fragmente koji vežu antigene različite od polipeptida hTNFSF13b, a koje mogu prirodno graničiti s nukleinskom kiselinom u ljudskoj genomskoj DNA. Tako, na primjer, izolirana nukleinska kiselina ovog izuma, koja kodira regiju HCVR ljudskog protutijela anti-hTNFSF13b ne sadrži nikakve druge sekvence koje bi kodirale regije HCVR, a koje vežu antigene različite od polipeptida hTNFSF13b.
Izraz "vektor" uključuje molekulu nukleinske kiseline koja može prenijeti drugu nukleinsku kiselinu koja je na nju vezana. Jedan tip vektora je "plazmid", što je kružna dvolančana petlja DNA u koju je moguće ligirati dodatne segmente DNA. Drugi tip vektora je virusni vektor, gdje su dodatni segmenti DNA ligirani u genom virusa. Neki vektori mogu se samostalno replicirati u stanici domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko ishodište replikacije i episomalni vektori sisavca). Drugi vektori (npr. ne-episomalni vektori sisavaca) mogu se integrirati u genom stanice domaćina nakon uvođenja u stanicu, i time se repliciraju zajedno s genomom domaćina. Nadalje, neki vektori mogu usmjeravati ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori ovdje su nazvani "rekombinantni ekspresijski vektori" (ili, jednostavnije, "ekspresijski vektori"). Općenito, ekspresijski vektori korišteni u tehnikama rekombinantne DNA često se nalaze u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, pojmovi "plazmid" i "vektor" mogu se koristiti uzajamno, budući da je plazmid najčešće korišten oblik vektora. Međutim, izum uključuje i druge oblike ekspresijskih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi, adenovirusi ili adeno-asocirani virusi, koji se ne mogu replicirati), koji imaju ekvivalentne funkcije.
Nukleinska kiselina je "operativno" vezana, kad je postavljena u funkcionalni odnos s drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primjer, DNA za presekvencu ili sekrecijskii vodeći signal operativno je vezana za DNA polipeptida ukoliko se ovaj eksprimira kao preprotein koji sudjeluje u lučenju polipeptida; promotor ili pojačivač su operativno vezani za kodirajuću sekvencu ako utječu na njezinu transkripciju; ili, mjesto vezanja ribosoma je operativno vezano za kodirajuću sekvencu ukoliko je postavljeno tako da olakšava translaciju. Općenito, "operativno vezano" znači da su povezane sekvence DNA susjedne i, u slučaju sekrecijskog vodećeg signala, susjedne i unutar okvira čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susjedni. Vezanje se postiže ligacijom na uobičajenim restrikcijskim mjestima. Ukoliko takva mjesta ne postoje, koriste se sintetski oligonukleotidni adapteri ili "linkeri", prema uobičajenoj praksi.
Izraz "rekombinantni" u odnosu na protutijelo uključuje protutijela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolirana na rekombinantni način. Reprezentativni primjeri uključuju protutijela eksprimirana pomoću rekombinantnog ekspresijskog vektora transfeciranog u stanicu domaćina, protutijela izolirana iz rekombinantne kombinirane biblioteke ljudskih protutijela, protutijela izolirana iz životinje (npr. miša) koja je transgenična za ljudske imunoglobulinske gene ili protutijela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolirana na bilo koji način koji uključuje cijepanje sekvence ljudskog imunoglobulinskog gena i vezanje za druge sekvence DNA. Takva rekombinantna ljudska protutijela imaju varijabilne i konstantne regije porijeklom iz osnovnih ljudskih imunoglobulinskih sekvenci.
Fraza "rekombinantna stanica domaćin" (ili, jednostavnije, "stanica domaćin") uključuje stanicu u koju je uveden rekombinantni ekspresijski vektor. Treba razumjeti da se takvi izrazi ne odnose samo na određenu, pojedinačnu stanicu, već i na njezino potomstvo. Budući da se u sljedećim generacijama mogu desiti određene modifikacije, bilo zbog mutacije ili utjecaja okoliša, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično roditeljskoj stanici, ali još uvijek je uključeno u opseg izraza "stanica domaćin", kako je ovdje korišteno.
Rekombinantna ljudska protutijela mogu također biti izložena mutagenezi in vitro (ili, kad su korišteni životinjski transgeni za ljudske Ig sekvence, somatskoj mutagenezi in vivo), pa tako aminokiselinske sekvence regija HCVR i LCVR rekombinantnih protutijela su sekvence koje, iako potječu od sekvenci srodnih osnovnim ljudskim sekvencama HCVR i LCVR, ne moraju prirodno postojati unutar repertoara ljudskih osnovnih protutijela in vivo.
Mogu se koristiti transgenične životinje (npr. miševi) koje mogu, po imunizaciji, proizvesti potpuni repertoar ljudskih protutijela u odsutnosti endogene proizvodnje imunoglobulina. Prijenos ljudskog osnovnog imunoglobulinskog niza gena u takve miševe s mutiranom osnovnom linijom uzrokovat će proizvodnju ljudskih protutijela nakon izazova antigenom (v., npr., Jakobovits i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555 (1993); Jakobovits i sur., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann i sur., Year in Immun. 7:33 (1993), Nature, 148:1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross J.A. i sur., Nature 404:995-999 (2000); te U.S. patente br. 5 877 397, 5 874 299, 5 814 318, 5 789 650, 5 770 429, 5 661 016, 5 633 425, 5 625 126, 5 569 825 i 5 545 806 (svaki je ovdje uključen citatom u svojoj potpunosti za sve namjene)). Ljudska protutijela mogu se također proizvoditi u bibliotekama za prikaz faga (Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks i sur., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Tehnike opisane u Cole i sur., i Boerner i sur., također su dostupne za pripremu ljudskim monoklonskih protutijela (Cole i sur., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) i Boerner i sur., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)).
"Spremnik" znači bilo kakvu posudu ili kutiju za pohranjivanje, transport, dispeniju i/ili rukovanje farmaceutskim proizvodom.
"Materijal za pakiranje" odnosi se na sredstvo, lako za rukovanje, koje omogućuje uobičajenu primjenu i/ili pomoćna sredstva koja pomažu u davanju, edukaciji i/ili primjeni. Materijal za pakiranje može poboljšati primjenu protutijela, omogućiti platformu za ekonomske studije poboljšanja zdravlja i/ili ograničiti opterećenje distribucijske mreže. Također, materijal za pakiranje može uključivati, ali bez ograničenja, pakiranje na osnovi papira, smanjeno pakiranje, pakiranje prozirno na vrhu, pokusne kupone, edukacijske materijale, pomoćna sredstva i/ili sredstvo za davanje.
"Umetak u pakiranju" znači informaciju koja prati proizvod i koja daje opis kako primijeniti proizvod, zajedno s podacima o sigurnosti i učinkovitosti, potrebnima liječniku, farmaceutu i pacijentu da bi donijeli informiranu odluku o upotrebi proizvoda, i/ili informaciju za edukaciju pacijenta. Umetak u pakiranju općenito se smatra "oznakom" farmaceutskog proizvoda.
"Jedinka" se odnosi na sisavca, poželjno čovjeka, kojem je potrebno liječenje. U smislu ovog izuma, jedinke kojima je potrebno liječenje uključuju sisavce koji boluju, ili su skloni bolovanju od bolesti u kojima je štetna aktivnost TNFSF13b, na primjer, imunih bolesti, uključujući autoimune bolesti, i upalnih bolesti. Poželjne bolesti uključuju, ali bez ograničenja, sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis, juvenilni kronični artritis, Lyme-ov artritis, Crohnovu bolest, ulcerativni kolitis, upalnu bolest crijeva, astmu, alergijske bolesti, psorijazu, bolest graft-versus-host, odbacivanje presađenog organa, akutne ili kronične imune bolesti povezane s presađivanjem organa, sarkoidozu, zarazne bolesti, parazitske bolesti, neplodnost žena, autoimunu trombocitopeniju, autoimunu bolest štitnjače, Hashimotovu bolest, Sjogrenov sindrom i karcinome, naročitno limfome ili mijelome B ili T-stanica.
U sljedećim potpoglavljima detaljnije su opisani različiti aspekti ovog izuma.
Ovaj se izum odnosi na ljudska monoklonska protutijela koja su specifična za bioaktivne polipeptide hTNFSF13b i neutraliziraju ih. Također su objavljene aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca protutijela koje su visoko specifične za polipeptide TNFSF13b i neutraliziraju ih prilikom vezivanja. Ova visoka specifičnost omogućuje da ljudska anti-hTNFSF13b monoklonska protutijela i ljudska monoklonska protutijela sa sličnom specifičnošću budu imunoterapija bolesti povezanih s TNFSF13b.
U jednom aspektu, izum daje izolirano ljudsko protutijelo koje sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci prikazanima u sekvencama id. br. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16, i koje veže polipeptidni epitop TNFSF13b s visokim afinitetom, disocira s vezanog polipeptida TNFSF13b s niskom konstantom Koff od 1×10-4 s-1 ili manjom, i ima mogućnost antagoniziranja aktivnosti polipeptida TNFSF13b. U jednom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine: polipeptid CDR1 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 4; polipeptid CDR2 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 6; polipeptid CDR3 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 8; polipeptid CDR1 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 12; polipeptid CDR2 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 14; i polipeptid CDR3 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 16. U drugom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži bar dva polipeptida izabrana iz grupe koju čine: polipeptid CDR1 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 4; polipeptid CDR2 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 6; polipeptid CDR3 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 8; polipeptid CDR1 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 12; polipeptid CDR2 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 14; i polipeptid CDR3 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 16. U još jednom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži bar tri polipeptida izabrana iz grupe koju čine: polipeptid CDR1 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 4; polipeptid CDR2 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 6; polipeptid CDR3 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 8; polipeptid CDR1 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 12; polipeptid CDR2 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 14; i polipeptid CDR3 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 16. U još jednom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži bar četiri polipeptida izabrana iz grupe koju čine: polipeptid CDR1 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 4; polipeptid CDR2 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 6; polipeptid CDR3 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 8; polipeptid CDR1 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 12; polipeptid CDR2 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 14; i polipeptid CDR3 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 16. U još jednom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži bar pet polipeptida izabrana iz grupe koju čine: polipeptid CDR1 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 4; polipeptid CDR2 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 6; polipeptid CDR3 iz LCVR, prikazan u sekvenci id. br. 8; polipeptid CDR1 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 12; polipeptid CDR2 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 14; i polipeptid CDR3 iz HCVR, prikazan u sekvenci id. br. 16. U još jednom ostvarenju, anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži polipeptide CDR1 polipeptida LCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 4, CDR2 polipeptida LCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 6; CDR3 polipeptida LCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 8; CDR1 polipeptida HCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 12; CDR2 polipeptida HCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 14 i CDR3 polipeptida HCVR, prikazanog u sekvenci id. br. 16.
Poželjnije je da anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži, kao varijabilnu regiju lakog lanca (LCVR), polipeptid prikazan u sekvenci id. br. 2 ili, kao varijabilnu regiju teškog lanca (HCVR), polipeptid prikazan u sekvenci id. br. 10. Još je poželjnije da anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo sadrži LCVR polipeptid prikazan u sekvenci id. br. 2 i HCVR polipeptid prikazan u sekvenci id. br. 10.
U poželjnim ostvarenjima, izolirano ljudsko protutijelo disocira s vezanog polipeptida TNFSF13b s Koff konstantom brzine od 5×10-5 s-1 ili manjom, i inhibira proliferaciju potaknutu TNFSF13b u testu neutralizacije in vitro s IC50 od 1×10-7 M ili manjom. U poželjnijim ostvarenjima, izolirano ljudsko protutijelo disocira s vezanog polipeptida TNFSF13b s Koff konstantom brzine od 1×10-5 s-1 ili manjom, i inhibira proliferaciju potaknutu TNFSF13b u testu neutralizacije in vitro s IC50 od 1×10-8 M ili manjom. U još poželjnijem ostvarenju, izolirano ljudsko protutijelo disocira s vezanog polipeptida TNFSF13b s Koff konstantom brzine od 5×10-6 s-1 ili manjom, i inhibira proliferaciju potaknutu TNFSF13b u testu neutralizacije in vitro s IC50 od 1×10-9 M ili manjom. Primjeri anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela koja ispunjavaju spomenute kinetičke i neutralizacijske kriterije uključuju protutijela 4A5-3.1.1-B4.
Najpoželjnije anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo ovog izuma ovdje se navodi kao 4A5-3.1.1-B4. 4A5-3.1.1-B4 ima polipeptidne sekvence LCVR i HCVR prikazane u sekvencama id. br. 2, odnosno id. br. 10. Polinukleotidna sekvenca koja kodira LCVR i HCVR 4A5-3.1.1-B4 prikazana je sekvencama id. br. 1, odnosno id. br. 9. Svojstva anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela ovog izuma specifično su prikazana u Primjerima. Naročito su upadljivi visok afinitet za polipeptid TNFSF13b, spora kinetika disocijacije i visok kapacitet antagoniziranja aktivnosti polipeptida TNFSF13b, što pokazuju 4A5-3.1.1-B4.
Koff anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela može se odrediti rezonancijom površinskog plazmona, kako je općenito opisano u Primjeru 4. Općenito, rezonancija površinskog plazmona mjeri vezne interakcije u stvarnom vremenu između liganda (rekombinantnog polipeptida TNFSF13b imobiliziranog na biosenzornom matriksu) i analita (protutijela u otopini) rezonancijom površinskog plazmona (engl. surface plasmon resonance, SPR) pomoću BIAcore sustava (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). SPR analiza može se također provesti imobiliziranjem analita (protutijela na biosenzornom matriksu) i prezentiranjem liganda (rekombinantni TNFSF13b u otopini).
U jednom aspektu, ovaj izum također je usmjeren prema staničnim linijama koje proizvode anti-hTNFSF13b ljudska protutijela ovog izuma. Izolacija staničnih linija koje proizvode monoklonska protutijela ovog izuma može se postići rutinskim preglednim tehnikama, poznatima u struci. Hibridom koji proizvodi anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo ovog izuma pohranjen je u ATCC (ATCC PTA-3674), kako je ovdje objavljeno.
Moguće je koristiti velik broj domaćinskih ekspresijskih sustava za ekspresiju protutijela ovog izuma, uključujući bakterijske, kvaščeve, bakulovirusne, biljne ekspresijske sustave te ekspresijske sustave sisavaca (kao i ekspresijske sustave prikaza faga). Primjer prikladnog bakterijskog ekspresijskog vektora je pUC119 (Sfi). Drugi ekspresijski sustavi protutijela također su poznati u struci i ovdje su razmatrani.
Protutijelo ovog izuma može se prirediti rekombinantnom ekspresijom imunoglobulinskih gena za lake i teške lance u domaćinskoj stanici. Za rekombinantnu ekspresiju protutijela, domaćinska stanica transfecira se jednim ili više rekombinatnih ekspresijskih vektora koji sadrže fragmente DNA koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance protutijela, tako da su laki i teški lanci eksprimirani u domaćinskoj stanici. Poželjno je da se rekombinantna protutijela izlučuju u medij u kojem su uzgojene domaćinske stanice, odakle se ta protutijela lako mogu prikupiti. Za dobivanje gena za teške i lake lance protutijela, njihovu ugradnju u rekombinantne ekspresijske vektore i uvođenje vektora u domaćinske stanice korištene su standardne metode rekombinantne DNA.
Izolirana DNA koja kodira HCVR regiju može se prevesti u potpuni gen za teški lanac operativnim vezivanjem DNA koja kodira HCVR za drugu molekulu DNA, koja kodira konstantne regije teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence DNA konstantnih regija gena za ljudske teške lance protutijela poznate su u struci, a fragmenti DNA koji omeđuju te regije mogu se dobiti uobičajenom PCR amplifikacijom. Konstantna regija teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, kao i bilo koja njihova alotipska varijanta, kako je opisano u Kabat (Kabat i sur., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication 91-3242 (1991)), ali najpoželjnije konstantne regije su IgG1 ili IgG4. Alternativno, dio protutijela može biti Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 ili jednolančani FV fragment. Za Fab fragment gena za teški lanac, DNA koja kodira HCVR može se operativno vezati za drugu molekulu DNA koja kodira samo za konstantnu regiju CH1 teškog lanca.
Izolirana DNA koja kodira LCVR regiju može se provesti u potpuni gen za laki lanac (kao i gen za Fab lakog lanca) operativnim vezivanjem DNA koja kodira LCVR za drugu molekulu DNA, koja kodira konstantnu regiju lakog lanca, CL. Sekvence DNA konstantnih regija gena za ljudske lake lance protutijela poznate su u struci, a fragmenti DNA koji omeđuju te regije mogu se dobiti uobičajenom PCR amplifikacijom. Konstantna regija lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantna regija.
Da bi se kreirao gen scFV, fragmenti DNA koji kodiraju HCVR i LCVR operativno su vezani za drugi fragment koji kodira fleksibilni linker, npr. kodira aminokiselinsku sekvencu Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser (Gly4-Ser)3, tako da se HCVR i LCVR sekvence mogu eksprimirati kao susjedni, jednolančani proteini, pri čemu su LCVR i HCVR regije spojene fleksibilnim linkerom (v. npr. Bird i sur., Science 242:423-426 (1988); Huston i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty i sur., Nature 348:552-554 (1990)).
Za ekspresiju protutijela ovog izuma, DNA koje kodiraju djelomične ili potpune teške i lake lance, dobivene kako je gore opisano, ugrađene su u ekspresijske vektore, tako da su geni operativno vezani za transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence. Gen za protutijelo ligiran je u vektor tako da transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence unutar vektora služe namjeravanoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena za protutijelo. Ekspresijski vektor i ekspresijske kontrolne sekvence izabrane su tako da su kompatibilne s ekspresijom korištene domaćinske stanice. Geni za laki i teški lanac protutijela mogu se ugraditi u odvojene vektore ili, tipičnije, oba su gena ugrađena u isti ekspresijski vektor. Geni za protutijela ugrađeni su u ekspresijski vektor standardnim postupcima (npr. ligacija komplementarnih restrikcijskih mjesta na fragmentu gena za protutijelo i vektoru, ili ligacija tupih krajeva, ukoliko nema restrikcijskih mjesta). Nadalje, ili alternativno, rekombinantni ekspresijski vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela iz stanice domaćina. Gen za neki od lanaca anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela može se klonirati u vektor tako da je signalni peptid vezan, u okviru, za amino-kraj gena za lanac protutijela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski ili heterologni signalni peptid (npr. iz neimunoglobulinskog proteina).
Osim gena za lance protutijela, rekombinantni ekspresijski vektori ovog izuma mogu imati regulacijske sekvence koje kontroliraju ekspresiju gena za lance protutijela u stanici domaćinu. Regulacijske sekvence obuhvaćaju promotore, pojačivače i druge ekspresijske kontrolne elemente (npr. poliadenilacijske signale) koji kontroliraju transkripciju ili translaciju gena za lance protutijela. Stručnjaci područja primijetit će da dizajn ekspresijskog vektora, uključujući i izbor regulacijskih sekvenci, može ovisiti o raznim faktorima, kao što su izbor domaćinske stanice koja će se transformirati, željena razina ekspresije proteina, itd. Poželjne regulacijske sekvence za ekspresiju u domaćinskim stanicama sisavaca uključuju virusne elemente koji omogućuju visoke razine ekspresije proteina u stanicama sisavaca, kao što su promotori i/ili pojačivači porijeklom iz citomegalovirusa (CMV), kao što je CMV promotor/pojačivač, virusa SV40 (kao što je SV40 promotor/pojačivač), adenovirus (npr. glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma.
Osim gena za lance protutijela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresijski vektori ovog izuma mogu imati i dodatne sekvence, kao što su sekvence koje reguliraju replikaciju vektora u domaćinskim stanicama (npr. ishodišta replikacije) i selekcijske gene-markere. Selekcijski gen-marker olakšava selekciju domaćinskih stanica u koje je vektor uveden. Na primjer, tipičan selekcijski gen-marker daje domaćinskoj stanici, u koju je vektor uveden, otpornost na lijekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat. Poželjni selektivni geni-markeri uključuju gen za dihidrofolat-reduktazu (DHFR), za upotrebu u dhfr-domaćinskim stanicama uz selekciju/amplifikaciju metotreksatom, i gen neo (za selekciju pomoću G418).
Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresijski vektor(i) koji kodiraju teške i lake lance transfeciraju se u domaćinsku stanicu standardnim tehnikama. Različiti oblici izraza "transfekcija" trebali bi obuhvatiti širok raspon tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNA u prokariotsku ili eukariotsku domaćinsku stanicu, npr. elektroporaciju, precipitaciju s kalcijevim fosfatom, transfekciju pomoću DEAE-dekstrana i slično. Iako je teoretski moguće eksprimirati protutijela ovog izuma i u prokariotskim i u eukariotskim domaćinskim stanicama, ekspresija protutijela u eukariotskim stanicama, a naročito u domaćinskim stanicama sisavaca, najpoželjnija je zato što je za takve eukariotske stanice, a naročito stanice sisavaca, vjerojatnije, u usporedbi s prokariotskim stanicama, da sklapaju i luče pravilno smotano i imunološki aktivno protutijelo. Poželjne domaćinske stanice sisavaca za ekspresiju rekombinantnih protutijela ovog izuma uključuju stanice jajnika kineskog hrčka (CHO stanice) (uključujući dhfr-CHO stanice, opisane u Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980), korištene uz DHFR selektivni marker, npr., kako je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp, Mol. Biol., 159:601-621 (1982)); NS0 mijelomske stanice, COS stanice i SP2 stanice. Kad se rekombinantni ekspresijski vektori, koji sadrže gene za protutijela, uvode u domaćinske stanice sisavaca, protutijela se proizvode uzgojem domaćinskih stanica u kulturi kroz vremenski period koji je dovoljan za ekspresiju protutijela u stanici domaćinu ili, što je poželjnije, sekreciju protutijela u medij u kojem su domaćinske stanice uzgajane. Protutijela se iz medija mogu prikupiti pomoću standardnih metoda za pročišćavanje proteina.
Domaćinske stanice također se mogu koristiti za proizvodnju dijelova cijelih protutijela, kao što su Fab fragmenti scFV molekula. Razumljivo je da su varijacije gornjeg postupka unutar opsega ovog izuma. Na primjer, može biti poželjno transfecirati domaćinsku stanicu DNA koja kodira bilo za laki, bilo za teški lanac (ali ne za oboje) protutijela ovog izuma. Tehnologija rekombinantne DNA može se također upotrijebiti za uklanjanje neke ili sve DNA koja kodira bilo za laki ili za teški lanac, ili za oba tipa lanaca, a koja nije potrebna za vezivanje hTNFSF13b. Molekule koje eksprimiraju takve krnje molekule DNA također su obuhvaćene protutijelima ovog izuma. U jednom od sustava za rekombinantnu ekspresiju protutijela ovog izuma, rekombinantni ekspresijski vektor koji kodira i za teški i za laki lanac protutijela uveden je u dhfr-CHO stanice transfekcijom pomoću kalcijevog fosfata. Unutar rekombinantnog ekspresijskog vektora, geni za teški i laki lanac protutijela operativno su vezani za pojačivačke/promotorske regulacijske elemente (npr. porijeklom iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što su pojačivač iz CMV/promotorski regulacijski element AdMLP, ili pojačivač SV40/promotorski regulacijski element AdMLP) koji omogućuju postizanje visoke razine transkripcije gena. Rekombinantni ekspresijski vektor također nosi gen DHFR, koji omogućuje selekciju CHO stanica koje su transfecirane vektorom pomoću selekcije/amplifikacije metotreksatom. Selektirane transformirane domaćinske stanice uzgojene su tako da omogućuju ekspresiju teških i lakih lanaca protutijela, a cjelovito protutijelo prikuplja se iz hranjivog medija. Za pripremu rekombinantnog ekspresijskog vektora, transfekciju domaćinske stanice, selekciju transformanata, uzgoj domaćinskih stanica i prikupljanje protutijela iz hranjivog medija, korištene su standardne tehnike molekularne biologije. Protutijela ovog izuma ili njihovi fragmenti koji vežu antigen mogu se eksprimirati u životinji (npr. mišu) koja je transgenična za ljudske imunoglobulinske gene (v. npr. Taylor L.D. i sur., Nucl. Acids Res., 20:6287-6295 (1992)). Biljne stanice također je moguće modificirati kreiranjem transgeničnih biljaka koje eksprimiraju protutijelo ovog izuma, ili njegov fragment koji veže antigen.
Imajući u vidu navedeno, drugi aspekt ovog izuma odnosi se na nukleinske kiseline, vektore i domaćinske stanice koje je moguće koristiti za rekombinantnu ekspresiju protutijela i dijelova protutijela ovog izuma. Poželjno je da izum odražava nukleinske kiseline koje kodiraju CDR 4A5-3.1.1-B4, ili potpune varijabilne regije teškog i/ili lakog lanca 4A5-3.1.1-B4. U skladu s time, u jednom ostvarenju, izum se odnosi na izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca protutijela, i to CDR3 teškog lanca 4A5-3.1.1-B4 i obuhvaća aminokiselinsku sekvenu id. br. 16. Poželjno je da nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca protutijela, još kodira CDR2 teškog lanca 4A5-3.1.1-B4, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 14. Još je bolje da nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca protutijela, kodira i CDR1 teškog lanca 4A5-3.1.1-B4, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 12. Čak je još bolje da izolirana nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca protutijela, obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 10 (potpuna regija HCVR 4A5-3.1.1-B4).
U drugim ostvarenjima, izum se odnosi na izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca, i to CDR3 lakog lanca 4A5-3.1.1-B4 i obuhvaća aminokiselinsku sekvenu id. br. 8. Poželjno je da nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca protutijela, još kodira CDR1 lakog lanca 4A5-3.1.1-B4, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 4. Čak je još bolje da izolirana nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca protutijela, obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 2 (potpuna regija LCVR 4A5-3.1.1-B4).
U drugim ostvarenjima, izum se odnosi na izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca, i to CDR3 lakog lanca 4A5-3.1.1-B4 i obuhvaća aminokiselinsku sekvenu id. br. 8. Poželjno je da nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca protutijela, još kodira CDR1 lakog lanca 4A5-3.1.1-B4, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 4. Čak je još bolje da izolirana nukleinska kiselina, koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca protutijela, obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 2 (potpuna regija LCVR 4A5-3.1.1-B4).
U još jednom ostvarenju, izum daje izoliranu nukleinsku kiselinu koaj kodira CDR3 domenu teškog lanca, koja obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 16 (tj. CDR3 HCVR 4A5-3.1.1-B4). Ta nukleinska kiselina može kodirati samo CDR3 regiju ili, poželjnije, kodira cijelu varijabilnu regiju teškog lanca protutijela (HCVR). Na primjer, nukleinska kiselina može kodirati HCVR tako da sadrži CDR2 domenu koja obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 14 (tj. CDR2 HCVR 4A5-3.1.1-B4) i CDR1 domenu koja obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 12 (tj. CDR1 HCVR 4A5-3.1.1-B4).
U još jednom ostvarenju, izum daje izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca protutijela, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 2 (tj. LCVR 4A5-3.1.1-B4). Poželjno je da ta nukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu id. br. 1, iako će stručnjak područja primijetiti da, zbog degeneriranosti genetičkog koda, i druge nukleotidne sekvence mogu kodirati aminokiselinsku sekvencu id. br. 2. Nukleinska kiselina može kodirati samo LCVR, ili može također kodirati konstantne regije lakog lanca protutijela, operativno vezane na LCVR. U jednom ostvarenju, ta je nukleinska kiselina rekombinantni ekspresijski vektor.
U još jednom ostvarenju, izum daje izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca protutijela, što obuhvaća aminokiselinsku sekvencu id. br. 10 (tj. HCVR 4A5-3.1.1-B4). Poželjno je da ta nukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu id. br. 9, iako će stručnjak područja primijetiti da, zbog degeneriranosti genetičkog koda, i druge nukleotidne sekvence mogu kodirati aminokiselinsku sekvencu id. br. 10. Nukleinska kiselina može kodirati samo HCVR, ili može također kodirati konstantne regije lakog lanca protutijela, operativno vezane na HCVR. Na primjer, nukleinska kiselina može sadržati konstantne regije IgG1 ili IgG4. U jednom ostvarenju, ta je nukleinska kiselina rekombinantni ekspresijski vektor.
Stručnjaci područja svjesni su da modifikacije aminokiselinske sekvence protutijela mogu rezultirati protutijelom koje pokazuje ekvivalentne ili poboljšane funkcionalne osobine u usporedbi s originalnim protutijelom. Promjene protutijela ovog izuma mogu uključivati jednu ili više aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, skraćenja, fuzija i slično, bilo od prirodnih mutacija ili ljudskom manipulacijom. Ovaj izum obuhvaća ovdje objavljena protutijela koja sadrže još jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, uz uvjet da supstituirana protutijela imaju u biti jednake (ili poboljšane ili smanjene, kako je već poželjno) aktivnosti kao i ovdje objavljena protutijela. Poželjno je da CDR ovog izuma ima tri ili manje konzervativnih supstitucija. Poželjno CDR ovog izuma ima dvije ili manje konzervativnih supstitucija. Poželjno je da CDR ovog izuma ima jednu konzervativnu supstituciju. Stručnjak područja prepoznat će da se protutijela s konzervativnim supstitucijama aminokiselina mogu prirediti različitim tehnikama, poznatima struci. Na primjer, moguće je koristiti razne metode mutageneze, uključujući PCR, Kunkel (dut-ung-) i tiofosfatnu (Amersham Sculptor kit) mutagenezu usmjerenu oligonukleotidima. Konzervativne supstitucije od interesa prikazane su u Tablici 1, zajedno s poželjnim supstitucijama.
Tablica 1. Konzervativne supstitucije
[image]
Izum također daje rekombinantne ekspresijske vektore koji kodiraju protutijelo koje sadrži polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida, prikazanog u sekvenci id. br.2, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 4, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 6, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 8, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 10, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 12, polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 14 i polipeptida prikazanog u sekvenci id. br. 16.
Izum također daje rekombinantne ekspresijske vektore koji kodiraju i teški i laki lanac protutijela. Na primjer, u jednom ostvarenju, izum daje rekombinantni ekspresijski vektor koji kodira:
a) teški lanac protutijela čija varijabilna regija sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 10; i
b) laki lanac protutijela čija varijabilna regija sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 2.
Kad su jednom eksprimirana, cijela protutijela, njihovi dimeti, pojedini laki i teški lanci ili drugi oblici imunoglobulina ovog izuma mogu se pročistiti prema standardnim postupcima struke, uključujući taloženje s amonij-sulfatom, razne kromatografije (ionsko-izmjenjivačku, afinitetnu, obrnutih faza, hidrofobnih interakcija na koloni), gel-elektroforezu i slično. Za farmaceutsku upotrebu, poželjni su u biti čisti imunoglobulini od barem oko 90 do oko 95% homogenosti, a još bolje 98% do 99% ili višom homogenosti. Kad su jednom pročišćeni, djelomično ili do željene homogenosti, polipeptidi se mogu koristiti terapeutski ili profilaktički, kako je ovdje prikazano.
Protutijela ovog izuma mogu se ugraditi u farmaceutske pripravke prikladne za primjenu u jedinke. Tipično, farmaceutski pripravaka sadrži protutijelo ili dio protutijela ovog izuma i farmaceutski prihvatljivo sredstvo za razrjeđivanje, nosač i/ili ekscipijent. Farmaceutski pripravci za primjenu dizajnirani su tako da su prikladni za određeni oblik primjene, pa se prema tome koriste i farmaceutski prikladna sredstva za razrjeđivanje, nosači i/ili ekscipijenti, kao što su sredstva za disperziju, puferi, surfaktanti, konzervansi, sredstva za otapanje, sredstva za izotoničnost, stabilizatori i slično.
Farmaceutski pripravak koji sadrži anti-hTNFSF13b ljudsko protutjelo ovog izuma može se primijeniti u sisavcu, uz rizik za pojavu autoimunih simptoma ili patologije, kao što je sistemski lupus erythematosus, uz upotrebu standardnih tehnika primjene intrevenskim, intraperitonealnim, supkutanim, plućnim, transdermalnim, intramuskularnim, intranazalnim, bukalni, sublingvalnim načinom ili u obliku čepića.
Protutijela ovog izuma mogu se ugraditi u farmaceutski pripravaka prikladan za parenteralnu primjenu. Poželjna je periferna sistemska primjena intravenskom, intraperitonealnom ili supkutanom injekcijom. Prikladni nosači za takve injekcije su izravni. Međutim, primjena se može postići i kroz mukozne membrane pomoću nazalnih aerosola ili čepića. Prikladne formulacije za takve načine primjene dobro su poznate i tipično uključuju surfaktante koji olakšavaju prijenos preko membrane.
Farmaceutski pripravci tipično moraju biti sterilni i stabilni u uvjetima proizvodnje i pohrane. Dakle, farmaceutski pripravci mogu se sterilno filtrirati nakon pripreme formulacije, ili se na neki drugi način učine mikrobiološki prihvatljivima. Tipični sastav za intravensku infuziju može imati volumen od 250 mL tekućine, kao što je sterilna Ringerova otopina, i 1-100 mg na mL, ili više, koncentracije protutijela. Terapeutska sredstva ovog izuma mogu biti smrznuta ili liofilizirana za pohranu i rekonstituirana u prikladnom sterilnom nosaču prije upotrebe. Liofilizacija i rekonstitucija mogu dovesti do različitih stupnjeva gubitka aktivnosti protutijela (npr. kod konvencionalnih imunoglobulina, IgM protutijela obično teže većem gubitku aktivnosti od IgG protutijela). Doziranje se može tako prilagoditi da kompenzira taj gubitak. pH formulacije odabire se tako da uravnoteži stabilnost protutijela (kemijsku i fizikalnu) i udobnost pacijenta prilikom primjene. Općenito, podnosi se pH između 6 i 8.
TNFSF13b igra kritičnu ulogu u patologiji povezanoj s različitim bolestima koje uključuju imune i upalne faktore. Prema tome, farmaceutski pripravak koji sadrži anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo ovog izuma može se koristiti u liječenju bolesti u kojima je aktivnost TNFSF13b štetna, na primjer, imunih bolesti, uključujući autoimune bolesti i upalne bolesti. Poželjne bolesti uključuju, ali bez ograničenja, sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis, juvenilni kronični artritis, Lyme-ov artritis, Crohnovu bolest, ulcerativni kolitis, upalnu bolest crijeva, astmu, alergijske bolesti, psorijazu, bolest graft-versus-host, odbacivanje presađenog organa, akutne ili kronične imune bolesti povezane s presađivanjem organa, sarkoidozu, zarazne bolesti, parazitske bolesti, neplodnost žena, autoimunu trombocitopeniju, autoimunu bolest štitnjače, Hashimotovu bolest, Sjogrenov sindrom i karcinome, naročitno limfome ili mijelome B ili T-stanica.
Poželjnije je da se farmaceutski pripravak koji sadrži anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo i/ili fragment protutijela ovog izuma koristi za liječenje bolesti sistemski lupus erythematosus.
Upotreba protutijela anti-hTNFSF13b ljudskog protutijela ovog izuma u proizvodnji lijeka za liječenje bar jedne od prethodno nabrojanih bolesti u kojima je aktivnost TNFSF13b štetna također je ovdje razmatrana.
U nekim situacijama, protutijelo ovog izuma će se formulirati ili primijeniti zajedno s jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava koja se koriste u liječenju autoimunih i/ili upalnih bolesti. Takve kombinacijske terapije imaju prednost da mogu koristiti niže doze primijenjenih terapijskih sredstava, čime se izbjegava moguća toksičnost ili komplikacije povezane s raznim monoterapijama. Stručnjak praktičar primijetit će da, kad se protutijela ovog izuma koriste kao dio kombinacijske terapije, može biti poželjna manja doza protutijela, u usporedbi s primjenom samog protutijela (npr., kroz kombinacijsku terapiju moguće je postići sinergistički terapijski učinak koji, nadalje, omogućuje primjenu niže doze protutijela za postizanje željenog terapijskog učinka).
Farmaceutski pripravci ovog izuma mogu uključivati "terapijski učinkovitu količinu" ili "profilaktički učinkovitu količinu" protutijela ovog izuma. "Terapijski učinkovita količina" odnosi se na količinu učinkovitu, u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog terapijskog rezultata. Terapijski učinkovita količina protutijela može varirati, ovisno o faktorima kao što su status bolesti, dob, spol i težina pojedinca, te sposobnosti protutijela ili dijela protutijela da potakne željeni odgovor u pojedincu. Terapijski učinkovita količina također je ona u kojoj su toksični ili štetni učinci protutijela ili dijela protutijela prevladani terapijski povoljnim učincima. "Profilaktički učinkovita količina" odnosi se na količinu učinkovitu, u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, budući da se profilaktička doza koristi u jedinke prije ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički učinkovita količina bit će manja od terapeutski učinkovite količine.
Režim doziranja može se prilagoditi tako da daje optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primjer, može se primijeniti jedan bolus, ili nekoliko doza podijeljenih u vremenu, ili se doza može proporcionalno smanjivati ili povećavati, kako je vidljivo iz potrebe terapijske situacije.
Zbog svoje sposobnosti da vežu hTNFSF13b, protutijela ovog izuma mogu se koristiti za detekciju TNFSF13b polipeptida (npr. u biološkom uzorku, kao što su serum ili plazma), pomoću uobičajenog imunotesta, kao što je enzimski vezani imunotest (engl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), radioimunotest (RIA) ili tkivna imunohistokemija. Izum daje postupak za detekciju TNFSF13b u biološkom uzorku, što obuhvaća kontaktiranje biološkog uzorka s protutijelom, ili dijelom protutijela ovog izuma i detekciju bilo protutijela (ili dijela protutijela) vezanog na hTNFSF13b, ili nevezanog protutijela (ili dijela protutijela), da bi se time detektirao hTNFSF13b u biološkom uzorku. Protutijelo je direktno ili indirektno obilježeno spojem kojeg je moguće detektirati, da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog protutijela. Prikladne tvari za detekciju uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale i radioaktivne materijale. Primjeri prikladnih enzima uključuju peroksidazu iz hrena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu ili acetilkolin-esterazu; primjeri prikladnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primjeri prikladnih fluorescentnih materijala uključuju ubeliferon, fluorescein, fluorescein-izotiocijanat, rodamin, diklorotriazinil-amin-fluorescein, danzil-klorid ili fikoeritrin; primjer luminiscentnog materijala je luminol; a primjeri prikladnih radioaktivnih materijala uključuju 125I, 131I, 35S ili 3H.
Osim obilježavanja protutijela, TNFSF13b se može ispitati u biološkim tekućinama kompeticijskim imunotestom uz korištenje TNFSF13b standarda obilježenih spojem kojeg je moguće detektirati, i neobilježenog ljudskog anti-hTNFSF13b protutijela. U ovom testu, biološki uzorak, obilježeni standarni TNFSF13b i anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo se kombiniraju i određuje se količina obilježenog TNFSF13b standarda vezanog na neobilježeno protutijelo. Količina TNFSF13b u biološkom uzorku obrnuto je proporcionalna količini obilježenog hTNFSF13b standarda vezanog na anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo.
U drugom ostvarenju, ovaj izum daje upotrebu protutijela koje neutralizira aktivnost TNFSF13b vezanjem epitopa TNFSF13b. Epitop je identificiran kako je opisano u Primjeru 10. Za referencu, topljivi dijelovi hTNFSF13b prikazani su kako slijedi:
[image]
Aminokiseline hTNFSF13b, uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b protutijela, sadrže bar jednu od aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73, glutaminska kiselina na položaju 105, treonin na položaju 106, leucin na položaju 107 i asparagin na položaju 109. U drugom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela, sadrže bar dvije aminokiseline izabrane iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73, glutaminska kiselina na položaju 105, treonin na položaju 106, leucin na položaju 107 i asparagin na položaju 109. U još jednom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela, sadrže bar tri aminokiseline izabrane iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73, glutaminska kiselina na položaju 105, treonin na položaju 106, leucin na položaju 107 i asparagin na položaju 109. U još jednom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela, sadrže bar četiri aminokiseline izabrane iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73, glutaminska kiselina na položaju 105, treonin na položaju 106, leucin na položaju 107 i asparagin na položaju 109.
U drugom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73 i glutaminsku kiselinu na položaju 105.
U drugom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju glutaminsku kiselinu na položaju 105 i bar jednu od aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72 i tirozin na položaju 73. U još jednom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju treonin na položaju 106 i bar jednu od aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72 i tirozin na položaju 73. U još jednom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju leucin na položaju 107 i bar jednu od aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72 i tirozin na položaju 73. U još jednom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju asparagin na položaju 109 i bar jednu od aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: treonin na položaju 69, lizin na položaju 71, treonin na položaju 72 i tirozin na položaju 73.
U drugom ostvarenju, aminokiseline uključene u vezanje novih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela uključuju lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73 i glutaminsku kiselinu na položaju 105.
Sljedeći primjeri ilustriraju, ali ne ograničavaju izum.
Primjer 1:
Dobivanje anti-hTNFSF13b ljudskih monoklonskih protutijela
Monoklonska protutijela proizvedena su upotrebom HuMAb-MouseTM tehnologije, Medarex, imuniziranjem miševa topljivim hTNFSF13b (aminokiseline 133-285, nabavljeno od RDI, Flanders, NJ). Korišteni su HCo7 i HCo12 miševi. Miševi su imunizirani s 15 μg do 50 μg topljivog hTNFSF13b u RIBI, Freundovom potpunom adjuvantu ili Freundovom nepotpunom adjuvantu. Osam miševa koji su proizvodili serumski titar protutijela na hTNFSF13b injicirani su i.v. s 10 μg hTNFSF13b u PBS. Tri dana kasnije, od svakog je miša uzeta slezena i fuzionirana s mijelomskim stanicama prema postupku opisanom kod Zole (Zola, H. Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL. (1987)).
Hibridomi su testirani na vezivanje hTNFSF13b i provjereni da zaista eksprimiraju teške i lake lance ljudskih imunoglobulina. Vezanje protutijela na hTNFSF13b detektirano je ELISA testom kako slijedi:
Ploče su prekrivene s 50 μL 5μg/mL hTNFSF13b u PBS preko noći pri 4 °C. Zatim su ploče ispražnjene i blokirane sa 100 μL PBS + 0,05% Tween 20 (PBST) + 5% pilećeg seruma kroz 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon trostrukog ispiranja PBST, ploče su ispražnjene i u svaku jažicu je dodano 100 μL razrijeđenog sekundarnog reagensa (HRP-HuIgGFc, Jackson cat #109-036-098 ili HRP-HuKappa, Bethyl cat #A80-115P; 1:5000 u puferu za blokiranje). Nakon jednosatne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su isprane triput kako je gore opisano. Ploče su razvijene upotrebom 10 mL citrat-fosfatnog pufera pH 4,0, 80 μL ABTS, 8 μL H2O2 po ploči. Nakon inkubacije od 30 min do 1 h na sobnoj temperaturi, očitana je apsorbancija ploča na A415-C490. Hibridomi koji su pokazali vezanje hTNFSF13b i koji su imali huIgG teški i ljudski kapa laki lanac izabrani su za subkloniranje.
Medij stanične kulture subkloniranih hibridoma koncentriran je u Amicon ProFlux M12 tangencijalnom sustavu za filtraciju pomoću Amicon S3Y30 UF membrana. Koncentrirani medij propušten je kroz protein-A/sefaroznu kolonu (kolona od 5 do 20 mL) pri brzini protoka od 5 mL/min. Kolone su isprane puferom A (PBS, pH 7,4) dok se apsorbancija ne povrati na bazalnu, a vezani polipeptidi eluirani su 50 mM limunskom kiselinom, pH 3,2. Frakcije su odmah neutralizirane 1M Tris, pH 8,0. Frakcije su zatim analizirane pomoću SDS-PAGE. Frakcije koje sadrže protutijelo spojene su i koncentrirane pomoću Ultrafree centrifugalne jedinice za filtriranje (Millipore, molekulska masa 10 kDa odrezana).
Primjer 2:
Funkcionalna aktivnost anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela
Neutralizirajuća aktivnost anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela ovog izuma mjerena je na mišjoj IL-1ovisnoj liniji B-stanica, T1165.17. Stanice su isprane triput medijem u kojem se provodi testiranje (RPMI1640 s 10% FBS, 1 mM natrijev piruvat, 5×10-5 M 2-merkaptoetanol i penicilin, streptomicin i fungizon) da bi se uklonio IL-1. Potom su stanice resuspendirane u mediju koji sadrži 2,5 ng/mL topljivog huTNFSF13b, u koncentraciji 100 000 stanica/mL, te su nasađene u koncentraciji 5000 stanica/jažici na ploče od 96 jažica i inkubirane pri 37°C uz 5% CO2. Supernatanti ELISA-pozitivnih hibridoma uključeni su u razrijeđenja 1:4. Četrdeset osam sati kasnije, dodano je 20 μL otopine Promega CellTiter96 Aqueous One Solution (Madison, WI) i ploča je inkubirana daljnjih 5 sati na 37°C uz 5% CO2. Apsorbancija je očitana na A490, kao mjera proliferacije. Primjer neutralizirajuće aktivnosti jednog od hibridomskih supernatanta, 4A5-3.1.1-B4, prikazan je na Slici 1. Kao kontrola, protutijela su dodana IL-1 stimuliranim stanicama. Nije pokazana inhibicija IL-1 potaknute proliferacije, samo proliferacije potaknute hTNFSF13b.
Neutralizirajućim protutijelima ispitana je sposobnost inhibicije proliferacije primarnih ljudskih B-stanica pojačane TNFSF13b, kao odgovor na anti-IgM stimulaciju. Primarne ljudske B-stanice izolirane su iz ljudske krvi pomoću CD19 pozitivne selekcije i upotrebe MACS magnetskog sustava za izolaciju (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). B-stanice dodane su u jažice ploče od 96 jažica, u koncentraciji 2×105 stanica po jažici u potpunom RPMI uz 10% FCS (potpun RPMI je RPMI1640 koji sadrži 10 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, 1 mM natrijevog piruvata, 0,1 mM neesencijalnih aminokiselina i 1×10-5 M β-merkaptoetanola). Neke od jažica prekrivene su s 10 μg/mL anti-ljudskih IgM u PBS (BD PharMingen, klon G20-127), preko noći pri 4°C i isprane su četiri puta s PBS prije upotrebe. Neke od stanica stiulirane su topljivim hTNFSF13b (25 ng/mL) u prisutnosti ili odsutnosti neutralizirajućeg anti-hTNFSF13b protutijela (2,5 μg/mL). Slika 2 prikazuje sposobnost 4A5-3.1.1-B4 da neutraliziraju stimulirajući učinak hTNFSF13b.
Primjer 3:
Karakterizacija monoklonskih protutijela
Sva neutralizirajuća anti-hTNFSF13b protutijela bila su ili ljudski IgG1 ili ljudski IgG4. Također je ispitana njihova sposobnost vezanja hTNFSF13b u denaturiranom stanju, tj. hTNFSF13b razdvojen pomoću SDS-PAGE i prenesen na nitrocelulozu. Nijedno neutralizirajuće protutijelo nije moglo vezati hTNFSF13b u Western blotu, dok su neka od ne-neutralizirajućih protutijela to mogla postići.
Pomoću BIAcore sustava provedeni su pokusi da bi se odredilo vežu li ne-neutralizirajuća i neutralizirajuća protutijela za isto mjesto na hTNFSF13b. Najprije, 4A5-3.1.1-B4 nanesena su na čip, nakon čega je injiciran hTNFSF13b, a zatim zasićena količina ne-neutralizirajućeg protutijela. Kad je postignuto zasićenje, na čip je nanesena visoka koncentracija 4A5-3.1.1-B4. Jedanaest ne-neutralizirajućih monoklonskih protutijela nije moglo kompetirati za isto vezno mjesto kao 4A5-3.1.1-B4. Jedan ne-neutralizirajući hibridom mogao je blokirati vezanje 4A5-3.1.1-B4 približno 45%, što ukazuje da bi mogao imati epitop blizu epitopa 4A5-3.1.1-B4.
Istim eksperimentalnim dizajnom određeno je i da neutralizirajuće mAb, 4A5-3.1.1-B4, može kompetirati za isto vezno mjesto kao jedan od receptora za hTNFSF13b, TACI. Ti pokusi ukazuju da bi TAC1-Fc i 4A5-3.1.1-B4 mogli imati preklapajuće epitope na hTNFSF13b.
4A5-3.1.1-B4 je imobiliziran na čvrstoj fazi propuštanjem otopine protutijela preko IMAC smole s Co2+. Nakon vezanja, kobalt je oksidiran do +3 stanja inkubiranjem smole s razrijeđenom otopinom peroksida. Nakon ispiranja smole, nativni hTNFSF13b i modificirani hTNFSF13b (redukcijom/alkilacijom ili termičkom denaturacijom) propušteni su kroz kolonu. Nakon ispiranja, vezani proteini eluirani su kiselom otopinom i analizirani su MALDI MS. 4A5-3.1.1-B4 vezali su nativni rekombinantni hTNFSF13b, ali nisu vezali ni kemijski ni termički modificiran hTNFSF13b. Dakle, 4A5-3.1.1-B4 prepoznaje konformacijski epitop na topljivom hTNFSF13b.
Rekombinantni topljivi hTNFSF13b (RDI) inkubiran je s 4A5-3.1.1-B4 ili anti-TNFSF13b zečjim poliklonskim protutijelom (MoBiTec, Marco Island, FL; protiv aminokiselina 254-269 hTNFSF13b) na ledu kroz 2 sata i proteinska smjesa nanesena je na HPLC s isključenjem veličine (dvije, tandem TosoHaas TSK-GEL G3000PW kolone), uz ekvilibraciju u PBS i brzinu protoka od 0,25 mL/min. Proteini su eluirani pomoću PBS. Kao kontrole, zasebno su analizirane otopine protutijela i otopina hTNFSF13b. Ljudski TNFSF13b eluiran je s kolone uz isključenje veličine u položaju koji odgovara trimeru TNFSF13b molekula. Elucija trimernih hTNFSF13b pomaknula se na raniju vremensku točku u prisutnosti 4A5-3.1.1-B4, ali ne u prisutnosti poliklonskih anti-TNFSF13b protutijela, što upućuje na vezivanje trimernih hTNFSF13b za 4A5-3.1.1-B4 protutijela. Ovi podaci pokazuju da neutralizirajuća mAb 4A5-3.1.1-B4 vežu konformacijski epitop na hTNFSF13b.
Primjer 4:
Mjerenje afiniteta monoklonskih protutijela BIAcore sustavom
Afinitet raznih anti-hTNFSF13b ljudskih prottuijela za hTNFSF13b mjeren je pomoću BIAcore 2000 instrumentalnog sustava. Sustav koristi optička svojstva rezonancije površinskog plazmona da bi mjerio promjene u koncentraciji proteina molekula u interakciji unutar dekstranskog biosenzornog matriksa. Svi reagensi i materijali nabavljeni su od BIAcore AB (Uppsala, Švedska), ukoliko nije drukčije naznačeno. Sva mjerenja provedena su pri 25°C. Uzorci su otopljeni u HBS-EP puferu (150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (w/v) surfaktant P-20 i 10 mM HEPES, pH 7,4). Kozji anti-mišji IgG (Fc specifičan; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) imobiliziran je na protočnoj stanici 1 na CM5 senzornom čipu pomoću kompleta za sparivanje amina. Kozji anti-ljudski IgG (Fc specifičan; Jackson Immunoresearch) imobiliziran je na protočnoj stanici 2, također pomoću sparivanja amina. Oba protutijela imobilizirana su tako da svako dosegne 700 jedinica odgovora.
Vezanje rekombinantnog hTNFSF13b (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ) mjereno je pomoću višestrukih analitičkih ciklusa. Svaki ciklus proveden je pri brzini protoka od 30 μL/min i sastojao se od sljedećih koraka: injiciranja 150 μL 4A5-3.1.1-B4 u koncentraciji 20 μg/mL, injiciranja 250 μL hTNFSF13b (počevši od 50 nM i slijedeći dvostruka serijska razrijeđenja u svakom ciklusu), nakon čega je uslijedilo 15 minuta za disocijaciju, te regeneracije pomoću 90 μL 10 mM glicin HCl, pH 1,5.
Brzine asocijacije i disocijacije za svaki ciklus određene su pomoću Langmuirovog 1:1 modela vezanja u BIAevaluation softveru. KD 4A5-3.1.1-B4 za hTNFSF13b određena je na 38 pM.
Primjer 5:
Kloniranje i sekvenciranje antigen-vezujućih regija teških i lakih lanaca
Varijabilne regije teškog i lakog lanca za neutralizaciju ljudskih mAb 4A5-3.1.1-B4 klonirane su i sekvencirane prema sljedećim protokolima.
mRNA je priređena iz 2×106 hibridomskih stanica pomoću Micro-Fast Track protokola (Invitrogen) priloženog uz komplet. cDNA je pripremljena iz 200 μL etanolnog taloga mRNA pomoću kompleta cDNA Cycle kit (Invitrogen) rotiranjem alikvota mRNA kroz 30 min pri 14000 rpm i 4 °C, nakon čega je talog ispran 70%-tnim etanolom. Talog, osušen na zraku, resuspendiran je u 11,5 μL sterilne vode i priređena je cDNA pomoću uputa proizvođača. Eventualni drugi ciklus sinteze cDNA je izostavljen, ali cDNA je pročišćena ekstrakcijom fenol/kloroformom i taloženjem etanolom. Talog cDNA resuspendiran je u 30 μL TE za upotrebu u PCR.
PCR reakcije postavljene su s degeneriranim početnicama na 5' kraju varijabilne regije za teški i laki lanac, sparenima s 3' početnicama u konstantnoj regiji. Za svaku reakciju od 50 μL korišten je alikvot od 1 μL cDNA. Reakcija je postavljena s PfuI i 20 ciklusa. PCR produkti provjereni su na 1%-tnom agaroznom gelu. Produkti pozitivnih reakcija klonirani su pomoću kompleta Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen). Minipreparacije pozitivnih klonova sekvencirane su i analizirani su produktivni rearanžmani geni. Rezultati neovisnih PCR reakcija i sekvenciranja višestrukih klonova otkrili su sekvence, kao što je opisano u nastavku.
[image]
[image]
Primjer 6:
Vrsna kros-reaktivnost ljudskih anti-hTNFSF13b ljudskih protutijela s TNFSF13b koja nisu ljudskog porijekla
U cilju određivanja vrsne kros-reaktivnosti neutralizirajućih mAb, postavljena je ELISA uz korištenje 4A5-3.1.1-B4 kao mAb i za hvatanje i za detekciju. Kao standardna krivulja korišteni su ljudski rekombinantni TNFSF13b. Ljudski TNFSF13b može se detektirati u supernatantu kulture CHO stanica transfeciranih vektorom koji eksprimira hTNFSF13b, supernatantu kulture ljudskih monocita ili ljudskom serumu ili plazmi. Supernatanti CHO stanica koje eksprimiraju mišji TNFSF13b ispitani su na reaktivnost ELISA testom i pokazali su se negativni. 4A5-3.1.1-B4 također nije mogao imunoprecipitirati mišji TNFSF13b, ali mogao je imunoprecipitirati ljudski TNFSF13b. Mišji TNFSF13b korišten je u testu proliferacije, opisanom u Primjeru 2. U ovom testu proliferacije, 4A5-3.1.1-B4 nije mogao neutralizirati proliferaciju potaknutu mišjim TNFSF13b. To ukazuje da 4A5-3.1.1-B4 ne može prepoznati mišji TNFSF13b.
Primjer 7:
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 4A5-3.1.1-B4
U nastavku je dana aminokiselinska sekvenca teškog lanca protutijela 4A5-3.1.1-B4, koja obuhvaća HCVR i IgG4 konstantnu regiju. Ljudska IgG4 konstantna regija ima serin na položaju 231. Međutim, na ovom položaju 231 serin je zamijenjen prolinom, što uvodi strukturnu promjenu u regiji "šarke", da bi se postigle optimalne međulančane disulfidne veze. To smanjuje stvaranje polovičnih protutijela. Polovična protutijela sastoje se od jednog teškog i jednog lakog lanca.
Sekvenca id. br. 17
[image]
Osim toga, mogu se napraviti supstitucije alanina za fenilalanin na položaju 237 te alanina ili glutaminske kiseline za leucin na položaju 238, da bi se ublažila efektorska funkcija protutijela.
Primjer 8:
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 4A5-3.1.1-B4
U nastavku je aminokiselinska sekvenca teškog lanca protutijela 4A5-3.1.1-B4, koja obuhvaća HCVR i IgG1 konstantnu regiju.
Sekvenca id. br. 18
[image]
Primjer 9:
Aminokiselinska sekvenca lakog lanca 4A5-3.1.1-B4
U nastavku je aminokiselinska sekvenca lakog lanca protutijela 4A5-3.1.1-B4, koja obuhvaća LCVR i kapa konstantnu regiju.
Sekvenca id. br. 19
[image]
Primjer 10:
Identifikacija epitopa 4A5-3.1.1-B4
Određen je epitop na koji se 4A5-3.1.1-B4 vežu i neutraliziraju ljudski TNFSF13b. Ljudske i mišje sekvence TNFSF13b poravnate su kako je prikazano u nastavku:
[image]
Na temelju poznate kristalne strukture za neke članove TNF obitelji kreiran je homologan model za ljudski TNFSF13b. Izloženi ostaci, koji se razlikuju između mišjeg i ljudskog TNFSF13b, potencijalna su vezna mjesta za 4A5-3.1.1-B4, budući da 4A5-3.1.1-B4 neutralizira ljudski, ali ne i mišji TNFSF13b.
Identificirana su tri potencijalna epitopa: 1) K71, T72, Y73, E105; 2) q26, S29, L139, D140; i 3) L53, K55, E56, K119. Provedena je mutageneza, da bi se napravile kimerne molekule promjenom aminokiselinske sekvence od ljudske u mišju. Kimera A bila je L139R, D140N; kimera B bila je K71P, T721I, Y73F; kimera C bila je K71P, T72I, Y73F, E105K; kimera D bila je L53V, K55R, E56Q; kimera E bila je E105K.
Pomoću testa proliferacije, opisanog u Primjeru 2, svim je kimerama testirana funkcionalna aktivnost i neutralizacija djelovanjem 4A5-3.1.1-B4. Početni testovi provedeni su na supernatantima iz 293 prolazne transfekcije za svaku kimeru, te za roditeljske molekule ljudske i mišje TNFSF13b. Sev su kimere potaknule sličnu proliferaciju, što ukazuje da su dobivene kimere funkcionalne. Uz 6 μg/mL 4A5-3.1.1-B4, opažena je 100%-tna neutralizacija s ljudskim TNFSF13b i kimerama A, B, D i E. Nije opažena neutralizacija za mišji TNFSF13b ili kimeru C. Pročišćeni TNFSF13b mutanti dobiveni su za kimere A, B i C, te je test ponovljen uz upotrebu 11 ng/mL svakog roditeljskog TNFSF13b ili kimeru TNFSF13b i 1 μg/mL 4A5-3.1.1-B4. Pokazana je 100%-tna neutralizacija s ljudskim TNFSF13b i kimerom A, 88%-tna neutralizacija s kimerom B, a neutralizacija je izostala za mišji TNFSF13b ili kimeru C.
Primjer 11:
Studije in vivo uz upotrebu 4A5-3.1.1-B4
Transgenični miševi koji prekomjerno eksprimiraju topljivi ljudski TNFSF13b dobiveni su pomoću uspostavljenih tehnika opisanih u Hogan, B. i sur. (1986) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY i modificiranih u Fox i Solter (Mol. Cell Biol. 8:5470, 1988). Ukratko, fragment DNA koji obuhvaća gen za hTNFSF13b mikroinjiciran je u muške projezgre upravo oplođenih jednostaničnih embrija (zigota) soja FVB/N. Embriji su uzgojeni u kulturi in vitro preko noći da se omogući razvoj u dvostanični stadij. Dvostanični embriji su zatim presađeni u jajovode lažno skotnih miševa soja CD-1, da im se omogući razvoj. Da bi se ispitala prisutnost transgena u novorođenih miševa, svakoj životinji uklonjen je komadić nožnog prsta i razgrađen proteinazom K, da bi se oslobodile nukleinske kiseline. Uzorak ekstrakta prsta zatim je proveden kroz PCR analizu da bi se identificirali miševi koji sadrže transgen.
hTNFSF13b transgenični miševi imali su značajan porast perifernih B-stanica, općenito oko triput, u usporedbi s kontrolama iste dobi i spola. Također je postojao lagani porast perifernih T-stanica. hTNFSF13b transgenični miševi tretirani su 4A5-3.1.1-B4, da se odredi bi li neutralizacija hTNFSF13b rezultirala smanjenjem broja B-stanica na normalne razine. 15 tjedana stare ženke hTNFSF13b miševa injicirane su supkutano dvaput tjedno tijekom tri tjedna s 25 μg 4A5-3.1.1-B4 ili izotipom kontrolnog protutijela. Četiri dana nakon zadnje injekcije protutijela, miševi su žrtvovani, a slezena je uzeta za analizu. Broj B i T-stanica izračunat je određivanjem postotka CD19+ stanica, za B-stanice i CD3+ stanica, za T-stanice, upotrebom protočne citometrije i određivanjem apsolutnog broja bijelih krvnih stanica za svaku slezenu. Rezultati prikazani u nastavku pokazuju da primjena 4A5-3.1.1-B4 in vivo u hTNFSF13b transgeničnih miševa može uspostaviti normalni broj T i B-stanica (srednja vrijednost ± standardna devijacija).
[image]
[image]
[image]

Claims (47)

1. Anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo, naznačeno time da sadrži bar tri sekvence izabrane iz grupe koju čine: sekvenca id. br. 4, smještena u CDR1 varijabilne regije lakog lanca (LCVR); sekvenca id. br. 6, smještena u CDR2 LCVR; sekvenca id. br. 8, smještena u CDR3 LCVR; sekvenca id. br. 12, smještena u CDR1 varijabilne regije teškog lanca (HCVR); sekvenca id. br. 14, smještena u CDR2 HCVR; i sekvenca id. br. 16, smještena u CDR3 HCVR.
2. Protutijelo iz zahtjeva 1, naznačeno time da sadrži bar četiri sekvence izabrane iz grupe koju čine: sekvenca id. br. 4, smještena u CDR1 varijabilne regije lakog lanca (LCVR); sekvenca id. br. 6, smještena u CDR2 LCVR; sekvenca id. br. 8, smještena u CDR3 LCVR; sekvenca id. br. 12, smještena u CDR1 varijabilne regije teškog lanca (HCVR); sekvenca id. br. 14, smještena u CDR2 HCVR; i sekvenca id. br. 16, smještena u CDR3 HCVR.
3. Protutijelo iz zahtjeva 1, naznačeno time da sadrži bar pet sekvenci izabranih iz grupe koju čine: sekvenca id. br. 4, smještena u CDR1 varijabilne regije lakog lanca (LCVR); sekvenca id. br. 6, smještena u CDR2 LCVR; sekvenca id. br. 8, smještena u CDR3 LCVR; sekvenca id. br. 12, smještena u CDR1 varijabilne regije teškog lanca (HCVR); sekvenca id. br. 14, smještena u CDR2 HCVR; i sekvenca id. br. 16, smještena u CDR3 HCVR.
4. Protutijelo iz zahtjeva 1, naznačeno time da sadrži sekvence: sekvencu id. br. 4, smještenu u CDR1 varijabilne regije lakog lanca (LCVR); sekvencu id. br. 6, smještenu u CDR2 LCVR; sekvencu id. br. 8, smještenu u CDR3 LCVR; sekvencu id. br. 12, smještenu u CDR1 varijabilne regije teškog lanca (HCVR); sekvencu id. br. 14, smještenu u CDR2 HCVR; i sekvencu id. br. 16, smještenu u CDR3 HCVR.
5. Anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo, naznačeno time da kao varijabilnu regiju lakog lanca (LCVR) sadrži polipeptid prikazan sekvencom id. br. 2, ili, kao varijabilnu regiju teškog lanca (HCVR), polipeptid prikazan sekvencom id. br. 10.
6. Protutijelo iz zahtjeva 5, naznačeno time da sadrži LCVR polipeptid, prikazan sekvencom id. br. 2 i HCVR polipeptid, prikazan sekvencom id. br. 10.
7. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 6, naznačeno time da protutijelo disocira s polipeptida TNFSF13b konstantom KD od 1×10-8 M ili manjom.
8. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 7, naznačeno time da protutijelo ima konstantnu brzine Koff od 5×10-4 s-1 ili manju.
9. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 8, naznačeno time da protutijelo ima IC50 od 1×10-8 M ili manju.
10. Protutijelo iz zahtjeva 9, naznačeno time da protutijelo ima IC50 od 1×10-9 M ili manju.
11. Protutijelo iz zahtjeva 10, naznačeno time da protutijelo ima IC50 od 1×10-10 M ili manju.
12. Protutijelo iz zahtjeva 11, naznačeno time da protutijelo ima IC50 od 1×10-11 M ili manju.
13. Anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo, naznačeno time da posjeduje sljedeće karakteristike: konstantu Koff od 5×10-4 s-1 ili manju; polipeptid sekvence id. br. 8, smješten u CDR3 LCVR; i polipeptid sekvence id. br. 16, smješten u CDR3 HCVR.
14. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 13, naznačeno time da sadrži konstantnu regiju teškog lanca izabranu iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgE i IgD.
15. Protutijelo iz zahtjeva 14, naznačeno time da je konstantna regija teškog lanca IgG1 ili IgG4.
16. Protutijelo iz zahtjeva 15, naznačeno time da je konstantna regija teškog lanca IgG4.
17. Protutijelo iz zahtjeva 16, naznačeno time da je u IgG4 na položaju 231 serin zamijenjen prolinom.
18. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 17, naznačeno time da sadrži kapa ili lambda konstantnu regiju lakog lanca.
19. Protutijelo iz zahtjeva 18, naznačeno time da sadrži kapa konstantnu regiju lakog lanca.
20. Protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 19, naznačeno time da CDR ima tri ili manje od tri konzervativne supstitucije aminokiselina.
21. Protutijelo iz zahtjeva 20, naznačeno time da CDR ima dvije ili manje konzervativne supstitucije aminokiselina.
22. Protutijelo iz zahtjeva 21, naznačeno time da CDR ima jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.
23. Anti-hTNFSF13b ljudsko protutijelo, naznačeno time da sadrži u lakom lancu sadrži LCVR polipeptid prikazan sekvencom id. br. 2 i kapa konstantnu regiju, a u teškom lancu HCVR polipeptid prikazan sekvencom id. br. 10 i IgG4 konstantnu regiju, u kojoj je na položaju 231 serin zamijenjen prolinom.
24. Izolirana nukleinska kiselina, naznačena time da kodira aminokiselinsku sekvencu bilo kojeg od protutijela iz zahtjeva 1 do 23.
25. Rekombinantni ekspresijski vektori, naznačeni time da kodiraju protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1 do 23.
26. Farmaceutski pripravak, naznačen time da sadrži protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1-23.
27. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 26, naznačen time da još sadrži i farmaceutski prihvatljiv nosač.
28. Postupak inhibicije aktivnosti TNFSF13b u jedinke koja boluje od bolesti u kojoj je aktivnost TNFSF13b štetna, naznačen time da obuhvaća primjenu protutijela iz bilo kojeg od zahtjeva 1-23.
29. Postupak iz zahtjeva 28, naznačen time da je bolest izabrana iz grupe koju čine sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis, juvenilni kronični artritis, Lyme-ov artritis, Crohnova bolest, ulcerativni kolitis, upalna bolest crijeva, astma, alergijske bolesti, psorijaza, bolest graft-versus-host, odbacivanje presađenog organa, akutne ili kronične imune bolesti povezane s presađivanjem organa, sarkoidoza, zarazne bolesti, parazitske bolesti, neplodnost žena, autoimuna trombocitopenija, autoimuna bolest štitnjače, Hashimotova bolest, Sjogrenov sindrom i karcinom.
30. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da je bolest karcinom.
31. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da je bolest odbacivanje presađenog organa ili bolest graft-versus-host.
32. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da je bolest sistemski lupus erythematosus.
33. Upotreba protutijela iz bilo kojeg od zahtjeva 1-23 u proizvodnji lijeka, naznačena time da je namijenjena primjeni u jedinke koja boluje od bolesti u kojoj je aktivnost TNFSF13b štetna.
34. Upotreba iz zahtjeva 33, naznačena time da je bolest izabrana iz grupe koju čine sistemski lupus erythematosus, reumatoidni artritis, juvenilni kronični artritis, Lyme-ov artritis, Crohnova bolest, ulcerativni kolitis, upalna bolest crijeva, astma, alergijske bolesti, psorijaza, bolest graft-versus-host, odbacivanje presađenog organa, akutne ili kronične imune bolesti povezane s presađivanjem organa, sarkoidoza, zarazne bolesti, parazitske bolesti, neplodnost žena, autoimuna trombocitopenija, autoimuna bolest štitnjače, Hashimotova bolest, Sjogrenov sindrom i karcinom.
35. Upotreba iz zahtjeva 34, naznačena time da je bolest odbacivanje presađenog organa ili bolest graft-versus-host.
36. Upotreba iz zahtjeva 34, naznačena time da je bolest karcinom.
37. Upotreba iz zahtjeva 34, naznačena time da je bolest sistemski lupus erythematosus.
38. Upotreba protutijela koje neutralizira aktivnost TNFSF13b vezanjem epitopa TNFSF13b, naznačena time da epitop sadrži lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73 i glutaminsku kiselinu na položaju 105, u proizvodnji lijeka za primjenu u jedinke koja boluje od bolesti u kojoj je aktivnost TNFSF13b štetna.
39. Proizvod, naznačen time da sadrži materijal za pakiranje i protutijelo unutar tog materijala, pri čemu protutijelo neutralizira aktivnost TNFSF13b, s ciljem liječenja ili prevencije u ljudske jedinke koja boluje od bolesti u kojoj je aktivnost TNFSF13b štetna, i gdje materijal za pakiranje sadrži umetak koji ukazuje da protutijelo neutralizira vezanjem epitopa TNFSF13b, pri čemu epitop sadrži lizin na položaju 71, treonin na položaju 72, tirozin na položaju 73 i glutaminsku kiselinu na položaju 105.
40. Proizvod iz zahtjeva 39, naznačen time da je protutijelo iz bilo kojeg od zahtjeva 1-23.
41. Proizvod iz zahtjeva 40, naznačen time da protutijelo sadrži LCVR polipeptid prikazan sekvencom id. br. 2 i HCVR polipeptid prikazan sekvencom id. br. 10.
42. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da sadrži sekvencu id. br. 17.
43. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da sadrži sekvencu id. br. 18.
44. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da sadrži sekvencu id. br. 19.
45. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da sadrži sekvencu id. br. 17 i sekvencu id. br. 19.
46. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da sadrži sekvencu id. br. 18 i sekvencu id. br. 19.
47. Protutijelo ili njegov fragment, naznačen time da kompetitivno inhibira specifično vezanje 4A5-3.1.1-B4 protutijela, proizvedenog hibridomom, čiji je ATCC depozitni broj PTA-3674, na hTNFSF13b.
HR20040147A 2001-08-16 2004-02-16 Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies HRP20040147A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31280801P 2001-08-16 2001-08-16
PCT/US2002/021842 WO2003016468A2 (en) 2001-08-16 2002-08-15 Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20040147A2 true HRP20040147A2 (en) 2004-10-31

Family

ID=23213094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20040147A HRP20040147A2 (en) 2001-08-16 2004-02-16 Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies

Country Status (26)

Country Link
US (4) US7317089B2 (hr)
EP (2) EP2348048B1 (hr)
JP (1) JP4012880B2 (hr)
KR (1) KR100961299B1 (hr)
CN (1) CN100497392C (hr)
AR (1) AR035119A1 (hr)
AU (2) AU2002322436C1 (hr)
BR (1) BR0211630A (hr)
CA (1) CA2452447C (hr)
CO (1) CO5560617A2 (hr)
DK (2) DK1432735T3 (hr)
EA (1) EA009074B1 (hr)
EC (1) ECSP044978A (hr)
ES (2) ES2526990T3 (hr)
HR (1) HRP20040147A2 (hr)
HU (1) HU230006B1 (hr)
IL (1) IL160373A0 (hr)
MX (1) MXPA04001344A (hr)
NO (1) NO20040603L (hr)
NZ (1) NZ530657A (hr)
PE (1) PE20030334A1 (hr)
PL (1) PL212404B1 (hr)
PT (2) PT2348048E (hr)
UA (1) UA89017C2 (hr)
WO (1) WO2003016468A2 (hr)
ZA (1) ZA200401154B (hr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) * 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
CA2407910C (en) 2000-06-16 2013-03-12 Steven M. Ruben Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) * 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
CN1970077A (zh) * 2001-05-11 2007-05-30 安姆根有限公司 与tall－1结合的肽和相关分子
US20080050381A1 (en) * 2004-08-31 2008-02-28 Tsutomu Takeuchi Antihuman Baff Antibody
NZ591701A (en) 2005-05-16 2012-11-30 Abbott Biotech Ltd Use of tnf inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
EP3037544A1 (en) * 2005-10-13 2016-06-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of systemic lupus erythematosus (sle) patients with autoantibody positive diseases
WO2007056288A2 (en) 2005-11-08 2007-05-18 Biogen Idec Ma Inc. Methods of evaluating baff
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
NZ573360A (en) 2006-05-04 2012-08-31 Boehringer Ingelheim Int Polymorphic forms of 1-[(4-methyl-quinazolin-2-yl)methyl]-3-methyl-7-(2-butyn-1-yl)-8-(3-(R)-amino-piperidin-1-yl)-xanthine
PE20110235A1 (es) 2006-05-04 2011-04-14 Boehringer Ingelheim Int Combinaciones farmaceuticas que comprenden linagliptina y metmorfina
EP1852108A1 (en) 2006-05-04 2007-11-07 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG DPP IV inhibitor formulations
JP5209625B2 (ja) 2006-08-28 2013-06-12 協和発酵キリン株式会社 アンタゴニストのヒトｌｉｇｈｔ特異的ヒトモノクローナル抗体
EP2109460B1 (en) * 2007-01-11 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Anti-kir antibodies, formulations, and uses thereof
AR071175A1 (es) 2008-04-03 2010-06-02 Boehringer Ingelheim Int Composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de la dipeptidil-peptidasa-4 (dpp4) y un farmaco acompanante
US20200155558A1 (en) 2018-11-20 2020-05-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment for diabetes in patients with insufficient glycemic control despite therapy with an oral antidiabetic drug
WO2010093993A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance
US9034883B2 (en) 2010-11-15 2015-05-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vasoprotective and cardioprotective antidiabetic therapy
EP3559049A4 (en) 2011-10-28 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF
AR090626A1 (es) 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
JP6345655B2 (ja) 2012-07-03 2018-06-20 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ タウに対する抗体
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
US9700485B2 (en) 2013-04-24 2017-07-11 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
AU2013388126B2 (en) 2013-04-29 2019-03-07 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
EA033604B1 (ru) * 2014-01-31 2019-11-08 Boehringer Ingelheim Int Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
TWI694836B (zh) * 2014-05-16 2020-06-01 英商葛蘭素史克智慧財產管理有限公司 抗體調配物
US20170101466A1 (en) * 2014-06-03 2017-04-13 Masahisa Handa Anti-blys antibodies
TW202136296A (zh) 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
KR102639037B1 (ko) 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
AR104368A1 (es) 2015-04-03 2017-07-19 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-cd20- / anti-baff

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6096878A (en) 1993-05-10 2000-08-01 Japan Tobacco Inc. Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
BR9612752A (pt) 1996-10-25 2000-01-18 Human Genome Sciences Inc Neutrocina
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
EE200000148A (et) 1997-09-12 2001-02-15 Biogen, Incorporated Kay - uus immuunsüsteemi valk
US6297367B1 (en) 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
US6787638B1 (en) 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
EP2319527A3 (en) 1999-01-25 2011-10-12 Biogen Idec MA Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of the B-cell response
NZ513290A (en) 1999-02-23 2004-05-28 Human Genome Sciences Inc Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
CA2407910C (en) 2000-06-16 2013-03-12 Steven M. Ruben Antibodies that immunospecifically bind to blys

Also Published As

Publication number Publication date
EP2348048A1 (en) 2011-07-27
ES2389834T3 (es) 2012-11-02
CA2452447A1 (en) 2003-02-27
DK1432735T3 (da) 2012-08-06
EP1432735B1 (en) 2012-07-18
EP1432735A2 (en) 2004-06-30
EP2348048B1 (en) 2014-11-19
JP2005517384A (ja) 2005-06-16
CN100497392C (zh) 2009-06-10
US20050070694A1 (en) 2005-03-31
EA009074B1 (ru) 2007-10-26
US8173124B2 (en) 2012-05-08
CN1541224A (zh) 2004-10-27
EA200400312A1 (ru) 2004-10-28
BR0211630A (pt) 2004-11-09
CO5560617A2 (es) 2005-09-30
US20100272735A1 (en) 2010-10-28
PE20030334A1 (es) 2003-04-05
WO2003016468A3 (en) 2003-11-20
PL370534A1 (en) 2005-05-30
ES2526990T3 (es) 2015-01-19
AU2002322436C1 (en) 2011-09-01
KR20040030088A (ko) 2004-04-08
WO2003016468A2 (en) 2003-02-27
AU2008246261B2 (en) 2011-04-07
PL212404B1 (pl) 2012-09-28
NZ530657A (en) 2006-02-24
MXPA04001344A (es) 2004-05-05
ECSP044978A (es) 2004-03-23
IL160373A0 (en) 2004-07-25
US20080175841A1 (en) 2008-07-24
NO20040603L (no) 2004-05-14
EP1432735A4 (en) 2007-06-27
AU2008246261A1 (en) 2008-12-11
KR100961299B1 (ko) 2010-06-04
HUP0500816A2 (en) 2007-07-30
HUP0500816A3 (en) 2010-01-28
US7728109B2 (en) 2010-06-01
HU230006B1 (en) 2015-04-28
UA89017C2 (uk) 2009-12-25
US20120195904A1 (en) 2012-08-02
ZA200401154B (en) 2005-06-22
JP4012880B2 (ja) 2007-11-21
US7317089B2 (en) 2008-01-08
CA2452447C (en) 2012-04-24
DK2348048T3 (en) 2014-12-15
PT1432735E (pt) 2012-09-10
AU2002322436B9 (en) 2009-04-09
PT2348048E (pt) 2015-02-04
AR035119A1 (es) 2004-04-14
AU2002322436B2 (en) 2008-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2348048B1 (en) Antagonistic Anti-HTNFSF13B Human Antibodies
AU2002322436A1 (en) Antagonistic anti-HTNFSF13B human antibodies
CA2707773C (en) Binding molecules to the human ox40 receptor
JP4942487B2 (ja) Ｉｐ−１０抗体およびその用途
AU2003299641B2 (en) Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
AU2003295471B2 (en) Human monoclonal antibodies against CD25
AU2003219954B2 (en) Antagonistic anti-hFas ligand human antibodies and fragments thereof
ZA200506724B (en) Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
CN115335402A (zh) 特异性抗原结合分子,其制备方法及医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20050708

Year of fee payment: 4

OBST Application withdrawn