CN107966564B - 一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用 - Google Patents

一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫检测试剂，包括包被抗体和检测抗体，包被抗体与检测抗体为兔抗人PCSK9单克隆抗体，包被抗体与检测抗体分别连接待测蛋白样品，形成双抗体夹心；包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明采用重链修饰的PCSK9单克隆抗体，通过对兔单抗的重链恒定区CH3序列进行修饰提高了其与酶标板的亲和能力，亲和度更好的包被抗体在ELISA中使得待测样本的脱板游离概率大大降低，从而提高了检测结果的准确性与稳定性。该试剂盒采用的原料廉价易得且环境友好，高灵敏度、高准确度，适用于各种样本中的PCSK9检测，具有广泛的推广价值。

Description

一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测 试剂盒与应用
技术领域
本发明涉及一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用，属于生物医学领域，尤其是免疫诊断技术领域。
背景技术
一、前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK9)概述
前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK9)是分泌型枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶K亚家族成员。PCSK9主要来源于人体的肝脏、肾脏和小肠。PCSK9前体蛋白主要在内质网中合成可溶性PCSK9酶原，并在内质网或高尔基体中经过自身催化裂解产生成熟的蛋白酶并分泌到血液中。目前研究表明只有肝脏分泌的PCSK9可分泌进入血液中，并与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，介导LDLR的降解，从而调节血清胆固醇水平。作为LDLR的负调节剂，过量的PCSK9在肝细胞表面结合LDLR并导致其降解，从而导致LDLR对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的结合和降解能力减弱，进而增加血清LDL-C水平，最终导致血液中胆固醇水平升高。因此，PCSK9抗体药成为治疗高胆固醇血症的最新方法。
高胆固醇血症分为家族性和非家族性，均属于脂质代谢异常，是冠状动脉疾病发生的独立危险因素。他汀类药物是目前临床上应用最广泛的降脂药物，其机制为抑制肝脏胆固醇合成过程中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的活性从而达到降脂目的。但对于有些LDL-C水平过高或者对他汀类药物不耐受的患者，其脂质始终不能降低到正常水平。因此，还需要开发新型降脂药物单独或与他汀类药物协同使用治疗高胆固醇血症。抗PCSK9药物已成为治疗高胆固醇血症的一种新型治疗方法。目前，国外已研发中多种PCSK9单克隆抗体药物，其中安进Repatha和赛诺菲Praluent已经上市且临床疗效良好。
由于PCSK9与高胆固醇血症有着对应的比例关系，因此检测人血清中PCSK9蛋白的水平，可以作为使用PCSK9抗体药物治疗高胆固醇血症和冠心病的用药指导和病情监测。
二、PCSK9的检测现状
现有的PCSK9的检测主要是利用PCSK9的蛋白结构特异性进行检测，常规的蛋白检测方法都可以使用，目前使用较为广泛的是采用双抗夹心ELISA法进行检测，双抗体夹心法中两个抗体起到桥梁的作用，一抗(包被抗体)起到连接酶标板与蛋白的作用，二抗(检测抗体)起到连接蛋白与检测物的作用，最后通过检测检测物的有无和含量，来推导出蛋白含量，这种方法相较其他的蛋白检测方法来说，原理上可靠特异性高，操作过程简单步骤和所需仪器少，因此有不少的特异性蛋白检测试剂盒采用ELISA法，投放市场后取得了不错的反响，PCSK9检测试剂盒也已有部分面世。但这种检测方法存在检测灵敏度低、稳定性差等不足。这些问题可以通过大量的重复实验进行克服，但耗时长、需要的样本和试剂多、检测成本高，十分不利于检测试剂盒的大范围推广使用。试剂盒能否检测准确稳定取决于各方面的原因，如试剂的配比、酶标板的质量等，还有一个重要的影响因素就是抗体质量，抗体连接不稳或易被外界因素(如冲洗或震动等)干扰会大大影响检测结果的准确性。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以现有酶联免疫法的检测手段为基础，改进检测方法，获得一种检测效果好的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂具体如下：
所述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫检测试剂包括包被抗体和检测抗体，包被抗体和检测抗体为兔抗人PCSK9单克隆抗体，且分别连接待测蛋白样品成双抗体夹心结构；包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。包被抗体结合反应区域，检测抗体为酶标抗体或与酶标底物结合，待测蛋白结合在包被抗体与检测抗体之间，形成了一个稳定的双抗体夹心结构，便于对待测蛋白进行检测且检测结果准确。
包被抗体与检测抗体均为兔抗人PCSK9单克隆抗体，本发明仅对包被抗体进行修饰，将PCSK9单抗重链恒定区CH3序列第79位的苏氨酸取代为丝氨酸，并以修饰段为基础制备完整的兔抗人PCSK9单克隆抗体作为包被抗体。克服了现有的检测试剂盒中检测结果不稳定、检测精度不高的问题。本发明修饰后的包被抗体与酶标版的结合更稳定，且与待测样品结合后不会在后续步骤中脱板造成样品损失，使得检测结果更准确也更稳定，一次检测即可得到真实检测数据，大大降低了现有检测中的检测时间和检测成本。
优选地，包被抗体与反应区域结合形成固相抗体。蛋白之间反应需要一个较为稳定的环境，不仅可以保证反应稳定进行，而且可以保证反应结果便于检测，反应区域为蛋白反应营造了这样的环境。
优选地，本发明中的检测试剂一般反应环境为酶标板，酶标板上设有若干反应孔，包被抗体与酶标板的反应孔结合后形成固相抗体结合蛋白样品，检测抗体也与蛋白样品结合，形成双抗体夹心。
优选地，所述检测试剂还包括辣根过氧化物酶(HRP)。
本发明中的辣根过氧化物酶仅为一种优选的实施方案，酶连免疫法可以采用包括辣根过氧化物酶在内的包括碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶的其他酶，辣根过氧化物酶不能作为对本发明的限制。
酶与抗体的联合方式有直接结合，也就是酶标记检测抗体；以及间接结合，也就是一种生物标记体标记检测抗体，另一种生物标记体被酶标记，通过两种生物标记体的联合，间接达到酶与检测抗体结合的目的。
优选地，检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体，加入显色液，酶催化显色液反应显色。辣根过氧化物酶具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是良好的蛋白检测用酶，检测准确稳定，对显色体系有着重要影响。
优选地，检测抗体未被辣根过氧化物酶(HRP)标记，而是与辣根过氧化物酶(HRP)结合，加入显色液，酶催化显色液反应显色。这种结合方式相比较被酶标记的检测抗体的检测结果更加准确。
更优选地，检测抗体与辣根过氧化物酶(HRP)的结合是通过生物素与链霉亲和素的结合实现的，也就是说，检测抗体为生物素标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体，反应底物为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，生物素与链霉亲和素结合。生物素与链霉亲和素具有良好的结合能力，链霉亲和素被辣根过氧化物酶标记后，起到酶连放大的富集作用，使得检测结果更加准确。
优选地，所述检测试剂还包括显色液，显色液分别为过氧化氢溶液和TMB溶液，临用混合。辣根过氧化物酶可催化过氧化物反应，从而促进显色液显色。
更优选地，所述检测试剂还包括终止液，终止液为浓硫酸。显色液与辣根过氧化物酶反应显色后，加入终止液，终止反应后检测OD值。HRP催化H2O2氧化TMB后将其变为蓝色，TMB的显色程度取决于待测PCSK9蛋白的含量，显色肉眼可见，显色后加入浓硫酸终止反应，溶液体系由蓝色变为黄色，因此黄色的深浅与蛋白含量成正比，在450nm的波长下检测显色程度，可以得到待测PCSK9蛋白的含量。
更优选地，双抗体夹心可以通过加入与检测抗体结合的反应底物的方式对蛋白样品进行检测，检测可以是定量的也可以是定性的，定量检测需要辅助标准曲线，定性检测只需观察光密度值强弱即可。
检测试剂所采用的具体的显色检测方法和未提及部分步骤可以参照现有技术，在此不做赘述。
本发明的第二个目的在于提供一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫检测试剂盒，试剂盒采用上述的检测试剂，试剂盒包括盒体和盒内组分，盒体内包括如下组分：包被抗体(一抗)、酶标板和检测抗体(二抗)，其中包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其中包被抗体预结合在酶标板上，检测抗体与反应底物结合，反应底物与显色液反应后显色，通过检测光密度值获得待测蛋白样品的检测结果。
优选地，检测抗体为生物素标记的检测抗体。
优选地，试剂盒还包括已经制备好的蛋白浓度标准曲线，蛋白浓度标准曲线以蛋白标准品的蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标。
更优选地，本发明中的蛋白浓度标准曲线公式为：y＝0.0001x+0.1006，公式的R2值可以达到0.9968，说明公式的线性良好，可以作为参考使用。
更优选地，为了去除实验中的设备和人为误差，也可以在检测时制备标准曲线，此时，试剂盒中还包括蛋白标准品，蛋白标准品稀释为浓度梯度进行检测，检测可以单独进行，也可以与待测蛋白样品的检测一同进行。
待测蛋白样品浓度根据测得的OD值代入蛋白浓度标准曲线计算即可获得。
为了试剂盒的检测准确性，每次检测之前建议都进行标准曲线的制备，以保证检测结果的准确性和可靠性。标准曲线的制备条件与样品检测条件一致。这样可以保证待测蛋白样品的浓度数据可以直接根据标准曲线计算获得，减少人为误差。
优选地，本发明中的酶联免疫检测试剂盒还包括反应底物和显色液，形成双抗体夹心后的检测抗体经过与反应底物反应，显色，以获得待测蛋白样品的OD值。反应底物的选择多样，只要与检测蛋白结合后可以被检测即可。
包被抗体由抗体稀释液稀释至反应浓度。所述稀释液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)，其中CBS缓冲液是每升含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3的双蒸水溶液。修饰后的包被抗体由于亲和力好，所以无需采用过量的一抗包被酶标板，适量即可，本发明中采用的兔抗人PCSK9单克隆抗体包被反应孔的反应浓度为2μg/ml。
检测抗体由封闭液稀释至反应浓度，所述封闭液为含有1％BSA的PBST溶液。
优选地，检测抗体为生物素标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体，检测抗体结合待测蛋白样品时的反应浓度为0.5μg/ml。
反应底物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，检测时使用封闭液稀释到终浓度为0.05μg/ml。
优选地，显色液分别为过氧化氢溶液和TMB溶液，使用时等体积混合。
显色液包括显色液A和显色液B，所述显色A液每升由醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g和30％过氧化氢溶液0.6ml组成，溶于双蒸水，定容至1000ml；所述显色B液每升由乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.4g、柠檬酸1.9g、甘油10ml、四甲基联苯胺0.03g和二甲亚砜0.6ml组成，加双蒸水至1000ml。
优选地，试剂盒还包括终止液，所述终止液为1mol/L的硫酸。
本发明的第三个目的是提供一种采用上述PCSK9酶联免疫检测试剂盒的使用方法，所述方法按如下步骤进行：
1.样品处理：采集患者血液5ml置于室温放置2h后于1000g离心20min，取上清，待检血清做1:300倍稀释使用。
2.上样：上样孔每孔分别加入50μL稀释过的血清样品，每组样品做3个复孔，并设置空白孔和标准孔，空白孔加稀释液50μL，标准孔加标准品50μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；37℃温育90min。
3.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔3次，每次浸泡1-2min，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4.加入检测抗体(二抗)：弃去孔内液体，甩干，每孔加入50μL稀释过的生物素标记的二抗，酶标板上覆膜，37℃温育1h。
5.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔3次，每次浸泡1-2min，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
6.加入酶结合物：每孔加入50μL稀释的HRP标记的链霉亲和素，酶标板上覆膜，37℃温育30min。
7.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔5次，洗涤过程同步骤3。
8.显色：将显色液A液和B液各50μL混匀后加入酶标板，酶标板加上覆膜，37℃避光温育20min，温育时间可根据标准品孔的明显梯度出现时间进行调整。
9.终止反应：每孔加入终止液100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同，反应结束后立即用酶标仪在450nm波长读取OD值。
上述步骤中，洗涤步骤以无溶液残留为准，上述洗涤次数仅为本发明中的优选方案，不应作为对本发明的限制。
优选地，为了减少人为操作误差或进行定量检测，本方法还包括标准曲线制备步骤，具体如下：采用人PCSK9蛋白标准品制备标准曲线，蛋白标准品为干粉状态，使用稀释液进行倍比稀释至终浓度为0、250、500、1000、2000、4000、8000、16000pg/mL，进行标准曲线测定。
如进行定量实验，需要根据读取的待测样品OD值带入标准曲线进行计算，得到待测样品的浓度检测结果。定性实验则不需要。
本发明的第四个目的在于提供一种上述人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂或检测试剂盒的应用，该试剂盒可以检测PCSK9的血液含量，PCSK9的检测结果可以辅助判断高胆固醇血症，为下一步的高胆固醇血症的诊断与治疗提供一定的参考。
与现有技术相比，本发明采用重链修饰的PCSK9单克隆抗体，通过对兔单抗的重链恒定区CH3序列进行修饰提高了其与酶标板的亲和能力，亲和度更好的包被抗体使得待测样本的脱板游离概率大大降低，从而提高了检测结果的准确性与稳定性。经检测，采用修饰后的单抗的试剂盒，抗体结合酶标板的能力和灵敏度与未突变的兔抗人PCSK9单克隆抗体相比提高了至少3倍。该试剂盒采用的原料廉价易得且环境友好，具有高灵敏度、高准确度的特点，适用于各种样本中的PCSK9检测，具有广泛的推广价值。
附图说明
图1兔抗人PCSK9单克隆抗体修饰前后重链恒定区CH3序列图；
图2是本发明提供的试剂盒检测流程示意图；
图3是本发明提供的试剂盒蛋白浓度标准曲线图；
图4是本发明提供的试剂盒与市售试剂盒的检测结果比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
一、单克隆抗体的制备与检测
1.1单克隆抗体的制备
本发明为改善单抗与酶标版的亲和力问题，设计制备了一款修饰后的PCSK9单克隆抗体，修饰方法为将PCSK9单抗重链恒定区CH3序列第79位的苏氨酸取代为丝氨酸(如图1中方框和序列下划线所示)，修饰后的兔抗人PCSK9蛋白单抗重链恒定区CH3区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示：
PKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSIS
编码该段重链恒定区的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示：
Figure BDA0001422922990000071
上述DNA序列和氨基酸序列由艾博抗(上海)贸易有限公司(Abcam)受申请人委托制备，由本申请涉和的抗体基因不可变区的序列，嵌合重链可变区和轻链可变区，即可获得全长的抗体分子作为检测靶标，用于PCSK9的检测。具体制备过程同PCT专利申请WO2017071513A对于PCSK9单抗的重链可变区或轻链可变区的制备过程，在此不做赘述。
1.2单克隆抗体的亲和力检测
采用BIacore3000测定全抗体的亲和力，将修饰后的PCSK9单克隆抗体偶联于CM5芯片，单抗终浓度为2μg/mL。稀释人PCSK9至合适的浓度，设置一系列的浓度梯度(50、40、32、25、20、12.5、6.25、3.125、1.5625和0.78125nmol/L)流经固定相表面，测定各单抗结合的动力学常数。
以现有的市售PCSK9试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-H1579c作为对照，在相同检测环境下检测市售PCSK9试剂盒与人PCSK9结合的动力学常数。具体的检测结果如下表1所示。
表1与PCSK9结合的动力学常数比较
Figure BDA0001422922990000072
Figure BDA0001422922990000081
由上述检测实验可知，本发明经过对单抗重链的氨基酸进行修饰，大大提高了单抗的动力学常数，且与市售单抗相比，提高了3倍以上。
二、人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒
2.1试剂盒组成
本实施例中的检测试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以和设在盒体内的试剂。其中，所述酶标板的每个孔使用修饰的兔抗人PCSK9单克隆抗体进行包被，所述试剂包括人PCSK9蛋白标准品、阴性对照液，生物素标记的兔抗人PCSK9蛋白二抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，洗涤液PBST、显色液(A液)、显色液(B液)和反应终止液。其中：
所述稀释液为pH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)，其中CBS缓冲液是每升含有1.59gNa2CO3和2.93g NaHCO3的双蒸水溶液。
所述用于包被酶标板的抗人PCSK9蛋白单抗被稀释到包被浓度为2μg/mL。
所述PBST为含有Tween 20体积百分比为0.1％，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；其中PBS缓冲液是每升含有8g NaCl，0.4g KH2PO4，5.6g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl的双蒸水溶液。
所述封闭液为含有1％BSA的PBST溶液。
所述生物素标记的兔抗人PCSK9蛋白二抗使用封闭液稀释到终浓度为0.5μg/mL。
所述HRP标记的链霉亲和素使用封闭液稀释到终浓度为0.05μg/mL。
所述显色A液为醋酸钠27.2g，柠檬酸3.2g，30％过氧化氢溶液0.6mL，溶于双蒸水，定容至1000mL。
所述显色B液为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.4g，柠檬酸1.9g，甘油10mL，四甲基联苯胺0.03g，二甲亚砜0.6mL，加双蒸水至1000mL。
所述终止液为1mol/L的硫酸。
2.2酶标板的制备
酶标版的制备过程为：将抗人PCSK9蛋白单抗用稀释液稀释后加入酶标板各孔，每孔加50μL，置于4℃条件下，温育过夜；除去孔内液体，每孔加350μL PBST洗板两次，拍干后分别向每孔加300μL封闭液，37℃封闭2h。PBST洗板3次，拍干后即得到抗人PCSK9蛋白抗体包被的酶标板。
2.3标准曲线的制备
所述人PCSK9蛋白标准品为干粉状态，使用样品和稀释液进行倍比稀释至终浓度为0、250、500、1000、2000、4000、8000、16000pg/mL，进行标准曲线测定。本检测试剂盒标准曲线图如图3所示。
所述样品和稀释液为含有0.5％BSA的PBST溶液。
三、人血清中PCSK9蛋白的检测方法
如图2中的试剂盒检测流程所示，待测样本的检测过程如下：
1.样品处理：采集患者血液5ml置于室温放置2h后于1000g离心20min，取上清，待检血清做1:300倍稀释使用。
2.上样：取已被包被抗体(一抗)包被的酶标板，上样孔每孔分别加入50μL稀释过的血清样品，每组样品做3个复孔，并设置空白孔和标准孔，空白孔加稀释液50μL，标准孔加标准品50μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；37℃温育90min。
3.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔3次，每次浸泡1-2min，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4.加入检测抗体(二抗)：弃去孔内液体，甩干，每孔加入50μL稀释过的生物素标记的兔抗人PCSK9蛋白二抗，酶标板上覆膜，37℃温育1h。
5.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔3次，每次浸泡1-2min，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
6.加入酶结合物：每孔加入50μL稀释的HRP标记的链霉亲和素，酶标板上覆膜，37℃温育30min。
7.洗涤：用PBST洗涤酶标板各反应孔5次，每次浸泡1-2min，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
8.显色：将显色液A液和B液各50μL混匀后加入酶标板，酶标板加上覆膜，37℃避光温育20min，温育时间可根据标准品孔的明显梯度出现时间进行调整。
9.终止反应：每孔加入终止液100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同，反应结束后立即用酶标仪在450nm波长读取OD值。
10.将待测蛋白样品的OD值带入蛋白浓度标准曲线进行计算，获得待测样品的蛋白浓度。
四、将本试剂盒与市售试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-H1579c进行灵敏度对比分析。取相同的酶标板分别包被市售试剂盒与本试剂盒中的兔抗人PCSK9单抗，包被浓度分别为2ug/ml、5ug/ml和10ug/ml，其他条件与本试剂盒相同。检测结果见图4，具体统计数据如下表2：
表2
Figure BDA0001422922990000101
由检测结果可知：在本试剂盒的兔抗人PCSK9单抗的包被浓度(2ug/ml)下，本试剂盒的灵敏度明显高于市售试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-H1579c。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0001422922990000111
Figure BDA0001422922990000121
序列表
<110> 武汉菲思特生物科技有限公司
<120> 一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用
<130> 2017
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(97)
<223> 兔抗人PCSK9重链恒定区氨基酸序列
<400> 1
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
20 25 30
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
35 40 45
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys
50 55 60
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Ser Cys
65 70 75 80
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
85 90 95
Ser
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(300)
<223> 兔抗人PCSK9重链恒定区基因序列
<400> 2
ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 60
acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 120
aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 180
ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttctcctgc 240
tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 300

Claims (13)

1.一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括包被抗体和检测抗体，其中：
包被抗体和检测抗体为兔抗人PCSK9单克隆抗体，且分别连接待测蛋白样品成双抗体夹心结构；
包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：包被抗体与反应区域结合形成固相抗体。
3.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括辣根过氧化物酶(HRP)。
5.根据权利要求4所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括反应底物，反应底物为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，检测抗体为生物素标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括显色液，显色液分别为过氧化氢溶液和TMB溶液，使用时等比例加入。
7.根据权利要求1所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括终止液，终止液为浓硫酸。
8.一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：包被抗体、酶标板、检测抗体、反应底物和显色液，其中：包被抗体预结合在酶标板上，检测抗体与反应底物结合，反应底物与显色液反应后显色，通过检测光密度值获得待测蛋白样品的检测结果，包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
9.根据权利要求8所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：检测抗体为生物素标记的兔抗人PCSK9单克隆抗体。
10.根据权利要求8所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCSK9蛋白浓度标准曲线，标准曲线以蛋白标准品的蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标。
11.根据权利要求8所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括蛋白标准品，检测时以蛋白标准品的蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制蛋白浓度标准曲线。
12.根据权利要求8所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：反应底物为辣根过氧化酶标记的链霉亲和素。
13.根据权利要求8所述的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：显色液分别为过氧化氢溶液和TMB溶液，使用时等比例加入。
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