JPH04338398A - ジフェニルメタン誘導体類、その製造方法およびそれを含有するヨードチロニン類を結合する蛋白からヨードチロニン類を置換するための試薬 - Google Patents

ジフェニルメタン誘導体類、その製造方法およびそれを含有するヨードチロニン類を結合する蛋白からヨードチロニン類を置換するための試薬

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JPH04338398A
JPH04338398A JP4012825A JP1282592A JPH04338398A JP H04338398 A JPH04338398 A JP H04338398A JP 4012825 A JP4012825 A JP 4012825A JP 1282592 A JP1282592 A JP 1282592A JP H04338398 A JPH04338398 A JP H04338398A
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    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はジフェニルメタン誘導体
類、その製造方法およびそれを含有するヨードチロニン
類を結合する蛋白からヨードチロニン類を置換するため
の試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】本発
明は一般式Ｉ：
【化６】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっており、水
素またはヒドロキシ、Ｒ３は水素またはアルコキシ、Ｒ
４は水素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応
する酸の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２ま
たは対応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表す］で示さ
れるジフェニルメタン誘導体類および該化合物の製造方
法に関する。
【０００３】本発明は、特に免疫学的方法によって、特
に、蛋白結合ヨードチロニンを置換および放出する物質
の添加ならびに該試料中の全ヨードチロニンの測定によ
る液体試料中のヨードチロニン結合蛋白の存在下におけ
るヨードチロニンの測定方法において、特に、ヨードチ
ロニン類を結合する蛋白からヨードチロニン類を置換す
るための該化合物の使用に関する。さらに、本発明は対
応するヨードチロニン測定用試薬中の本発明化合物の使
用に関する。
【０００４】本発明の範囲内のヨードチロニン類は、特
に、臨床学的診断において関心のあるものである。この
ようなヨードチロニン類は、特に、３，５，３’，５’
−テトラヨードチロニン（チロキシン；Ｔ４）、３，５
，３’−トリヨードチロニン（Ｔ３）、３，３’，５’
−トリヨードチロニンおよび３，３’−ジヨードチロニ
ンである。血液中または血漿もしくは血清のような血液
から誘導した試料中のＴ４および／またはＴ３の濃度の
定量測定は甲状腺機能の試験において非常に重要な役割
を果す。血液、血漿または血清中に存在するヨードチロ
ニンの大部分は蛋白に結合している。このようなヨード
チロニン結合蛋白の例としてはチロキシン結合プレアル
ブミンおよびとりわけ「チロキシン−結合グロブリン」
（ＴＢＧ）が挙げられる。
【０００５】血液試料中のヨードチロニンの全含有量を
測定するために、次いで、遊離形態で存在するヨードチ
ロニンを測定することができるために、個々の担体蛋白
から蛋白結合ヨードチロニンを分離することが多くの方
法で必要である。蛋白結合ヨードチロニンを放出するた
めに、蛋白の上の個々の結合部位からヨードチロニンを
置換し、かつそれ自体を蛋白に結合するいわゆる「置換
試薬」を添加するのが慣例である。このような置換試薬
は、例えば欧州特許出願番号第００７８４７７号および
第０１３３４６４号から公知である。
【０００６】欧州特許出願第００７８４７７号は一般式
Ｚ１−Ｙ−Ｚ２（Ｚ１およびＺ２はハロゲン、アルキル
および／またはアルコキシによって置換され得るフェニ
ル基を表し、これらのフェニル環はカルボン酸またはス
ルホン酸残基を担持しており、Ｙは酸素、イミン、硫黄
、メチレンまたはカルボニルであり得る）を有する置換
効果を有する物質を開示している。しかしながら、塩素
によって置換されているフェニル酢酸誘導体類が好まし
い。
【０００７】欧州特許出願第０１３３４６４号には、ヨ
ードチロニンを結合する蛋白からヨードチロニンを置換
するのに非常に好都合であるとして２−ヒドロキシ−４
−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸およびこの
酸の塩が開示されている。
【０００８】予め蛋白に結合されたヨードチロニンの放
出の後に、試料中の遊離ヨードチロニンを測定する。通
常、このために免疫学的方法が使用される。このような
免疫学的方法では、ヨードチロニンはその各々の抗体に
結合される。抗体に結合しているヨードチロニンの程度
、すなわち、どのくらいのヨードチロニンが抗体に結合
されていたかは、試験されるべき試料のヨードチロニン
含有量の定量測定をさせるマーカーを含有する免疫学的
試験薬によって測定される。可能なマーカーは、ある反
応を触媒化し、このような酵素反応の程度によって試験
されるべき試料中にどのくらいのヨードチロニンが存在
するかを示す酵素である。
【０００９】試料中のヨードチロニンの全含有量を確実
に測定するために、置換試薬は免疫化学反応、すなわち
特定抗体とヨードチロニンとの反応または酵素マーカー
の活性のいずれにも影響を及ぼさないことが必要である
。しかしながら、個々の担体蛋白からヨードチロニンを
置換するための公知の物質は、置換活性の欠如を示すか
、またはヨードチロニン−抗体反応または置換効果を有
する濃度の酵素マーカーの活性を弱めることによってヨ
ードチロニンの免疫学的測定を妨害する。
【００１０】本発明の目的は、個々の結合蛋白からでき
る限り多くのヨードチロニンを置換し、さらにヨードチ
ロニンについての免疫学的試験反応、特に酵素−免疫ア
ッセイを弱めない化合物を提供することである。
【００１１】この目的は本特許請求の範囲で特徴付けら
れるような本発明によって達成される。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は一般式Ｉ：
【化
７】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっており、水
素またはヒドロキシ、Ｒ３は水素またはアルコキシ、Ｒ
４は水素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応
する酸の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２ま
たは対応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表す］で示さ
れる化合物を提供するものである。
【００１３】一般式Ｉで示される化合物の定義中、アル
コキシ基は、特に１〜６個の炭素原子を有するものであ
る。特に好ましくは１〜３個の炭素原子を有するアルコ
キシ基である。特にメトキシ基が好ましい。
【００１４】Ｒ４基およびＲ５基について可能な意味と
して挙げられる酸残基のうちの１つの塩は、特に、アル
カリ塩、アルカリ土類塩およびアンモニウム塩を含むと
解される。アルカリ塩はリチウム塩、ナトリウム塩、カ
リウム塩、ルビジウム塩およびセシウム塩と解され、好
ましくはリチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩で
あり、とりわけナトリウム塩およびカリウム塩が好まし
く、特にナトリウム塩が好ましい。アルカリ土類塩はベ
リリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロン
チウム塩またはバリウム塩である。好ましくはマグネシ
ウム塩およびカルシウム塩であり、特にカルシウム塩が
好ましい。アンモニウム塩として非置換アンモニウムイ
オン、ＮＨ４＋の塩が使用され得る。しかしながら、ア
ンモニウムイオンが１〜４個のアルキル、アリール基ま
たはアラルキル基によって置換されるこれらのアンモニ
ウム塩を使用するのも可能である。この場合、「アルキ
ル」は１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子を有す
る直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を表す。例として
は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソブチル基ま
たはｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。アンモニウムイ
オンの置換基として好ましいアルキル基はメチル、エチ
ルおよびｎ−プロピルである。「アリール」は炭素芳香
族基またはヘテロ芳香族基を表し、好ましくは６〜１０
個の環原子を有するものを表し、特に、さらにアルキル
、アルコキシまたは／およびハロゲンによって置換され
得るフェニルまたはナフチル基を表す。この場合、ハロ
ゲンはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素の基を表し得る
。好ましくはフッ素および塩素である。「アルキル」お
よび「アルコキシ」は前記の意味を有する。置換アンモ
ニウムイオンにおける特に好ましいアリール基はフェニ
ル基である。「アラルキル」基は上記定義のアルキル基
が上記で挙げられたアリール基によって置換される基を
表す。好ましくはベンジル基である。一般式Ｉで示され
る本発明の化合物の特に好ましい塩は前記の意味を有す
るアルカリ塩である。
【００１５】一般式Ｉで示される好ましい化合物は可能
な酸の基Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つがスルホン酸
基または該酸の塩であるものである。
【００１６】本発明の目的はＲ１が水素またはヒドロキ
シ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が水素、Ｒ５がＳＯ３Ｈまた
は対応する塩、Ｒ６がアルコキシである一般式Ｉで示さ
れる化合物、およびＲ１が水素またはヒドロキシ、Ｒ２
がヒドロキシ、Ｒ３がアルコキシ、Ｒ４がＳＯ３Ｈまた
は対応する塩、Ｒ５がＳＯ３Ｈまたは対応する塩、Ｒ６
がアルコキシである一般式Ｉで示される化合物によって
特によく達成される。
【００１７】好ましい化合物として記載されている化合
物のうちＲ１が水素を表すものが最も好都合に使用され
得る。このようなジフェニルメタン誘導体類の特に好適
な例としては、特に、２−ヒドロキシ−４−メトキシジ
フェニルメタン−５−スルホン酸および対応する塩、な
らびに２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシ
ジフェニルメタン−５，５’−ジスルホン酸およびその
対応する塩が挙げられる。特に、後者の酸およびその塩
、特にジナトリウム塩は、本発明において特に好適であ
る。
【００１８】本発明の化合物は新規である。固有の特徴
は水および緩衝溶液のような水性媒質に容易に溶解し、
ヨードチロニン類を結合している蛋白から、特にＴＢＧ
から、ヨードチロニン類、特にチロキシンを容易に置換
し得ることである。これらの化合物の特徴は非常に良好
な置換効果を有するが、一方、免疫学的試験反応におけ
る障害に関するそれらの可能性が公知の従来技術と比較
して実質的に減少することである。これは、特に、ヨー
ドチロニン−抗体結合反応の段階での免疫学的反応およ
び酵素マーカーと対応する基質との酵素反応に関する。
【００１９】本発明は本発明の化合物の製造方法にも関
する。一般式Ｉで示される化合物は一般式ＩＩ：
【化８
】 ［式中、Ｒ２は水素またはヒドロキシ、Ｒ３は水素また
はアルコキシ、Ｒ４は水素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ
３Ｈ２または対応する酸の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３
Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応する酸の塩、Ｒ６はアルコキ
シを表す］で示される化合物を還元することによって製
造するのが好ましい。
【００２０】この場合、各基は一般式Ｉで示される化合
物についての定義と同一の意味を有する。
【００２１】適切な還元条件の選択は一般式Ｉで示され
る化合物中のＲ１の意味を規定するのに使用され得る。 かくして、酸性条件下で一般式ＩＩで示されるケトンが
シアノホウ水素化ナトリウムと反応すると、Ｒ１が水素
を表す一般式Ｉで示される化合物が得られる。このよう
な反応はｐＨ２〜４で水性媒質中で行うのが好ましい。
【００２２】パラジウム−炭素の存在下で一般式ＩＩで
示されるケトンを水素で水素添加しても同一の結果が得
られる。これは水素雰囲気中で数時間撹拌しつつ行うの
が好ましい。
【００２３】しかしながら、酸化白金（ＩＶ）の存在下
で一般式ＩＩで示されるケトンを水素で水素添加すると
、Ｒ１がヒドロキシを表す一般式Ｉで示される化合物が
得られる。これについては水素雰囲気中で数時間撹拌す
るのも好ましい。
【００２４】本発明の製造方法は、好ましくは１０〜４
０℃の温度で、特に好ましくは室温で行う。
【００２５】さらに、本発明は、特にヨードチロニン結
合蛋白の存在下でのヨードチロニンの測定方法および測
定用試薬において、ヨードチロニンを結合する蛋白から
ヨードチロニンを置換するための一般式Ｉで示される化
合物の使用にも関する。
【００２６】蛋白結合ヨードチロニンを置換および放出
する物質の添加ならびに試料中の全ヨードチロニンの測
定によって液体試料中のヨードチロニン結合蛋白の存在
下でヨードチロニンを測定する本発明の方法は置換物質
として一般式Ｉで示される化合物を該試料に添加するこ
とを特徴とする。ヨードチロニンを結合する蛋白からヨ
ードチロニンを置換するのに必要な濃度は、もちろん、
試料中の結合蛋白の量に依存する。実際、ヒト試料、特
に血液、血漿または血清について、本発明の一般式Ｉで
示される物質の濃度が少なくとも６ミリモル／リットル
に調節されると、試験されるべき試料中のヨードチロニ
ン、特にＴ４が試料中のヨードチロニン結合蛋白から、
特に「チロキシン結合グロブリン」（ＴＢＧ）から、ほ
とんど完全に置換されることが判明した。８〜３０ミリ
モル／リットルの濃度が特に好ましいのが判明した。こ
の濃度範囲の下限は試料中の個々の結合蛋白からヨード
チロニンをほとんど完全に置換するのに必要な濃度であ
る。該濃度範囲の上限は経済的な考慮によってほとんど
決定される。必要以上に多量の置換試薬を使用してもさ
らなる置換効果は生じない。実際、好ましいとして記載
された濃度範囲が　ｉｎｖｉｖｏ　で生じるヨードチロ
ニン濃度の測定に最適であることが判明した。しかしな
がら、これらの濃度とは別に、個々のケースにおいて一
般式Ｉで示される物質の最適濃度を決定するのは当業者
の判断しだいである。
【００２７】試料中の全ヨードチロニン含有量を測定す
るため、上記置換反応の後に該試料中のヨードチロニン
についての試験を行う。これは公知の方法に従って行わ
れ得る。通常の免疫学的定量方法が使用される。これに
関連して、免疫学的定量方法またはイムノアッセイは抗
原またはハプテンと抗体との間の相互関係に基づいてい
る方法と解される。抗体は全抗体（ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体）または同様の活性を有するフラ
グメント、例えばＦａｂの形態で使用され得る。
【００２８】イムノアッセイを行うため、使用される抗
体または定量されるべき物質に類似の化合物を検出可能
な形態で標識しなければならない。一般式Ｉで示される
本発明化合物は、酵素をマーカーとして使用するような
方法における使用のために特に好適である。このような
定量方法は酵素−イムノアッセイとして公知である（例
えば、エム・エルレリッヒ（Ｍ．Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ）
、ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー・アン
ド・クリニカル・バイオケミストリー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２２、８９
５−９０４（１９８４）参照）。ヨードチロニンを結合
する蛋白からヨードチロニンを置換するのに必要な本発
明の化合物の濃度はヨードチロニンの個々の抗体への結
合または酵素−イムノアッセイに使用される酵素の活性
を実質的に妨害しないので、本発明の化合物の規定によ
って酵素−イムノアッセイによる全ヨードチロニンの特
に有益な定量方法が得られる。
【００２９】酵素−イムノアッセイで使用されるマーカ
ーは、特にペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
またはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである。ヨードチロニ
ンを結合する蛋白からのヨードチロニンの置換のための
本発明の一般式Ｉを有する化合物の使用は、特に、酵素
−イムノアッセイにおける酵素マーカーとしてβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼを使用する場合に好都合であることが
判明した。
【００３０】ＩＥＭＡ法、いわゆる「免疫−酵素測定ア
ッセイ（ｉｍｍｕｎｏ−ｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ　ａ
ｓｓａｙｓ）」に基づく本発明の酵素−イムノアッセイ
が特に好ましい。この方法では、酵素標識抗体は試験さ
れるべき試料に過剰に添加される。この抗体に試験され
るべき試料中の遊離ヨードチロニンが結合する。次いで
、固相上に固定したヨードチロニンを過剰に添加し、結
果として遊離抗体を固相上に固定するさらなる段階で過
剰の遊離標識抗体を分離する。次いで、固相を液相から
分離する。試験される試料中の定量されるべきヨードチ
ロニンの量は適当な酵素基質によってアッセイされ得る
液相中または固相上に存在する酵素活性に基づいて測定
される。
【００３１】本発明は液体試料中のヨードチロニン結合
蛋白の存在下でヨードチロニンを測定する本発明の方法
を行うための試薬にも関する。このような試薬はヨード
チロニンを結合する蛋白からヨードチロニンを置換する
のに適している物質、および試料中のヨードチロニンの
量の尺度を表す遊離非結合ヨードチロニンによるシグナ
ルを生じる薬物を含有しなければならない。このような
本発明の試薬は置換物質として一般式Ｉで示される化合
物を含有することを特徴とする。原則的には、遊離非結
合ヨードチロニンの測定用試薬として、該目的に適して
いる試薬を使用し得る。これらの物質はイムノアッセイ
、特に酵素−イムノアッセイに必要である本発明の試薬
中での遊離非結合ヨードチロニンの測定用薬物の成分と
して使用されるのが好ましい。本発明の特に好ましいＩ
ＥＭＡ試験を行うため、該試薬は酵素標識抗体、担体上
に固定されたヨードチロニンおよび酵素変換が試料中の
ヨードチロニンの量の尺度である色素形成または変色を
導く酵素マーカーに対する適当な基質を含有しなければ
ならない。
【００３２】本発明の試薬は本発明の一般式Ｉで示され
る物質による置換反応および遊離非結合ヨードチロニン
の測定が行われ得るｐＨに試験されるべき試料中のｐＨ
を設定する緩衝物質を含有するのが好ましい。このため
、ｐＨ値を６〜８に設定する緩衝物質を使用するのが特
に好ましい。
【００３３】本発明の試薬はヨードチロニンを結合する
蛋白からヨードチロニンを置換する物質を、遊離非結合
ヨードチロニンによって試験されるべき試料中のヨード
チロニンの量の尺度であるシグナルを生じる試薬と一緒
に混合物状態で含有し得る。しかしながら、置換物質お
よび測定反応を行うための薬物は互いに空間的に分離状
態を維持している。
【００３４】本発明の試薬は溶液状態で存在し得る。か
くして、例えば、上記定義に従って、一般式Ｉで示され
る物質は遊離非結合ヨードチロニンの測定用薬物と一緒
に共通の媒質中に存在し得る。しかしながら、本発明の
試薬は各々が別々の試薬成分を含有しているいくつかの
分離した溶液からもなり得る。好ましくは、置換物質は
遊離非結合ヨードチロニンの測定用薬物から分離してい
る。好ましく使用される溶媒は本発明の一般式Ｉで示さ
れる化合物を溶解するのに好適であり、かつ遊離非結合
ヨードチロニンの測定用薬物の成分と一体化するのに好
適である溶媒である。とりわけ、水性溶媒が好適であり
、特に好ましくは緩衝溶液である。
【００３５】遊離非結合ヨードチロニンの定量用薬物は
溶液状態で存在するが、本発明の試薬は固体の不活性担
体中または上にヨードチロニンを結合する蛋白からのヨ
ードチロニンの置換用物質も含有し得る。反対の場合も
可能である。
【００３６】本発明の試薬の特に好ましい具体例として
は、完全に担体に結合されていることが挙げられる。例
えば、「図１」に示される試験担体がこれに適している
。このような試験担体は欧州特許出願第０３１８７７７
号に詳細に記載されている。「図１」に示される試験担
体１は基本的な試験片の形態を有している。それは、特
に、免疫学的定量を行うための高品質分析システムであ
る。標識された全試験領域３は基層２上に位置しており
、基層２の長さの一部分だけを覆って伸びている。試験
領域３は試料塗布帯域４および試験帯域５に細分され得
る。試料塗布帯域４では、熱溶融型接着剤片１０によっ
て基層２に接着されている被覆ネット６、赤血球分離用
層７、および２つの試薬層８および９を上から下まで見
ることができる。
【００３７】熱溶融型接着剤片１０で接着されている吸
収材料からなる液体移動層１１は試料塗布帯域４を越え
て試験帯域５中に延びている。層６〜９によって被覆さ
れていない液体移動層の領域の上方に３つの層が位置し
ており、これらは外圧の非存在下でそれらが基層２に対
して斜めに突き出し、かつそれに接しないように、熱溶
融型接着剤片１２によって基層２上に固定される。これ
らの層は固定された分析物または分析物アナログを含有
する試験層１３、第３試験層１４および被覆ホイル１５
である。
【００３８】ここで示した好ましい試験担体は、いわゆ
るＩＥＭＡ法に基づいている免疫学的定量用を行うのに
特に適している。ヨードチロニン（例えば、Ｔ４）を試
料中で測定するべきである場合、「図１」に示された試
験担体を使用する分析は以下のように行われる。
【００３９】赤血球分離層７の上方で被覆ネット６に１
滴の血液（約３０マイクロリットル）を塗布し、例えば
米国特許第４，４７７，５７５号に従って構築され得る
赤血球分離層７を透過させる。この方法で得られた血清
を層８を通して層９中に透過させる。層８は本発明の一
般式Ｉで示される化合物を含有しており、その結果、こ
こで血液から誘導された試料が該物質を吸収し、その個
々の結合蛋白からヨードチロニンを置換し、かくして、
試料中の全ヨードチロニンが定量される。層９はヨード
チロニンに対する酵素的標識抗体を含有しており、該抗
体は試料中の最大ヨードチロニン濃度よりも過剰である
。この抗体−酵素コンジュゲート（ＡｂＥ）は透過血清
によって溶解される。この工程で、ＡｂＥとヨードチロ
ニンとの間で複合体が形成され、これをＩ−ＡｂＥと記
す。ＡｂＥが過剰に存在するので、平衡に達すると遊離
コンジュゲートＡｂＥが残存する。層１３の目的は、他
の場合なら以下の試験を妨害するであろう免疫学的結合
によって、これからＡｂＥを除去することである。した
がって、免疫学的分離層とも記す。担体結合形態中には
ヨードチロニンまたはヨードチロニン・アナログを含有
しており、これによって、担体上での固定は、例えば欧
州特許出願第０３１８７７７号に記載されているものの
如き無機担体粒子の助けを借りて行われる。例えばクロ
マトグラフィー用のためのシリカゲルとして供給される
もののような担体粒子としてＳｉＯ２粒子を使用するの
が好都合である。しかしながら、酸化チタンの使用が特
に好ましい。
【００４０】試料中、結合されたヨードチロニンがその
個々の結合蛋白から置換され、遊離非結合ヨードチロニ
ンとＡｂＥとの間で平衡が確立された予備定量インキュ
ベーション期間の後、層１３〜１５に上方から圧力が加
えられる。これは、手動で、または欧州特許出願第０１
２９２２０号に記載されているように装置構成要素の助
けを借りて機械的に行われ得る。下向きの圧力によって
免疫学的分離層１３を液体移動層１１と接触させ、そこ
に存在する成分を層１３中に透過させる。この工程で、
非複合化ＡｂＥは固定されたヨードチロニンと結合する
が、Ｉ−ＡｂＥ複合体は別に支障なく透過し得る。
【００４１】試薬層１４は酵素マーカー用色素産生基質
を含有する。液体が該基質に到達すると、遊離Ｉ−Ａｂ
Ｅ複合体中の酵素は該基質の着色反応を触媒化する。し
たがって、色の変化率は試薬層１４に到達する遊離Ｉ−
ＡｂＥ複合体の量の尺度である。次に、これは試料中の
ヨードチロニンの量の尺度である。
【００４２】「図１」の試験担体の個々の層のための可
能な材料は欧州特許出願第０３１８７７７号から得るこ
とができる。
【００４３】
【実施例】以下に、実施例によって本発明をさらに説明
する。
【００４４】実施例１ ２−ヒドロキシ−４−メトキシジフェニルメタン−５−
スルホン酸のナトリウム塩
【化９】
【００４５】ａ）水１２００ミリリットルに入れた２−
ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホ
ン酸［ユビヌル（Ｕｖｉｎｕｌ）　ＭＳ−４０；ドイツ
連邦共和国ルドヴィクシャフェン／レインのビーエイエ
スエフ・カンパニー（ＢＡＳＦ　Ｃｏｍｐａｎｙ）］７
４ｇ（２４０ミリモル）に、水７００ミリリットルに入
れたシアノホウ水素化ナトリウム６０ｇ（９５０ミリモ
ル）を添加し、室温で撹拌する。２Ｎ塩酸の連続添加に
よって４時間にわたって溶液のｐＨを３．５に維持し、
次いで、塩酸をさらに添加してｐＨ２に調整する。その
後、該溶液を介して空気を導入し、６時間、５０℃に加
熱して、反応の間に遊離したシアン化水素を完全に除去
する。該溶液を真空濃縮し、残留物をメタノールと一緒
にダイジェストする。非溶解部分（塩化ナトリウム）を
アスピレートし、濾液をエーテルに注ぎ、生成物を沈殿
させる。熱エタノールに再度溶解し、ジエチルエーテル
中で沈殿させて純粋な形態の標記化合物を得る。収量７
０ｇ（９２％）；融点＞２７０℃；Ｒｆ０．３［シリカ
ゲル；移動溶媒：イソプロパノール／酢酸ｎ−ブチル／
水／２５％アンモニア水溶液＝１０：６：３：１（ｖ／
ｖ／ｖ／ｖ）］。
【００４６】ｂ）別に、標記化合物は以下のとおり製造
することもできる。メタノール５００ミリリットルに入
れた２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５
−スルホン酸［ユビヌル（Ｕｖｉｎｕｌ）　ＭＳ−４０
；ドイツ連邦共和国ルドヴィクシャフェン／レインのビ
ーエイエスエフ・カンパニー（ＢＡＳＦＣｏｍｐａｎｙ
）］５ｇ（１６ミリモル）を、パラジウム−炭素（１０
％）１ｇの存在下、水素雰囲気下、室温で６時間撹拌す
る。触媒をアスピレートした後、１Ｎメタノール性ナト
リウムメチラート溶液を添加し、該溶液を真空濃縮し（
残留容量約１００ミリリットル）、ジエチルエーテル１
０００ミリリットルを添加して、生成物を沈殿させる。 収量４ｇ（７９％）；融点＞２７０℃；Ｒｆ０．３［シ
リカゲル；移動溶媒：イソプロパノール／酢酸ｎ−ブチ
ル／水／２５％アンモニア水溶液＝１０：６：３：１（
ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）］。
【００４７】実施例２ ２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシジフェ
ニルメタン−５，５’−ジスルホン酸のジナトリウム塩
【化１０】
【００４８】２Ｎ塩酸の連続添加（全消費量約２５０ミ
リリットル）によってｐＨを３．５に維持している間に
、実施例１に記載と同様の方法で、室温で８時間、水３
０００ミリリットル中、シアノホウ水素化ナトリウム５
７ｇ（９００ミリモル）で２，２’−ジヒドロキシ−４
，４’−ジメトキシベンゾフェノン−５，５’−ジスル
ホン酸のジナトリウム塩［ユビヌル（Ｕｖｉｎｕｌ）　
ＤＳ−４９；ドイツ連邦共和国ルドヴィクシャフェン／
レインのビーエイエスエフ・カンパニー（ＢＡＳＦ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ）］１４４ｇ（０．３ミリモル）を脱酸素
する。上記と同様に処理して、所望の化合物を得る。収
量：１０３ｇ（７４％）；融点＞２６０℃；Ｒｆ０．７
５［ＨＰＴＬＣ−ＲＰ　１８；ドイツ連邦共和国ダーム
スタットのイー・メルク・カンパニー（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ
　Ｃｏｍｐａｎｙ）；移動剤：エタノール／水＝７：３
（ｖ／ｖ）］。
【００４９】実施例３ ２−ヒドロキシ−４−メトキシジフェニルカルビノール
−５−スルホン酸のアンモニウム塩
【化１１】
【００５０】メタノール８００ミリリットルに入れた２
−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スル
ホン酸［ユビヌル（Ｕｖｉｎｕｌ）　ＭＳ−４０、ドイ
ツ連邦共和国ルドヴィクシャフェン／レインのビーエイ
エスエフ・カンパニー（ＢＡＳＦＣｏｍｐａｎｙ）］１
５．４ｇ（５０ミリモル）に、ピリジン４ｇ（５０ミリ
モル）およびＰｔＯ２３ｇを添加し、水素雰囲気下、室
温で２４時間撹拌する。触媒を濾去し、濾液を濃縮した
後、残留物をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー
によって精製する［移動溶媒：塩化メチレン／メチルエ
チルケトン／メタノール／濃アンモニア水溶液＝５：１
：２：０．３（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）］。Ｒｆ０．１２の画
分を濃縮して、標記化合物を得る；収量９．５ｇ（５８
％）；融点２１１℃。
【００５１】実施例４ 全チロキシン（Ｔ４）の定量方法
【００５２】Ａ）試験方法 以下の成分を、逐次、ピペットで遠心管に入れる：０〜
２０μｇ／ｄｌのＴ４を有する血清８マイクロリットル
、緩衝液に入れた置換試薬溶液２０マイクロリットル（
０〜３０ミリモル）。
【００５３】次いで、２分間混合する。次に、この混合
物に緩衝液に入れた（抗−Ｔ４抗体）−β−ガラクトシ
ダーゼコンジュゲート２５マイクロリットル（４０Ｕ／
ミリリットル）を添加する。緩衝液は置換試薬について
と同一である。再度、２分間混合する。
【００５４】次いで、緩衝液に入れた二酸化チタン−Ｔ
４懸濁液２０マイクロリットル（５０％）を添加する。 該二酸化チタン−Ｔ４懸濁液は欧州特許出願第０３１８
７７７号（実施例１．２）の記載に従って調製する。再
度、２分間混合した後、遠心分離によって固体成分を除
去し、該上澄み液２０マイクロリットルを、緩衝液に入
れたクロロフェノールレッド−ガラクトシド７５０マイ
クロリットル（１ミリモル）に添加する。
【００５５】クロロフェノールレッド−ガラクトシドは
欧州特許出願第０１４６８６６号に従って調製する。
【００５６】短時間混合した後、５７８ｎｍで吸光度変
化／分を測定する。
【００５７】各々の場合、使用した緩衝液は以下の物質
の水溶液（ｐＨ＝７．０）である。 ＫＨ２ＰＯ４　　　　１０ミリモル ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　５ミリモルＮａＣｌ　　
　　　　　　２５ミリモル
【００５８】Ｂ）結果 ａ）物質２−ヒドロキシ−４−メトキシジフェニルメタ
ン−５−スルホン酸（ナトリウム塩）（α）および２，
２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシジフェニル
メタン−５，５’−ジスルホン酸（ジナトリウム塩）（
β）に対して使用した置換試薬（ＤＲ）の濃度に対する
測定したシグナル（吸光度変化／分）の依存性を「表１
」に示す。比較として、同一Ｔ４濃度（この場合：試験
混合物中５．０μｇ／ｄｌ）を有するＴＢＧ−遊離血清
についての測定値を示す（ＤＲを用いずに測定）。
【００５９】
【表１】
【００６０】物質βの置換効果は約６ミリモルの濃度以
上で完全に達する。物質αは混合物中８〜１０ミリモル
の濃度で「正しい」測定シグナルに至る。
【００６１】ｂ）物質βを含有する混合物中の種々のＴ
４濃度を使用して行った実験を「表２」に示す。
【００６２】
【表２】 これに従って、良好な傾斜を有する合計Ｔ４試験は、８
〜３０ミリモルの範囲の混合物中のＤＲ濃度で行われ得
る。
【００６３】実施例５ 全チロキシン（Ｔ４）の定量用試験担体
【００６４】１
．試験担体の構築および機能試験担体の構築および機能
は「図１」と同じである。血清中に存在する全チロキシ
ンを検出可能とするために、第１試薬層８に位置してい
る適切な置換試薬によって蛋白結合Ｔ４を放出するのが
必要である。
【００６５】２．分離層１３の調製 ２．１　　ＴｉＯ２のアミノ−シラン化（ＴｉＯ２−Ｓ
ｉ）再蒸留水１０００ミリリットルにＴｉＯ２［ＲＮ４
３；ドイツ連邦共和国レファークセンのクロノス−チタ
ン（Ｋｒｏｎｏｓ−Ｔｉｔａｎ）］５０ｇを懸濁し、ｐ
Ｈをモニターしながら（ｐＨ３〜４）、３−アミノプロ
ピル−トリエトキシシラン［ドイツ連邦共和国ダイセン
ホフェンのシグマ−ヘミィ（Ｓｉｇｍａ−Ｃｈｅｍｉｅ
）］１０ミリリットルと一緒に７５℃で２時間撹拌する
。その後、ガラスフィルター（Ｇ５）上でアスピレート
し、ｐＨが中和になるまで再蒸留水で洗浄する。
【００６６】２．２　　架橋分子の合成（ＴｉＯ２−Ｓ
ｉ−ＧＡ−Ｃｃ）グルタルジアルデヒド溶液［水中２５
％、ドイツ連邦共和国ダイセンホフェンのシグマ−ヘミ
ィ（Ｓｉｇｍａ−Ｃｈｅｍｉｅ）］２５０ミリリットル
にシラン化二酸化チタン（ＴｉＯ２−Ｓｉ）５０ｇを懸
濁し、ｐＨ７．４で１２時間撹拌する。その後、ガラス
フィルター（Ｇ５）上でアスピレートし、次いで、まず
再蒸留水で洗浄し、次いで、０．５Ｍリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７．６）で洗浄する。固相にリン酸塩緩衝液２２５
ミリリットルを吸収させ、クロテイン−Ｃ溶液［リン酸
塩緩衝液中１０％；ドイツ連邦共和国ネーテタルのクロ
ダ（Ｃｒｏｄａ）から入手したクロテイン（Ｃｒｏｔｅ
ｉｎ）　Ｃ］２５ミリリットルと一緒に１２時間撹拌す
る。残存する遊離アルデヒド基を飽和するために、リン
酸塩緩衝液中で洗浄した固相５０ｇを、０．５Ｍグリシ
ンを含有する０．５Ｍリン酸塩緩衝液５００ミリリット
ル中で１時間撹拌する。強く洗浄した後（再蒸留水）、
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）４５０ミリリットル中に
沈殿物（約５０ｇ）を取り、シアノホウ水素化ナトリウ
ム（ホウ酸塩緩衝液中５％）５０ミリリットルと一緒に
１５分間撹拌し、シッフ塩基を還元する。 次いで、ガラスフィルター（Ｇ５）上でアスピレートし
、リン酸塩緩衝液および再蒸留水で洗浄する。
【００６７】２．３　　分析物アナログとしてＢＯＣ−
Ｔ４−ヒドロキシスクシンイミド（ＴｉＯ２−Ｓｉ−Ｇ
Ａ−Ｃｃ−Ｔ４）の結合 ０．０６Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．８）２００ミリ
リットルにＴｉＯ２−Ｓｉ−ＧＡ−Ｃｃ　１０ｇを懸濁
し、暗所で、ＢＯＣ−Ｔ４−ヒドロキシスクシンイミド
溶液（ジオキサン中０．０５％）１７０ミリリットルと
一緒に２時間撹拌する。その後、０．０６Ｍ　Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４／ジオキサン（１０：８．５）で洗浄し、次いで
、再蒸留水で数回洗浄し、アスピレートする。
【００６８】２．４　　ファブリック上へのフィルム塗
布下記「表３」の組成物を含有する塗布材料を、湿フィ
ルム厚３５０μのファブリック　ＰＥ　８１２　Ｋ６［
スイス国タールのシュヴァイツェリシェ・サイデンガツ
ェファブリク（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｉｓｃｈｅ　Ｓｅｉ
ｄｅｎｇａｚｅｆａｂｒｉｋ）］に塗布し、乾燥する。
【００６９】
【表３】
【００７０】３．第１試薬層８上の置換試薬の調製Ｇａ
ｌ緩衝液に２００ｍＭ置換試薬（２，２’−ジヒドロキ
シ−４，４’−ジメトキシジフェニルメタン−５，５’
−ジスルホン酸（ジナトリウム塩））を溶解し、ティー
バッグ紙［ＧＦＲゲルンシャイムのシェラー・アンド・
ヘシュ（Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｅｓｃｈ）
］上に浸み込ませる。
【００７１】
【表４】
【００７２】４．コンジュゲート層として第２試薬層９
の調製 以下の溶液をファブリック　ＰＥ　１４　１００　ノー
マル［スイス国タールのシュヴァイツァー・サイデンガ
ツェファブリク（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ　Ｓｅｉｄｅｎｇ
ａｚｅｆａｂｒｉｋ）］上に浸み込ませる。
【００７３】
【表５】
【００７４】５．基質層として第３試薬層１４の調製フ
ァブリック　ＰＥ　ＨＤ−１［スイス国タールのシュヴ
ァイツァー・サイデンガゼファブリク（Ｓｃｈｗｅｉｚ
ｅｒ　Ｓｅｉｄｅｎｇａｚｅｆａｂｒｉｋ）］上への注
入。注入溶液の組成：Ｇａｌ緩衝液中２０ｍＭクロロフ
ェノール・レッド−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）（欧州特
許出願第０１４６８６６号に従って製造した）。
【００７５】６．結果 種々の全Ｔ４濃度を有する血清３マイクロリットルを試
験片に塗布し、５６７ｎｍで本出願人の「リフロトロン
（Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ）」装置で測定する。
【００７６】
【表６】
【００７７】２．０〜１７．０μｇ／ｄｌの臨床学的に
適切な範囲に達することができるグラデーションによっ
て、非常に良好な精度で測定できる。
【００７８】実施例６ 置換試薬による酵素マーカーとしてのβ−ガラクトシダ
ーゼの酵素活性への影響
【００７９】Ａ）試験方法 以下の成分を、逐次、ピペットで遠心管に入れる：５μ
ｇ／ｄｌのＴ４を有する血清８０マイクロリットル、緩
衝液に入れた置換試薬溶液２０マイクロリットル（０〜
４０ミリモル）。
【００８０】次いで、２分間混合する。次に、この混合
物に緩衝液に入れた（抗−Ｔ４抗体）−β−ガラクトシ
ダーゼコンジュゲート２５マイクロリットル（４０Ｕ／
ミリリットル）を添加する。緩衝液は置換試薬について
と同一である。再度、２分間混合する。
【００８１】次いで、緩衝液に入れたクロロフェノール
レッド−ガラクトシド７５０マイクロリットル（１ミリ
モル）にこの混合物２０マイクロリットルを添加する。
【００８２】クロロフェノールレッド−ガラクトシドは
欧州特許出願第０１４６８６６号に従って調製する。
【００８３】短時間混合した後、５７８ｎｍで吸光度変
化／分を測定する。
【００８４】各々の場合、使用した緩衝液は以下の物質
の水溶液（ｐＨ＝７．０）である。 ＫＨ２ＰＯ４　　　　１０ミリモル ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　５ミリモルＮａＣｌ　　
　　　　　　２５ミリモル
【００８５】Ｂ）結果 ａ）物質２−ヒドロキシ−４−メトキシジフェニルメタ
ン−５−スルホン酸（ナトリウム塩）（α）（実施例１
参照）、２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキ
シジフェニルメタン−５，５’−ジスルホン酸（ジナト
リウム塩）（β）（実施例２参照）および２−ヒドロキ
シ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸（γ
）（従来技術；欧州特許出願第０１３３４６４号参照）
について使用した置換試薬（ＤＲ）の濃度に対する測定
シグナル（吸光度変化／分）の依存性を酵素活性の尺度
として「表７」に示す。
【００８６】
【表７】
【００８７】本発明の物質（α、β）はβ−ガラクトシ
ダーゼ活性への影響を示さないが、従来技術の置換試薬
（γ）によって、酵素活性は実質的に影響される。より
高いＤＲ濃度で、酵素活性は非常に減少する。
【図面の簡単な説明】
【図１】　　本発明の試薬を使用し得る試験担体の断面
図。
【符号の説明】
１・・・試験担体、２・・・基層、３・・・試験領域、
４・・・試料塗布帯域、５・・・試験帯域、６・・・被
覆ネット、７・・・赤血球分離用層、８および９・・・
試薬層、１１・・・液体移動層、１３および１４・・・
試験層、１５・・・被覆ホイル。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　一般式Ｉ： 【化１】 ［式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシ、Ｒ２は水素また
    はヒドロキシ、Ｒ３は水素またはアルコキシ、Ｒ４は水
    素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応する酸
    の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対
    応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表す］で示される化
    合物。
  2. 【請求項２】　　Ｒ１が水素またはヒドロキシ、Ｒ２、
    Ｒ３およびＲ４が水素、Ｒ５がＳＯ３Ｈまたは対応する
    酸の塩、Ｒ６がアルコキシを表す請求項１記載の一般式
    Ｉの化合物。
  3. 【請求項３】　　Ｒ１が水素またはヒドロキシ、Ｒ２が
    ヒドロキシ、Ｒ３がアルコキシ、Ｒ４がＳＯ３Ｈまたは
    対応する塩、Ｒ５がＳＯ３Ｈまたは対応する塩、Ｒ６が
    アルコキシを表す請求項１記載の一般式Ｉの化合物。
  4. 【請求項４】　　一般式ＩＩ： 【化２】 ［式中、Ｒ２は水素またはヒドロキシ、Ｒ３は水素また
    はアルコキシ、Ｒ４はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２
    または対応する酸の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、Ｐ
    Ｏ３Ｈ２または対応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表
    す］で示される化合物を還元することを特徴とする一般
    式Ｉ：【化３】 ［式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシを表し、Ｒ２〜Ｒ
    ６は上記一般式ＩＩの定義と同じである］で示される化
    合物の製造方法。
  5. 【請求項５】　　一般式Ｉ： 【化４】 ［式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシ、Ｒ２は水素また
    はヒドロキシ、Ｒ３は水素またはアルコキシ、Ｒ４は水
    素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応する酸
    の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対
    応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表す］で示される化
    合物を置換物質として試料に添加することを特徴とする
    、特に免疫学的方法によって、蛋白結合ヨードチロニン
    を置換および放出する物質を添加して試料中の全ヨード
    チロニンを測定することによるヨードチロニン−結合蛋
    白の存在下での液体試料中のヨードチロニン測定方法。
  6. 【請求項６】　　一般式Ｉ： 【化５】 ［式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシ、Ｒ２は水素また
    はヒドロキシ、Ｒ３は水素またはアルコキシ、Ｒ４は水
    素、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対応する酸
    の塩、Ｒ５はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２または対
    応する酸の塩、Ｒ６はアルコキシを表す］で示される化
    合物を置換物質として含有することを特徴とする、ヨー
    ドチロニンを結合する蛋白からヨードチロニンを置換す
    るための物質および遊離非結合ヨードチロニンによって
    試料中のヨードチロニンの量の尺度を表すシグナルを生
    じる薬物を含有する試料中でのヨードチロニン測定用試
    薬。
  7. 【請求項７】　　ヨードチロニンを結合する蛋白からヨ
    ードチロニンを置換するために含有される物質が遊離非
    結合ヨードチロニンによって被験試料中のヨードチロニ
    ンの量の尺度であるシグナルを生じる薬物と空間的に分
    離されている請求項６記載の試薬。
  8. 【請求項８】　　ヨードチロニンを結合する蛋白からヨ
    ードチロニンを置換するための物質が固体担体中または
    上に存在する請求項６または７記載の試薬。
  9. 【請求項９】　　担体に結合して存在する請求項６〜８
    のいずれか１項記載の試薬。
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