JP4243372B2 - 乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は乾式塗膜要素およびイムノアッセイにおけるそれの使用に関する。より詳しくは、本発明は乾式塗膜要素における標識免疫反応体の安定性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然免疫反応を利用するイムノアッセイは、臨床化学分野において分析技法として幅広く使用されている。反応の特異性故に、イムノアッセイは生物学的流体中に極低濃度で存在する生物学的分析物（analyte ）を定量するのに特に有利である。このような分析物としては、例えば、抗原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク質、等が挙げられる。
【０００３】
アッセイの標的物質である分析物を本明細書では「リガンド」と称する。リガンドを特異的に認識し且つ該リガンドと反応して複合体を形成する化合物を本明細書では「レセプター」と称する。このレセプターとリガンドは接合体ペア（conjugate pair）を形成する。このペアのいずれのメンバーもレセプターまたはリガンドとして機能することができる。
【０００４】
競合アッセイの場合、標識された免疫応答性誘導体をはじめとする標識分析物およびそのような分析物の類似体が前記アッセイの典型成分であり、一方、サンドイッチアッセイの場合には、分析物のための標識レセプターが典型的に使われる。本明細書ではこれらをそれぞれ標識リガンドおよび標識レセプターと称する。
【０００５】
競合結合イムノアッセイでは、標識リガンドが一定量の適当なレセプターとの反応を目当てにした未標識リガンドとの競合状態に置かれる。結合した標識リガンドまたは未結合の（すなわち遊離の）標識リガンドのいずれかの測定シグナルから、リガンドの未知濃度を決定することができる。反応は以下のように進行する。
リガンド ＋ 標識リガンド ＋ レセプター−基質 ＜＝＞
リガンド−レセプター−基質 ＋ 標識リガンド−レセプター−基質。
【０００６】
サンドイッチイムノアッセイまたはイムノメトリックアッセイとして知られている別のイムノアッセイ形式では、別々のエピトープ部位においてリガンドに結合する２種以上のレセプター分子とリガンドとを接触させる。典型的には一方のレセプターが適当に標識されており、そして他方が固体支持体上に固定化されていかまたは固定化することができる。リガンドの量は、リガンドと２種のレセプター間で結合した複合体の量に正比例する。これは以下のように説明される。
基質−レセプター₁ ＋ リガンド ＋ レセプター₂ −標識 ＜＝＞
基質−レセプター₁ −リガンド−レセプター₂ −標識
【０００７】
常用の標識としては放射性標識、酵素、発色団、蛍光団、安定なラジカル並びに酵素補因子、阻害剤およびアロステリックエフェクターが挙げられる。
【０００８】
イムノアッセイ分析要素は米国特許第4,517,288 号及び同第4,258,001 号明細書からも周知である。一般に、このような要素は、粒状層に固定化されたレセプター（例えば、リガンドに対する抗体）を含む。さらに、該要素は通常、結合した種または未結合の種との相互作用を通して、試料中のリガンド濃度に相関させることのできるシグナルを生成する試薬系を含有する。使用する際には、試料を酵素標識リガンドと混合し、そして要素へ適用すればよい。一定時間の後、標識リガンドのための基質を含有する溶液を粒状層に適用する。酵素標識によって基質との反応が触媒されて最終的にシグナル（例えば色）の生成を引き起こす反応生成物を形成させる。この色の反射濃度は試料中のリガンド濃度に相関させることができる。他の既知の常用標識、例えば放射性標識、発色団、蛍光団、安定なラジカル並びに酵素補因子、酵素阻害剤及びアロステリック酵素エフェクターについても同様のシグナル生成系が知られている。
【０００９】
多層イムノアッセイ要素は、上述したイムノアッセイ原理を利用して液体試料中の分析物を測定する乾燥塗膜要素である。競合アッセイ要素では、発色（または別のシグナル生成）の速度が存在する分析物の量に反比例し、サンドイッチアッセイ要素では、発色（または別のシグナル生成）の速度が存在する分析物の量に正比例する。さらに、発色（または別のシグナル生成）速度は、固定化レセプターに結合した酵素標識分析物（例えば薬物）または酵素標識レセプターの活性にも正比例する。イムノアッセイが安定な検定を維持するためには、特定の検定期間中はいずれのスライドにおいても全く酵素活性（測定速度）が失われてはならない。
【００１０】
イムノアッセイ要素は、必要な時に１要素を取り出すことができる50個の独立した要素を含むプラスチック製「カートリッジ」として顧客に供給される場合が多い。これらの要素は、カートリッジ中の下側49個の要素の上面が全てその上の要素によってカバーされるように次々に上に積み重ねられる。しかしながら、この積層品の最上部の要素にはこのようなカバーがないため、その要素の表面は他の49の要素が受けないような環境因子に晒される。例えば、製造中にカートリッジを取り扱っている時やカートリッジが臨床分析装置の要素供給部の中にある時には、最上部（または第一）の要素が残りの要素よりも多く空気流や光に暴露される。
【００１１】
使用前の保存中には、カートリッジそれ自体はホイルで内張りしたシールバッグの中に保存される。しかしながら、最上部要素はまだ他の49の要素よりもシールバッグ内の残留空気や湿気に多く暴露される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
共通の試験液をカートリッジ中の要素と反応させた時、最上部（または第一）要素で観測される発色の速度が、同じ試験液を同一カートリッジ中の最上部要素の下側にある要素に適用した時に観測される発色の速度よりも常に低くなることがわかった。この現象は「第一スライドの偏り（first slide bias）」と呼ばれる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
第一スライドの発色の速度が遅いという問題を処理する１つの方法は、Daniel他による米国特許第5,516,645 号明細書に記載されるようなバナジウムイオンの使用を伴う。本出願人は、「第一スライドの偏り」を減らすための１または複数のテルル化ジアリール（ＤＡＴまたはＤＡＴｓ）の使用を開発した。第一スライドの偏りを防ぐためのテルル化ジアリールの使用は、サンドイッチアッセイと競合イムノアッセイの両方に使用することができる。
【００１４】
本発明の一つの面によれば、リガンドをアッセイするための乾式イムノアッセイ分析要素であって、
(a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含んで成る標識層；
(b) 展開層；
(c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度で含んで成るレセプター層；および
(d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層
を担持しているる支持体を含んで成る、乾式イムノアッセイ分析要素が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
一態様では、前記レセプターは0.1 〜５μm の範囲の直径を有するポリマービーズに共有結合で結合される。好ましい態様では、酵素標識リガンドとテルル化ジアリールが同じグラビア層（または帯域）に存在し、前記グラビア層（または帯域）は液体試料との最初の接触を提供する展開層の表面に隣接しているかまたはそれと連続している。
【００１６】
上述した要素は第一スライドの偏り、すなわちカートリッジ中の最上部要素の発色速度が同一カートリッジ中の他の要素の発色速度に比較して差異があること、を減少させる。更に、カートリッジ中の全ての要素がより長期間の安定性および貯蔵性を示す。本発明の実施例は、テルル化ジアリール（ＤＡＴ）化合物がこれらの利点を提供することを確証する。
【００１７】
加えて、このＤＡＴ化合物は、一般に酵素組成物、特にペルオキシダーゼ、特には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および治療薬、乱用薬物、ステロイド等のような小型分子と酵素（好ましくはＨＲＰ）との接合体を安定化する上でも有用である。別の態様は、酵素が標識として用いられる、酵素（好ましくはＨＲＰ）と大型分子（例えばタンパク質、炭水化物など）との接合体である。例えば、該化合物は、本発明の乾式要素においてだけでなく溶液アッセイにおいても使用することができる。
【００１８】
本発明の別の態様は、水性試料中に含まれる免疫学的反応性リガンドのアッセイ方法であって、
(1) 乾式イムノアッセイ分析要素であって、
(a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含んで成る標識層；
(b) 展開層；
(c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度で含んで成るレセプター層；および
(d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層
を担持している支持体を含んで成る乾式イムノアッセイ分析要素を用意し、
(2) 前記要素の展開層の限定領域を前記試料と接触させ、それにより(i) 固定化リガンド−レセプター複合体、(ii)固定化酵素標識リガンド−レセプター複合体、または(iii) (i) と(ii)の混合物、または固定化レセプター−リガンド−標識レセプター複合体を形成させ、
(3) 前記限定領域を前記酵素標識のための基質溶液と接触させ、それによりシグナルの生成を触媒し、そして
(4) 前記シグナルを検出することにより前記リガンドの濃度を測定する
ことを含んで成る方法を提供する。
【００１９】
上記方法では、酵素標識レセプターまたは酵素標識リガンドが、固定化酵素標識リガンドまたは固定化酵素標識レセプターから分離される。このような分離は、当該技術分野で知られている任意の手段、例えば、過酸化水素溶液などの基質溶液を添加することによって行うことができる。
【００２０】
本発明の要素の１または複数の層は各々１または複数の帯域を含むことができる。要素の連続層はそれらの間にはっきりした境界を有してもよく、光学および／または電子鏡検法によると、それらは該要素の別個の且つ独立した層として見えてもよく、あるいは層の混合が起こって層間の境界がぼやけるかまたは不明瞭である接触した帯域または領域を有してもよい。そのような場合、別個の層は光学および／または電子鏡検法により見えることもあるし見えないこともある。帯域の形成は部分的であっても実質的に完全（または完全）であってもよい。部分的帯域形成の場合、別々に付着させた１もしくは複数の連続層の中に１または複数の帯域を含むように、付着層の一部だけが浸透して、別々に付着させた連続層に浸透しそれと混合することができる（両層が相互に互いに浸透してもよいが、どの場合でも、両層の一部を含んで成る帯域が形成し、そして両者が記載のような帯域形成をもたらすので、個別のおよび相互の層浸透が共に期待される）。
【００２１】
他方、別々に付着させた層の大部分または全部が、それが光学および／または電子鏡検法により該要素の連続層から別個のまたは離れた層として見えることがないように実質的にもしくは完全に１または複数の連続層の内部に含まれるようにして、１または複数の連続層に浸透し混合して１または複数の連続層の中に１または複数の帯域を形成してもよい。部分もしくは完全な帯域が故意に形成されてもよくまたはやむを得ず形成してもよい。故意に形成される場合、層の中の帯域は、実施者が１または複数の特定の成分を１または複数の層の中に混和させるか、含有せしめるか、または層の中の帯域の中に混入させることができる任意の方法で提供することができる。例えば、ポリマーまたは他のマトリックス中に１または複数の特定成分を封入し、次いで該マトリックスを１または複数の層の中に混和させることができる。
【００２２】
あるいは、本発明の別の態様は、２つの隣接した層と連続している特定成分Ａ（または複数成分）を含んで成る１つの層を、該成分が２つの連続層のうちの１つの中に可溶であるように調製してもよいことに関する。最初の接触の間またはその後に、該成分が可溶である連続層の中に完全なまたは部分的帯域が形成される。連続層の中のこの帯域は、従って、特定成分Ａを含んで成る。この帯域の形成は上記に記載したように部分的であっても全体的（完全）であってもよい。帯域形成の程度は、層を用意するのに使われる溶剤、乾燥前の層の接触時間、温度などといった、塗布技術の熟練者に周知であるような条件の調整により調節することができる。標識層、レセプター層、グラビア層および／または他の層という用語を用いて定義される乾式イムノアッセイ要素は、該要素の標識層、レセプター層、グラビア層および／または別の層が別々の異なる層を形成するか、あるいは指摘の層の付着中または付着後に１もしくは複数の連続層の中に１もしくは複数の部分的または完全な帯域を形成することができる全ての態様を包含するということを理解すべきである。
【００２３】
グラビア層は、別の層、例えば展開層の表面上に付着された１または複数の成分を含んで成る薄層である。「グラビア層」という用語は薄層を意味し、ここで「薄」とは、その層が接触している１または複数の連続層に相対して厚さが薄いことを表すために使われる相対的用語である。この用語は、グラビア塗布法がテルル化ジアリール（および／または別の成分）を含んで成る薄層を塗布するのに好ましい手法であるので、便宜上の用語である。この用語の使用は、どんな形でも制限する意図のものではない。上記に明記したような薄層の塗布、付着または別のやり方の据え付けを可能にする任意の手段が「グラビア層」の用語の範囲内に含まれると見なされる。本発明の要素の展開層の上に直接塗布されたグラビア層は、展開層上の別個のまたは分離した層として見えないかもしれない。グラビア層はそれとの初期接触を経験する展開層（または別の層）の表面の上に、上と内部に、またはすぐ下に、薄い連続帯域を形成すると予想される。どんな場合でも、液体試料をグラビア層および／または帯域を含んで成る展開層と接触させると、展開層自体の多孔性のため、液体試料は展開層の成分、ビーズなどと直接接触して、試料の展開と計量（これらの用語は当業界で既知である）を可能にするだろう。よって、グラビア層および／または帯域を有する要素を液体試料と接触させるということは、展開層の展開、計量および他の機能が妨げられない時、展開層を液体試料と接触させるという言葉で簡単に説明することができる。
【００２４】
下記に記載するＴｅ５は、本出願人らの前の出願において教示されている一般式Ａｒ¹ −Ｔｅ−Ａｒ² を有する多数の種のうちの１種を表す。更に、本発明者らは、テルル化ジアリール、特に下式で示されるＴｅ５：
【００２５】
【化７】

【００２６】
が、カルバマゼピン（ＣＲＢＭ）競合イムノレートアッセイのイムノアッセイ要素のグラビア層中に１mMの最終再水和（rewet ）濃度で混和されると第一スライドの偏りを著しく減少させることを発見した。第一スライドの偏りの有意な減少は１年の期間に渡り観察された。実際、第一スライドは非第一スライド対照から区別できない。同レベルのＴｅ５を、ビーズ展開層上に塗布されたグラビア層ではなくむしろビーズ展開層に直接塗布すると、それは第一スライドの偏りの発生を予防するのに不十分である。また、カルバマゼピン（ＣＲＢＭ）、フェノバルビタール（ＰＨＢＲ）、フェニトイン（ＰＨＴＹ）およびジゴキシン（ＤＧＸＮ）の測定用に設計された乾式イムノアッセイ要素のグラビア層中への0.25〜0.50 mM （要素の再水和時）のＴｅ５の混和が、６か月および９か月の凍結保存後に第一スライドの偏りを有意に減少させることもわかった。
【００２７】
本発明は、一般に、展開層上に付着されたグラビア層に塗布されたテルル化ジアリール化合物を含んで成る、改良型乾式イムノアッセイ要素に向けられる。しかしながら、グラビア層は別の層の上に付着されていてもよい。
別の面では、本発明は、前記改良型乾式塗膜要素を使ったイムノアッセイの実施方法に関する。
【００２８】
本発明の要素は、標識リガンドまたは標識レセプター、展開層（または帯域）、レセプター層（または帯域）およびグラビア層（または帯域）を含んで成る。これらの帯域および層は前に定義した通りである。各種の帯域が一つの塗布層に存在してもよいし、また別々の塗布層に存在してもよい。例えば、展開帯域とレセプター帯域が単一層にあってもよく、或いはそれらが別々の層にあってもよい。別々の層は、支持体上に任意の順序で配置することができる。また、支持体上に直接レセプター層があり、そのレセプター層のすぐ上に展開層があり、そして展開層の上に標識リガンドまたは標識レセプター帯域があるように、別々の層を配置させることができる。レセプター帯域が完全に別々の層を形成する場合、その層は後述のタイプのバインダーも含むだろう。本発明の要素はグラビア層のような追加の層を含むことができる。このような層はいずれも当該技術分野で周知の塗布技法によって塗布することができる。
【００２９】
テルル化ジアリールである代表的化合物は下式：
Ａｒ¹ −Ｔｅ−Ａｒ²
を有する。テルル化ジアリールは、後述するヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）イムノアッセイ要素のような、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識免疫反応体を含んで成るイムノアッセイ要素に含められると、第一スライドの偏りを有意に減少させる。これらの化合物のサブセットを、第一スライドの偏りを防止する能力について化合物を評価するために設計されたモデル系において試験すると、ＨＲＰ活性を保持することも証明された。
有用なジオルガノテルル化物としては、Ａｒ¹ およびＡｒ² が同一もしくは異なるアリール基または同一もしくは異なるヘテロアリール基（下記に定義される）である物質が挙げられる。
【００３０】
【化８】

【００３１】
上式中、ＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであり；
Ｒ¹¹，Ｒ¹²，Ｒ¹³，Ｒ²¹，Ｒ²²，Ｒ²³，Ｒ³¹，Ｒ³²，Ｒ³³，Ｒ⁴¹，Ｒ⁴²およびＲ⁴³は同一であるかまたは異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、ＯＨ、ＯＲ¹ 、ＳＨ、ＮＨ₂ 、ＮＨＲ¹ 、ＮＲ¹ ₂、ＮＲ¹ Ｒ² 、ＣＯ₂ Ｈおよびその塩、ＣＯ₂ Ｒ¹ 、ＳＯ₃ Ｈおよびその塩、ＰＯ₃ Ｈ₂ およびその塩並びにＳＲ¹ から成る群より各々選ばれ、ここでＲ¹ とＲ² は異なり且つ１個または数個の親水基を担持することがある炭素原子数１〜14の炭素鎖を有するアルキル、フェニルまたは置換フェニルから成る群より各々選ばれ；
Ｒ¹⁴，Ｒ¹⁵，Ｒ²⁴およびＲ²⁵は同一であるかまたは異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、炭素原子数１〜５のアルコキシ、ＣＯ₂ Ｈおよびその塩、ＣＯ₂ Ｒ¹ （Ｒ¹ は上記した通り）、ＳＯ₃ Ｈおよびその塩、ＰＯ₃ Ｈ₂ およびその塩から成る群より各々選ばれる。
【００３２】
上記において、「アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、 sec−ブチル、tert−ブチル、アミル、イソアミルまたはネオペンチルのような基を意味する。「炭素原子数１〜５の炭素鎖」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、 sec−ブチル、tert−ブチル、アミル、イソアミルまたはネオペンチルのような直鎖状または分枝状の炭素鎖を意味する。「炭素原子数１〜14の炭素鎖」には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、 sec−ブチル、tert−ブチル、アミル、イソアミル、ネオペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、テトラデシル等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
「親水基」とは、スルホン酸、ホスホン酸、カルボン酸、ヒドロキシル基およびアミノ基のような基を意味する。これらの化合物の幾つかはいずれかの酸または塩基と塩を形成することができる。ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩、塩酸、臭化水素酸、リン酸および硫酸との塩、並びにシュウ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、クエン酸およびコハク酸のような有機酸との塩が好ましい。
【００３４】
好ましいＤＡＴは、水溶性を付与する基、例えば、限定するものではないが、ヒドロキシル基、アミンおよびその塩並びにカルボン酸およびその塩を含有する置換基を芳香環上に有するものである。特に、単独でまたはバナジル化合物と共同してＨＲＰ活性を保存する水溶性ＤＡＴ化合物は以下のものである（Ｔｅ１−Ｔｅ５）：
【００３５】
【化９】

【００３６】
展開層に用いられる他の材料については、例えば米国特許第4,258,001 号明細書に開示されている乾式分析要素の製造技術において周知である。このような層は、布や紙などから製造されたマクロ多孔質層を包含する。好ましい粒状層はビーズ展開層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈したまたは未希釈の検査試料（例えば１〜200 μＬ）を収容する本発明の要素において使用するのに適した多孔性を有するように容易に構築することができる。展開層は等方性多孔質であることが好ましく、この特性は帯域を含んで成る粒子間の連続空間によって造られる。「等方性多孔質」とは、展開層が適用された液体をあらゆる方向で層全体に均一に展開させることを意味する。
【００３７】
ビーズ展開層をはじめとする有用な展開層が米国特許第4,670,381 号、同第4,258,001 号および同第4,430,436 号明細書に記載されている。特に有用な展開層は、米国特許第4,258,001 号明細書に記載されている有機ポリマー粒子とその粒子のための高分子接着剤とから形成された粒状構造を有する展開層である。展開層に有用な有機ポリマー粒子は、一般に直径約10〜40μｍの範囲内またはこれより小さい粒度を有する熱安定性の球形ビーズである。
【００３８】
これらの粒子は、必要な特性を有する、天然ポリマーと合成ポリマーの両方を含む多種多様な有機ポリマーから構成され得る。しかしながら、上記特許明細書に記載されている１または複数の付加ポリマーから構成されることが好ましい。
【００３９】
レセプター層が別個の層である場合には、それは支持体上に、または支持体の上の試薬層もしくは下塗層の上に、調製され且つ塗布される。レセプターは、レセプター上の表面の反応性基（求核性遊離アミノ基やスルフヒドリル基）を介してポリマー粒子に共有結合で取り付けられる。
【００４０】
レセプターを小さなポリマービーズに結合させる一般的手法として、特定のレセプターを一般に既知の反応によってビーズに共有結合で取り付ける方法がある。多くの側基、例えば、ハロアルキル、２−置換活性エチルスルホニルおよびビニルスルホニルを使って、レセプターをビーズに直接結合させることができる。一般に、水性緩衝液（pHは一般に約５〜約10である）中で、約0.1 〜約40重量％のポリマー粒子濃度、好ましくは約0.1 〜約10重量％のポリマー粒子濃度でビーズとレセプターの混合が行われる。レセプターの量は、ポリマーに対する比率で約 0.1：1000〜約１：10、好ましくは約１：100 〜約１：10である。混合は約５〜約50℃、好ましくは約５〜約40℃の範囲の温度において約0.5 〜約48時間実施される。任意の適当な緩衝液が使用可能である。
【００４１】
場合により、リガンドを共有結合させるために外面上の反応性側基を修飾または活性化する必要がある。例えば、カルボキシル基は、1992年７月22日発行の欧州特許第308235号公報や米国特許第5,155,166 号明細書に記載されている既知のカルボジイミドまたはカルバモイロニウム化学を使って活性化する必要がある。
【００４２】
しかしながら、カルボキシル基を含む単分散ポリマービーズへのレセプターの結合は二段階で行われる。第一段階は、該粒子の水性懸濁液をカルボジイミドまたはカルバモイロニウム化合物と接触させて、カルボキシル基の代わりに中間反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子を生成させることを含む。この段階は、所望のｐＨを提供するために適当な酸または緩衝剤を用いて適当なｐＨにおいて実施される。一般に、ｐＨは６未満であるが、反応が進行できる限りこれは重要でない。おそらく、ｐＨは約3.5 〜約７であろう。粒子表面上のカルボキシル基に対するカルボジイミドまたはカルバモイロニウム化合物のモル比は約10：１〜500 ：１である。
【００４３】
この方法の第二段階では、第一段階で形成された反応性中間体を反応性アミン基またはスルフヒドリル基含有のレセプターと接触させる。これにより粒子とレセプターとの間に共有結合が形成される。レセプター対ポリマー粒子の重量比は、一般に約１：1000〜約１：１、好ましくは約１：100 〜約１：10である。
【００４４】
別の場合として、外面上のエポキシ基を加水分解して、免疫学的種の中のアミン基に対するカップリング剤として作用できる臭化シアンと反応することができるジオール化合物を形成させることができる。アルデヒドをアミンと直接反応せしめてシッフ塩基を生成させ、続いてこのシッフ塩基を還元して共有結合を形成させてもよい。別法として、アルデヒドを酸化して酸にし、そしてカルボキシル基について上述した化学を使ってアミド結合を形成させることもできる。
【００４５】
レセプターが、ポリマー上の反応性基と反応するか、またはポリマーが反応性カルボキシル基を有する場合にはポリマー粒子上のカルボキシル基とカルボジイミドもしくはカルバモイロニウム化合物との反応によって生成した中間体と反応するであろう、反応性アミンまたはスルフヒドリル基をそれぞれ含有する限り、いずれの反応性アミンまたはスルフヒドリル含有のレセプターでも単分散ポリマービーズに結合させることができる。
【００４６】
レセプター上のアミンまたはスルフヒドリル基と直接に反応しやすい反応性基を有する小さなポリマービーズは、必要ならば適当な緩衝液中で、レセプターと単に混合することにより反応させることができる。
【００４７】
レセプター用のビーズを中から選ぶことができるポリマーとしては次のものが挙げられる：ポリ（ｍ−＆ｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）〔モル比67：30：３〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）〔モル比95.5：4.5 〕、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド｝〔モル比99.3：0.7 〕、ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比95：５、98：２および99.8：0.2 〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比93.5：4.5 ：2 〕、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸｝〔モル比97.3：0.7 ：2 〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）〔モル比70：30〕、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕〔モル比97.6：2.4 〕、ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジルクロリド−コ−アクリル酸）〔モル比85：10：５〕、ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）〔モル比99：１〕、ポリ（スチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比90：10〕、ポリ（スチレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ＆ｐ−ジビニルベンゼン）〔モル比89：10：１〕、ポリ（スチレン−コ−２−カルボキシエチルアクリレート）〔モル比90：10〕、ポリ（メチルメタクリレート−コ−アクリル酸）〔モル比70：30〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−ビニルベンズアルデヒド）〔モル比95：５〕、およびポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−ビニルベンズアルデヒド−コ−メタクリル酸）〔モル比93：５：２〕。
【００４８】
要素の各層は適当な支持体の上に担持される。レセプター層は支持体上に塗布されるが、支持体とレセプター層との間にゼラチン／緩衝剤層のような中間介在層が存在してもよい。支持体は、寸法安定性がよく、好ましくは非多孔質で約200 〜約900 nmの波長の電磁線を透過する透明な（すなわち、電磁線透過性）材料であればいずれの適当な材料であってもよい。意図する検出様式（反射、透過、発光または蛍光分光法）と適合するように、特定の要素について支持体を選定する必要がある。有用な支持体材料としてはポリスチレン、ポリエステル〔例えばポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例えば酢酸セルロース）等が挙げられる。
【００４９】
レセプター層のためのポリマーバインダーは、カナダ国特許第1,240,445 号明細書に総括的に記載されており、本明細書では参考としてこれを特別に援用する。有用なポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのようなＮ−アルキル置換アクリルアミドの重合体を約30〜97重量％含むポリマーである。他の有用なＮ−アルキル置換アクリルアミドとして、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドおよびＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドが挙げられる。これらのバインダーの有用性を例証するために、実施例においてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドが用いられる。
【００５０】
このポリマーバインダーは、１分子当たり少なくとも２個の付加重合性基を有する１または複数の重合架橋用モノマーを約３〜25重量％更に含んで成る。これらの架橋用モノマーは当該技術分野では一般に周知である。好適な架橋用モノマーは、Ｎ−アルキル置換アクリルアミドとの重合を促進するためにアクリルアミド基またはメタクリルアミド基を含有する。
【００５１】
有用な架橋用モノマーの例として、次のものが挙げられる：
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド；
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスメタクリルアミド；
エチレンジメタクリレート；
２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート；
ジビニルベンゼン；
モノ〔２，３−ビス（メタクリロイルオキシ）プロピルホスフェート；
Ｎ，Ｎ′−ビス（メタクリロイル）尿素；
トリアリルシアヌレート；
アリルアクリレート；
アリルメタクリレート；
Ｎ−アリルメタクリルアミド；
４，４′−イソプロピリデンジフェニレンジアクリレート；
１，３−ブチレンジアクリレート；
１，４−シクロヘキシレンジメチレンジメタクリレート；
２，２′−オキシジエチレンジメタクリレート；
ジビニルオキシメタン；
エチレンジアクリレート；
エチリデンジアクリレート；
プロピリデンジメタクリレート；
１，６−ジアクリルアミドヘキサン；
１，６−ヘキサメチレンジアクリレート；
１，６−ヘキサメチレンジメタクリレート；
フェニルエチレンジメタクリレート；
テトラメチレンジメタクリレート；
２，２，２−トリクロロエチリデンジメタクリレート；
エチレンビス（オキシエチレン）ジアクリレート；
エチレンビス（オキシエチレン）ジメタクリレート；
エチリジントリメタクリレート；
プロピリジントリアクリレート；
ビニルアリルオキシアセテート；
１−ビニルオキシ−２−アリルオキシエタン；
２−クロトノイルオキシエチルメタクリレート；
ジアリルフタレート；および
２−（５−フェニル−２，４−ペンタジエノイルオキシ）エチルメタクリレート。
【００５２】
これらのポリマーバインダーは、重合した親水性モノマーを０〜60重量％含むこともできる。５〜35重量％の量も有用である。親水性モノマーはカナダ国特許第1,240,445 号明細書に開示されている。具体的には、このようなモノマーはヒドロキシ、ピロリドン、アミン、アミド、カルボキシ、スルホ、カルボン酸塩、スルホン酸塩および硫酸塩の基の中から選ばれた１または複数の基を有する。一般に、上記塩の基の対イオンはアルカリ金属またはアンモニウムである。有用な親水性モノマーはアクリル酸およびメタクリル酸並びにそれらの塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレートおよびグリセリルメタクリレートである。
【００５３】
更に、先に列挙したバインダーは、押出ホッパー塗布工程中の剪断減粘性により達成される非常に低いバインダー粘性のため、レセプター層の均一塗膜を形成できるようにする。列挙したバインダーを使うと、均一塗膜の形成直後にバインダーの粘性が実質的に増加し、バインダーの乾燥や湿式輸送の間中、安定性と均一性が維持される「セット層」が得られるという、更なる利点が得られる。
【００５４】
レセプターはまた、8000〜400,000 の範囲の分子量を有するポリ（ビニルアルコール）、ウシ血清アルブミン、アラビアゴムおよびＮ−ビニルピロリドンのホモポリマー；並びにアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキル置換アクリルアミド、Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−アルキル置換−１−ビニルイミダゾール、２−ヒドロキシアルキル置換−１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸から成る群より選ばれた二種以上のモノマーを有する水溶性ビニル付加コポリマー（ここで前記コポリマー中のアルキルおよびヒドロキシアルキルはメチル、エチル、プロピルおよびヘキシルのように１〜６個の炭素原子を含有する）から成る群より選ばれたポリマーバインダー中に分散させることもできる。
【００５５】
本発明の要素は、１または複数の追加の層、例えば、電子移動剤のような別の必要な添加剤を含有する、別個のまたは合体させたゼラチン／緩衝剤層および試薬／展開層を含むことができる。
【００５６】
該要素のゼラチン／緩衝剤層または試薬層または展開層は、１もしくは複数の合成または天然バインダー材料、例えば、ゼラチンまたは別の天然コロイド、ホモポリマーおよびコポリマー、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）および類似のコポリマー中に分散された１または複数の試薬を含んで成る指示（検知）組成物を含むことができる。この指示組成物はレセプター層に分散されてもよい。
【００５７】
その他の任意の層、例えば、下塗層、輻射線遮断層、等を所望であれば含めることもできる。要素の全ての層は互いに流体接触状態にあり、すなわち、流体並びに該流体中の試薬と複合体形成してない反応生成物は、隣接層の重ね合わされた領域間を透過することができる。
【００５８】
本発明の要素の層は、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤およびその他当該技術分野で周知の物質をはじめとする、望ましいが任意である種々様々な別の成分を含有することができる。これら成分の量の選択も当該分野の技術者の技術範囲内である。
【００５９】
本発明の要素を使用して、生物学的流体（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトまたは動物組織の懸濁液、排泄物、唾液、リンパ液など）のような液体中の低濃度の免疫学的反応性リガンドを測定することができる。これらのリガンドは約10^-15 モル程度の低濃度で、最も一般的には約10^-11 〜約10^-4モルの濃で測定することができる。
【００６０】
このように定量的または定性的に測定することができるリガンドとしては、治療薬（例えばフェノバルビタール、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジン、フェニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラマイシン、リドカイン、プロカインアミド等）、天然または合成ステロイド（例えばコルチゾール、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エストリオール等）、ホルモン（例えば甲状腺ホルモン、ペプチドホルモン、インスリン等）、タンパク質（例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フェリチン、血液凝固因子、Ｃ反応性タンパク質、イソ酵素、ｈＣＧ、アポリポタンパク質等）、抗原、抗体（モノクローナル抗体を含む）、レセプターと自然に反応するその他の種が挙げられる。本発明は、ジゴキシン、フェニトイン、カルバマゼピン、テオフィリンまたはフェノバルビタールのような治療薬、チロキシンまたはトリヨードチロニンのようなホルモン、並びにｈＣＧまたはＣ反応性タンパク質のような分析物の測定に特に有用である。分析はリガンドに結合して標識リガンドを形成することができる任意の酵素標識を使用して実施することができる。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼおよびガラクトシダーゼのような酵素が好ましい標識である。
【００６１】
特定の標識に適した基質を決めることは臨床化学分野における当業者の技術範囲内である。基質は、酵素標識によって直接に作用を受ける物質であるか、或いは該標識の酵素反応を含む一連の反応に関与する物質であることができる。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、その基質は過酸化水素と適当な還元剤である。一例としてグルコースオキシダーゼを使用する時、その基質であるグルコースは、約0.01モル／ｍ² 、好ましくは約0.001 〜約0.1 モル／ｍ² となるように通常は試薬層内に存在するかまたは基質溶液として添加される。当業者であれば、アッセイに使用する酵素標識の量に対して特定の基質の量を調整する方法を知っているだろう。
【００６２】
試薬層は、酵素標識により触媒される反応の結果として検出可能な種を提供する１または複数の試薬を含んで成る指示組成物を含有することができる。この検出可能な種は、発色性のもの、放射性のもの、蛍光性のもの、または化学発光性のものであることができる。当該目的上、酵素標識リガンド類似体と基質との酵素反応の結果として比色法により検出可能な種を提供する比色用指示組成物を使って本発明を説明する。
【００６３】
この指示組成物は、酵素反応によって検出可能な色素を生成する単一化合物であるか、或いは色素を生成する試薬の組合せであることができる。例えば、基質としてグルコースを使用し且つ酵素標識としてグルコースオキシダーゼを使用する場合、比色用指示組成物は、反応して色素を生成する被酸化性化合物とカプラーを含むことができる。あるいは、該組成物は、ロイコ色素とペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化する時に生じる過酸化水素の生成の結果として検出可能な色素を生成する別の適当な過酸化性化合物を含むことができる。有用なロイコ色素は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第4,089,747 号（1978年５月16日、Bruschi に対して発行）および米国特許第4,670,385 号（1987年６月２日、Babb他に対して発行）明細書に記載されているものが挙げられる。比色用指示組成物の特定量およびそれの種々の成分については当業者であれば適宜選定することができる。
【００６４】
標識リガンドは、既知の出発物質と手順を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、リガンドは標識（例えば酵素成分）に共有結合を通して結合される。
【００６５】
イムノアッセイ法は手動であっても自動化されてもよい。一般に、液体中のリガンドの量は、供給ロール、チップパケットまたはその他の供給源から本発明の要素を取り出し、そして該要素の展開層の限定領域を該液体の試料（例えば１〜200 μＬ）と物理的に接触させることにより測定される。接触させられる限定領域の面積は一般に約150 mm² 以下である。
【００６６】
リガンドの量は、複合体形成したリガンド類似体を直接検出するための、または酵素標識と基質との酵素反応の結果として形成される検出可能な種を検出するための、適当な装置に要素を通過させることによって測定される。例えば、一般に知られている手順を用いて適当な分光光度分析装置を使ってこれらの種を検出することができる。酵素反応においては、得られた生成物は、例えば検査試料と接触せしめた限定領域中の反射密度または透過密度の変化率を測定することによって分析される。測定される領域の直径は約３〜約５mmである。液体試料中のリガンドの量は、競合アッセイの場合は限定領域において測定された標識の量に反比例し、サンドイッチアッセイの場合には正比例する。通常、標識の測定は基質溶液を適用した後に行われる。
【００６７】
１．テルル化ジアリールの合成
ＤＡＴを調製するには多くの合成経路がある。特定の化合物に対して採用される合成経路は芳香環上の置換基に大きく依存する。既知の合成経路の幾つかを下記の例で説明する。他のＤＡＴの合成へのこれらの方法および文献に記載の別法の推定は当業者に容易に明らかであろう。
【００６８】
調製１：４，４′−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（Te１）
(a) 〔２−（４−ブロモフェノキシ）エトキシ〕（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシラン（１ａ）の調製
150 mLの乾燥ジメチルホルムアミド中の〔２−（４−ブロモフェノキシ）エタノール（10.0 g, 46ミリモル）の溶液（30mL）にｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（8.34 g, 55ミリモル）とイミダゾール（7.82 g, 115 ミリモル）を加えた。これらの物質を反応フラスコ中へ洗い移すために追加のジメチルホルムアミド（20mL）を使用した。得られた溶液をニューマン管を用いて室温で一晩攪拌した。それを水（200 mL）の中に注ぎ、エーテル（３×75mL）で抽出した。合わせた抽出液を0.5 N HCl (200 mL)、飽和NaHCO₃ (200 mL) 、水（４×150 mL）および飽和NaCl（200 mL）で洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして濾過した。溶媒をロータリーエバポレーター上で減圧留去して粗生成物（16.5 g；＞100 ％）を得た。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.34 (2H, d, J=8.9), 6.78 (2H, d, J=8.9), 4.00-3.93 (4H, m), 0.89 (9H, s), 0.08 (6H, s)。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 158.1, 132.2, 116.4, 112.8. 69.6, 61.9, 25.9, 18.4 。FDMS (m/e) 330（Ｍ⁺ ，⁷⁹Br）。この粗生成物を精製せずに100 ％として使用した。
【００６９】
(b) ４，４′−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（Te１）の調製
500 mLの三口フラスコをアルゴン雰囲気下に置き、そこに冷却器と滴下漏斗を取り付けた。マグネシウム屑（0.89 g, 37ミリモル）を添加した。臭化物１ａ（12.3 g, 37ミリモル, 100 ％として使用）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（100 mL）中に取り、そして滴下漏斗に移した。この臭化物溶液約10mL、１，２−ジブロモエタンおよびヨウ素を使ってグリニャール反応を開始させた。残りの臭化物溶液を加え、反応液を一晩還流させた後は、Mgはまったく残存していなかった。加熱マントルを30分間取り外し、次いでテルル顆粒（4.74 g, 37ミリモル）を加え、そして反応液を再び加熱して７時間還流させた後は、ほぼ全てのテルルが消費されていた。反応液を室温まで冷却し、次いで激しく攪拌しながら10％水性NH₄Cl (300 mL)中に注ぎ、15分間攪拌した。沈澱したＴｅをセライト（商標）珪藻土を通して濾過することにより分離し、濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾液を分液漏斗に移し、エーテルで３回（200 mL, 100 mL, 100 mL）抽出した。合わせた抽出液を水と飽和NaClで洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして濾過した。溶媒を減圧留去して赤色油状物として粗生成物（12.4 g）を得た。それを銅粉末（2.5 g ）と共にトルエン（50mL）中に取り、ニューマン管を使って2.5 時間加熱して還流させると、その時には色が赤から灰色に変わていた。反応液を室温まで冷却し、セライト珪藻土を通して濾過し、エーテルで洗浄し、濃縮して琥珀色油状物（12.4 g）を得た。¹H-NMRにより分析すると、それは所望の生成物と、失活したグリニャール試薬と、残留トルエンとの混合物であった。この混合物をフッ化カリウム（5.025, 86 ミリモル）と共にメタノール（50mL）とＴＨＦ（20mL）中に取り、そして24時間還流させた。メタノールの大部分を減圧留去し、残渣をエーテル／酢酸エチルと水の間に分配させた。水性相を酢酸エチルで更に２回抽出し、そして一緒にした抽出液を水と飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧留去して褐色固体として粗生成物（8 g ）を得た。エーテル粉砕により白色固体を与え、それを濾過により単離し、エーテルで洗浄し、風乾して、粗生成物（1.74 g）を得た。それをジクロロメタンを用いてフラッシュシリカゲル（20mL）上に吸着させた。200 mLのフラッシュシリカゲル上で、ジクロロメタンに続いて95：5 ジクロロメタン：メタノールを使って溶離させるフラッシュクロマトグラフィーを注意深く行い（生成物は対応する少量のビアリール化合物の直前に溶出する）、エーテルで粉砕し、そして濾過すると、白色固体（1.2 g ）として純物質が得られた。粗生成物のエーテル粉砕で得られたエーテル濾液を上記と同様なクロマトグラフィーにかけた。エーテル粉砕とエタノールからの再結晶により、追加の純粋なTe１（0.2 g ）が得られた。総収量：1.4 g, 19 ％。¹H-NMR (DMSO-d₆)：δ 7.52 (4H, d, J=8.5), 6.80 (4H, d, J=8.5), 4.82 (2H, t, J=5.5), 3.91 (4H, t, J=5.0), 3.65 (4H, app q, J=5.1)。¹³C-NMR (DMSO-d₆) ：δ 159.2, 139.8, 116.5, 104.5, 69.9, 59.9 。FDMS (m/e) 404 (Ｍ⁺ , ¹³⁰Te ）。
【００７０】
調製２：Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（Te２）
(a) Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン（２ａ）の調製
室温でアルゴン雰囲気下においた丸底フラスコに入った乾燥エーテル（50mL）中のＮ，Ｎ−ジメチルベンゼンメタンアミン（2.70 g, 0.020 モル）の溶液に、シリンジを使ってn-BuLi（2.5 M, 10 mL, 0.025 モル）を滴下添加した。反応混合物を室温で５時間攪拌した後、乾燥テトラヒドロフラン中のフェニルテルレニルブロミドの溶液（0.5 Ｍ）をシリンジにより滴下添加した。38 mL (0.019モル) を添加した後、反応混合物がフェニルテルレニルブロミドに特徴的なオレンジ色に変わったので、添加を停止した。その反応混合物をエーテル（100 mL）上に注ぎ、得られた溶液を飽和NaCl（１×100 mL, ２×50mL）で洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして濃縮した。残渣をアセトン（100 mL）に溶かし、ヨウ素（5.08 g. 0.020 モル）を加えた。得られた溶液を冷却して生成物を沈澱させた。黄色結晶を濾過して集め、冷アセトンで洗浄し、乾燥して、２ａのヨウ素付加物（5.95 g, 50％、融点178-179 ℃）を得た。このヨウ素付加物（5.93 g, 0.010 モル）をジメチルホルムアミド（100 mL）に溶かした。水（100 mL）に溶かした亜硫酸水素ナトリウム（5.2 g, 0.05 モル）の溶液をゆっくり添加し、反応混合物を室温で１時間攪拌すると、その間に反応混合物は無色になった。反応混合物を水（500 mL）の上に注ぎ、次いでエーテル（２×50mL）で洗浄した。水性層を10％NaOHで塩基性にし、該アミンをエーテル（３×100 mL）中に抽出した。合わせた抽出液を飽和NaClで洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、濃縮した。残渣をメタノールから再結晶すると、白色固体（融点51〜54℃）として純粋な生成物（3.14 g, 93％）が得られた。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.88 (2H, d, J=6.9), 7.35 (1H, t, J=7.3), 7.26 (2H, t, J=7.3), 7.17 (1H, d, J=7.7), 7.10-7.04 (2H, m), 6.94-6.89 (1H, m), 3.53 (2H, s), 2.25 (6H, s) 。
【００７１】
(b) Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（Te２）の調製
水浴中に入れたエーテル（50mL）中の２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１−フェニルテルロベンゼン（1.02 g, 3.0 ミリモル）のスラリーに、塩化水素／エーテル溶液（3.15 mL, 1.0 M, 3.15ミリモル）をシリンジにより滴下添加した。濃厚なスラリーをイソプロパノール（20mL）で希釈した後、濾過した。白色固体をエーテルで洗浄し、風乾すると、生成物（1.13 g, 95％）が得られた。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 2.6 (1H, br s), 8.13 (1H, d, J=7.5), 7.80 (1H, d, J=7.7), 7.52-7.48 (3H, m), 7.26-7.17 (4H, m), 4.44 (2H, d, J=5.8), 2.68 (6H, d, J=4.5) 。C₁₅H₁₈ClNTe についての元素分析，計算値：Ｃ，48.00 ；Ｈ，4.83；Ｎ, 3.73。実測値：Ｃ，47.97 ；Ｈ，4.87；Ｎ，3.65。
【００７２】
調製３：Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン（Te３）
(a) Ｎ，Ｎ−ビス〔２−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕エチル〕ベンゼンアミン（３ａ）の調製
下記の物質を使って１ａについて用いたのと同様の手順を使用した：２，２′−（フェニルイミノ）ジエタノール（9.0 g, 50 ミリモル）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（18.1 g, 0.12モル）、イミダゾール（17.0 g, 0.25モル）およびジメチルホルムアミド（50mL）。反応混合物を便宜上一晩攪拌した。１ａと同様に後処理すると、淡色油状物として３ａが得られた（21.6 g, ＞100 ％）。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.21 (2H, d, J=8.4), 6.68 (3H, 重複するd,t), 3.77 (4H, d, J=6.6), 3.52 (4H, d, J=6.6), 0.92 (18H, s), 0.06 (12H, s)。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 147.8, 129.2, 115.7, 111.4, 60.3, 53.5, 25.9, 18.3, -5.3 。FDMS (m/e) 409 (Ｍ⁺ ) 。この油状物を精製せずに100 ％として使用した。
【００７３】
(b) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ〔２−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕エチル〕−４，４′−テルロビスベンゼンアミン（３ｂ）の調製
オーブン乾燥しアルゴン雰囲気下に置いた500 mLの三口フラスコに塩化テルル（IV）（5.93 g, 22ミリモル）を入れた。乾燥エーテル（100 mL）をシリンジで加えると薄黄色のスラリーが生じ、フラスコを水浴中に置いた。乾燥エーテル（50mL）中の３ａ（18 g, 44ミリモル）の溶液をアルゴン雰囲気下で調製し、その溶液を激しく攪拌しながらカニューレにより反応混合物に移した。最初に非常に濃厚な黄色沈澱が形成するが、それはアニリン溶液の添加を続けていくうちに薄まった。添加終了後、緑がかった黄色のスラリーを一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で蒸発させた。生じた黄緑色の油状物をジクロロメタン（200 mL）中に取り、水（200 mL）中のメタ亜硫酸水素ナトリウム（8.36 g, 44ミリモル）の溶液を攪拌下で添加した。得られた二相混合物を室温で30分間攪拌した後、セライト珪藻土を通して濾過した。固体のNaHCO₃を添加してpH 9にし、次いで反応混合物を分液漏斗に移した。ジクロロメタン層を分離し、水層を追加のジクロロメタンで抽出した。合わせた抽出液を水／飽和NaCl（200 mL／50mL）に続いて飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧留去した。得られた赤色油状物（21.4 g）をトルエン（80mL）中に取り、そして銅粉末（4 g ）を添加した。反応混合物をニューマン管を使って加熱して一晩還流させた。得られた灰色の反応混合物を室温に冷却し、セライト珪藻土を通して濾過し、そして溶媒を減圧留去せしめた。生じた琥珀色油状物（18ｇ）を３：１のシクロヘキサン：ジクロロメタンを使ったフラッシュクロマトグラフィーにより２回精製して、回収した出発物質から生成物を分離すると、黄色オイルとして純粋な３ｂが得られた（5.0 ｇ，理論量の48％）。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.54 (4H, d, J=8.6), 6.53 (4H, d, J=8.5), 3.72 (4H, t, J=6.4), 3.47 (4H, t, J=6.5), 0.88 (18H, s), 0.03 (12H, s) 。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 147.6, 139.7, 112.7, 98.2, 60.2, 53.4, 25.9, 18.3, -5.3。FDMS (m/e) 946（Ｍ⁺ , ¹³⁰Te ）。
【００７４】
(c) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン（Te３）の調製
シリルエーテル３ｂ（2.7 g, 2.86 ミリモル）とフッ化カリウム（0.66 g, 11.4ミリモル）とメタノール（20mL）の不均一混合物を加熱して20時間還流させた。白色スラリーを氷浴中で冷却し、次いで生成物を濾過により単離し、冷メタノールで洗浄し、そして風乾した（0.80 g, 57％）。分析試料用に少量をメタノールから再結晶した（融点 169-170℃）。¹H-NMR (DMSO-d₆)：δ 7.54 (4H, d, J=8.6), 6.53 (4H, d, J=8.5), 3.45 (4H, app q, J=5.7), 3.33 (4H, t, J=5.9) 。¹³C-NMR (DMSO-d₆) ：δ 148.1, 139.8, 113.1, 97.6, 58.4, 53.5。IR (KBr)：3350, 1585, 1495, 1350 cm ^-1。FDMS (m/e) 490（Ｍ⁺ , ¹³⁰Te ）。C₂₀H₂₈N₂O₄Teについての元素分析，計算値：Ｃ，49.22 ；Ｈ，5.78；Ｎ，5.74。実測値：Ｃ，48.78 ；Ｈ，5.72；Ｎ，5.66。
【００７５】
調製４：２，２′−〔テルロビス（４，１−フェニレンオキシ）〕ビス酢酸二ナトリウム塩（Te４）
(a) ４−（ブロモフェノキシ）（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシラン（４ａ）の調製
乾燥ジメチルホルムアミド（450 mL）中のｐ−ブロモフェノール（104 g, 0.6モル）の溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（108 g, 0.72 モル）とイミダゾール（102 g, 1.5モル）を添加した。得られた淡黄色溶液をニューマン管を使って室温で３時間攪拌した。それを水（1.2 L ）中に注ぎ入れ、エーテル（900 mL, 300 mL, 300 mL）で３回抽出した。合わせた抽出液を水（150 mL）で４回、1 N HCl (300 mL)、飽和NaHCO₃ (300 mL) および飽和NaCl (300 mL) で１回ずつ洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして濾過した。溶媒をロータリーエバポレーターと次に真空ポンプを使って減圧留去すると、加水分解した出発物質からのシラノールと６：１の比で、粗生成物（183 g ；＞100 ％）が得られた。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.31 (2H, d, J=8.7), 6.71 (2H, d, J=8.7), 0.97 (9H, s), 0.18 (6H, s) 。これを精製せずに100 ％として使用した。
【００７６】
(b) ４，４′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（４ｂ）の調製
オーブン乾燥した後にアルゴン雰囲気下に置いた２Ｌの三口フラスコに、頭上攪拌器と滴下漏斗を取り付けた。マグネシウム屑（15.2 g, 0.66モル）を添加した。臭化物４ａ（17.2 g, 0.6 モル、100 ％として使用）を乾燥ＴＨＦ（600 mL）中に取り、滴下漏斗に移した。臭化物溶液約25 mL と結晶ヨウ素数粒を用いてグリニャール反応を開始した。反応液が還流し続けるような速度で残りの臭化物溶液を添加した。添加終了後、反応混合物を更に30分間還流させると、その時点でわずかな量のＭｇだけが残った。反応液を水浴中で若干冷却し、次いでテルル顆粒（76.8 g, 0.6 モル）を加え、反応液を再び加熱して2.5 時間還流させると、その時にはほとんど全てのＴｅが消費されていた。反応液を室温まで冷却し、次いで素早く攪拌しながら10％水性NH₄Cl (2 L) 上に注ぎ入れ、30分間攪拌した。沈澱したＴｅをセライト珪藻土を通して濾過することにより分離し、濾過ケークをエーテルで洗浄した。濾液を分液漏斗に移し、エーテルで３回（1200 mL, 300 mL, 300 mL ）抽出した。合わせた抽出液を水と飽和NaClで洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、セライト珪藻土を通して濾過して、処理中に沈澱したＴｅとMgSO₄ の両方を除去した。溶媒を減圧留去して赤色油状物として粗生成物（194 g ）を得た。それを銅粉（38ｇ）と共にトルエン（900 mL）中に取り出し、ニューマン管を使って2.5 時間加熱還流せしめると、その間に色が赤から灰色に変化した。反応混合物を室温に冷却し、セライト珪藻土を通して濾過し、濃縮して琥珀色油状物（181 g ）を得た。¹H-NMRにより分析すると、それは所望の生成物と失活したグリニャール試薬と残留トルエンの混合物であり、４ｂを0.23モル含有すると算出された。４ｂのヨウ素付加物を経由して精製を行った。粗生成物をアセトン (0.6 L)に取り、激しく攪拌しながらヨウ素（58 g, 0.23モル）を分割して添加した。15分後、非常に濃厚な沈澱が生じた。エタノール (1.2 L)を加え、濾過と風乾により、橙色固体と暗真珠色の結晶性固体を単離した。濾液を再濾過して第二の収穫物を得た。合わせた収量は206 g であり、ＮＭＲによるとそれは純粋であり、唯一の汚染物は残留エタノールであった。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.95 (4H, d, J=8.7), 6.86 (4H, d, J=8.7), 0.98 (18H, s), 0.25 (12H, s) 。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 158.6, 138.4, 121.9, 25.5, 18.2, -4.3。
【００７７】
このヨウ素付加物をジオキサン（500 mL）、ジクロロメタン（500 mL）および５％水性NaHSO₃ (1.1 L)中に取り、生じた二相系を激しく攪拌した。１時間後、下（有機）層はまだ赤色であり、還元が不完全であることを示していた。黄色水性層の大部分をデカントして保存し、そして有機層を減圧下で蒸発させた。その残渣にジオキサン（200 mL）、ジクロロメタン（200 mL）および５％水性NaHSO₃（400 mL）を加え、混合物を更に１時間攪拌した。それを減圧下で蒸発させて有機溶媒を部分的に除去し、残った水性ジオキサンを分液漏斗に移してエーテルで３回抽出した。一緒にした抽出液を水、飽和NaHCO₃および飽和NaClで洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして濾過した。先にデカントしておいた水性層についても同様に処理し、両者を一緒にした。溶媒を減圧留去すると、琥珀色油状物として純粋な４ｂ（97.3 g, 60％）が得られた。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.54 (4H, d, J=8.4), 6.80 (4H, d, J=8.4), 0.96 (18H, s), 0.17 (12H, s) 。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 155.8, 139.6, 121.5, 105.2, 25.7, 18.2, -4.4 。FDMS (m/e) 544（Ｍ⁺ , ¹³⁰Te ）。
【００７８】
(c) ４，４′−テルロビスフェノール（４ｃ）の調製
シリルエーテル４ｂ（54.2 g, 0.1 モル）を500 mLの丸底フラスコの中のメタノール（200 mL）中に取った。フッ化カリウム（11.6 g, 0.2 モル）を添加し、反応混合物をアルゴン下で1.5 時間加熱して還流させた。反応混合物を室温に冷却した後、追加のメタノール（20mL）を使って移し替えを容易にすることにより、激しく攪拌している水（1.2 L)の中に反応混合物を注ぎ入れた。10％NaOH（約40mL）でpH 14 に調整し、反応混合物をセライト珪藻土を通して濾過した。濾液を分液漏斗に移してジクロロメタンで２回洗浄した。水性層を氷浴中に置いた２Ｌのアーレンマイヤーフラスコに移し、そして25％水性酢酸を加えてpH 6にすると、クリーム色の沈澱が生成した。その生成物を濾過により単離し、水で洗浄し、風乾して粗生成物（29ｇ）を得た。エーテルを用いてそれをフラッシュシリカゲル（150 mL）に吸着させた。１Ｌのフラッシュシリカゲル上で、ジクロロメタンに続いて１：４の酢酸エチル：ジクロロメタンを用いて溶離させる真空クロマトグラフィーは、純粋な生成物を与えた。ジクロメタンでの粉砕により、２部分の収穫物において黄色固体（24 g, 76％）として純粋な４ｃが得られた。¹H-NMR (CDCl₃ 、５滴のDMSO）：δ 8.77 (2H, s), 7.29 (4H, d, J=8.4), 6.47 (4H, d, J=8.4) 。
【００７９】
(d) ４，４′−ジ（エトキシカルボニルメトキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（４ｄ）の調製
頭部攪拌器と滴下漏斗を取り付けたオーブン乾燥済の250 mLの三口フラスコをアルゴン雰囲気下に置き、そこに水素化ナトリウム（60％, 1.76 g, 44ミリモル）を加えた。それをシクロヘキサンで３回洗浄し、次いで乾燥済（分子篩で）ジメチルホルムアミド（60mL）を加えた。フラスコを水浴中に置き、そして乾燥ジメチルホルムアミド（15mL）中のビスフェノール４ｃ（6.28 g, 20ミリモル）の溶液を滴下漏斗から滴下添加した（激しいＨ₂ 発生）。生じたスラリーを油浴中で85℃に20分間加熱した（更にＨ₂ 発生）。スラリーを室温まで冷却し、そして乾燥ジメチルホルムアミド（5mL ）中のブロモ酢酸エチル（6.68 g, 40ミリモル）の溶液を滴下漏斗から滴下添加すると、その間に沈澱がなくなった。反応混合物を45分間攪拌した後、激しく攪拌されている水（320 mL）の中に注いだ。得られた淡褐色沈澱を濾過により単離し、水で洗浄した。それを水（50mL）とジクロロメタン（80mL）との間に分配させた。水性相をジクロロメタンで更に２回抽出し、合わせた抽出液を水、次に飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧留去し、得られた固体をエタノール（50mL）から再結晶し、冷却し、濾過した。白色固体として生成物が得られた（5.3 g, 55 ％、融点88.5〜89℃）。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.60 (4H, d, J=8.5), 6.75 (4H, d, J=8.5), 4.58 (4H, s), 4.25 (4H, q, J=7.1), 1.28 (6H, t, J=7.1) 。IR (KBr)：1765, 1720, 1580, 1480 cm ^-1。FDMS (m/e) 488（Ｍ⁺ , ¹³⁰Te)。C₂₀H₂₂O₆Teについての元素分析，計算値：Ｃ, 49.43 ；Ｈ, 4.56。実測値：Ｃ, 49.36 ；Ｈ, 4.55。
【００８０】
(e) ４，４′−ジ（カルボキシメトキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン二ナトリウム塩（Te４）の調製
ジエステル４ｄ（39.2 g, 81ミリモル）をメタノール（400 mL）中に取り出し、10％水性NaOH（47 mL, 170ミリモル）を加えた。非常に濃厚なスラリーが得られた。反応混合物を１時間加熱して還流させた。得られたスラリーを氷浴中で冷却した。固体を濾過により単離し、エタノール洗浄し、風乾し、そして乳鉢と乳棒で磨砕すると、淡いクリーム色の固体（37.6 g, 98％）としてTe４が得られた。¹H-NMR (DMSO-d₆,５滴のD₂O)：δ 7.46 (4H, d, J=8.4), 6.66 (4H, d, J=8.5), 4.06 (4H, s) 。¹³C-NMR (D₂O) ：δ 176.6, 158.0, 139.8, 115.9, 104.8, 66.5。IR (KBr)：3540, 3430, 1595, 1490, 1415, 1230 cm ^-1。C₁₆H₁₂Na₂O₆Te 1.5 H₂O についての元素分析，計算値：Ｃ, 38.37 ；Ｈ, 3.02。実測値：Ｃ, 38.33 ；Ｈ, 3.05。
【００８１】
調製５．Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（カルボキシメチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン四ナトリウム塩（Te５）
(a) Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニルグリシンのエチルエステル（５ａ）の調製
ニューマン管を取り付けたフラスコ内で、アニリン（9.3 g, 0.1モル）、ブロモ酢酸エチル（36.7 g, 0.22モル）および２，６−ルチジン（23.5 g, 0.22モル）をアセトニトリル（200 mL）中で１日還流させた。ＴＬＣ（ジクロロメタン）によると反応は完全であった。反応混合物を室温に冷却し、エーテル（200 mL）で希釈した。沈澱したルチジン塩酸塩を濾過により除去し、その濾液を減圧下で蒸発させた。残渣をエーテルと水の間に分配させ、水層をエーテルで更に２回抽出した。合わせた抽出液を1N HCl、飽和NaHCO₃および飽和NaClで洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、そして減圧下で蒸発させ、暗色液体として粗製の５ａを得た。これをジクロロメタン中に取り、シリカゲルを通して濾過して脱色して、淡色油状物として生成物（23.2 g, 88％）を得た。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.21 (2H, t, J=7.9), 6.77 (1H, t, J=7.3), 6.61 (2H, d, J=8.4), 4.20 (4H, q, J=7.2), 4.13 (4H, s), 1.26 (6H, t, J=7.1)。
【００８２】
(b) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（エトキシカルボニルメチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン（５ｂ）の調製
オーブン乾燥し、滴下漏斗を取り付けそしてアルゴン雰囲気下に置いた500 mLの三口フラスコに、塩化テルル（IV）（11.9 g, 44ミリモル）を添加した。乾燥エーテル（200 mL）をシリンジにより添加すると、薄い黄色スラリーが得られ、フラスコを氷浴中に置いた。乾燥エーテル（50mL）中の５ａ（23.2 g, 89ミリモル）の溶液をアルゴン雰囲気下で調製し、その溶液をカニューレにより滴下漏斗に移した。それを激しく攪拌しながら反応混合物に滴下添加した。すぐに濃厚なスラッジが生じ、攪拌棒が停止した。残りの添加は反応混合物を手動で且つ渦動攪拌しながら実施した。反応混合物を攪拌せずに一晩静置しておき、次いでスラッジ全部が塊状固体に変わるまで音波処理した。反応混合物を濾過し、濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾過ケークをジクロロメタン（200 mL）中に取り、水（200 mL）中のメタ亜硫酸水素ナトリウム（17.0 g, 89ミリモル）の溶液を攪拌しながら添加した。得られた二相混合物を室温で30分間攪拌した。固体NaHCO₃を添加してpH 7に調整し、反応混合物をセライト珪藻土を通して濾過した。濾液を分液漏斗に移し、ジクロロメタン層を分離し、水層を追加のジクロロメタンで抽出した。一緒にした抽出液を水と飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、次いで溶媒を減圧留去した。得られた赤色油状物（17.9 g）をトルエン（100 mL）中に取り、そこに銅粉（９ｇ）を添加した。反応混合物をニューマン管を使って２時間加熱還流させた。生じた灰色の反応混合物を室温に冷却し、セライト珪藻土を通して濾過し、そして溶媒を減圧留去した。粗生成物（18 g, 琥珀色油状物）を、ジクロロメタンに続いて98:2のジクロロメタン：メタノールを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより２回精製して、回収された出発物質から生成物を分離すると、淡い橙色の粘稠油状物（7.36 g, 理論量の50％）として純粋な５ｂが得られた。¹H-NMR (CDCl₃)：δ 7.52 (4H, d, J=8.6), 6.43 (4H, d, J=8.7), 4.19 (8H, q, J=7.1), 4.08 (8H, s), 1.25 (12H, t, J=7.1)。¹³C-NMR (CDCl₃) ：δ 170.7, 147.6, 139.5, 113.6, 101.3, 61.2, 53.3, 14.2。IR (塩プレート法) ：1730, 1580, 1490, 1180 cm ^-1。FDMS (m/e) 658 (Ｍ⁺ , ¹³⁰Te ）。
【００８３】
(c) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（カルボキシメチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン四ナトリウム塩（Te５）の調製
ジエステル５ｂ（4.35 g, 6.63ミリモル）をメタノール（60mL）中に取り、10％水性NaOH（7.4 mL, 26.5ミリモル）を添加した。反応混合物を加熱して１時間還流させた。得られたスラリーを氷浴中で冷却した後、濾過した。固体を冷メタノールで洗浄し、風乾すると、淡いクリーム色の固体（3.81 g, 91％）としてＴｅ５が得られた。¹H-NMR (D₂O)：δ 7.56 (4H, d, J=8.6), 6.38 (4H, d, J=8.6), 3.83 (8H, s) 。¹³C-NMR (D₂O) ：δ 179.4, 148.7, 139.6, 113.0, 98.3, 55.5 。IR (KBr)：3250 (br), 1575, 1405, 1210 cm^-1。 C₂₀H₁₆Na₄N₂O₈Te・3 H₂O についての元素分析，計算値：Ｃ, 35.02 ；Ｈ, 3.23；Ｎ, 4.08。実測値：Ｃ, 34.82 ；Ｈ, 3.03；Ｎ, 4.04。
【００８４】
【実施例】
下記の実施例は本発明の例示であって排他ではない。
実施例１
下記の塗膜を細長く切ってスライドとして取り付けた。スライドを入れたカートリッジを卓上にのせ、実験室の照明をつけたまま16〜20時間置いておくことにより準備した。卓上インキュベーションの翌日に、原型の自動乾燥塗膜イムノアッセイ分析装置を用いてスライドを試験した。10,000ｍIU／mLのｈＣＧを含有するヒト血清基質溶液11μL を各スライド上に適用した。次いで各スライドを37℃で５分間インキュベートし、その後、Na₂HPO₄ (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H₂O₂（8 mM）およびジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）（10mM）を含有する洗浄液12μL を各スライドに適用した。この洗浄液は、未結合の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識リガンドまたはレセプターを読取り領域から洗い流し（除去し）、且つＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液を加えた後、各スライドを37℃での第二のインキュベーションにかけ、その間に、670 nmの波長において３秒間隔で反射濃度の読みを行った。反射濃度の読みから、各塗膜より調製したスライドについての色素生成速度（発色速度）を算出した。
【００８５】
血清試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ) のアッセイ用に、次の粗製の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。全ての塗膜構造に用いる用語は表１にまとめて記載してある。
【００８６】
塗膜１
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤，pH 7 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130.0
BSA 1.0
グリセロール 2.0
マンニトール 1.0
標識 34e-6
レセプター層 TES 緩衝剤，pH 7.0 0.10
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤，pH 7.0 4.580
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
BVSME 0.15
【００８７】
塗膜２
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤，pH 7.0 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130
BSA 1.0
グリセロール 2
マンニトール 1.0
標識 34e-6
VOSO_４ 0.04
レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
TX-100 0.02
BVSME 0.15
【００８８】
塗膜３
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130.0
BSA 1.0
マンニトール 1.0
標識 34e-6
Te１ 0.04
レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
TX-100 0.02
BVSME 0.15
【００８９】
塗膜４
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130
BSA 1.0
グリセロール 2.0
マンニトール 1.0
標識 34e-6
Te３ 0.012
レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
TX-100 0.02
BVSME 0.15
【００９０】
塗膜５
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130
BSA 1.0
グリセロール 2.0
マンニトール 1.0
標識 34e-6
VOSO_４ 0.04
Te１ 0.04
レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝液, pH 7.0 4.58
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
TX-100 0.02
BVSME 0.15
【００９１】
塗膜６
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
ジメドン 0.45
接着剤ポリマー 2.58
ポリマービーズ 130
BSA 1.0
グリセロール 2
マンニトール 1.0
標識 34e-6
VOSO_４ 0.04
Te３ 0.012
レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
抗体ビーズ 0.1
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
TX-100 0.02
BVSME 0.15
【００９２】

【００９３】
このカートリッジスライドの比較は、塗膜中にVOSO₄ またはＤＡＴ化合物のいずれも含まれていないと、カートリッジ中の第一スライドの速度低下率が大きいことを明確に示している。この第一スライドにおける発色速度の低下は、検査を行う試料について不正確な分析物濃度予測を引き起こすことになる。VOSO₄ （塗膜２）、ＤＡＴ化合物（塗膜３および４）またはVOSO₄ とＤＡＴ化合物の組合せ（塗膜５および６）を包含させると、最上部スライドにおいて保持される速度パーセントが著しく改良される。
【００９４】
実施例２
調査したＤＡＴ化合物の効果をさらに区別化するため、各塗膜からのスライドを卓上に直接表を上にして置き、カートリッジに保持されたスライドと同じ条件に暴露した（蛍光灯をつけたまま室温で16〜20時間のインキュベーション）。インキュベーション期間後、上述したものと同じ材料およびプロトコールを使用した原型自動乾燥塗膜イムノアッセイ分析装置上でスライドを試験した。予想される結果は、スライドの環境因子（光、空気など）に対する暴露が増加したことによる発色速度のより大幅な低下である。環境への暴露が増加したことによる影響を観察する方法として、卓上スライドの発色速度と各条件についてのカートリッジ内スライド（最上部スライドを除く）の発色速度とを比較した。上記のように処理したスライドの結果は以下の通りであった。
【００９５】

【００９６】
この卓上スライド試験は、VOSO₄ （塗膜２）、ＤＡＴ化合物（塗膜３および４）またはVOSO₄ とＤＡＴ化合物の組合せ（塗膜５および６）を塗膜に含めると、環境への暴露による速度低下に対する保護を提供することを示している。この試験はまた、同じ塗膜中にVOSO₄ とTe１を混在させると（塗膜５）協同作用が生じることも示している。この結果、いずれかの化合物を単独で含めた時（塗膜２と３）よりも速度低下％が小さい。
ＤＡＴ化合物であるTe１〜Te５を、ＨＲＰ活性の低下を強調するようにデザインしたモデル系において評価した。この系において、ＤＡＴ化合物Te１，Te４およびTe５は、次の実施例に示す通り、単独でまたはバナジル塩と協同してＨＲＰ活性を保護した。
【００９７】
実施例３〜５
ポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に下記組成の分析要素を調製した。

【００９８】
この分析要素を使用して、下記のプロトコールでＨＲＰ安定性を測定した。様々な量の本発明のテルル化ジアリール化合物の１つと約３×10^-8ＭのＨＲＰを含有する10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0の10μＬ試料を、上記の塗布要素の別々の１cm² 片の上に各々スポットした（各化合物についておよび各濃度において４試料）。これらの要素を乾燥し、そして暗い引き出しの中に入れた。30分後と24時間後（すなわち、翌日）に、要素を引き出しから再び取り出して、各要素を試験管に入った10 mM リン酸ナトリウム緩衝剤、0.15 M塩化ナトリウム、0.1 ％ウシ血清アルブミンの溶液（pH 7.0）１mLの中に浸漬することによりＨＲＰを抽出した。試験管を１分間渦動攪拌した後〔ポリ（エチレンテレフタレート）支持体から分析要素成分を分離させる〕、得られた懸濁液を遠心分離し、溶液を取り出した。100 μL アリコートを分光光度計のキュベットに入れ、そしてそこに試薬溶液を添加して50 mM リン酸カリウム緩衝剤（pH 7.0）、 5 mM ４′−ヒドロキシアセトアニリド、0.625 ％ Triton X-100 界面活性剤、0.005 ％４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素および0.85 mM 過酸化水素の最終溶液１mLを提供することにより、溶液中の活性ＨＲＰの量を測定した。アッセイ温度は30℃であった。青色が生じ、その発色速度を655 nmにおいて分光光度測定した。この発色速度は、抽出液中の活性酵素の量に正比例した。
【００９９】
各試料について24時間目に抽出された活性を30分目に抽出された活性で割ることにより計算した「活性比」としてデータを表わした。活性比１は、酵素が24時間に渡って添加剤により完全に保護されたことを示す。実験間でデータのばらつきが多少観察されたが、これは恐らく環境湿度と環境温度が日ごとに異なるために生じたのだろう。これは、ＨＲＰがどの位速く塗膜上で乾燥定着（dry down）するかに影響を与え、引いては酵素の見かけ安定性に影響を与える可能性がある。従って、データは実施例３〜５の実施例内では比較可能であるが、いずれか２つの実施例間で比較することはできない。
【０１００】
実施例３
１mMでのTe１，Te２，Te３およびTe４の効果を、単独でまたは１mM VOSO₄の存在下で比較した（図１）。化合物Te１とTe４は、モデル乾燥定着方式において添加剤を含まないものに比較してＨＲＰ活性を保護した。化合物Te２とTe３は、この方式において有効な安定剤でなかった。VOSO₄ とTe１かTe4 の両者が含まれる場合には、いずれか一方が単独で存在する場合よりも多くのＨＲＰ活性が保持された。
実施例４
ＨＲＰを安定化するTe１およびTe４の能力に対する濃度の効果を示す（図２）。ＨＲＰ溶液において、1 mM, 0.1 mMまたは0.01 mM Te１および10 mM,１mMまたは0.1 mM Te４の濃度を使用した。その上、緩衝剤のみを含有するＨＲＰ溶液または１mM VOSO₄を含有するＨＲＰ溶液をスポットした。Te１とTe４の両方とも、活性低下は試薬濃度に依存した。10 mM Te４の存在下では、24時間のインキュベーション後でもＨＲＰ活性が十分に保護された。
【０１０１】
実施例５
この実施例は、抗ＣＲＰ−ＨＲＰ酵素接合体（2.85×10^-8Ｍ）の安定性に対するTe４およびTe５の効果を示す。スポット液には、緩衝液のみ、1 mM, 2 mM, 4 mMまたは 8 mM Te４；または1 mMもしくは 8 mM Te５が存在した。Te４またはTe５のいずれも接合型ＨＲＰの活性を保護し、この保護は濃度依存性であった（図３）。
実施例６
下記塗膜構造７〜10に示されるように塗膜７〜10を調製し、スライドとして取り付け、約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで２日間に渡りコンディショニングし、そして凍結させた。
【０１０２】
塗膜７
血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に調製した。
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219
ジメドン 0.450
CaCl_２ 1.0
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
グリセロール 2
ウシ血清アルブミン 0.5
マゼンタ色素 0.0538
接着剤ポリマー 2.538
ポリマービーズ 130
レセプター層 TES 緩衝剤 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
ＰＣビーズ 0.3
抗ＣＲＰ抗体 0.05
抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
BVSME 0.15
【０１０３】
塗膜８
血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に調製した。
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219
ジメドン 0.450
CaCl_２ 1.0
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
グリセロール 2
ウシ血清アルブミン 0.5
マゼンタ色素 0.0538
接着剤ポリマー 2.538
ポリマービーズ 130
Te１ 0.08
レセプター層 TES 緩衝剤 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
ＰＣビーズ 0.3
抗ＣＲＰ抗体 0.05
抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005
TETRONIC T908 0.02
OLIN 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
BVSME 0.15
【０１０４】
塗膜９
血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に調製した。
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219
ジメドン 0.450
CaCl_２ 1.0
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
グリセロール 2
ウシ血清アルブミン 0.5
マゼンタ色素 0.0538
接着剤ポリマー 2.538
ポリマービーズ 130
Te２ 0.075
レセプター層 TES 緩衝剤 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
ＰＣビーズ 0.3
抗ＣＲＰ抗体 0.05
抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005
Tetronic T908 0.02
Olin 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤 pH 7.0 4.580
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
BVSME 0.15
【０１０５】
塗膜 10
血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に調製した。
層 材料 乾燥塗布量 (g/m ^２ ）
ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219
ジメドン 0.450
CaCl_２ 1.0
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22
グリセロール 2
ウシ血清アルブミン 0.5
マゼンタ色素 0.0538
接着剤ポリマー 2.538
ポリマービーズ 130
VOSO_４ 0.04
レセプター層 TES 緩衝剤 0.1
TX-100 0.02
ポリマーバインダー 0.8
ロイコ色素 0.2
ＰＣビーズ 0.3
抗ＣＲＰ抗体 0.05
抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005
Tetronic T908 0.02
Olin 10G 0.01
ゲル ゼラチン 10
TES 緩衝剤 pH 7.0 4.580
3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44
BVSME 0.15
【０１０６】
カートリッジを解凍してE250分析装置に装填した。
各スライドに、約20 mg/L のＣＲＰを含有するヒト血清試料11μL を適用した。次いで各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na₂HPO₄ (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H₂O₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液12μL を各スライドに適用して、未結合の抗体−ＨＲＰ接合体を読取り領域から洗い流し、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させた。37℃での2.5 分間のインキュベーション後、670 nmにおける反射濃度を測定し、それを検量線によってＣＲＰ濃度に変換した。
【０１０７】
最上部スライドの推定濃度を、その下の６枚のスライドの平均推定濃度と比較した。この方法での幾つかの実験の結果を下記に示す。
偏り＝最上部スライドの推定値−スライド２〜７の平均推定値
【０１０８】

【０１０９】
これらの結果は、どの保護剤も存在しない場合、最上部スライドはその下のスライドよりも実質的に小さい推定値を有することを示す。Te１，Te２またはVOSO₄ のいずれかの添加は、最上部スライドとその下のスライドとの間の偏りを減少させる。Te１により最大の改善が得られる。
【０１１０】
実施例７
塗膜７〜10を細く切り、スライドとして取り付け、約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで２日間コンディショニングし、そして冷凍した。
カートリッジを解凍した。各カートリッジの最上部スライドを取り出し、カートリッジを約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで３日間インキュベートした。
これらのスライドを、実施例６に記載した通りに、約20 mg/L のＣＲＰを含有するヒト血清を用いて試験した。
約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨに３日間暴露した最上部スライドの推定値を、スライド２〜７の平均推定値と比較した。その結果を以下に示す。
偏り＝最上部スライドの推定値−スライド２〜７の平均推定値
【０１１１】

【０１１２】
これらの結果は、新たに暴露された最上部スライドが３日間に渡り変化し、保護剤の不在下ではその下のスライドよりも実質的に低い推定値を生じることを示す。テルル化ジアリールTe１およびTe２並びにVOSO₄ はスライドを保護し、同一カートリッジ内の下部スライドと比較した偏りを小さくする。同様に、Te１が最大の改良を示す。
【０１１３】
実施例８
塗膜７〜10を細く切り、スライドとして取り付け、約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで２日間コンディショニングし、そして冷凍した。
カートリッジを解凍し、そして約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで７日間インキュベートした。
インキュベート後のカートリッジと解凍したてのカートリッジを、実施例６に記載した通りに、約10〜30 mg/L の範囲のＣＲＰを含有する３つのヒト血清試料を使って分析した。インキュベート後のスライドの推定値を、解凍したてのスライドの推定値と比較した。３つの液体試料について、解凍したてのスライドに対するインキュベート後のスライドの平均偏りを測定し、これを以下に示す。
【０１１４】

【０１１５】
これらの結果は、保護剤の不在下では、約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨに７日間暴露したスライドは、解凍したてのスライドに対して偏りを生じることを示している。Te１もしくはTe２またはVOSO₄ のいずれかの存在下では、この暴露から生じる偏りが実質的に減少する。
【０１１６】
下記の例は、ＤＡＴをグラビア層に塗布した時に、ＤＡＴを使用しなかった時または別の層に塗布した時に比べて、優れた意外な結果が得られたことを証明する。
【０１１７】
実施例９
Te５を次の方法でＣＲＢＭアッセイにおいて評価した。
塗膜１（ Te ５無し）
下記に示す組成および層構造を有する、血清試料中のカルバマゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１１８】
実施例 10
塗膜２
下記に示す組成および層構造を有し、１mMの最終再水和濃度で展開層に塗布されたTe５を含んで成る、カルバマゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１１９】
実施例 11
塗膜３、 1 mM Te5 （グラビア層）
下記に示す組成および層構造を有し、１mMの最終再水和濃度でグラビア層に塗布されたTe５を含んで成る、カルバマゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１２０】
実施例 12
塗膜１〜３を細く切り、スライドとして取り付けた。このスライドを含むカートリッジを塗布後２週間目に速度応答について試験し、次いでフリーザー中−18℃で１年間保存した。フリーザー保存の１年後、カートリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。VITROS E250 ANALYZER上でスライドを試験した。8.8 μg/mLのＣＲＢＭを含むヒト血清基質溶液11μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na₂HPO₄ (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H₂O₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液12μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を読取り領域から洗い流し（または除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度の読みを行った。その反射率測定値をClapper-William 変換を使って透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。その結果を下記に示す。
【０１２１】

【０１２２】
塗膜比較実験は、Te５が塗膜に存在しないかまたは１mMの再水和濃度でビーズ展開層中に置かれた時に、カートリッジ中の第一スライドに大きな速度低下が起こったことを明らかに示す。この第一スライドにおける色素生成の速度低下は、試験しようとする試料について正しくない分析物濃度推定値を与えるだろう。１mMの再水和濃度でのグラビア層へのTe５の包含は、フリーザー保存１年後に第一スライドに保持される速度パーセントに著しい改善をもたらす。
【０１２３】
実施例 13
フェノバルビタール乾燥塗膜要素のグラビア層中においてTe５を評価した。
塗膜４（ Te ５なし）
下記に示す組成および層構造を有する、ＰＨＢＲアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１２４】
実施例 14
塗膜５（グラビア層中 0.25 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＰＨＢＲアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１２５】
実施例 15
塗膜６（グラビア層中 0.5 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＰＨＢＲアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１２６】
実施例 16
比較実験２
塗膜４〜６を細く切り、スライドとして取り付けた。このスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カートリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約27μg/mLのフェノバルビタールを含むヒト血清基質溶液 11 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na₂HPO₄ (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H₂O₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を洗い流し（または除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。その反射率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。この値を検量線によりフェノバルビタール濃度に変換した。
【０１２７】
結果を下記に示す：偏り＝最上部スライドの推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。

【０１２８】
実施例 17
Te５を下記のようなフェニトイン乾燥塗膜要素のグラビア層において試験した。
塗膜７（ Te ５なし）
下記に示す組成および層構造を有する、ＰＨＹＴアッセイ用の薄層塗膜を調製した。

【０１２９】
実施例 18
塗膜８（グラビア層中 0.25 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＰＨＹＴアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３０】
実施例 19
塗膜９（グラビア層中 0.5 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＰＨＹＴアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３１】
実施例 20
比較実験３
塗膜７〜９を細く切り、スライドとして取り付けた。このスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カートリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約12.5μg/mLのフェニトインを含むヒト血清基質溶液 11 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na_２ＨＰＯ₄ （１０ ｍＭ， ｐＨ ６．８） 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H_２Ｏ₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を洗い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。
反射率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。この値を検量線によりフェニトイン濃度に変換した。
【０１３２】
結果を下記に示す：偏り＝最上部スライドの推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。

【０１３３】
実施例 21
Te５を下記のようなジコキシンのグラビア層において試験した。
塗膜 10 （ Te ５なし）
下記に示す組成および層構造を有する、ＤＧＸＮアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３４】
実施例 22
塗膜 11 （グラビア層中 0.25 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＤＧＸＮアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３５】
実施例 23
塗膜 12 （グラビア層中 0.5 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＤＧＸＮアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３６】
実施例 24
比較実験４
塗膜10〜12を細く切り、スライドとして取り付けた。このスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カートリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約2.0 μg/mLのジゴキシンを含むヒト血清基質溶液 11 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na_２ＨＰＯ₄ （１０ ｍＭ， ｐＨ ６．８） 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H_２Ｏ₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を洗い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。反射率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。この値を検量線によりジゴキシン濃度に変換した。結果を下記に示す：偏り＝最上部スライドの推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。
【０１３７】

【０１３８】
実施例 25
Te５を下記の通りカルバマゼピン乾燥塗膜要素のグラビア層において試験した。
塗膜 13 （ Te ５なし）
下記に示す組成および層構造を有する、ＣＲＢＭアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１３９】
実施例 26
塗膜 14 （グラビア層中 0.25 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＣＲＢＭアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１４０】
実施例 17
塗膜 15 （グラビア層中 0.5 mM Te ５）
下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、ＣＲＢＭアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。

【０１４１】
実施例 28
比較実験５
塗膜13〜15を細く切り、スライドとして取り付けた。このスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カートリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約9.3 μg/mLのカルバマゼピンを含むヒト血清基質溶液 11 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na_２ＨＰＯ₄ （１０ ｍＭ， ｐＨ ６．８） 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H_２Ｏ₂（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を洗い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。反射率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。この値を検量線によりカルバマゼピン濃度に変換した。
【０１４２】
結果を下記に示す：偏り＝最上部スライドの推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。

【０１４３】
比較実験２〜５は、グラビア層中のTe５の存在が、Te５不在下よりも第一スライドの偏りの有意な減少をもたらすこと、すなわち第一スライドの偏りがより０に近い値であることを示す。必要なTe５の濃度は異なり、ある場合には0.25（ＰＨＹＴ）であり、またある場合には 0.5（ＰＨＢＲ，ＤＧＸＮ，ＣＲＢＭ）である。しかしどの場合でも、グラビア層中のＴｅ５の存在により、第一スライドの偏りを０に近い値へと減少させることができる。
【０１４４】
本発明は、競合イムノレートアッセイにおいて展開層中に塗布されるのと対比して、安定剤が展開層の上のグラビア層の中に置かれた時、より低レベルのTe５によって第一スライドの偏りの有意な減少をもたらす。これは、本明細書中に与えられた実施例により一般的な現象であることがわかる。展開層中に直接塗布したテルル化ジアリールと比較して、４種のイムノレートアッセイのグラビア層へのテルル化ジアリールの包含は低レベルであっても、第一スライドの偏りを有意に減少させた。用量依存性である方法ではテルル化ジアリールはアッセイに不利な影響を及ぼし得るので（例えば、位置合わせ色素を漂白することにより）、展開層に必要とされる高濃度に対立するものとして、グラビア層中により低濃度のテルル化ジアリールを使用することが重要な利点を付与する。
【０１４５】
本発明により、単独でまたはバナジル化合物のような他の安定剤と協同してＨＲＰの安定性が改善される。本発明の好ましい態様はＴｅ５とバナジル塩の両方を含んで成る。
表１
接着剤ポリマー：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
抗体ビーズ：リガンドに対する抗体が結合しているポリ（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸のポリマー粒子
ＰＣビーズ：ホスホリルコリンが結合しているポリ（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸のポリマー粒子
BSA ：牛血清アルブミン
BVSME ：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
DTPA：ジエチレントリアミン五酢酸
標識：リガンドまたはリガンドのためのレセプターと西洋ワサビペルオキシダーゼとの接合体
ロイコ色素：４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール
マゼンタ色素：４，５−ジヒドロキシ−３−（６，８−ジスルホ−２−ナフチランゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸ナトリウム
MOPS：３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤
OLIN 10G：１分子当たり平均して約10グリシドール単位を有するイソノニルフェノキシポリグリシドール界面活性剤（販売元Olin Chemical Co. ）
ポリマービーズ：平均直径20〜40μｍのポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸）粒子
ポリマーバインダー：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド）
ポリマーバインダーＩ：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド）
TES ：Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤
TX-100：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤であるTriton X-100界面活性剤（販売元Union Carbide ）
TETRONIC T908 ：酸化エチレンと酸化プロピレンのブロックコポリマーである非イオン性界面活性剤（販売元BASF Corp.）
【０１４６】
本発明をその好ましい実施態様を参照しながら詳しく説明してきたが、本発明の精神および範囲内で様々な変更や修正が可能であることを理解されたい。特に、本出願人の発明を最適化するために、１もしくは複数のテルル化ジアリールの使用、特定のテルル化ジアリールの使用、複数の特定のテルル化ジアリールの組合せの使用、または１もしくは複数のテルル化ジアリールと１もしくは複数のバナジル化合物との組合せの使用を選択できるということを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３に記載のように、緩衝剤のみ、1 mM VOSO₄、単独での1 mM各テルル化ジアリール、または1 mM VOSO₄と1 mM各テルル化ジアリールを含む種々の溶液をスポットした時の、モデル乾燥定着方式におけるＨＲＰ安定性を示す棒グラフである。
【図２】図２は、実施例３に記載のように、様々な濃度のテルル化ジアリール１および４を使ったモデル乾燥定着方式における24時間に渡るＨＲＰ安定性を示す棒グラフである。
【図３】図３は、実施例５に記載のように、スポット溶液中に混和された種々の濃度のテルル化ジアリール１および４を使ったモデル乾燥定着方式における抗ＣＲＰ−ＨＲＰ接合体の安定性を示す棒グラフである。

Claims (23)

1. リガンドをアッセイするための乾式イムノアッセイ分析要素であって、
   (a) 展開層；
   (b) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度で含んで成るレセプター層；および
   (c) テルル化ジアリールおよび酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含んで成るグラビア層
   を担持している支持体を含んで成る、乾式イムノアッセイ分析要素。
2. 前記テルル化ジアリール化合物が次の構造（Ｉ）：
   Ａｒ¹−Ｔｅ−Ａｒ² （Ｉ）
   を含んで成り、上式中Ａｒ¹とＡｒ²は
   

   

   から成る群より選ばれた同一もしくは異なるアリール基または同一もしくは異なるヘテロアリール基であり、
   ここでＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであり；
   Ｒ¹¹，Ｒ¹²，Ｒ¹³，Ｒ²¹，Ｒ²²，Ｒ²³，Ｒ³¹，Ｒ³²，Ｒ³³，Ｒ⁴¹，Ｒ⁴²およびＲ⁴³は同一または異なり且つ各々水素、炭素原子数１〜５のアルキル、ＯＨ、ＯＲ¹、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲ¹、ＮＲ¹ ₂、ＮＲ¹Ｒ²、ＣＯ₂Ｈおよびその塩、ＣＯ₂Ｒ¹、ＳＯ₃Ｈおよびその塩、ＰＯ₃Ｈ₂およびその塩並びにＳＲ¹から成る群より各々選ばれ、ここでＲ¹とＲ²は異なり且つ１個または複数個の親水基を有することがある炭素原子数１〜14の炭素鎖を有するアルキル、フェニルおよび置換フェニルから成る群より各々選ばれ；
   Ｒ¹⁴，Ｒ¹⁵，Ｒ²⁴およびＲ²⁵は同一または異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、炭素原子数１〜５のアルコキシ、ＣＯ₂Ｈおよびその塩、ＣＯ₂Ｒ¹、ＳＯ₃Ｈおよびその塩、並びにＰＯ₃Ｈ₂およびその塩から成る群より各々選ばれる、請求項１に記載の要素。
3. 前記テルル化ジアリールが
   

   

   から成る群より選ばれる、請求項１に記載の要素。
4. バナジル塩を更に含んで成る、請求項１に記載の要素。
5. バナジル塩を更に含んで成る、請求項２に記載の要素。
6. バナジル塩を更に含んで成る、請求項３に記載の要素。
7. 前記標識リガンドまたは標識レセプター中の標識がペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ誘導体である、請求項１に記載の要素。
8. 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体である、請求項７に記載の要素。
9. 前記グラビア層が液体試料との接触を提供する展開層表面と連続している、請求項１に記載の要素。
10. 前記テルル化ジアリールが
    

    

    から成る群より選ばれる、請求項９に記載の要素。
11. バナジル塩を更に含んで成る、請求項１０に記載の要素。
12. 水性液体試料中に含まれる免疫学的反応性リガンドのアッセイ方法であって、
    (1) 乾式イムノアッセイ分析要素であって、
    (a) 展開層；
    (b) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度で含んで成るレセプター層；および
    (c) テルル化ジアリールおよび酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含んで成るグラビア層
    を担持している支持体を含んで成る乾式イムノアッセイ分析要素を用意し、
    (2) 前記要素の展開層の限定領域を前記試料と接触させ、それにより(i) 固定化リガンド−レセプター複合体、(ii)固定化酵素標識リガンド−レセプター複合体、または(iii) (i) と(ii)の混合物、または固定化レセプター−リガンド−標識レセプター複合体を形成させ、
    (3) 前記限定領域を前記酵素標識のための基質溶液と接触させ、それによりシグナルの生成を触媒し；そして
    (4) 前記シグナルを検出することにより前記リガンドの濃度を測定する
    ことを含んで成る方法。
13. 前記テルル化ジアリール化合物が次の構造（Ｉ）：
    Ａｒ¹−Ｔｅ−Ａｒ² （Ｉ）
    を含んで成り、上式中Ａｒ¹とＡｒ²は
    

    

    から成る群より選ばれた同一もしくは異なるアリール基または同一もしくは異なるヘテロアリール基であり、
    ここでＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであり；
    Ｒ¹¹，Ｒ¹²，Ｒ¹³，Ｒ²¹，Ｒ²²，Ｒ²³，Ｒ³¹，Ｒ³²，Ｒ³³，Ｒ⁴¹，Ｒ⁴²およびＲ⁴³は同一または異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、ＯＨ、ＯＲ¹、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲ¹、ＮＲ¹ ₂、ＮＲ¹Ｒ²、ＣＯ₂Ｈおよびその塩、ＣＯ₂Ｒ¹、ＳＯ₃Ｈおよびその塩、ＰＯ₃Ｈ₂およびその塩並びにＳＲ¹から成る群より各々選ばれ、ここでＲ¹およびＲ²は異なり且つ１個または複数個の親水基を有することがある炭素原子数１〜14の炭素鎖を有するアルキル、フェニルおよび置換フェニルから成る群より各々選ばれ；
    Ｒ¹⁴，Ｒ¹⁵，Ｒ²⁴およびＲ²⁵は同一または異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、炭素原子数１〜５のアルコキシ、ＣＯ₂Ｈおよびその塩、ＣＯ₂Ｒ¹、ＳＯ₃Ｈおよびその塩並びにＰＯ₃Ｈ₂およびその塩から成る群より各々選ばれる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記テルル化ジアリールが
    

    

    から成る群より選ばれる、請求項１２に記載の方法。
15. 前記要素がバナジル塩を更に含んで成る、請求項１２に記載の方法。
16. 前記要素がバナジル塩を更に含んで成る、請求項１３に記載の方法。
17. 前記要素がバナジル塩を更に含んで成る、請求項１４に記載の方法。
18. 前記標識リガンドまたは標識レセプター中の標識がペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ誘導体である、請求項１２に記載の方法。
19. 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記シグナルが比色シグナルである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記グラビア層が液体試料との接触を提供する展開層表面と連続している、請求項１２に記載の方法。
22. 前記テルル化ジアリールが
    

    

    から成る群より選ばれる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記要素がバナジル塩を更に含んで成る、請求項２２に記載の方法。

Images