ES2210679T3

ES2210679T3 - Reduccion del sesgo del primer clise y estabilidad mejorada por incorporacion de teluros de diarilo en la capa de grabado de elementos de pelicula seca de inmunoensayos.

Info

Publication number: ES2210679T3
Application number: ES98307662T
Authority: ES
Inventors: Margaret Elizabeth Logan; Janet Fyles; Stephen Hasselberg
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: PT903583E; DE69819646T2; KR19990030045A; AU8615498A; SI0903583T1; DE69819646D1; JPH11160316A; EP0903583A2; DK0903583T3; EP0903583A3; AU736764B2; EP0903583B1; JP4243372B2; KR100597818B1; CA2247723A1; US5928886A; ATE254281T1; CA2247723C

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ELEMENTO ANALITICO PARA INMUNOENSAYO EN SECO PARA ANALIZAR UN LIGANTE, QUE COMPRENDE UN SOPORTE QUE TIENE: A) UNA CAPA DE ETIQUETA QUE COMPRENDE UN LIGANTE ETIQUETADO CON UNA ENZIMA O UN RECEPTOR ETIQUETADO CON UNA ENZIMA; B) UNA CAPA DE DISPERSION; C) UNA CAPA RECEPTORA QUE COMPRENDE UNA CONCENTRACION FIJA DE UN RECEPTOR INMOVILIZADO PARA EL LIGANTE, Y D) UNA CAPA DE FOTOGRABADO QUE COMPRENDE TELURURO DE DIARILO. UNA REALIZACION PREFERIDA DE LA INVENCION INCLUYE TAMBIEN SAL DE VANADILO. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UN PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR UN ENSAYO UTILIZANDO UN ELEMENTO COMO EL DESCRITO ANTERIORMENTE.

Description

Reducción del sesgo del primer clisé y estabilidad mejorada por incorporación de teluros de diarilo en la capa de grabado de elementos de película seca de inmunoensayos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a elementos de películas secas y a su uso en inmunoensayos. En particular, se refiere a una estabilidad mejorada de los inmunorreactivos marcados en elementos de películas secas.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos, que aprovechan la ventaja de las reacciones inmunológicas naturales, han encontrado un uso extenso como técnicas analíticas en química clínica. A causa de la especifidad de las reacciones, son particularmente ventajosos para cuantificar analitos biológicos que están presentes en fluidos biológicos en muy baja concentración. Entre tales analitos están incluidos, por ejemplo, antígenos, anticuerpos, fármacos terapéuticos, narcóticos, enzimas, hormonas, proteínas, etc.

El analito, que es la diana del ensayo, se denomina aquí ligando. Los compuestos que reconocen específicamente el ligando y reacionan para formar complejos con el ligando se denominan aquí receptores. El receptor y el ligando forman un par conjugado. Cualquier miembro del par puede actuar como receptor o ligando.

En el caso de un ensayo competitivo, son componentes típicos del ensayo un analito marcado, incluidos derivados inmunocompetentes marcados y análogos de tales analitos; mientras que, en el caso de un ensayo sandwich, típicamente se emplea un receptor marcado del analito. Éstos se denominan aquí ligando marcado y receptor marcado, respectivamente.

En los inmunoensayos competitivos de unión, se pone un ligando en competición con un ligando no marcado para reaccionar con una cantidad fijada de un receptor apropiado. Se pueden determinar concentraciones desconocidas del ligando a partir de la señal medida del ligando marcado unido o no unido (esto es, libre). La reacción transcurre como sigue:

ligando + ligando marcado + receptor - sustrato \longleftrightarrow

ligando - receptor - sustrato + ligando marcado-receptor - sustrato.

En un formato alternativo de inmunoensayo, conocido como inmunoensayo sandwich o ensayo inmunométrico, el ligando se pone en contacto con dos o más moleculas de receptor que se unen al ligando en diferentes sitios epitópicos. Típicamente se marca apropiadamente un receptor y el otro se inmoviliza sobre un sustrato sólido o es capaz de inmovilizarse sobre él. La cantidad de ligando es directamente proprcional a la cantidad de complejo unido entre el ligando y los dos receptores. Esto se ilustra de la siguiente manera:

sustrato - receptor + ligando + receptor_{2} - marcador \longleftrightarrow

sustrato – receptor_{1} -ligando-recetor_{2} – marcador

El grupo de marcadores típicos incluye etiquetas radiactivas, enzimas, cromóferos, fluoróferos, radicales libres estables y cofactores enzimáticos, inhibidores y agentes alostéricos.

Se conocen elementos analíticos de inmunoensayos por las patentes U.S. nº. 4.517.288 y nº. 4.258.001. En general, tales elementos comprenden receptores, tales como anticuerpos para un ligando, inmovilizados en una capa en particulas. Además, el elemento usualmente contiene un sistema de reactivo que, mediante interacción con una especie unida o no unida, da una señal que se puede correlacionar con la concentración de ligando en la muestra. En el uso, la muestra puede combinarse con un ligando marcado con una enzima y aplicarse al elemento. Después de cierto tiempo, se aplica a la capa en partículas una solución que contiene un sustrato para el ligando marcado. La reacción con el sustrato se cataliza por el marcador de enzima para formar un producto de reacción que finalmente causa una señal, por ejemplo, un color. La densidad de reflexión del color se puede correlacionar con la concentración del ligando en la muestra. Son conocidos sistemas similares de revelado de color para otros marcadores convencionales conocidos, tales como etiquetas radiactivas, cromóferos, fluoróferos, radicales libres estables y cofactores enzimáticos, inhibidores y agentes alostéricos.

Los elementos multicapas de inmunoensayos son elementos de película seca que usan los principios de inmunoensayo antes mencionados para medir analitos en muestras de fluidos. En elementos de ensayos competitivos, la velocidad de formación del color (u otra señal) se relaciona inversamente con la cantidad de analito presente y, en elementos de ensayos sandwich, la velocidad de formación de color (u otra señal) es directamente proporcional a la cantidad del analito marcado con enzima, por ejemplo, un fármaco o un receptor marcado con enzima unido al receptor inmovilizado. Para que los imnunoensayos mantengan una calibración estable, no se puede perder actividad de la enzima (velocidad medida) en ninguno de los clisés durante el período de calibración especificado.

Frecuentemente, los elementos de inmunoensayo se suministran a los clientes en "cartuchos" de plástico que contienen 50 elementos separados, de los que se puede extraer un elemento cuando sea necesario. Los elementos están colocados uno encima de otro, por lo que los 49 elementos de abajo tienen cubierta su superficie superior por el elemento de encima. Sin embargo, el elemento de más arriba de la pila no está cubierto y, por tanto, su superficie está expuesta a factores ambientales, en tanto que no lo están los 49 elementos restantes. Por ejemplo, el elemento de más arriba (el primero) está más expuesto al aire y a la luz que los restantes cuando se manipulan los cartuchos durante la manufactura o cuando los cartuchos están en los acopios de los analizadores clínicos.

Durante el almacenamiento, antes del uso, los cartuchos están almacenados en bolsas cerradas, forradas con una hoja. Sin embargo, el elemento cimero sigue estando más expuesto al aire y humedad residuales dentro de las bolsas selladas que los otros 49 elementos restantes.

Se ha encontrado que, cuando se hace reaccionar un fluido común de ensayo con los elementos de un cartucho, la velocidad de formación de color vista para el elemento de más arriba era siempre más baja que la velocidad de formación de color cuando se aplicó el mismo fluido de ensayo a elementos por debajo del cimero del mismo cartucho. Esto se denomina sesgo del primer clisé.

Sumario de la invención

Un método para afrontar la formación de color a menor velocidad del primer clisé implica el uso de iones vanadio como se describe en la patente U.S. nº. 5.516.645, de Daniel y otros, que se incorpora aquí por referencia. Los solicitantes han descubierto que se puede usar teleruro de diarilo (DAT o, en plural, DATs) para prevenir el sesgo del primer clisé puede efectuarse en inmunoensayos tanto competitivos como sandwich.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, hay un elemento seco de inmunoensayo para ensayar un ligando, que comprende un soporte que dispone de:

un elemento analítico seco para ensayar un ligando, que comprende un soporte que dispone de:

(a) una capa de marcador que comprende un ligando marcado con enzima o un receptor marcado con enzima;

(b) una capa de esparcimiento;

(c) una capa de receptor que comprende una concentración fija de un receptor inmovilizado del ligando; y

(d) una capa de grabado que comprende un teleruro de diarilo.

En una realización, el receptor está unido covalentemente a perlas de polímero que tienen un diámetro en el intervalo de 0,1 a 5 \mum. En una realización preferente, el ligando marcado con enzima y el teleruro de diarilo están en la misma capa o zona de grabado, siendo la capa o zona de grabado adyacente o contigua a la superficie de la capa de esparcimiento que proporciona el inicial o primer contacto con una muestra líquida.

El elemento definido antes reduce sustancialmente el sesgo del primer clisé, esto es, la velocidad alterada de revelado del color del elemento de más arriba del cartucho en comparación con los otros elementos del mismo cartucho. Además, todos los elementos del cartucho presentan una mayor estabilidad a largo plazo y al almacenamiento. Los ejemplos establecen que los compuestos teleruro de diarilo proporcionan estos beneficios.

Además, los compuestos DAT son útiles en la estabilización de composiciones de enzimas en general, en particular peroxidasas y, especialmente, peroxidasa de rábano picante (HRP) y conjugados de enzimas, preferiblemente HRP, con moléculas pequeñas tales como fármacos terapéuticos, fármacos de abuso, esteroides y similares. Otra realización es la de conjugados de enzimas, preferiblemente HRP, con moléculas grandes tales como proteínas, hidratos de carbono, etc., en los que tales enzimas se usan como marcadores. Por ejemplo, los compuestos se pueden usar en ensayos en solución así como en los elementos secos de esta invención.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para ensayar un ligando inmunológicamente reactivo en una muestra acuosa, que comprende las etapas de:

(1) proporcionar un elemento analítico de inmunoensayo que comprende un soporte que dispone de:

: (a) una capa de marcador que comprende un ligando marcado con enzima o un receptor marcado con enzima;

: (b) una capa de esparcimiento;

: (c) una capa de receptor que comprende una concentración fija de un receptor inmovilizado del ligando;

: (d) una capa de grabado que comprende un teleruro de diarilo.

(2) poner en contacto una superficie finita de la capa de esparcimiento del elemento con la muestra, con lo que se forma (i) un complejo de ligando inmovilizado-receptor, (ii) un complejo de enzima inmovilizada-ligando marcado-receptor, o (iii) una mezcla de (i) y (ii), o un complejo de receptor inmovilizado-ligando-receptor marcado receptor;

(3) poner en contacto la superficie finita con una solución de sustrato para el marcador de enzima, con lo que se cataliza el desarrollo de una señal; y

(4) determinar la concentración del ligando detectando la señal y midiendo la intensidad o cantidad de la mencionada señal.

En el método anterior, el receptor marcado con enzima o ligando marcado con enzima se separa del ligando marcado con enzima inmovilizado o el receptor marcado con enzima inmovilizado. Tales separaciones pueden efectuarse por cualquiera de los medios conocidos en la técnica, por ejemplo añadiendo una solución de sustrato, por ejemplo, una solución de peróxido de hidrógeno.

Cada una de una o más capas de un elemento pueden comprender una o más zonas. Las capas contiguas de un elemento pueden tener unos bordes nítidos entre ellos, pudiendo aparecer por microscopía óptica y/o electrónica como capas distintas y separadas de un elemento; o pueden tener una zona o región de contacto en la que hay una mezcla de capas y bordes entre capas que son borrosas o desdibujadas. En tales casos, capas separadas y distintas pueden ser visibles o no por microscopía óptica y/o electrónica. La formación de zonas puede ser parcial o sustancialmente completa (o completa). En el caso de formación parcial de zona, sólo una porción de una capa depositada penetra y se mezcla con una capa contigua depositada separadamente (ambas capas pueden penetrar mútuamente pero, en cualquier caso, se forma una zona que comprende una porción de ambas capas y se contempla una penetración de capa individual y mutua, ya que ambas dan por resultado la formación de zona como se ha descrito aquí) de manera que se incluye una zona (o varias zonas) dentro de la capa (o capas) contigua(s) depositada(s) separadamente; las capas que permanecen separadas y distintas pero que tienen límites fronterizos borrosos y desdibujados.

Por otra parte, la mayor parte o la totalidad de una capa depositada separadamente puede penetrar y mezclarse con una capa (o capas) contigua(s) para formar una zona (o zonas) dentro de una capa (o capas) contigua(s) de manera que quede incluida sustancial o enteramente dentro de la capa (capas) contigua(s) de forma que no aparezca como capa tan distinta o separada de la capa (o capas) contigua(s) del elemento por microscopía óptica o electrónica. Se pueden formar intencionadamente o inevitablemente zonas parciales o completas. Si se forman intencionadamente, se pueden lograr zonas dentro de las capas por cualquier procedimiento que permita que el experimentador incorpore un componente (componentes) específico(s), para que queden comprendidos o incluidos dentro de la zona, dentro de una o más capas. Por ejemplo, se puede(n) encapsular un componente específico o componentes específicos dentro de un polímero u otra matriz, matriz que puede luego incorporarse dentro de una capa o capas.

Alternativamente, otra realización de la presente invención implica la preparación de una capa que comprende un componente específico A (o componentes) que es contigua a dos capas adyacentes, que es soluble en una de las capas contiguas. Durante el contacto inicial o posteriormente, dentro de la capa contigua en la que se soluble se forma una zona completa o parcial. Por tanto, la zona de la capa contigua comprende el componente específico A. La formación de la zona puede ser parcial o completa, como se ha definido antes. El grado de formación de zona se puede controlar mediante ajuste de condiciones tales como los disolventes que se usan para obtener las capas, el tiempo de contacto de las capas antes del secado, la temperatura, etc., como lo saben los expertos en las técnicas de revestimiento. Ha de entenderse que los elementos secos de inmunoensayo definidos usando los términos de capa marcada, capa de receptor, capa de grabado y/u otras capas, incluyen todas las realizaciones en las que un marcador, receptor, grabado y/u otra capa del elemento puede formar una capa distinta y separada, o una zona (o zonas) parcial(es) o completa(s) con una capa (capas) contigua(s) durante o después del depósito de las capas indicadas.

Una capa de grabado es una capa delgada que comprende uno o más componentes depositado(s) sobre la superficie de otra capa, por ejemplo, una capa de esparcimiento. El término "capa de grabado" que se usa significa una capa delgada en la que "delgada" es un término relativo usado para denotar que la capa es de un espesor menor en relación a una capa(s) contigua(s) con la(s) que está en contacto. Es un término de conveniencia, puesto que el método de revestimiento por grabado representa un método preferido para revestir con una capa delgada que comprende teleruro de diarilo (y/u otros componentes). No se usa el término como restrictivo en forma alguna. Se considera que cualquier medio que permite revestir con una capa delgada, depositar o aportar ésta de otra forma, está dentro del ámbito del término "capa de grabado". La capa de grabado aportada para revestimiento sobre una capa de esparcimiento de un elemento de la presente invención puede no aparecer como una capa distinta o separada sobre la capa de esparcimiento; se anticipa que la capa de grabado forma una delgada zona contigua sobre, sobre y dentro, o justo por debajo, de la superficie de la capa de esparcimiento (u otra capa) con la que tiene contacto inicial. En cualquier caso, una muestra líquida, cuando tiene contacto con las capas de esparcimiento que comprenden una capa de grabado y/o zona, tendrá directamente contacto con los componentes de la capa de esparcimiento, perlas, etc., a causa de la porosidad de la propia capa de esparcimiento, permitiendo que la muestra se esparza y aporte, ya que estos términos son conocidos en la técnica. Así, el contacto de un elemento que tiene una capa de grabado y/o zona con una muestra de líquido puede describirse simplemente en términos de contacto de la capa de esparcimiento con la muestra de líquido, como esparcimiento, dosificación, y todas las otras funciones de la capa de esparcimiento no son
obstaculizadas.

El Te5, que se identifica más adelante, representa una de varias especies que tienen la fórmula genérica Ar^{1}-Te-Ar^{2}, especies que se consideran en el caso madre, incorporado aquí por referencia. Además, se ha encontrado que el teleruro de diarilo, especialmente el Te5 de fórmula:

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da por resultado una reducción significativa del sesgo del primer clisé cuando se incorpora a una capa de grabado del elemento de inmunoensayo del ensayo competitivo inmunizado de carbazepina (CRBM) a un nivel final rehumedecido de 1 mM. Los solicitantes han encontrado una reducción significativa del sesgo del primer clisé a lo largo de un período de tiempo de un año. De hecho, los primeros clisés son indistinguibles de los controles que no son primer clisé. Cuando se reviste con el mismo nivel de Te5 la capa de esparcimiento de perlas, y no la capa de grabado que reviste la capa de esparcimiento, la cantidad de Te5 es insuficiente para evitar que se manifieste el sesgo del primer clisé. También se ha encontrado que la incorporación de 0,25 a 0,50 mM (después de remojar el elemento) de Te5 a las capas de grabado de los elementos secos de inmunoensayo diseñados para determinar carbazepina (CRBM), fenobarbital (PHBR), fenitoína (PHYT) y digoxina (DGXN) reduce significativamente el sesgo del primer clisé después de 6 y 9 meses de almacenamiento en congelador.

Esta invención está diseñada, en general, para elementos secos de inmunoensayos que comprenden compuestos de teleruro de diarilo en una capa de grabado de revestimiento dispuesta sobre una capa de esparcimiento. Sin embargo, la capa de grabado pues estar colocada sobre cualquier capa.

En otro aspecto, se refiere a métodos para realizar inmunoensayos usando los mencionados elementos mejorados de película seca.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de barras que presenta la estabilidad de la HRP en un modelo de formato de seco hacia abajo cuando se hacen manchas con varias soluciones, incluidas: tampón solo, 1 mM de VOSO_{4} y 1 mM de cada uno de los teleruros de diarilo solo o 1 mM cada uno con 1 mM de VOSO_{4} según se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 2 es un diagrama de barras en el que se representa la estabilidad de HRP en un período de 24 horas en modelo de seco hacia abajo con varias concentraciones de los teleruros de diarilo 1 y 4 según se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 3 es un diagrama de barras que representa la estabilidad de un anticuerpo CRP-conjugado de HRP en un formato de seco hacia abajo con diferentes concentraciones de los teleruros de diarilo 4 y 5 incorporados a las soluciones de manchas según se describe en el Ejemplo 5.

Descripción detallada de la invención

Los elementos de la invención comprenden ligando marcado o receptor marcado, capas (o zonas) de esparcimiento, capas (o zonas) de receptor y capas (o zonas) de grabado. Las zonas y capas son lo definido antes. Las varias zonas pueden estar en una capa revestida o en capas revestidas separadas. Por ejemplo, la zona de esparcimiento y la zona de receptor pueden estar en una capa individual o pueden estar en capas separadas. Las capas separadas pueden estar situadas en cualquier orden sobre el soporte. O las capas separadas pueden estar dispuestas de tal manera que la capa de receptor esté directamente sobre el soporte, la capa de esparcimiento directamente encima de la capa de receptor y la zona de ligando marcado o de receptor marcado sobre la capa de esparcimiento. Cuando la zona del receptor forma una capa enteramente separada, la capa incluirá también un aglutinante del tipo que se describe más adelante. El elemento puede incluir capas adicionales tales como una capa de grabado. Todas estas capas pueden revestirse usando métodos conocidos en esta técnica.

Los compuestos representativos que son teleruros de diarilo tienen la fórmula:

Ar^{1} - Te- Ar^{2}.

Los teleruros de diarilo dan por resultado una reducción significativa del sesgo del primer clisé cuando se incorporan a los elementos de inmunoensayo que comprenden un inmunorreactivo marcado con peroxidasa de rábano picante, tal como los elementos de inmunoensayo de gonadotropina coriónica humana (hCG) y proteína C-reactiva, según se describe más adelante. Se ensayó una subserie de estos compuestos y se vió que preservaban también la actividad de la HRP en un sistema de modelo diseñado para evaluar compuestos en cuanto a su capacidad de prevenir el sesgo del primer clisé.

El grupo de diorganoteleruros útiles incluye materiales en los que Ar^{1} y Ar^{2} son los mismos o diferentes grupos arilo o heteroarilo que se definen seguidamente.

2

3

en los que X es O, S, Se o Te y R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{31}, R^{32}, R^{33}, R^{41}, R^{42} y R^{43} son los mismos o diferentes y cada uno se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, OH, OR^{1}, SH, NH_{2}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, NR^{1}R^{2}, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales, y SR^{1}, siendo R^{1} y R^{2} diferentes y cada uno seleccionado entre el grupo constituido por alquilo que tiene una cadena de 1 a 14 átomos de carbono que opcionalmente presentan uno o varios grupos hidrófilos, fenilo y fenilo sustituido.

R^{14}, R^{15}, R^{24} y R^{25} son iguales o diferentes y cada uno se seleciona entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, alcoxi que tiene 1-5 átomos de carbono, COOH o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales, siendo R^{1} lo descrito antes.

En lo anterior, alquilo significa grupos tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, amilo, isoamilo o neopentilo. Una cadena con 1-14 átomos de carbono incluye, aunque no exclusivamente, los compuestos metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, amilo, isoamilo, neopentilo, hexilo, octilo, decilo, tetradecilo, etc.

Grupos hidrófilos significa grupos tales como grupos ácido sulfónico, fosfónico o carboxílico, grupos hidroxilo y amino. Algunos de estos compuestos pueden formar sales con ácidos o bases. Se prefieren sales sódicas, potásicas, amónicas, cálcicas y magnésicas y sales con los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico y sulfúrico y con ácidos orgánicos tales como los ácidos oxálico, fumárico, tartárico, malónico, acético, cítrico y succínico.

Los DATs preferidos son los que tienen sustituyentes en el anillo aromático que contienen grupos que imparten solubilidad en agua, tales como, pero no exclusivamente, grupos hidroxilo, aminas y sus sales y ácidos carboxílicos y sus sales. En particular, los DATs que preservan la actividad de HRP bien solos o en cooperación con compuestos de vanadilo son los siguientes (Te1-Te5)

4

5

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Otros materiales para uso en capas de esparcimiento son bien conocidos en la técnica de producción de elementos analíticos secos, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº. 4.258.001. Tales capas incluyen capas microporosas hechas de tejido, papel, etc. Una capa en partículas preferida es una capa de esparcimiento de perlas (BSL). Esta capa se puede construir fácilmente para que tenga una porosidad adecuada para uso en los elementos de la presente invención con el fin de acomodar una muestra de ensayo (por ejemplo de 1 a 200 \mul), diluida o no diluida. Preferiblemente, la capa de esparcimiento es isotrópicamente porosa, propiedad que es generada por espacios interconectados entre partículas que comprenden la zona. Por isotrópicamente poroso se entiende que la capa de esparcimiento esparce uniformemente el fluido aplicado en todas las direcciones a través de la capa.

Se discuten capas de esparcimiento útiles, incluidas capas de esparcimiento de perlas, en las patentes U.S. nº. 4.670.381, nº. 4.258.001 y nº. 4.430.436. Son capas de esparcimiento particularmente útiles las que tienen una estructura en partículas formada por partículas organopolímeras y un adhesivo polímero para esas partículas descritas en la patente U.S. nº. 4.258.001. Generalmente, las partículas organopolímeras útiles en la capa de esparcimiento son estables al calor, teniendo las perlas esféricas un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 10 a 40 \mum de diámetro o incluso menor.

Las partículas pueden estar compuestas por una amplia variedad de polímeros orgánicos, incluidos tanto polímeros naturales como sintéticos, que tienen las propiedades exigidas. Preferiblemente, sin embargo, están compuestas por uno o más polímeros de adición descritos en las patentes antes mencionadas.

Cuando la capa de receptor es una capa separada, se prepara y reviste sobre un soporte o sobre una capa reactiva o una capa subyacente sobre el soporte. Los receptores están unidos por covalencia a las partículas de polímero mediante grupos reactivos superficiales sobre el receptor (grupos amino y grupos sulfhidrilo nucleófilos libres).

Un procedimiento general para adosar receptores a perlas pequeñas de polímero incluye la unión por covalencia del receptor seleccionado a las perlas usando reacciones generalmente conocidas. Con muchos grupos pendientes, por ejemplo el haloalquilo, etilsulfonilo y vinilsulfonilo 2-sustituidos activados, el receptor puede unirse directamente a las perlas. Por lo general, las perlas se mezclan con el receptor en una solución acuosa tamponada en la que generalmente el pH es de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 40% en peso de partículas de polímero, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10% en peso. La cantidad de receptor está en una relación con el polímero de aproximadamente 0,1:1000 a aproximadamente 1:10, y preferiblemente, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10. La mezcla se efectúa a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 50ºC y, preferiblemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40ºC, durante aproximadamente 0,5 a aproximadamente 48 horas. Se puede usar cualquier tampón adecuado.

En algunos casos, los grupos reactivos pendientes sobre la superficie exterior deben modificarse o activarse para causar una unión covalente del ligando. Por ejemplo, los grupos carbonilo se deben activar usando la química conocida de carbodiimidas o carbamoilonio, descrita en la patente EP 308235, publicada el 22 de julio de 1992, y al patente U.S. nº. 5.155.166.

La unión del receptor a perlas de polímero monodispersado que contiene grupos carboxilo se realiza, sin embargo, en dos etapas. La primera etapa implica el contacto de una suspensión acuosa de partículas con un compuesto carbodiimida o carbomoilonio para producir partículas reactivas de un polímero intermedio que tiene grupos reactivos intermedios en vez de grupos carboxilo. Esta etapa se realiza a un pH adecuado usando ácidos o tampones adecuados para tener el pH deseado. Por lo general, el pH es inferior a 6, pero esto no es crítico en tanto que pueda efectuarse la reacción. Más probablemente, el pH está entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 7. La relación molar de carbodiimida o compuesto de carbamoilonio a los grupos carboxilo sobre la superficie de las partículas es de aproximadamente 10:1 a 500:1.

En la segunda etapa del método, el intermedio reactivo formado en la primera etapa se pone en contacto con un receptor que contiene un grupo reactivo amina o sulfhidrilo. Se forma así una unión covalente entre las partículas y el receptor. La relación ponderal del receptor a las partículas polímeras generalmente es de aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1:1 y, preferiblemente, de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10.

En otros casos, se puede hidrolizar un grupo epoxi sobre la superficie exterior para formar un compuesto diol capaz de reacciobnar con bromuro de cianógeno, que puede actuar como agente de acoplamiento para los grupos amina en la especie inmunológica. Los aldehídos pueden reaccionar directamente con aminas para formar una base de Schiff que luego puede reducirse para formar una unión covalente. Alternativamente, el aldehído puede oxidarse a ácido y se puede usar la química antes identificada para formar una unión amida.

Cualquier receptor que contiene amina o sulfhidrilo reactivo se puede unir a las perlas polímeras monodispersadas en tanto que el receptor contenga un grupo reactivo amina o sulfhidrilo, respectivamente, que reaccionará con los grupos reactivos del polímero o con el intermedio formado por la reacción de un compuesto carbodiimida o carbamoilonio con grupos carboxilo de las partículas en el caso de que el polímero tenga grupos carboxilo reactivos.

Las perlas pequeñas de polímero que tienen grupos reactivos que reaccionan fácilmente directamente con los grupos amina o sulfhidrilo de los receptores simplemente se mezclan con los receptores en un tampón apropiado, si es necesario, y se deja que reaccionen.

Los polímeros entre los que se pueden seleccionar perlas para el receptor incluyen los siguientes: poli(m- y p-clorometilestireno), poli(estireno-co-m- y p-clorometil-estireno-co-acrilato de 2-hidroxietilo) (relación molar 67:30:3), poli(estireno-co-m- y p-cloroetilsulfonilmetil-estireno (relación molar 95,5:4,5), poli{estireno-co-N-[m- y p-(2-cloroetilsulfonilmetil)fenil] acrilamida} (relación molar 99,3:0,7), poli(m- y p-clorometilestireno-co-ácido acrílico) (relación molar 95:5, 98:2 y 99,8:02), poli(estireno-co-m- y p-cloroetilsulfonilmetilestireno-co-ácido acrílico) (relación molar 93,5:4,5:2), poli{estireno-co-N-[m- y p-(2-cloroetilsulfonilmetil)fenil]acrilamida-co-ácido metacrílico} (relación molar 97,3:3,0:7,2), poli(estireno-co-m- y p-clorometilestireno) (relación molar 70:30), poli[estireno-co-3-(p-vinilbeciltio)ácido propiónico] (relación molar 97,6:2,4), poli(estireno-co-cloruro de vinilbencilo-co-ácido acrílico) (relación molar 85:10:5), poli(estireno-co-ácido acrílico) (relación molar 99:1), poli(estireno-co-ácido metacrílico) (relación molar 90:10), poli(estireno-co-ácido acrílico-co-m- y p-divinilbenceno) (relación molar 89:10:1), poli(estireno-co-acrilato de 2-carboxietilo) (relación molar 90:10), poli(metacrilato de metilo-co-ácido acrílico)(relación molar 70:30), poli(estireno-co-m- y p-vinilbenzaldehído) (relación molar 95:5) y poli(estireno-co-m- y p-vinilbenzaldehído-co-ácido metacrílico) (relación molar 93:5:2).

Las capas del elemento se disponen sobre un soporte adecuado. La capa de receptor reviste el soporte, aunque puede haber capas intermedias tales como una capa de gelatina/tampón entre el soporte y la capa de receptor. El soporte puede ser cualquier material adecuado dimensionalmente estable y, preferiblemente, no poroso y transparente (esto es, transmisor de radiación) que transmite radiación electromagnética entre aproximadamente 200 y aproximadamente 900 nm. Un soporte de elección para un elemento particular debe ser compatible con el modo de detección previsto (reflexión, transmisión, luniniscencia o espectoscopía de fluorescencia). Entre los materiales soporte útiles están incluidos poliestireno, poliésteres [por ejemplo, (poli(tereftalato de etileno)], policarbonatos, ésteres de celulosa (por ejemplo, acetato de celulosa), etc.

Se describen en general aglutinantes polímeros para la capa de receptor en la patente canadiense nº. 1.240.445 y se incorporan aquí expresamente por referencia. Los polímeros útiles son polímeros que comprenden de aproximadamente 30 a 97% en peso de acrilamida N-alquilsustituida polimerizada, tal como N-isopropilamida. Entre otras acrilamidas N-alquilsustituidas están incluidas N-n-butilacrilamida, N,N,dietilacrilamida y N-n-propilaacrilamida. En los ejemplos se usa poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido metacrílico-co-N,N'-metilen-bisacrilamida para ilustrar la utilidad de estos aglutinantes.

El aglutinante polímero comprende también de aproximadamente 3 a 25% en peso de uno o más monómeros de reticulación polimerizados que tienen como mínimo dos grupos polimerizables por adición por molécula. Estos monómeros de reticulación son generalmente bien conocidos en la técnica. Los monómeros de reticulación preferidos contienen grupos acrilamido o metacrilamido para facilitar la polimerización con acrilamidas sustituidas con N-alquilo.

El grupo de ejemplos útiles de monómeros de reticulación incluye:

N,N'-metilenbisacrilamida;

N,N'-metilenbismetacrilamida;

dimetacrilato de etileno;

diacrilato de 2,2-dimetil-1,3-propileno;

divinilbenceno;

fosfato de mono[2,3-bis(metacriloiloxi)propilo];

N,N'-bis(metacriloil)urea;

cianurato de trialilo;

acrilato de alilo;

metacrilato de alilo;

N-alilmetacrilamida;

diacrilato de 4,4'-isopropilidendifenileno;

diacrilato de 1,3-butileno;

dimetacrilato de 1,4-ciclohexilendimetileno;

dimetacrilato de 2,2'-oxidietileno;

diviniloximetano;

diacrilato de etileno;

diacrilato de etilideno;

dimetacrilato de propilideno;

1,6-diacrilamidohexano;

diacrilato de 1,6-hexametileno;

dimetacrilato de 1,6-hexametileno;

dimetacrilato de feniletileno;

dimetacrilato de tetrametileno;

dimetacrilato de 2,2,2-tricloroetilideno;

diacrilato de etilenbis(oxietileno);

dimetacrilato de etilenbis(oxietileno);

trimetacrilato de etilideno;

triacrilato de propilideno;

aliloxiacetato de vinilo;

1-viniloxi-2-aliloxietano;

metacrilato de 2-crotonoiloxietilo;

ftalato de dialilo; y

metacrilato de 2-(5-fenil-2,4-pentadienoiloxi)etilo.

Estos aglutinantes polímeros pueden incluir también de 0 a 60% en peso de monómeros hidrófilos polimerizados. También son útiles cantidades de 5 a 35% en peso. Se discuten monómeros hidrófilos en la patente canadiense nº. 1.240.445. En particular, tales monómeros tienen uno o más grupos seleccionados entre grupos hidroxi, pirrolidona, amina, amida, carboxi, sulfo, sal carboxilato, sal sulfonato y sal sulfato. Por lo general, los iones conjugados de los grupos sal son de metales alcalinos o amonio. Son monómeros hidrófilos útiles, ácido acrílico y metacrílico y sus sales, 2-acrilamido-2-metilpropano-sulfonato sódico, acrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de 2-hidroxipropilo, metacrilato de 2-hidroxipropilo y metacrilato de glicerilo.

Además, los aglutinantes mencionados posibilitan la formación de revestimientos uniformes de capas de receptor debido a sus viscosidades muy bajas, que se logran por un marcado adelgazamiento durante el revestimiento por extrusión. Se consigue otra ventaja con los mencionados aglutinantes en cuanto a que, inmediatamente después de formar revestimientos uniformes, la viscosidad del aglutinante aumenta sustancialmente, lo que da por resultado una "capa endurecida" que permanece estable y uniforme durante el transporte en húmedo y el secado de los aglutinantes.

Los receptores también pueden dispersarse en un aglutinante polímero seleccionado entre el grupo constituido por:

poli(alcohol vinílico);

albúmina de suero bovino;

goma arábiga;

homopolímeros de N-vinilpirrolidona

que tienen un peso molecular en el intervalo de 8.000 a 400.00; y copolíomeros de adición de vinilo solubles en agua que tienen uno o más monómeros seleccionados entre el grupo constituido por acrilamida, metacrilamida, acrilamidas sustituidas con N-alquilo, metacrilamidas sustituidas con N-alquilo, 1-vinilimidazol, 1-vinil-imidazoles sustituidos con 2-alquilo, 1-vinilimdazoles sustituidos con 2-hidroxialquilo, N-vinilpirrolidona, acrilatos de hidroxialquilo, metacrilatos de hidroxi-alquilo, ácido acrílico y ácido metacrílico; en los que el alquilo o hidroxialquilo de los copolímeros tiene de 1 a 6 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo y hexilo.

El elemento puede comprender una o más capas adicionales, por ejemplo una capa separada o combinada de reactivo/esparcimiento y una capa de gelatina/tampón que contiene otros aditivos necesarios tales como agentes de transferencia de electrones.

La capa de gelatina/tampón, o la capa de reactivo o la capa de esparcimiento del elemento puede contener el indicador de composición que comprende uno o más reactivos dispersados en uno o más materiales aglutinantes sintéticos o naturales tales como gelatina, u otros coloides naturales, homopolímeros y coplímeros, tales ciomo poliacrilamida, polivinilpirrolidona, poli(N-isopropil-acrilamida), poli(acrilamida-co-N-vinil-2-pirrolidona) y copolímeros similares. La composición de indicador también puede dispersarse en la capa de receptor.

Si se desea, se pueden incluir otras capas opcionales, por ejemplo, capas subyacentes, capas que bloquean la radiación, etc. Todas las capas del elemento están en contacto de fluidos entre sí, lo que significa que los fluidos y reactivos y productos de reacción no complejados de los fluidos pueden pasar entre regiones superpuestas de capas adyacentes.

Las capas del elemento pueden contener una variedad de otros componentes deseables pero opcionales, incluidos tensioactivos, espesativos, tampones, endurecedores, antioxidantes, disolventes acopladores y otros materiales conocidos en la técnica. Las cantidades de estos componentes es materia que corresponde a los expertos en la técnica.

Los elementos se pueden usar para determinar concentraciones bajas de ligandos inmunológicamente reactivos en un líquido tal como un fluido biológico (por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, orina, fluido espinal, suspensiones de tejidos humanos o animales, heces, saliva, fluido linfático y otros similares). Los ligandos se pueden determinar a concentraciones tan bajas como aproximadamente 10^{-15} molar y, muy generalmente, a una concentración de aproximadamente 10^{-11} a aproximadamente 10^{-4} molar.

Entre los ligandos que se pueden determinar así, cuantitativa o cualitativamente, están incluidos fármacos terapéuticos (por ejemplo, fenobarbital, digoxina, teofilina, gentamicina, quinidina, fenitoína, propanolol, carbazepina, tobramicina, lidocaína, procainamida y similares), esteroides naturales o sintéticos (por ejemplo, cortisol, aldosterona, testosterona, progesterona, estriol, etc.), hormonas (por ejemplo, hormonas de tiroides, hormonas peptídicas, insulina, etc.), proteínas (por ejemplo, albúmina, IgG, IgM, ferritina, factores de coagulación de la sangre, proteína C-reactiva, isoenzimas, hCG, apolipoproteínas, etc.), antígenos, anticuerpos incluidos anticuerpos monoclonales, y otras especies que reaccionan naturalmente con un receptor. Esta invención es particularmente útil para la determinación de fármacos terapéuticos, tales como digoxina, fenitoína, carbamazepina, teofilina o fenobarbital, hormonas tales como tiroxina o triyodotironina y analitos tales como hCG y proteína C-reactiva. El ensayo se puede realizar usando cualquier marcador enzima que se puede unir al ligando para formar un ligando marcado. Los marcadores preferidos son enzimas tales como glucosa-oxidasa, peroxidasas tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina y galactosidasa.

Corresponde a un experto corriente en la química clínica determinar un sustrato adecuado para un marcador dado. El sustrato puede ser un material sobre el que actúa directamente el marcador de enzima o un material que está involucrado en una serie de reacciones que implican una reacción enzimática del marcador. Por ejemplo, si el marcador enzima es una peroxidasa, el sustrato es peróxido de hidrógeno más un agente reductor apropiado. Usando como ejemplo glucodsaoxidasa, el sustrato de glucosa generalmente está presente en la capa de reactivo o se añade como solución de sustrato para que haya aproximadamente 0,01 mol/m^{2} y, preferiblemente, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 mol/m^{2}. Un experto en la técnica sabrá cómo ajustar la cantidad de un sustrato particular para la cantidad de marcador enzima usada en el ensayo.

La capa de reactivo puede contener una composición de indicador que comprende uno o más reactivos que proporcionan una especie detectable como resultado de l reacción catalizada por el marcador. La especie detectable puede revelar un color, ser reactiva, fluorescente o quimiluminiscente. A los fines prácticos, la invención se ilustra usando una composición de un indicador colorimétrico que proporciona una especie colorimétricamente detectable como resultado de la reacción enzimática de un análogo de ligando marcado con enzima con un sustrato.

La composición de indicador puede ser un compuesto solo que produce un colorante detectable después de la reacción enzimática o una combinación de reactivos que producen el colorante. Por ejemplo, cuando se usa glucosa como sustrato y glucosa-oxidasa como marcador enzima, la composición de indicador colorimétrico puede incluir un acoplador y un compuesto oxidable que reaccionan para dar un colorante. Alternativamente, la composición puede incluir un colorante leuco y peroxidasa u otro compuesto peroxidante adecuado que genera un colorante detectable como resultado de la formación de peróxido de hidrógeno, producido cuando la glucosa-oxidasa convierte la glucosa en ácido glucónico. Se conocen en la técnica colorantes leuco útiles, entre ellos los descritos en, por ejemplo, la patente U.S. nº. 4.089.747 (expedida el 16 de mayo de 1978 a Bruschi) y la patente U.S. nº. 4.670.385 (expedida el 2 de junio de 1987 a Babbo y otros). Las cantidades particulares de la composición de indicador colorimétrico y sus varios componentes corresponden al conocimientos de un experto en la técnica.

Los ligandos marcados se pueden preparar usando materiales de partida y procedimientos conocidos o adquirirse comercialmente. Por lo general, el ligando se une al marcador (por ejemplo un resto de enzima) a través de un enlace covalente.

El inmunoensayo puede ser manual o automatizado. Por lo general, la cantidad de un ligando en un líquido se determina tomando el elemento de un rollo de suministro, un paquete u otra fuente, y poniendo físicamente en contacto una superficie finita de la capa de esparcimiento con una muestra del líquido, por ejemplo, de 1 a 200 \mul. Por lo general, la superficie finita que se pone en contacto no es mayor que aproximadamente 150 mm^{2}.

La cantidad de ligando se determina haciendo pasar el elemento a través de un aparato adecuado para detectar el análogo de ligando complejado directamente o la especie detectable formada como resultado de la reacción enzimática de un marcador de enzima y un sustrato. Por ejemplo, la especie puede detectarse con un aparato espectrofotométrico adecuado usando procedimientos generalmente conocidos. En una reacción enzimática, el producto resultante se determina midiendo, por ejemplo, la velocidad de cambio de la densidad de reflexión o transmisión en la superficie finita que estuvo en contacto con la muestra de ensayo. La superficie que se mide generalmente tiene un diámetro de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 mm. La cantidad de ligando en la muestra de líquido es inversamente proporcional a la cantidad de marcador medida en la superficie finita en el caso de un ensayo competitivo, o es directamente proporcional en el caso de un ensayo sandwich. Por lo general, las medidas del marcador se hacen después de aplicar una solución de sustrato.

1. Síntesis de teleruros de diarilo

Hay muchas vías de síntesis para preparar DATs. La vía a usar para un compuesto particular depende marcadamente de los sustituyentes de los anillos aromáticos. En los ejemplos que siguen se ilustran varias de las vías conocidas. La extrapolación de estos y otros métodos de la bibliografía para la síntesis de otros DATs resultará fácil a los expertos en la técnica.

Preparación 1

4,4'di(2-hidroxietoxi)-1,1'-telurobisbenceno (Te1) (a) Preparación de [2-(4-bromofenoxi)etoxi](1,1-dimetiletil)dimetilsilano (1a)

A una solución de [2-(4-bromofenoxi)etanol (10,0 g, 46 mmol) en 150 ml de dimetilformamida seca (30 ml) se añadió cloruro de t-butildimetilsililo (8,34 g, 55 mmol) e imidazol (7,82 g, 115 mmol). Se usó más dimetilformamida (20 ml) para lavar estos materiales en el matraz de reacción. La solución resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente con un tubo Newman. Se vertió en agua (200 ml) y se sometió a extracción con éter (3 x 75 ml). Los extractos combinados se lavaron con HCl 0,5 N (200 ml), NaHCO_{3} saturado (200 ml), agua (4 x 150 ml) y NaCl saturado (200 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente a presión reducida en un evaporador rotatorio, obteniéndose el producto en bruto (16,5 g; >100%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,34 (2H, d, J = 8,9), 6,78 (2H, d, J = 8,9), 4,00-3,93 (4H, m), 0,89 (9H, s), 0,08 (6H, s). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 158,1, 132,2, 116,4, 112,8, 69,6, 61,9, 25,9, 18,4. FDMS (m/e) 330 (M^{+}, ^{79}Br). Se usó como 100% sin purificación.

(b). Preparación de 4,4'-di(2-hidroxietoxi)-1,1'-telurobisbenceno (Te1)

Se equipó con condensador y embudo de adición un matraz de 3 bocas, de 500 ml, y se puso bajo argón. Se añadieron virutas de magnesio (0,89 g, 37 mmol). Se recogió el bromuro 1a (12,3 g, 37 mmol, usado al 100%) en tetrahidrofurano seco (THF, 100 ml) y se pasó al embudo de adición. La reacción de Grignard se inició con aproximadamente 10 ml de la solución de bromuro, 1,2-dibromoetano y yodo. Se añadió el resto de la solución de bromuro y la mezcla se mantuvo a reflujo durante la noche, a cuyo término no quedaba magnesio. Se quitó la camisa de calentamiento durante 30 minutos, luego se añadieron gránulos de teluro (4,74 g, 37 mmol) y la mezcla de reacción volvió a calentarse a reflujo durante 7 horas, a cuyo término se había consumido casi todo el Te. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y luego se vertió sobre solución acuosa al 10% de NH_{4}Cl (300 ml) sometida a agitación rápida. Se separó por filtración a través de un filtro celita de tierra de diatomeas el Te precipitado y se lavó con éter la torta de filtración. El filtrato se pasó a un embudo de separación y se sometió e extracción 3 veces con éter (200 ml, 100 ml, 100 ml). Los extractos combinados se lavaron con agua y solución saturada de NaCl, la combinación se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente a presión reducida, obteniéndose el producto en bruto (12,4 g )como un aceite rojo. Se recogió en tolueno (50 ml) con polvo de cobre (2,5 g) y se calentó a reflujo con un tubo Newman durante 2,5 horas, a cuyo término el color había cambiado de rojo a gris. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de un filtro celita de tierra de diatomeas, se lavó con éter y se concentró, resultando un aceite ambarino (12,4 g). Según la RMN ^{1}H, era una mezcla del producto deseado, producto de la reacción de Grignard y tolueno residual. Se recogió en metanol(50 ml) y (50 ml) y THF (20 ml) con fluoruro potásico (5,0 25, 86 mmol) y se mantuvo a reflujo durante 24 h. Se eliminó bajo presión reducida el grueso de metanol y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se sometió a extracción dos veces más con acetato de etilo y se lavaron los extractos combinados con agua y NaCl saturado, la combinación se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente a presión reducida, obteniéndose el producto en bruto (8 g)M como un sólido. La trituración con éter dio un sólido blanco que se aisló por filtración, se lavó con éter y se secó al aire, obteniéndose el producto en bruto (1,74 g). Fue adsorbido sobre gel rápido de sílice (20 ml) usando diclorometano. Después de cromatografía rápida cuidadosa en 200 ml de gel rápido de sílice, eluyendo con diclorometano, luego con diclorometano:metanol 95:5 (el producto eluye justo antes que una pequeña cantidad del correspondiente compuesto de biarilo), trituración con éter y filtración, se obtuvo puro el producto como un sólido blanco (1,2 g). El filtrato en éter de la trituración del producto en bruto se cromatografió como se ha indicado antes. La trituración con éter y recistalización en etanol dio Te1 puro adicional (0,2 g). Producto total: 1,4 g, 19%. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,52 (4H, d, J = 8,5), 6,80 (4H, d, J = 8,5), 4,82 (2H, t, J = 5,5), 3,91 (4H, t, J = 5,0), 3,65 (4H, q apar., J = 5,1). RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 159,2, 139,8, 116,5, 104,5, 69,9, 59,9. FDMS (M7E) 404 (M^{+}, ^{130}Te).

Preparación 2

N,N-dimetil-2-(fenilteluro)bencenometanamina, sal hidrocloruro (Te2) (a) Preparación de N,N-dimetil-2-(fenilteluro)-bencenometanamina (2a)

A una solución de N,N-dimetilbencenometanamina (2,70 g, 0,020 mol) en éter seco (50 ml) en un matraz de fondo redondo bajo argón, a temperatura ambiente, se añadió a gotas con una jeringa, n-butil-litio (2,5 M, 10 ml, 0,025 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas a temperatura ambiente y luego se añadió a gotas, con una jeringa, una solución de bromuro de feniltelurenilo en tetrahidrofurano seco (0,5 M). Después de añadir 38 ml (0,019 mol), la mezcla de reacción presentaba el característico color naranja del bromuro de feniltelurenilo y se paró la adición. La mezcla de reacción se vertió sobre éter (100 ml) y la solución resultante se lavó con solución saturada de NaCl (1 x 100 ml, 2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El residuo se disolvió en acetona (100 ml) y se añadió yodo (5,08 g, 0,020 mol). La solución resultante se enfrió para que precipitara el producto. Se recogieron por filtración los cristales amarillos resultantes, se lavaron con acetona fría y se secaron para obtener el aducto de yodo de 2a (5,95 g, 50%, p.f. 178-179ºC). El aducto de yodo (5,93 g, 0,010 mol) se disolvió en dimetilformamida (100 ml). Se añadió lentamente bisulfito sódico (5,2 g, 0,05 mol) en agua (100 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, tiempo durante el cual la mezcla se volvió incolora. La mezcla de reacción se vertió en agua (500 ml) y luego se lavó con éter (2 x 50). La capa acuosa se alcalinizó con NaOH al 10% y la amina se extrajo en éter (3 x 100 ml). Los extractos combinados se lavaron con solución saturada de NaCl, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El residuo se recristalizó en metanol, obteniéndose el producto puro (3,14 g, 93%) como un sólido blanco (p.f. 51-54ºC). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,88 (2H, d, J = 6,9), 7,35 (1H, t, J = 7,3), 7,26 (2H, t, J = 7,3), 7,17 (1H, d, J = 7,7), 7,10-7,04 (2H, m), 6,94-6,89 (1H, m), 3,53 (2H, s), 2,25 (6H, s).

(b). Preparación de N,N-dimetil-2-(fenilteluro)-bencenometanamina, sal hidrocloruro (Te2)

A una suspensión de 2-(N,N-dimetilaminometil)-1-feniltelurobenceno (1,02 g, 3,0 mmol) en éter (50 ml) en baño de agua se añadió a gotas con jeringa una solución de cloruro de hidrógeno/éter (3,15 ml, 1,0 M, 3,15 mmol). La suspensión espesa se diluyó con isopropanol (20 ml) y luego se filtró. El sólido blanco se lavó con éter y se secó al aire, obteniéndose el producto (1,13 g, 95%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,6 (1H, s a) 8,13 (1H, d, J = 7,5), 7,80 (1H, d, J = 7,7), 7,52-7,48 (3H, m), 7,26-7,17 (4H, m), 4,44 (2H, d, J = 5,8), 2,68 (6H, d, J = 4,5). Análisis calculado para C_{15}H_{18}ClNTe: C 48,00; H 4,83; N 3,73. Hallado: C 47,97; H 4,87; N 3,65.

Preparación 3

N,N,N',N'-tetra(2-hidroxietil)-4,4'-teluro-bisbencenamina (Te3) (a) Preparación de N,N-bis[2-[[(1,1-dimetiletil)-dimetilsilil]oxi]etil]benzamina (3a)

Se usó un procedimiento análogo al usado para 1a, empleando los siguientes materiales: 2,2'-(fenilimino)dietanol (9,0 g, 50 mml), cloruro de t-butildimetilsililo (18,1 g, 0,12 mol), imidazol (17,0 g, 0,25 mol) y dimetilformamida (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche por razones de conveniencia. El tratamiento como en 1a dió 3a como un aceite pálido (21,6 g, >100%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,21 (2H, d, J = 8,4), 6,68 (3H, d que se solapa, t), 3,77 (4H, d, J = 6,6), 3,52 (4H, d, J = 6,6), 0,92 (18H, s), 0,06 (12H, s). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 147,8, 129,2, 115,7, 111,4, 60,3, 53,5, 25,9, 18,3, -5,3. FDMS (m/e) 409 (M^{+}). Se usó al 100% sin purificación.

(b) Preparación de N,N,N',N'-tetra[2-[[(1,1-dimetil-etil)dimetilsilil]oxi]etil]-4,4'-telurobisbenzamina (3b)

A un matraz de 3 bocas de 500 ml, secado en horno y puesto bajo argón, se añadió cloruro de teluro(IV) (5,93 g, 22 mmol). Se añadió éter seco (100 ml) con jeringa, resultando una suspensión fluida de color amarillo y el matraz se puso en baño de agua. Se preparó bajo argón una solución de 3a (18 g, 44 mmol) en éter seco (50 ml) y la solución se pasó con una cánula a la mezcla de reacción, que se agitó vigorosamente. Inicialmente se formó un precipitado grueso de color amarillo, que se aligeró a medida que se continuó añadiendo anilina. Al terminar la adición, la suspensión amarillo-verdosa se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El aceite amarillo-verdoso resultante se recibió en diclorometano (200 ml) y se añadió, mientras que se agitaba, una solución de metabosulfito sódico (8,36 g, 44 mol) en agua (200 ml). La mezcla bifásica resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente y luego se filtró a través de un filtro celita de tierra de diatomeas. Se añadió NaHCO_{3} sólido hasta pH 9 y luego se pasó la mezcla de reacción a un embudo separador. Se separó la capa de diclorometano y la fase acuosa se sometió a extracción con más diclorometano. Los extractos combinados se lavaron con agua/solución saturada de NaCl, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró, eliminándose luego el disolvente a presión reducida. El aceite rojo resultante (21,4 g) se recibió en tolueno (80 ml) y se añadió polvo de cobre (4 g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche con un tubo Newman. La mezcla de reacción resultante, de color gris, se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de tierra de diatomeas celita y el disolvente se eliminó a presión reducida. El aceite de color ámbar resultante (18 g) se sometió a cromatografía rápida dos veces con ciclohexano:diclorometano 3:1 para separar el producto del material de partida recuperado, resultando el compuesto 3b puro como un aceite amarillo 5,0 g, 48% del teórico). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,6), 6,53 (4H, d, J = 8,5), 3,72 (4H, t, J = 6,4), 3,47 (4H, t, J = 6,5), 0,88 (18H, s), 0,03 (12H, s). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 147,6, 139,7, 112,7, 98,2, 60,2, 53,4, 25,9, 18,3, -5,3. FDMS (m/e) 946 (M^{+}, ^{130}Te).

(c) Preparación de N,N,N',N'-tetra(2-hidroxietil)-4,4'-telurobisbencenamina (Te3)

Se calentó a reflujo durante 20 horas una mezcla heterogénea del silil éter 3b (2,7 g, 2,86 mmol), fluoruro potásico (0,66 g, 11,4 mmol) y metanol (20 ml). La suspensión blanca se enfrió en baño de hielo y luego el producto se aisló por filtración, se lavó con metanol frío y se secó al aire (0,80 g, 57%). Se recristalizó en metanol una pequeña cantidad para una muestra analítica (p.f. 169-170ºC). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,6), 6,53 (4H, d, J = 8,5), 3,45 (4H, q apar., J = 5,7), 3,33 (4H, t, J = 5,9). RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 148,1, 139,8, 113,1, 97,6, 58,4, 53,5. IR (KBr) 3350, 1585, 1495, 1350 cm^{-1}. FDMS (m/e) 490 (M^{+}, ^{130}Te). Análisis calculado para C_{20}H_{28}N_{2}O_{4}Te: C 49,22; H 5,78; N 5,74. Hallado: C 48,78; H 5,72; N 5,66.

Preparación 4

Ácido 2,2'-[telurobis(4,1-fenilenoxi)]-bis-acético, sal disódica (Te4) (a) Preparación de 4-(bromofenoxi)(1,1-dimetiletil)-dimetilsilano (4a)

A una solución de p-bromofenol (104 g, 0,6 mol) en dimetilformamida seca (450 ml) se añadió cloruro de t-butil dimetilsililo (108 g, 0,72 mol) e imidazol (102 g, 1,5 mol). La solución de color amarillo pálido resultante se agitó durante 3 h con un tubio Newman. Se vertió en agua (1,2 l) y se sometió tres veces a extracción con éter (900 ml, 300 ml, 300 ml). Los extractos combinados se lavaron 4 veces con agua (150 ml), una vez con HCl 1 N (300), solución saturada de NaHCO_{3} (300 ml) y solución saturada de NaCl (300 ml), se secaron sobre MgSO_{4} y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida en un evaporador rotatorio y luego con bomba de vacío, obteniéndose el producto en bruto (183 g, >100%), en una relación 6:1 con silanol a partir del material de hidrolizado. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,31 (2H, d, J = 8,7), 6,71 (2H, d, J = 8,7), 0,97 (9H, s), 0,18 (6H, s). Se usó al 100% sin purificación.

(b) Preparación de 4,4'-di(t-butildimetilsililoxi)-1,1'-telurobisbenceno (4b)

Se equipó con agitador de eje y embudo de adición un matraz de 3 bocas, de 2 l, secado en horno, y luego se puso bajo argón. Se añadieron virutas de magnesio (15,2 g, 0,66 mol). Se recibió en THF seco (600 ml) el bromuro 4a (17,2 g, 0,6, usado al 100%) y se pasó al embudo de adición. La reacción de Grignard se inició con aproximadamente 25 ml de la solución de bromuro y varios cristales de yodo. La solución restante de bromuro se añadió a una velocidad tal que la reacción continuaba a reflujo. La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 30 min más después de haber terminado la adición; en ese momento sólo quedaba una pequeña cantidad de Mg. La mezcla de reacción se enfrió ligeramente en baño de agua, se añadieron gránulos de teluro (76,8 g, 0,6 mol) y la mezcla de reacción se volvió a poner a reflujo durante 2,5 h, a cuyo termino se había consumido casi todo el Te. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, luego se vertió en una solución acuosa al 10% de NH_{4}Cl (2 l) que estaba sometida a rápida agitación y se continuó agitando durante 30 min. El Te precipitado se eliminó por filtración a través de un filtro celita de tierra de diatomeas y la torta de lavado se lavó con éter. El filtrado se pasó a un embudo separador y se sometió tres veces a extracción con éter (1200 ml, 300 ml, 300 ml).Los extractos combinados se lavaron con agua y solución saturada de NaCl, se secaron sobre MgSO_{4} y se filtraron a través de un filtro celita de tierra de diatomeas para eliminar MgSO_{4} y Te que se había depositado durante el tratamiento. El disolvente se eliminó a presión reducida, obteniéndose el producto en bruto (194 g) como un aceite rojo. Se recibió en tolueno (900 ml) con polvo de cobre (38 g) y se calentó a reflujo con un tubo Newman durante 2,5 h, a cuyo término el color había pasado de rojo a gris. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de un filtro celita de tierra de diatomeas y se concentró, obteniéndose un aceite ambarino (181 g). Según RMN ^{1}H, se trataba de una mezcla del producto deseado, producto Grignard apagado y tolueno residual y se calculó que contenía 0,23 mol de 4b. La purificación se realizó mediante el aducto de yodo de 4b. El producto en bruto se recibió en acetona (0,6 l) y se añadió yodo (58 g, 0,23 mol) en porciones mientras que se agitaba vigorosamente. Después de 15 min, se había formado un precipitado muy espeso. Ss añadió etanol (1,2 l) y se aislaron por filtración el sólido naranja y el sólido cristalino iridiscente, que se secaron al aire. Se obtuvo una segunda cosecha volviendo a filtrar el filtrado. El rendimiento combinado fue de 206 g y, según RMN, se trataba de producto puro, siendo etanol residual el único contaminante. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,95 (4H, d, J = 8,7), 6,86 (4H, d, J = 8,7), 0,98 (18H, s), 0,25 (12H, s). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 158,6, 138,4, 121,9, 25,5, 18,2, -4,3. El aducto de yodo se recibió en dioxano (500 ml), diclorometano (500 ml) y solución acuosa al 5% de NaHSO_{3} (1,1 l) y se agitó vigorosamente el sistema bifásico. Después de 1 h, la capa inferior (orgánica) estaba todavía roja, lo que indicaba una reducción incompleta. Se decantó y conservó el grueos de la capa acuosa amarilla y la capa orgánica se evaporó a presión reducida. Se añadió al residuo dioxano (200 ml), diclorometano (200 l) y solución acuosa al 5% de NaHSO_{3} (400 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más. Se evaporó a presión reducida para eliminar parcialmente los disolventes orgánicos y el dioxano acuoso que quedaba se pasó a un embudo de separación y se sometió tres veces a extracción con éter. Los extractos combinados se lavaron con agua, solución saturada de NaHCO_{3} y solución saturada de NaCl, se secaron sobre MgSO_{4} y la mezcla se filtró. Se trató de la misma manera la capa acuosa decantada y se combinaron las dos. El disolvente se eliminó a presión reducida, obteniéndose 4b puro (97,3 g, 60%) como un aceite de color ámbar. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,4), 6,80 (4H, d, J = 8,4), 0,96 (18H, s), 0,17 (12H, s). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 155,8, 139,6, 121,5, 105,2, 25,7, 18,2, -4,4. FDMS 5 (m/e) 544 (M^{*}, ^{130}Te).

(c). Preparación de 4,4'-telurobisfenol (4c)

Se recibió en metanol (200 ml) el silil éter 4b (54,2 g, 0,1 mol) en un matraz de fondo redondo de 500 ml. Se añadió fluoruro potásico (11,6 g, 0,2 mol) y la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 1,5 h bajo argón. Después de haber enfriado la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se vertió en agua sometida a agitación rápida (1,2 l), usando más metanol (20 ml) para facilitar el paso. El pH se ajustó a 14 con NaOH al 10% (aprox. 40 ml) y la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de tierra de diatomeas. El filtrado se pasó a un embudo separador y se lavó dos veces con diclorometano. La capa acuosa se pasó a un matraz erlenmeyer de 2 l en baño de hielo y se añadió ácido acético acuoso al 25% hasta pH 6, formándose un precipitado color crema. El producto se aisló por filtración, se lavó con agua y se secó al aire, obteniéndose el producto en bruto (29 g). Se adsorbió sobre gel de sílice (150 ml) usando éter. La cromatografía rápida en vacío sobre 1 l de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:diclorometano 1:4, dió el producto puro. La trituración con diclorometano dió, en dos cosechas, 4c puro como un sólido amarillo (24 g, 76%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 5 gotas de DMSO) \delta 8,77 (2H, s), 7,29 (4H, d, J = 8,4), 6,47 (4H, d, J = 8,4).

(d). Preparación de 4,4'-di(etoxicarbonilmetoxi)-1,1'-telurobisbenceno (4d)

Se equipó con agitador de eje y embudo de adición un matraz de 3 bocas, de 250 ml, secado al aire, que se puso bajo argón y se añadió hidruro sódico (al 60%, 1,76 g, 44 mmol). Se lavó tres veces con ciclohexano y luego se añadió dimetilformamida seca (tamices moleculares) (60 ml). El matraz se puso en baño de agua y se añadió a gotas, desde el embudo de adición), una solución del bisfenol 4c (6,28 g, 20 mmol) en dimetilformamida seca (15 ml) (desprendimiento vigoroso de H_{2}). La suspensión resultante se calentó durante 20 min a 85ºC en baño de aceite (desprendimiento adicional de H_{2}). La suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se añadió a gotas, desde el embudo de adición, una solución de bromoacetato de etilo (6,68 g, 40 mmol) en dimetilformamida seca (5 ml), aclarándose el precipitado durante este tiempo. La mezcla de reacción se agitó durante 45 min y luego se vertió en agua agitada rápidamente (320 ml). El precipitado resultante se aisló por filtración y se lavó con agua. Se repartió entre agua (50 ml) y diclorometano (80 ml). La fase acuosa se sometió dos veces más a extracción con diclorometano y los extractos combinados se lavaron con agua, luego con solución saturada de NaCl, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida y el sólido resultante se recristalizó en etanol (50 ml), se enfrió y filtró. El producto se obtuvo como un sólido blanco (5,3 g, 55%, p.f. 88,5-89ºC). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,60 (4H, d, J = 8,5), 6,75 (4H, d, J = 8,5), 4,58 (4H, s), 4,25 (4H, q, J = 7,1), 1,28 (6H, t, J = 7,1). IR (KBr) 1765, 1720, 1580, 1480 cm^{-1}. FDMS (M/e) 488 (M^{*}, ^{130}Te). Análisis calculado para C_{20}H_{22}O_{6}Te: C 49,43; H 4,56. Hallado: C 49,36; H 4,55.

(e). Preparación de 4,4'-di(carboximetoxi)-1,1'-teluro bisbenceno, sal disódica (Te4)

Se recibió en metanol (400 ml) el diéster 4d (39,2 g, 81 mmol) y se añadió solución acuosa al 10% de NaOH (47 ml, 170 mmol). Se formó una suspensión muy espesa. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora. La suspensión resultante se enfrió en baño de hielo. El sólido se aisló por filtración y se lavó con etanol, se secó al aire y se molió con almirez y mano para obtener Te4 como un sólido de color crema pálido (37,6 g, 98%). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 5 gotas de D_{2}O). \delta 7,46 (4H, d, J = 8,4), 6,66 (4H, d, J = 8,5), 4,06 (4H, s). RMN ^{13}C (D_{2}O) \delta 176,6, 158,0, 139,8, 115,9, 104,8, 66,5. IR (KBr) 3540, 3430, 1595, 1490, 1415, 1230 cm^{-1} Análisis calculado para C_{16}H_{12}Na_{2}O_{6}Te\cdot1,5H_{2}O: C 38,37; H 3,02. Hallado: C 38,33; H 3,05.

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Preparación 5

N,N,N',N'-tetra(carboximetil)-4,4'-teluro-bisbenzamina, sal tetrasódica (Te5) (a). Preparación de N-(2-etoxi-2-oxoetil)-N-fenil-glicina, éster etílico (5a)

Se mantuvieron a reflujo durante un día, en un matraz equipado con un tubo Newman, anilina (9,3 g, 0,1 mol), bromoacetato de etilo (36,7 g, 0,22 mol) y 2,6-lutidina (23,5 g, 0,22 mol) en acetonitrilo (200 ml). Por TLC (diclorometano) se vió que la reacción había sido completa. Se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con éter (200 ml). La sal hidrocloruro de lutina precipitada se separó por filtración y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se repartió entre éter y agua y la capa acuosa se sometió dos veces más a extracción con éter. Los extractos combinados se lavaron con HCl 1N, agua, solución saturada de NaHCO_{3} y solución saturada de NaCl, se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a presión reducida, obteniéndose 5a como in líquido oscuro. Se recibió en diclorometano y se filtró a través de gel de sílice, resultando el producto (23,2 g, 88%) como un aceite pálido. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,21 (2H, t, J = 7,9), 6,77 (1H, t, J = 7,3), 6,61 (2H, d, J = 8,4), 4,20 (4H, q, J = 7,2), 4,13 (4H, s), 1,26 (6H, t, J = 7,1).

(b) Preparación de N,N,N',N'-tetra(etoxicarbonil-metil)-4,4'-telurobisbenzamina (5b)

A un matraz de 500 ml, de 3 bocas, secado en horno, equipado con embudo de adición y puesto bajo argón, se añadió cloruro de teluro(IV) (11,9 g, 44 mmol). Se añadió éter seco (200 ml) con jeringa, resultando una suspensión tenue, amarilla, y el matraz se puso en un baño de hielo. Se preparó bajo argón una solución de 5a (23,2 g, 89 mmol) en éter seco (50 ml) y la solución se pasó mediante una cánula al embudo de adición. Se añadió a gotas a la mezcla de reacción, que se agitó vigorosamente. Se formó inmediatamente un barro espeso y se paró la barra del agitador. El resto de la adición se realizó mientras que se arremolinaba y agitaba manualmente. La mezcla de reacción se dejó en reposo sin agitar durante la noche, luego se sonicó hasta que el barro se convirtió en un sólido grumoso. Se filtró la mezcla de reacción y la torta de filtración se lavó con éter. La torta de filtración se recibió en diclorometano (200 ml) y se añadió, mientras que se agitaba, una solución de metabisulfito sódico (17,0 g, 89 mmol) en agua (200 ml). La mezcla bifásica resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió NaHCO_{3} sólido hasta pH 7 y la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro celita de tierra de diatomeas. El filtrado se pasó a un embudo separador, se separó la capa de diclorometano y la capa acuosa se sometió a extracción con más diclorometano. Los extractos combinados se lavaron con agua y solución saturada de NaCl, se secó la combinación sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró, disolviéndose luego el disolvente a presión reducida. El aceite rojo resultante (17,9 g) se recibió en tolueno (100 ml) y se añadió polvo de cobre (9 g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo con un tubo Newman durante 2 horas. La mezcla de reacción de color gris resultante se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de un filtro celita de tierra de diatomeas y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto en bruto (18 g de un aceite de color ámbar) se sometió dos veces a cromatografía rápida con diclorometano y luego diclormetano:metanol 98:2 para separar el producto del material de partida recuperado, resultando 5b como un aceite viscoso de color naranja pálido (7,36 g, 50% del teórico). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (4H, d, J = 8,6), 6,43 (4H, d, J = 8,7), 4,19 (8H, q, J = 7,1), 4,08 (8H, s), 1,25 (12H, t, J = 7,1). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 170,7, 147,6, 139,5, 113,6, 101,3, 61,2, 53,3, 14,2. IR (placas de sales) 1730, 1580, 1490, 1180 cm^{-1}. FDMS (m/e) 658 (M^{+}, ^{130}Te).

(c) Preparación de N,N,N',N'-tetra(carboximetil)-4,4'-telurobisbenzamina, sal tetrasódica (Te5)

Se recibió en metanol (60 ml) el diéster 5b (4,35 g, 6,63 mmol) y se añadió solución acuosa al 10% de NaOH (7,4 ml, 26,5 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora. La suspensión resultante se enfrió en baño de hielo y se filtró. El sólido se lavó con metanol frío y se secó al aire, obteniéndose Te5 como un sólido de color crema pálido (3,81 g, 91%). RMN ^{1}H (D_{2}O) \delta 7,56 (4H, d, J = 8,6), 6,38 (4H, d, J = 8,6), 3,83 (8H, s). RMN ^{13}C (D_{2}O) \delta 179,4, 148,7, 139,6, 113,0, 98,3, 55,5. IR (KBr) 3250 (an), 1575, 1405, 1210 cm^{-1}.

Análisis calculado para C_{20}H_{16}Na_{4}N_{2}O_{8}Te\cdot3H_{2}O: C 35,02; H 3,23; N 4,08. Hallado: C 34,82; H 3,03; N 4,04.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la invención, no exhaustivos.

Ejemplo 1

Se cortaron los revestimientos descritos y se montaron como clisés. Se prepararon cartuchos que contenían los cliseés poniendo los cartuchos en la parte de arriba del banco durante 16-20 horas quedando conectadas las luces del laboratorio durante este período de tiempo. Al día siguiente de la incubación del banco, se ensayaron los clisés usando un analizador automatizado de inmunoensayos de película seca. A cada clisé se aplicaron once \mul de una solución matriz de suero humano que contenía 10.000 m-IU/ml hCG. Cada clisé se incubó luego durante 5 minutos a 37ºC y, transcurrido este tiempo, se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM), y ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) (10 mM). El fluido de lavado elimina por lavado el ligando o receptor no unido, marcado con peroxidasa de rábano picante, de la zona roja y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se incubó por segunda vez, a 37ºC, tiempo durante el cual se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos a una longitud de onda de 670 nm. La velocidad de la formación de color para clisés de cada revestimiento se calculó a partir de las lecturas de la densidad de reflectancia.

Se prepararon sobre soporte de poli(tereftalato de etileno) revestimientos de película seca de las formulaciones siguientes, para el ensayo de gonadotropina coriónica humana (hCG) en muestras de suero. Los términos usados en todas las estructuras de revestimiento se describen en la Tabla 1.

Revestimiento 1

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Revestimiento 2

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Revestimiento 3

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Revestimiento 4

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Revestimiento 5

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Revestimiento 6

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Comparación de clisés de cartucho para los revestimientos 1-6

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La comparación de los clisés del cartucho muestra claramente que se produce un alto porcentaje de pérdida del primer clisé del cartucho cuando no se incorporan al revestimiento VOSO_{4} o compuestos de DAT. Esta pérdida de la velocidad de formación del color para el primer clisé dará por resultado una predicción incompleta de la concentración de analito en la muestra que se está ensayando. La inclusión de VOSO_{4} (revestimiento 2), los compuestos de DAT (revestimientos 3 y 4) o la combinación de VOSO_{4} y compuestos de DAT (revestimientos 5 y 6) da por resultado una marcada mejora de la velocidad porcentual de formación de color de los clisés cimeros.

Ejemplo 2

Con el fin de diferenciar los efectos de los compuestos de DAT investigados, se pusieron clisés de cada revestimiento con la cara hacia arriba, directamente sobre el banco y expuestos a las mismas condiciones que los clisés que quedaban en los cartuchos (16-20 horas de tiempo de incubación con la luz fluorescente conectada). Seguidamente al período de incubación, se ensayaron los clisés en un prototipo de analizador para inmunoensayos automatizado, de película seca, usando los mismos materiales y el mismo protocolo descrito antes. El resultado esperado es una gran pérdida de la velocidad de formación debido a una exposición mayor de los clisés a factores ambientales (luz, aire, etc.). Como medio para observar el efecto de un aumento de la exposición ambiental, se comparó la velocidad de formación del color de los clisés del banco con la velocidad de formación de los clisés del cartucho para cada condición (excluidos los clisés cimeros). Los resultados de los clisés tratados como se ha descrito son los siguientes:

Comparación de los clisés del cartucho para los revestimientos 1-6

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El ensayo de clisés puestos en el banco revela nuevamente que la inclusión de VOSO_{4} y compuestos de DAT (revestimientos 5 y 6) en el revestimiento proporciona protección frente a la pérdida de velocidad debida a la exposición al ambiente. Este ensayo revela también que hay una acción cooperativa cuando se incorporan VOSO_{4} y Te1 en el mismo revestimiento (revestimiento 5). Esto da por resultado una pérdida porcentual menor que cuando se incorpora solo uno cualquiera de los compuestos (revestimientos 2 y 3).

Los DTAs Te1-Te5 se evaluaron en un sistema modelo diseñado para acentuar la pérdida de la actividad de la HRP: En este sistema, los DATs Te1, Te4 y Te5b protegían la actividad de HRP solos o en combinación con una sal de vanadilo como se demuestra en los ejemplos siguientes.

Ejemplos 3-5

Se prepararon elementos analíticos de la formulación siguiente sobre soporte de poli(tereftalato de etileno):

15

Este elemento analítico se usó para medir la estabilidad de HRP con el protocolo siguiente. Se emplearon muestras de 10 microlitros de soluciones de tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, que contenían aproximadamente HRP 3 x 10^{-8} M y cantidades variables de uno de los compuestos teleruro de diarilo de la invención para obtener manchas de piezas separadas de 1 cm^{2} de superficie cada una de los anteriores elementos revestidos (4 muestras para cada compuesto y a cada concentración). Estos elementos se secaron y se pusieron en un cajón oscuro. Después de 30 minutos y nuevamente 24 horas después, esto es, al día siguiente, se sacaron los elementos del cajón y la HRP se extrajo sumergiendo cada elemento en 1 ml de solución de tampón de fosfato sódico 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, 0,1% de albúmina de suero bovino, pH 7,0, en un tubo de ensayo para extraer la HRP. Después de agitar el tubo de ensayo durante 1 minuto (lo que eliminó los componentes de los elementos analíticos del soporte de poli(tereftalato de etileno), se centrifugó la suspensión resultante y se eliminó la solución. La cantidad de HRP activo en esta solución se determinó añadiendo una parte alicuota de 100 \mul a una cubeta de espectrómetro y una solución de reactivo para obtener 1 ml de una solución final de tampón de fosfatopotásico 50 mM, pH 7,0, 4'-hidroxiacetanilida 5 mM, 0,625% del tensioactivo Triton X-100, 0,0005% de colorante leuco 4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)imidazol y peróxido de hidrógeno 0,85 mM. La temperatura de ensayo era de 30ºC. Se formó un color rosa que luego se determinó espectrofotométricamente a 655 nm. La velocidad de formación de color era directamente proporcional a la cantidad de enzima activa en el extracto.

Los datos se expresaron como relaciones de actividad, calculados dividiendo la actividad extraída a las 24 horas por la actividad extraída a los 30 minutos para cada muestra. Una relación de 1 indicaba que la enzima estaba totalmente protegida por el aditivo durante un período de tiempo de 24 horas. Se observó alguna variación de datos de tanda a tanda, probablemente causada por las diferencias día a día en la humedad y temperatura ambiental. Esto podría afectar a la velocidad de secado de la HRP sobre el revestimiento y afectar así a la estabilidad aparente de la enzima. Por tanto, los datos se pueden comparar entre los Ejemplos 3-5, pero no entre dos cualesquier de los ejemplos.

Ejemplo 3

La eficacia de los compuestos Te1, Te2, Te3 y Te4 a 1 mM se compara estando solos o en presencia de VOSO_{4} 1mM(Figura 1). Los compuestos Te1 y Te 4 protegían la actividad de la HRP en el modelo de formato de seco hacia abajo comparativamente a cuando no había aditivos. Los compuestos Te2 y Te3 no eran estabilizadores efectivos en este formato. Cuando se incluyeron VOSO_{4} y uno cualquiera de Te1 o Te4, se retuvo más actividad de HRP que en presencia de uno solo de tales compuestos.

Ejemplo 4

En la Figura 2 se presenta el efecto de la concentración sobre la capacidad de Te1 y Te4 para estabilizar la HRP. Se usaron las siguientes concentraciones de la solución de HRP: Te1 1, 0,1 o 0,01 mM y Te4 10, 1 o 0,1 mM. Además, se hicieron manchas con soluciones de HRP que contenían contenían tampón solo, o VOSO_{4} 1 mM. La pérdida de actividad dependía de la concentración tanto para Te1 como para Te4. En presencia de Te4 10 mM, la actividad de HRP estaba totalmente protegida durante una incubación de 24 horas.

Ejemplo 5

Este ejemplo presenta el efecto de Te4 o Te5 sobre la estabilidad del conjugado de enzima anti-CRP-HRP (2,85 x 10^{-8} M). En la solución para las manchas estaba presente también tampón solo; Te4 1, 2, 4 u 8 mM; o Te4 1 o 8 mM. Tanto Te4 como Te5 protegían la actividad de HRP conjugado y la protección dependía de la concentración

\hbox{(Figura 3).}

Ejemplo 6

Los revestimientos se prepararon como se indica en las siguientes estructuras de revestimiento, 7-10, montadas como clisés, acondicionadas a 21ºC/73% de humedad relativa durante 2 días y congeladas.

Revestimiento 7

Se preparó un revestimiento de película seca de la siguiente formulación para el ensayo de proteína C-reactiva (CRP) en muestras de suero sobre soporte de poli(tereftalato de etileno).

16

Revestimiento 8

17

Revestimiento 9

Se preparó un revestimiento de película seca de la siguiente formulación para ensayo de proteína C-reactiva (CRP) en muestras de suero sobre soporte de poli(tereftalato de etileno).

18

Revestimiento 10

19

Se descongelaron los cartuchos y se cargaron en un analizador E250.

A cada clisé se aplicaron 11 \mul de una muestra de suero humano que contenía aproximadamente 20 mg/ml de CRP. Cada clisé se incubó luego durante 5 minutos a 37ºC y seguidamente se aplicaron 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DTPA (10 \mul) para lavar (eliminar) el conjugado no unido de anticuerpo HRP de la zona roja e iniciar la reacción de formación de colorante catalizada por HRP. Después de incubar a 37ºC durante 2,5 min, se midió la densidad de reflectancia a 670 nm y se convirtió en concentración de CPR mediante una curva de calibración.

Se comparó la concentración predicha del clisé de más arriba con la concentración media predicha de los siguientes seis clisés. Seguidamente se presentan los resultados de varios experimentos de este tipo.

Sesgo = predicción del clisé de más arriba-predicción de la media de los clisés 2-7.

20

Estos resultados revelan que, en ausencia de un agente protector, el clisé cimero tiene un valor predicho sustancialmente menor que los clisés posteriores. La adición de Te1, Te2 o VOSO_{4} disminuye el sesgo entre el clisé cimero y los clisés siguientes.

La mejora mayor la proporciona Te1.

Ejemplo 7

Se cortaron los revestimientos 7-10 y se montaron como clisés y se acondicionaron a 21ºC/33% de humedad relativa durante 3 días.

Se descongelaron los cartuchos. Se expulsó el clisé cimero de cada cartucho y los cartuchos se incubaron a 21ºC/33% de humedad relativa durante 3 días.

Los clisés se ensayaron con suero humano que contenía aproximadamente 20 mg/l de CRP como se ha descrito en el Ejemplo 6.

Se comparó la predicción del clisé cimero que recibió 3 días de exposición a 21ºC/33% de humedad relativa con la predicción de los clisés 2-7 y los resultados se presentan seguidamente.

Revestimiento	Agente	Media de 2 cartuchos
7	ninguno	-26,4
8	Te1	-4,5
9	Te2	-8,2
10	VOSO_{4}	-5,6

Los resultados revelan que un clisé cimero recientemente expuesto cambia en un período de 3 días, dando por resultado una predicción que es sustancialmente más baja que clisés siguientes en ausencia de un agente protector. Los teleruros de diarilo Te1 y Te2 y el VOSO_{4} protegen el clisé y el resultado es un sesgo menor en comparación con clisés siguientes del cartucho, siendo Te1 nuevamente el agente que proporciona la mayor mejora.

Ejemplo 8

Se cortaron los revestimientos 7-10, se montaron como clisés, se acondicionaron a 21ºC/33% de humedad relativa durante 2 días y se congelaron.

Los cartuchos se descongelaron e incubaron a 21ºC/33% de humedad relativa durante 7 días.

Los cartuchos incubados y los cartuchos recientemente descongelados se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 6 con 3 muestras de suero humano que contenía CRP en el intervalo de 10-30 mg/l. Se compararon las predicciones de los clisés incubados con las predicciones de clisés recientemente descongelados. Se determinó el sesgo medio de clisés incubados frente a clisés recientemente descongelados para 3 fluidos; los resultados se dan seguidamente.

\newpage

Revestimiento	Agente	Sesgo medio
7	ninguno	-7,8
8	Te1	0,8
9	Te2	-2,62
10	VOSO_{4}	-0,26

Los resultados revelan que, en ausencia de un agente protector, los clisés expuestos a 21ºC/33% de humedad relativa durante 7 días desarrollan un sesgo de clisés recientemente descongelados. En presencia de Te1, Te2 o VOSO_{4}, se reduce sustancialmente el sesgo que resulta de esta exposición.

Los ejemplos siguientes presentan resultados que eran superiores e inesperados cuando el DAT revistió una capa de grabado en comparación a cuando no se usó DAT o revistió una capa diferente.

Ejemplo 9

Se evaluó Te5 en un ensayo de CRBM de la siguiente manera:

Revestimiento 1, Sin Te5

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de carbamazepina (CRBM) en muestras de suero que tenía la formulación y la estructura de capas que se indica seguidamente.

21

Ejemplo 10

Revestimiento 2

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de carbamazepina (CRBM) que tenía la composición y la estructura siguientes que comprendía Te5 revestido en la capa de esparcimiento a un nivel final rehumedecido de 1 mM.

22

Ejemplo 11

Revestimiento 3, Te5 1 mM (capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de carbamazepina (CRBM) que tenía la composición y la estructura siguientes, que comprendía Te5 que reviste la capa de grabado a un nivel final rehumedecido de 1 mM.

23

Ejemplo 12

Ejemplo comparativo 1

Se cortaron los revestimientos 1-3 y se montaron como clisés. Se ensayaron cartuchos que contenían los clisés en cuanto a la velocidad de respuesta 2 semanas después de revestimiento, luego se almacenaron en un congelador a -18ºC durante 1 año. Después de 1 año de almacenamiento en el congelador, se ensayaron los cartuchos en cuanto a su velocidad de respuesta y el sesgo del clisé cimero. Los clisés se ensayaron en un analizador VITROS E250. Se aplicaron al primer clisé (cimero) de 3 cartuchos 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía 8,8 \mug/ml de CRBM, y también a los cartuchos 2-7 de esos mismos cartuchos. Cada clisé se incubó durante 5 minutos a 37ºC y después de ello se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DPTA (10 \muM). El fluido de lavado arrastra (o elimina) el marcado no unido de peroxidasa de rábano picante y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante, catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se reincubó a 37ºC y, durante este tiempo, se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos durante 2,5 minutos a una longitud de onda de 670 nm. Las medidas de reflectancia se convirtieron en transmitancia, Dt, usando la transformada de Clapper-Williams y se calculó la velocidad de formación de color. Los resultados son los siguientes:

24

La comparación de los revestimientos revela claramente que se presenta un gran porcentaje de pérdida de velocidad para los primeros clisés de los cartuchos cuando en el revestimiento no estaba presente Te5 o se puso en la capa de esparcimiento de perlas a un nivel rehumedecido de 1 mM. Esta pérdida de velocidad de la formación de color en el primer clisé daría por resultado una predicción incorrecta de la concentración de analito para la muestra que se está ensayando. La inclusión de Te5 en la capa de grabado a un nivel rehumedecido de 1 mM da por resultado una mejora marcada de la velocidad porcentual retenida para los clisés cimeros después de 1 año de almacenamiento en congelador.

Ejemplo 13

Se evaluó Te5 en la capa de grabado de un elemento de película seca de fenobarbital como sigue:

Revestimiento 4, sin Te5

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de PHBR, que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

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(Tabla pasa a página siguiente)

25

Ejemplo 14

Revestimiento 5 (Te5 0,25 mM en capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de PHBR, que tenía la composición y estructura de capas siguiente y que comprendía Te5 en la capa de grabado a un nivel final rehumedecido de 0,25 mM:

26

Ejemplo 15

Revestimiento 6 (Te5 0,5 mM en capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de PHBR, que tenía la composición y estructura de capas siguiente y que comprendía Te5 en la capa de grabado a un nivel final rehumedecido de 0,5 mM:

27

Ejemplo 16

Ejemplo comparativo 2

Se cortaron los revestimientos 4-6 y se montaron como clisés. Los cartuchos que contenían los clisés se almacenaron en un congelador a -18ºC. Después de haber sido congelados durante 6 meses y 9 meses, los cartuchos se ensayaron en cuanto a la velocidad de respuesta y sesgo del primer clisé. Los clisés se ensayaron en un analizador VITROS 250. Se aplicaron al primer clisé (cimero) 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía aproximadamente 27 \mug/ml de fenobarbital y también a los clisés 2-7 de esos mismos cartuchos. Cada clisé se incubó durante 5 minutos a 37ºC y, después de ello, se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DPTA (10 \muM). El fluido de lavado arrastra (o elimina) el marcador no unido de peroxidasa de rábano picante y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante, catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se reincubó a 37ºC y durante este tiempo se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos durante 2,5 minutos a una longitud de onda de 670 nm. Las medidas de reflectancia se convirtieron en transmitancia, Dt, usando la transformada de Clapper-Williams y se calculó la velocidad de formación de color.

Los resultados son como sigue: Sesgo = predicción para el clisé cimero-predicción, medida de clisés 2-7.

Revestimiento	Agente	Sesgo, 6 meses	Sesgo,9 meses
4	Ninguno	3,43	3,54
5	0,25Te5	2,96	3,55
6	0,50Te5	1,02	1,15

Ejemplo 17

Se evaluó el Te5 en la capa de grabado de un elemento de película seca de feniftoína como sigue:

Revestimiento 7, sin Te5

28

Ejemplo 18

Revestimiento 8 (Te 0,25 mM en la capa de grabado)

Se preparó un revestimiento para el ensayo de PHYT que comprendía Te5 de revestimiento en la capa de grabado a un nivel rehumedecido de 0,25 mM, que tenía la composición y la estructura de capas que se indica:

29

Ejemplo 19

Revestimiento 9 (Te 0,5 mM en el grabado)

Se preparó un revestimiento para el ensayo de PHYT que comprendía Te5 de revestimiento en la capa de grabado a un nivel rehumedecido de 0,5 mM, que tenía la composición y la estructura de capas que se indica:

30

Ejemplo 20

Ejemplo comparativo 3

Se cortaron los revestimientos 7-9 y se montaron como clisés. Los cartuchos se almacenaron en un congelador a -18ºC. Después de haber sido congelados durante 6 meses y 9 meses, los cartuchos se ensayaron en cuanto a la velocidad de respuesta y sesgo del primer clisé. Los clisés se ensayaron en un analizador VITROS 250. Se aplicaron al primer clisé (cimero) 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía aproximadamente 12,5 \mug/ml de fenitoína y también a los clisés 2-7 de esos mismos cartuchos. Cada clisé se incubó durante 5 minutos a 37ºC y, después de ello, se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DPTA (10 \muM). El fluido de lavado arrastra (o elimina) el marcador no unido de peroxidasa de rábano picante y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante, catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se reincubó a 37ºC y durante este tiempo se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos durante 2,5 minutos a una longitud de onda de 670 nm.

Las medidas de reflectancia se convirtieron en transmitancia, Dt, usando la transformada de Clapper-Williams y se calculó la velocidad de formación de color. Los resultados son los siguientes:

Revestimiento	Agente	Sesgo, 6 meses	Sesgo,9 meses
7	Ninguno	0,89	1,10
8	0,25Te5	0,10	-0,17
9	0,50Te5	0,19	-0,41

Ejemplo 21

Se evaluó Te5 en la capa de grabado de digoxina como sigue:

Revestimiento 10 (Sin Te5)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de DGXN que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

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(Tabla pasa a página siguiente)

31

Ejemplo 22

Revestimiento 11 (Te5 0,25 mM en capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de DGXN que comprendía Te5 de revestimiento a un nivel final rehumedecido de 0,25 mM, que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

32

Ejemplo 23

Revestimiento 12 (Te5 0,25 mM en capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de DGXN que comprendía Te5 que reviste a un nivel final rehumedecido de 0,5 mM, que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

33

Ejemplo 24

Ejemplo comparativo 4

Se cortaron los revestimientos 10-12 y se montaron como clisés. Los cartuchos que contenian los clisés se almacenaron en un congelador a -18ºC. Después de haber sido congelados durante 6 meses y 9 meses, los cartuchos se ensayaron en cuanto a la velocidad de respuesta y sesgo del primer clisé. Los clisés se ensayaron en un analizador VITROS 250. Se aplicaron al primer clisé (cimero) 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía aproximadamente 12,5 \mug/ml de digoxina y también a los clisés 2-7 de esos mismos cartuchos. Cada clisé se incubó durante 5 minutos a 37ºC y, después de ello, se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DPTA (10 \muM). El fluido de lavado arrastra (o elimina) el marcador no unido de peroxidasa de rábano picante y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante, catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se reincubó a 37ºC y durante este tiempo se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos durante 2,5 minutos a una longitud de onda de 670 nm. Las medidas de reflectancia se convirtieron en transmitancia, Dt, usando la transformada de Clapper-Williams y se calculó la velocidad de formación de color. Los resultados son los siguientes:

\newpage

Revestimiento	Agente	Sesgo, 6 meses	Sesgo,9 meses
10	Ninguno	0,16	0,38
11	0,25Te5	0,063	0,21
12	0,50Te5	0,003	0,03

Ejemplo 25

Se evaluó Te5 en la capa de grabado de un elemento de película seca de carbazepina como sigue:

Revestimiento 13 (Sin Te5)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de CRBM que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

34

Ejemplo 26

Revestimiento 14 (Te5 0,25 mM en capa de grabado)

Se preparó un revestimiento de película seca para el ensayo de CRBM que comprendía Te5 de revestimiento en la capa de grabado a un nivel rehumedecido de 0,25 mM y que tenía la composición y estructura de capas siguiente:

35

Ejemplo 27

Revestimiento 15 (Te5 0,5 mM en capa de grabado)

36

Ejemplo 28

Ejemplo comparativo 5

Se cortaron los revestimientos 13-15 y se montaron como clisés. Los cartuchos que contenían los clisés se almacenaron en un congelador a -18ºC. Después de haber sido congelados durante 6 meses y 9 meses, los cartuchos se ensayaron en cuanto a la velocidad de respuesta y sesgo del primer clisé. Los clisés se ensayaron en un analizador VITROS 250. Se aplicaron al primer clisé (cimero) 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía aproximadamente 12,5 \mug/ml de carbamazepina y también a los cartuchos 2-7 de esos mismos cartuchos. Cada clisé se incubó durante 5 minutos a 37ºC y, después de ello, se aplicaron a cada clisé 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM) y DPTA (10 \muM). El fluido de lavado arrastra (o elimina) el marcador no unido de peroxidasa de rábano picante y sirve para iniciar la reacción de formación de colorante, catalizada con HRP. Seguidamente a la adición de la solución de lavado, cada clisé se reincubó a 37ºC y durante este tiempo se tomaron lecturas de la densidad de reflectancia a intervalos de 3 segundos durante 2,5 minutos a una longitud de onda de 670 nm. Las medidas de reflectancia se convirtieron en transmitancia, Dt, usando la transformada de Clapper-Williams y se calculó la velocidad de formación de color. Los resultados son los siguientes:

Revestimiento	Agente	Sesgo, 6 meses	Sesgo,9 meses
13	Ninguno	0,35	0,69
14	0,25Te5	0,53	0,56
15	0,50Te5	-0,013	0,12

Los ejemplos comparativos 2-5 revelan que la presencia de Te5 en la capa de grabado da por resultado una reducción significativa del sesgo del primer clisé, que es más próximo a cero que en ausencia de Te5. El nivel requerido de Te5 varía, siendo de 0,25 (PHYT) en algunos casos y de 0,5 (PHBR, DGXN, CRBM) en otros. Pero, en todos los casos, se puede reducir a casi cero el sesgo del primer clisé con Te5 en la capa de grabado.

Esta invención da por resultado una reducción significativa del sesgo del primer clisé con niveles más bajos de Te5 cuando el estabilizador se pone en una capa de grabado sobre la capa de esparcimiento en vez de estar revistiendo dentro de la capa de esparcimiento en ensayos competitivos de inmunovelocidad. Los ejemplos que se aportan en esta memoria revelan que esto es un fenómeno general. La incorporación de incluso niveles bajos de teleruro de diarilo en las capas de grabado de cuatro ensayos de inmunovelocidad, da una reducción significativa del sesgo del primer clisé comparativamente con teleruro de diarilo que reviste directamente la capa de esparcimiento. Puesto que los teleruros de diarilo pueden afectar negativamente al ensayo de varias de modo depende de la dosis (mediante, por ejemplo, blanqueo del colorante de registro), el uso de concentraciones más bajas de teleruro de diarilo en la capa de grabado, en vez de unos niveles más altos requeridos en la capa de esparcimiento, supone una gran ventaja.

La presente invención da por resultado una mejora de la estabilidad de la RHP bien solos, o bien en unión con otros estabilizadores tales como compuestos de vanadilo. Una realización preferente de la presente invención comprende Te5 y una sal de vanadilo.

TABLA 1

Polímero adhesivo: Poli(acrilato de metilo-co-2-acrilamido-propanodulfonato de 2-metilo-co-metacrilato de 2-acetoxietilo)

Perlas de anticuerpo: Partículas de polímero del ácido poli(estireno-co-3-(p-vinilbenciltio)propiónico que tienen un anticuerpo de un ligando unido a ellas

Perlas de PC: Partículas de polímero del ácido poli(estireno-co-3-(p-vinilbenciltio)propiónico que tienen fosforilcolina unida a ellas

BSA: Albúmina de uero bovino

BVSME: Bis(vinilsulfonilmetil)éter

DTPA: Ácido dietilentriaminapentaacético

Marcador: Un conjugado de un ligando o un receptor de un ligando y peroxidasa de rábano picante

Colorante leuco: 4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(3,5-dimetoxi-4-hidroxifenil)imidazol

Colorante magenta: Ácido 4,5-dihidroxi-3-(6,8-di-sulfo-2-naftilanzo)-2,7-naftalenodisulfónico, sal sódica

MOPS: Tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico

OLIN 10G: Un tensioactivo de isononil-fenoxipoliglicidol que tiene una media de aproximadamente 10 unidades de glicidol por molécula (vendido por Olin Chemical Co.=

Perlas de polímero: Partículas de poli(viniltolueno-ácido metacrílico) que tienen un diámetro medio de 20-40 \mum.

Aglutinante de polímero: Poli(N-isopropilacrilamida-co-2-acrilamido-sal sódica del ácido 2-metilpropanosulfónico-co-N,N'-metilenbisacrilamida)

Aglutinante de polímero I: Poli(N-isopropilacrilamida-co-metacrilato de 2-hidroxietilo-co-N,N-metilenbisacril-amida)

TES: Tampón de ácido N-[tris(hidroxi-metil)metil]-2-aminoetanosulfónico

TX-100: Tensioactivo Triton X-100, un tensioactivo octilfenoxipolietoxietanol (vendido por Union Carbide)

TETRONIC T908: Un tensioactivo no iónico que es un copolímero de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno (vendido por BASF Corp.)

La invención ha sido descrita detalladamente haciendo referencia particular a realizaciones preferentes; pero debe tenerse en cuenta que se pueden efectuar variaciones y modificaciones dentro del espíritu y ámbito de la invención. En particular, un experto en la técnica podría seleccionar, con el fin de optimizar la invención de los solicitante, el uso de uno o más teleruros de diarilo, o el uso de un teleruro de diarilo particular, o de una combinación de teleruros de diarilo específicos, o de uno o más teleruros de diarilo en combinación con uno o más compuestos de vanadinilo.

Claims

1. Un elemento analítico seco de inmunoensayo para ensayar un ligando, que comprende un soporte que dispone de:

(b) una capa de esparcimiento;

(c) una capa de receptor que comprende una concentración fija de un receptor inmovilizado para el ligando, y

(d) una capa de grabado que comprende un teleruro de diarilo.

2. El elemento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto teleruro de diarilo comprende una estructura (I):

(I) Ar^{1}-Te-Ar^{2}

en la que Ar^{1} y Ar^{2} son los mismos o diferentes grupos arilo o heteroarilo seleccionados entre el grupo constituido por

37

38

en las que X es O, S, Se o Te, y R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{31}, R^{32}, R^{33}, R^{41}, R^{42} y R^{43} son los mismos o diferentes, cada uno seleccionado entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, OH, OR^{1}, SH, NH_{2}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, NR^{1}R^{2}, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales, y SR^{1}, grupos en los que R^{1} y R^{2} son los mismos o diferentes y cada uno se selecciona entre el grupo constituido por alquilo que tiene una cadena de carbono de 1 a 14 átomos de carbono que opcionalmente presenta uno o varios grupos hidrófilos, fenilo y fenilo sustituido;

R^{14}, R^{15}, R^{24} y R^{25} son los mismos o diferentes y cada uno se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, alcoxi que tiene 1-5 átomos de carbono, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales.

3. El elemento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el teleruro de diarilo se selecciona entre el grupo constituido por

39

40

4. El elemento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende una sal de vanadilo.

5. El elemento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador del ligando marcado o el receptor marcado es una peroxidasa o un derivado de peroxidasa.

6. El elemento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la peroxidasa es peroxidasa de rábano picante o un derivado de peroxidasa de rábano picante.

7. El elemento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la capa de grabado también comprende el ligando marcado o el receptor marcado.

8. El elemento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la capa de grabado es contigua a la superficie de la capa de esparcimiento que proporciona contacto con una muestra líquida.

9. Un método para ensayar un ligando inmunológicamente reactivo en una muestra acuosa, que comprende las etapas de:

(1) proporcionar un elemento analítico seco de inmunoensayo según se ha definido en las reivindicaciones 1 a 8;

(2) poner en contacto una superficie finita de la capa de esparcimiento del elemento con la muestra, con lo que se forma (a) un complejo de ligando inmovilizado-receptor, (b) un complejo de enzima inmovilizada-ligando marcado-receptor, o (c) una mezcla de (a) y (b), o un complejo de receptor inmovilizado-ligando marcado-receptor;

(4) determinar la concentración del ligando detectando la señal.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la señal es una señal colorimétrica.