KR100597818B1 - 리간드검정용무수면역검정분석부재및이를사용하는리간드의검정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 포함하는 표지 층; (b) 확산 층; (c) 리간드에 대한 고정된 수용체를 포함하는 일정 농도로 포함하는 수용체 층 및 (d) 디아릴 텔루라이드를 포함하는 그라비어 층을 갖는 지지체를 포함하는, 리간드 검정용 무수 면역검정 분석 부재에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 바나딜 염을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 부재를 사용하여 검정을 방법에 관한 것이다.

Description

리간드 검정용 무수 면역검정 분석 부재 및 이를 사용하는 리간드의 검정방법{Reduction in first slide bias and improved enzyme stability by incorporation of diaryl tellurides in the gravure layer of dry-film, immunoassay elements}
본 출원은 로간 마가렛 이(Logan, Margaret E.) 등의 이름으로 박막 면역검정 부재 내 디아릴 텔루라이드의 혼입에 의한 제1 슬라이드 바이어스의 감소 및 개선된 효소 안정성이란 명칭하에 1995년 6월 7일 출원된 미국 특허원 제08/476,155호의 부분 연속 출원이다.
본 발명은 무수 필름 부재 및 면역검정에서의 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 무수 필름 부재중 표시된 면역반응물의 개선된 안정성에 관한 것이다.
천연의 면역학적 반응을 이용하는 면역검정은 임상 화학에서 분석 기술로서 광범위하게 사용되어 왔다. 반응의 특이성으로 인하여, 이들은 특히 생체액중에 극히 저 농도로 존재하는 생물학적 분석물을 정량하는데 유리하다. 이러한 분석물은 예를 들면, 항원, 항체, 치료학적 약물, 마취제, 효소, 호르몬 및 단백질을 포함 한다.
검정의 표적인 분석물은 본원에서 리간드라고 언급된다. 리간드를 특이적으로 인지하여 이와 반응함으로써 복합체를 형성하는 화합물을 본원에서는 수용체라고 칭한다. 수용체 및 리간드는 결합체 쌍을 형성한다. 당해 쌍 중 임의의 구성원은 수용체 또는 리간드로서 작용할 수 있다.
경쟁적 검정의 경우에, 표지된 면역-경쟁성 유도체를 포함하는 표지된 분석물 및 이러한 분석물을 동족체는 검정의 통상적인 성분인 반면, 샌드위치 검정의 경우에는 분석물를 위한 표지된 수용체가 통상적으로 사용된다. 이들을 본원에서는 각각 표지된 리간드 및 표지된 수용체로 언급한다.
경쟁적 결합 면역검정에 있어, 고정량의 적절한 수용체와의 반응에 대해 표지된 리간드는 표지되지 않은 리간드와 경쟁한다. 미지 농도의 리간드는 결합되거나 결합되지 않은(즉, 유리된) 표지된 리간드의 시그날 측정치로부터 측정할 수 있다. 이 반응은 다음과 같이 진행된다:
리간드 + 표지된 리간드 + 수용체-기질 <=>
리간드-수용체-기질 + 표지된 리간드-수용체 -기질.
샌드위치 면역검정 또는 면역측정 검정으로 공지된 대체 면역검정 방식에 있어서, 리간드는 상이한 에피토프 부위에서 리간드에 결합하는 2개 이상의 수용체 분자와 접촉한다. 하나의 수용체는 통상적으로 적절히 표지되며, 다른 수용체는 고체 기질상에 고정되거나 고체 기질상에 고정될 수 있다. 리간드의 양은 리간드 및 2개의 수용체중의 결합된 복합체의 양에 직접 비례한다. 이는 다음과 같이 설명된다:
기질-수용체1 + 리간드 + 수용체2-표지 <=>
기질-수용체1-리간드-수용체2-표지
통상의 표지는 방사성 택(radioactive tag), 효소, 발색단, 형광단, 안정한 유리 라디칼 및 효소 보조인자, 억제제 및 알로스테릭(allosteric) 효과기를 포함한다.
면역검정 분석 부재는 미국 특허 제4,517,288호 및 제4,258,001호에 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 부재들은 미립자 층 내에 고정된 리간드용 항체와 같은 수용체를 포함한다. 또한, 부재들은 일반적으로 결합되거나 결합되지 않은 종과의 상호작용을 통해 샘플중의 리간드의 농도에 연관될 수 있는 시그날을 생성하는 시약 시스템을 함유한다. 사용시, 샘플은 효소 표지된 리간드와 결합시켜 부재에 적용할 수 있다. 시간의 경과후, 표지된 리간드에 대한 기질을 함유하는 용액은 미립자 층에 적용된다. 기질과의 반응은 효소 표지에 의해 촉매되어 궁극적으로 시그날을 유발하는, 예를 들어, 발색되는 반응 생성물을 형성한다. 색상의 반사 밀도(reflection density)는 샘플중 리간드의 농도와 상관관계가 있을 수 있다. 유사한 시그날 생성 시스템이 방사성 택, 발색단, 형광단, 안정한 유리 라디칼 및 효소 보조인자, 억제제 및 알로스테릭 효과기와 같은 기타 공지된 통상의 표지에 대해 공지되어 있다.
다층 면역검정 부재는 상술한 면역검정 원리를 이용하여 액체 샘플중 분석물을 측정하는 무수 필름 부재이다. 경쟁적 검정 부재에 있어서, 색상(또는 기타 시그날) 형성률(the rate of color formation)은 존재하는 분석물의 양에 반비례하며, 샌드위치 검정 부재에 있어서, 색상(또는 기타 시그날) 형성률은 존재하는 분석물의 양에 직접 비례한다. 또한, 색상(또는 기타 시그날) 형성률은 효소 표지된 분석물, 즉 약물 또는 고정된 수용체에 결합된 효소 표지된 수용체의 활성에 직접 비례한다. 안정한 조정을 유지하기 위한 면역검정에 있어서, 효소 활성(측정된 비율)은 특정 보정 기간 동안에 어떠한 슬라이드에서도 상실될 수 없다.
흔히, 면역검정 부재는 필요할 때에 1개씩 꺼낼 수 있는 50개의 개별적 부재를 함유하는 플라스틱 "카트리지"로 사용자에게 공급된다. 부재들은 다른 부재의 상부에 하나씩 쌓여서 카트리지내 하부 49개 부재들은 모두 상부 표면이 위의 부재에 의해 덮혀 있다. 그러나, 적층물내 상부 부재는 이와 같이 덮히지 않음으로써 이의 표면은 나머지 49개의 부재들과는 달리 환경 인자에 노출된다. 예를 들어, 상부(또는 제1) 부재는 카트리지가 제조 동안 취급되거나 카트리지가 임상 분석기의 부재 공급기내에 존재하는 경우 나머지 부재들보다 공기 유동 및 빛에 더 노출된다.
사용하기 전 저장 동안에, 카트리지 자체는 호일로 배면 처리된 밀봉된 백(bag) 내에 저장된다. 그러나, 상부 부재는 나머지 49개의 부재들보다 밀봉된 백 내부의 잔류 공기 및 습도에 훨씬 더 노출되게 된다.
일반적인 시험액이 카트리지내 부재와 반응하는 경우, 상부(또는 제1) 부재에서 관측된 색상 형성률은 동일한 카트리지내 상부 부재 아래의 부재에 동일한 시험액을 적용시키는 경우 관측되는 색상 형성률보다 더욱 낮은 것으로 밝혀져 있다. 이것은 제1 슬라이드 바이어스(first slide bias)라고 언급한다.
제1 슬라이드의 보다 낮은 색상 형성률을 다루는 한가지 방법은 본원에서 참조로 인용된 다니엘(Daniel) 등의 미국 특허 제5,516,645호에 기술된 바와 같이 바나듐 이온을 사용하는 것을 포함한다. 출원인은 "제1 슬라이드 바이어스"를 감소시키기 위하여 디아릴 텔루라이드(DAT) 또는 복수의 디아릴 텔루라이드(DATs)의 사용을 개발하였다. 제1 슬라이드 바이어스를 방지하기 위한 디아릴 텔루라이드의 사용은 샌드위치 검정 및 경쟁적 면역율 검정 모두에서 사용될 수 있다.
본 발명의 한가지 양태에 따라서,
(a) 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 포함하는 표지 층;
(b) 확산 층;
(c) 리간드에 대한 고정된 수용체를 일정 농도로 포함하는 수용체 층 및
(d) 디아릴 텔루라이드를 포함하는 그라비어 층을 갖는 지지체를 포함하는, 리간드 검정용 무수 면역검정 분석 부재가 제공된다.
한 양태에서, 수용체는 직경이 0.1 내지 5㎛ 범위인 중합체성 비드에 공유결합된다. 바람직한 양태에서, 효소 표지된 리간드 및 디아릴 텔루라이드는 동일한 그라비어 층 또는 구역에 존재하는데, 여기서 그라비어 층 또는 구역은 액체 샘플과 처음으로 또는 초기에 접촉하는 확산 층의 표면에 인접하거나 또는 접촉되어 있다.
상기 정의된 부재는 실질적으로 제1 슬라이드 바이어스 즉, 동일한 카트리지내 다른 부재와 비교하여 변경된 카트리지내 상부 부재의 발색률을 감소시킨다. 더우기, 카트리지내 모든 부재들은 장기간의 안정성 및 저장성이 더 높아진다. 실시예들은 디아릴 텔루라이드 화합물이 이러한 장점을 제공함을 확증하고 있다.
또한, DAT 화합물은 일반적으로 효소 조성물, 특히 퍼옥시다제, 특히 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 효소, 바람직하게는 HRP와 치료학적 약물, 남용 약물 및 스테로이드와 같은 소분자와의 결합체를 안정화시키는데 유용하다. 다른 양태 는 표지로서 사용되는 효소, 바람직하게는 HRP와 단백질 및 탄수화물과 같은 거대 분자와의 결합체이다. 예를 들어, 당해 화합물은 본 발명의 무수 부재 및 용액 검정에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는
(1) (a) 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 포함하는 표지 층;
(b) 확산 층;
(c) 리간드에 대한 고정된 수용체를 일정 농도로 포함하는 수용체 층 및
(d) 디아릴 텔루라이드를 포함하는 그라비어 층을 지닌 지지체를 포함하는, 무수 면역검정 분석 부재를 제공하는 단계;
(2) 당해 부재의 확산 층의 한정된 영역을 샘플과 접촉시킴으로써 (i) 고정된 리간드-수용체 복합체, (ii) 고정된 효소-표지된 리간드-수용체 복합체 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 혼합물, 또는 고정된 수용체-리간드-표지된 수용체 복합체를 형성시키는 단계;
(3) 한정된 영역과 효소 표지물에 대한 기질 용액을 접촉시킴으로써 시그날의 전개를 촉진시키는 단계 및
(4) 시그날을 검출하고 시그날의 강도 또는 양을 측정함으로써 리간드의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 수성 샘플 중의 면역학적으로 반응성인 리간드를 검정하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 효소 표지된 수용체 또는 효소 표지된 리간드는 고정된 효소 표지된 리간드 또는 고정된 효소 표지된 수용체로부터 분리된다. 이러한 분리는 당해 분야에 공지된 특정의 수단, 예를 들면, 기질 용액(예: 과산화수소 용액)의 첨가에 의해 수행될 수 있다.
부재의 하나 이상의 층은 각각 하나 이상의 구역을 포함할 수 있다. 부재의 접촉 층은 서로간에 급격한 경계를 지닐 수 있으며, 이 경우 광학 및/또는 전자 현미경에 의해 이들은 별개의 분리된 부재 층을 보이며, 또한 이들은 층의 혼합이 일어나 층간 경계부가 희미해지거나 불명확한 접촉 구역 또는 접촉 영역을 지닐 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 별개의 분리된 층들은 광학 및/또는 전자 현미경에 의해 가시적이거나 비가시적일 수 있다. 구역의 형성은 부분적이거나 실질적으로 완전(또는 완전)하다. 부분적인 구역 형성의 경우에, 단지 일부의 침작된 층만이 침투하여, 개별적으로 침착된 접촉 층과 혼합됨으로써(이 경우 층들 둘 다는 각각 상호 침투할 수 있으나, 어떠한 경우에도 층들 모두의 일부를 포함하는 구역이 형성되고, 개개의 상호 층 침투가 모두 고려되고, 모두 본원에 기술된 바와 같은 구역 형성을 가져온다), 개별적으로 침착된 접촉 층(또는 층들) 내에 구역(들)을 포함하며, 이때 층들은 별개로 분리되어 존재하지만 희미하거나 불명확한 경계를 갖는 층으로 존재한다.
한편, 대부분 또는 모든 개별적으로 침착된 층은 침투하여 접촉 층(또는 층들)과 혼합됨으로써 접촉 층(또는 층들)내에 실질적으로 또는 전적으로 함유되는 방식으로 접촉 층(또는 층들)내에 구역(또는 구역들)을 형성하며, 따라서 이것은 광학 및/또는 전자 현미경에 의해 부재의 접촉 층(또는 층들)로부터 떨어져 존재하는 별개의 분리된 층으로써 보이지 않을 수 있다. 부분적 또는 완전한 구역은 의 도대로 형성될 수 있거나 필연적으로 형성될 수 있다. 의도적으로 형성되는 경우, 층 내의 구역은 실행자가 특정 성분(들)을 혼입하여 하나 이상의 층들 내의 구역내에 포함되도록 하는 임의의 방법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 특정 성분 또는 특정 성분들이 중합체 또는 기타 매트릭스 내에 봉입될 수 있으며, 이 매트릭스는 이어서 층 또는 층들 내에 혼입될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 양태는 2개의 인접한 층과 접촉된, 특정 성분(들)(A)을 포함하는 층을, 당해 층이 접촉 층들 중 하나의 층에 용해될 수 있도록 제조함을 포함한다. 초기의 접촉 동안 또는 이후 연속하여, 완전하거나 부분적인 구역이 당해 구역이 용해될 수 있는 접촉 층 내에 형성된다. 따라서, 접촉 층 내 구역은 특정 성분(A)를 포함한다. 구역의 형성은 상기 정의한 바와 같이 부분적이거나 완전할 수 있다. 구역 형성도는 피복 분야의 숙련가에게 알려져 있는 바와 같은, 층을 제공하기 위해 사용된 용매, 건조전 층의 접촉 시간, 온도 등과 같은 조건을 조정함으로써 조절할 수 있다. 표지 층, 수용체 층, 그라비어 층 및/또는 기타 층이라는 용어를 사용하여 정의된 무수 면역검정 부재들은, 부재의 표지 층, 수용체 층, 그라비어 층 및/또는 기타 층이, 기재된 층들의 침착동안 또는 침착후에 접촉 층(또는 층들)과 함께 별개의 분리된 층, 또는 부분적으로 또는 완전한 구역(또는 구역들)을 형성할 수 있는 모든 양태를 포함한다.
그라비어 층은 다른 층, 예를 들어 확산 층의 표면위에 침착된 하나 이상의 성분들을 포함하는 박층이다. 사용된 용어 "그라비어 층"은 박층을 의미하여, 여 기서 "박"은 층의 두께가 접촉하고 있는 접촉 층(또는 층들)에 비해 더 적음을 의미하는 것으로 사용된다. 편리하게는, 그라비어 피복 방법은 디아릴 텔루라이드(및/또는 다른 성분들)을 포함하는 박층을 피복하는 바람직한 방법을 나타낸다. 이 용어의 사용은 어떠한 방식으로 한정되는 것으로 의도되지는 않는다. 상기 정의된 것으로서 박층을 피복, 침착 또는 적층하는 수단은 용어 "그라비어 층"의 범위내에 속하는 것으로 고려된다. 본 발명의 부재의 확산 층 상에 직접 피복된 그라비어 층은 확산 층 상에 별개의 분리된 층으로서 보이지 않을 수 있다. 그라비어 층은 최초로 접촉하는 확산 층(또는 기타 층)의 표면 상에, 표면내에 또는 바로 밑에 얇은 접촉 구역을 형성하는 것으로 기대된다. 어떠한 경우에서도, 액체 샘플은 그라비어 층 및/또는 구역을 포함하는 확산 층과 접촉하는 경우, 확산 층 자체의 다공성으로인하여, 확산 층 성분들, 비드 등(이들 용어들은 당해 분야에 공지되어 있다)과 직접 접촉하여, 샘플이 확산 및 계량된다. 즉, 그라비어 층 및/또는 구역을 갖는 부재와 액체 샘플의 접촉은, 확산, 계량 및 확산 층의 기타 모든 작용이 방해받지 않기 때문에 확산 층과 액체 샘플의 접촉 측면에서 간단히 기술될 수 있다.
하기 정의된 Te5는 본원에 인용된 모 특허에서 교시된 화학식 1의 다수의 화합물 종들 중 하나를 나타낸다.
[화학식 1]
Ar1-Te-Ar2
또한, 본 발명자는 디아릴 텔루라이드, 특히 화학식
의 Te5가 1mM의 최종 재습윤(final rewet) 수준에서 카바마제핀(CRBM) 경쟁적 면역율 검정의 면역검정 부재의 그라비어 층 내로 혼입되는 경우, 제1 슬라이드 바이어스의 현저한 감소를 가져온다는 것을 발견하였다. 본 출원인들은 1년 동안에 걸친 제1 바이어스가 현저히 감소됨을 발견하였다. 사실상, 제1 슬라이드는 첫번째가 아닌 슬라이드 조절로부터 구별되지 않는다. 동일한 수준의 Te5를, 비드 확산 층에 피복된 그라비어 층이 아닌, 비드 확산 층에 직접 피복시키는 경우, 제1 슬라이드 바이어스의 생성을 방지하기에 충분치 않다. 또한 카바마제핀(CRBM), 페노바르비탈(PHBR), 페니토인(PHYT) 및 디곡신(DGXN) 측정을 위해 고안된 무수 면역검정 부재의 그라비어 층 내에 0.25 내지 0.50mM Te5를 혼입(부재의 재습윤시)시키는 경우, 6개월 및 9개월의 냉동기 저장후에도 제1 슬라이드 바이어스를 현저히 감소시킴이 밝혀졌다.
일반적으로, 본 발명은 확산 층 위에 배치된 그라비어 층 내에 피복된 디아릴 텔루라이드 화합물을 포함하는 개선된 무수 면역검정 부재에 관한 것이다. 그러나, 그라비어 층은 임의의 층위에 배치될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 개선된 무수 필름 부재를 사용하여 면역검정을 수행하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 부재들은 표지된 리간드 또는 표지된 수용체, 확산 층(또는 구역), 수용체 층(또는 구역) 및 그라비어 층(또는 구역)을 포함한다. 구역 및 층들은 앞서 정의되었다. 각종 구역이 하나의 피복 층 또는 별개의 피복층들 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 확산 구역 및 수용체 구역은 단일 층에 존재하거나 별개의 층들에 존재할 수 있다. 별개의 층들은 지지체 상에서 어떠한 순서로도 배열될 수 있다. 또한, 별개의 층들은 수용체 층이 지지체 상에 직접 존재하거나, 확산 층이 수용체 층 바로 위에 직접 존재하거나, 표지된 리간드 또는 표지된 수용체 구역이 확산 층 상에 존재하는 방식으로 배열될 수 있다. 수용체 구역이 전적으로 별개의 층을 형성하는 경우, 이 층들은 또한 이후 기술된 유형의 결합제를 포함할 것이다. 부재는 그라비어 층과 같은 추가의 층을 포함할 수 있다. 이러한 층 모두는 당해 분야에 공지된 피복 기술을 사용하여 피복시킬 수 있다.
디아릴 텔루라이드의 대표적인 화합물은 화학식 1의 화합물이다.
화학식 1
Ar1-Te-Ar2
디아릴 텔루라이드는 이후 기술될 사람 융모막 고나도트로핀(hCG) 및 C-반응성 단백질(CRP) 면역검정 부재와 같은 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 면역반응물을 포함하는 면역검정 부재들내로 혼입되는 경우 제1 슬라이드 바이어스를 현저히 감소시킨다. 이들 화합물의 서브세트를 제1 슬라이드 바이어스를 방지하는 이들의 능력에 대해 화합물을 평가하도록 설계된 모델 시스템내에서 HRP 활성의 보존에 대해 시험하여 나타낸다.
유용한 디오가노텔루라이드는 Ar1 및 Ar2이 동일하거나 상이한 하기 화학식의 아릴 또는 헤테로아릴 그룹인 물질을 포함한다:
[여기서, X는 O, S, Se 또는 Te이고, R11, R12, R13, R21, R22, R23, R31, R32, R33, R41, R42 및 R43은 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, OH, OR1, SH, NH2, NHR1, NR1 2, NR1R2, CO2H 및 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, PO3H2 및 이의 염, 및 SR1(여기서, R1 및 R2는 상이하며, 각각 1개 또는 수개의 친수성 그룹을 포함하거나 포함하지 않는 탄소수 1 내지 14의 탄소 쇄를 갖는 알킬, 페닐 및 치환된 페닐로 이루어진 그룹중에서 선택된다)로 이루어진 그룹 중에서 선 택되고, R14, R15, R24 및 R25는 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, CO2H 또는 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, PO3H2 및 이의 염(여기서, R1은 위에서 정의한 바와 같다)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다]
상기에서, 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 아밀, 이소아밀 또는 네오펜틸과 같은 그룹을 의미한다. 탄소수 1 내지 5의 탄소 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 아밀, 이소아밀 또는 네오펜틸과 같은 직쇄 또는 측쇄의 탄소 쇄를 의미한다. 탄소수 1 내지 14의 탄소 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 아밀, 이소아밀, 네오펜틸, 헥실, 옥틸, 데실, 테트라데실 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
친수성 그룹은 설폰산, 포스폰산 또는 카복실산, 하이드록실 및 아미노 그룹과 같은 그룹을 의미한다. 이들 화합물중 일부는 산 또는 염기와의 염을 형성할 수 있다. 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염 및 염산, 브롬화수소산, 인산 및 황산과의 염, 및 옥살산, 푸마르산, 타르타르산, 말론산, 아세트산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산과의 염이 바람직하다.
바람직한 DAT는 하이드록실 그룹, 아민 및 이들의 염, 및 카복실산 및 이들의 염과 같은 수용성을 부여하는 그룹(이에 한정되지는 않는다)을 함유하는 방향족 환상에 치환체를 갖는 것들이다. 특히, 단독으로 또는 바나딜 화합물과 함께 HRP 활성을 보존하는 수용성 DAT는 다음과 같다(Te1-Te5):
확산 층 내에서 사용하기 위한 기타 물질은 기술된 바와 같은 무수 분석 부재들을 제조하는 당해 분야, 예를 들면 미국 특허 제4,258,001호에 잘 공지되어 있다. 이러한 층들은 피복, 제지 등으로부터 제조된 거대다공성 층을 포함한다. 바 람직한 미립자 층은 비드 확산 층(BSL)이다. 이 층은 희석되거나 희석되지 않은 시험 샘플(예를 들면, 1 내지 200μ L)을 수용하도록 본 발명의 부재에 사용하기에 적합한 다공성을 갖도록 용이하게 제조될 수 있다. 바람직하게는, 확산 층은 구역을 구성하는 입자 사이의 내부 연결된 공간에 의해 생성되는 등방의 다공성이다. 등방의 다공성이란 확산 층이 층을 통해 모든 방향으로, 적용된 액체를 균일하게 확산시킴을 의미한다.
비드 확산 층을 포함하는 유용한 확산 층이 미국 특허 제4,670,381호, 제4,258,001호 및 제4,430,436호에 기술되어 있다. 특히 유용한 확산 층은 유기-중 합체성 입자 및 중합체성 접착제(이들 입자는 미국 특허 제4,258,001호에 기술되어 있다)에 의해 형성된 미립자 구조를 갖는 것들이다. 확산 층에 유용한 유기-중합체성 입자는 일반적으로, 직경이 약 10 내지 40㎛ 또는 보다 더 작은 범위인 입자 크기를 갖는 열안정성 구형 비드이다.
이 입자는 필수적인 특성을 갖는 천연 및 합성 중합체를 포함하는 광범위한 유기 중합체로 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직하게는 이들은 앞의 특허에서 기술한 하나 이상의 부가 중합체로 구성된다.
수용체 층이 별개의 층인 경우, 이것은 지지체 위에 또는 지지체 상의 시약 층 또는 하부 층 위에서 제조되어 피복된다. 수용체는 수용체 상의 표면 반응성 그룹(친핵성 유리 아미노 그룹 및 설프하이드릴 그룹)을 통해 중합체 입자에 공유 결합된다.
수용체를 작은 중합체 비드에 부착시키기 위한 일반적인 방법은 선택된 수용체를 일반적으로 공지된 반응을 사용하여 비드에 공유 결합시킴을 포함한다. 많은 펜던트 그룹, 예를 들면, 할로알킬, 2-치환된 활성화 에틸설포닐 및 비닐설포닐을 사용하여, 수용체를 비드에 직접 결합시킬 수 있다. 일반적으로, 비드는 완충 수용액중에서 수용체와 혼합되는데, 여기서 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 10이고, 중합체 입자의 농도는 약 0.1 내지 약 40중량％이고, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10중량％이다. 수용체의 양은, 수용체 대 중합체의 비율이 약 0.1:1000 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:100 내지 약 1:10이다. 혼합은 약 5 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 5 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 약 0.5 내지 약 48시간 동안 수행한다. 임의의 적합한 완충액을 사용될 수 있다.
일부 경우, 외부 표면상의 펜던트 반응성 그룹은 리간드의 공유 결합을 유발시키기 위하여 개질되거나 활성화된다. 예를 들어, 카복실 그룹은 1992년 7월 22일 공개된 EP 제308235호 및 미국 특허 제5,155,166호에 기술된 공지의 카보디이미드 또는 카바모일로늄 화학을 사용함으로써 활성화된다.
그러나, 카복실 그룹-함유 일분산된 중합체 비드에 대한 수용체의 결합은 2단계로 수행된다. 제1 단계는 입자의 수성 현탁액을 카보디이미드 또는 카바카모일로늄 화합물과 접촉시켜 카복실 그룹 대신에 중간 반응성 그룹을 갖는 중간체 중합체 입자를 제조함을 포함한다. 이 단계는 적합한 산 또는 완충액을 사용한 적합한 pH를 사용하여 수행함으로써 목적하는 pH를 제공한다. 일반적으로, pH는 6 미만이나, 이것은 반응이 진행될 수 있는 한 중요하지 않다. 더욱 바람직하게는, pH는 약 3.5 내지 약 7이다. 카보디이미드 또는 카바모일로늄 화합물 대 입자 표면 상의 카복실 그룹의 몰비는 약 10:1 내지 500:1이다.
당해 방법의 제2의 단계에서, 제1 단계중에 형성된 반응성 중간체는 반응성 아민- 또는 설프하이드릴-그룹 함유 수용체와 접촉된다. 이로써 공유 결합이 입자와 수용체간에 형성된다. 수용체 대 중합체성 입자의 중량비는 일반적으로 약 1:1000 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1:100 내지 약 1:10이다.
다른 경우, 외부 표면상의 에폭시 그룹이 가수분해되어 면역학적 종 중의 아 민 그룹에 대한 커플링제로 작용할 수 있는 시아노겐 브로마이드와 반응할 수 있는 디올 화합물을 형성할 수 있다. 알데하이드는 아민과 직접 반응하여, 연속적으로 환원됨으로써 공유 결합을 형성할 수 있는 쉬프(Schiff) 염기를 형성한다. 또한, 알데하이드가 산으로 산화될 수 있으며, 카복실 그룹에 대해 상기 확인한 화학을 사용하여 아미드 결합을 형성시킬 수 있다.
중합체 상의 반응성 그룹, 또는 중합체가 카복실 그룹을 갖는 경우에는 입자상의 카복실 그룹과 카보디이미드 또는 카바모일로늄 화합물의 반응에 의해 형성된 중간체와 반응할, 반응성 아민 또는 설프하이드릴 그룹 각각을 수용체가 함유되는 한, 임의의 반응성 아민- 또는 설프하이드릴-함유 수용체를 일분산된 중합체성 비드에 결합시킬 수 있다.
수용체 상의 아민 또는 설프하이드릴 그룹과 용이하게 직접 반응하는 반응성 그룹을 갖는 작은 중합체 비드를, 경우에 따라, 적절한 완충액 중에서 수용체와 단순히 혼합시켜 반응시킨다.
수용체에 대한 비드로 선택될 수 있는 중합체는 다음을 포함한다: 폴리(m 및 p-클로로메틸스티렌), 폴리(스티렌-코-m 및 p-클로로메틸스티렌-코-2-하이드록시에틸 아크릴레이트)(67:30:3 몰비), 폴리(스티렌-코-m 및 p-클로로에틸설포닐메틸스티렌)(95.5:4.5 몰비), 폴리{스티렌-코-N[m 및 p-(2-클로로에틸설포닐메틸)페닐]아크릴아미드}(99.3:0.7 몰비), 폴리(m 및 p-클로로메틸스티렌-코-메타크릴산)(95:5, 98:2 및 99.8:0.2 몰비), 폴리(스티렌-코-m 및 p-클로로에틸설포닐메틸스티렌-코-메타크릴산)(93.5:4.5:2 몰비), 폴리{스티렌-코-N-[m 및 p-(2-클로로에틸설포닐메틸)페닐]아크릴아미드-코-메타크릴산}(97.3:0.7:2 몰비), 폴리(스티렌-코-m 및 p-클로로메틸스티렌)(70:30 몰비), 폴리[스티렌-코-3-(p-비닐벤질티오)프로피온산](97.6:2.4 몰비), 폴리(스티렌-코-비닐벤질 클로라이드-코-아크릴산)(85:10:5 몰비), 폴리(스티렌-코-아크릴산)(99:1 몰비), 폴리(스티렌-코-메타크릴산)(90:10 몰비), 폴리(스티렌-코-아크릴산-코-m 및 p-디비닐벤젠)(89:10:1 몰비), 폴리(스티 렌-코-2-카복시에틸 아크릴레이트)(90:10 몰비), 폴리(메틸 메타크릴레이트-코-아크릴산)(70:30 몰비), 폴리(스티렌-코-m 및 p-비닐벤즈알데하이드)(95:5 몰비) 및 폴리(스티렌-코-m 및 p-비닐벤즈알데하이드-코-메타크릴산)(93:5:2 몰비).
부재의 층들은 적합한 지지체 상에 존재한다. 비록 지지체와 수용체 층 사 이에 젤라틴/완충액 층과 같은 삽입 층이 존재할 수 있다고 해도, 수용체 층은 지지체위에 피복될 수 있다. 지지체는 적합한 크기 안정성을 갖고, 바람직하게는 파장이 약 200 내지 약 900nm인 전자기 방사선을 통과시키는 비다공성의 투명한(즉 방사선 투과성) 물질일 수 있다. 특정 부재를 위한 지지체는 목적하는 검출 방식(반사, 투과, 발광 또는 형광 분광 분석)과 부합되도록 선택되어야 한다. 유용한 지지체 물질은 폴리스티렌, 폴리에스테르[예를 들면, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)], 폴리카보네이트, 셀룰로즈 에스테르(예를 들면, 셀룰로즈 아세테이트) 등을 포함한다.
수용체 층용의 중합체성 결합제는 일반적으로 캐나다 특허 제1,240,445호에 기술되어 있으며 본원에 참조로 인용된다. 유용한 중합체는 N-이소프로필아크릴아미드와 같이 약 30 내지 97중량％의 중합된 N-알킬 치환된 아크릴아미드를 포함하는 중합체이다. 기타 유용한 N-알킬-치환된 아크릴아미드는 N-n-부틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드 및 N-n-프로필아크릴아미드를 포함한다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-메타크릴산-코-N,N'-메틸렌비스아크릴아미드)를 실시예에서 사용하여 이들 결합제의 용도를 설명한다.
중합체 결합제는 또한 분자당 2개 이상의 부가-중합가능한 그룹을 같은 하나 이상의 중합된 가교결합 단량체 약 3 내지 25중량％를 포함한다. 이들 가교결합 단량체는 일반적으로 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 바람직한 가교결합 단량체는 N-알킬-치환된 아크릴아미드와의 중합에 용이하도록 아크릴아미도 또는 메타크릴아 미도 그룹을 포함한다.
유용한 가교결합 단량체의 예는 다음을 포함한다:
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드;
N,N'-메틸렌비스메타크릴아미드;
에틸렌 디메타크릴레이트;
2,2-디메틸-1,3-프로필렌 디아크릴레이트;
디비닐벤젠;
모노[2,3-비스(메타크릴로일옥시)프로필 포스페이트;
N,N'-비스(메타크릴로일)우레아;
트리알릴 시아누레이트;
알릴 아크릴레이트;
알릴 메타크릴레이트;
N-알릴메타크릴아미드;
4,4'-이소프로필리덴디페닐렌 디아크릴레이트;
1,3-부틸렌 디아크릴레이트;
1,4-사이클로헥실렌디메틸렌 디메타크릴레이트;
2,2'-옥시디에틸렌 디메타크릴레이트;
디비닐옥시메탄;
에틸렌 디아크릴레이트;
에틸리덴 디아크릴레이트;
프로필리덴 디메타크릴레이트;
1,6-디아크릴아미도헥산;
1,6-헥사메틸렌 디아크릴레이트;
1,6-헥사메틸렌 디메타크릴레이트;
페닐에틸렌 디메타크릴레이트;
테트라메틸렌 디메타크릴레이트;
2,2,2-트리클로로에틸리덴 디메타크릴레이트;
에틸렌비스(옥시에틸렌) 디아크릴레이트;
에틸렌비스(옥시에틸렌) 디메타크릴레이트;
에틸리딘 트리메타크릴레이트;
프로필리딘 트리아크릴레이트;
비닐 알릴옥시아세테이트;
1-비닐옥시-2-알릴옥시에탄;
2-크로토노일옥시에틸 메타크릴레이트;
디알릴 프탈레이트 및
2-(5-페닐-2,4-펜타디에노일옥시)에틸 메타크릴레이트.
이들 중합체성 결합제는 또한 0 내지 60중량％의 중합된 친수성 단량체를 포함할 수 있다. 5 내지 35중량％의 양이 또한 유용한다. 친수성 단량체는 캐나다 특허 제1,240,445호에 기술되어 있다. 특히, 이러한 단량체는 하이드록시, 피롤리돈, 아민, 아미드, 카복시, 설포, 카복실레이트 염, 설포네이트 염 및 설페이트 염 그룹중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 갖는다. 일반적으로 염 그룹의 짝 이온은 알칼리 금속 또는 암모늄이다. 유용한 친수성 단량체는 아크릴산 및 메타크릴산 및 이들의 염, 나트륨 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설포네이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필 아크릴레이트, 2-하이드록시프로필 메타크릴레이트 및 글리세릴 메타크릴레이트이다.
또한, 인용된 결합제는 압출 호퍼 피복(extrusion hopper coating)동안에 전단 감점성(shear thinning)으로 달성된 매우 낮은 결합제 점도로 인하여 수용체 층의 균일한 피복을 가능케 한다. 인용된 결합제를 사용함으로써, 균일한 피복이 형성되는 즉시, 결합제의 점도가 실질적으로 증가하여 결합제의 습윤 수송 및 건조 동안 안정하고 균일하게 존재하는 "고정 층(set layer)"을 형성한다는 추가의 이점이 달성된다.
수용체는 또한 폴리(비닐 알콜); 소 혈청 알부민; 아카시아 검; 분자량이 8000 내지 400,000인 N-비닐피롤리돈의 단독중합체 및; 아크릴아미드, 메타크릴아미드, N-알킬-치환된 아크릴아미드, N-알킬 치환된 메타크릴아미드, 1-비닐이미다졸, 2-알킬 치환된-1-비닐이미다졸, 2-하이드록시알킬 치환된-1-비닐이미다졸, N-비닐피롤리돈, 하이드록사알킬 아크릴레이트, 하이드록시알킬 메타크릴레이트, 아크릴산 및 메타크릴산으로 이루어진 그룹중에서 선택된 2개 이상의 단량체를 갖는 수용성 비닐 부가 공중합체(여기서, 공중합체 중 알킬 및 하이드록시알킬은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖고, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필 및 헥실이다)로 이루어진 그룹중에서 선택된 중합체 결합제 중에 분산될 수 있다.
부재는 하나 이상의 추가 층, 예를 들면, 별개의 또는 조합된 시약/확산 층 및 전자 이동제와 같은 기타 필수적인 첨가제를 함유하는 젤라틴/완충액 층을 포함할 수 있다.
부재의 젤라틴/완충액 층 또는 시약 층 또는 확산 층은, 젤라틴과 같은 하나 이상의 합성 또는 천연 결합제 물질 또는 기타 천연 콜로이드, 단독중합체 또는 공중합체[예: 폴리(아크릴아미드), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(아크릴아미드-코-N-비닐-2-피롤리돈) 및 유사한 공중합체] 중에 분산된 하나 이상의 시약을 포함하는 지시제 조성물을 함유할 수 있다. 지시제 조성물은 또한 수용체 층 내에 분산될 수 있다.
기타 임의의 층, 예를 들어, 하부 층, 조사-차단 층 등이 경우에 따라 포함될 수 있다. 부재의 모든 층은 서로 유체 접촉되어 있으며, 이는 유체와 유체 중의 시약 및 복합체를 형성하지 않은 반응 생성물이 인접한 층들의 겹쳐진 영역 사이를 통과할 수 있음을 의미한다.
부재의 층들은 계면활성제, 증점제, 완충액, 경화제, 산화방지제, 커플링 용매 및 당해 분야에 공지된 기타 물질을 포함하는 각종의 기타 바람직하지만 임의적인 성분을 함유할 수 있다. 이들 성분들의 양은 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
부재들은 생체액(예: 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 정액, 사람 또는 동물 조직 현탁액, 배설액, 타액, 림프액 등)과 같은 액체중 저 농도의 면역학적으로 반응성인 리간드를 측정하는데 사용될 수 있다. 리간드는 약 10-15몰농도의 낮은 농도에서 측정될 수 있으며, 가장 일반적으로는 약 10-11 내지 약 10-4몰농도에서 측정될 수 있다.
적량적으로 또는 정성적으로 측정될 수 있는 리간드는 치료학적 약물(예: 페노바르비탈, 디곡신, 디기톡신, 테오필린, 겐타마이신, 퀴니딘, 페니토인, 프로판올롤, 카바마제핀, 토브라마이신, 리도카인, 프로카인아미드 등), 천연 또는 합성 스테로이드(예: 코르티솔, 알도스테론, 테스토스테론, 프로게스테론, 에스트리올 등), 호르몬(예: 갑상선 호르몬, 펩타이드 호르몬, 인슐린 등), 단백질(예: 알부민, IgG, IgM, 페리틴, 혈액 응괴 인자, C-반응성 단백질, 동위 효소, hCG, 아포리포단백질 등), 항원, 항체(예: 모노클로날 항체) 및, 수용체와 천연적으로 반응하는 기타 종류를 포함한다. 본 발명은 디곡신, 페니토인, 카바마제핀, 테오필린 또는 페노바르비탈과 같은 치료학적 약물, 타이록신 또는 트리요도타이로닌과 같은 호르몬 및 hCG 및 C-반응성 단백질과 같은 분석물을 측정하는데 특히 유용하다. 검정은 리간드에 결합하여 표지된 리간드를 형성할 수 있는 효소 표지물을 사용하여 수행할 수 있다. 글루코스 옥시다제, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 같은 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 갈락토시다제와 갖은 효소가 바람직한 표지물이다.
임상 화학에서의 당해 분야 숙련가들은 주어진 표지에 대한 적합한 기질을 결정할 수 있다. 기질은 효소 표지물이 직접 작용하는 물질 또는 표지물의 효소적 반응을 포함하는 일련의 반응중에 포함된 물질일 수 있다. 예를 들어, 효소 표지물이 퍼옥시다제인 경우, 기질은 과산화수소와 적절한 환원제이다. 예를 들면, 글루코스 옥시다제를 사용하는 경우, 기질 글루코스는 약 0.01몰/m2, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 0.1몰/m2이 되도록 기질 용액으로서 가하거나 시약 층 내에 존재한다. 당해 분야의 숙련가들은 검정중에 사용된 효소 표지물의 양에 대한 특이적 기질의 양을 조절하는 방법을 숙지하고 있다.
시약 층은 표지물에 의해 촉매된 반응의 결과로써 검출가능한 화합물 종을 제공하는 하나 이상의 시약을 포함하는 지시제 조성물을 포함할 수 있다. 검출가능한 화합물 종은 발색성, 방사성, 형광성이거나 화학발광성일 수 있다. 본 목적을 위해 본 발명은 효소 표지된 리간드 유사체와 기질의 효소 반응의 결과로서, 비색 검출가능한 화합물 종을 제공하는 비색 지시제 조성물을 사용하여 나타낸다.
지시제 조성물은 효소 반응시 검출가능한 염료를 생성하는 단일 화합물이거나 염료를 생성하는 시약의 배합물일 수 있다. 예를 들어, 글루코스가 기질로 사용되고 글루코스 옥시다제가 효소 표지물로서 사용되는 경우, 비색 지시제 조성물은, 반응하여 염료를 제공하는 커플링 화합물 및 산화가능한 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 이 조성물은 류코 염료, 및 글루코스 옥시다제가 글루코스를 글루콘 산으로 전환시키는 경우 생성된 과산화수소 형성의 결과로써 검출가능한 염료를 생성하는 퍼옥시다제 또는 기타 과산화성 화합물을 포함할 수 있다. 유용한 류코 염료는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제4,089,747호(1978년 5월 16일 브루스키(Bruschi)에게 허여) 및 미국 특허 제4,670,385호(1987년 6월 2일 밥(Babb) 등에게 허여)에 기술되어 있다. 특정량의 비색 지시제 조성물 및 이의 다양한 성분들은 당해 분야의 숙련가 범위내에 있다.
표지된 리간드는 공지된 출발 물질 및 공정을 사용하여 제조하거나 구입할 수 있다. 일반적으로, 리간드는 공유 결합을 통해 표지(예: 효소 잔기)에 결합된다.
면역검정은 수조작 또는 자동화일 수 있다. 일반적으로, 액체중의 리간드의 양은 공급 롤, 칩 파켓(chip packet) 또는 기타 공급원으로부터 부재를 취하고, 예를 들면, 1 내지 200μ L의 액체중의 샘플과 확산 층의 한정 영역을 물리적으로 접촉시켜 측정한다. 접촉된 한정 영역은 일반적으로 약 150mm2 이하이다.
리간드의 양은, 복합체를 형성한 리간드 유사체를 직접 검출하거나 효소 표지물과 기질과의 효소 반응의 결과로써 형성된 검출가능한 화합물 종을 검출하기에 적합한 장치를 통해 부재를 통과시킴에 의해 측정한다. 예를 들어, 이러한 화합물 종은 일반적으로 공지된 공정을 사용하는 적합한 분광광도계 장치를 사용하여 검출할 수 있다. 효소 반응에 있어서, 수득된 생성물은 예를 들면, 시험 샘플과 접촉된 한정 영역에서의 투과 밀도 또는 반사 변화율을 측정함으로써 측정한다. 측정된 영역은 일반적으로 약 3 내지 약 5mm의 직경을 갖는다. 액체 샘플중 리간드의 양은, 경쟁적 검정의 경우, 한정 영역내에서 측정된 표지물의 양에 반비례하고, 샌드위치 검정의 경우 직접 비례한다. 일반적으로, 표지 측정은 기질 용액을 적용한 후 수행한다.
1. 디아릴 텔루라이드의 합성
DAT를 제조하는데는 많은 합성 경로가 존재한다. 특정 화합물에 사용된 경로는 방향족 환 상의 치환체에 크게 의존한다. 몇몇의 공지된 경로가 하기 실시예에 나열되어 있다. 기타 DAT의 합성에 대한 이들 및 기타 문헌의 부연은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
제조 1. 4,4'-디(2-하이드록시에톡시)-1,1'-텔루로비스벤젠(Tel)
(a) [2-(4-브로모페녹시)에톡시](1,1-디메틸에틸)디메틸실란(1a)의 제조
150mL의 무수 디메틸포름아미드 중 [2-(4-브로모페녹시)에탄올(10.0g, 46mmol)의 용액(30mL)에 3급 부틸디메틸실릴 클로라이드(8.34g, 55mmol) 및 이미다졸(7.82g, 115mmol)을 가한다. 추가의 디메틸포름아미드(20mL)를 사용하여 반응 플라스크내로 이들 물질을 세척한다. 수득된 용액을 뉴만 튜브(Newman tube)를 사용하여 실온에서 밤새 교반한다. 이를 물(200mL)에 붓고 에테르(3 X 75mL)로 추출한다. 합한 추출물을 0.5N HCl(200mL), 포화 NaHCO3(200mL), 물(4 X 150mL) 및 포화 NaCl(200mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조 및 여과시킨다. 용매를 회전 증발기에서 감압하에 제거하여 조 생성물(16.5g; >100％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.34(2H, d, J=8.9), 6.78(2H, d, J=8.9), 4.00-3.93 (4H, m), 0.89 (9H, s), 0.08(6H, s). 13C NMR (CDCl3) d 158.1, 132.2, 116.4, 112.8, 69.6, 61.9, 25.9, 18.4. FDMS (m/e) 330 (M+, 79Br). 이것을 정제하지 않고 100％로 사용한다.
(b) 4,4'-디(2-하이드록시에톡시)-1,1'-텔루로비스벤젠(Tel)의 제조
500mL 용량의 3구 플라스크를 아르곤하에 두고, 응축기 및 부가 깔대기를 장착한다. 마그네슘 터닝(0.89g, 37mmol)을 가한다. 브로마이드(1a)(12.3g, 37mmol, 100％로 사용)를 무수 테트라하이드로푸란(THF)에 용해시키고 부가 깔대기로 이동시킨다. 그리나드 반응을 대략 10mL의 브로마이드 용액, 1,2-디브로모에탄 및 요오드을 사용하여 개시한다. 남은 브로마이드 용액을 가하고, 반응물을 밤새 환류시키며, 그 후 Mg가 더 이상 잔류하지 않는다. 가열 멘틀을 30분 동안 제거한 후, 텔루륨 과립(4.74g, 37mmol)을 가하고, 반응물을 다시 7시간 동안 환류가열시키면 거의 모든 Te가 소모된다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 빠르게 교반 중인 10％ 수성 NH4Cl(300mL)에 붓고 15분 동안 교반한다. 침전된 Te를 셀라이트 규조토를 통해 여과시켜 제거하고 여과 케이크를 에테르로 세척한다. 여액을 분별 깔대기로 옮기고 에테르(200mL, 100mL, 100mL)로 3회 추출한다. 합한 추출물을 물 및 포화 NaCl로 세척하고, MgSO4 상에서 건조 및 여과시킨다. 용매를 감압하에 제거하여 적색 오일로서의 조 생성물(12.4g)을 수득한다. 이를 톨루엔(50mL) 중에 구리 분말(2.5g)과 함께 용해시키고 뉴만 튜브로 2.5시간 동안 환류가열시키면 이때 색상이 적색에서 회색으로 바뀐다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 셀라이트 규조토를 통해 여과시키고, 에테르로 세척 및 농축시켜 호박색 오일(12.4g)을 수득한다. 1H NMR 결과, 이것은 바람직한 생성물, 칭된 그리나드 및 잔류 톨루엔의 혼합물이다. 이것을 불화칼륨(5.0g, 86mmol)과 함께 메탄올(50mL) 및 (50mL) 및 THF(20mL)에 용해시키고 24시간 환류시킨다. 다량의 메탄올을 감압하게 제거하고 에테르-에틸 아세테이트 및 물 사이에 분배한다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 2회 이상 추출하고, 합한 추출물을 물 및 포화 NaCl로 세척하고, NaSO4 상에서 건조 및 여과한다. 용매를 감압하에 제거하여 갈색 고체로서의 조 생성물(8g)을 수득한다. 에테르 연마로 백색 고체를 수득하고, 여과에 의해 분리한 후, 에테르로 세척 및 공기 건조시켜 조 생성물(1.74g)을 수득한다. 이것은 디클로로메탄을 사용하여 섬광 실리카 겔(20mL)에 흡착시킨다. 디클로로메탄에 이어서 95:5의 디클로롤메탄:메탄올로 용출시키면서 200mL의 섬광 실리카 겔 상에서 조심스럽게 섬광 크로마토그래피하고(생성물은 소량의 상응하는 바아릴 화합물 바로 직전에 용출된다), 에테르 연마 및 여과로 순수한 백색 고체(1.2g)를 수득한다. 조 생성물의 연마로부터의 에테르 여액을 상기한 바와 같이 크로마토그래피한다. 에테르 연마 및 에탄올로부터 재결정화로 추가의 순수한 Te1(0.2g)을 수득한다. 총 수율: 1.4g, 19％, 1H NMR (DMSO-d6) d 7.52(4H, d, J=8.5), 6.80(4H, d, J=8.5), 4.82 (2H, t, J=5.5), 3.91 (4H, t, J=5.0), 3.65 (4H, app q, J=5.1). 13C NMR (DMSO-d6) d 159.2, 139.8, 116.5, 104.5, 69.9, 59.9. FDMS (m/e) 404 (M+, 130Te).
제조 2. N,N-디메틸-2-(페닐텔루로)벤젠메탄아민, 하이드로클로라이드 염(Te2)
(a) N,N-디메틸-2-(페닐텔루로)벤젠메탄아민(2a)의 제조
환저 플라스크내 무수 에테르(50mL) 중 N,N-디메틸벤젠메탄아민(2.70g, 0.020mol)의 용액에 아르곤하 실온에서 n-BuLi(2.5M, 10mL, 0.025mmol)을 주사기로 적가한다. 반응 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반한 후, 무수 테트라하이드로푸란(0.5M) 중 페닐텔루레닐 브로마이드의 용액을 주사기로 적가한다. 38mL(0.019mol)을 첨가한 후, 반응 혼합물이 페닐텔루레닐 브로마이드의 특징적인 오렌지 색으로 되면 첨가를 중지한다. 반응 혼합물을 에테르(100mL)에 붓고, 수득된 용액을 포화 NaCl(1 X 100mL, 2 X 50mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조 및 농축시킨다. 잔사를 아세톤(100mL) 중에 용해시키고 요오드(5.08g, 0.020mol)를 가한다. 수득된 용액을 냉각시켜 생성물을 침전시킨다. 황색 결정을 여과로 수집하고 냉각 아세톤으로 세척 및 건조시켜 2a의 요도드 부가물(5.95g, 50％, mp 178-179℃)을 수득한다. 요오드 부가물(5.93g, 0.010mol)을 디메틸포름아미드(100mL) 중에 용해시킨다. 수(100mL) 중 아황산나트륨(5.2g, 0.05mmol)을 서서히 가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고 이 동안 반응 혼합물은 무색이 된다. 반응 혼합물을 물(500mL)에 붓고, 에테르(2 X 50mL)로 세척한다. 수성 층을 10％ NaOH로 염기성화하고 아민을 에테르(3 X 100mL)로 추출한다. 합한 추출물을 포화 NaCl로 세척, MgSO4 상에서 건조 및 농축시킨다. 잔사를 메탄올로부터 재결정화하여 백색 고체(융점 51 내지 54℃)로서의 순수한 생성물(3.14g, 93％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.88(2H, d, J=6.9), 7.35(1H, t, J=7.3), 7.26(2H, t, J=7.3), 7.17 (1H, d, J=7.7), 7.10-7.04(2H, m), 6.94-6.89(1H, m), 3.53(2H, s), 2.25(6H, s).
(b) N,N-디메틸-2-(페닐텔루로)벤젠메탄아민, 하이드로클로라이드 염(Te2)의 제조
수욕내 에테르(50mL) 중 2-(N,N-디메틸아미노메틸)-1-페닐텔루로벤젠(1.02g, 3.0mmol)의 슬러리에 염화수소/에테르 용액(3.15mL, 1.0M, 3.15mmol)을 주사기로 적가한다. 점성 슬러리를 이소프로판올(20mL)로 희석한 후 여과한다. 백색 고체를 에테르로 세척 및 공기 건조시켜 생성물(1.13g, 95％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 2.6(1H, br s), 8.13(1H, d, J=7.5), 7.80(1H, d, J=7.7), 7.52-7.48(3H, m), 7.26-7.17(4H, m), 4.44(2H, d, J=5.8), 2.68(6H, d, J=4.5).
C15H18ClNTe에 대한 원소 분석:
계산치 : C, 48.00; H, 4.83; N, 3.73
실측치 : C, 47.97; H, 4.87; N, 3.65
제조 3. N,N,N',N'-테트라(2-하이드록시에틸)-4,4'-텔루로비스벤젠아민(Te3)
(a) N,N-비스[2-[[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]옥시]에틸]벤젠아민(3a)의 제조
(1a)에 대해 사용된 것과 동일한 공정을 하기 물질을 사용하여 수행한다: 2,2'-(페닐이미노)디에탄올(9.0g, 50mmol), 3급 부틸디메틸실릴 클로라이드(18.1g, 0.12mol), 이미다졸(17.0g, 0.25mol) 및 디메틸포름아미드(50mL). 이 반응물을 편의상 밤새 교반한다. (1a)에서와 같이 후처리하여 투명한 오일로서(3a)(21.6g, >100％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.21(2H, d, J=8.4), 6.68(3H, 중복된 d, t), 3.77 (4H, d, J=6.6), 3.52(4H, d, J=6.6), 0.92(18H, s), 0.06(12H, s). 13C NMR (CDCl3) d 147.8, 129.2, 115.7, 111.4, 60.3, 53.5, 25.9, 18.3, -5.3. FDMS(m/e). 이것을 정제하지 않고 100％로 사용한다.
(b) N,N,N',N'-테트라[2-[[(1,1,-디메틸에틸)디메틸실릴]옥시]에틸-4,4'-텔룰로비스벤젠아민(3b)의 제조
오븐 건조되고 아르곤하에 둔 500mL 용량의 3구 플라스크에 염화텔루륨(IV)(5.93g, 22mmol)을 가한다. 무수 에테르(100mL)를 주사기로 가하여 담황색 슬러리를 수득하고 이 플라스크를 수욕 중에 둔다. 무수 에테르(50mL) 중 (3a)(18g, 44mmol)의 용액을 아르곤하에 제조하고, 이 용액을 격렬히 교반하면서 캐뉼라를 사용하여 반응 혼합물로 옮긴다. 초기에 매우 점성인 황색 침전물이 형성되며, 이것은 계속된 아닐린 용액의 첨가로 희석된다. 첨가 완료시, 녹황색 슬러리를 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 감압하에 증발시킨다. 수득된 황녹색 오일을 디클로로메탄(200mL)에 용해시키고, 수(200mL) 중 나트륨 메타비설파이트(8.36g, 44mmol)의 용액을 교반하면서 가한다. 수득된 2상 혼합물을 실온에서 30분 교반한 후, 셀라이트 규조토를 통해 여과시킨다. 고체 NaHCO3를 pH 9가 될 때까지 가한 후, 반응 혼합물을 분별 깔대기로 옮긴다. 디클로로메탄 층을 분리하고, 수성 층을 추가의 디클로로메탄으로 추출한다. 합한 추출물을 물/포화 NaCl(200mL/50mL)에 이어 포화 NaCl로 세척한 후, NaSO4 상에서 건조시키고 여과시키며, 용매를 감압하에 제거한다. 수득된 적색 오일(21.4g)을 톨루엔(80mL)에 용해시키고, 구리 분말(4g)을 가한다. 수득된 혼합물을 뉴만 튜브를 사용하여 밤새 환류가열시킨다. 수득된 회색 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 규조토를 통해 여과시키고, 용매를 감압하에 제거한다. 수득된 호박색 오일(18g)을 3:1 사이클로헥산 : 디클로로메탄으로 섬광 크로마토그래피하여 회수된 출발물질로부터 생성물을 분리함으로써 황색 오일로서의 순수한 (3b)를 수득한다(5.0g, 이론치의 48％). 1H NMR (CDCl3) d 7.54(4H, d, J=8.6), 6.53(4H, d, J=8.5), 3.72(4H, t, J=6.4), 3.47 (4H, t, J=6.5), 0.88(18H, s), 0.03(12H, s). 13C NMR (CDCl3) d 147.6, 139.7, 112.7, 98.2, 60.2, 53.4, 25.9, 18.3, -5.3, FDMS (m/e) 946 (M+, 130Te).
(c) N,N,N',N'-테트라(2-하이드록시에틸)-4,4'-텔루로비스벤젠아민(Te3)의 제조
실릴 에테르(3b)(2.7g, 2.86mmol), 불화칼륨(0.66g, 11.4mmol) 및 메탄올(20mL)의 이종 혼합물을 20시간 동안 환류가열시킨다. 백색 슬러리를 빙욕내에서 냉각시키고, 생성물을 여과로 분리하며, 냉각 메탄올로 세척하고 공기 건조시킨다(0.80g, 57％). 분석 샘플을 위해 소량을 메탄올로부터 재결정화한다(융점: 169-170℃). 1H NMR (DMSO-d6) d 7.54(4H, d, J=8.6), 6.53(4H, d, J=8.5), 3.45(4H, app q,J=5.7), 3.33 (4H, t, J=5.9) 13C NMR (DMSO-d6) d 148.1, 139.8, 113.1, 97.6, 58.4, 53.5. IR(KBr) 3350, 1585, 1495, 1350cm-1. FDMS (m/e) 490 (M+, 130Te).
C20H28N2O4Te에 대한 원소 분석:
계산치 : C, 49.22; H, 5.78; N, 5.74
실측치 : C, 48.78; H, 5.72; N, 5.66
제조 4. 2,2'-[텔루로비스(4,1-페닐렌옥시)]비스아세트산, 이나트륨 염(Te4)
(a) 4-(브로모페녹시)(1,1-디메틸에틸)디메틸실란(4a)의 제조
무수 디메틸포름아미드(450mL) 중 p-브로모페놀(104g, 0.6mol)의 용액에 3급 부틸디메틸실릴 클로라이드(108g, 0.72mol) 및 이미다졸(102g, 1.5mol)을 가한다. 수득된 담황색 용액을 실온에서 뉴만 튜브를 사용하여 3시간 동안 교반한다. 이것을 물(1.2L)에 붓고 에테르(900mL, 300mL, 300mL)로 3회 추출한다. 합한 추출물을 물(150mL)로 4회, 1N HCl(300mL), 포화된 NaHCO3(300mL) 및 포화 NaCl(300mL)로 1회 세척하고 MgSO₄상에서 건조시킨 후 여과한다. 용매를 감압하에 회전 증발기에 이어 진공 펌프에서 제거하여 가수분해된 출발 물질로부터 실란과의 6:1의 비로서의 조 생성물(183g, >100％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.31(2H, d, J=8.7), 6.71(2H, d, J=8.7), 0.97 (9H, s), 0.18 (6H, s). 이것을 정제하지 않고 100％로 사용한다.
(b) 4,4'-디(3급-부틸디메틸실릴옥시)-1,1'-텔루로비스벤젠(4b)의 제조
2L 들이 3구 플라스크를 아르곤하에 두고 오버헤드 교반기 및 부가 깔대기를 장착한다. 마그네슘 터닝(15.2g, 0.66mol)을 가한다. 브로마이드(4a)(17.2g, 0.6mol, 100％로 사용)를 무수 THF(600mL) 중에 용해시키고 부가 깔대기로 이동시킨다. 그리나드 반응을 대략 25mL의 브로마이드 용액 및 수개의 요오드 결정을 사용하여 개시한다. 나머지 브로마이드 용액을 반응이 계속 환류되는 속도로 가한다. 첨가가 완료된 후 반응 혼합물을 추가로 30분 동안 환류시키면, 이때 소량의 Mg가 잔류한다. 반응물을 수욕 중에서 약간 냉각시킨후 텔루륨 과립(76.8g, 0.6mol)을 가하고, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 다시 환류가열시키면, 이때 거의 모든 Te가 소모된다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후 빠르게 교반하면서 10％ 수성 NH4Cl(2L)에 붓고 30분 동안 교반한다. 침전된 Te를 셀라이트 규조토를 통해 여과시켜 제거하고 여과 케이크를 에테르로 세척한다. 여액을 분별 깔대기로 옮기고 에테르(1200mL, 300mL, 300mL)로 3회 추출한다. 합한 추출물을 물 및 포화 NaCl로 세척하고, MgSO4 상에서 건조 및 여과시키고, 후처리 동안 침전된 MgSO4 및 Te 모두를 제거한다. 용매를 감압하에 제거하여 적색 오일로서의 조 생성물(194g)을 수득한다. 이를 톨루엔(900mL) 중에 구리 분말(38g)과 함께 용해시키고, 뉴만 튜브로 2.5시간 동안 환류가열시키면 이때 색상이 적색에서 회색으로 바뀐다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 규조토를 통해 여과시키고 농축시켜 호박색 오일(181g)을 수득한다. 1H NMR 결과, 이것은 바람직한 생성물, 칭된 그리나드 및 잔류 톨루엔의 혼합물이며 0.23mol의 (4b)를 함유하는 것으로 계산된다. (4b)의 요오드 부가물을 통해 정제한다. 조 생성물을 아세톤(0.6L) 및 요오드(58g, 0.23mol)에 용해시키고 격렬히 교반하면서 나누어 가한다. 15분 후, 매우 점성의 침전물이 형성된다. 에탄올(1.2L)을 가하고, 오렌지색 고체 및 암훈색 결정성 고체를 여과에 의해 분리하여 공기 건조시킨다. 제2 생성물을 여액의 재여과로 수득한다. 합한 수득량은 206g이며, 이것은 NMR에 의해 순수하고, 단지 잔류 에탄올인 오염물만이 존재하는 것으로 나타난다. 1H NMR (CDCl3) d 7.95 (4H, d, J=8.7), 6.86 (4H, d, J=8.7), 0.98 (18H, s), 0.25 (12H, s). 13C NMR(CDCl) d 158.6, 138.4, 121.9, 25.5, 18.2, -4.3. 요도드 부가물을 디옥산(500mL), 디클로로메탄(500mL) 및 5％ 수성 NaHSO3(1.1L)에 용해시키고, 2상 시스템을 격렬히 교반한다. 1시간 후에, 하부(유기) 층은 여전히 적색이며, 이것은 불완전 환원을 나타낸다. 다량의 황색 수성 층을 경사시켜 보관하고, 유기 층을 감압하게 증발시킨다. 디옥산(200mL), 디클로로메탄(200mL) 및 5％ 수성 NaHSO3(400mL)를 잔사에 가하고 이 혼합물을 추가로 1시간 동안 교반한다. 이것을 감압하에 증발시켜 유기 용매를 부분적으로 제거하고, 잔류하는 수성 디옥산을 분별 깔대기로 옮겨 에테르로 3회 추출한다. 합한 추출물을 물 및 포화 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세척하고, NaSO4 상에서 건조 및 여과한다. 상기로부터 경사시킨 수성 층을 동일한 방법으로 후처리하고 2개를 합한다. 용매를 감압하에 제거하여 호박색 오일로서 순수한 (4b)(97.3g, 60％)를 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.54(4H, d, J=8.4), 6.80(4H, d, J=8.4), 0.96 (18H, s), 0.17(12H, s). 13C NMR (CDCl3) d 155.8, 139.6, 121.5, 105.2, 25.7, 18.2, -4.4. FDMS 5(m/e) 544 (M+, 130Te).
(c) 4,4'-텔루로비스페놀(4c)의 제조
실릴 에테르(4b)(54.2g, 0.1mol)을 500mL 들이 환저 플라스크내 메탄올(200mL) 중에 넣는다. 불화칼륨(11.6g, 0.2mol)을 가하고, 반응 혼합물을 아르곤 하에 1.5시간 동안 환류가열시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 신속하게 교반하는 물(1.2L)에 추가의 메탄올(20mL)을 사용하여 부어 용이하게 옮긴다. pH 를 10％ NaOH(약 40mL)를 사용하여 14로 조정하고, 반응 혼합물을 셀라이트 규조토를 통해 여과시킨다. 여액을 분별 깔대기로 옮기고 디클로로메탄으로 2회 세척한다. 수성 층을 빙욕 중의 2L 들이 에를렌마이어 플라스크로 옮기고, 25％ 수성 아세트 산을 pH 6이 될 때까지 가하여, 크림색 침전물을 형성시킨다. 생성물을 여과로 분리, 물로 세척 및 공기 건조시켜 조 생성물(29g)을 수득한다. 이것을 에테르를 사용하여 섬광 실리카 겔(150mL)상에 흡착시킨다. 1L의 섬광 실리카 겔 상에서 디클로로메탄에 이어서 1:4의 에틸 아세테이트 : 디클로로메탄으로 용출시키면서 진공 크로마토그래피하여 순수한 생성물을 수득한다. 디클로로메탄으로 연마시켜 2개의 생성물로서, 황색 고체인 순수한 (4c)(24g, 76％)를 수득한다. 1H NMR(CDCl3, 5방울의 DMSO) d 8.77 (2H, s), 7.29 (4H, d, J=8.4), 6.47 (4H, d, J=8.4).
(d) 4,4'-디(에톡시카보닐메톡시)-1,1'-텔루로비스벤젠(4d)의 제조
오버헤드 교반기 및 부가 깔대기가 장착된 250mL 용량의 오븐 건조된 3구 플라스크를 아르곤하에 두고, 수소화나트륨(60％, 1.76g, 44mmol)을 가한다. 이것을 사이클로헥산으로 3회 세척한 후, 무수(체) 디메틸포름아미드(60mL)를 가한다. 플라스크를 수욕에 넣고, 무수 디메틸포름아미드(15mL) 중 비스페놀(4c)(6.28g, 20mmol)의 용액을 부가 깔대기로부터 적가한다(결렬한 H2 방출). 수득되는 슬러리를 오일욕내에서 85℃로 20분(추가의 H2 방출) 동안 가열한다. 슬러리를 실온으로 냉각시키고 무수 디메틸포름아미드(5mL) 중 에틸 브로모아세테이트(6.68g, 40mmol)의 용액을 부가 깔대기로부터 적가하면, 이 동안 침전물이 선명해진다. 반응 혼합물을 45분간 교반한 후, 교반 수(320mL)에 신속하게 붓는다. 수득된 황갈색 침전물을 여과로 분리하고 물로 세척한다. 이것을 물(50mL) 및 디클로로메탄(80mL)사이에 분배한다. 수성 상을 디클로로메탄으로 2회 이상 추출하고, 합한 추출물을 물에 이어 포화 NaCl로 세척하고, NaSO4로 건조 및 여과시킨다. 용매를 감압하게 제거하고, 수득된 고체를 에탄올(50mL)로부터 재결정화하고, 급냉시키며, 여과시킨다. 생성물을 백색 고체(5.3g, 55％, 융점: 88.5-89℃)로 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.60(4H, d, J=8.5), 6.75(4H, d, J=8.5), 4.58 (4H, s), 4.25 (4H, q, J=7.1), 1.28(6H, t, J=7.1). IR(KBr) 1765, 1720, 1580, 1480 cm-1. FDMS (m/e) 488 (M+, 130Te).
C20H22O6Te에 대한 원소 분석:
계산치 : C, 49.43; H, 4.56
실측치 : C, 49.36; H, 4.55
(e) 4,4'-디(카복시메톡시)-1,1'-텔루로비스벤젠, 이나트륨 염(Te4)의 제조
디에스테르(4d)(39.2g, 81mmol)를 메탄올(400mL)에 용해시키고 10％ 수성 NaOH(47mL, 170mmol)를 가한다. 매우 점성인 슬러리가 수득된다. 이 반응 혼합물을 1시간 동안 환류가열시킨다. 수득된 슬러리를 빙욕중에 냉각시킨다. 고체를 여과에 의해 분리하고 에탄올로 세척하며, 공기 건조시키고 막자사발 및 막자로 분쇄하여 연한 크림색 고체(37.6g, 98％)로서의 (Te4)를 수득한다. 1H NMR (DMSO-d6, 5방울의 D2O) d 7.46(4H, d, J=8.4), 6.66(4H, d, J=8.5), 4.06 (4H, s).
13C NMR (D2O) d 176.6, 158.0, 139.8, 115.9, 104.8, 66.5, IR(KBr) 3340, 3430, 1595, 1490, 1415, 1230 cm-1.
C16H12Na2O6Te·1.5H2O에 대한 원소 분석:
계산치 : C, 38.37; H, 3.02
실측치 : C, 38.33; H, 3.05
제조 5. N,N,N',N'-테트라(카복시메틸)-4,4'-텔루로비스벤젠아민, 사나트륨 염(Te5)
(a) N-(2-에톡시-2-옥소에틸)-N-페닐글라이신, 에틸 에스테르(5a)의 제조
아세토니트릴(200mL) 중 아닐린(9.3g, 0.1mmol), 에틸 브로모아세테이트(36.7g, 0.22mol) 및 2,6-루티딘(23.5g, 0.22mol)을 뉴만 튜브가 장착된 플라스크에서 1일간 환류시킨다. TLC(디클로로메탄)에 의해 반응을 완료한다. 이를 실온으로 냉각시키고 에테르(200mL)로 희석시킨다. 침전된 루티딘 하이드로클로라이드를 여과로 제거하고, 여액을 감압하에 증발시킨다. 잔사를 에테르 및 물에 분배하고, 수 층을 에테르로 2회 이상 추출한다. 합한 추출물을 1N HCl, 물, 포화된 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세척하고, MgSO4 상에서 건조 및 감압하에 증발시켜 암색 액체로서 조 생성물(5a)을 수득한다. 이것을 디클로로메탄에 용해시키고 실리카 겔을 통해 여과하여 색을 제거함으로써 담색 오일로서의 생성물(23.2g, 88％)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.21 (2H, t, J=7.9), 6.77(1H, t, J=7.3), 6.61 (2H, d, J=8.4), 4.20 (4H, q, J=7.2), 4.13(4H, s), 1.26(6H, t, J=7.1).
(b) N,N,N',N'-테트라(에톡시카보닐메틸)-4,4'-텔루로비스벤젠아민(5b)의 제조
공기 건조되고 부가 깔대기가 장착되며 아르곤하에 둔 500mL들이 3구 플라스크에 염화텔루륨(IV)(11.9g, 44mmol)을 가한다. 무수 에테르(200mL)를 주사기로 가하여 연황색 슬러리를 수득하고, 플라스크를 빙욕내에 둔다. 무수 에테르(50mL) 중 (5a)의 용액(23.2g, 89mmol)을 아르곤하에 제조하고, 용액을 캐뉼라에 의해 부가 깔대기로 옮긴다. 이것을 반응 혼합물에 격렬히 교반하면서 적가한다. 점성 슬러리가 즉시 형성되면 교반 막대기 정지시킨다. 나머지 첨가를 수행하면서 이 동안에 반응 혼합물을 진탕시키면서 손으로 교반한다. 반응 혼합물을 밤새 교반하지 않고 정치시킨 후, 슬러지 모두가 고체 덩어리로 전환될 때까지 초음파 처리한다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 에테르로 세척한다. 여과 케이크를 디클로로메탄(200mL)에 용해시키고, 수(200mL) 중 메타아황산나트륨(17.0g, 89mmol) 용액을 교반하면서 가한다. 수득된 2상 혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 고체 NaHCO3를 pH 7이 될 때까지 가하고 반응 혼합물을 셀라이트 규조토를 통해 여과한다. 여액을 분별 깔대기에 옮기고, 디클로로메탄 층을 분리하고, 수성 층을 추가의 디클로로메탄으로 추출한다. 합한 추출물을 물 및 포화 NaCl로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조 및 여과하고, 용매를 감압하에 제거한다. 수득된 적색 오일(17.9g)을 톨루엔(100mL)에 용해시키고 구리 분말(9g)을 가한다. 반응 혼합물을 뉴만 튜브를 사용하여 2시간 동안 환류가열시킨다. 수득된 회색 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 규조토를 통해 여과시키며, 용매를 감압하에 제거한다. 조 생성물(18g의 호박색 오일)을 디클로로메탄에 이어 98:2의 디클로로메탄:메탄올로 2회 섬광 크로마토그래피하여 회수된 출발 물질로부터 생성물을 분리하고, 연한 오렌지색 점성 오일로서의 순수한 (5b)(7.36g, 이론치의 50％)를 수득한다. 1H NMR (CDCl3) d 7.52 (4H, d, J=8.6), 6.43(4H, d, J=8.7), 4.19 (8H, q, J=7.1), 4.08 (8H, s), 1.25(12H, t, J=7.1). 13C NMR(CDCl3) d 170.7, 147.6, 139.5, 113.6, 101.3, 61.2, 53.3, 14.2, IR(염 플레이트) 1730, 1580, 1490, 1180 cm-1. FDMS (m/e) 658 (M+, 130Te).
(c) N,N,N',N'-테트라(카복시메틸)-4,4'-텔루로비스벤젠아민, 사나트륨 염(Te5)의 제조
디에스테르(5b)(4.35g, 6.63mmol)를 메탄올(60mL)에 넣고, 10％ 수성 NaOH(7.4mL, 26.5mmol)를 가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류가열시킨다. 수득된 슬러리를 빙욕 중에서 냉각시키고 여과시킨다. 고체를 냉각 메탄올로 세척하고 공기 건조시켜 연한 크림색 고체로서의 (Te5)(3.81g, 91％)를 수득한다. 1H NMR (D2O) d 7.56(4H, d, J=8.6), 6.38(4H, d, J=8.6), 3.83 (8H, s). 13C NMR(D2O) d 179.4, 148.7, 139.6, 113.0, 98.3, 55.5. IR(KBr) 3250(br), 1575, 1405, 1210cm-1.
C20H16Na4N2O8Te· 3H2O에 대한 원소 분석:
계산치 : C, 35.02; H, 3.23; N, 4.08
실측치 : C, 34.82; H, 3.03; N, 4.04
하기 실시예는 본 발명의 예시이며, 본 발명은 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1
기술한 피복물을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포함하는 카트리지는 카트리지를 실험실내 광으로 16 내지 20시간 동안 벤치 상부에 둠으로써 제조한다. 벤치 상부에서의 항온처리 1일째에, 슬라이드를 원형(prototype) 자동화된 무수 필름 면역검정 분석기를 사용하여 시험한다. 10,000 m-IU/mL hCG를 함유하는 11μ L의 사람 혈청 매트릭스를 각각의 슬라이드에 도포한다. 다음 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분간 항온처리한 후, Na2HPO4(10mM, pH6.8), 4'-하이드록시아세트아날라이드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 디에틸렌트리아민-펜타아세트산(DTPA)(10mM)을 함유하는 세척액 12μ L를 각각의 슬라이드에 도포한다. 세척액 모두는 판독 영역으로부터 결합되지 않은 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 리간드 또는 수용체를 세척(제거)하며 HPR-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어 각각의 슬라이드를 37℃에서 제2 항온처리하고, 이때의 반사 밀도 판독을 670nm의 파장에서 3초 간격으로 수행한다. 각각의 피복물로부터의 슬라이드에 대한 색상 형성률을 반사 밀도 판독치로부터 계산한다.
혈청 샘플 중 사람 융모막 고나도트로핀(hCG)의 검정을 위해 하기 제형의 무수 필름 피복물을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다. 모든 피복물 구조에 사용된 용어는 표 1에 기술되어 있다.
피복물 1
피복물 2
피복물 3
피복물 4
피복물 5
피복물 6
피복물 1 내지 6에 대한 카트리지 슬라이드 비교
카트리지 슬라이드 비교는 VOSO4 또는 DAT 화합물이 피복물내에 혼입되지 않는 경우 카트리지내 제1 슬라이드에 높은 손실률(％)이 나타남을 명백히 나타낸다. 제1 슬라이드내 색상 형성 손실률은 시험되는 샘플에 대한 분석물 농도를 부정확하게 예측하도록 한다. VOSO4(피복물 2), DAT 화합물(피복물 3 및 4), 또는 VOSO4 및 DAT 화합물의 배합물(피복물 5 및 6)의 혼입은 상부 슬라이드에 대해 보유된 비율(％)의 현저한 개선을 가져온다.
실시예 2
연구된 DAT 화합물의 효과를 더욱 차별화하기 위하여, 각각의 피복물로부터의 슬라이드를 벤치 상부에 윗면을 위로 향하게 두고 카트리지 내에 남아있는 슬라이드와 동일한 조건에 노출시킨다(형광 광이 유지되는 실온에서 16 내지 20시간의 항온처리). 항온처리 기간 후, 슬라이드를 상술한 바와 동일한 물질 및 프로토콜을 사용하여 원형 자동화된 무수-필름 면역검정 분석기상에서 시험한다. 예상된 결과는 환경 인자(광, 공기 등)에 대한 슬라이드의 노출 증가에 따른 색상 형성률의 손실률이 더욱 크다는 것이다. 환경 노출의 증가 효과를 관측하기 위한 수단으로써, 각각의 조건(상부 슬라이드 제외)에 대해 벤치 상부 슬라이드의 색상 형성률을 카트리지 슬라이드의 색상 형성률과 비교한다. 기술한 바와 같이 처리한 슬라이드에 대한 결과는 다음과 같다:
피복물 1 내지 6에 대한 카트리지 슬라이드 비교
벤치 상부 슬라이드 시험은 피복물내에 VOSO4(피복물 2), DAT 화합물(피복물 3 및 4), 또는 VOSO4 및 DAT 화합물(피복물 5 및 6)의 배합물의 혼입이 환경 노출에 기인한 손실을 방지함을 다시 보여준다. 이 시험은 또한 VOSO4 및 Te1이 동일한 피복물(피복물 5)에 혼입되는 경우 협동 작용이 일어남을 보여준다. 이것은 하나의 화합물이 혼입되는 경우(피복물 2 및 3)보다 낮은 손실률(％)을 가져온다.
Dat, Te1-Te5를 HRP 활성의 손실률을 평가하기 위해 고안된 모델 시스템 내에서 평가한다. 이 시스템내에서 DAT, Te1, Te4 및 Te5는 단독으로 또는 다음 실시예에서 나타내는 바와 같이 바나딜 염과 함께 HRP 활성을 보호한다.
실시예 3 내지 5
하기 제형의 분석 부재들을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다:
분석 부재를 사용하여 하기 프로토콜에 따라 HRP 안정성을 측정한다. 약 3 x 10-8M HRP 및 각종 농도의 본 발명의 다아릴 텔루라이드 화합물 중 하나를 함유하는, 10mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 용액의 10㎕ 샘플을 피복된 상기 부재의 별개의 1 cm2 조각 각각에 스포팅한다(각각의 화합물 및 농도에 대해 4개의 샘플). 이들 부재를 건조시키고 암 서랍에 둔다. 30분 후, 및 다시 24시간 후(즉, 다음 날), 부재들을 서랍에서 제거하고, 시험 튜브내 10mM 인산나트륨 완충액, 0.15M 염화나트륨, 0.1％ 소 혈청 알부민의 용액(pH 7.0) 1mL중에 각각의 부재를 침지시켜 HRP를 추출한다. 시험 튜브를 1분 동안 볼텍싱한 후(이로써 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체로부터 분석 부재 성분이 제거된다), 수득된 현탄액을 원심분리하고 용액을 제거한다. 이 용액 중 활성 HRP의 양을, 분광광도계 큐베트 및 시약 용액에 100μ L 분취량을 가하여, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0), 5mM 4'-하이드록시아세트아닐리드, 0.625％ 트리톤 X-100 계면활성제, 0.005％ 4,5-비스(4-디메틸아미노페닐)-2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)이미다졸 류코 염료 및 0.85mM 과산화수소의 최종 용액 1mL를 제공함으로써 측정한다. 검정 온도는 30℃이다. 청색이 형성되면 이의 비율을 655nm에서 분광광도계로 측정한다. 색상 형성률은 추출물중 활성 효소의 양에 직접 비례한다.
이 데이터는 각각의 샘플에 대해 30분째에 추출한 활성으로 24시간째에 추출한 활성을 나눔으로써 계산한 활성 비율로 나타낸다. 비율 1은 24시간에 걸쳐 효소가 첨가제에 의해 완전히 보호됨을 의미한다. 수행 데이터의 편차를 측정하며, 이는 아마도 시험일의 주위 습도 및 온도의 차이에 기인한다. 이는 피복물 상에서 HRP가 건조되는 속도에 영향을 미치므로 효소의 명백한 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 데이터를 임의의 2개의 실시예에서가 아닌, 실시예 3 내지 5내에서 비교할 수 있다.
실시예 3
1mM 농도의 Te1, Te2, Te3 및 Te4 화합물의 효능을 단독으로 또는 1mM VOSO4의 존재하에 비교한다(도 1). 화합물 Te1 및 Te4는 첨가되지 않은 것과 비교시 무수 포맷 모델내에서 HRP 활성을 보호한다. Te2 및 Te3는 이러한 포맷에서 효과적인 안정화제가 아니다. VOSO4 및 Te1 또는 Te4 둘 다를 포함시킬 경우, 하나만 존재하는 경우보다 더 높은 HRP 활성이 유지된다.
실시예 4
HRP를 안정화시키는 Te1 및 Te4의 능력에 대한 농도의 효과를 나타낸다(도2). 하기 농도를 HRP 용액에 사용한다: 1, 0.1 또는 0.01mM Te1, 및 10, 1 또는 0.1mM Te4. 또한, 완충액 만을 함유하거나 1mM VOSO4를 함유하는 HRP 용액을 스포팅한다. 활성 손실은 Te1 및 Te4 모두의 경우 시약 농도 의존성이다. 10mM Te4의 존재하에서, HRP 활성은 24시간의 항온처리 동안 완전히 보호된다.
실시예 5
실시예 5는 항-CRP-HRP 효소 결합체(2.85 x 10-8M)의 안정성에 대한 Te4 및 Te5의 효과를 나타낸다. 스포팅 용액 중에는 완충액 단독, 1, 2, 4 또는 8mM의 Te4, 또는 1 또는 8mM의 Te5가 존재한다. Te4 및 Te5 모두는 결합된 HRP의 활성을 보호하며, 이 보호는 농도에 의존적이다(표 3).
실시예 6
피복물 7 내지 10을 하기 피복물 구조 7 내지 10에서 나타낸 바와 같이 제조하고, 슬라이드로서 적재하고, 2일 동안 70℉/33％ RH에서 시효처리한다.
피복물 7
하기 제형의 혈청 샘플중 C-반응성 단백질(CRP)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다:
피복물 8
하기 제형의 혈청 샘플중 C-반응성 단백질(CRP)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다:
피복물 9
하기 제형의 혈청 샘플중 C-반응성 단백질(CRP)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다:
피복물 10
하기 제형의 혈청 샘플중 C-반응성 단백질(CRP)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 지지체 상에서 제조한다:
카트리지를 해동시키고 E250 분석기상에 로딩한다.
약 20mg/L CRP를 함유하는 사람 혈청 샘플 11μ L를 각각의 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분간 항온처리한 후 Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H202(8mM) 및 DTPA(10μ M)를 함유하는 세척액 12μ L를 각각의 슬라이드에 적용시켜 판독 영역으로부터 결합되지 않은 항체-HRP 접합체를 세척(제거)하고 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시한다. 37℃에서 항온처리한지 2.5분 후, 670nm에서의 반사 밀도를 측정하고 이를 보정 곡선을 통해 CRP 농도로 전환시킨다.
상부 슬라이드의 예측된 농도를 다음 6개의 슬라이드의 예측된 평균 농도와 비교한다. 이러한 유형의 7개 실험 결과를 다음에 나타낸다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예견치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예측치
이들 결과는 임의의 보호제의 부재하에서, 상부 슬라이드는 이후의 슬라이드보다 실질적으로 적은 예측치를 가짐을 보여준다. Te1, Te2 또는 VOSO4의 첨가는 상부 슬라이드 및 이후의 슬라이드간의 바이어스를 감소시킨다.
최대 향상치는 Te1에 의해 제공된다.
실시예 7
피복물 7 내지 10을 슬릿화하여 슬라이드 위에 적재하고, 70℉/33％ RH에서 2일 동안 시효처리하고 동결시킨다.
카트리지를 해동시킨다. 각각의 카트리지의 상부 슬라이드를 꺼내고, 이 카트리지를 70℉/33％ RH에서 3일 동안 항온처리한다.
이 슬라이드를 실시예 6에서 기술한 바와 같이 약 20mg/L CRP를 함유하는 사람 혈청을 사용하여 시험한다.
70℉/33％ RH에서 3일 동안 노출된 상부 슬라이드의 예측치를 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예견치와 비교하고 이 결과를 하기에 나타낸다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예측치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 예측치 평균
이들 결과는 임의의 보호제의 부재하에서,새로이 노출된 상부 슬라이드가 3일에 걸쳐 변화하여 그 결과 이후의 슬라이드보다 실질적으로 낮은 예측치를 초래함을 나타낸다. 디아릴 텔루라이드 Te1, Te2 또는 VOSO4는 슬라이드를 보호하며, 카트리지내 이후의 슬라이드와 비교하여 더욱 적은 바이어스를 초래하며, 또한 Te1은 최대의 향상치를 보여준다.
실시예 8
피복물 7 내지 10을 슬릿화하여 슬라이드 위에 적재하고, 70℉/33％ RH에서 2일 동안 시효처리하고 동결시킨다.
카트리지를 해동시키고, 70℉/33％ RH에서 7일 동안 항온처리한다.
항온처리된 카트리지 및 새로이 해동시킨 카트리지를 10 내지 30mg/L의 범위에서 CRP를 함유하는 3개의 사람 혈청 샘플을 사용하여 실시예 6에 기술된 바와 같이 분석한다. 항온처리된 슬라이드의 예측치를 새로이 해동된 슬라이드의 예측치와 비교한다. 3개의 액체에 대한, 항온처리된 슬라이드 대 새로이 해동시킨 슬라이드의 평균 바이어스를 측정하고 이 결과를 하기에 나타낸다:
이들 결과는 보호제의 부재하에서, 70℉/33％ RH에 7일간 노출시킨 슬라이드가 새로이 해동된 슬라이드에 보다 바이어스를 더욱 생성시킴을 보여준다. Te1 또는 Te2 또는 VOSO4의 존재하에서 노출로부터 생성된 바이어스는 실질적으로 감소된다.
하기 실시예는 DAT를 그라비어 층 내에 피복시킨 경우를 DAT를 사용하지 않거나 상이한 층에 피복시킨 경우와 비교시 예상치 않게 더욱 우수하다는 결과를 입증한다.
실시예 9
Te5를 다음 방식으로 CRBM 검정에서 평가한다.
Te5를 포함하지 않는 피복물 1
하기 제형의 혈청 샘플 중 카바마제핀(CRBM)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖도록 제조한다:
실시예 10
피복물 2
1mM의 최종 재습윤 수준에서 확산 층 내 피복된 Te5를 함유하는 카바마제핀(CRBM)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖도록 제조한다:
실시예 11
피복물 3, 1mM Te5(그라비어 층)
1mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내 피복된 Te5를 함유하는 카바마제핀(CRBM)의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖도록 제조한다:
실시예 12
비교 실시예 1
피복물 1 내지 3을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포함하 는 카트리지를 피복후 2주만에 반응률에 대해 시험한 후, -18℃에서 1년간 냉동기에 저장한다. 냉동기 저장 1년 후, 카트리지를 반응률 및 제1 슬라이드 바이어스에 대해 시험한다. 슬라이드를 비트로스 E250 분석기(VITROS E250 ANALYZER) 상에서 시험한다. 8.8㎍/mL CRBM을 함유하는 11㎕의 사람 혈청 매트릭스 용액을 3개 카트리지로부터의 제1 슬라이드(상부 슬라이드) 및, 또한 동일한 카트리지로부터의 제2 내지 제7 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후 Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 DPTA(10μ M)을 함유하는 세척액 12㎕를 각각의 슬라이드에 적용시킨다. 세척액은 결합되지 않은 약물-서양고추냉이 퍼옥시다제 표지를 세척(제거)하며 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어, 각각의 슬라이드를 37℃에서 재항온처리하며 이 동안 반사 밀도를 670nm의 파장에서 2.5분 동안 3초의 간격으로 판독한다. 반사 측정치를 클리퍼-윌리암 전환(Clapper-William transform)을 사용하여 투과율, Dt로 전환시키고, 색상 형성률을 계산한다. 이 결과는 다음과 같다.
피복물 비교는 Te5가 피복물로부터 부재하거나 1mM의 재습윤 수준에서 비드 확산 층 내에 위치하는 경우, 카트리지내 제1 슬라이드에서 손실률(％)이 크다는 것을 명확히 보여준다. 제1 슬라이드내 색상 형성률의 손실은 시험된 샘플에 대한 분석물 농도의 부정확한 예측을 초래한다. 1mM의 재습윤 수준에서 그라비어 층 내에 Te5를 포함시키는 경우, 냉동기 저장 1년 후에 상부 슬라이드에 대해 현저히 향상된 색상 형설률(％)이 유지된다.
실시예 13
Te5를 다음과 같은 페노바르비탈 무수 필름 부재의 그라비어 층 내에서 평가한다.
Te5를 포함하지 않는 피복물 4
PHBR 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖도록 제조한다.
실시예 14
피복물 5(그라비어 층 내 0.25mM Te5)
0.25mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내 피복된 Te5를 함유하는 PHBR의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖도록 제조한다:
실시예 15
피복물 6(그라비어 층 내 0.5mM Te5)
0.5mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내 피복된 Te5를 함유하는 PHBR의 검정을 위한 무수 필름 피복물을 하기 나타낸 조성물 층 구조를 갖도록 제조한다:
실시예 16
비교 실시예 2
제4 내지 제6 피복물을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포함하는 카트리지를 -18℃에서 냉동기에 저장한다. 6개월 및 9개월 동안 동결시킨 후, 카트리지를 반응률 및 제1 슬라이드 바이어스에 대해 시험한다. 슬라이드를 비트로스 E250 분석기 상에서 시험한다. 약 27㎍/mL 페노바르비탈을 함유하는 11㎕의 사람 혈청 매트릭스 용액을 3개 카트리지로부터의 제1 슬라이드(상부 슬라이드) 및, 또한 동일한 카트리지로부터의 제2 내지 제7 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후 Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 DPTA(10μ M)을 함유하는 세척액 12㎕를 각각의 슬라이드에 도포한다. 세척액은 결합하지 않은 약물-서양고추냉이 퍼옥시다제 표지를 세척(제거)하며 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어, 각각의 슬라이드를 37℃에서 재항온처리하며 이 동안 반사 밀도를 670nm의 파장에서 2.5분 동안 3초의 간격으로 판독한다. 반사 측정치를 클리퍼-윌리암 전환을 사용하여 투과율, Dt로 전환시키고, 색상 형성률을 계산한다. 이것을 보정 곡선을 통해 페노바르비탈의 농도로 전환시킨다.
이 결과는 다음과 같다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예측치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예측치
실시예 17
Te5를 다음과 같은 페니토인 무수 필름 부재의 그라비어 층 내에서 평가한다
Te5를 포함하지 않는 피복물 7
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는 PHYT 검정용 박막 피복물을 제조한다:
실시예 18
피복물 8(그라비어 층 내 0.25mM Te5)
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.25mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내에 피복된 Te5를 함유하는 PHYT 검정용 박막 피복물을 제조한다:
실시예 19
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.5mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내에 피복된 Te5를 함유하는 PHYT 검정용 박막 피복물을 제조한다:
실시예 20
비교 실시예 3
제7 내지 제9 피복물을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포 함하는 카트리지를 -18℃에서 냉동기에 저장한다. 6개월 및 9개월 동안 동결시킨 후, 카트리지를 반응률 및 제1 슬라이드 바이어스에 대해 시험한다. 슬라이드를 비트로스 E250 분석기 상에서 시험한다. 약 12.5㎍/mL 페니토인을 함유하는 11㎕의 사람 혈청 매트릭스 용액을 3개 카트리지로부터의 제1 슬라이드(상부 슬라이드) 및, 또한 동일한 카트리지로부터의 제2 내지 제7 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 DPTA(10μM)을 함유하는 세척액 12㎕를 각각의 슬라이드에 도포한다. 세척액은 결합하지 않은 약물-서양고추냉이 퍼옥시다제 표지를 세척(제거)하며 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어, 각각의 슬라이드를 37℃에서 재항온처리하며 이 동안 반사 밀도를 670nm의 파장에서 2.5분 동안 3초의 간격으로 판독한다.
반사 측정치를 클래퍼-윌리암 전환을 사용하여 투과율, Dt로 전환시키고, 색상 형성률을 계산한다. 이것을 보정 곡선을 통해 페니토인의 농도로 전환시킨다.
이 결과는 다음과 같다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예측치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예측치
실시예 21
Te5를 하기와 같이 디곡신의 그라비어 층 내에서 평가한다.
Te5를 포함하지 않는 피복물 10
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, DGXN 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 22
피복물 11(그라비어 층 내 0.25mM Te5)
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.25mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내 피복된 Te5를 포함하는 DGXN 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 23
피복물 12(그라비어 층 내 0.5mM Te5)
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.5mM의 최종 재습윤 수준에서 그라비어 층 내 피복된 Te5를 포함하는 DGXN 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 24
비교 실시예 4
제10 내지 제12 피복물을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포함하는 카트리지를 -18℃에서 냉동기에 저장한다. 6개월 및 9개월 동안 동결시킨 후, 카트리지를 반응률 및 제1 슬라이드 바이어스에 대해 시험한다. 슬라이드를 비트로스 E250 분석기 상에서 시험한다. 약 2.0㎍/mL 디곡신을 함유하는 11㎕의 사람 혈청 매트릭스 용액을 3개 카트리지로부터의 제1 슬라이드(상부 슬라이드) 및, 또한 동일한 카트리지로부터의 제2 내지 제7 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 DPTA(10μM)을 함유하는 세척액 12㎕를 각각의 슬라이드에 도포한다. 세척액은 결합하지 않은 약물-서양고추냉이 퍼옥시다제 표지를 세척(제거)하며 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어, 각각의 슬라이드를 37℃에서 재항온처리하며 이 동안 반사 밀도를 670nm의 파장에서 2.5분 동안 3초의 간격으로 판독한다. 반사 측정치를 클래퍼-윌리암 전환을 사용하여 투과율, Dt로 전환시키고, 색상 형성률을 계산한다. 이것을 보정 곡선을 통해 디곡신의 농도로 전환시킨다. 이 결과는 다음과 같다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예측치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예측치
실시예 25
Te5를 하기와 같이 카바마제핀 무수 필름 부재의 그라비어 층 내에서 평가한다.
Te5를 포함하지 않는 피복물 13
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, CRBM 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 26
피복물 14(그라비어 층 내 0.25mM Te5)
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.25mM의 최종 재습윤 수준에서의 그라비어 층 내 피복된 Te5를 포함하는 CRBM 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 27
피복물 15(그라비어 층 내 0.5mM Te5)
하기 나타낸 조성 및 층 구조를 갖는, 0.5mM의 최종 재습윤 수준에서의 그라비어 층 내 피복된 Te5를 포함하는 CRBM 검정용 무수 필름 피복물을 제조한다:
실시예 28
비교 실시예 5
제13 내지 제15 피복물을 슬릿화하여 슬라이드로서 적재한다. 슬라이드를 포함하는 카트리지를 -18℃에서 냉동기에 저장한다. 6개월 및 9개월 동안 동결시킨 후, 카트리지를 반응률 및 제1 슬라이드 바이어스에 대해 시험한다. 슬라이드를 비트로스 E250 분석기 상에서 시험한다. 약 9.3㎍/mL 카바마제핀을 함유하는 11㎕의 사람 혈청 매트릭스 용액을 3개 카트리지로부터의 제1 슬라이드(상부 슬라이드) 및, 또한 동일한 카트리지로부터의 제2 내지 제7 슬라이드에 도포한다. 각각의 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, Na2HPO4(10mM, pH 6.8), 4'-하이드록시아세트아닐리드(5mM), 헥사데실피리디늄 클로라이드(0.1％), H2O2(8mM) 및 DPTA(10μ M)을 함유하는 세척액 12㎕를 각각의 슬라이드에 도포한다. 세척액은 결합하지 않은 약물-서양고추냉이 퍼옥시다제 표지를 세척(제거)하며 HRP-촉매된 염료 형성 반응을 개시하도록 한다. 세척액의 첨가에 이어, 각각의 슬라이드를 37℃에서 재항온처리하며 이 동안 반사 밀도를 670nm의 파장에서 2.5분 동안 3초의 간격으로 판독한다. 반사 측정치를 클래퍼-윌리암 전환을 사용하여 투과율, Dt로 전환시키고, 색상 형성률을 계산한다. 이것을 보정 곡선을 통해 카바마제핀의 농도로 전환시킨다.
이 결과는 다음과 같다:
바이어스 = 상부 슬라이드 예측치 - 제2 내지 제7 슬라이드의 평균 예측치
비교 실시예 2 내지 5는 그라비어 층 내 Te5의 존재가 Te5의 부재하에서 보다. 0에 현저히 가까운 제1 슬라이드 바이어스의 현저한 감소를 가져옴을 보여준다. 요구되는 Te5의 수준은 일부 경우에는 0.25(PHYT)이고 기타 경우에는 0.5(PHBR, DGXN, CRBM)으로 변화한다. 그러나, 모든 경우에 있어 제1 바이어스는 그라비어 층 내에서 Te5를 사용하는 경우 거의 0으로 감소한다.
본 발명은 안정화제가 경쟁적 면역수율 검정에 있어 확산 층 내에 피복되는 것과는 달리, 확산 층 위의 그라비어 층 내에 위치하는 경우, 더욱 낮은 수준의 Te5를 사용하여 제1 슬라이드 바이어스를 현저히 감소시킨다. 이것은 본원에 제공된 실시예에 의한 일반적인 현상으로 밝혀졌다. 4개의 면역수율 검정의 그라비어 층 내로 심지어 낮은 수준의 디아릴 텔루라이드를 혼입하는 경우, 확산 층 내 디아릴 텔루라이드를 직접 피복하는 경우에 비해, 제1 슬라이드 바어어스를 현저히 감소시킨다. 디아릴 텔루라이드는 용량 의존적인(예를 들어, 기록 염료의 표백에 의해) 방식으로 검정에 마이너스적인 영향을 미칠 수 있기 때문에, 확산 층 내에서 요구되는 높은 농도와 대조적으로, 그라비어 층 내에서 더 낮은 농도의 디아릴 텔루라이드를 사용하는 경우, 중요한 장점이 부여된다.
본 발명은 단독으로 또는 바나딜 화합물과 같은 기타 안정화제와 함께 HRP 안정성을 향상시킨다. 본 발명의 바람직한 양태는 Te5 및 바나딜 염 모두를 포함한다.
[표 1]
본 발명을 이의 바람직한 양태를 특별히 참조하여 상세히 기술하였으나, 본 발명의 취지 및 영역내에서 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 당해 분야의 숙련가들은 하나 이상의 디아릴 텔루라이드의 사용, 또는 특정 디아릴 텔루라이드, 또는 하나 이상의 바나딜 화합물과 배합된 특정 디아릴 텔루라이드 또는 하나 이상의 디아릴 텔루라이드의 사용이 본 출원인의 발명을 최적화시키기 위해 선택될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 의해 안정화제가 경쟁적 면역수율 검정에 있어 확산 층 내에 피복되는 것과는 달리, 확산 층 위의 그라비어 층 내에 위치하는 경우, 더욱 낮은 수준의 Te5로도 제1 슬라이드 바이어스를 현저히 감소시킬 수 있다.
도 1은 완충액 단독, 1mM VOSO4 및 실시예 3에서 기술한 바와 같은 1mM의 각각의 디아릴 텔루라이드(DAT) 단독 또는 1mM의 디아릴 텔루라이드 각각과 1mM VOSO4의 혼합물을 포함하는 다양한 용액을 스포팅하는 경우, 건조 포맷 모델에 있어서 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 안정성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 실시예 3에서 기술한 바와 같은 각종 농도의 디아릴 텔루라이드 1 및 4를 사용한 건조 포맷 모델에 있어서 24시간의 기간에 걸친 HRP 안정성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 실시예 5에서 기술한 바와 같이 스포팅 용액 중에 혼입된 상이한 농도의 디아릴 텔루라이드 4 및 5를 사용한 건조 포맷 모델에 있어서 항 C-반응성 단백질(anti-CRP)-HRP 결합체(conjugate)의 안정성을 나타내는 막대 그래프이다.

Claims (25)

  1. (a) 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 포함하는 표지 층;
    (b) 확산 층;
    (c) 리간드에 대한 고정된 수용체를 일정 농도로 포함하는 수용체 층 및
    (d) 디아릴 텔루라이드를 포함하는 그라비어 층을 갖는 지지체를 포함하는, 리간드 검정용의 무수 면역검정 분석 부재.
  2. 제1항에 있어서, 디아릴 텔루라이드 화합물이 화학식 1의 화합물을 포함하는 부재.
    화학식 1
    Ar1-Te-Ar2
    상기식에서,
    Ar1 및 Ar2는 하기의 화학식으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 동일하거나 상이한 아릴 또는 헤테로아릴 그룹이다.
    [여기서, X는 O, S, Se 또는 Te이고, R11, R12, R13, R21, R22, R23, R31, R32, R33, R41, R42 및 R43은 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, OH, OR1, SH, NH2, NHR1, NR1 2, NR1R2, CO2H 및 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, PO3H2 및 이의 염, 및 SR1(여기서, R1 및 R2는 상이하며 각각_친수성 그룹을 포함하거나 포함하지 않는 탄소수 1 내지 14의 탄소 쇄를 갖는 알킬 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, R14, R15, R24 및 R25는 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, CO2H 및 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, 및 PO3H2 및 이의 염(여기서, R1은 위에서 정의한 바와 같다)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다]
  3. 제1항에 있어서, 디아릴 텔루라이드가 하기의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 부재.
  4. 제1항에 있어서, 바나딜 염을 추가로 포함하는 부재.
  5. 제2항에 있어서, 바나딜 염을 추가로 포함하는 부재.
  6. 제3항에 있어서, 바나딜 염을 추가로 포함하는 부재.
  7. 제1항에 있어서, 퍼옥시다제가 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체 중의 표지물인 부재.
  8. 제7항에 있어서, 퍼옥시다제가 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)인 부재.
  9. 제8항에 있어서, 그라비어 층이 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 추가로 포함하는 부재.
  10. 제9항에 있어서, 그라비어 층이 액체 샘플과의 접촉을 제공하는 확산 층 표면과 접촉되어 있는 부재.
  11. 제10항에 있어서, 디아릴 텔루라이드가 하기의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 부재.
  12. 제11항에 있어서, 바나딜 염을 추가로 포함하는 부재.
  13. (1) (a) 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 포함하는 표지 층,
    (b) 확산 층,
    (c) 리간드에 대한 고정된 수용체를 일정 농도로 포함하는 수용체 층 및
    (d) 디아릴 텔루라이드를 포함하는 그라비어 층을 갖는 지지체를 포함하는 무수 면역검정 분석 부재를 제공하는 단계;
    (2) 당해 부재의 확산 층의 한정된 영역을 수성 샘플과 접촉시킴으로써 (a) 고정된 리간드-수용체 복합체, (b) 고정된 효소-표지된 리간드-수용체 복합체 또는 (c) (a)와 (b)의 혼합물, 또는 고정된 수용체-리간드-표지된 수용체 복합체를 형성시키는 단계;
    (3) 한정된 영역과 효소 표지물에 대한 기질 용액을 접촉시킴으로써 시그날의 전개를 촉매하는 단계 및
    (4) 시그날을 검출함으로써 리간드의 농도를 측정하는 단계를 포함하여, 수성 샘플 중의 면역학적으로 반응성인 리간드를 검정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 디아릴 텔루라이드 화합물이 화학식 1의 화합물을 포함하는 방법.
    화학식 1
    Ar1-Te-Ar2
    상기식에서,
    Ar1 및 Ar2는 하기의 화학식으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 동일하거나 상이한 아릴 또는 헤테로아릴 그룹이다.
    [여기서, X는 O, S, Se 또는 Te이고,R11, R12, R13, R21, R22, R23, R31, R32, R33, R41, R42 및 R43은 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, OH, OR1, SH, NH2, NHR1, NR1 2, NR1R2, CO2H 및 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, PO3H2 및 이의 염, 및 SR1(여기서, R1 및 R2는 상이하며, 각각_친수성 그룹을 포함하거나 포함하지 않은 탄소수 1 내지 14의 탄소 쇄를 갖는 알킬 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, R14, R15, R24 및 R25는 동일하거나 상이하며, 각각 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, CO2H 및 이의 염, CO2R1, SO3H 및 이의 염, 및 PO3H2 및 이의 염(여기서, R1은 위에서 정의한 바와 같다)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다]
  15. 제13항에 있어서, 디아릴 텔루라이드가 하기의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 부재가 바나딜 염을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 부재가 바나딜 염을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 부재가 바나딜 염을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 퍼옥시다제가 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체 중의 표지물인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 퍼옥시다제가 서양고추냉이 퍼옥시다제인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 시그날이 비색계 시그날(colorimetric signal)인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 그라비어 층이 효소 표지된 리간드 또는 효소 표지된 수용체를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 그라비어 층이 액체 샘플과의 접촉을 제공하는 확산 층 표면과 접촉되어 있는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 디아릴 텔루라이드가 하기의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 부재가 바나딜 염을 추가로 포함하는 방법.
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