JPH03186761A - イムノアッセイ用分析要素及びアッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は臨床化学に関し、より詳細には免疫反応性リ
ガンドのイムノアッセイ用要素およびその測定方法に関
する。

〔従来の技術〕

自然界の免疫反応の利点を有するイムノアッセイは、臨
床化学における分析技法として広範な使用が見い出され
てきた。これらの反応の特異性のため、これらは、特に
非常に低濃度で存在する生物学的被分析体の定量にとっ
て有利である。このような被分析体（本明細書ではりガ
ントと称する）としては、例えば抗体、治療薬、麻薬、
酵素、ホルモン、タンパク質などが挙げられる。

競争パインディングアッセイでは、標識リガンド類縁体
（本明細書では、リガンド類縁体と称する）が固定され
た量の適当なパインディング物質（本明細書では、受容
体と称する）との反応に対して未標識リガンドと競争状
態に置かれる。リガンドの未知量は、パインデイングリ
ガント類縁体または未パインディング（遊離の）リガン
ド類縁体いずれかの測定信号から決定することができる
。

この反応は以下のように進行する。

リガンド＋リガンド類縁体＋受容体＝ リガンド−受容体＋リガンド類縁体−受容体。

通常の標識類としては、放射線活性タグ、酵素、発色原
体、蛍光原体、安定フリーラジカル、ならびに酵素補因
子、酵素阻害剤およびアロステリックエフェクターが挙
げられる。

米国特許第４，６７０．３８１号は、乾式イムノアッセ
イ分析要素を公表する。この要素では、パインディング
したリガンドとＭ離のリガンドの分離が、多孔質のビー
ズ化展開層を使用して達成されており、この展開層は液
体試料の拡散が、拡散中に起こる受容体中のリガンドと
リガンド類縁体の複合化を十分遅くするようなものであ
る。その受容体は展開層に固定化されていてもよい。こ
れらのビーズは、主して２０〜４０Ｉ！ｒｎの範囲内に
ある大きなビーズであるが、一般にｌ〜２００ｐの多様
なサイズで存在する。このような展開層は、多種多様な
被分析体に対して有用である。このことは、拡散性の要
件が類似であるからである。

〔発明が解決しようとする課題〕

このようなビーズが、常にイムノアッセイに適するとは
限らない点に課題がある。相違するりガントは、相違す
る濃度の受容体を必要とする。非常に大きなビーズは、
必要な受容体濃度にすべての場合に適する十分な表面積
を提供しない可能性がある。さらに、展開層で一般に使
用されるビーズは、抗体のような生物学的に活性な物質
が都合よく付着できるのに必要な表面品質と表面特性を
持たない。例えば、大きなビーズは抗体のような生物学
的な活性種の共有固定化のための反応性官能基を一般に
含まない。

大きなビーズが共有結合性の反応性基を有する場合でさ
えも、それらの調製方法のため小さいビーズのように抗
体の固定化能は良好でない。展開層のビーズは、一般に
限定された凝集剤を使用する懸濁重合によって調製され
ている。この調製は受容体とりガントの固定化に悪影響
を示す。この調製方法は、ビーズ表面上に各種の残留物
、例えば界面活性剤やシリカ安定剤を残す。これらの残
留物は、ビーズへの受容体の付着を阻害する。これらの
残留物は、付着された受容体の作用もマスクする。マス
クされた受容体は、その後にリガンドを固定化すること
ができない。

〔課題を解決するための手段〕

この発明は、前記課題を、支持体と展開層を含んでなる
イムノアッセイ用分析要素であって、（ａ）前記展開層
に適用される液体の均一な拡散を促進するような１０〜
２００Ｊｒｍの範囲内の直径を有する比較的大きなポリ
マービーズの第１集団、ならびに （ｂ）（ｉ　）　０．１〜５ｎの範囲内の直径を有し、
質がない表面を有する比較的小さなポリマービ−ズの第
２集団を含むことを特徴とする要素の提供によって解決
する。

便宜上、ポリマービーズの第１集団を大きなビーズ類と
称し、第２集団を小さなビーズ類と称する。

好ましくは、第２集団のポリマービーズ類は単分散であ
る。単分散とは、３σ（シグマ）の粒子サイズ分布が平
均粒子直径の７％以下であることを意味する。展開層の
大きな粒子は、典型的には、広範なサイズを有する多分
散である（第１集団）。

この発明は、前記要素を使用し、次の工程を含んでなる
液体中の免疫反応リガンドのアッセイ方法も提供する： Ａ、標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開層の
限定された領域に接触してその限定された領域内に固定
化されたリガンド−受容体複合体を形成し、そして液体
の拡散によって前記固定化された複合体から未複合体化
リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに Ｂ、工程への終了後、前記限定された領域の中心にある
前記固定化された複合体を測定する工程。

この発明はまた、次の工程を含んでなる上述の分析要素
による液体中の免疫反応リガンドをアッセイするための
方法も提供する。

Ａ、標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開層の
限定された領域に接触してその限定された領域内に固定
化されたリガンド−受容体複合体を形成する工程、 Ｂ、洗浄液を加えて前記固定化された複合体から未複合
体化リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに Ｃ９前記限定された領域の中心にある前記固定化された
複合体を測定する工程。

この要素およびアッセイは、高度に自動化されたアナラ
イザーで使用することができる。

以下、この発明を具体的に説明する。

この発明で提供される要素類は、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌシ匹１ル曲（ち−２０６〜２０７ページに記
載されるサンドインチ法を用いるアッセイを初めとする
すべてのイムノアッセイで有用である。しかしながら、
便宜上本明細書では、競争イムノアッセイの語で説明す
るであろう。後者のアッセイでは、測定する種と対応す
る標識種を共通の反応体の一定量について競争させる。

測定するこれらの種は、本明細書においてリガンドと称
しており、標識種はリガンド類縁体と称している。リガ
ンドおよびリガンド類縁体を特異的に認識しそして反応
してそれらは、共役対（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｐａｉｒ
）を形成する。この対のいずれの構成員も受容体または
リガンドとして機能できる。

本発明の要素を使用して生物学的流体のような液体（例
えば、全血、血清、血漿、尿、を髄液、ヒトもしくは動
物組織の懸濁液、排泄物、唾液おびリンパ液など）にお
ける低濃度の免疫反応リガンドを測定することができる
。リガンドは１Ｏ−Ｉｓモル濃度のような低濃度、より
一般的には１０−　”〜１０−４モル濃度で測定するこ
とができる。

こうして定量的または定性的に測定することができるリ
ガンド類としては、治療薬類（例えば、フェノバルビタ
ール、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジン、フェ
ニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラマ
イシン、リドカイン、プロカインアミドなど）、天然も
しくは台底ステロイド類（例えば、コーチゾール、アル
ドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エスト
リオールなと）、ホルモン類（例えば、甲状腺ホルモン
、ペブタイドホルモン、インシュリンなど）、タンパク
質類（例えば、アルブミン、　ＩｇＧ、　　ＩｇＭ、フ
ェリチン、Ｃ反応性クンバク質、アイソザイム、アポリ
ポタンパク質など）、抗原、モノクローナル抗体を初め
とする抗体および受容体とそのまま反応しうる他の種を
挙げることができる。この発明は、治療薬、例えばジゴ
キシン、フェニトイン、テオフィリンまたはフェノハル
ビタールおよびホルモン、例えばチロキシンまたはトリ
ョードチロニンの測定にとって特に有用である。

小さなポリマービーズに共有結合するのに必要な遊離ア
ミノ基またはスルフヒドリル基を有する生物学的に興味
深い受容体類としては、次のものが挙げられる。

ａ）ＩｇＧ抗体のＦｃ部に親和性を有するプロティンＡ
またはプロティンＧ。

ｂ）ビオチンまたはビオチン錯体に親和性を有するアビ
ジンまたはアビジン錯体。

この発明の試薬を調製するのに使用できるアビジンモノ
マー、ビオシチン（すなわち、ビオチン−ε−Ｎ−リジ
ン）、ビオチンヒドラジド、２イミノビオチンのアミン
もしくはスルフヒドリルＨＡ　４体およびビオチニル−
ε−アミノカプロン酸ヒドラジド、 ビオチン誘導体類、例えばビオチン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプロ
ン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ
スクシンイミジル−６（ビオチンアミノ）ヘキサノエー
ト、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチン、ビ
オチンブロモアセチルヒドラジド、Ｐ−ジアゾベンシイ
；；・ビオシチンおよび３−（Ｎ−アレイ兆ドプロビオ
ニル）ビオシチンが含まれる。

Ｃ）抗原が誘発する抗体に対する抗原に特異的な親和性
を有するモノクローナル抗体類およびそれらの抗原。

ｄ）ポリクローナル抗体類およびそれらの個々の抗原。

ｅ）プラスミノーゲンに親和性を有するリシン。

ｆ）フィブロネクチンに親和性を有するゼラチンのよう
な興味の対象とする他のタンパク質または生物学的高分
子に特異的な親和性を有するタンパク質類および他の生
物学的高分子。

ｇ）オリゴマーまたは高分子量の生物学的分子、例えば
糖、薬剤、ＤＮＡ塩基類、ＤＮＡオリゴマー類およびホ
ルモン類に特異的な親和性を有する小分子種およびオリ
ゴマ一種。

ｈ）特定の糖類田および糖含有高分子（凝集因子に親和
性を有するヘパリン、リポクンバク質類、血漿タンパク
Ｘ１など）に特異性を示すコンカナバリンＡのような生
物学的分子の特定部類のものに特異性を有する高分子類
。

ｉ）色素シバルコン（Ｃ３ｂａｒｃｏｎ−商標−）ブル
ー　Ｆ３ＧＡならびにアルブミン、アデニル含有補因子
を要求する酵素、凝集因子およびインターフェロンに特
異性を有する他のタンパク質特異的疎水性色素類のよう
な生物学的分子類に特異的親和性を有する小分子類。

当業者に明らかなように、アッセイの目的に応じてリガ
ンドは受容体となることができ、受容体はリガンドとな
ることができる。例えば、フエノパルビタールを含んで
なるリガンドは、それがフエノバルビクール抗体または
標識フェノバルビタール抗体を用いるフェノバルビター
ルのアッセイに向けられる場合には小さなビーズに付着
することができる。

上述したように、小さなポリマービーズはそれらの表面
上に受容体を有する。これらの受容体は、受容体の遊離
アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、アルデヒ
ド基またはケトン基と直接または間接的な反応性を有す
る表面反応性基を介してそれらのビーズに結合される。

有用な表面反応性基としては、 ａ）活性ハロゲン基、 ｂ）活性化２−置換エチルスルホニル基または活性化ビ
ニルスルホニル基、 Ｃ）反応性カルボキシル基、 ｄ）エポキシ基、 ｅ）イソシアネート基、 ｆ）アジリジン基、 ｇ）アルデヒド基、 ｈ）２−置換エチルカルボニル基、およびｉ）スクシン
イミドキシカルボニル基、が挙げられる。表面反応性基
ａ）、ｂ）、ｃ）およびｉ）が好ましい。

具体的なアッセイ目的および設計に応じて、表面活性基
ａ）〜ｉ）が受容体の一部である時には、アミノ基、ス
ルフヒドリル基、カルボニル基およびアルデヒド基が受
容体を小さなビーズに付着する表面活性基として役立つ
ことは、当業者に明らかであろう。

一般に、小さなポリマービーズを形成するのに使用され
るポリマー類は次の一般式に従う。

％式％（１） 上式中、−Ａ−は、１種以上の疎水性エチレン系不飽和
モノマー類に由来する反復単位を表し、−Ｂ−は、受容
体の遊離アミノ基またはスルフヒドリル基と直接または
間接に反応しうる必要な反応性基を有する１種以上のエ
チレン系不飽和モノマー類に由来する反復単位を表し、 −り一は、−Ａ−または−Ｂ−で表されるものと相違す
る１種以上のエチレン系不飽和モノマー類に由来する反
復単位を表す。

弐（１）において、Ｏは０〜９９．０モル％であり、ｐ
は０．１〜１００モル％であり、モしてｑは０〜１０モ
ル％である。

前記−Ａ−反復単位は、１種以上の疎水性エチレン系不
飽和モノマー類に由来する。このようなモノマー類は水
に不溶性である。限定されるものでないが、代表的な疎
水性モノマー類としては、スチレンおよびスチレン誘導
体類（例えば、ビニルトルエン、２．５−ジメチルスチ
レン、４−を−７”チルスチレンおよび２−クロロスチ
レン）、アクリル酸およびメタクリル酸エステル類（例
えば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレー
ト、メチルアクリレート、エチルアクリレート、２−エ
チルへキシルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルア
ミドおよびメチルメタクリレート）、アクリロニトリル
ならびにビニルアセテートが挙げられる。

ポリマーは、必要によりいずれか適当な様式で架橋する
ことができる。ある方法では、２以上のエチレン系の不
飽和重合性基を有するモノマー少量、すなわち１５モル
％まで、好ましくは０．３〜５モル％を組み込む。これ
らのモノマー類は、Ａが誘導される疎水性モノマー間に
含まれる。代表的モノマー類はリサーチ・ジスクロージ
ヤー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）、出
版１９５５１．１９８０年７月、３０４ページに記載さ
れており、例えば、ジビニルベンゼン、エチレンジメタ
クリレート、Ｎ、Ｎ’メチレンビスアクリルアミド、２
．２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート、
アリルアクリレート、エチリジントリメタクリレートお
よびエチレンジアクリレートが挙げられる。

Ａ−が誘導される特に有用なモノマー類は、スチレン、
ビニルトルエン、エチレンジメタクリレート、ブチルア
クリレート、ジビニルベンゼン、２−エチルへキシルメ
タクリレートおよびメチルメタクリレートである。

Ｂ−反復単位は、中間的な架橋剤を用いまたは用いない
でアミノ基またはスルフヒドリル基と容易に反応する追
加の表面反応性基を含んでなる。

従って、Ｂ基はそのような反応性基を含むいずれかのモ
ノマーから誘導することができる。好ましいモノマー類
としては、上記ａ）〜ｉ）に記載した追加の求電子的表
面反応性基を含んでなるものがγげられる。

ｌ１繁な反応性基を提供する七ツマー類の好まし活性ハ
ロゲン原子を有するモノマー類の例としては、ビニルク
ロロアセテート、ビニルブロモアセテート、ハロアルキ
ル化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチレンまた
はブロモメチルスチレン）、ハロアルキルアクリル酸エ
ステルマタハロアルキルメタクリル酸エステル（例えば
、クロロエチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒド
ロキシプロピルメタクリレートおよび３−クロロプロピ
ルアクリレート）ならびに当業者に既知の他のモノマー
類が挙げられる。ハロアルキル化ビニル芳香族、例えば
炭素原子１〜３の活性ハロアルキル基を有するものは、
反応性基として活性ハロゲン原子を使用する場合に好ま
しい。クロロメチルスチレンが非常に有用である。

活性ハロゲン原子を有するモノマー類は、多くの利点を
発揮するが、活性化２−置換エチルスルホニル基および
ビニルスルホニル基を有するモノマー類は、温和な条件
下で製造中のプロセスコントロールをあまり必要としな
いでそれらのポリマーにタンパク質を結合することがで
きる点でさらなる利点を示す。このことが、より効率的
で経費のかからない製造を可能にする。後者の基を有す
る代表的モノマー類の多くは、米国特許第４．１６１，
４０７号および同４，５４８．８７０号明細書に記載さ
れるものを初めとし、当該技術分野で既知である。

好ましい活性化２−置換エチルスルホニルモノマー類オ
よびビニルスルホニルモノマー類ハ、下記式（Ｉｔ）に
よって示される。

Ｏ ＩＩ ＣＨｚ−ＣＬ　　Ｓ　　Ｒ’　　　　（ＩＩ）１ 上式中、Ｒは水素または置換もしくは未置換アルキル（
一般に炭素原子１〜６）、例えば、メチル、エチル、イ
ソプロピルまたはヘキシルである。好ましいＲは水素ま
たはメチルである。

Ｒ’　は−ＣＨ＝　ＣＨＲ”または−Ｃ）１２ｃＨ２Ｘ
　（ココＴ：、Ｘは求核剤によって置換されるか、ある
いは塩基で処理することによってＨＸの状態で除去され
る脱離基、例えばハロ、アセトキシ、メチルスルホニル
オキシのようなアルキルスルホニルオキシ、ｐトリルス
ルホニルオキシのようなアリールスルホニルオキシ、第
三アンモニオ、例えば、トリメチルアンモニオ塩もしく
はピリジノ塩である）を表す。Ｒ２は水素、置換もしく
は未置換アルキル（一般に、Ｒについて定義したような
炭素原子１〜６）、または置換もしくは未置換子り−ル
（−般に、核炭素原子６〜１２の、例えばフェニル、ナ
フチル、キシリルもしくはトリル）である。好ましいＲ
’　は−ＣＩＩｚＣＨｚＸである。活性２−置換エチル
基であるこの基は、脱離基ＸのＷ換を害さない何等かの
基で置換されていてよい。

Ｌは、一般に炭素原子１〜２０の置換もしくは未置換ア
ルキレンであって、主鎖中の複数原子に結合する連結基
である。アルキレンのこの定義は、オキシ、チオ、−Ｎ
Ｒ３−（ここで、Ｒ３は水素、炭素原子１〜６の置換も
しくは未置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチル
もしくは２−ヒドロキシエチル）または炭素原子６〜１
０の置換もしくは未置換アリール（例えば、フェニル、
ナフチルもしくはキシリル）である〕、エステル（−Ｃ
ｏｏ−）、アミド（−ＣＯＮＨ−）　、ウリジン１ （−ＮＨＣＮＨ−）　、スルホニル（−ＳＯＺ　−）　
、カーボネート、スルホナミド、アゾまたはホスフォノ
基などで中断されているかあるいはそれらを末端基とす
るアルキレン基を包含することを意味している。代表的
なアルキレン基としては、メチレン、エチレン、イソブ
チレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエトキシカ
ルボニル、メチレンビス（イミノカルボニル）、カルボ
ニルオキシドデシレンカルボニルオキシエチレン、カル
ボニルイミノメチレンイミノカルボニルエチレン）なら
びに上記米国特許第４，１６１，４０７号および同４，
５４８，８７０号明細書に記載されているか示唆される
他の基が挙げられる。

Ｌはまた、一般に核炭素原子６〜１２の置換もしくは未
置換アリーレンであってもよい。代表的なアリーレン基
としては、フェニレン、トリレン、ナフチレンおよび上
記特許明細書に記載された他の基が挙げられる。また、
Ｌのこの定義に含まれるものは、上記アルキレン基およ
びアリーレン基のそれぞれが１個以上組み合わされた二
価の基、例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンア
リーレンアルキレンおよび当業者によって容易に決定さ
れる他の基が挙げられる。好ましくは、Ｌは未置換フェ
ニレンアルキレン、あるいは１個以上のアルキル基（Ｒ
について定義したような）、アルコキシ基（一般に炭素
原子１〜６の、例えば、メトキシ、プロポキシもしくは
ブトキシ）またはハロ基で置換されたフェニレンアルキ
レン、あるいはカルボニルイミノメチレンイミノカルボ
ニルエチレンである。

Ｂが誘導できる代表的な２−置換エチルスルホニルモノ
マー類およびビニルスルホニルモノマー類としては、ｍ
−およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）ス
チレン、ｍ−およびｐ（２−（ｐ−）リルスルホニルオ
キシ）エチルスルホニルメチル〕スチレン、ｍ−および
ｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、Ｎ−（ｍ−およ
びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル
コアクリルアミド、ならびにＮ−［２−（２クロロエチ
ルスルホニル）エチルホルムアミドメチル］アクリルア
ミドが挙げられる。最初のモノマーが好ましい。

反復単位Ｂを形成するのに追加することのできる他の好
ましい反応性基はカルボキシル基である。

カルボキシル基は、このような基を含むモノマーｉ、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２−カ
ルボキシエチルアクリレート、フマール酸、マレイン酸
、２−カルボキシエチルメタクリレート、カルボキシメ
チルスチレン、メタクリルアミドヘキサン酸およびＮ−
（２−カルボキシ−１，１−ジメチルエチル）アクリル
アミドなどを組み入れるか、あるいはカルボキシル基に
転化することができる他の反応性基を有するポリマーの
さらなる化学反応（例えば、マレイン酸無水物のような
無水物の加水分解、または表面メチロール基もしくはア
ルデヒド末端基の酸化）によって粒子に付加することが
できる。

これらのカルボキシル基単独では殆どの現実に使用する
アミノ基およびスルフヒドリル基との反応が遅すぎるの
で、補助的な架橋剤を使用してこれらのカルボキシル基
にタンパク質、例えば、抗原、抗体、ハプテンなどを共
有結合する。補助的架橋剤の有用なものは、周知のカル
ボシイご部類、例えば、１−シクロへキシル−３−［２
−モルホリニル−４−エチル］カルボジイミドメト−ｐ
　−トルエンスルホネートがあり、このものは米国特許
第４，１８１，６３６号明細書に記載されるように写真
ゼラチン層のゼラチンを架橋したり診断試薬を調製する
のに使用されてきた。

他の好ましい部類の補助的架橋剤としては、米国特許第
４，４２Ｌ８４７号明細書に記載されるようなカルバモ
イルオニウム塩が挙げられる。代表的なカルバモイルオ
ニウム化合物類としては、１（４−モルホリノカルボニ
ル）　−１−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロ
キシド（分子内塩）および１−（４−モルホリノカルボ
ニル）−ピリジニウムクロライドが挙げられる。

ポリマー中に組み入れて必要な反応性基を供給すること
ができる他のモノマー類としては、エポキ基を含むモノ
マー類（例えば、グリシジルアクチル）、イソシアネー
ト基を含むモノマー類（例えば、イソシアネートアクリ
レート、イソシアネートエチルメタクリレートまたはα
、α−ジメチルメタイソプロペニルベンジルイソシアネ
ート）、アジリジン基を含むモノマー類〔例えば、ビニ
ルカルバモイルアジリジン、Ｎ−メタクリロイルアジリ
ジン、Ｎ−アクリロイルアジリジンおよび２−（１−ア
ジリジニル）エチルアクリレート〕、アルデヒド基を含
むモノマー類（例えば、ビニルヘンズアルデヒドまたは
アクロレイン）あるいは２−置換エチルカルボニル含有
モノマー類（例工ば、２−クロロエチルアクリレート、
２−クロロエチルメタクリレート、２−メチルスルホニ
ルオキシエチルメタクリレートおよび２−ｐ−）リルス
ルホニルオキシエチルアクリレート）が挙げられる。

Ｄは、ＡまたはＢで表されるもの以外の１種以上のエチ
レン系不飽和モノマー類から誘導される反復単位が挙げ
られる。これらのモノマー類は、得られる粒子について
水性溶液中の分散安定性を付与するかまたは固定化され
たりガントの生物学的活性に影響を及ぼすイオン性基ま
たは他の親水性基を有することができる。限定されるも
のではないが、有用なイオン性モノマー類としては、２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナト
リウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン酸ナ
トリウム、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリ
ウムおよびスチレンスルホン酸ナトリウム、ならびに他
の既知のスルホネート類、スルフェート類、カルボキシ
レートＩＩＴ、それらの塩類または無水物が挙げられ、
そして有用な非イオン極性モノマー類としては、２−ヒ
ドロキシエチルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプ
ロピルアクリレート、アクリルアミド、２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート、Ｎ−イソブロピルアクリルアミ
ド、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリロ
ニトリルおよびＮ−インブトキシメチルアクリルアごド
が挙げられる。好ましいモノマー類は、２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アク
リル酸ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンス
ルホン酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリウム、２−ヒ
ドロキシエチルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプ
ロピルアクリレート、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドおよびアクリロニトリルが挙げられる
。

本発明の小さなポリマービーズは、全体を通して同しポ
リマーからなる均質な粒子、または、例えば米国特許第
３，７００，６０９号明細書に記載されるようなグラフ
トポリマー類のような１種のポリマーより多くからなる
かもしくは、例えば米国特許第４，４０１，７６５号明
細書に記載されるようなコアー−シェルポリマー類から
なる均質な粒子であることができる。これは、例えば反
応性基または分散安定性を付与する基を含むものを粒子
表面上に存在させるポリマーの反復単位のいずれかが高
価な場合に有利である。ポリマー粒子は、比較的安価な
モノマー類または価格の上昇を抑制するモノマー類から
製造し、次いで必要な表面基を有する別異のポリマーの
重合を続けてシェルを付加することができる。

これらの小さなポリマービーズは、乳化重合法（回分式
、半連続式および連続式を含む）を用いて製造すること
ができる。乳化重合を使用すると、一般に例えば米国特
許第４，４１５，７００号（上述）およびＲｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ発行１５９６３　（１９７
７年、７月）に記載されるように界面活性剤または乳化
剤を用いることなく小さな粒子を提供できるので、乳化
重合が好ましい。Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕ
ｒｅは、Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｍａｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ、　Ｌｔｄ、　（Ｔｈｅ　Ｏ１ｄｔｌａｒｂ
ｏｕｒｍａｓｔｅｒ’ｓ、　８　Ｎｏｒｔｈ　５ｔｒｅ
ｅｔ、　Ｅｍｓｈｏｒｔｈ＋Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ　ＰＯ
ｌｏ　７００．　Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手可能な刊行
物である。

２種のポリマーからなるコアー−シェルポリマーを提供
するには段階的乳化重合を使用することができる。コア
ーの乳化重合は、標準的な条件下で反応器に反応体を連
続的に加えることによって実質的に反応が終了するまで
行われる。次に、シェルポリマーを形成するのに必要な
モノマー類と触媒が、前記コアーポリマーのラテックス
を含む反応器に連続的に加えられる。この方法で、シェ
ルはコアーモノマーとシェルモノマーの混合物となるよ
りもむしろ限定された既知の組成を有する。

この発明で有用な代表的なポリマー類としては次のもの
が挙げられる。ポリ（ｍ−およびｐ−クロロメチルスチ
レン）、ポリ（スチレンーコーｍおよびｐ−クロロメチ
ルスチレン−ヨー２−ヒドロキシエチルアクリレート）
（６７：　３０　：　３モル比）ボ１ノ（スチレンーコ
ーｍ−およびｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレ
ン）（９５，５：　４．５モル比）ポリ（スチレン〜コ
ーＮ−（ｍ−およびｐ−（２クロロエチルスルホニルメ
チル）フェニルコアクリルアミド）　　（９９，３：　
０．７モル比）、ポリ（ｍおよびｐ−クロロメチルスチ
レンーコーメタクリル酸）（９５：５．９８：　２およ
び９９．８　：　０．２モル比）ポリ（スチレンーコー
ｍ−およびｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン
ーコーメタクリル酸）（９３，５：　４．５　：　２モ
ル比）、ポリ（スチレン−ＺＮ　−Ｃｍ−オよびｐ−（
２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリ
ルアミドーコーメタクリル酸）　　（９７，３：’０．
７　：　２モル比）、ポリ（スチレンーコーｍ−および
−ｐ−クロロメチルスチレン）（７０７３０モル比）、
ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロライドーコー
アクリル酸）（８５：１０：５モル比）、ポリ（スチレ
ンーコーアクリル酸）（９９：１モル比）、ポリ（スチ
レンーニメタクリル酸）（９０：１０モル比）、ポリ（
スチレンーコーアクリル酸−コーｍ−およびｐ−ジビニ
ルベンゼン）（８９：　１０　：　１モル比）、ポリ（
スチレン−ヨー２−カルボキシエチルアクリレ−））（
９０：１０モル比）、ポリ　（メチルメタクリレートー
コーアクリル酸）　（７０：　３０モル比）、ポリ（ス
チレンコーｍ−およびｐ−ビニルベンズアルデヒド）（
９５：５モル比）、ならびにポリ（スチレン−ｒ　−ｍ
　−およびＰ−ビニルベンズアルデヒドーコーメタクリ
ル酸）（９３：　５　：　２モル比）。

受容体は、上述のａ）から１）の表面反応性基を介して
それらの粒子に共有結合される。これらの基は、生物学
的受容体の求核性遊離アくノ基およびスルフヒドリル基
と直接的または間接的な反応性を有する。

生物学的種が求電子性基（カルボキシ、アルデヒドなど
）を含むかまたは含むように変性されたタンパク質であ
る場合、ポリマー粒子は表面反応性求核性基、例えばア
ミン、スルフヒドリルなどを有することができる。

小さなポリマービーズに受容体を付着させる一般的な方
法には、一般に既知の反応を用いるビーズへの選ばれた
受容体の共有結合方法が含まれる。

多くのペンダント基、例えばハロアルキル、２−１　換
活性化エチルスルホニルおよびビニルスルホニルにより
受容体をビーズに直接結合することができる。一般に、
水性緩衝液（通常、ｐ１１５〜１０）中、ポリマー粒子
濃度０．１〜４０重量％（好ましくは、０．１−１０重
量％）でビーズが受容体と混合される。受容体量はポリ
マーに対する比として、０、１　：　１０００〜１：１
０、好ましくは１：１００〜ｌ：１０である。混合は温
度範囲５〜５０″Ｃ１好ましくは５〜４０″Ｃで、０．
５〜４８時間行われる。いずれか適当な緩衝剤を使用す
ることができる。

ある場合には、外表面上ペンダント反応性基はリガンド
乙共有結合を起こすために変性または活性化しなければ
ならない。例えば、カルボキシル基は上記既知のカルボ
ジイミド類またはカルパモイルオニウ類を用いて活性化
しなければならない。

他の例では、外表面のエポキシ基を加水分解して免疫学
的種のアミノ基に対するカプリング剤として働くことの
できるシアノゲンブロマイドと反応できるジオール化合
物を形成する。アルデヒド類はアミン類と反応して、そ
の後還元して共有結合を形成することのできるシッフ塩
基を形成することができる。また、アルデヒドは酸に酸
化することができ、カルボキシル基に対する上記と同様
な化学試薬を使用してアミド結合を形成することができ
る。

受容体が、それぞれポリマー上の反応性基またはそのポ
リマーが反応性カルボキシル基を有する場合にはその粒
子上のカルボキシル基とカルボジイミド化合物もしくは
カルバモイルオニウ化合物との反応によって形成される
中間体と反応しうる反応性アミン基またはスルフヒドリ
ル基を含む限り、反応性アミノ基またはスルフヒドリル
基のいずれかを含む受容体は、単分散ポリマービーズに
結合することができる。

受容体上のアミノ基またはスルフヒドリル基と容易に直
接反応する反応性基を有する小さなポリマービーズは、
必要があれば適当な緩衝剤の存在下で、受容体と単に混
合するだけで反応させることができる。

しかしながら、カルボキシル基を含む単分散ポリマービ
ーズへの受容体の結合は２段階で行われ、第１段階はカ
ルボジイミド化合物もしくはカルバモイルオニウム化合
物とポリマー粒子の水性懸濁液を接触させてカルボキシ
ル基の代わりに中間的な反応性基を有する反応性中間体
ポリマー粒子を生成する。この段階は、適当な酸または
所定のｐＨを提供する緩衝剤を使用して適当なｐＨで行
う。反応を進行することができる限り制限されるもので
ないが、一般にｐＨは６未満である。より好ましくは、
ｐＨは３．５と７との間にある。粒子表面のカルボキシ
ル基に対するカルボジイミド化合物またはカルバモイル
オニウム化合物のモル比は、ｌ：１０〜１：５００にあ
る。

前記方法の第２段階では、第１段階で形成された反応性
中間体を反応性アミノ基またはスルフヒドリル基含有受
容体と接触する。こうして共有結合が粒子と受容体との
間に形成される。受容体に対するポリマー粒子の重量比
は、一般に１：１０００〜１：１、好ましくは１：１０
０〜ｌ：１０である。

多孔質展開層は、希釈または未希釈試験試料（例えば、
１〜１００ｍ）を収容するのに適する多孔性を有する。

好ましくは、展開層は等方性多孔質であり、この性質は
特定区域を占める粒子間を相互に連結する空隙によって
作製される。等方性多孔質とは、展開層が適用された液
体をその層のすみからずみまで容易にそして均一に拡散
することを意味する。

有用な展開層は、米国特許第４，６７０．３８１号、同
４．２５８，００１号および同４，４３０，４３６号で
公表されている。特に有用な展開層は、米国特許第４．
２５８．ＯＯ構造を有するものである。

この展開層に有用な熱安定性有機ポリマー粒子は、はぼ
球状の直径２０〜４０ｎの範囲内にある粒子サイズを有
するものである。これらが大きなビーズの第１集団ポリ
マービーズとなる。

これらの粒子は、必要な特性を有する天然ポリマーおよ
び合成ポリマーの両方を含む多種多様な有機ポリマーか
ら構成することができる。しかしながら、それらは上述
の特許に記載された１種以上の付加ポリマー類から好ま
しくは構成される。

特に有用な付加ポリマー類としては、米国特許第４．２
５８，００１号の第１表に列挙されるものが挙げられる
。その表中のカッコ内の数字は、ポリマーを製造するの
に使用したモノマーブレンドにおけるモノマー類の重量
比を表す。ポリ（ビニルトルエン−Ｄ−Ｐ−ｔ−ブチル
スチレン−ニーメタクリル酸）（６１：３７：２Ｌポリ
（スチレン−２−ｎ−ブチルアクリレート）　　（７５
：２５）およびポリスチレンが好ましいポリマー類であ
る。これらの有機ポリマー粒子は、必要により当該技術
分野で既知の他の添加剤を含めることができる。

この発明で有用なポリマー粘Ｓ質は、有機ポリマー粒子
を相互に結合して整然とした三次元格子を展開層中に提
供する。

特に有用な付加ポリマー類としては、米国特許第４．２
５８，００１の第■表および米国特許第４，２８３．４
９１号に列挙されたものが挙げられる。ポリ（メチルア
クリレート−ヨー２−アセトアセトキシエチルメチルア
クリレートーコー２−アクリルアミド−２−メチルプロ
パンスルホン酸）　　（８８ニア　：　５）、ポリ　（
Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ　（ｎブチルアク
リレート−ニースチレン−２−２−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩）（７５：２
０：５）およびポリ（メチルアクリレート−ヨー２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウ
ム塩−コーアセトアセトキシエチルメタクリレート）（
９５：１３〕が好ましい粘着性ポリマーである。

上記粒子と粘着質による粒状構造物の調製方法は上記特
許に示されている。

本発明の要素の展開層は適当な支持体上に担持される。

このような支持体は適当な寸法安定性で、好ましくは２
００と９００ｎｍとの間の波長の電磁線を透過する非孔
賞の透明（すなわち、輻射線透過性）材料であることが
できる。個々の要素について選ばれる支持体は意図する
検出様式（反射、透過または蛍光分光）に適合性があら
ねばならない。有用な支持体材料としては、ポリスチレ
ン、ポリエステル類〔例えば、ポリ（エチレンテレフタ
レート）〕、ポリカーボネート類、セルロースエステル
類（例えば、酢酸セルロース）などが挙げられる。

本発明の要素は、１種以上の層、例えば、分離層または
試薬層／展開層の組み合わさった層および他の必要な添
加剤、カプリング酵素などを含むゼラチン緩衝層を含む
ことができる。大きなポリマービーズと小さなポリマー
ビーズは、同一または相違する層のいずれかに塗布する
ことができる。

小さなビーズは、大きなビーズと同時にまたは前後に塗
布することができる。

この要素の試薬層または展開層は、１種以上の合成また
は天然のバインダー材料、例えばゼラチンまたは他の天
然に見い出されるコロイド、ホモポリマー類およびコポ
リマー類、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニ
ルピロリドン）、ポリ　（Ｎ−イソプロピルアミド）、
ポリ　（アクリルアミド−ヨーＮ−ビニル−２−ピロリ
ドン）および類似のコポリマー類中に分散された１種以
上の試薬を含むインジケーター組成物を含めることがで
きる。

他の任意の層、例えば下塗り層、輻射線遮断層などを必
要により含めることができる。液体中で本発明の要素の
すべてが相互に接触状態にあり、液体中の試薬と来復合
体化反応生成物が隣接層の上塗り領域間を通過できるこ
とを意味する。

アッセイは、リガンドに結合してリガンド類縁体を形成
することができるいずれか適当な標識を用いて行うこと
ができる。有用な標識類としては、放射線タグ、色素、
蛍光体類、酵素類、酵素基質類、酵素阻害剤類、アロス
テリックエフェクター類、補因子類および他の既知酵素
モデュレーター類を挙げることができる。酵素、例えば
グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ
性ホスファターゼおよびガラクトシダーゼが好ましい標
識類である。

酵素標識が使用される場合には、その酵素に対する基質
が要素に存在するかまたは洗液に加えられる。これらの
基質は、パインディング反応と同時にまたはその前後に
要素へ加えることができる。

供給された標識に対して適当な基質を測定する方法は臨
床化学分野の当業者の通常の技術範囲内にある。基質類
は、酵素標識と直接反応する物質または標識の酵素反応
を伴う一連の反応に関与する物質であることができる。

例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合には、
基質は過酸化水素である。例えばグルコースオキシダー
ゼを使用すると、一般に基質グルコースは試薬層または
洗液中に０．０１モル／ボ、好ましくはｏ、ｏｏｔ〜０
．１モル／ボの量で存在する当業者は、アッセイで使用
する酵素標識量に対して個々の基質量をどのように調整
するか知っているであろう。

特定の標識、例えば酵素、補因子、酵素基質または酵素
モデュレーターが使用される場合、試薬層は標識の反応
の結果として検出可能種を提供する１種以上の試薬を含
んでなるイ・ンジケーター組成物を含む。インジケータ
ー組成物としては、基質と酵素標識リガンド類縁体の酵
素反応の結果として比色法で検出可能種を提供する比色
インジケーター組成物が好ましい。

このインジケーター組成物は、酵素反応で検出可能色素
を提供する単一化合物または色素を生成する試薬の組み
合わせであることができる。例えば、基質としてグルコ
ースが使用され、そして酵素標識としてグルコースオキ
シダーゼが使用される場合、比色インジケーター組成物
は反応して色素を提供するカプラーおよび酸化可能な化
合物を含むことができる。また、この組成物はロイコ染
料ならびにペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダ
ーゼがグルコースをグルコン酸に転化する場合に生成さ
れる過酸化水素の形成の結果として検出可能な色素を生
ずる他の適当な過酸化水素化物様化合物を含むことがで
きる。有用なロイコ染料は当該技術分野で既知であり、
例えば米国特許第４，０８９，７４７号およびヨーロッ
パ特許公開第０１６２６８５号公報に記載されるような
ものが挙げられる。比色インジケーター組成物の具体的
な量およびその各種成分は、当業者の常識の範囲内にあ
る。

この発明の実施に際して有用なりガント類縁体は、既知
の出発原料と方法で調製するかまたは市販のものから人
手することができる。一般に、この類縁体のリガンド部
分は、共有結合を介して標識（例えば、酵素部分または
蛍光体）に結合される。

イムノアッセイは手動または自動的であることができる
。一般に、液体中のりガント量は、供給ロール、チップ
パケットまたは他の供給源から要素を取り出し、次いで
その展開層の限定領域に液体試料１〜１００ｊｌ！を物
理的に接触させて測定される。接触される限定領域は、
一般に１００ｍｍ２未満である。

リガンド類縁体が加工中に要素に組み込まれない場合に
は、試験試料が要素と接触するのと同時にまたはその前
にリガンド類縁体を混合することができる。

いずれかの態様による試料の適用後、要素は試験結果を
迅速またはその結果の人手を促進するのに必要であるか
も知れないインキュベーションまたは加熱などのいずれ
かの条件下にさらされる。

リガンド量は、複合体化リガンド類縁体を直接検出する
かまたは酵素標識と基質の酵素反応の結果形成される検
出可能種を検出するための適当な装置に要素を通過する
ことによって測定される。

例えば、これらの種は、通常の既知の方法で用いられる
適当な放射能測定装置、蛍光測定装置または分光光度計
によって検出することができる。酵素反応では、得られ
た生成物は、例えば、試験試料が接触した限定領域の中
心における反射濃度もしくは透過濃度または蛍光を測定
することによって決定する。測定される前記領域は、一
般に、競争アッセイについては直径３〜５肋である。液
体試料中のりガント量は、前記限定領域の中心で測定さ
れる標識量に反比例する。好ましい態様では、未複合体
化リガンドから複合体化リガンドを分離するのに、別に
洗浄段階が必要である。一般に標識の測定は、試料の接
触後５〜１８０秒して洗液を散布または適用した後に行
われる。

［実施例］ 以下で例でこの発明の有用性を明らかにする。

これらの例では、コアー／シェル単分散ポリマービーズ
は、各種の他のモノマー類、例えばｍ　＋ｐ−ビニルベ
ンジルクロライド、ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホ
ニルメチル）スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、ｏ
、ｍ＋ｐ−ジビニルベンゼンおよびエチレングリコール
ジメチルアクリレートと共重合されたポリスチレンを含
む。特定の単分散ビーズのモル％組成を有するビーズは
次のものであった。

１、　ポリ（スチレン−ニーｏ、ｍ＋ｐ−ジビニルベン
ゼン）（９９，４：　０．６　）を含んでなるコアーと
ポリ（スチレン−：ｌ−ｍ＋　ｐ　（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレン−旦−０，ｍ＋ｐ−ジビニ
ルベンゼン）　（９９，８：　１．２　）を含んでなる
シェル、ジゴキシンおよびフェニトインに有用。

２、　ポリ（スチレン−２−エチレングリコールジメタ
クリレート）（９９：１）を含んでなるコアーとポリ（
スチレンーコ＝ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホニル
メチル）スチレンーコーエチレングリコールジメタクリ
レート）（９３，５／　４．５　／　１　）を含んでな
るシェル、ジゴキシンおよびチロキシンに有用。

展開層の大きなビーズは、ポリ（ｍ＋ｐ−ビニルトルエ
ンーコーメタクリル酸）であった。このサイズ範囲は約
２０８〜約４０Ｊｍであった。

粘着質は、ポリ　（メチルアクリレート−２−２＝アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム
塩−ヨー２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
（９４，９：　２．１　：　３　）であった。

社−柱 ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド） ＴＥＡ　（）リエタノールアミン緩衝剤）ＭＯＰＳ　（
３−（Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸緩衝剤） ＡＬＰ　（アルカリ性ホスファターゼ）ＡＮＳ　（８−
アニリノ−１−ナフタレンスルアミノ−２−メチル−１
−プロパツール（１，５Ｍ　。

ｐＨ１０，３）　中Ｐ−ニトロフェニルホスフェート基
質（１５ｍＭ）を含んでなる。

チロキシン−ＡＬＰ結合体は、Ｍ、　ＩｔｏらのＣｌ１
ｎ。

Ｃｈｅｍ、、　３０．１６８２〜１６８５ページ（１９
８４）の方法で調製した。

フェニトイン−ＡＬＰ結合体は、５，５−ジフェニルヒ
ダントイン−３−（ω−吉草ｖ＞　を用いるＢ、　Ｆ、
　ＥｒｌａｎｇｅｒらのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、
、　２３４．１０９０ページ（１９５９）の方法によっ
て調製した。

他の材料は次のものであった。

Ｚｏｎｙｌ　（商標）ＦＳＮ界面活性剤（ＤｕＦｏｎｔ
。

Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｄｅｌａｗａｒｅ　Ｕ、Ｓ、
Ａ）、Ｔｒｉｔｏｎ　（商標）Ｘ−１００界面活性剤（
Ｒｏｈｍ　＆Ｈｎａｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、
　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ）、ならび
に残りは１ｌｉａｓｔｎ＋ａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、製
（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ）または既知の出発原
料および方法で調製した。

この明細書で使用する１、Ｕ、は酵素活性の国際単位を
表し、Ｉｌ、υ、は酵素に対する標準的なｐＨと温度条
件下で１分当たり基質１マイクロモル（μ＋＋＋ｏｌｅ
）の転化を触媒するのに要する酵素活性量として定義し
た。

要素の水溶性ポリマー層は、いずれかの水溶性ポリマー
を含んでなる。好ましいポリマーは、ボリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポ
リ　（アクリルア〔ドーコーＮ−ビニルー２−ピロリド
ン）もしくはゼラチンまたはこれらのポリマー類の組み
合わされたものである。

鼾　チロキシン　Ｔ４）のアッセイ この例は、３層フォーマットと分離した洗浄段階を用い
るＴ４の競争イムノアッセイを具体的に説明する。次の
要素構造はＴ４のアッセイに有用である。

塗布量（ｇ／ｒｙｆ） 大きなピース ３０ ５−２００ ポリビニルピロリドン ０二０８ ０．０２ ０．２ Ｘ−１００ ０，０５ ０、Ｏｌ ０．２ 粘着質 −１５ ＴＥＡ（ｐＨ ７，５） ０．１５ ０．０１ ＳＡ ０．０５ ０．０１ −０．２ Ｘ ００ ０．０１ ０．００５ ０．０５ ｇＣｂ ０．０２ ０．０１ ０．０５ Ｘ−１００ ０，０２ ０，０１ １，０ Ｘ１０ ５Ｍから２Ｘ１０ Ｍまで濃度変化する 一連のＴ４標準を、ＤＭＳＯ中Ｉ　Ｘｌ０−’Ｍ　Ｔ４
保存液から下記に記載の緩衝剤で調製した。この緩衝剤
は、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，，４）ならびに
ウシ血清アルブミン（１％）およびＡＮＳ（８，７ＸＩ
Ｏ−’Ｍ）から構成した。Ｔ、−ＡＬＰ結合結合液溶液
１゜０ＸＩＯ−”Ｍの濃度で調製した。これらのＴ４液
とＴ４−ＡＬＰ溶液をｌ対１で混合し、Ｔ４−ＡＬＰの
最終濃度を５　Ｘｌ０−９Ｍとした。

１０ＩＪ１のアリコートをＴ４要素上にスポットした。

３７°Ｃで５分後、洗液（１０ｍ）を加えて要素の中心
からパインデイグしていないＴ、−ＡＬＰを洗い出した
。１分後、３７”Ｃで４００ｎｍにて要素の中心で３０
秒間ΔＤＲを測定した。ウイルアムスークラッパー（Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換（Ｊ、　Ｏｔｉ
ｃａｌ　Ｓａｃ＾ｍ、、　４３．５９５ページ（１９５
３）　）を使用してＤ７値に変換した。結果を第２表に
示した。

策１表 Ｔ４濃度　　　　変化率（ΔＤア／分）Ｉ　Ｘｌ０−”
　Ｍ　　　　　　Ｏ，０２８９１Ｘｌ０−９Ｍ　　　　
　　　Ｏ，０２９３１Ｘｌ０−８Ｍ　　　　　　　Ｏ，
０２６３１Ｘｌ０−７Ｍ　　　　　　　Ｏ，０１８２１
Ｘｌ０−６Ｍ　　　　　　　Ｏ，００７４１Ｘｌ０−５
Ｍ　　　　　　　Ｏ，００１２この例は１、測定された
Ｔ４のレベルの関数としての変化率において改良された
変化を示す。

奥１　フェニトインのアッセイ 以下の要素は、フェニトインのアッセイに有用である。

塗布量（ｇ７／ポ） 好ましい例　　範　囲 下塗り 層 Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００ ｔｒインダー セラチン ＴＥＡ、　　ｐＨ７，５ ＢＳ八 Ｚｏｎｙｌ　　ＦＳＮ ＭｇＣ１□ ｎＣ１ｚ ０．０５ ０．２ ０．０５ ０．１ ０．０１ ０．０２ ０．０２−０．２ −１５ ０．２−５ ０．０５−１ ０．０１−０．２ ０．０５−０．５ ０．００５−０．０５ ０．００５−０．０５ セラチン層硬化セラチン ＴＥＡ、　　ｐＨ７，５ Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００ ０ −２０ ０，８０，０１−１，０ ０，０２０，０１−０，１ この例は、３層フォーマットを用いるフェニトインの放
射状洗浄イムノアッセイを具体的に説明する。０．１５
Ｍ塩化ナトリウム（Ｎａｃｌ）中復数のフェニトイン標
準と０．１％ウシ血清アルブミンを含む第１の一連の水
性溶液を調製した。これらの溶液を緩衝溶液（０，０２
Ｍ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，０，１５Ｍ　Ｎａｃｌおよび
２％ＢＳＡ）と１：１で混合した。第２の一連の水性溶
液を上記のように調製し、１０ｎＭフェニトインーアル
カリ性ホスファターゼ結合物を含ました緩衝溶液と１＝
１で混合した。

第１の一連のフェニトイン標準（１０ｊ１１アリコート
）を前記結合物を組み入れた要素上にスポットした。第
２の一連のフェニトイン標準（１０Ｉｌｌアリコート）
を前記結合物を組み入れていない要素上にスポットした
。３７°Ｃで５分インキュベーション後、洗液（１０Ｉ
ｌｌ）を要素に加えてスポットの中心からパインディン
グしていない前記結合物を洗い出した。３７°Ｃで１分
後、４００ｒ＋ｍにおける反射濃度（ΔＤ、）の変化を
スポットの中心で３０秒かけて測定した。

結果を第３表に示す。

１　ｘｌＯ−９０，０３２１０，０３６１１ｘｌＯ−８
０，０３１４０，０３３０１ｘｌＯ−７０，０２９３０
，０３１５１ｘｌＯ−６０，０２０９０，０２２９１ｘ
ｌＯ−５０，０１６００，００７６１ｘｌＯ−’　　　
　　　　０．００４４　　　　　　−０．００２４〔発
明の効果〕 この発明は、非常に改良されたイムノアッセイ用要素を
提供する。小さなポリマービーズは、いずれかのイムノ
アッセイに必要な受容体濃度の収容に必要な表面積を提
供する。これらのビーズは、抗体のような受容体を固定
化するのに必要な表面反応性官能基を提供するポリマー
から調製される。

さらに、これらのビーズは受容体の付着を阻害し、そし
てまた受容体をマスクする界面活性剤および乳化剤など
の物質を含まない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、支持体と展開層を含んでなるイムノアッセイ用分析
   要素であって、 （ａ）前記展開層に適用される液体の均一な拡散を促進
   するような１０〜２００μｍの範囲内の直径を有する比
   較的大きなポリマービーズの第１集団、ならびに （ｂ）（ｉ）０．１〜５μｍの範囲内の直径を有し、（
   ｉｉ）表面反応性基を介してビーズ表面に共有結合した
   レセプター類を有し、そして（ｉｉｉ）残留物質がない
   表面を有する比較的小さなポリマービーズの第２集団を
   含むことを特徴とする要素。 ２、展開層が、ポリマービーズの第１集団および第２集
   団の両方を含んでなる請求項１記載の要素。 ３、ポリマービーズの第２集団が、展開層の上層または
   下層として配置されている請求項１記載の要素。 ４、展開層が、（ａ）インジケーター組成物用試薬、（
   ｂ）隣接ビーズの表面を介して相互に結合して凝集し、
   水性液体中で実質的に非膨潤性である三次元格子を形成
   するポリマービーズの第１集団を含む粒状構造体、なら
   びに（ｃ）ポリマービーズの第２集団を含んでなる請求
   項３記載の要素。 ５、Ａ、標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開
   層の限定された領域に接触してその限定された領域内に
   固定化されたリガンド−受容体複合体を形成し、そして
   液体の拡散によって前記固定化された複合体から未複合
   体化リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに Ｂ、工程Ａの終了後、前記限定された領域の中心にある
   前記固定化された複合体を測定する工程、を含んでなる
   請求項１から４のいずれかに記載の分析要素による液体
   中の免疫反応性リガンドのアッセイ方法。