JPS58214855A - 免疫分析用分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免役化学的分析法に関し、更に詳しくは、酸素
免疫分析用分析素子に関する。

生物学的流体試料、例えば面沿、尿、１ノンノく液中に
存在する種々の化合物は、医学の進歩、に従って疾患と
の関係が明らかＫなるにつれ種々＋７）　ｆｆ１ｌｌ定
法の開発がなされてきた。

上記分析方法は、通常の分析化学で用いられている手段
が行なわれてきたが、生物学的流体試料中には種々の化
合物が測定対象物と共存した状態にあり、あ２、ものは
９似化合物として正の誤差を与え、また他のものは防害
物質として負の誤差を与え、その測定精度に問題があっ
た。このため、より分析反応の特異性を高めるために酵
素を用いた生化学的分析法が用いられるようになでた。

しかしながら、酵素反応を用いる分析方法も、その検出
限界において問題があり、極微量σ）分析対象化合物に
対しては限界があること７５辺知らしている。

そこで、該流体試料中σ）極微量σ）化合物を潰１１定
するための方法の開発が必要とされてさた。

この分析方法は、主として免役反応をその原理とするも
のである。すなわち、免疫反応を起しうるものとしては
、例えば抗原、抗体、・・ブテン抗原補体等が挙けられ
、例えば血清中に存在する免役活性物質（以下、抗原と
略す）と該免疫活性物質と特異的に結合する物質（以下
、抗体と略す）との特異的結合反応（即ち、免疫反Ｚ）
を用いるものである。上記原理を用いる測定法として種
々のものが開発されてきたが、最も精度の高いものとし
ては免疫測定法（以下、イムノアッセイと略す）が知ら
れている 上記のイムノアフセイに、１９５８年、Ｂｅｒｓｏｎと
ＹｅｌｌＯｗ　が放射性ヨードで標識したウシインスリ
ンと糖尿病患者血清中の抗インスリン抗体を用いて血清
中のインスリ／を抑１定することに成功していらい奴射
兜疫６（ｊ定法（ラジλ・１ムノアツセイ、ＲＩＡと略
記する）が広く用いられている。しかしながら、上記Ｒ
ＩＡば、その感度および樗度の良さに反して悸は化合物
に放射性同位元素を用いるために種々の不都合があるこ
とも事実でりる、すなわち、放射性同位元素を扱うため
に、通常の実験設備を脣する実験室では操作か不可能で
るり、専用の実験設備を設置する必要かあり、また放射
性同位元素による放射能被爆に笑験者は留意せねばなら
ず、更にその廃液は画然のことながら環境に対して放射
能汚染を引き起こすという欠点を有している、このため
、放射性同位元素以外の標識化合物の開発がなぢれてき
た。例えば該化合物としては、酵素、酵素基質、補酵素
、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金
属および有機金璃の錯体、有機補欠分子族、化学発光性
反応体および螢光性分子等が挙けられる。

一方、イムノアッセイの他の重要な問題点としては、結
合にあずからなかった標識抗原（以■、Ｆｒｅｅと略す
）と結合した標識抗原−抗本複合本（以下、Ｂｏｕｎｄ
と略記する）の分離に関してであり、更には、いずれの
標識化合物を用いたイムノアッセイも溶液中で反応を行
なわしめる浴沿反応（ワエット　ケばストリイ）である
という点が指摘される。

前者の欠点を解決するために、抗原または抗体を種々の
水不溶性担体に担持した不溶化試薬の開発もなされてい
るっ 例えば不溶化試薬に用いる担体として、セルロース、架
橋テキストラン、架橋アクリルアミドの如き天然または
合成高分子物質の微粒子を用いるもの〃・する。しかし
ながら、前記Ｂ／Ｆ分離の際には通常遠心分離を必要と
し、また分離した試薬を十分に洗浄することが必序であ
り、操作に十分な熟練と多大の労力を要するという欠点
ヲ有する。

更に別の不溶化試薬の列として、過当な寸法、形状に成
形したプラスチ９りやガラスをｆｆ１Ｋに用い罠ものや
、試験管の内面を担体に利用したものがある。しかしな
から、上記不溶化試薬は倣粒状試薬に比へて比表面積か
小さく、このだめ、抗体または抗原の担持量が少なくな
り、互だその童のバラツキも避けかたいので、その結果
側定範囲か狭くて、かつ古現性、鞘匿も低化しゃ丁いと
いう欠点を有している。

また後者の欠点に対しては、現在まで弔効な解決法か見
い出ちれてふ・らず、促−・て礫作注はよくないはかり
でなく、環境汚染の問題が常につさ１と−・ている塊状
にろる。

一本発明者らは、上記欠点を解決するために鋭意検討を
重ねた結果、本発明を完成するに至った。

不発明によれは、本発明の前記目的は液体不浸透性、光
透過性支持体の一側に位置し、親水性コロイドから成る
少なくとも一種の検知反応のための試薬を含有する少な
くとも一層の検知層と、該検知層の該支持体とは反対側
に位置し、流体試料中の免疫活性物質と特異的に結合す
る物質を含有する少なくとも一層の免疫反応層を有する
免疫分析用分析素子において、該免疫反応層が該流体と
自由に埃触する相互連絡空隙構造を有し、そσ〕空隙率
が約２５乃至８５パーセントであり、該流体に対して実
質的に非膨潤性三次元格子であり、かつ該免疫反応層の
該流体と接触する表面に該流体中の免疫活性物質と特異
的に結合する物質を担持した免役分析中分析素子により
達成し得ること刀）判った。

以下に本発明を史に詳細に祝明する。

本究明に係る免疫反応層は、かｆ、ネ試料と自由に接触
することができる空隙率が約５乃至８５％の相互連絡空
隙構造を有し、流体に対して実質的に非膨潤性三次元格
子をなすものが用いられる。

そのし１」としては、布、１紙、カラス繊維を紙、ミク
ロフィルター（商品名にミリポアとして知られている）
等を挙けることができる。しかし、これらの素材は前記
の如き空隙を有する利点はあるが、同時に後述の検知層
・と積層する必登性があることから物理的に圧力を加え
て張り合わせることになり、圧力を刃口えると検知層の
膜厚を不均一にするという欠点をもつことになる。検知
層の膜厚が不均一になると必然的に検知反応のｆ＃度を
著しく阻害することになり好ましくないので、免疫反応
層を形成する場合には塗布による方法が望ましい。

このような層の形成方法に関しては、例えば特開昭５５
−９０８５９号、特願昭５５−１７９６１３号ならひに
同５５−１７９６１４号等に記載があるか、上記特開昭
５５−９０８５９号によれ（グ熱安定性で、かつ流体試
料に河して非膨潤性で不浸透性の有機合成高分子重合体
粒子を、上記の粒子より熱軟化点が低く、η１つ粒径が
小さい有機合成高分子重合体粒子（例えは合成ラテック
ス）を接着剤として用いて塗布することにより粒子構造
体を形成せしめることが開示されている。

しかしながら、上記接着剤となるラテックスは熱安定性
重合体粒子同志の接触界面に一様に配置させることが難
かしく、空隙を埋めてしまう傾向があり、更にその構造
が脆弱であるという欠点を有することが知られている。

本発明に係る免疫反応層の好ましいものと（、て特願昭
５．５−１７９６１３号および同５５−１７９６１４号
に記載された形成方法を挙げることがでＡる。

上記刊行物のうち前者は、面体試料に灼し１非膨潤性、
不浸透性である表面に官忙基を有する熱安定性声磯合成
高分子重合体粒子単位を該表面の官能基と反応する官能
基を有する多官能性低分子化合物により結合させたもの
に関する記載であり、また後者は上記と同様の粒子単位
を粒子電位表面の官能基−志で直接結合させたものに闇
する記載である。

更には％願昭５６−１５５７８８号、同５７−５１９２
号等に記載のある試薬層も免疫反応層として用いること
ができる。

上記刊行物の記載による免疫反応層は何れも流体試料に
対して非膨潤性で不浸透性の核に親水性の殻を有する核
殻多層構造を壱する粒子単位を用いるものであり、この
粒子単位の殻部分の粘着力により強固ｔ゛結合有するも
のである。

上記の核の構成物質としては合成高分子化合物、ガラス
、無機顔料等が用いられる。また親水性股部分を構成す
る素材としては、例えばゼラチン、酸処理のゼラチンの
如きセラチン類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロ
キシエチルセルロース等の水浴性セルロース誘導体類、
プルラン、カルボキシメチルプルラン等のプルラン誘導
体類、ポリビニルアルコール、ホリビニルヒａリド／、
ボリア・クリルアミド、ポリアクリルアミド等の水溶性
とニルポリマー類等が挙けられる。

更に前述の粒子単位の観水性殻表面には電離性放射線ま
たは光礫橋性官能基を導入することか可能であろうこれ
ら官能基は特公昭５６−５７６１号、同５６−５７６２
号および同５６−５７６３号に詳細に記載されている。

上記島分子重合体粒子単位は、そのサイズが好ましくは
約１乃至３５０ミクロンであり、これら粒子単位は相互
連絡空隙を含む三次元格子である粒子結合体を形成し、
かつ空隙体積の合計が約５乃至８５％である一 本発明に係る流体不浸透性、非膨潤性粒子結合体は前記
流体が実質的に浸透しないことを示し、かつ非膨潤性と
に流体に接触した時に実質的に膨潤性を示埒ないものを
いう。このＷｅ潤性の度合は例えＪｄ　Ａ−Ｇｒｅｅｎ
およびＧ、工、Ｐ、ＴＪｅＶｅｎＳＯｎ　　者Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｓｉ・＝ｎ
ｃａ　　第’ｌｊＪ巻、　第２０５頁（１９７２年）に
示される型の膨潤計を使用し、所望の流体下で測定する
ことができる。即ちポリエチレンテレフタレート支持体
の如き通話な支持体上に、（１）粒子材料として用いる
ことを考慮中の高分子重合体の自己支持性フィルムか、
でたに、（２）加乃至３５０ミクロンの範囲内の乾燥膜
厚の層を形成し、前記膨潤置針を用い、該フィルムまた
は層を関℃の液浴に約２．５分間浸すことにより生じる
フィルムまたは層の厚さぁ増加パーセントを測定する。

これらの方法により測定された膨潤度が約加％未満、好
ましくは約【０％未満のものが好ましい高分子重合体粒
子材料として用いることができる。

本発明に係る粒子結合体を構成する高分子重合体粒子単
位のサイズは上述の範囲内で広く可変であり、徨々のサ
イズのものを混合して用いることも可能であるが、好ま
しい態碌でＩゴ、こｎら粒子単位は実質的に均一サイズ
である。好ましくは粒子単位表面は白面状であり、より
好ｔＬ＜は実質的に球状である。有機画分子重合陸粒子
率位のサイズにより、ある程度相互連絡空隙構造層に含
まれる空隙の孔径が規制される。

上記高分子重合体粒子単位の粒径は、そのサイズか好ま
しくは約１乃至３５０ミクロンであり、これら粒子単位
は相互連絡空隙を含む三次元格子でるる粒子結合体を形
成し、かつ空隙体積の曾計、たその空隙を形成する孔は
、該粒子単位の粒径にある程度依存する。即ち、孔径は
該粒子単位の粒径の約１／２乃至ｌＡＯ程度であり、ま
た孔径は被測定物質によって適宜選択されるべきである
。

更に本発明の分析素子における免役反応層は、用いる粒
子単位の粒径を変化させることで、その表面積を容易に
変化させることが可能である。また該層の膜厚を変化さ
せることでも自由に表面積を変化させることが可能であ
る。これによって担持される抗体量を自由にコントロー
ルすることができるという特徴を有している。

本発明に用いられる前述の粒子単位の合成に関しては、
前記刊行物に詳細に記載されており、これらに従って容
易に合成することができる。

本発明に係る粒子単位表面は、抗体または抗原を担持す
ることができる。担持の方法は、例えは物理吸着による
方法および化学結合に・よる方法がある。

上記物理吸着による方法では、抗体または抗原を水また
は適当な緩ｓ俵に溶解させた水浴系に本発明に係る粒子
単位を浸漬して吸着させる。この際緩衝液は、０．０１
乃至ＩＭ程度の適当な緩衝液を用いることができる。ま
た、吸着させる物質の濃度は約０．００１％乃至１．０
％の範囲でるり、表面を十分に清浄にした上記の粒子単
位を浸漬し吸着させる。

上記吸着のための温度は、室温ま７２：はそれ以下が好
ましく、また時間Ｉａ、１０時間乃至１００時間が好ま
しい。

得られた粒子単位は該溶液から分離の後、水または適当
な緩衝液で洗浄し、吸着にあづからなかった抗体または
抗原を洗浄する。

一方、化学結合を用いる方法とし７ては、抗体または抗
原を本発明に係る粒子単位表面へ多官能試薬を用いて結
合させる。また、特願昭５５−１７９６１３号および同
５５−１７９６１４号に記載の反応性基を有する粒子単
位の場合、該粒子表面の反応性基へ直接結合させること
も可能である。こｎらσ〕方法は、例えば千畑一部ｓｒ
固定化酵素Ｊ　（１９７５年講談社刊）に記載されてい
る酵素等の固定化技術を応用することができる。−例を
挙げれば、ジアゾ化法、アミド化法、アルキル化法およ
びグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジイソシアネー
トを用いる方法等がある。

更に本発明に係る粒子単位には必要に応じて免疫反応に
おける非特異的反応を排除する目的で。

測定すべき抗原または抗体による免疫反応に関与しない
蛋白質を担持することも可能である。これら蛋白質の代
表的な例としてに、補乳動物の正常血清タンパク質、ア
ルブミン、ゼラチンおよびゼラチン分解物等が挙けられ
る。また、これら蛋白質の担持方法扛前述と同様に物理
ＯｉＬ看法および化学結合法を適宜用いることができる
。

更に前述の抗原または抗体と上記非免役性蛋白質の本発
明に係る粒子単位への担持は別々または同時に行なうこ
とができ゛る。

不発明の免役分析用分析素子の前記区域を構成する粒子
結合体は、種々の方法を用いて製造することが可能であ
る。好ましい方法の１つとして、下記の工程を挙げるこ
とができる。

（１）　本発明の粒子単位を該粒子を＃解しない液体キ
ャリヤーに分散し安定な分散液を調製し、に）　この安
定な分散液を支持体に適用し、そして（３）　　粒子単
位を適当な温度で、該粒子単位同志の納会を起こさせな
がらｆｉ１２Ｂキャリヤーを除去する。′ “安定な分散液′とは、粒子単位同志が凝集塊を形成す
ることｌ〈キャリヤー中に存在することを意味する。粒
子結合体構造層を製造するために有用な分散液は、同分
散液を支持年上に適用するに十分な時間、安定である必
要がある１、不発明に係る粒子単位は分散液の液体キャ
リヤーを除去する際に該粒子単位同志の接触で結合させ
ることにより粒子結合体を製造するものであるが、結合
を起こさせる触媒、たとえは酸アルカリを分散液中に存
在させることは有用である。特に酸触媒のうち揮発性酸
触Ｉｓ（例えは酢酸等）その他を用いることは有用であ
る。また９体キャリヤーを除去する操作に、粒子単位の
熱安定性温度以下および免疫活性物質と特異的に結合す
る物質の失活する温度以下であることが望ましいが、好
ましくはＩＯ乃至７０℃の温度により実施することがで
きる。

前記分散液のｗｌ、体キャリヤーは、水性ｙ１体を用い
ることができる。しかしながら、該粒子単位がキャリヤ
ーに不溶性であり、従って、それらの粒状特性が保持さ
れるという条件で種々の有機液体のような他のｍｌキャ
リヤーも使用可能である。

水以外の代表的な液体キャリヤーには、水混和性有機溶
媒、水と水混和性有機溶媒の水性混和物および適当な水
不混和性有機溶媒がある。水混和性有機溶媒には低級ア
ルコール（即ち、アルキル基の炭素数１乃至４個のアル
コール）、アセトンおよびテトラヒドロフランがめる。

水不混和性溶媒には酢酸エチルの如き低級アルキルエス
テル、およびハロゲン化炭化水素（例えばクロロホルム
塩化メチレンおよび四塩化炭素等）の如きハロケン化有
機溶媒がある。

このような安定な分散液を製造するためには、多くの方
法を単独または組合わせて用いることが可能で壱る。例
えば有用な方法の一つとして界面活性剤を液体キャリヤ
ーへ添加し粒子単位の分散液中における分布および安定
化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例とし、ては、１”う
（トン■ｘ７１００（ロームアンドハース社製オクチル
フェノキシポリエトキシエタノール）サーファクタント
ＩＯＧ■（オリーン社Ｂ）ニルフェノキシポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された童を用いることが可
能であるが、重合体粒子単位の重量に対してｔｏ　ｌｉ
　ｔ　バーセント乃至０．００５重量パーセント好まし
くは６重量パーセント乃至０．０５重量パーセント用い
ることができる。史に別の方法として該粒子単位とｍｌ
キャリヤーの音波処理、物理的混合、および物理的攪拌
処理、ｐＨ調製がある、これらに前記の方法と組合わせ
ることにより、さらに有用である。

本発明の粒子結合体の区域を有する分析素子は例えに浸
漬塗布法、エアーナイフ法、カーテン塗布法または米国
特許第２，６８１，２９４号明細書に記載の如きホッパ
ーを用いる押し出し塗布法等各棟の塗布法で堕布するこ
とが可能であり、所望により二層またはそれ以上の層を
米ｉ特許第２，７６１゜７９１号および英国特許ｉｇ　
８３７　、０９５号明ｋＪ誉に記載の方法で同時に塗布
することもできる。

本発明の分析素子の免疫反応層は、免疫反応（即ち、抗
原−抗体反応）を行なわしめるのみならす、試料のピペ
ッティングによる誤差を回避するためにも有用な層であ
る。即ち、一定の空隙率を有する相互連絡空隙を有する
上記層は単位面積当り一定容量の試料を収納することが
できる。例えは試料が多けれは該膚の収納面積が広がり
、また少ない場合に狭くなるので、いつも単位面積当り
一定容量を免疫反応層へ供給することが可能である。

更に本発明の分析素子の免疫反応層は前述の効果以外に
検知反応を反射分元元度測定するためのバー７タグラワ
ンドを形成するものである。このため種々の染料または
顔料をその目的に応じて該粒子単位中に含有することが
可能である。例えは上記染料または顔料とし、ては、二
酸化チタン、硫酸マグネシワム、カーボンブラック等を
挙けることができる。

本発明罠係る検知層は、検知反応のための少なくとも一
種の試薬を含有する少なくとも一層の親水性コロイドか
ら成るものである。

検知反応のための試薬とは、酵素免役測定法（エンサイ
ムイムノアウセイ　ＥＩＡと略す。）の標識化合物であ
る酵素と協同作用によって種々の量として検知するだめ
の反応を構成する試薬を指す。これらは標識された酵素
によって瞠定されるものであるが、例えば酵、素基質、
合成基質、補酵素、色原体、標識さｎた酵素と協働する
酵素等が卒けられる、。

上記試薬は、親水性コロイドから成るバインダー中に溶
解、あるいは分散し塗布准とすることができる。特に疎
水性化合物の分散には写真業界で多用されているオイル
プロテクト分散法、直接分散法等棟々の公知の分散法を
用いることができる。

丈に本発明に係る検知層に用いられる親水性コロイドは
、セラチン、フタル化セラチン等のセラチン誘導体、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルイミダゾール、ポリアクリルアミド等の合成高分子、
ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリワム塩等のセルロース誘４陣等の多糖類等が
挙げられる。そして好ましくはゼラチン、フタル化ゼラ
チン等のゼラチン誘４体が挙けらｎる１、更に不発明に
係る検知層のバインダーは、その膜物性、例えば膨潤度
や熱による溶解性の改良のために一部を他の水分散性高
分子重合体、即ち高分子ラテックスと置換すること刀−
でさる。好ましい高分子ラテ・・クスの列としては、例
えば特願昭５６−１９３１号、同５６−１７７５９６号
記載のものが有用である。これらの高分子ラテーｌクス
に、親水性コロイドバインダーの最大７０パーセントを
置換することが可能であるが、好ましくは酌量パーセン
ト以下の置換である該検知層には他の添加剤、例えば緩
衝剤、保恒剤、硬膜剤、界面活性剤等を目的に応じて添
加することができる。

また、その膜厚は約３乃至約箕ミクロン、好ましくは約
３０乃至約５ミクロンである。

上記検知層の層形成に除しても免疫反応層と同様に浸漬
塗布法、エアーナイフ塗布法、カーテン塗布法、スライ
ドホラパー塗布法等が用いられる。

本発明の免疫分析用分析素子は、沿体不浸透性、光透過
性の支持体上に検知層、免疫反応層を順次塗布して成る
ものである。

不発明に用いられる支持体は上述の条件を満たすもので
あｎば１町でｔ中いることかでさるが、例えば酢酸セル
ロース、ポリスチレンテレフ〉レート、ポリスチレン、
ホリカーボネート等の高分子重合体やガラスの如きもの
が挙げられる。支持体の選択は結果検出の様式、即ち伏
仰反応によ−て選択きれるものである。即ち、検知反応
の結果検出が可視光領域で行なわれる場合には可視光領
域に吸収を有しないものがよく、また紫外光領域で行わ
れる場合も同様に検出のだめの波長領域に吸収を有しな
いものがよい。更に螢光検出の場合は励起光および発螢
光の領域に吸収を有しないものを選択することが必須で
ある。

本発明の分析素子は各種の機能層、試薬含有島および部
材、例えは米国特許第３，９９２，１５８号記載の試薬
層、濾過層、反射層、下塗り層、同第４．０４２，３３
５号記載の放射線プロ・ツタキング層、同第４，０６６
．４０３号記載のバリヤ一層、　同第４．１４４，３０
６号記載のレジストレーション層、同第４．１６６．０
９３号記載のマイグレーション阻止層、同第４，１２７
，４９９号記載のシンチレーション島、特開昭５５−９
０８５９号記載の清掃層および米国特許第４，１１０，
０７９号記載の破壊性ボウド状部材等を任意に組合わせ
て本発明の目的に合わせた分析素子を構成することが可
能である。

前記層の製造法および前記層の本発明の分が素子への組
み込み法ニ前記刊行物に記載の方云と同じであるか、ま
たは類似である。。

本発明の分析素子に適用されるイムノアンセイは酵素免
疫測定法である。この酵素免疫測定法、すなわちＥＩＡ
は、その反応様式知より競合法、サンドイツチ法、二抗
体法等が挙げら才りるが、これら全ての様式に適用する
ことができる。＝！り、標識化合物である酵素に公知の
酵素、列えに一例トシてグルコースオキンターセ、ベル
オそシダーセ等の酸化酵素、アルカリホスファターセ、
Ｉ−り一力うクトシダーゼ等が挙けられる。標識化合物
としての酵素および酵素と抗原または抗体との結合を含
むＥ　Ｉ　Ａに関する実際についてに、石川栄治、河合
志、宮井潔湖集　「酵素免疫測定法」（１９７８年医学
香院刊）に詳細に北部されている本発明の兄す：分町用
分析素子を剛いたＥＩＡの操作法について競合法を例に
説明する。

（１）　　血清サンフル（または標準数）および酔素非
識抗原を一定量分取混合し、盃発明の分析素子の免疫反
応層に一定量を滴下する。（土ｇＣ試料に　゛必侵に応
じて希釈額を加えることも＝Ｊｉ仁である）（２）上記
分析素子を一定温丸で一定時向インキーペーションを朽
７ｉ−った後、分析素子の免役反応層を洗浄する。

（３）洗浄後乾燥するか、またはそのまま基質溶液（必
要に応じて他の試薬を同時に）を−足置部下し一定温度
一定時間インキュペーションを行なう。

（４）　　インキュベーション終了後、支持体側から反
射分光光度測定を行なう。

当然の事ながら最後の側足は、酵素反応により色素を形
成する場合、反射分光光度演１」定を行なうが螢光物質
を生成またｆ′：ｉ減少する場合には反射分光光度測定
を行ない、また発光反応の硬合は発光測定を行なう。

本発明の免疫分析用分析素子な、榎々のＥＩＡに適用す
ることが可能でるるか、好ましくは標識化合物としての
酵素は酸化酵素、例えはグルコースオキシターゼ、ペル
オキシダーゼ等がｉｆｆられる。また検知反応のための
芭原陣は酸化カップリング等の酸化反応により色素を形
成するものなら何でも用いることは可能であるが、好ま
しくに特＃ｍ５５−１７１８７２号、同５５１７ｉ８７
３号、同５５−１７１８７４号および同５５−１７１８
７５号に記載の耐拡散性カプラーおよびカラー現像剤の
組合わせを挙げることができる。これらは発色速度が早
く分子吸光係数が大きくて、生成した色素が検知層内を
移動することがないので微量成分の検出に最適であり良
好なものである。

本発明の分析素子は、血清、尿、リンパ腋等の生物学的
流体試料に適用することができる。また該流体試料に約
２００乃至約５　ａ−１、好ましくは約艶乃至約８ｐｌ
であるが、一般的には約加乃至約１０μｍを適用する。

本発明の分析素子の使用分野は特に制限はない。

抗原、抗体、ハプテン、補体等のＥ　Ｉ　Ａに通した測
定対象ならイロ」でも用いることができる。例えばα−
１−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、免疫グロブリンＧ、Ａ、Ｍ、（工ｇＧ。

ＩｇＡ、工ｇＭ　）等の血清蛋白質、インスリン成長ホ
ルモン等のホルモン、ステロイドホルモン、ＨＢ抗原等
のワイルス、更にチオフェリン等の薬物等の広範囲な分
野に使用できるっ 本発明の分析素子に、その製造が容易でバシクグ′ラウ
ンドが小さく測定範囲が広く、かつ再現性がきわめて良
好であるばかりでなく、試料のピペッティングの誤差が
ほとんどない乾式のＥＩＡを達成することが可能である
。

以下に本発明の免疫分析用分析素子を実施例をも−・て
詳細に説明するが、これによって本発明が何ら限定され
るものでＶ′ｉない。

実施例−１ 透明な膜厚約１８０ミクロンの下塗り済みポリエチレン
テレフタレート支持体上に下記組成の塗亜液を塗布した
。

〔塗布液組成〕

脱イオン化セラチン　　　　　　　　４．４９コポリ（
メチルアクリレート−３− アクリロイルオキシプロパン−ス ルホン酸ナトリウムー２−７セｌ− アセトキシエチルアクリレート） （重量比８８．７５　：　４．７５　：　６．５）　　
　４．４　Ｆ２．４−シクロロー：３−メチル−６ −〔α−（２，４−ジーｔ−アミル フェノキシ）ブチルアミド〕 フェノール　　　　　　　　　　　３．０９ジエチルラ
ワラミド　　　　　　　　１．５９ジメドン　　　　　
　　　　　　　　　　０．１３ｇビスヒニルスルホニル
メチルエーテル０−１６．９上記組成液を０．０１　Ｍ
　Ｉ）ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝　７．０　）で１
００尼にしたものを乾燥膜厚［０ミクロンになるように
塗布を行ない検知層とした。

次いで、平均粒径加ミクロンのコポリ（スチレン−ｎ−
ブチルメタアクリレート−グリシジルメタアクリレート
）（７５：１５：［０重量％）にワサギ抗ヒトα−１−
７エトフロテイン抗ｆｔ（抗ＡＦｐ抗体と略す。デンマ
ーク　ダコパツク社）および牛血清アルブミンを吸着さ
せたものを調製し、下記組成の塗布液を作成した。

〔塗布液組成〕

抗ＡＦＰ抗本吸着　粒子単位　　　　１０＆Ｔｒｉｔｏ
ｎｘ　−１００ （ノニオン界面活性剤　ロームアンド・・−ス社襄）０
．５ｇＯ，ＯＩＭリン酸ナトリウに緩衝敵（ｐｈ　７．
０　）　　　９．Ｆ１紅上記塗布准を検知層上に乾燥膜
厚約３５０ミクロンになるように塗布を行ない４０℃で
乾燥し免疫反応層とした。

また酵素標識抗原はヒトα−１−フェトプロティン（デ
ンマークコパック社）に西洋ワサビペルオキシダーゼ（
長瀬生化学工業■）をゲルタールアルデヒドを用い結合
し、常法に従って反応物を精製し、得られた酵素標識抗
原は後述するＡＦＰ標準数の最高濃度＜　Ａ　Ｆ　Ｐ　
８００　ｎ９／ｒａｔ；　）における反射濃度辿１定が
いずれの場合でも十分可能な範囲に帆０１Ｍリン酸ナト
リワム緩衝ｇ（但し、十皿清アルブミン０．１％含有　
ｐＨ７，０以下、緩衝液Ａと略す）で希釈調製し使用に
供した。

（１）ＡＦＰの測定 上述の酵素標識抗原に標準ＡＦＰ（テンマークダコバッ
ク社製）を加え、標準ＡＦＰの濃度がＯ〜８００訪／ｍ
／、の所定摂尻になるように調製した各々の標準溶液１
０μｍを不発明の免役分析用分析素子の免疫反応層上に
滴下し、３７℃、加分間インキュベーションヲ行ｆｚつ
だ。インキュベーション終了後、緩衝液Ａを用い免疫反
応層を洗浄し、乾燥の後基質溶赦（過酸化水素０．０２
％Ｎ、Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン０．Ｏ１
％ヲ含ム０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液）を１０．
ａｆ７１０え、３７℃、加分間インキュベーションを行
なった後、ただちにサクラ光電濃度計ＰＤＡ−６５（小
西六写真工業■製）で赤色フィルター（λｍａｘ　＝　
６４４　ｎｍ）を用いて支持体側から反射濃度測定を行
なった。

測定結果は下記の第−表に示す。

第−表 上記第一衣から明らかなように、本発明の分析素子は操
作が簡単で短時間で測定が終了し、かつバラタグ２ワン
ドが低く、良好な検量線の作製が可能でめった。

実施例−２ 実７Ｍ例−１で作製した本発明の免疫用分析素子および
酵素標識抗原（ＡＦＰにペルオキシダーゼを結合したも
の）を用い検体試料として、原発性肝疾瘍患者の血清を
用意し、上記血清を原血清、２倍希釈、５倍希釈、１０
倍希釈になり、かつ一定量の酵素標識抗原が含有するよ
うに緩衝液Ａで希釈し試料とした。操作法は実施例−１
と同様であり、また検量線も実地例−１の第−表記載の
ものを用い同一試料で６回測定を行ないＡＦＰｅ度に換
質し、平均値、標準偏差、変動係数を求めた。

測定結果を下記第二衣に示す。

第二衣 上記の第二衣からも明らかなように本発明の免疫分析用
分析素子はｊ！４現性もきわめて良好な分町素子である
ことがわかる。

代理人　榮　原　義　美

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｇ木下浸透性、光透過性支持体の一側に位置し、親水性
   コロイドから成る少なくとも一種の検知反応のための試
   薬を含有する少なくとも一層の検知層と、該伏知層の該
   支持体とは反対側に位置し、流体試料中の免疫活性物質
   上特異的に結合する物質を含有する少なくとも一層の免
   疫反応層を有する免役分析用分析素子において、該免疫
   反応層が該流体と自由に接触する相互連絡空隙構造を有
   し、その空原正が約５乃至８５パー−こ７・トであり、
   該流体に対して実質的に非膨潤性三次元格子であり、か
   つ該免疫反応層の該流体と接触する表面に該流洋甲の免
   疫活性物質と特異的に結合する物質を担持したことを特
   徴とする免役分析用分析素子。