ES2211933T3 - Elemento de inmunoensayo que contiene teluluros de diarilo para incrementar su estabilidad. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN ELEMENTO ANALITICO PARA INMUNOENSAYO EN SECO PARA ENSAYAR UN LIGANTE, QUE COMPRENDE UN SOPORTE QUE SOPORTA: 1) UN LIGANTE ETIQUETADO CON UNA ENZIMA O UNA ZONA RECEPTORA ETIQUETADA CON UNA ENZIMA; 2) UNA ZONA DE DISEMINACION; Y 3) UNA ZONA RECEPTORA QUE CONTIENE UNA CONCENTRACION FIJA DE UN RECEPTOR INMOVILIZADO PARA EL LIGANTE Y EL LIGANTE ETIQUETADO CUANDO ESTA PRESENTE Y EL RECEPTOR ESTA COVALENTEMENTE UNIDO A PERLAS POLIMERICAS QUE TIENE UN DIAMETRO EN LA BANDA DE ENTRE 0.1 Y 5 {MI}M; EL ELEMENTO SE CARACTERIZA EN QUE CONTIENE UN COMPUESTO DE TELURIDO DE DIARILO (DAT) Y LAS ZONAS PUEDEN ESTAR EN LAS MISMAS CAPAS O EN CAPAS SEPARADAS.

Description

Elemento de inmunoensayo que contiene teluluros de diarilo para incrementar su estabilidad.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un elemento de inmunoensayo y a su uso en un inmunoensayo.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos, que aprovechan reacciones inmunológicas naturales, han encontrado un amplio uso como técnicas analíticas en la química analítica. Debido a la especificidad de las reacciones, son particularmente ventajosas en la cuantificación de analitos biológicos que están presentes en concentraciones muy bajas en fluidos biológicos. Tales analitos incluyen, por ejemplo, antígenos, anticuerpos, fármacos, narcóticos, enzimas, hormonas, proteínas, etc.

El analito, que es el objetivo del ensayo, se denomina ligando en la presente memoria. Los compuestos que reconocen específicamente el ligando y reaccionan para formar complejos con el ligando se denominan receptores en la presente memoria. El receptor y el ligando forman un par conjugado. Cualquier miembro del par puede actuar como receptor o como ligando.

En el caso de un ensayo competitivo, un analito marcado, incluyendo derivados y análogos inmunocompetentes marcados de un analito de este tipo, son componentes necesarios del ensayo; mientras que, en el caso de un ensayo en sándwich, necesariamente se emplea un receptor marcado para el analito. En la presente memoria, éstos se denominan ligando marcado y receptor marcado, respectivamente.

En inmunoensayos de unión competitiva, un ligando marcado compite con un ligando no marcado para reaccionar con una cantidad fija del receptor apropiado. Las concentraciones desconocidas del ligando pueden determinarse a partir de la señal medida del ligando marcado unido o no unido (es decir libre). La reacción se desarrolla de la forma siguiente:

ligando + ligando marcado + receptor - sustrato \leftrightarrow

ligando-receptor + ligando marcado-receptor - sustrato.

En un formato alternativo de inmunoensayo conocido como inmunoensayo o ensayo inmunométrico "en sándwich", el ligando se pone en contacto con dos o más moléculas receptoras que se unen al ligando en diferentes epítopos. Un receptor típicamente se marca de forma apropiada y el otro se inmoviliza sobre un sustrato sólido o es capaz de ser inmovilizado sobre el mismo. La cantidad de ligando es directamente proporcional a la cantidad de complejo unido entre el ligando y los dos receptores. Esto se ilustra de la forma siguiente:

sustrato - receptor_{1} + ligando + receptor_{2} - marcador \leftrightarrow

sustrato - receptor_{1} - ligando - receptor_{2} - marcador.

Los marcadores convencionales incluyen marcadores radioactivos, enzimas, cromóforos, fluoróforos, radicales libres estables y cofactores enzimáticos, inhibidores y efectores alostéricos.

Los elementos analíticos de inmunoensayos se conocen a partir de las patentes de Estados Unidos nº 4.517.288 y 4.258.001. En general, tales elementos comprenden receptores, tales como anticuerpos para un ligando, que se inmovilizan sobre una capa particular. Además, el elemento usualmente contiene un sistema de reactivos que, a través de su interacción con una especie unida o no unida, da como resultado una señal que puede correlacionarse con la concentración de ligando en una muestra. En el uso, la muestra se combina manualmente con un ligando marcado enzimáticamente y se aplica al elemento. Después de un tiempo, se aplica a la capa particulada una solución que contiene un sustrato para el ligando marcado. La reacción con el sustrato es catalizada por el marcador enzimático para formar un producto de reacción que finalmente provoca la aparición de un color señal. La densidad de reflexión del color puede correlacionarse con la concentración del ligando en la muestra. Se conocen sistemas similares de producción de señales para otros marcadores convencionales conocidos tales como marcadores radioactivos, enzimas, cromóforos, fluoróforos, radicales libres estables y cofactores enzimáticos, inhibidores y efectores alostéricos.

Los elementos de inmunoensayo de capas múltiples son elementos en película fina que usan los principios de inmunoensayo descritos anteriormente para medir analitos en muestras fluidas. En elementos de ensayo competitivos, la velocidad de formación de color es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente y en elementos de ensayo en sándwich, la velocidad de formación de color es directamente proporcional a la cantidad de analito presente. También, la velocidad de formación de color es directamente proporcional a la actividad del analito marcado enzimáticamente, por ejemplo fármaco o receptor marcado enzimáticamente unido al receptor inmovilizado. Para que los inmunoensayos mantengan un calibrado estable no puede perderse ninguna actividad enzimática (velocidad medida) en ninguna de las placas durante el periodo de calibrado especificado.

Frecuentemente, los elementos de inmunoensayo se proporcionan a los clientes en "cartuchos" de plástico que contienen 50 elementos distintos de los que puede extraerse un elemento cada vez según sea necesario. Los elementos se apilan uno sobre otro de forma que los 49 elementos inferiores en el cartucho tienen la superficie superior cubierta por el elemento anterior. Sin embargo, el elemento superior de la pila no tiene un recubrimiento de este tipo y, por lo tanto, la superficie de ese elemento está expuesta a factores ambientales a los que no están expuestos los otros 49. Por ejemplo, el elemento superior (o primero) está más expuesto a corrientes de aire y a la luz que el resto de los elementos cuando se manipulan los cartuchos durante la fabricación o cuando los cartuchos están en el alimentador de elementos de los analizadores clínicos.

Durante el almacenamiento, antes de su uso, los mismos cartuchos se almacenan en bolsas selladas recubiertas con papel de aluminio. Sin embargo, el elemento superior sigue estando más expuesto al aire y a la humedad residuales dentro de las bolsas cerradas que los otros 49 elementos.

Se ha encontrado que, cuando se hacía reaccionar un fluido de experimentación normal con los elementos de un cartucho, la velocidad de formación de color que se observaba en el elemento superior (o primero) era siempre inferior a la velocidad de formación de color observada cuando el mismo fluido de experimentación se aplicaba a elementos por debajo del elemento superior en el mismo cartucho. Esto se denomina desviación de la primera placa.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un elemento analítico de inmunoensayo en seco para ensayar un ligando, que comprende un soporte que porta:

(a) un ligando marcado enzimáticamente o una zona de receptor marcado enzimáticamente;

(b) una zona de extensión; y

(c) una zona de receptor que contiene una concentración fija de un receptor inmovilizado para el ligando y el ligando marcado cuando están presentes. En este caso, el receptor se une covalentemente a perlas poliméricas que tienen un diámetro en el intervalo de 0,1 a 5 \mum; que se caracteriza porque el elemento contiene un compuesto de telururo de diarilo (DAT) y las zonas pueden estar en la misma capa o en capas separadas.

El elemento que se define anteriormente reduce sustancialmente la desviación de la primera placa, es decir la velocidad alterada de aparición de color del elemento superior en un cartucho comparada con los otros elementos en el mismo cartucho. Además, todos los elementos del cartucho muestran una mayor conservación a largo plazo. Los ejemplos establecen que cualquier compuesto de telururo de diarilo (DAT) proporciona estos beneficios.

Además, los compuestos de DAT son de utilidad para estabilizar las composiciones enzimáticas en general, en particular las de peroxidasa de rábano y conjugados en los que se usan tales enzimas como marcadores. Por ejemplo, los compuestos pueden usarse en ensayos en solución así como en los elementos secos de esta invención.

La presente invención proporciona también un procedimiento para el ensayo de un ligando inmunológicamente reactivo en una muestra líquida acuosa, que comprende las etapas de:

A. proporcionar un elemento analítico de inmunoensayo en seco de acuerdo con la presente invención;

B. poner en contacto un área finita de la zona o capa superior del elemento con muestra de la muestra líquida formando así: (i) un complejo ligando/receptor inmovilizado, (ii) un complejo ligando-receptor marcado enzimáticamente inmovilizado; o (iii) una mezcla de (i) y (ii); o un complejo receptor-ligando-receptor marcado inmovilizado;

C. poner en contacto el área finita con una solución de sustrato catalizando así la aparición de un color; y

D. determinar la concentración del ligando colorimétricamente.

En el procedimiento anterior, el receptor marcado o ligando marcado se separa del ligando marcado inmovilizado o receptor marcado inmovilizado. Una separación de este tipo puede efectuarse por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo mediante la adición de una solución de sustrato, por ejemplo una solución de peróxido de hidrógeno.

Detalles de la invención

En los dibujos que se acompañan:

La Figura 1 muestra la estabilidad de HRP (peroxidasa de rábano) en un formato seco modelo donde las variaciones de las soluciones de sembrado incluyen: sólo tampón; VOSO_{4} 1 mM; y cada telururo de diarilo solo 1 mM o 1 mM de cada uno con VOSO_{4} 1 mM;

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la Figura 2 muestra la estabilidad de HRP en un formato seco modelo con concentraciones crecientes de 4 a 10 mM de actividad de HRP completamente protegida durante 24 horas; y

la Figura 3 muestra la evaluación de la estabilidad del conjugado anti-CRP-HRP en un formato seco modelo con concentraciones diferentes en soluciones de sembrado.

Los elementos de esta invención comprenden ligando marcado o receptor marcado, y zonas de extensión y de receptor. Las diversas zonas pueden estar en una capa recubierta o en capas recubiertas diferentes. Por ejemplo, la zona de extensión y la zona de receptor pueden estar en una única capa o pueden estar en capas separadas. Las capas separadas pueden organizarse en cualquier orden sobre el soporte. O las capas separadas pueden organizarse tal que la capa de receptor esté directamente sobre el soporte, la capa de extensión directamente sobre la capa de receptor y la zona de ligando marcado o de receptor marcado sobre la capa de extensión. Cuando la zona de receptor forma una capa completamente separada, la capa incluirá también un aglutinante del tipo que se describe a continuación. El elemento puede incluir capas adicionales tales como las que se describen más abajo. Todas las capas de este tipo pueden recubrirse usando las técnicas que se conocen en la técnica y que se describen brevemente más abajo.

La capa o zona de extensión es porosa. Contiene, como ingrediente esencial, un telururo de diarilo. Los compuestos representativos que son telururos de diarilo de la fórmula

Ar^{1}-Te-Ar^{2}

producen reducciones significativas en la desviación de la primera placa cuando se incorporan a las placas de ensayo de HCG o CRP como se describe más adelante. Un subconjunto de estos compuestos mantiene también la actividad de HRP en un sistema modelo diseñado para evaluar compuestos o su capacidad de evitar la desviación de la primera placa.

Diorganotelururos de utilidad incluyen materiales en los que Ar^{1} y Ar^{2} representan grupos arilo o heteroarilo iguales o diferentes, sustituidos o no sustituidos, con sustituyentes que se definen más abajo.

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en los que X es O, S, Se o Te y R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{31}, R^{32}, R^{33}, R^{41}, R^{42} y R^{43} son iguales o diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, OH, OR^{1}, SH, NH_{2}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, NR^{1}R^{2}, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales y SR^{1} donde R^{1} y R^{2} son diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por alquilo que tiene una cadena de carbonos de 1 a 14 átomos de carbono que opcionalmente portan uno o varios grupo hidrófilos, fenilo y fenilo sustituido.

R^{14}, R^{15}, R^{24} y R^{25} son iguales o diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, alcoxi que tiene 1-5 átomos de carbono, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales donde R^{1} es como se describe anteriormente.

En lo anterior, alquilo significará grupos tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, amilo, isoamilo o neopentilo.

Una cadena de carbonos con 1-5 átomos significará una cadena de carbonos lineal o ramificada, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, amilo, isoamilo o neopentilo.

Una cadena de carbonos con 1-14 átomos de carbono incluirá, pero sin limitación, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, amilo, isoamilo, neopentilo, hexilo, octilo, decilo, tetradecilo y similares.

Grupos hidrófilos significa grupos tales como grupos ácido sulfónico, fosfónico o carboxílico, hidroxilo y amino. Algunos de estos compuestos pueden formar sales con ácidos o bases. Se prefieren las sales de sodio, potasio, amonio, calcio y magnesio y las sales con ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico y sulfúrico y con ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, fumárico, tartárico, malónico, acético, cítrico y succínico.

Los DAT preferidos son aquellos que tienen sustituyentes en el anillo aromático que contienen grupos que confieren solubilidad en agua, tales como, pero sin limitación, grupos hidroxilo, aminas y sus sales y ácidos carboxílicos y sus sales. En particular, los compuestos solubles en agua que conservan la actividad de HRP ya sean solos o en cooperación con compuestos de vanadilo son los siguientes.

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Otros materiales para usarse en capas de extensión son notorios en la técnica de preparar elementos analíticos secos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos nº 4.258.001. Las capas de este tipo incluyen capas macroporosas hechas de tejido, papel, etc. Una capa particulada preferida es una capa de extensión de perlas (BSL). Esta capa puede construirse fácilmente para que tenga una porosidad adecuada para usarse en los elementos de la presente invención para acomodar una muestra de experimentación (por ejemplo 1 a 100 \mul), diluida o no diluida. Preferiblemente, la capa de extensión es isotrópicamente porosa, lo que se crea de forma adecuada mediante espacios interconectados entre las partículas que comprenden la zona. Con isotrópicamente poroso se quiere decir que la capa de extensión uniformemente extiende el fluido aplicado en todas direcciones por toda la capa.

Capas de extensión de utilidad, incluyendo capas de extensión de perlas se describen en las patentes de Estados Unidos nº 4.670.381; 4.258.001 y 4.430.436. Capas de extensión particularmente útiles son las que tienen una estructura particulada formada por partículas organopoliméricas y un adhesivo polimérico para las partículas que se describen en la patente de Estados Unidos nº 4.258.001. Las partículas organopoliméricas de utilidad en la capa de extensión son generalmente perlas estables al calor, esféricas que tienen un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 10 a 40 \mum en diámetro o incluso menores.

Las partículas pueden estar compuestas por una amplia variedad de polímeros orgánicos, que incluyen polímeros naturales y sintéticos, que tienen las propiedades requeridas. Preferiblemente, sin embargo, están compuestas por uno o más polímeros de adición descritos en las patentes mencionadas anteriormente.

Cuando la capa de receptor es una capa distinta, se prepara y se recubre sobre un soporte o sobre una capa de reactivo o capa auxiliar sobre el soporte. Los receptores se unen covalentemente a partículas poliméricas mediante los grupos reactivos de la superficie del receptor (grupos amino libres nucleófilos y grupos sulfhidrilo).

Un procedimiento general para unir los receptores a las pequeñas perlas poliméricas incluye unir covalentemente el receptor seleccionado a las perlas usando reacciones conocidas generalmente. Con muchos grupos pendientes, por ejemplo el haloalquilo, etilsulonilo y vinilsulfonilo activados sustituidos en 2, el receptor puede unirse directamente a las perlas. Generalmente, las perlas se mezclan con el receptor en una solución tamponada acuosa (pH generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10) y una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 40 por ciento en peso de partículas poliméricas (preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 por ciento en peso). La cantidad de receptor está en una relación con la de polímero de aproximadamente 0,1:1000 a aproximadamente 1:10, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10. el mezclado se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 50ºC, y preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 40ºC, durante aproximadamente 0,5 a aproximadamente 48 horas. Puede usarse cualquier tampón adecuado.

En algunos casos, los grupos reactivos pendientes en la superficie exterior deben modificarse o activarse para que provoque la unión covalente del ligando. Por ejemplo, los grupos carboxilo deben activarse usando reacciones de carbodiimida o carbamoilonio conocidas que se describen en el documento EP 308235 publicado el 22 de julio de 1992 y la patente de Estados Unidos nº 5.155.166.

La unión del receptor a las perlas poliméricas monodispersas que contienen grupos carboxilo, sin embargo, se lleva a cabo en dos etapas, la primera de las cuales implica poner en contacto una suspensión acuosa de las partículas con un compuesto de carbodiimida o carbamoilonio para producir las partículas poliméricas intermedias reactivas que tienen grupos reactivos intermedios en lugar de los grupos carboxilo. Esta etapa se lleva a cabo a un pH adecuado usando ácidos o tampones adecuados para proporcionar el pH deseado. Generalmente, el pH es inferior a 6, pero no es crítico en tanto en cuanto la reacción pueda progresar. Más probablemente, el pH está entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 7. La relación molar entre el compuesto de carbodiimida o carbamoilonio y los grupos carboxilo en la superficie de las partículas está entre aproximadamente 10:1 y 500:1.

En la segunda etapa del procedimiento, el intermedio reactivo formado en la primera etapa se pone en contacto con receptor que contiene un grupo amina o sulfhidrilo reactivo. Así se forma un enlace covalente entre las partículas y el receptor. La relación entre el peso del receptor y el de las partículas poliméricas está generalmente entre aproximadamente 1:1000 y aproximadamente 1:1, y preferiblemente entre aproximadamente 1:100 y aproximadamente 1:10.

En otros casos, puede hidrolizarse un grupo epoxi en la superficie exterior para formar un compuesto de diol capaz de reaccionar con bromuro de cianógeno que puede actuar como agente de acoplamiento para los grupos amina en las especies inmunológicas. Los aldehídos pueden reaccionar directamente con aminas para formar una base Schiff que subsiguientemente puede reducirse para formar un enlace covalente. De forma alternativa, el aldehído puede oxidarse a un ácido y pueden usarse las reacciones identificadas anteriormente para los grupos carboxilo para formar un enlace amida.

Cualquier receptor que contenga amina o sulfhidrilo reactivos puede unirse a las perlas poliméricas monodispersas siempre que ese receptor contenga un grupo amina o sulfhidrilo reactivo, respectivamente, que reaccionará con los grupos reactivos en el polímero o con el intermedio formado mediante reacción de un compuesto carbodiimida o carbamoilonio con grupos carboxilo en las partículas en el caso de que el polímero tenga grupos carboxilo reactivos.

Las pequeñas perlas poliméricas que tienen grupos reactivos que reaccionan fácilmente directamente con los grupos amina o sulfhidrilo de los receptores simplemente se mezclan con los receptores, en un tampón apropiado si fuera necesario, y se dejan reaccionar.

Polímeros de los que pueden seleccionarse perlas para el receptor incluyen los siguientes: poli(m y p-clorometiles-
tireno), poli(estireno-co-m y p-clorometilestireno-co-acrilato de 2-hidroxietilo) (relación molar 67:30:3), poli(estireno-co-m y p-cloroetilsulfonilmetilestireno) (relación molar 95,5:4,5), poli{estireno-co-N-[m y p-(2-cloroetilsulfonilmetil)fenil]acrilamida} (relación molar 99,3:0,7), poli(m y p-clorometilestireno-co-ácido metacrílico) (relación molar 95:5, 98:2 y 99,8:0,2), poli(estireno-co-m y p-cloroetilsulfonilmetilestireno-co-ácido metacrílico) (relación molar 93,5:4,5:2), poli{estireno-co-N-[m y p-(2-cloroetilsulfonilmetil)fenil]acrilamida-co-ácido metacrílico} (relación molar 97,3:0,7:2), poli(estireno-co-m y p-clorometilestireno) (relación molar 70:30), poli[estireno-co-3-(p-vinilbenciltio)ácido propiónico] (relación molar 97,6:2,4), poli(estireno-co-cloruro de vinilbencilo-co-ácido acrílico) (relación molar 85:10:5), poli(estireno-co-ácido acrílico) (relación molar 99:1), poli(estireno-co-ácido metacrílico) (relación molar 90:10), poli(estireno-co-ácido acrílico-co-m y p-divinilbenceno) (relación molar 89:10:1), poli(estireno-co-acrilato de 2-carboxietilo) (relación molar 90:10), poli(metacrilato metílico-co-ácido acrílico) (relación molar 70:30), poli(estireno-co-m y p-vinilbenzaldehído) (relación molar 95:5), y poli(estireno-co-m y p-vinilbenzaldehído-co-ácido metacrílico) (relación molar 93:5:2).

Las capas del elemento se portan en un soporte adecuado. La capa de receptor se recubre sobre el soporte aunque puede haber capas entre ellas, tales como una capa de gelatina/tampón, entre la capa de soporte y la de receptor. El soporte puede ser cualquier material adecuado que sea dimensionalmente estable y, preferiblemente, no poroso y transparente (es decir que transmita la radiación) que transmita la radiación electromagnética de una longitud de onda entre aproximadamente 200 y aproximadamente 900 nm. Un soporte elegido para un elemento particular debería ser compatible con el modo de detección pretendido (espectroscopia de reflexión, transmisión o fluorescencia). Materiales de soporte de utilidad incluyen poliestireno, poliésteres [por ejemplo poli(etilentereftalato)], policarbonatos, ésteres de celulosa (por ejemplo acetato de celulosa), etc.

Los aglutinantes poliméricos para la capa del receptor se describen de forma general en la patente canadiense 1.240.445 y se incorporan expresamente a la presente memoria como referencia. Los polímeros útiles son polímeros que comprenden de aproximadamente 30 a 97 por ciento en peso de acrilamida sustituida con alquilo en N polimerizada tal como N-isopropilacrilamida. Otras acrilamidas sustituidas con alquilo en N de utilidad incluyen N-n-butilacrilamida, N,N-dietilacrilamida y N-n-propilacrilamida. En los ejemplos se usa poli(N-isopropilacrilamida-co-ácido metacrílico-co-N,N'-metilenbisacrilamida para ilustrar la utilidad de estos aglutinantes.

El aglutinante polimérico comprende también de aproximadamente 3 a 25 por ciento en peso de uno o más monómeros de reticulación polimerizados que tienen al menos dos grupos polimerizables más por molécula. Estos monómeros de reticulación polimerizados contienen grupos acrilamido o metacrilamido para facilitar la polimerización con las acrilamidas sustituidas con alquilo en N.

Los ejemplos de monómeros de reticulación de utilidad incluyen:

N,N'-metilenbisacrilamida;

N,N'-metilenbismetacrilamida;

etilendimetacrilato;

2,2-dimetil-1,3-propilendiacrilato;

divinilbenceno;

mono[2,3-bis(metacriloiloxi)propilfosfato;

N,N'-bis(metacriloil)urea;

trialil cianurato;

alil acrilato;

alil metacrilato;

N-alilmetacrilamida;

4,4'-isopropilidendifenilen diacrilato;

1,3-butilendiacrilato;

1,4-ciclohexilendimetilen dimetacrilato;

2,2'-oxidietilen dimetacrilato;

diviniloximetano;

etilen diacrilato;

etiliden diacrilato;

propiliden dimetacrilato;

1,6-diacrilamidohexano;

1,6-hexametilen diacrilato;

1,6-hexametilen dimetacrilato;

feniletilen dimetacrilato;

tetrametilen dimetacrilato;

2,2,2-tricloroetiliden dimetacrilato;

etilenbis(oxietilen)diacrilato;

etilenbis(oxietilen)dimetacrilato;

etiliden trimetacrilato;

propiliden triacrilato;

vinil aliloxiacetato;

1-viniloxi-2-aliloxietano;

2-crotonoiloxietil metacrilato,

dialil ftalato; y

2-(5-fenil-2,4-pentadienoiloxi)etil metacrilato.

Estos aglutinantes poliméricos pueden incluir también de 0 a 60 por ciento en peso de monómeros hidrófilos polimerizados. Son también de utilidad cantidades de 5 a 35 por ciento en peso. Monómeros hidrófilos se describen en la patente canadiense 1.240.445. En particular, tales monómeros tienen uno o más grupos que se seleccionan de grupos hidroxi, pirrolidona, amina, amida, carboxi, sulfo, sal carboxilato, sal sulfonato y sal sulfato. Generalmente, los iones conjugados de los grupos salinos son metales alcalinos o amonio. Monómeros hidrófilos de utilidad son ácido acrílico y ácido metacrílico y sus sales, sulfonato de 2-acrilamido-2-metilpropano sódico, 2-hidroxietil acrilato, 2-hidroxietil metacrilato, 2-hidroxipropil acrilato, 2-hidroxipropil metacrilato y gliceril metacrilato.

Además, los aglutinantes citados hacen posible formar recubrimientos uniformes de capas de receptor debido a las bajísimas viscosidades de aglutinante logradas por afinamiento durante el recubrimiento con tolva de extrusión. Con los aglutinantes citados se logra una ventaja adicional porque, inmediatamente después de formar los recubrimientos uniformes, aumenta sustancialmente la viscosidad de los aglutinantes, dando como resultado una "capa fija" que permanece estable y uniforme durante el transporte en húmedo y secado de los aglutinantes.

Los receptores pueden dispersarse también en un aglutinante polimérico que se selecciona del grupo constituido por:

- alcohol poli(vinílico);

- albúmina de suero bovino;

- goma arábiga;

- homopolímeros de N-vinilpirrolidona

que tienen un peso molecular en el intervalo de 8000 a 400.000; y copolímeros de adición de vinilos solubles en agua que tienen dos o más monómeros que se seleccionan del grupo constituido por acrilamida, metacrilamida, acrilamidas sustituidas con alquilo en N, metacrilamidas sustituidas con alquilo en N,1-vinilimidazol, 1-vinilimidazoles sustituidos con alquilo en 2,1-vinilimidazoles sustituidos con hidroxialquilo en 2,N-vinilpirrolidona, hidroxialquilacrilatos, hidroxialquilmetacrilatos, ácido acrílico y ácido metacrílico; en los que alquilo e hidroxialquilo en los copolímeros tienen de 1 a 6 átomos de carbonos tales como metilo, etilo, propilo y hexilo.

El elemento puede comprender una o más capas adicionales, por ejemplo capas separadas o combinadas de reactivo/extensión y una capa de gelatina/tampón que contenga otros aditivos necesarios tales como agentes de transferencia de electrones.

La capa de gelatina/tampón o la capa de reactivo o la capa de extensión del elemento puede contener la composición del indicador que comprende uno o más reactivos dispersos en uno o más materiales aglutinantes sintéticos o naturales, tales como gelatina, u otros coloides, homopolímeros y copolímeros naturales, tales como poli(acrilamida), poli(vinilpirrolidona), poli(N-isopropilacrilamida), poli(acrilamida-co-N-vinil-2-pirrolidona) y copolímeros similares. La composición del indicador puede también estar dispersa en la capa de receptor.

Pueden incluirse capas opcionales, por ejemplo capas auxiliares, capas de bloqueo de radiaciones, etc. si se desea. Todas las capas del elemento están en contacto fluido entre sí, lo que quiere decir que los fluidos y reactivos y productos de reacción no complejados de los fluidos pueden pasar entre las regiones superpuestas de capas adyacentes.

Las capas del elemento pueden contener una variedad de otros componentes deseables pero opcionales, que incluyen tensioactivos, espesantes, tampones, endurecedores, antioxidantes, disolventes acopladores y otros materiales conocidos en la técnica. Las cantidades de estos componentes están también dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Los elementos pueden usarse para determinar concentraciones bajas de ligandos inmunológicamente reactivos en un líquido, tal como un fluido biológico (por ejemplo sangre entera, suero, plasma, orina, fluido espinal, suspensiones de tejido humano o animal, heces, saliva, fluido linfático y similares). Los ligandos pueden determinarse en concentraciones desde aproximadamente 10^{-15} molar, y de forma más general a una concentración de aproximadamente 10^{-11} a aproximadamente 10^{-4} molar.

Los ligandos que pueden determinarse de este modo, ya sea cuantitativa o cualitativamente, incluyen fármacos (por ejemplo fenobarbital, digoxina, digitoxina, teofilina, gentamicina, quinidina, fenitoína, propanolol, carbamazepina, tobramicina, lidocaína, procainamida y similares), esteroides naturales o sintéticos (por ejemplo cortisol, aldosterona, testosterona, progesterona, estriol, etc.), hormonas (por ejemplo hormonas tiroideas, hormonas peptídicas, insulina, etc.), proteínas (por ejemplo albúmina, IgG, IgM, ferritina, factores coaguladores de la sangre, proteína C reactiva, isoenzimas, hCG, apolipoproteínas, etc.), antígenos, anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales, y otras especies que reaccionarán de forma natural con un receptor. Esta invención es particularmente útil para determinar fármacos, tales como digoxina, fenitoína, carbamazepina, teofilina o fenobarbital, hormonas tales como tiroxina o triyodotironina y analitos tales como hCG y proteína C reactiva.

El ensayo puede llevarse a cabo usando cualquier marcador enzimático que pueda unirse al ligando para formar un ligando marcado. Las enzimas, tales como glucosa oxidasa, peroxidasas tales como peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina y galactosidasa son los marcadores preferidos.

Está dentro del conocimiento de los expertos en química clínica determinar un sustrato adecuado para un marcador dado. El sustrato puede ser un material sobre el que actúe directamente el marcador enzimático o un material que esté implicado en una serie de reacciones que implican la reacción enzimática del marcador. Por ejemplo, si el marcador enzimático es una peroxidasa, el sustrato es peróxido de hidrógeno más un agente reductor apropiado. Usando la glucosa oxidasa como ejemplo, el sustrato glucosa está generalmente presente en la capa de reactivo o se añade como solución de sustrato para dar aproximadamente 0,01 mol/m^{2}, y preferiblemente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 mol/m^{2}. Un experto en la técnica sabría cómo ajustar la cantidad de un sustrato particular para la cantidad de marcador enzimático usado en el ensayo.

La capa de reactivo puede contener una composición indicadora que comprenda uno o más reactivos que proporcionan una especie detectable como resultado de que el marcador cataliza la reacción. La especie detectable podría producir un color, ser radioactiva, fluorescente o quimioluminiscente. Para los presentes fines, la invención se ilustra usando una composición de indicador colorimétrico que proporciona una especie colorimétricamente detectable como resultado de la reacción enzimática de un análogo de ligando marcado con enzima con un sustrato.

La composición indicadora puede ser un único compuesto que produce un tinte detectable al reaccionar enzimáticamente o una combinación de reactivos que producen el tinte. Por ejemplo, cuando se usa glucosa como sustrato y glucosa oxidasa como marcador enzimático, la composición de indicador colorimétrico puede incluir un acoplador y un compuesto oxidable que reacciona para proporcionar un tinte. De forma alternativa, la composición puede incluir un tinte leuco y peroxidasa u otro compuesto peroxidativo adecuado que genera un tinte detectable como resultado de la formación de peróxido de hidrógeno que se produce cuando la glucosa oxidasa convierte la glucosa en ácido glucónico. Los tintes leucos de utilidad son conocidos en la técnica e incluyen los descritos, por ejemplo en la patente de Estados Unidos nº 4.089.747 (concedida el 16 de mayo de 1978 de Bruschi) y la patente de Estados Unidos nº 4.670.385 de Babb y cols. Las cantidades particulares de la composición de indicador colorimétrico y sus diversos componentes están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Los ligandos marcados pueden prepararse usando materiales iniciales y procedimientos conocidos, u obtenerse comercialmente. Generalmente, el ligando se une al marcador (por ejemplo un resto enzimático) mediante un enlace covalente.

El inmunoensayo puede ser manual o automatizado. En general, la cantidad de un ligando en un líquido se determina tomando el elemento de un rollo de abastecimiento, paquete de pastillas u otra fuente y poniendo físicamente en contacto un área finita de la capa de extensión con una muestra del líquido, por ejemplo 1 a 100 \mul. El área finita que se pone en contacto generalmente no es superior a aproximadamente 150 mm^{2}.

La cantidad de ligando se determina pasando el elemento a través de un aparato adecuado para detectar el análogo de ligando complejado directamente o la especie detectable formada como resultado de la reacción enzimática de un marcador enzimático y un sustrato. Por ejemplo, la especie puede detectarse con un aparato espectrofotométrico adecuado usando procedimientos conocidos generalmente. En una reacción enzimática, el producto resultante se determina midiendo, por ejemplo, la velocidad de cambio de reflexión o densidad de transmisión en el área finita que se pone en contacto con la muestra de experimentación. El área que se mide tiene un diámetro generalmente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 mm. La cantidad de ligando en la muestra líquida es inversamente proporcional a la cantidad de marcador medido en el área finita en el caso de un ensayo competitivo, o es directamente proporcional en el caso de un ensayo en sándwich. Generalmente, se realiza una medición de marcador después de aplicar una solución de sustrato.

Descripción detallada de la invención 1. Síntesis de los telururos de diarilo

Existen muchas rutas de síntesis para preparar los DAT. La ruta usada para un compuesto particular depende mucho de los sustituyentes de los anillos aromáticos. Varias de las rutas conocidas se ilustran en los ejemplos a continuación. La extrapolación de estos y otros procedimientos de la bibliografía para la síntesis de otros DAT debería ser fácilmente aparente.

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Preparación 1

4,4'-Di(2-hidroxietoxi)-1,1'-telurobisbenceno (1) (a) Preparación de [2-(4-Bromofenoxi)etoxi](1,1-dimetiletil)dimetilsilano (1a)

A una solución de [2-(4-bromofenoxi)etanol (10,0 g, 46 mmol) en 150 ml de dimetilformamida seca (30 ml) se añadió cloruro de t-butildimetilsililo (8,34 g, 55 mmol) e imidazol (7,82 g, 115 mmol). Se usó dimetilformamida adicional (20 ml) para lavar estos material s al matraz de reacción. La solución resultante se agitó hasta la mañana siguiente a temperatura ambiente con un tubo de Newman. Se vertió en agua (200 ml) y se extrajo con éter (3 x 75 ml). Los extractos combinados se lavaron con HCl 0,5 N (200 ml), NaHCO_{3} sat. (200 ml), agua (4 x 150 ml), y NaCl saturado (200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se filtró. El disolvente se separó a presión reducida en una evaporadora giratoria para dar el producto bruto (16,5 g; >100%). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,34 (2H, d, J = 8,9), 6,78 (2H, d, J = 8,9), 4,00-3,93 (4H, m), 0,89 (9H, s), 0,08 (6H, s). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 158,1, 132,2, 116,4, 112,8, 69,6, 61,9, 25,9, 18,4. EMDF (m/e) 330 (M^{+}, ^{79}Br). Se usó como 100% sin purificar.

(b) Preparación de 4,4'-Di(2-hidroxietoxi)-1,1'-telurobisbenceno (1)

Se colocó un matraz de 500 ml de tres bocas en atmósfera de argón y se equipó con un condensador y un embudo de adición. Se añadieron virutas de magnesio (0,89 g, 37 mmol). Se disolvió el bromuro 1a (12,3 g, 37 mmol, usado como 100%) en tetrahidrofurano seco (THF) (100 ml) y se transfirió a un embudo de adición. La reacción de Grignard se inició con aproximadamente 10 ml de la solución de bromuro, 1,2-dibromoetano y yodo. Se añadió la solución de bromuro restante y la reacción se sometió a reflujo hasta la mañana siguiente, después de lo cual no quedó nada de Mg. Se retiró la manta calefactora durante 30 minutos, después se añadieron gránulos de telurio (4,74 g, 37 mmol), y la reacción se volvió a calentar a reflujo durante 7 h, momento en el cual casi todo el Te se había consumido. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, después se vertió en NH_{4}Cl acuoso al 10% (300 ml) en agitación vigorosa y se agitó durante 15 minutos. El Te precipitado se eliminó por filtración con tierra de diatomeas Celite y la torta de la filtración se lavó con éter. El filtrado se transfirió a un embudo separador y se extrajo tres veces con éter (200 ml, 100 ml, 100 ml). Los extractos combinados se lavaron con agua y NaCl saturado, se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar el producto crudo (12,4 g) en forma de aceite rojo. Se disolvió en tolueno (50 ml) con polvo de cobre (2,5 g), y se calentó a reflujo con un tubo de Newman durante 2,5 h, momento en el cual el color había cambiado de rojo a gris. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró con tierra de diatomeas Celite, se lavó con éter y se concentró, dando un aceite ámbar (12,4 g). Según la RMN de ^{1}H era una mezcla del producto deseado, Grignard inactivado y tolueno residual. Se disolvió en metanol (50 ml) y (50 ml) y THF (20 ml) con fluoruro de potasio (5,0 25, 86 mmol) y se sometió a reflujo durante 24 h. La mayor parte del metanol se eliminó a presión reducida y se fraccionó entre éter-acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo dos veces más con acetato de etilo y los extractos combinados se lavaron con agua y NaCl sat., se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se filtraron. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar el producto bruto (8 g) en forma de sólido tostado. La trituración con éter dio un sólido blanco que se aisló mediante filtración, se lavó con éter, y se secó al aire, para dar el producto bruto (1,74 g). Se adsorbió en gel de sílice ultrarrápido (20 ml) usando diclorometano. Una cuidadosa cromatografía ultrarrápida en 200 ml de gel de sílice ultrarrápido, eluyendo con diclorometano y después diclorometano:metanol 95:5 (el producto eluye justo antes de una pequeña cantidad del compuesto de biarilo correspondiente), trituración con éter y filtración dieron 1 puro en forma de un sólido blanco (1,2 g). El filtrado con éter de la trituración del producto bruto se cromatografió como anteriormente. La trituración con éter y la recristalización de etanol dio más 1 puro (0,2 g). Rendimiento total: 1,4 g, 19%. RMN de ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,52 (4H, d, J = 8,5), 6,80 (4H, d, J = 8,5), 4,82 (2H, t, J = 5,5), 3,91 (4H, t, J = 5,0), 3,65 (4H, ap q, J = 5,1). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 159,2, 139,8, 116,5, 104,5, 69,9, 59,9. EMDF (m/e) 404 (M^{+}, ^{130}Te).

Preparación 2

Sal clorhidrato de N,N-dimetil-2-(feniltelurio)bencenometanamina (2) (a) Preparación de N,N-dimetil-2-(fenilteluro)bencenometanamina (2a)

A una solución de N,N-dimetilbencenometanamina (2,70 g, 0,020 mol) en éter seco (50 ml) en un matraz de base redonda en atmósfera de argón a temperatura ambiente se añadió n-BuLi (2,5 M, 10 ml, 0,025 mol) gota a gota mediante una jeringuilla. La reacción se agitó 5 h a temperatura ambiente, después se añadió una solución de bromuro de feniltelurenilo en tetrahidrofurano seco (0,5 M) gota a gota mediante una jeringa. Después de la adición de 38 ml (0,019 mol), la reacción se volvió de color naranja característico del bromuro de feniltelurenilo, y se detuvo la adición. La mezcla de reacción se vertió en éter (100 ml), y la solución resultante se lavó con NaCl sat. (1 x 100 ml, 2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se concentró. El residuo se disolvió en acetona (100 ml) y se añadió yodo (5,08 g, 0,020 mol). La solución resultante se enfrió para precipitar el producto. Los cristales amarillos se recolectaron por filtración, se lavaron con acetona fría, y se secaron para dar el aducto de yodo de 2a (5,95 g, 50%, pf 178-179º). El aducto de yodo (5,93 g, 0,010 mol) se disolvió en dimetilformamida (100 ml). Se añadió lentamente bisulfito sódico (5,2 g, 0,05 mol) en agua (100 ml) y la reacción se agitó 1 h a temperatura ambiente, tiempo durante el cual la reacción se volvió incolora. La reacción se vertió en agua (500 ml), después se lavó con éter (2 x 50). La fase acuosa se basificó con NaOH al 10%, y la amina se extrajo en éter (3 x 100 ml). Los extractos combinados se lavaron con NaCl sat., se secaron sobre MgSO_{4}, y se concentraron. El residuo se recristalizó de metanol para dar el producto puro (3,14 g, 93%) en forma de sólido blanco (pf 51-54ºC). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,88 (2H, d, J = 6,9), 7,35 (1H, t, J = 7,3), 7,26 (2H, t, J = 7,3), 7,17 (1H, d, J = 7,7), 7,10-7,04 (2H, m), 6,94-6,89 (1H, m), 3,53 (2H, s), 2,25 (6H, s).

(b) Preparación de sal clorhidrato de N,N-dimetil-2-(fenilteluro)bencenometanamina (2)

A una disolución espesa de 2-(N,N-dimetilaminometil)-1-feniltelurobenceno (1,02 g, 3,0 mmol) en éter (50 ml) al baño maría se añadió gota a gota mediante una jeringa una solución de cloruro de hidrógeno/éter (3,15 ml, 1,0 M, 3,15 mmol). La mezcla espesa se diluyó con isopropanol (20 ml) después se filtró. El sólido blanco se lavó con éter y se secó al aire para dar el producto (1,13 g, 95%). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,6 (1H, br s), 8,13 (1H, d, J = 7,5), 7,80 (1H, d, J = 7,7), 7,52-7,48 (3H, m), 7,26-7,17 (4H,m), 4,44 (2H, d, J = 5,8), 2,68 (6H, d, J = 4,5). Anal. calc. para C_{15}H_{18}ClNTe: C, 48,00; H, 4,83; N, 3,73. Hallada: C, 47,97; H, 4,87; N, 3,65.

Preparación 3

N,N,N',N'-Tetra(2-hidroxietil)-4,4'-telurobisbencenamina (3) (a) Preparación de N,N-Bis[2-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oxi]etil]bencenamina (3a)

Se utilizó un procedimiento análogo al usado para 1a con los siguientes materiales: 2,2-(fenilmino)dietanol (9,0 g, 50 mmol), cloruro de t-butildimetilsililo (18,1 g, 0,12 mol), imidazol (17,0 g, 0,25 mol) y dimetilformamida (50 ml). La reacción se agitó hasta la mañana siguiente por comodidad. El procedimiento como en 1a dio 3a en forma de aceite pálido (21,6 g, >100%). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,21 (2H, d, J = 8,4), 6,68 (3H, sobrepuesto a d, t), 3,77 (4H, d, J = 6,6), 3,52 (4H, d, J = 6,6), 0,92 (18 H, s), 0,06 (12 H, s). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 147,8, 129,2, 115,7, 111,4, 60,3, 53,5, 25,9, 18,3, -5,3. EMDF (m/e) 409 (M^{+}). Se usó como 100% sin purificar.

(b) Preparación de N,N,N',N'-Tetra[2-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oxi]etil]-4,4'-telurobisbencenamina (3b)

A un matraz de 500 ml de tres bocas, secado en horno y en atmósfera de argón se añadió cloruro de telurio (IV) (5,93 g, 22 mmol). Se añadió éter seco (100 ml) mediante una jeringa, dando una mezcla fluida amarilla, y el matraz se colocó al baño maría. Se preparó una solución de 3a (18 g, 44 mmol) en éter seco (50 ml) en atmósfera de argón y la solución se transfirió mediante una cánula a la reacción agitando vigorosamente. Inicialmente se formó un precipitado amarillo muy espeso, que se fue aclarando al continuar la adición de la solución de anilina. Al completar la adición, se agitó la mezcla espesa amarillo verdosa hasta la mañana siguiente. La reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El aceite verde amarillento resultante se disolvió en diclorometano (200 ml), y se añadió una solución de metabisulfito sódico (8,36 g, 44 mmol) en agua (200 ml) agitando. La mezcla de dos fases resultante se agitó 30 minutos a temperatura ambiente, después se filtró con tierra de diatomeas Celite. Se añadió NaHCO_{3} hasta un pH 9, después la reacción se transfirió a un embudo separador. La fase de diclorometano se separó y la fase acuosa se extrajo con más diclorometano. Los extractos combinados se lavaron con agua/NaCl sat. (200 ml / 50 ml) después NaCl sat., se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se filtraron y el disolvente se eliminó a presión reducida. El aceite rojo resultante (21,4 g) se disolvió en tolueno (80 ml), y se añadió polvo de cobre (4 g). La reacción se agitó a reflujo con un tubo de Newman hasta la mañana siguiente. La reacción gris resultante se enfrió a temperatura ambiente, se filtró con tierra de diatomeas Celite y el disolvente se separó a presión reducida. El aceite ámbar resultante (18 g) se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces con ciclohexano:diclorometano 3:1 para separar el producto del material inicial recuperado, dando 3b puro en forma de aceite amarillo (5,0 g, 48% del teórico). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,6), 6,53 (4H, d, J = 8,5), 3,72 (4H, t, J = 6,4 ), 3,47 (4H, t, J = 6,5), 0,88 (18H, s), 0,03 (12H, s). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 147,6, 139,7, 112,7, 98,2, 60,2, 53,4, 25,9, 18,3, -5,3. EMDF (m/e) 946 (M^{+}, ^{130}Te).

(c) Preparación de N,N,N',N'-Tetra(2-hidroxietil)-4,4'-telurobisbencenamina (3)

Se calentó a reflujo una mezcla heterogénea de éter de sililo 3b (2,7 g, 2,86 mmol), fluoruro de potasio (0,66 g, 11,4 mmol) y metanol (20 ml) durante 20 h. la disolución blanca se enfrió en un baño helado, después el producto se aisló por filtración, se lavó con metanol frío y se secó al aire (0,80 g, 57%). Una pequeña parte se recristalizó de metanol para obtener una muestra para analizar (pf 169-170º). RMN de ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,6), 6,53 (4H, d, J = 8,5), 3,45 (4H, ap q, J = 5,7), 3,33 (4H, t, J = 5,9). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 148,1, 139,8, 113, 1, 97,6, 58,4, 53,5. IR (KBr) 3350, 1585, 1495, 1350 cm^{-1}. EMDF (m/e) 490 (M^{+}, ^{130}Te). Anal. calc. para C_{20}H_{28}N_{2}O_{4}Te: C, 49,22; H, 5,78; N, 5,74. Hallada: C, 48,78; H, 5,72; N, 5,66.

Preparación 4

Sal disódica del ácido 2,2'-[telurobis(4,1-fenilenoxi)]bisacético (4) (a) Preparación de (4-Bromofenoxi)(1,1-dimetiletil)dimetilsilano (4a)

A una solución de p-bromofenol (104 g, 0,6 mol) en dimetilformamida seca (450 ml) se añadió cloruro de t-butildimetilsilio (108 g, 0,72 mol) e imidazol (102g, 1,5 mol). La solución resultante amarillo pálido se agitó 3 h a temperatura ambiente con un tubo de Newman. Se vertió en agua (1,2 l) y se extrajo tres veces con éter (900 ml, 300 ml, 300 ml). Los extractos combinados se lavaron cuatro veces con agua (150 ml), una vez con HCl 1 N (300 ml), NaHCO_{3} sat. (300 ml); y NaCl sat. (300 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron. El disolvente se separó a presión reducida en una evaporadora giratoria y después con una bomba de vacío para dar el producto bruto (183 g; >100%), en una proporción de 6:1 del silanol y el material inicial hidrolizado. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,31 (2H, d, J = 8,7), 6,71 (2H, \delta, J = 8,7), 0,97 (9H, s), 0,18 (6H, s). Se usó como 100% sin purificar.

(b) Preparación de 4,4'-Di(t-butildimetilxililoxi)-1,1'-telurobisbenceno (4b)

Se colocó un matraz de 2 l de tres bocas en atmósfera de argón y se equipó con un agitador aéreo y un embudo de adición. Se añadieron virutas de magnesio (15,2 g, 0,66 mol). Se disolvió el bromuro 4a (17,2 g, 0,6 mol, usado como 100%) en THF (600 ml) y se transfirió a un embudo de adición. La reacción de Grignard se inició con aproximadamente 25 ml de la solución de bromuro y varios cristales de yodo. Se añadió la solución de bromuro restante a una velocidad tal que la reacción continuó a reflujo. La reacción se mantuvo a reflujo durante otros 30 minutos más después de haberse completado la adición, momento en el cual únicamente quedaba una pequeña cantidad de Mg. La reacción se enfrió ligeramente al baño maría, después se añadieron gránulos de telurio (76,8 g, 0,6 mol), y la reacción se volvió a calentar a reflujo durante 2,5 h, momento en el cual casi todo el Te se había consumido. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, después se vertió en NH_{4}Cl acuoso al 10% en agitación vigorosa (2 l) y se agitó durante 30 minutos. El Te precipitado se eliminó por filtración con tierra de diatomeas Celite y la torta de la filtración se lavó con éter. El filtrado se transfirió a un embudo separador y se extrajo tres veces con éter (1200 ml, 300 ml, 300 ml). Los extractos combinados se lavaron con agua y NaCl saturado, se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron con tierra de diatomeas Celite para eliminar tanto el MgSO_{4} como el Te que había precipitado durante el procedimiento. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar el producto crudo (194 g) en forma de aceite rojo. Se disolvió en tolueno (900 ml) con polvo de cobre (38 g), y se calentó a reflujo con un tubo de Newman durante 2,5 h, momento en el cual el color había cambiado de rojo a gris. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró con tierra de diatomeas Celite, se lavó con éter y se concentró, dando un aceite ámbar (181 g). Según la RMN de ^{1}H era una mezcla del producto deseado, Grignard inactivado y tolueno residual, y se calculó que contenía 0,23 moles de 4b. La purificación se efectuó mediante el aducto de yodo de 4b. El producto bruto se disolvió en acetona (0,6 l) y se añadió yodo (58 g, 0,23 mol) en porciones agitando vigorosamente. Después de 15 minutos, se había formado un precipitado muy espeso. Se añadió etanol (1,2 l) y el sólido naranja y sólido cristalino iridiscente oscuro se aisló por filtración y se secaron al aire. Se obtuvo una segunda cosecha volviendo a filtrar el filtrado. El rendimiento combinado fue de 206 g, y según la RMN era puro, siendo etanol residual el único contaminante. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,95 (4h; d, J = 8,7), 6,86 (4H, d, J = 8,7), 0,98 (18 H, s), 0,25 (12 H, s). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 158,6, 138,4, 121,9, 25,5, 18,2, -4,3. El aducto de yodo se disolvió en dioxano (500 ml), diclorometano (500 ml), y NaHSO_{3} acuoso al 5% (1,1 l) y el sistema de dos fases se agitó vigorosamente. Después de 1 h, la fase inferior (orgánica) era todavía roja, lo que indicaba una reducción incompleta. La mayor parte de la fase acuosa amarilla se decantó y reservó y la fase orgánica se evaporó a presión reducida. Se añadieron al residuo dioxano (200 ml), diclorometano (200 ml), y NaHSO_{3} ac. al 5% (400 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más. Se evaporó a presión reducida para eliminar parcialmente los disolventes orgánicos y el dioxano acuoso restante se transfirió a un embudo separador y se extrajo tres veces con éter. Los extractos combinados se lavaron con agua, NaHCO_{3} saturado y NaCl sat., se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron. La fase acuosa decantada de la etapa anterior se sometió al mismo procedimiento y se combinaron las dos. El disolvente se separó a presión reducida para dar 4b puro (97,3 g, 60%) en forma de aceite ámbar. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,54 (4H, d, J = 8,4), 6,80 (4H, d, J = 8,4), 0,96 (18H, s), 0,17 (12 H, s). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 155,8, 139,6, 121,5, 105,2 25,7, 18,2, -4,4. EMDF (m/e) 544 (M^{+}, ^{130}Te).

(c) Preparación de 4,4'-Telurobisfenol (4c)

Se disolvió éter de sililo 4b (54,2 g, 0,1 mol) en metanol (200 ml) en un matraz de base redonda de 500 ml. Se añadió fluoruro potásico (11,6 g, 0,2 mol) y la reacción se calentó a reflujo durante 1,5 h en atmósfera de argón. Después de enfriar la reacción a temperatura ambiente se vertió en agua (1,2 l) en agitación rápida, usando más metanol (20 ml) para facilitar la transferencia. El pH se ajustó a 14 con NaOH al 10% (aproximadamente 40 ml), y la reacción se filtró con tierra de diatomeas Celite. El filtrado se transfirió a un embudo separador y se lavó dos veces con diclorometano. La fase acuosa se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 2 l en un baño helado, y se añadió ácido acético con un pH de 6, dando como resultado la formación de un precipitado de color cremoso. El producto se aisló mediante filtración, se lavó con agua y se secó al aire para dar el producto bruto (29 g). Se adsorbió en gel de sílice ultrarrápido (150 ml) usando éter. La cromatografía a vacío en 1 l de gel de sílice ultrarrápido, eluyendo con diclorometano y después acetato de etilo: diclorometano 1:4 dio el producto puro. La trituración con diclorometano dio, en dos cosechas 4c puro en forma de sólido amarillo (24 g, 76%). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 5 gotas de DMSO) \delta 8,77 (2H, s), 7,29 (4H, d, J = 8,4), 6,47 (4H, d, J = 8,4).

(d) Preparación de 4,4'-Di(etoxicarbonilmetoxi)-1,1'-telurobisbenceno (4d)

Se colocó un matraz de 250 ml de tres bocas secado en horno en atmósfera de argón y se equipó con un agitador aéreo y un embudo de adición y se añadió hidruro sódico (60%, 1,76 g, 44 mmol). Se lavó con ciclohexano tres veces, después se añadió dimetilformamida seca (tamices) (60 ml). El matraz se colocó al baño maría y se añadió gota a gota una solución de bisfenol 4c (6,28 g, 20 mmol) en dimetilformamida seca (15 ml) gota a gota desde el embudo de adición (producción vigorosa de H_{2}). La mezcla espesa resultante se calentó en un baño de aceite a 85º durante 20 minutos (más producción de H_{2}). La mezcla espesa se enfrió a temperatura ambiente, y se añadió una solución de bromoacetato de etilo (6,68 g, 40 mmol) en dimetilformamida seca (5 ml) desde el embudo de adición, tiempo durante el cual se aclaró el precipitado. La reacción se agitó 45 minutos, después se vertió en agua (320 ml) en agitación vigorosa. El precipitado tostado resultante se aisló mediante filtración y se lavó con agua. Se fraccionó entre agua (50 ml) y diclorometano (80 ml). La fase acuosa se extrajo dos veces más con diclorometano y los extractos combinados se lavaron con agua y después NaCl saturado, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se filtraron. El disolvente se separó a presión reducida y el sólido resultante se recristalizó de etanol (50 ml), se enfrió y se filtró. El producto se obtuvo en forma de sólido blanco (5,3 g, 55%, pf 88,5-89º). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,60 (4H, d, J = 8,5), 6,75 (4H, d, J = 8,5), 4,58 (4H, s), 4,25 (4H, q, J = 7,1), 1,28 (6H, 6, J = 7,1). IR (KBr) 1765, 1720, 1580, 1480 cm^{-1}. EMDF (m/e) 488 (M^{+}, ^{130}Te). Anal. calc. para C_{20}H_{22}O_{6}Te: C, 49,43; H, 4,56. Hallada: C, 49,36; H, 4,55.

(e) Preparación de sal disódica de 4,4'-di(carboximetoxi)-1,1'-telurobisbenceno (4)

Se disolvió diéster 4d (39,2 g, 81 mmol) en metanol (400 ml) y se añadió NaOH ac. al 10% (47 ml, 170 mmol). Se formó una mezcla muy espesa. La reacción se calentó a reflujo durante 1 h. La mezcla espesa resultante se enfrió en un baño helado. El sólido se aisló mediante filtración y se lavó con etanol, se secó al aire y se molió con un mortero y mano para dar 4 en forma de sólido crema pálido (37,6 g, 98%). RMN de ^{1}H (DMSO-d_{6}, 5 gotas de D_{2}O) \delta 7,46 (4H, d, J = 8,4), 6,66 (4H, d, J = 8,5), 4,06 (4H, s). RMN de ^{13}C (D_{2}O) \delta 176,6, 158,0, 139,8, 115,9, 104,8, 66,5. IR (KBr) 3540, 3430, 1595, 1490, 1415, 1230 cm^{-1}. Anal. calc. para C_{16}H_{12}Na_{2}O_{6}Te\cdot1,5 H_{2}O: C, 38,37; H, 3,02. Hallada: C, 38,33; H, 3,05.

Preparación 5

Sal tetrasódica de N,N,N',N'-tetra(carboximetil) 4,4'-telurobisbencenamina (5) (a) Preparación de Éster etílico de N-(2-etoxi-2-oxoetil)-N-fenilglicina (5a)

Se sometieron a reflujo anilina (9,3 g, 0,1 mol), bromoacetato etílico (36,7 g, 0,22 mol) y 2,6-lutidina (23,5 g, 0,22 mol) en acetonitrilo (200 ml) durante 1 día en un matraz equipado con un tubo de Newman. La reacción se completó según la TLC (diclorometano). Se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con éter (200 ml). El clorhidrato de luditina precipitado se eliminó por filtración, y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se fraccionó entre éter y agua, y la fase acuosa se extrajo dos veces más con éter. Los extractos combinados se lavaron con HCl 1 N, agua, NaHCO_{3} saturado y NaCl saturado, se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a presión reducida para dar 5a bruto en forma de líquido oscuro. Se disolvió en diclorometano seco y se filtró con gel de sílice para eliminar el color, dando el producto (23,2 g, 88%) en forma de aceite pálido. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,21 (2H, t, J = 7,9), 6,77 (1H, t, J = 7,3), 6,61 (2H, \delta, J = 8,4), 4,20 (4H, q, J = 7,2), 4,13 (4H, s), 1,26 (6H, t, J = 7,1).

(b) Preparación de N,N,N',N'-Tetra(etoxicarbonilmetil)-4,4'-telurobisbencenamina (5b)

A un matraz de 500 ml de 3 bocas, secado en horno, equipado con un embudo de adición y en atmósfera de argón se añadió cloruro de telurio (IV) (11,9 g, 44 mmol). Se añadió éter seco (200 ml) mediante una jeringa, dando una mezcla fluida amarilla, y el matraz se colocó en un baño helado. Se preparó una solución de 5a (23,2 g, 89 mmol) en éter seco (50 ml) en atmósfera de argón y la solución se transfirió mediante una cánula al embudo de adición. Se añadió gota a gota a la reacción agitando vigorosamente. Inmediatamente se formó una pasta espesa y se dejó de agitar. El resto de la adición se realizó dando vueltas y agitando manualmente la reacción. La reacción reposó sin agitación hasta la mañana siguiente, después se sometió a ultrasonidos hasta que toda la pasta se convirtió en un sólido grumoso. Se filtró la reacción y la torta filtrada se lavó con éter. La torta filtrada se disolvió en diclorometano (200 ml) y se añadió una solución de metabilsulfito sódico (17,0 g, 89 mmol) en agua (200 ml) agitando. La mezcla de dos fases resultante se agitó 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió NaHCO_{3} hasta un pH 7 y la reacción se filtró con tierra de diatomeas Celite. El filtrado se transfirió a un embudo separador, la fase de diclorometano se separó y la fase acuosa se extrajo con más diclorometano. Los extractos combinados se lavaron con agua/NaCl sat., se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se filtraron y el disolvente se eliminó a presión reducida. El aceite rojo resultante (17,9 g) se disolvió en tolueno (100 ml), y se añadió polvo de cobre (9 g). La reacción se calentó a reflujo con un tubo de Newman durante 2 h. La reacción gris resultante se enfrió a temperatura ambiente, se filtró con tierra de diatomeas Celite y el disolvente se separó a presión reducida. El producto bruto (18 g de aceite ámbar) se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces con diclorometano y después con diclorometano:metanol para 98:2 para separar el producto del material inicial recuperado, dando 5b puro en forma de aceite viscoso naranja pálido (7,36 g, 50% del teórico). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (4H, d, J = 8,6), 6,43 (4H, d, J = 8,7), 4,19 (8H, 1, J = 7,1), 4,08 (8H, s), 1,25 (12H, t, J = 7,1). RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 170,7, 147,6, 139,5, 113,6, 101,3, 61,2, 53,3, 14,2. IR (placas salinas) 1730, 1580, 1490, 1180 cm^{-1}.EMDF (m/e) 658 (M^{+}, ^{130}Te).

(c) Preparación de Sal tetrasódica de N,N,N',N'-tetra(carboximetil)-4,4'-telurobisbencenamina (5)

Se disolvió el diéster 5b (4,35 g, 6,63 mmol) en metanol (60 ml) y se añadió NaOH ac. al 10% (7,4 ml, 26,5 mmol). La reacción se calentó a reflujo durante 1 h. La mezcla espesa resultante se enfrió en un baño helado, después se filtró. El sólido se lavó con metanol frío y se secó al aire para dar 5 en forma de un sólido crema pálido (3,81 g, 91%). RMN de ^{1}H (D_{2}O) \delta 7,56 (4H, d, J = 8,6), 6,38 (4H, d, J = 8,6), 3,83 (8H, s). RMN de ^{13}C (D_{2}O) \delta 179,4, 148,7, 139,6, 113,0, 98,3, 55,5. IR (KBr) 3250 (br), 1575, 1405, 1210 cm^{-1}. Anal. calc. para C_{20}H_{16}Na_{4}N_{2}O_{8}\cdot3 H_{2}O: C, 35,02; H, 3,23; N, 4,08. Hallada: C, 34,82; H, 3,03; N, 4,04.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la invención:

Ejemplo 1

Los recubrimientos descritos se cortaron en tiras y se montaron en forma de placas. Se prepararon cartuchos que contenían las placas colocando los cartuchos sobre el banco de trabajo durante 16-20 horas manteniendo las luces del laboratorio encendidas durante este periodo de tiempo. El día después de la incubación sobre el banco de trabajo, se analizaron las placas usando un analizador de inmunoensayo de película fina automatizado prototipo. Se aplicaron 11 \mul de una solución matriz de suero humano que contenía 10.000 mUl/ml de hCG a cada placa. Cada placa se incubó después durante 5 minutos a 37ºC después de lo cual se aplicaron a cada placa 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM), cloruro de hexadecilpiridinio (0,1 %), H_{2}O_{2} (8 mM), y ácido dietilentriaminapenta-acético (DTPA) (10 \muM). El fluido de lavado completa la eliminación del anticuerpo no unido - marcador de peroxidasa de rábano del área de lectura y sirve para iniciar la reacción de formación de tinte catalizada por HRP. Después de añadir la solución de lavado, se somete a cada placa a una segunda incubación a 37ºC. Durante este tiempo se toman las lecturas de densidad de reflectancia con intervalos de 3 segundos con una longitud de onda de 670 nm. Se calculó la velocidad de formación de color para las placas de cada recubrimiento a partir de las lecturas de densidad de reflectancia.

Los recubrimientos en película fina para el ensayo de gonadotropina coriónica humana (hCG) en las muestras de suero de las siguientes formulaciones se prepararon sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato). (Los términos usados en todas las estructuras de recubrimiento se describen en el Apéndice A.)

Recubrimiento 1

4

Recubrimiento 2

5

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Recubrimiento 3

6

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Recubrimiento 4

8

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Recubrimiento 5

10

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Recubrimiento 6

12

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Comparación de las placas de los cartuchos para los recubrimientos 1-6

14

La comparación de placas del cartucho demuestra claramente que en las primeras placas del carro ocurre una gran pérdida de velocidad porcentual cuando no se incorpora VOSO_{4} ni los compuestos de DAT en el recubrimiento. Esta pérdida de velocidad de la formación de color en la primera placa daría como resultado una predicción de concentración de analito incorrecta para la muestra analizada. La inclusión de VOSO_{4} (recubrimiento 2), los compuestos DAT (recubrimientos 3 y 4) o la combinación de VOSO_{4} y los compuestos de DAT (recubrimientos 5 y 6) da como resultado una marcada mejora de la retención de la velocidad porcentual de las primeras placas.

Ejemplo 2

Para diferenciar más los efectos de los compuestos de DAT investigados, se colocaron placas de cada recubrimiento cara arriba directamente sobre el banco de trabajo y se expusieron a las mismas condiciones que las placas que permanecían en los cartuchos (16-20 horas de incubación a temperatura ambiente con luces fluorescentes encendidas). Después del periodo de incubación, se analizaron las placas en un analizador de inmunoensayo de película fina automatizado prototipo usando los mismos materiales y protocolo descritos anteriormente. El resultado esperado es una mayor pérdida de la velocidad de formación de color debido a la mayor exposición de las placas a factores ambientales (luz, aire, etc.). Como medio para observar el efecto de la mayor exposición ambiental, se comparó la velocidad de formación de color de las placas del banco de trabajo con la velocidad de formación de las placas del cartucho para cada condición (excluyendo las placas superiores). Los resultados de las placas tratadas como se describe son los siguientes:

Comparación de las placas de los cartuchos para los recubrimientos 1-6

15

La prueba de las placas del banco demuestra otra vez que la inclusión de VOSO_{4} (recubrimiento 2), los compuestos de DAT (recubrimientos 3 y 4), o la combinación de VOSO_{4} y los compuestos de DAT (recubrimientos 5 y 6) en el recubrimiento proporcionan protección contra la pérdida de velocidad debido a la exposición ambiental. Esta prueba muestra también que se produce una función de cooperación cuando se incorporan VOSO_{4} y 1 en el mismo recubrimiento (recubrimiento 5). Esto da como resultado una pérdida menor de la velocidad porcentual que cuando cualquiera de los dos compuestos se incorpora solo (recubrimientos 2 y 3).

Se evaluaron todos los DAT (1-5) en un sistema modelo diseñado para acentuar la pérdida de la actividad de HRP. En este sistema, los DAT 1, 4, y 5 protegieron la actividad de HRP solos o en cooperación con una sal de vanadilo como se muestra en los siguientes ejemplos.

Ejemplos 3-5

Se prepararon los elementos de análisis de la siguiente formulación sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato):

16

Este elemento analítico se usó para medir la estabilidad de HRP con el siguiente protocolo. Se sembraron muestras de 10 microlitros de la solución de tampón de fosfato 10 mM, pH 7,0, que contenía HRP aproximadamente 3 x 10^{-8} M y cantidades variables de uno de los compuestos de telururo de diarilo de la invención en cada uno de distintos trozos de 1 cm^{2} del elemento recubierto anterior (4 muestras para cada compuesto con cada concentración). Estos elementos se secaron y se colocaron en un cajón oscuro. Después de 30 minutos y de nuevo después de 24 horas, es decir, al día siguiente, se sacaron los elementos del cajón y se extrajo la HRP sumergiendo cada elemento en 1 ml de una solución de tampón de fosfato sódico 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, albúmina de suero bovino al 0,1%, pH 7,0, en un tubo de ensayo para extraer la HRP. Después de agitar con vórtice el tubo de ensayo durante 1 minuto (que separó los componentes del elemento analítico del soporte de poli(etilen tereftalato)), la suspensión resultante se centrifugó y se separó la solución. La cantidad de HRP activa en esta solución se determinó añadiendo una alícuota de 100 \mul a una cubeta de un espectrómetro y una solución de reactivos para proporcionar un ml de una solución final de tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,0, 4'-hidroxiacetanilida 4 mM, tensioactivo Triton X-100 al 0,625%, tinte leuco 4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)imidazol al 0,005%, y peróxido de hidrógeno 0,85 mM. La temperatura del ensayo era de 30ºC. Se formó un color azul cuya velocidad se determinó espectrométricamente a 655 nm. La velocidad de formación de color era directamente proporcional a la cantidad de enzima activa en el extracto.

Los datos se expresaron como proporciones de la actividad, calculadas dividiendo la actividad extraída a las 24 horas entre la actividad extraída a los 30 minutos para cada muestra. Una relación de 1 indicaba que la enzima estaba completamente protegida por el aditivo durante un periodo de 24 horas. Se observó alguna variación de los datos entre tandas, probablemente provocada por las diferencias diarias de humedad y temperatura ambientales. Esto podría afectar a lo rápido que se secaba la HRP en el recubrimiento y afectar así a la estabilidad aparente de la enzima. Por lo tanto, los datos pueden compararse entre los Ejemplos 3-5, pero no entre dos ejemplos cualesquiera.

Ejemplo 3

Se compara la efectividad de los compuestos 1, 2, 3, y 4 a 1 mM solos o en presencia de VOSO_{4} 1 mM (Figura 1). Los compuestos 1 y 4 protegieron la actividad de HRP en el formato seco modelo comparado con el que no tenía aditivo. Cuando se incluyeron tanto VOSO_{4} como uno cualquiera de 1 ó 4, se mantuvo más actividad de HRP que en presencia de cualquiera de ellos solos.

Ejemplo 4

Se muestra el efecto de la concentración sobre la capacidad de 1 y 4 de estabilizar HRP (Figura 2). Se usaron las siguientes concentraciones en la solución de HRP: 1, 0,1 ó 0,01 mM de 1 y 10, 1 ó 0,1 mM de 4. Además, se sembraron las soluciones de HRP que contenían únicamente tampón, o VOSO_{4} 1 mM. La pérdida de la actividad dependía de la concentración del reactivo tanto para 1 como para 4. En presencia de 4 10 mM, la actividad de HRP estaba completamente protegida después de una incubación de 24 horas.

Ejemplo 5

Este ejemplo muestra el efecto de 4 y 5 sobre la estabilidad del conjugado enzimático anti-CRP-HRP (2,85 x 10^{-8}M). También estaban presentes en la solución de sembrado sólo tampón; 4 1, 2, 4 ó 8 mM; o 5 1 ó 8 mM. Tanto 4 como 5 protegían la actividad de HRP conjugada, y la protección dependía de la concentración (Figura 3).

Ejemplo 6

Los recubrimientos 7-10 se prepararon como se indica en las siguientes estructuras de recubrimiento, 7-10, se montaron en forma de placas, se acondicionaron a 21,1ºC F/HR del 33% durante dos días y se congelaron.

Recubrimiento 7

Se preparó un recubrimiento en película fina de la siguiente formulación sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato) para el ensayo de proteína C reactiva (CRP) en muestras de suero.

17

18

Recubrimiento 8

Se preparó un recubrimiento en película fina de la siguiente formulación sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato) para el ensayo de proteína C reactiva (CRP) en muestras de suero.

19

Recubrimiento 9

Se preparó un recubrimiento en película fina de la siguiente formulación sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato) para el ensayo de proteína C reactiva (CRP) en muestras de suero.

21

Recubrimiento 10

Se preparó un recubrimiento en película fina de la siguiente formulación sobre un soporte de poli(etilen-tereftalato) para el ensayo de proteína C reactiva (CRP) en muestras de suero.

23

Se descongelaron los cartuchos y se cargaron en un analizador E250.

Se aplicaron a cada placa 11 \mul de una muestra de suero humano que contenía aproximadamente 20 mg/l de CRP. Cada placa se incubó después durante 5 minutos a 37ºC después de lo cual se aplicaron 12 \mul de una solución de lavado que contenía Na_{2}HPO_{4} (10 mM, pH 6,8), 4'-hidroxiacetanilida (5 mM) cloruro de hexadecilpiridinio (0,1%), H_{2}O_{2} (8 mM), y DTPA (10 \muM) a cada placa para lavar el conjugado de anticuerpo no unido-HRP del área de lectura e iniciar la reacción de formación de tinte catalizada por HRP. Después de 2,5 minutos de incubación a 37ºC, se mide la densidad de reflectancia a 670 nm y se convierte en una concentración de CRP mediante una curva de calibrado.

La concentración prevista para la placa superior se comparó con la concentración media predicha por las seis placas siguientes. A continuación se muestran los resultados de varios experimentos de este tipo:

Desviación = predicción para la placa superior - predicción para la media de las placas 2-7;

25

Estos resultados muestran que, en ausencia de agente protector, la placa superior prevé un valor sustancialmente inferior que las placas subsiguientes. La adición de DTA 1 ó 2 o VOSO_{4} disminuye la desviación entre la placa superior y las placas subsiguientes.

La mayor mejora es proporcionada por 1.

Ejemplo 7

Los recubrimientos 7-10 se cortaron en tiras, se montaron en forma de placas, se acondicionaron a 21,1ºC F/HR del 33% durante 2 días y se congelaron.

Se descongelaron los cartuchos. Se extrajo la placa superior de cada cartucho y los cartuchos se incubaron a 21,1ºC F/HR del 33% durante 3 días.

Se analizaron las placas con suero humano que contenía aproximadamente 20 mg/l de CRP como se describe en el Ejemplo 6.

Se comparó la predicción de la placa superior que recibió una exposición de tres días a 21,1ºC F/HR del 33% con la predicción media de las placas 2-7 y los resultados se muestran a continuación:

Desviación = predicción de la placa superior – predicción de la media de las placas 2-7;

Recubrimiento	Agente	Media de 2 carros
7	ninguno	-26,4
8	1	-4,5
9	2	-8,2
10	VOSO_{4}	-5,6

Estos resultados muestran que una placa superior expuesta recientemente cambia en un periodo de 3 días dando como resultado una predicción que es sustancialmente menor que las placas subsiguientes en ausencia de un agente protector. Los telururos de diarilo 1 y 2 y VOSO_{4} protegen la placa y dan como resultado una desviación menor comparada con las placas subsiguientes del cartucho y, de nuevo, 1 demuestra la mejora mayor.

Ejemplo 8

Los recubrimientos 7-10 se cortaron en tiras, se montaron en forma de placas, se acondicionaron a 21,1ºC F/HR del 33% durante 2 días y se congelaron.

Se descongelaron los cartuchos y se incubaron a 21,1ºCF/HR del 33% durante 7 días.

Los cartuchos incubados y los cartuchos recién descongelados se analizaron con muestras de suero humano que contenían CRP en el intervalo de 10-30 mg/l como se describe en el Ejemplo 6. Se compararon las predicciones de las placas incubadas con las predicciones de las placas recién descongeladas. Se determinó la desviación media de las placas incubadas comparada con las placas recién descongeladas para los 3 fluidos y se muestra a continuación.

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Recubrimiento	Agente	Desviación media
7	ninguno	-7,8
8	1	0,8
9	2	-2,62
10	VOSO_{4}	-0,26

Estos resultados demuestran que, en ausencia de agente protector, las placas expuestas a 21,1ºC F/HR del 33% durante 7 días desarrollan una desviación comparada con las placas recién descongeladas. En presencia de 1 o 2 o VOSO_{4} se reduce sustancialmente la desviación que resulta de esta exposición.

La invención da como resultado una mejora de la estabilidad de HRP ya sea sola o en conjunción con otros estabilizantes tales como compuestos de vanadilo.

TABLA

Polímero adhesivo

Poli(metilacrilato-co-2-acrilamido-2-metilpropanosulfonato-co-2-acetoacetoxietilmetacrilato)sódico

Perlas con anticuerpo

Partículas poliméricas de poli(estireno-co-ácido 3-(p-vinilbenciltio)propiónico que tienen un anticuerpo contra gonadotropina coriónica humana unido sobre ellas.

Perlas de PC

Partículas poliméricas de poli(estireno-co-ácido 3-(p-vinilbenciltio)propiónico que tienen fosforilcolina unida sobre ellas.

BSA

Albúmina de suero bovino.

BVSME

Bis(vinilsulfonilmetil)éter.

DTPA

Ácido dietilentriaminapenta-acético

Marcador

Un conjugado de un anticuerpo contra gonadotropina coriónica humana y peroxidasa de rábano tiolada.

Tinte Leuco

4,5-Bis-(4-dimetilaminofenil)-2-(3,5-dimetoxi-4-hidroxifenil)imidazol.

Tinte magenta

Sal sódica del ácido 4,5-dihidroxi-3-(6,8-disulfo-2-naftilanzo)-2,7-naftalendisulfónico.

MOPS

Tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico.

Olin 10G

Un tensioactivo de isononilfenoxipoliglicidol que tiene de media aproximadamente 10 unidades de glicidol por molécula (vendido por Olin Chemical Co).

Perlas poliméricas

Partículas de poli(viniltolueno-co-ácido metacrílico) que tienen un diámetro medio de 20-40 \mum.

Aglutinante polimérico

Poli(N-isopropilacrilamida-co-sal sódica del ácido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfónico-co-N,N'-metilenbisacrilamida).

Aglutinante polimérico I

Poli(N-isopropilacrilamida-co-2-hidroxietil-metacrilato-co-N,N'-metilenbisacrilamida) (IMnAg).

TES

Tampón de ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico.

TX-100

Tensioactivo Triton X-100 - un tensioactivo de octilfenoxi polietoxi etanol (vendido por Union Carbide).

Tetronic T908

Un tensioactivo no iónico que es un copolímero de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno (vendido por BASF Corp).

Se ha descrito la invención en detalle con referencia particular a sus realizaciones preferidas, pero se entenderá que pueden efectuarse variaciones y modificaciones dentro del alcance de la invención.

Claims (11)

1. Un elemento analítico de inmunoensayo en seco para ensayar un ligando, que comprende un soporte que porta:

(a) un ligando marcado enzimáticamente o una zona de receptor marcado enzimáticamente;

(b) una zona de extensión; y

(c) una zona de receptor que contiene una concentración fija de un receptor inmovilizado para el ligando y el ligando marcado cuando están presentes, en el que el receptor se une covalentemente a perlas poliméricas que tienen un diámetro en el intervalo de 0,1 a 5 \mum; que se caracteriza porque el elemento contiene un compuesto de telururo de diarilo (DAT) y las zonas pueden estar en la misma capa o en capas separadas.

2. El elemento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el telururo de diarilo comprende una estructura (I):

Ar^{1}-Te-Ar^{2}

en la que Ar^{1} y Ar^{2} representan grupos arilo o heteroarilo iguales o diferentes, sustituidos o no sustituidos, que tiene los siguientes sustituyentes:

26

en los que X es O, S, Se o Te y R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{31}, R^{32}, R^{33}, R^{41}, R^{42} y R^{43} son iguales o diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, OH, OR^{1}, SH, NH_{2}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, NR^{1}R^{2}, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales y SR^{1}, en el que R^{1} y R^{2} son diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por alquilo que tiene una cadena de carbonos de 1 a 14 átomos de carbono que opcionalmente portan uno o varios grupo hidrófilos, fenilo y fenilo sustituido.

R^{14}, R^{15}, R^{24} y R^{25} son iguales o diferentes y cada uno se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo que tiene 1-5 átomos de carbono, alcoxi que tiene 1-5 átomos de carbono, CO_{2}H o sus sales, CO_{2}R^{1}, SO_{3}H y sus sales, PO_{3}H_{2} y sus sales.

3. El elemento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la peroxidasa de rábano o un derivado de la peroxidasa de rábano es el marcador en el ligando marcado o el receptor marcado.

4. Un procedimiento para el ensayo de un ligando inmunológicamente reactivo en una muestra líquida acuosa, que comprende las etapas de:

A. proporcionar un elemento analítico de inmunoensayo en seco de acuerdo con la reivindicación 1;

B. poner en contacto un área finita de la zona o capa superior del elemento con una muestra formando así: (i) un complejo ligando-receptor inmovilizado, (ii) un complejo ligando-receptor marcado enzimáticamente inmovilizado; o (iii) una mezcla de (i) y (ii); o un complejo receptor-ligando-receptor marcado inmovilizado.

C. poner en contacto el área finita con una solución de sustrato catalizando así la aparición de un color; y

D. determinar la concentración del ligando colorimétricamente.

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5. Una composición para su uso en un ensayo de un ligando inmunológicamente reactivo que comprende un compuesto que contiene un telururo de diarilo y peroxidasa de rábano o un conjugado del mismo.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5 en la que el compuesto se selecciona del grupo constituido por:

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7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el compuesto es:

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8. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el compuesto es:

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9. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el compuesto es:

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10. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el compuesto es:

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11. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el compuesto es:

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