CN114487409B

CN114487409B - 一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN114487409B
Application number: CN202210388301.0A
Authority: CN
Inventors: 任朋亮; 王俊皓; 孙亚军; 秦刚
Original assignee: Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
Current assignee: Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114487409A

Abstract

本发明提供一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒，其包括如下步骤：（1）将第一肽底物、第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品分别混合孵育形成肽复合物；第一肽底物和第二肽底物的质量比为10~150:1；（2）使肽复合物附着在支持物上；（3）加入能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物以及显色底物，检测反应体系发出的信号值，并根据转肽酶A标准品的检测结果评估待测样品的酶活性。本发明的方法可以同时反映转肽酶实际工艺应用过程中的水解和偶联功能，并且检测灵敏度高，具有更低的定量下限，其检测成本低、通量高、操作简单。

Description

一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物分析、免疫检测、酶活检测领域，具体涉及一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

在日趋火热的生物靶向药物领域，抗体偶联药物（Antibody Drug Conjugates，ADC）因其独特的结构特征、高效低毒的疗效而备受关注，然而ADC药物的成功离不开偶联技术的进步。传统化学偶联技术在ADC偶联过程中存在着制备工艺复杂、对蛋白质活性有损伤、连接产物不均一等问题，而基于转肽酶（Sortase）介导的ADC偶联技术可以很好地克服传统化学连接法的一系列问题，并具有反应条件温和、反应效率高、底物适用性广等明显优势，代表了蛋白质连接技术的发展新趋势。

现阶段用于合成或生产特异性标记蛋白、抗体产品的转肽酶越来越多。由于转肽酶制备工艺复杂、批间质量控制难度较高，所以一个可靠、健全的检测转肽酶活性的方法显得尤为重要。目前市面上有一些针对转肽酶A的检测试剂盒，如阿纳斯派克（AnaSpec）公司采用5-FAM/QXL^® FRET（5-FAM-LPXTG）为底物，转肽酶A水解该底物后释放FRET荧光基团，捕获荧光信号。Ryan G. Kruger等人设计了Dabcyl-QALPETGEE-Edans作为底物，转肽酶水解后应用HPLC进行信号检测。

现有的检测方法都仅用于检测转肽酶 A的水解功能，而应用于偶联技术的转肽酶A包含水解和偶联两个功能，水解和偶联的主要功能位点也是分开的；转肽酶A的水解反应速率要远远慢于其偶联速率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时反映转肽酶水解和偶联活性的检测方法及检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供一种转肽酶活性的检测方法，其包括如下步骤：

（1）将第一肽底物、第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品分别混合孵育形成肽复合物；其中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为10~150:1；

所述第一肽底物的结构式如式（I）所示：

；

所述第二肽底物的结构式如式（II）所示：

；

（2）通过所述肽复合物上的His标签与支持物上的His标签抗体结合，使所述肽复合物附着在所述支持物上；

（3）向步骤（2）的反应体系中加入能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物以及显色底物，检测反应体系发出的信号值，并根据所述转肽酶A标准品的检测结果评估所述待测样品的酶活性。

在一些实施方案中，所述能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物为偶联酶的亲和素。在一些实施方案中，亲和素为链霉亲和素。在一些实施方案中，能够催化底物发出信号的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）或葡萄糖氧化酶。

本申请不再仅局限于检测转肽酶的水解活性，本申请通过两个肽底物形成的复合物带有的信号标记物并结合信号值检测法建立转肽酶活力检测方法，该方法完全模拟了转肽酶在ADC工业应用中的作用与功能：同时反映转肽酶实际工艺应用过程中的水解和偶联功能。

在一些实施方案中，步骤（1）中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为10:1，20:1，30:1，40:1，50:1，60:1，70:1，85:1，93:1，97:1，98:1，100:1，102:1，110:1，120:1，125:1，130:1，137:1，140:1，150:1。在一些实施方案中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为80~120:1。在一些实施方案中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为100:1。在一些实施方案中，所述第一肽底物、所述第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品按照等体积投料。

在一些实施方案中，采用酶联免疫法进行检测，具体方法包括：使所述肽复合物与包被在支持物上的小肽标签抗体结合，然后加入偶联亲和素的催化底物显色的酶的复合物，再加入显色底物进行反应得到所述反应体系。在一些实施方案中，亲和素和催化底物显色的酶的复合物为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）或葡萄糖氧化酶标记的链霉亲和素。

在一些实施方案中，所述小肽标签抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述小肽标签抗体能够与所述小肽标签结合。在一些实施方案中，所述小肽标签抗体为His标签抗体（即His-Tag mAb）。

在一些实施方案中，所述显色底物为能够被所述辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）或葡萄糖氧化酶催化水解并显色的物质。在一些实施方案中，采用辣根过氧化物酶时，所述显色底物优选为TMB（3', 3', 5', 5', -四甲基联苯胺）。

在一些实施方案中，根据所述酶联免疫法测定的反应体系的信号值评估所述待测样品的酶活性的具体方法包括：将所述转肽酶A标准品的浓度与对应的信号值拟合出标准曲线，将所述待测样品的信号值（如OD值）带入所述标准曲线中并计算出所述待测样品的浓度，再根据所述待测样品的浓度评估所述待测样品的酶活性。本申请通过对转肽酶A标准品的信号值以及浓度，可以得出待测样品的信号值和浓度，可以灵敏地反映出待测样品的活性。

在一些实施方案中，所述转肽酶A标准品的浓度范围为78 ng/mL~2500 ng/mL。

在一些实施方案中，所述检测方法还包括测定不同浓度的转肽酶质控品的步骤，所述转肽酶质控品的浓度范围为78 ng/mL~2000 ng/mL。

在一些实施方案中，所得标准曲线公式如式（III）所示：

y=D+(A-D)/(1+(x/C)^B) （III）

式（III）中，y表示OD450值-OD630值，x表示转肽酶浓度。

在一些实施方案中，所得标准曲线公式如式（IV）所示：

y=3.523–3.497/(1+(x/862.6)^1.566) （IV）。

本发明另一方面提供一种转肽酶A活性的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

（1）将第一肽底物、第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品分别等体积混合孵育形成肽复合物；其中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为10~150:1；所述第一肽底物的结构式如上述式（I）所示；所述第二肽底物的结构式如上述式（II）所示；

（2）将所述肽复合物转移至包被His标签抗体的酶标板上孵育，洗涤除去未结合的肽复合物；

（3）向步骤（2）的反应体系中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，洗涤除去未结合的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和，然后加入3', 3', 5', 5', -四甲基联苯胺显色底物，采用硫酸终止反应后，检测反应体系发出的OD值，并根据所述转肽酶A标准品的检测结果评估所述待测样品的酶活性。

本申请进一步对检测原料、检测参数等进行优化，使得检测灵敏度可以从现有商业化检测试剂盒的μg/mL提高到ng/mL级别，具备更低的定量下限。本发明另一方面还提供一种用于测定转肽酶活性的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一肽底物、第二肽底物和转肽酶A标准品；所述第一肽底物的结构式如上述式（I）所示；所述第二肽底物的结构式如上述式（II）所示。

在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括与第二肽底物上标签结合的标签抗体。在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）或葡萄糖氧化酶标记的链霉亲和素。在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括显色底物。

在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括转肽酶A质控品。

在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括转肽酶A标准品，转肽酶A质控品，式（I）所示第一肽底物，式（II）所示第二肽底物，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶标记的链酶亲和素，显色底物，His标签抗体。

在一些实施方案中，检测试剂盒还包括用于稀释转肽酶A标准品、质控品和待测样品的溶剂：Tris-HCl缓冲液，其pH值为6.9-7.3。在一些实施方案中，pH值为6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明通过两个肽底物并结合酶联免疫法或荧光物标记法建立的转肽酶活力检测方法，可以同时反映转肽酶实际工艺应用过程中的水解和偶联功能，并且检测灵敏度高，具有更低的定量下限，检测成本低、通量高、操作简单，可应用于工业工艺放行的稳健检测。

附图说明

图1为实施例1的标准曲线。

具体实施方式

本发明的说明书中公开了所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了相互排斥的特征或步骤以外，均可以以任何方式组合。下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明不应限于这些实施例，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中一个例子而已。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

为了解决现有技术中的检测方法仅反映转肽酶A（Sortase A）的水解活性，并且检测灵敏度仅达到μg/mL这些问题，本申请基于以下两点预期自行设计了全新的实验架构，并完成方法建立与工艺应用：

第一：检测方法能够完全反映转肽酶 A水解和偶联两个功能模块；

第二：转肽酶 A检测方法相对稳健灵敏，可以应用于生产工艺放行要求。

本申请实施例中方法的建立是基于酶联免疫吸附试验（ELISA）检测技术，下述实施例的原理为：将两个肽底物（第一肽底物和第二肽底物）按合适比例与转肽酶 A等体积混合后共同孵育，形成肽复合物，其中第一肽底物的 N端偶联生物素（Biotin），第二肽底物的C端偶联His标签（His-Tag），第一肽底物为：生物素-PEG4-LPETGG（Biotin-PEG4-LPETGG），第二肽底物为：GGGGG-PEG4-His-His-His-His-His-His；将肽复合物转移至包被抗His标签抗体（本文也称His标签抗体）的 96孔板上孵育，肽复合物偶联的His标签能够和96孔板上包被的His标签抗体牢固结合，洗涤除去未结合的肽复合物，然后加入一定比例辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）孵育；洗涤除去未结合的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加TMB显色合适时间后用1M硫酸终止反应；OD值与标本中受检物质的量呈正相关性，再根据定义的酶活力评估样本的酶活。

本申请的上述方法具有下列优势：

（1）不再仅局限于检测转肽酶A的水解活性，可同时反映转肽酶A实际工艺应用过程中的水解和偶联功能，从而可以完全模拟转肽酶A在ADC工业应用中的作用与功能；

（2）检测灵敏度从现有μg/mL提高到ng/mL级别，具有更低的定量下限，检测灵敏度达到了78 ng/mL；

（3）提供低成本、高通量、易操作，高精密度的检测方法；

（4）提供可应用于工业工艺放行的稳健检测方法。

实施例1

1、主要材料和设备

美谷分子仪器公司（Molecular Device）的全波长酶标仪，96孔V底稀释板，96孔酶标板。

2、生物和化学试剂的来源与制备方法

第一肽底物: 生物素-PEG4-LPETGG (20 mg/mL)和第二肽底物: GGGGG-PEG4-His-His-His-His-His-His(20 mg/mL)的制备方法主要为：

第一肽底物和第二肽底物均以二氯树脂为起始原料，通过脱保护、偶联等常规步骤进行合成；第一肽底物先固相合成LPETGG，再依次固相添加4分子PEG和1分子生物素，最后用三氟乙酸切割液从树脂上将多肽切割，制备纯化冻干后得到；第二肽底物先固相合成GGGGG，再依次固相添加4分子PEG和6分子His，最后用三氟乙酸切割液从树脂上将多肽切割，制备纯化冻干后得到。

转肽酶A（4.31 mg/mL）：转肽酶A酶来源于大肠杆菌BL21 DE3胞内表达，宿主菌先摇瓶扩增，发酵罐培养，然后通过高压破碎及澄清，多步层析步骤纯化获得。

20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH7.2），PBST（成分为PBS+0.05%吐温-20），分析缓冲液（assay buffer）（成分为含0.5% BSA，0.05% 吐温20的PBS缓冲液），0.5 M EDTA（默克，货号为324504），6×His标签单克隆抗体（赛默飞，货号为MA1-21315；或诺唯赞），10×PBS（伯乐，货号为1610780），辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（R&D，货号为890803），TMB显色液Ⅶ（博达生物，货号为TMB-S-004）。

3、方法步骤

（1）使用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释6×His标签单克隆抗体溶液（诺唯赞）为1µg/mL，100 µL每孔加入到96孔酶标板中，2-8℃孵育过夜；

（2）甩掉板中液体，使用PBST洗涤3次（300 µL/孔），350 rpm震荡30 sec；拍干，加入含5% BSA的PBST，250 µL/孔，25℃孵育2 h；

（3）封闭完成后，使用PBST洗涤3次（每次300µL/孔），拍干备用；

（4）用Tris-HCl缓冲液稀释转肽酶A，分别配制不同浓度标准品，将配制好的标准品、质控品按照板布局加入到96孔V底稀释板，50 µL/孔；

（5）分别配制不同浓度的第一肽底物与第二肽底物，等体积混合后100 µL/孔加入到96孔V底稀释板，25℃、450 rpm孵育1h；

（6）用分析缓冲液将0.5 M EDTA稀释至60 mM，向96孔V底稀释板中对应加入60 mMEDTA（50 µL/孔），550 rpm，30 min后终止反应；

（7）终止结束后，将连接产物130 µL/孔转移到包被6×His标签单克隆抗体的酶标板中，450 rpm、25℃孵育1h；

（8）孵育完成后，用PBST洗涤3遍，拍干酶标板，按1:3000比例加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素（100µL/孔），350 rpm、25℃孵育1 h；

（9）孵育完成后，用PBST洗涤3遍，拍干酶标板，加入TMB显色液Ⅶ（100µL/孔），25℃静置孵育10～12 min；

（10）加入1 M硫酸（100 µL/孔）以终止反应，置于酶标仪中读数；

（11）酶标仪参数设定如下表1。

表2为不同浓度的转肽酶A以及不同浓度的第一肽底物与第二肽底物的OD读数，其中，表2中的P1为第一肽底物，P2为第二肽底物，浓度为µg/ml。如表2所示，当第一肽底物与第二肽底物的浓度为500µg/ml:5µg/ml时，信号响应最高，响应区间更大，所以该浓度比是最优反应比例。

实施例2

（1）使用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释6×His标签单克隆抗体（赛默飞）溶液为2 µg/mL，100 µL每孔加入到96孔酶标板中，2-8℃孵育过夜；

（4）用Tris-HCl缓冲液稀释转肽酶A，分别配制标准品和质控品，转肽酶A标准品S1～S8浓度梯度依次为5000 ng/mL、2500 ng/mL、1250 ng/mL、625 ng/mL，313 ng/mL、156ng/mL、78 ng/mL、39 ng/mL，质控品的浓度梯度依次为2000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、78 ng/mL；定量上限和下限分别为2500 ng/mL和78 ng/mL，其中S1和S8为锚定点；将配制好的标准品、质控品及待测样品按照板布局加入到96孔V底稀释板，50 µL/孔；

（5）将第一肽底物与第二肽底物分别用Tris-HCl缓冲液稀释至500 µg/mL和5 µg/mL，等体积混合后100 µL/孔加入到96孔V底稀释板，25℃、450 rpm孵育1h；

（10）加入1 M硫酸（100 µL/孔）以终止反应，置于酶标仪中读数，酶标仪参数设定同实施例1；

（11）以四参数方程将标曲进行拟合，然后将样品信号值插入该四参数方程计算出对应样品的浓度测量结果，再根据定义的酶活力评估样本的酶活。

实验结果

（1）标准曲线(无权重)：标准曲线的型态呈S型曲线，见附图1；标准曲线拟合的参数如表3所示：四参数逻辑 y = D + (A-D)/(1+(x/C)^B)。标准曲线的精密度和准确度均在一般生物分析试验接受标准范围内，不超过20%的偏差，其中锚定点（S1，S8）不参与接受标准评定，具体实验结果见下表4。

（2）每个水平质控样本至少50%且整体三分之二满足接受标准。以下表5提供了2位分析人员执行的3个分析批的批间精密度和准确度数据统计，结果显示，该方法重复性良好，具备工艺放行条件。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。