JP2000510242A - 生物学的に活性な物質の固相活性アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 固相アッセイを通して、生物学的に活性な物質の生物学的活性の程度、同一性および／または該活性物質の量を検出または測定する方法を開示する。この方法は、該物質自体の生物学的活性を利用して、該検出法を提供する。この方法は競合的および非−競合的アッセイを与える。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的に活性な物質の固相活性アッセイ 発明の背景 技術分野 本発明は、一般的には生物学的活性をもつ分子の同一性、量および活性を検出 並びに測定する方法に関する。より詳しくは、本発明は酵素、酵素阻害剤、レク チン、レセプタおよびその他の生物学的に活性な分子の量並びに活性を、固相ア ッセイ技術を使用して測定する方法に関するものである。 背景技術 バインダー−リガンドアッセイ、例えばイムノアッセイは、当分野において周 知であり、かつ抗体に基づく同定を利用する、物質の存在を定量するのに利用さ れる（吟味のためには、Stites等，ベーシック＆クリニカルイムノロジー(Basic and Clinical Immunology，第８版，Appleton & Lange，pp．170-176を参照の こと）。しかしながら、イムノアッセイは２つの欠点を有する。第一の欠点は、 対象とする物質に対して発生した抗体を必要とすることである。その第二は、同 定すべき物質が生物学的活性をもつ、例えば酵素である場合に、該イムノアッセ イは、該物質の存在のみを決定でき、該物質の活性のレベルを決定することはで きない。 酵素活性、レセプタ機能等を測定するためのアッセイがあるが、固相技術を利 用しおよび成分の最小量の調製によっても精度を維持する、即ち物理的な分離工 程を必要としない、このようなアッセイを利用できることが有用であり、また多 数のサンプルのルーチン的アッセイに適したものであることが有利である。 一例として、酵素は生物学的反応において重要な役割を演じている。その活性 の測定は、生物学に関連する全ての分野、例えば医学、食品および医薬品の分野 において重要である。酵素アッセイのために通常使用されている該方法は、主と して酵素触媒により、基質からの生成物の形成に依っている(Loround，1981;Ros somando，1990)。これらの方法は、多くの生物学的研究の主流であるが、酵素 の活性を測定するのみならず、存在する酵素の量並びにその同一性を決定する必 要もある。これは、ある酵素の活性が通常のミカエリス−メンテンの速度論に従 わない、例えばアロステリック酵素または共有結合により修飾することにより活 性化される酵素について特に重要である。 更に、生物学的系内に存在すると考えられる、酵素阻害剤の量の定量的測定に 対する要求もある。このことは、特に医学分野で重要であり、該分野では、AIDS 研究における幾つかの酵素の阻害剤の発見(Miller等，1989)、または血圧を調節 するための阻害剤の開発(Ondetti等，1982)もしくはペニシリンを含む抗生物質 の加水分解(Cullman，1990)が注目されている。 また、自動化できる酵素アッセイに対する緊急の要求が、特に医薬工業におい て存在する。というのは、酵素は通常薬物発見のためのターゲットとして利用さ れるからである。新規な薬物の探究のためには、数千に及ぶ化学物質をスクリー ニングする必要がある。高い処理量のスクリーニングおよび自動化を可能とする 酵素アッセイのための新規な方法の開発は、このようなスクリーニングを大幅に 簡略化するばかりか、多くの他の用途が考えられ、また大幅にコストを減ずるで あろう。酵素以外にも、高度に自動化された、レセプタおよびレクチンの測定用 のスクリーニングアッセイも必要とされている。 例えば、β−グルカナーゼに関する簡単かつ高信頼度のアッセイ手順の開発に おける、絶え間ない興味がある。というのは、この酵素が、醸造および家禽生産 工業両者における、大麦のβ−グリカンの解重合において重要な役割を演じてい るからである。このアッセイのための幾つかの方法が報告されており、その例は 粘度法(Bourne & Pierce，1970)、還元糖生産(Denalt等，1978)、放射状ゲル拡 散(Edney等，1986;Martin & Bamforth，1983)およびアゾ−大麦グルカンの使用( McCleary & Shameer，1987)を包含する。これまでに開発された任意の方法によ る、完成した飼料における酵素活性の検出およびその定量が、高い感度の必要性 および飼料自体の複雑な性質のために、技術的に試みられている。高感度の光学 的方法の開発が、特に高度のアッセイの自動化に導く可能性がある場合には、歓 迎されるであろう。マイクロタイタープレートおよびマイクロタイターリーダー を使用する微量滴定は、このようなアッセイを大幅に簡略化するであろう。 この方面では２つの方法があり、その一つは、マイクロプレート比色アッセイ を利用したWirth & Wolf(1992)の研究であった。このアッセイの原理は、吸光度 が該マイクロタイタープレート壁で読めることを除き、該アゾ−大麦グルカン法 と同一である。この手順並びに元のアゾ−大麦グルカン手順は、沈殿剤および遠 心分離工程を必要とするという欠点を有している。これは、また高い感度をもた ない。もう一つの方法は、酵素の免疫学的性質を利用した、酵素量を定量するも のであった(Buhler，1991;Rafael等，1995)。この技術の主な欠点は、特定の酵 素の生物学的活性を評価し得ないことである。というのは、このイムノアッセイ は、酵素タンパク質の生物学的活性ではなく、その量を評価するからである。ま た、該アッセイは、密接な関係をもつ種由来の酵素に対してのみ有用である。と いうのは、抗体は高い特異性をもつ傾向があるからである。最近の論評において 、Headon(1993)は、飼料に添加された酵素の検出および定量を容易にする、適当 な方法は報告されていないと、結論付けた。これは、一部には通常飼料に添加さ れる、極めて低い濃度の酵素を検出できるアッセイが存在しないことによるもの と考えられる。 更に、プロテアーゼ活性をアッセイするための簡単で、高感度かつ効果的な方 法の利用可能性は、固有のタンパク質分解活性をテストするための組み換えタン パク質工業、プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングのための薬物の発見、診断並 びにルーチン研究にとって極めて有用であろう。しかしながら、一般に通常使用 されている方法は、不十分な感度（例えば、カゼインゲル）、複雑な取扱い（例 えば、トリクロロ酢酸沈殿、遠心分離および加熱）、放射能の危険性（例えば、 放射性標識した基質）および必要とされる高価な装置（例えば、蛍光偏光アナラ イザー）等のために、これらの要件を満足しない。これらの手順は、通常長時間 を要し、またしばしば自動化を可能としない。 発明の概要 本発明では、固相アッセイを通して、生物学的に活性な物質の生物学的活性お よび／または該物質の量を検出する方法を開示する。この方法では、該物質自身 の生物学的活性を利用して、検出法が与えられる。 本発明の一態様においては、固相アッセイを通して、生物学的に活性な物質の 生物学的活性の程度を、該生物学的活性を利用して、検出する方法を開示する。 第一の成分は表面に結合し、そこで該第一の成分は第一の指示薬と結合する。あ るサンプルを該第一の成分と接触させる。このサンプルは、測定すべき未知の生 物学的活性を有する第二の成分を含有する。これら成分は、該第一および第二成 分間の生物学的活性が、該第一成分を分離しないような条件下で、反応混合物中 に存在する。該反応の完了後、該サンプルを取り出す。結合状態に維持されてい る第一成分の量を測定する。該生物学的活性の程度と、該結合状態に維持された 第一成分との間には相反する関係が存在する。 本発明の更なる態様においては、固相アッセイを通し、生物学的活性の阻害を 利用した、生物学的に活性な物質の生物学的活性の程度を検出する方法を開示す る。第一の成分は表面に結合されており、そこで該第一の成分は第一の指示薬と 結合している。サンプルを該第一の成分と接触させる。該サンプルは、既知量の 既知の生物学的活性をもつ第二の成分、および未知の量の該第二の成分の阻害剤 である第三の成分を含む。これら成分を、所定期間に渡り、該第一および第二成 分間の生物学的活性によって、該第一の成分が分離されず、かつ該第三の成分が 該第一および第二成分間の該反応を妨害するであろう条件下で反応させる。該反 応が完了した後、該サンプルを除去する。結合状態を維持した該第一成分の量を 測定する。ここで、該結合状態を維持した複合化された該第一の成分と、該サン プル中の該第三の成分の量との間には、直接的な相関関係が存在する。 本発明は、また固相アッセイにより、生物学的に活性な物質の該生物学的活性 を利用して、該物質の同一性を検出する方法をも提供する。第一の指示薬と複合 化された第一の成分は、表面に結合している。あるサンプルを該第一の成分と接 触させる。該サンプルは、一般的には既知の生物学的活性をもつが、その特異的 活性については未知の第二の成分を含む。該サンプルは、また既知量の第三の成 分をも含み、該第三の成分は該第二の成分の有力な阻害剤である。本発明のアッ セイは、このような有力な阻害剤のパネルを含む。該反応は、該第一および第二 成分間の生物学的活性によって、該第一の成分が分離されず、かつ該第三の成分 が該第二の成分に対して特異的である場合には、該第三の成分が該第一および第 二成分間の該反応を妨害できる条件下で行われる。 所定期間の経過後、当分野では公知の如く、一般的には洗浄することにより、 該サンプルを除去する。結合状態を維持している第一成分の量を測定する。該第 三成分に比して、結合している該第一成分の量に減少が見られる場合には、該第 一および第二成分間の該反応は、妨害されており、これにより該第二成分が同定 される。選択された特異的な阻害剤に比して、結合している該第一成分の量に有 意な減少が見られない場合には、上記反応は妨害されておらず、該第二成分は同 定されない。適当な基準曲線は、当分野で公知のように作成される。 本発明は、また第二成分の生物学的活性に基づく、第一成分および該第二成分 間の競合アッセイをも提供する。 固相競合アッセイの第一の対において、該方法は、生物学的に活性な物質の生 物学的活性を利用して、該物質の量を測定する。生物学的に活性な第二成分と結 合する第一成分の既知量が、反応容器の表面に結合している。未知量の生物学的 活性をもつ該第二成分を含むサンプルまたは抽出物を添加する。該サンプルは、 また第一の指示薬とカップリングしている既知量の該第二成分をも含む。この反 応は、該生物学的活性によって、該第一成分と該第二成分とが結合するような条 件下で行われる。所定期間の経過後、当分野で公知のように、該サンプルを除去 する。次に、該第一の成分と結合している第一の指示薬とカップリングしている 第二成分の量を測定する。該第一成分と結合した、第一の指示薬とカップリング している該第二成分の量と、該サンプル中の、生物学的活性をもつ未知の量の該 第二成分の量との間には、相反関係が存在する。当分野で公知の適当な標準曲線 により、定量が可能となる。 もう一つのアッセイにおいて、該サンプルは未知の量の該第一成分と、既知量 の、第一の指示薬とカップリングした該第二成分を含む。該結合している第一成 分と結合した、第一の指示薬とカップリングしている該第二成分の量と、該サン プル中の該第一成分の未知量との間には、相反関係が存在する。 競合固相アッセイの第二の対も、生物学的に活性な物質の生物学的活性を利用 した、該活性物質の定量法を提供する。これらアッセイにおいて、既知量の、生 物学的活性をもつ第二成分は、反応容器の表面に結合している。未知量の該第二 成分と既知量の、第一の指示薬とカップリングしている第一の成分とを含むサン プルを、添加する。この反応は、該第一および第二成分が、生物学的活性により 結合する条件下で行われる。該サンプルを、反応の終了後に除去する。該結合し た該第二成分と結合した、第一の指示薬とカップリングしている該第一成分の量 を、測定する。指示薬とカップリングしている該結合第一成分の量と、該サンプ ル中の該第二成分の未知量との間には相反関係が存在する。 この対のもう一つのアッセイにおいては、該サンプルは既知量の、第一の指示 薬とカップリングした該第一成分と、未知量の該第一成分とを含む。この反応が 完了した後、該結合第二成分と結合した、第一の指示薬とカップリングしている 該第一成分の量を測定する。指示薬とカップリングしている該結合第一成分の量 と、該サンプル中の該第一成分の未知量との間には、相反関係が存在する。 これらの競合アッセイにおいて、該第二成分は酵素であり、また該第一成分は 該酵素の阻害剤であり得る。あるいはまた、該第二成分はレクチンであり、かつ 該第一成分はレクチン−結合物質である。更に、該アッセイは、該第二成分とし てレセプタを、また該第一成分としてレセプタ−結合物質を使用することができ る。 図面の簡単な説明 本発明のその他の利点は容易に理解されよう。というのは、これらは、以下の 詳細な説明を、添付図と関連付けて参照することにより、より一層良く理解され るであろうからである。ここで、 第１図は、ビオチン処理したβ−グルカンの合成を示す反応式である。β−グ ルカンのヒドロキシル基は、NaIO₄によって部分的にアルデヒド基にまで酸化さ れ(A)、次いでエチレンジアミン[NH₂(CH₂)₂NH₂]との反応に付される(B)。生成さ れるシッフ塩基を、NaBH₄で還元し(C)、次いで該β−グルカン−エチレンジアミ ン錯体の遊離アミド基と、ビオチンのN-ヒドロキシサクシンイミドエステル(BNH S)とを反応させて、ビオチン処理したβグルカンを生成する(D)。 第２図は、β−グルカナーゼについてのELSAにおける諸工程を示す式である。 該基質、即ちビオチン処理した−β−グルカン(B-βG)を、β−グルカナーゼ（ リケナーゼ）と共にインキュベートし、かつ該加水分解された基質を洗浄により 除去する(A)。次に、過剰量のアルカリンホスファターゼ−ストレプタビジン複 合体(SA-AP)を、加水分解されたB-βGと共にインキュベートし、次いで洗浄して 未反応のSA-APを除去する(B)。該加水分解されていない基質(B-βG)と結合したS A-APの量を、pNPPとインキュベートすることによって定量する(C)。矢印は、該 β−グルカナーゼにより加水分解された結合を示す。 第３図は、β−グルカナーゼ（リケナーゼ）によるビオチン−グルカン基質の 加水分解およびこれに続く第二の酵素を使用する、加水分解されていないβ−グ ルカンの定量を示すグラフである。該0.02ビオチン−グルカン錯体[1〜50(■)お よび1〜100(□)希釈〕および0.2ビオチン−グルカン錯体[1〜50,000(▲)および1 〜100,000(△)希釈〕の２種の濃度各々で、タイタープレート上に塗布し、物質 および方法（実施例１）に記載のように調製した。β−グルカナーゼ(100μｌ) を該ウエルに、指定した濃度で添加し、該混合物を22℃にて15分間インキュベー トした。この反応を、PBS-Tで洗浄することにより停止させ、またホスファター ゼ−ストレプタビジンを各ウエルに添加し、次いで洗浄して、未結合の複合体を 除去した。結合したホスファターゼの量を酵素法により定量し、次いで1Mジエタ ノールアミンバッファー中のp-ニトロフェニルホスフェートと共に、30分間に渡 り22℃にてインキュベートした。数値は、３回の分析に関する平均値±SDで表さ れている。 第４図は、キシラナーゼアッセイに関する標準曲線のグラフである。該ビオチ ン(BNHS)対アラビノキシランの比は0.2であり、該基質の希釈率は１〜10,000で ある。各ウエルに添加した酵素量は、横軸に示されている。その他の条件は、第 ３図および物質および方法（実施例１）に記載した通りである。数値は、３回の 分析に関する平均値±SDで表されている。 第５図は、ビオチン−β−グルカナーゼ（リケナーゼ）の加水分解の経時経過 を示すグラフである。該酵素を22℃にて０、１、３、９、27分間インキュベート した。その際の該0.2ビオチン−グルカンの希釈率は１〜50,000であった。酵素 の６種の濃度は、それぞれ0.032(1)、0.16(2)、0.8(3)、4(4)、20(5)および100( 6)mU／ウエルであった。発色時間は22℃において30分であった。その他の手順 は、物質および方法（実施例１）および第３図に記載の通りであった。正味の該 β−グルカナーゼの活性は、酵素のない状態で得られた値(ODo)を、酵素を含む 状態での値(ODi)から差し引くことにより得た。 第６図は、β−グルカナーゼ（リケナーゼ）濃度の、ビオチン−グルカンの加 水分解に及ぼす影響を示すグラフである。アッセイ時間および酵素濃度は、図中 に示されている。その他の条件は第５図について記載した通りである。 第７図は、予め加水分解した（△）および加水分解されていない（○）β−グ ルカンの、β−グルカナーゼ（リケナーゼ）活性に及ぼす影響を示すグラフであ る。本図に示されたような、β−グルカンの２つの形態を種々の量で、結合した ビオチン−β−グルカンを含有するウエルに添加し、次いで0.5mUβ−グルカナ ーゼ／ウエル(50μｌ)を添加した。その他の条件は物質および方法（実施例１） または第５図に記載した通りである。 第８図は、アゾ−大麦グルカンおよびβ−グルカナーゼ（リケナーゼ）に対す るELSA法を比較する標準曲線を示すグラフである：ELSA（■），アゾ−大麦グル カン（▲）。これら２つのアッセイに関する詳細については、物質および方法（ 実施例１）および第５図を参照のこと。 第９図は、トリプシン濃度の、典型的なドーズ−応答曲線を示すグラフである （実施例２）。 第10A-B図は、オボムコイド(A)またはロイペプチン(B)の濃度を測定するため の、ドーズ−応答曲線を示すグラフである。これらのアッセイ手順は、第９図に 関するものと同一であるが、オボムコイド(A)またはロイペプチン(B)を、可変競 合体としての未標識のトリプシンと置換した。数値は３回の分析の平均値を表す 。正のコントロールの吸光度±SDは、2.0±0.01(A)および1.95±0.002光学密度( OD)単位であった。 第11図は、トリプシン卵白阻害剤（オボムコイド）と、種々のタンパク質分解 酵素との交叉反応性を示すグラフである。本実施例で使用したタンパク質分解酵 素はトリプシン(EC 3.4.21.4),■--■;コラーゲナーゼ(EC 3.4.24.3),▽--▽;カ テプシンＤ(EC 3.4.23.5),●--●;エラスターゼ(EC 3.4.21.11)，△--△;サーモ リシン(EC 3.4.24.27),＿--＿；ペプシン(EC 3.4.23.1)，｜--｜；パパイン (EC 3.4.22.2)，＿--＿;プロテアーゼXIII(EC 3.4.23.18)，- -- -;プロテアー ゼXXXI，+--+;およびプロテアーゼIV， -- であった。このアッセイ手順は、 上記その他のタンパク質分解酵素を可変競合体としての未標識のトリプシンと置 換したこと以外は、第９図に与えられたものと同一であった。数値は３回の分析 の平均を表す。正のコントロールの吸光度±SDは、1.85±0.007光学密度(OD)単 位であった。 第12図は、ビオチン処理したα−カゼインのトリプシンによる加水分解を示す グラフである。数値は３回の分析の平均を表し、平均のSDは、±0.005 OD単位で あった（実施例３の物質および方法を参照のこと）。 第13図は、ビオチン処理したα−カゼインのパパインによる加水分解を示すグ ラフである。数値は３回の分析の平均を表し、平均のSDは、±0.005 OD単位であ った。 第14図は、ビオチン処理したα−カゼインのプロテアーゼIV(ストレプトマイ セスカエピトサス(Streptomyces caepitosus))による加水分解を示すグラフであ る。数値は３回の分析の平均を表し、平均のSDは、±0.005 OD単位であった。 第15図は、トリプシン活性のオボムコイドによる阻害を示すグラフである。数 値は３回の分析の平均を表し、平均のSDは、±0.002 OD単位であった。トリプシ ン活性の100%阻害に対するOD_maxは1.056であった。OD_maxは、阻害剤およびトリ プシン両者を含むウエルのODから、トリプシンのみを含有するウエルのODを差し 引いた値である。 好ましい態様の詳細な説明 本発明によれば、固相アッセイによる、生物学的に活性な物質の生物学的活性 の程度（割合、度合い）および／または該物質の量並びに同一性を検出または決 定する方法が開示される。このアッセイでは、該物質自体の生物学的活性を利用 して、該物質自体の活性、量または同一性が測定または決定される。このアッセ イでは、抗体を使用しない。 一般的に、固相アッセイについて公知であるように、第一成分を反応容器の表 面に結合する。次いで、あるサンプルを、指示薬分子を含有する反応混合物中で 、該第一成分と接触させる。該サンプルは、生物学的活性をもつ第二成分を含有 する。逆のプロトコールを使用することができ、即ち該第二成分が結合されてお り、かつ該サンプルが該第一成分を含むことができる。該生物学的活性によって 引き起こされる、該第一および第二の成分間の相互作用が存在し、該相互作用は 指示薬分子の変化を生ずる。 生物学的活性および／または生物学的に活性な物質とは、このような第二分子 に作用して、該第二分子（リガンド）を変化させ、もしくは結合させ、かつ部分 的に生体系／生物中で活性またはこれらを由来とすることができる、任意の生物 学的分子を意味する。このような分子の例は、酵素、レクチン、レセプタおよび 細胞接着分子である。 該固相アッセイは、競合的または非−競合的であり得、また一般的に２つの成 分を含む。該成分の一方は、生物学的活性を有し（一般的に、本明細書では第二 成分と呼ぶ）、また他方の成分（一般的には、第一成分と呼ぶ）は、該第二成分 の生物学的活性のために、該第二成分に対して作用し、これと結合し、もしくは 妨害（阻害剤）する。例えば、これら２種の成分は、酵素とその基質、酵素と該 酵素の阻害剤、レクチンとレクチン結合物質、レセプタとレセプタ結合物質、お よびアドヘジン分子と細胞表面分子であり得る。 このアッセイは、該アッセイ成分の一方の、反応容器表面への結合を必要とす る。一般的に、このアッセイは、該第一成分との結合であるが、本発明において は、その逆即ち第二成分の結合であってもよい。本明細書に記載する本発明の態 様においては、該アッセイ成分の一方を、該反応容器表面に結合（または被覆） するための公知の方法を、利用することができる。一般的に、該結合法は、該表 面に対する該成分の結合のための電荷の差異を利用する。「サンドイッチ」技術 を包含する方法が、酵素イムノアッセイ(EIA)に対して当分野で公知であること から、利用可能である。例えば、該成分に対する抗体は、該表面に結合でき、従 って該成分と結合できる。この選択された方法は、立体障碍が最小化され、かつ 該アッセイの態様に対して成分量を最適化するように、該アッセイ中に該成分を 表示するであろう。好ましい態様においては、該反応容器はマイクロタイタープ レートである。 更に、該方法は、該アッセイの成分の一方を、定量のために使用される指示薬 分子と複合化（標識）する必要がある。該成分は全体としてランダムに標識して も、また開裂サイト、結合サイトまたは活性のアッセイに適した、只一つの位置 で標識してもよい。 この測定は間接的または直接的なものであり得る。間接的測定については、該 指示薬分子は、ビオチン−アビジン（またはストレプタビジン）等のカップリン グ系を含むことができる。該系の一成分は、ビオチンで標識される。該アビジン はラベル、例えばアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダ ーゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、 トリチウム、¹⁴Cおよびヨウ素(iodination)等と結合される。指示薬で標識した アビジンまたはストレプタビジンは、該ビオチン処理した基質を検出するのに使 用できるが、他の結合対を使用することも可能である。このような対に対する要 件は、低い結合定数をもつこと、該アッセイ条件下で安定であること、特異的で あること、バックグラウンド値を増大しないことおよび該アッセイを妨害しない ことである。他のカップリング対は、阻害剤とその生物学的に活性なターゲット 物質との間のまたは炭水化物とレクチンとの間の反応である。例えば、ビオチン の代わりにマンノースまたはグルコースを使用し、かつアビジン、即ち該カップ リング対の代わりに、対応する標識したレクチンを使用することである。これら のラベルを測定する方法は、当業者には公知であり、その例を本明細書に提示す る。 また、該標識した成分の直接測定を利用することも可能である。指示薬（ラベ ル）、例えばアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ 、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、トリ チウム、¹⁴Cおよびヨウ素を使用することができる。 ここに記載したように、該成分の反応混合物は、該成分同志の該生物学的活性 が維持されるような条件下で確立される。一般的に、他の成分と反応させる場合 に、該生物学的に活性な成分は、測定に利用されるラベルの量を変更するであろ う。例えば、該生物学的に活性な第二成分が酵素である場合、該酵素はこれが結 合している表面から、その基質（第一成分）を分離、即ち開裂するであろう。こ れらの条件は、生物学的に活性な成分の各組に対して、本明細書に記載のように 設定される。 レセプタは、一般的にそのリガンド、例えば細胞接着分子およびレクチン等と 結合し、また競合アッセイはその測定を必要とする。レクチンは、非−免疫グロ ブリン性のタンパク質（糖タンパク質）として定義されており、認識されるグリ コシルリガンドの何れの共有結合構造をも変更することなしに、複合炭水化物の 炭水化物部分を特異的に認識し、かつこれと可逆的に結合できる。第二の定義に よれば、レクチンは、細胞を凝集し、および／または複合糖質を沈殿する、非免 疫由来のタンパク質（または糖タンパク質）である。レクチンは、通常オリゴま たはポリサッカライドの非−還元性末端と反応し、C-3またはC-4については僅か な変動を許容するが、C-2については厳密であると思われる（詳細な概説につい ては、レクチン類(Lectins)，Pusztai，1989を参照のこと）。従って、レクチン （血液凝集素）またはこれらが結合する化合物を検出できるアッセイが利用可能 である。 該サンプルは、同定すべき該生物学的に活性な成分、または活性または量を決 定すべき該成分を含む可能性のある、生成物由来の抽出物であり得る。本発明は 固相アッセイを利用するので、該サンプル／抽出物は、精製する必要はなく、ま た直接適用することができる。該抽出物の非−相互作用（結合）要素を除去、即 ち洗い流す。従って、本発明の方法は、該抽出物から測定すべき該基質の物理的 抽出を必要としない。 上記のように、反応後、一般的にはEIA技術において公知の如く、該サンプル を該反応容器（マイクロタイターウエル）から除去する。次いで結合状態に維持 された指示薬の量を測定する。好ましい態様においては、比色法によるアッセイ を利用し、この方法は酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)プレートリー ダーおよび関連する技術の使用を可能とする。 本発明の方法は、固相アッセイにより、生物学的に活性な物質の該活性を利用 して、該活性物質の生物学的活性の程度の検出または決定を可能とする。このよ うに、第一の指示薬と結合している第一成分は、該反応容器の表面に結合してい る。次いで、あるサンプルを、該結合している第一成分を含む該反応容器と接触 （適用）させる。該第二成分は生物学的活性をもつが、その量（割合）は未知で あり、このアッセイにより測定すべきものである。これら成分は、該第一および 第二成分間の生物学的活性を維持するような条件の下で、反応混合物中にある。 このアッセイにおいて、該活性は、該表面または該表面分子の一部からの該第一 成分の分離をもたらす。即ち、該第二成分は加水分解され、さもなくば該表面か ら該標識された第一成分を除去するであろう。次いで、所定時間該反応を進行さ せた後に、該サンプルを除去する。 次に、該反応後に結合状態を維持している該第一成分の量を、上記のようにし て測定する。該生物学的活性と、該結合状態に維持された第一成分との間には相 反関係がある。即ち、該第二成分が活性であればある程、該第一成分の結合量は 低下する。 この方法は、該第二成分が酵素であり、かつ該第一成分が該酵素の基質である 場合に利用できる。該酵素は、ポリマー型または非−ポリマー型の基質からなる 群から選ばれる基質を分解することができる。ポリマー型の基質は、少なくとも ２つの位置において開裂可能な基質であり、またタンパク質、ポリペプチド、炭 水化物、DNAおよびRNAであり得る。非−ポリマー型の基質も、一つの位置（サイ ト）においてのみ、酵素で開裂できる、ペプチド、炭水化物分子および核酸配列 からなる群から選ぶことができる。 例えば、選択されたプロテアーゼに対して使用できるタンパク質基質は、カゼ イン、アルブミン、コラーゲンおよびゼラチンである。別の例においては、該酵 素はβ−グルカナーゼであり、その基質はグルカンであり、あるいは該酵素がキ シラナーゼであり、かつその基質がアラビノキシラン(arbinoxylan)であるか、 あるいは該酵素がセルラーゼであり、かつ該基質がセルロースである。 上で論じたように、指示薬に結合（カップリング）した結合状態を維持してい る該第一成分の量は、間接的ラベル例えばビオチン−アビジン（アビジンはアル カリンホスファターゼとカップリングする）または直接的ラベル例えばアルカリ ンホスファターゼを使用して測定できる。次いで、好ましくは比色アッセイを利 用できる。これらアッセイに対して適当な、キャリブレーションまたは標準曲線 を作成して、当分野で公知のように定量することができる。 該ポリマー基質（第一成分）を標識するために、ビオチンまたは他のラベルを 該分子全体に渡りカップリングする。該酵素は、該多重開裂サイトにおいて該分 子を開裂するので、多くのラベルが除去され、結果として該酵素の活性が示され る。 非−ポリマー型の基質、即ち１個の開裂サイトをもつ基質については、該第一 成分は表面に直接または間接的に結合し、一方で該分子の他の部分は適当な指示 薬分子に対して、直接または間接的に標識される。本例においては酵素である、 第二成分による該基質の開裂は、該指示薬分子を媒体中に遊離し、これは一般的 に洗浄により除去される。残留する標識分子を測定し、かつ該生物学的に活性な 物質の活性と関連付けることができる。例えば、酵素に対するペプチド基質は、 該ペプチドの末端カルボキシル基を介して表面に結合される。該末端アミノ基は 直接的測定または間接的なアッセイにおける、第一の指示薬分子とカップリング される。反応後、該ラベルを含有する加水分解されていない基質の量を定量する ことができ、これはプロテアーゼ活性と相反的に関連付けられる。 本発明は、また生物学的に活性な物質の生物学的活性の阻害を利用して、固相 アッセイにより、該活性物質の生物学的活性の阻害剤の量を測定する方法をも提 供する。このアッセイにおいて、該第一成分は反応容器の表面に結合している。 該第一成分は第一の指示薬と結合する。既知量の第二成分を含むサンプルを、該 反応容器内の該第一成分に添加する。該第二成分は既知の生物学的活性をもつ。 該サンプルは、また未知量の第三成分をも含み、該第三成分は該第二成分の阻害 剤である。これら成分を、所定時間の間、該第一および第二成分間の活性が該第 一成分を分離せず、かつ該第三成分が、該第一および第二成分間の該反応を妨害 するであろう条件下で反応させる。該反応の完了後、該サンプルを除去する。 該反応後に結合状態を維持している該第一成分の量を、上記のようにして測定 する。該結合状態を維持した結合第一成分と、該サンプル中の該第三成分の量と の間には、直接的な関連性が存在する。即ち、該反応中の該阻害剤の量が少ない 程、ラベルの量も少ない。というのは、該第一成分と第二成分との間の反応は、 阻害されないからである。該サンプル中の阻害剤の量が多い程、より多くのラベ ルが検出されるであろう。 上記のように、ポリマー型および非−ポリマー型の第一成分（基質）を、該ア ッセイで使用でき、また上記のように標識できる。 第三の態様においては、生物学的に活性な物質の生物学的活性の阻害剤を利用 して、固相アッセイにより、該活性物質の同一性を検出する方法を開示する。本 明細書において上記した２つのアッセイにおいて、第一の指示薬と結合した第一 の成分は、表面に結合している。あるサンプルを、該第一成分と接触させる。該 サンプルは、一般的には既知の生物学的活性をもつが、その特異的活性について は未知の第二成分を含む。例えば、該第二成分はプロテアーゼであるが、これが どのように特異的なプロテアーゼであるかについては未知である。また、該サン プルは既知量の第三成分をも含み、該第三成分は、該第二成分の有力な阻害剤で ある。このアッセイはこのような有力な阻害剤のパネルを含む。該第一および第 二成分間の生物学的活性が、該第一成分を分離せず、かつ該第三成分が該第二成 分に対して特異的である場合には、該第三成分が、該第一および第二成分間の該 反応を妨害するであろう条件下で、該反応を起こさせる。 所定時間後、当分野公知であるように、一般的には洗浄することにより、該サ ンプルを除去する。結合状態を維持している該第一成分の量を測定する。該結合 状態の第一成分の量が、該第三成分に比して低下している場合には、該第三成分 は、該第一および第二成分間の反応を妨害しており、結果として該第二成分を同 定している。該選択された特異的な阻害剤に比して、結合状態の第一成分の量に 有意な減少がみられない場合には、該阻害剤は該反応を妨害せず、また該第二成 分は同定されない。適当な標準曲線の作成は、当分野で公知である。 本発明は、また第二成分の生物学的活性に基づく、第一成分と該第二成分との 間の競合アッセイをも提供する。 固相競合アッセイの第一の対において、該方法は、生物学的に活性な物質の生 物学的活性を利用して、該活性物質の量を測定する。生物学的に活性な第二成分 と結合する、第一成分の既知量が、反応容器の表面に結合している。未知量の、 生物学的活性を有する該第二成分を含むサンプルまたは抽出液を添加する。該サ ンプルは、既知量の、第一の指示薬とカップリングした該第二成分をも含む。こ の反応は、該第一および第二成分が、該生物学的活性により結合するであろう条 件の下で行われる。所定時間の経過後、当分野で公知のように、該サンプルを除 去する。第一の指示薬とカップリングしている第二成分の、該第一成分に対する 結合量を、次に上記したようにして測定することができる。第一の指示薬とカッ プリングしている第二成分の、該第一成分に対する結合量と、該サンプル中の、 生物学的活性をもつ該第二成分の該未知量との間には、相反的関連性がある。即 ち、該ラベルの量が多い程、該第二成分の該未知量は少ない。当分野で公知の如 く、適当な標準曲線により定量が可能となる。 該対のもう一つのアッセイにおいては、該サンプルは、未知量の第一成分と、 既知量の、第一の指示薬とカップリングしている該第二成分とを含む。第一の指 示薬とカップリングしている該第二成分の該第一成分に対する結合量と、該サン プル中の該第一成分の未知量との間には、相反的な関連性がある。 これらのアッセイにおいて、該第二成分は酵素であり得、かつ該第一成分は該 酵素の阻害剤であり得る。一態様においては、該酵素はトリプシンであり、かつ 該阻害剤はオボムコイドまたはロイペプチンである。あるいはまた、該第二成分 はレクチンであり、かつ該第一成分はレクチン−結合物質である。更に、該アッ セイは、該第二成分としてレセプタを使用し、かつ該第一成分としてレセプタ− 結合物質を使用できる。更に、細胞接着分子およびその細胞表面結合分子、例え ばCD2および細胞表面分子LFA-3を使用することができる。 レセプタとその特定の結合剤（リガンド）との相互作用は、該酵素−酵素阻害 剤アッセイまたは該レクチン−レクチン結合剤アッセイに関する原理と同様であ る。それ故、リガンドまたはレセプタは、プレート上に塗布され、またリガンド またはレセプタの量は、競合型のアッセイを利用して定量される。このような状 況の下で、リガンドまたはレセプタは、レセプタまたはリガンドの何れを定量す るかに依存して、適当な指示薬分子で標識されるであろう。 また、競合的固相アッセイの第二の対は、生物学的に活性な物質の該生物学的 活性を利用して、該活性物質の量を測定する方法を提供する。これらのアッセイ においては、生物学的活性をもつ既知量の第二成分を、反応容器の表面に結合す る。未知量の該第二成分および既知量の、第一の指示薬とカップリングした第一 成分を含むサンプルを添加する。この反応は、該第一および第二成分が、生物学 的活性によって結合するであろう条件下で行われる。該反応が完了した後、該サ ンプルを除去する。第一の指示薬とカップリングした該第一成分の該結合第二成 分に対する結合量を測定する。該第一の指示薬とカップリングした該第一成分の 該第二成分に対する結合量と、該サンプル中の該第二成分の未知量とは、相反的 な関連性をもつ。 この対のもう一つのアッセイにおいては、該サンプルは、既知量の、第一の指 示薬とカップリングした該第一成分および未知量の該第一成分とを含有する。こ の反応の完了後、該第一の指示薬とカップリングした該第一成分の該第二成分に 対する結合量を測定する。第一の指示薬とカップリングした該第一成分の結合量 と、該サンプル中の該第一成分の未知量との間には、相反的な関連がある。 これらアッセイにおいても、該第二成分は酵素であり、かつ該第一成分は該酵 素の阻害剤であり得る。一例において、該酵素はトリプシンであり、かつ該阻害 剤はオボムコイドまたはロイペプチンである。あるいはまた、該第二成分はレク チンであり、かつ該第一成分はレクチン−結合物質である。更に、該アッセイで は、該第二成分としてレセプタを、また該第一成分としてレセプタ−結合物質を 使用することができる。更に、細胞接着分子およびその細胞表面結合分子を使用 することもできる。 本発明は、また上記アッセイ用のキットをも提供する。該キットは、酵素、基 質および／または阻害剤を包含する各成分に対する適当なバッファーに加えて、 レクチンとレクチン−結合物質（リガンド）、精製レセプタとレセプタ−結合物 質（リガンド）、細胞接着分子と細胞表面結合分子をも含み、また標準物質およ び反応容器をも備える。該反応容器は、該アッセイにとって適当な、該第一およ び第二成分、例えば酵素、レセプタ、レクチン、および適当な場合にはレクチン −結合およびレセプタ−結合物質（これらに限定されない）で、予め被覆するこ とができる。更に、このキットは適当な標識成分および阻害剤、例えば酵素、レ セプタ、レクチン、レクチン−結合およびレセプタ−結合物質（これらに限定さ れない）をも含む。該キットは、また該比色法または該反応容器内に残存する、 該アッセイ用のラベルの量を測定するのに使用される他のアッセイにとって必要 な物質をも含むことができる。 実施例１においては、基質として、アミノ化し、かつビオチン処理したグルカ ンを使用する、β−グルカナーゼに関する、簡単かつ感受性のアビジン−ビオチ ン酵素結合ソーベントアッセイ(ELSA)（第１図）を、本発明の方法を利用して開 発した。このアッセイにおいては、該基質をβ−グルカナーゼと共にインキュベ ートし、該タイタープレート上に残留するβ−グルカン−ビオチンの量を、アル カリンホスファターゼーストレプタビジン複合体の、該未反応の基質複合体に対 する結合（第２図）に引き続き、酵素を使用して定量する。結果として、該結合 したアルカリンホスファターゼの活性により生成される色と、該ウエル内の該酵 素の活性とを間接的に関連付けることができる。第二の酵素の使用は、該シグナ ルを大幅に増幅するばかりか、β−グルカナーゼ活性を追跡するための簡単な方 法の開発のための基礎を与える。 この基質のβ−グルカナーゼによる部分加水分解は、該末加水分解基質由来の ビオチンとアルカリンホスファターゼ−ストレプタビジン複合体との反応をによ り示され、また最終的にアルカリンホスファターゼを使用した、該プレート上に 残留しているβ−グルカンの定量が証明される。該最適化されたアッセイにおけ る、該結合した指示薬酵素、即ちアルカリンホスファターゼの活性は、該サンプ ル中の該β−グルカナーゼ活性と比例関係にある。該ELSAは、簡単である。とい うのは、該加水分解されたβ−グルカンフラグメントが、洗浄工程により、容易 に該加水分解されていない基質から分離でき、また多数のサンプル（一人一日当 たり200程度）のルーチンアッセイに適しており、良好な精度（CV=4.0〜6.4%） および高い感度(0.001mUのβ−グルカナーゼ／アッセイ程度の低濃度を検出）を 有しているからである。同様な型のアッセイも、ビオチン処理したアラビノキシ ランを使用して、キシラナーゼについて開発された。実施例１において開発され た該ELSAは、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼのアッセイのために、本発明 を利用した、簡単かつ高感度の手順を提供する。 実施例２においては、サンプル中の酵素量を定量するばかりでなく、その阻害 剤の濃度をも定量する特異的方法が、本発明の方法を利用して提示される。ビオ チン処理された酵素阻害剤ソーベントアッセイ(BEISA)と呼ばれる、このアッセ イは、ビオチン−標識酵素とその対応する阻害剤との間の特異的結合に基づいて いる。このアッセイにおいては、該阻害剤が、タイタープレートウエル中に見ら れるような、プラスチックの表面に被覆される。既知量のビオチン−標識酵素と 未知量の定量すべき該酵素とを混合し、該固定化された阻害剤と競合させる。次 いで、該阻害剤と結合する、該酵素−ビオチン複合体を、定量的に指示薬酵素、 例えばストレプタビジン−アルカリンホスファターゼ複合体と結合させる。次い で、固定化されている該アビジン−ホスファターゼ複合体を、ホスファターゼに 対する基質の１種と反応させて、着色した溶液を生成する。この反応による発色 強度は、該サンプル中の未知量の酵素と相反的な関連性をもつ。溶液中の酵素の 実際の量は、該酵素の既知濃度を使用して作成された、標準曲線に基づいて評価 できる。 サンプル中の阻害剤の量も、同様なアッセイを使用して定量できる。この手順 において、定量すべき該阻害剤およびプラスチックの表面上に固定化された該阻 害剤は、溶液中に存在する該ビオチン処理された酵素に対して競合する。次に、 該アビジン−ホスファターゼ複合体は、該固定化された阻害剤とカップリングし している、該酵素−ビオチン複合体と定量的に反応し、次いで発色する。未知濃 度の該阻害剤は、既知濃度の該阻害剤を使用して作成された標準曲線により測定 でき、かつ該結合したアビジン−ホスファターゼ複合体により生成される発色強 度と相反的な関連性をもつ。 実施例３において、固相ビオチン−処理したカゼインアッセイは、プロテアー ゼおよびプロテアーゼ阻害剤に対して、本発明の方法の正さを立証している。該 基質の固相との結合は、該アッセイにおける後の工程、例えば洗浄して、加水分 解された物質または未反応の試薬を除去する工程を著しく簡略化し、一方標識さ れた基質の使用は、残留している基質の量を容易に分析することを可能とする。 比較的小さな分子であるビオチンの該基質との結合は、立体的な妨害を回避し、 該立体的妨害は、大きな指示薬分子について起こる可能性があり、また使用でき る指示薬の型におけるかなりの融通性を与える。というのは、該ビオチンが、こ れに対して高いアフィニティーを有するタンパク質であるアビジンと結合した場 合には、任意の指示薬と反応するであろうからである(Green,N.M.，1963)。着色 分子ではなく、寧ろアルカリンホスファターゼ等の酵素の該指示薬分子として の使用は、大幅に増幅されたシグナルの発生を可能とする。というのは、各ホス ファターゼが多くの着色分子を生成するからである。該全工程のタイタープレー トホルメート(formate)への適合化、および吸光度を測定し、かつ結果を計算す るためのコンピュータに接続されたELISAリーダーの使用は、比較的短時間内で の多数のサンプルの分析を、大幅に簡略化した。更に、このアッセイはほんの僅 かな量の試薬を必要とするに過ぎず、しかも良好な感度および精度をもち、かつ 比較的短時間内に該アッセイを完了することを可能とする。結局、該アッセイは 自動化することができ、しかも多数のサンプルの分析に適している。 実施例３に与えたような実験条件の下で、該ビオチン処理したカゼイン法の感 度は、放射性アッセイ(Sevier，E.D.，1976)、FTC-カゼイン法(Twining，S.S.， 1984）、FITC₂₅BSA法(Voss等，1996）およびFP法(Bolger等，1994)よりも低い。 それにも拘らず、該アッセイは多くのプロテアーゼアッセイの必須の要件を満た し、広範囲の活性に渡り、プロテアーゼの活性（即ち、10--10⁶ngトリプシン/10 0μｌ/サンプル）をテストする可能性を有する。また、結果に示されるように、 このアッセイの該特徴は、その設計および結果としてその対応する感度における かなりの融通性を許容する。本出願人は、このアッセイの感度が、該基質をビオ チン処理する度合いを増大することにより、該タイタープレートのウエル上に被 覆される基質の量を減ずることにより、および該加水分解時間を延長することに よって、高めることが可能であることを明らかにした。これらの変更は、感度に おける著しい改良をもたらし得るが、幾つかの場合には、これに対応して、該所 定の吸光度の変動を起こすのに必要な時間の増加が必要とされる。しかしながら 、この後者の問題は、高い代謝回転数を有するホースラディッシュパーオキシダ ーゼ等の異なる指示薬酵素の使用により、もしくは結合した該指示薬の多数の単 位を有するアビジン複合体を使用することにより、解決できる。このような状況 の下では、より高感度のプロテアーゼアッセイを開発し、かつ比較的短時間で完 了できるアッセイを開発することが可能となる。 α−カゼインを、本アッセイの基質として選択したが、特定のアッセイまたは アッセイ群に対して適していることが明らかであれば、他のタンパク質も使用す ることができる。また、結果において示すように、該サンプル中のプロテアーゼ 群は、該アッセイを、種々の指示薬の組み合わせ（その各々は異なるプロテアー ゼ群を阻害できる）の使用とを組み合わせた場合には、容易に同定できる。その 上、該アッセイは、また特異的プロテアーゼ阻害剤の濃度測定のために変更でき る。 結局、この論文は、高感度かつ高精度で、簡単、迅速かつ容易にアッセイすべ きサンプルの特異性に適合させることのできる、プロテアーゼおよびプロテアー ゼ阻害剤に関する新規なアッセイの開発について報告している。本発明のアッセ イは、また安価に実施でき、多くの実験室に現存する装置を利用でき、しかも容 易に自動化できるものである。 上記の議論は、（競合的または非−競合的な）固相アッセイを通して、抗体を 使用することなく、生物学的に活性な物質および／またはその阻害剤の生物学的 活性の程度および／または該物質の量を検出または測定するための実際上の基礎 並びに該アッセイ用のキットを提供する。本発明と共に使用される方法並びに本 発明の利用性は、以下の非−限定的な実施例および添付図面により示すことがで きる。 実施例全般の方法 ： アッセイ技術及び全般の技術について、Stitesら，Basic and Clinical Immu- nology，第８編，Appleton＆Langeを参照のこと。また、Kemeny及びChallacom-b e，“ELISA and Other Solid Phase Immunoassays，Theoretical and Practical Aspects”，J.Wiley and Sons Ltd．New York，NY，1988を参照のこと。 実施例１ β−グルカナーゼ及びキシラーゼ活性に関するELSA 物質．下記の物質をMegazyme Pty.Ltd．Sydney，N.S.W.，2102，Australiaか ら入手した：バチルス・スブチリス(バッチMLI B2001)からのリケナーゼ（エン ド−１，３−１，４−β−Ｄ−グルカン−４−グルカノヒドラーゼ、EC 3.2.1.7 3）、トリコデルマ種(EBG 00703)からのエキソ−１，３−β−グルカナーゼ（EC 3.2.1.58）、大麦β−グルカン(ロットBBG 30108)、ライ麦粉アラビノキシラン (ペントサン、バッチMRP 90801)、トリコデルマ・ビリデ（バッチMXY 80202）か らのキシラナーゼ(エンド−１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒドロラーゼ、E C 3.2.1.32)及びアゾ−大麦グルカン。アスペルギラス・ニガー（型２）からの セルラーゼ(１，４−β−Ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1. 4)、エンテロバクター・エロゲネスからのプルラナーゼ(制限デキストラナーゼ 、アミロペクチン６−グリコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.41)、ブタ膵臓(型1-A)か らのα−アミラーゼ（１，４−Ｄグルカングルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1） 、ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BNHS)、エチレンジアミ ン、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ジエタノールアミン及びトゥイーン-20 をシグマ・ケミカル社（セントルイス、MO）から入手した。過ヨウ素酸ナトリウ ム及びホウ水素化ナトリウムをフィッシャー・サイエンティフィック社（フェア ローン、NJ）から入手し、アルカリ性ホスフェート−ストレプトアビジンをザイ ムド・ラボラトリィズ社（サンフランシスコ、CA）から入手し、ミクロタイタ・ プレート(ファルコン3911、ミクロテストIII)をベクトン・ディキンソン（ラブ ウエア、オクスナード、CA）から入手し、ジメチルスルホキシド(DMSO)をJ.T.ベ ーカー・ ケミカル社（フィリップスブルグ、N.J．08865）から入手し、また即席スキンミ ルク粉末をネッスル(1185イングリントンE.ドン・ミルズ、オンタリオ)から入手 した。RM-1はフィンフィーズ・インターナショナル社からの粗酵素製剤であり、 高いβ−グルカナーゼ、キシラナーゼ及びその他の酵素活性を含んでいた。全て の溶媒及び試薬は分析グレードのものであった。 ビオチン−グルカン接合体の調製． その技術は、多糖部分のヒドロキシル基 の過ヨウ素酸ナトリウム酸化後に生成される活性アルデヒド基がエチレンジアミ ンと反応してアミン化多糖を生成する原理に基いている。生成されるシッフ塩基 をホウ水素化ナトリウムとの反応により安定化する(Wong，1991)。次いでBNHSを 使用して、アミン基をビオチンに結合することができる。簡単に言えば、β−グ ルカン75mgを蒸留水２mLに溶解し、次いで100mMのNaIO₄ 0.1mLを添加した。その 反応を光から保護し、室温で0.5時間混合した。その反応混合物を２時間にわた ってエチレンジアミン１mLで処理し、未反応の試薬をエタノール沈殿により除去 した。これは反応混合物（３mL）への95％(V/V)のエタノール８mLの添加、続い てそのサンプルの混合、0℃で10分間の10000gにおける遠心分離及び蒸留水２mL 中のペレットの溶解を伴っていた。製剤を３回洗浄した。次いで洗浄した沈殿を 蒸留水２mLに溶解し、ホウ水素化ナトリウム5mgを添加し、その反応を４℃で４ 時間進行させた。上記の洗浄工程を３回繰り返した。ビオチンエステル(BNHS、1 5mgまたは0.15mg)をDMSO 0.2mLに溶解し、その混合物を室温で３時間反応させ、 続いて上記のようにしてエタノールで３回沈殿させた。最後の沈殿を蒸留水３mL に溶解し、アリコートに分け、BNHS−β−グルカン複合体の夫々のアリコートを 0℃でシールしたポリプロピレン容器中で凍結貯蔵した。BNHS対β−グルカンの 比はBNHS 15mgまたは0.15mg及びβ−グルカン75mgから夫々合成された複合体に ついて0.2及び0.002であった。 緩衝剤及びプレートの被覆．0.3％(W/V)のスキンミルクを含む食塩加リン酸緩 衝液［PBS、NaCl 4.39、Na₂HPO₄8.19及びNaH₂PO₄ 2.45(g/L);pH7.2］をアルカリ 性ホスフェート−ストレプトアビジン複合体の希釈に使用した。タイタ・ プレート用の洗浄緩衝液は0.05％(V/V)のトゥイーン20を含むPBS(pH7.2)(PBS-T) であった。リン酸ナトリウム緩衝液(20mM、pH6.5)をキシラナーゼ（これを25mM の酢酸塩緩衝液（pH4.7）で希釈した）以外の全ての酵素製剤の希釈に使用した 。アルカリ性ホスフェート基質溶液は1Mのジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)中 に１mg/mlのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含んでいた。 ミクロタイタ・プレートを0.05Mの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH=9.6）中で希 釈されたビオチン−グルカン複合体0.1mL/ウェルで直接被覆し、次いで室温で１ 時間放置し、４℃で一夜放置した。0.2及び0.002保存ビオチン−グルカン複合体 の通常の希釈は夫々50,000倍及び100倍であった。プレートをPBS-T緩衝液で３回 洗浄し、空にしたプレートを数ケ月までにわたつて０℃でシールした容器中で貯 蔵した。 試験操作．β−グルカナーゼ（リケナーゼ）を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液 （pH6.5）で所望の濃度に希釈した。酵素(100μＬ)をビオチン−グルカン被覆ミ クロタイタ・プレート中の夫々のウェルに添加し、プレートを低蒸発リッドでシ ールし、混合物を所望の期間（１分から30分まで）にわたって所望の温度（通常 22-24℃）でインキュベートした。プレートを空にし、続いてウェルをpH7.2のPB S-Tで３回洗浄することにより反応を停止した。ブランクは酵素を含まないイン キュベーション緩衝液を含んでいた。pH7.2のPBS中で1:1000に希釈したアルカリ 性ホスファターゼ−ストレプトアビジン(100μｇ)を夫々のウェルに添加し、室 温で30分間インキュベートした。プレートをpH7.2のPBS-Tで６回洗浄し、約10〜 20分間にわたって周囲温度で乾燥させた。次いでアルカリ性ホスファターゼ基質 溶液を夫々のウェルに添加し(100μＬ)、ミクロタイタ・プレートを室温で30分 間にわたって、または酵素を含まないウェルの吸光度が1.5から2.0までの光学密 度単位の値を生じるまでインキュベートした。ミクロタイタ・プレート・リーダ ー（バイオ−ラド・ラボラトリィズ社（ミシサウガ、ON、カナダ）型式450）を 使用して、プレートを405nmで読み取った。 その他の操作 アラビノキシラン基質の調製方法は、基質がβ−グルカンでは なくアラビノキシランであった以外はβ−グルカンについて使用したのと同じで あった。BNHS対アラビノキシラン比は0.2であり、保存基質をプレートに被覆す る前に10,000倍に希釈した。β−グルカナーゼのアッセイに関するアゾ−大麦グ ルカン方法はMcCleary及びShameer(1987)により記載された操作に従った。酵素 の３種の濃度(0.076、2.1及び160mU)/ウェルを使用して、アッセイの精度を研究 した。それらを１対50,000に希釈した0.2ビオチン−β−グルカンを含むウェル に添加し(100μｌ)、混合物を22℃で15分間インキュベートした。その他の操作 は上記のとおりであった。同じタイタ・プレート内のアッセイを８回反復実験し た。全アッセイを６回反復実験した。β−グルカンが酵素活性について有する効 果に関する研究において、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中のβ−グル カン(5.12mg/mL)を等容積の0.2U/mLのβ−グルカナーゼと混合し、40℃で60分間 にわたって加水分解した。酵素溶液を沸騰水浴中に15分間入れることにより、反 応を停止した。対照サンプルはβ−グルカンを含んでいたが、酵素と一緒にイン キュベートせず、また沸騰にかけなかった。加水分解されたβ−グルカン溶液及 び加水分解されなかった溶液を0.2ビオチン−β−グルカン(1:50,000希釈）を含 むウェルに添加し(50μｌ)、溶液をβ−グルカナーゼ(0.5mU)50μｌとともにイ ンキュベートした。その反応は22℃で15分間のインキュベーション後に完結した 。その他の条件は上記のとおりであった。 結果及び説明 β−グルカンの加水分解．異なる濃度のβ−グルカナーゼの存在下の異なるビ オチン−グルカン基質の加水分解、続いてアルカリ性ホスファターゼ−ストレプ トアビジン複合体を使用する加水分解されなかった基質の検出により得られた光 学密度変化を図３に示す。吸光度値は加水分解されなかった基質の量の目安を与 える。それ故、酵素の不在下の吸光度値を個々のアッセイについて得られた吸光 度値から引くことにより、加水分解された基質の正味の量を推定することができ る。 0.2(w/w)のビオチン／グルカン比におけるグルカンの標識は、0.002の比を有 する複合体で得られた値よりも大きい吸光度変化を有する急勾配の標準曲線を 与えた。また、ビオチニル化の両方の程度を有する基質の高希釈は更に感度の良 いアッセイを生じた。これらの結果は、低バックグラウンド値を有するアッセイ の増大された感度が基質のビオチン／グルカン比を増大することにより、またプ レートを被覆する基質の更に希薄な溶液を使用することにより得られることを示 唆する。しかしながら、これが行い得る程度には制限がある。何となれば、基質 の過度のビオチニル化は酵素へのその接近可能性を低下し得るからである。同様 に、基質の高希釈はアッセイの感度を増大するが、それらはまた発色に必要とさ れる時間のほぼ比例した増加を生じる。明らかに、折衷が基質へのビオチンの結 合の程度と使用される基質の相当する希釈になされる必要がある。何となれば、 これらがアッセイの感度、バックグラウンド値及び好適な着色反応を得るのに必 要とされる時間に影響するからである。100,000の希釈における0.2ビオチン−グ ルカン基質は１mU/ウェルから100mU/ウェルまでの範囲のβ−グルカナーゼ活性 を検出することができた。これらのデータは、アッセイが極めて低い酵素活性値 を検出することができることを示唆する。 基質がビオチン−アラビノキシラン複合体である時に、β−グルカナーゼで得 られたのと同様の曲線をキシラナーゼで得た（図４）。β−グルカナーゼをイン キュベーション混合物に添加した時に、活性がこのアッセイで得られなかった。 異なる酵素濃度における時間経過応答．この研究において、ビオチン−グルカ ン複合体を１分から27分までの期間にわたって0.032mU/ウェルから100mU/ウェル までのβ−グルカナーゼの存在下で加水分解した（図５）。このアッセイ及びそ の後のアッセイにおいて、酵素活性による正味の吸光度値をプロットした（450n mにおけるOD₀‐OD_i）。結果は、酵素の高濃度(100mU/ウエル)では、反応が１分 以内に完結し、一方、低濃度(0.032mU/ウェル)では、反応速度が低く、27分の期 間にわたって線形のままであったことを実証する。図６に示された結果は、短い インキュベーション期間（１分及び３分）中に酵素の量を増加するにつれて反応 の速度のほぼ線形の増加があり、かつインキュベーション時間を増大するにつれ て酵素の量を増加することにより曲線が次第に線形ではなくなったことを実証す る。これらの結果は、適当なアッセイ条件が選択されることを条件として、 サンプル中のβ−グルカナーゼの量を推定することができることを示す。アッセ イの利点は、高感度であることに加えて、200程度に多くのアッセイが一日に一 人により完結し得ることである。このアッセイの欠点は、それが酵素活性の絶対 的単位ではなく相対的な目安を与えることである。しかしながら、その操作はア ゾ−大麦グルカンアッセイ(McCleary及びShameer，1987)で使用される様式と同 様の様式で既知の活性の酵素に対して較正し得る。それ故、このような較正また は標準曲線の使用は更なる絶対値を与え得る。 アッセイ値に関する外在性β−グルカンの影響．β−グルカナーゼ並びにその 他の炭水化物加水分解酵素はそれらの基質に結合され（Headon，1993;Yuら，199 5）、また外在性基質が高濃度でサンプル中に存在する時に、これがこのアッセ イを妨害することが公知である。現在の研究は、加水分解された基質の存在が結 果に影響せず、一方、ウェル中のβ−グルカンの量が１μｇ/ウェルを越える時 に吸光度変化により見られるように、酵素の活性が低下されることを実証した（ 図７）。これは酵素を含む抽出物中の10μｇ/mLのβ−グルカンに等しいであろ う。それ故、高濃度のβ−グルカン（即ち、５％）を含む大麦は、ほぼ最小量の 緩衝液（１対10の重量対容積比と推定）で抽出された時に５μｇのβ−グルカン /mLを含むであろう。このような条件下で、抽出物中のβ−グルカンはβ−グル カナーゼ活性に関してほんの最小の効果を有するであろう。しかしながら、β− グルカナーゼの活性が外在性β−グルカンにより抑制される場合、その効果は図 ７について示された様式と同様の様式で抽出されたβ−グルカンの先の酵素加水 分解により低下し得る。本明細書中以下に説明されるようなその他のβ−グルカ ナーゼアッセイによる内在性基質の存在は低いアッセイ値を生じる高い可能性を 有する。何となれば、これらのアッセイによる酵素抽出物の希釈は、そのアッセ イの低下された感度のために、現在の研究に使用される希釈よりも極めて小さい からである。 また、この研究からのデータは、アッセイの改良形態が抽出物中のβ−グルカ ンの量を定量するのに使用し得ることを示す。このような条件下で、競合ELSAが 基質の二つの形態；抽出物中の未知の量及び基準量またはウェルの表面に結合さ れるビオチニル化β−グルカンを使用するであろう。このようなアッセイは低分 子量分析の検出に広く使用されるELISA（Kemeny及びChallacombe，1988）に似て いる。 アッセイの精度．酵素の３種の濃度(160、2.1及び0.076mU/mL)の８回の反復分 析により評価されるようなELSAに関するアッセイ内の平均±SDは夫々0.33±0.01 6（CV=6.4％）及び1.25±0.06（CV=4.9％）並びに1.92±0.078（CV=4.0％）の吸 光度値を生じた。実験内（平均CV=5.1％）よりも実験間（平均CV=12.9％）で吸 光度値の大きな変化があった。インキュベート時間及び発色時間、周囲温度また はその他の変数の相違が実験間変化に寄与したのであろう。これは適当な基準標 準物質の使用及びアッセイ条件の更に厳密な調節により減少される。 β−グルカナーゼ活性のアッセイに関するアゾ−大麦−グルカン方法とELSAの 関係．この研究の目的はこの研究で開発したアッセイの感度を別の間接的かつ非 常に人気のあるアッセイ、アゾ−大麦β−グルカン方法(McCleary及びShameer， 1987)と比較することであった。この比較において、酵素の濃度を対数目盛でプ ロットして活性の広範囲にわたって二つのアッセイの感度を比較した。図８に示 されるように、アゾ−色素操作は酵素の比較的高い濃度で急勾配の応答を生じた が、一方、ELSAは更に徐々の応答を生じたが、極めて感度が良かった。ELSAに関 する検出範囲は0.001〜1mU/アッセイであり、一方、アゾー大麦−グルカン操作 の検出範囲は10〜100mU/アッセイであり、10倍から100,000倍の感度の差があっ た。また、アゾ−青色色素は制限を有する。何となれば、その方法（それはその 他の通常の方法よりもかなり簡単である）は加水分解された基質と加水分解され なかった基質を分離するために沈殿工程、続いて遠心分離工程を必要とするから である。これらの工程はELSAに使用されるフォーマットへのその操作の適応を妨 げる。また、アゾ−色素方法は標準化される必要がある。何となれば、それは沈 殿剤のイオンの強さ、沈殿の温度及び遠心分離条件の如き因子により影響される ような染色された多糖フラグメントの溶解性の如きパラメーターの変化を問題と するからである。これらのデータは、ELSAを使用するβ−グルカナーゼ活性 のアッセイが極めて容易に行われ、相当するアゾ−大麦−グルカン方法よりもか なり感度が良いことを示唆する。 その他の酵素によるビオチニル化β−グルカンの加水分解．表１に示された結 果は異なる酵素製剤によるビオチニル化β−グルカンの加水分解の程度を比較す る。これらのアッセイの全てにおいて、酵素を酵素の製造業者により提供された アッセイ値に基く普通の活性に希釈した。その結果として、比較は正確ではない が、概算にすぎない。それにもかかわらず、これらの結果は、β−グルカンを加 水分解することができる酵素、例えば、リケナーゼ（基準酵素）、及びセルラー ゼ（McClear及びGlennie-Holmee，1985）がビオチニル化β−グルカンを加水分 解することができることを実証する。β−グルカナーゼ活性の高い粗酵素製剤で あるRM-1がまたビオチニル化β−グルカンを加水分解することができた。β−グ ルカンを加水分解する低い能力を有するその他の酵素、例えば、エキソ−１，３ −β−Ｄ−グルカナーゼ(Wood及びBhat，1988)またはその基質を加水分解する能 力を有しないその他の酵素（即ち、プルアルナーゼ、β−キシラナーゼ及びα− アミラーゼ）がまたリケナーゼで得られた値に対し低い値を生じた。α−アミラ ーゼと関連する活性はβ−グルカン製剤中の或る種の汚染澱粉の存在のため、ま たはおそらく酵素製剤中の残留β−グルカナーゼ活性のためであるかもしれない 。また、セルラーゼがその基質を加水分解することができることは、基質の変更 （即ち、β−グルカンではなくセルロースの使用）がそのアッセイの基礎を与え ることを示唆する。 実施例２ 酵素及びそのインヒビターの定量 この実施例はサンプル中の酵素の量の定量だけでなく、そのインヒビターの濃 度の定量を与える。アッセイ（これはビオチニル化酵素インヒビター吸着アッセ イ(BEISA)と称される）はビオチン標識酵素とその相当するインヒビターとの特 異的結合に基いている。 方法：NHS-ビオチン溶液（ジメチルスルホキシド200ul中5.5mg）及びトリプシ ン溶液(PBS 1000ul中15mg)を混合し、穏やかに振とうしながら室温で３時間にわ たって反応させた。ミニコン−15濃縮装置（アミコン社）を使用して、未結合ビ オチンを４℃で除去した。最終容積は1000ulであった。 全ての薬品はシグマ・ケミカル社（セントルイス、MO）またはフィッシャー・ サイエンティフィック社（ウィニペッグ、MB）からのものであった。トリプシン （EC 3.4.21.4）及びそのインヒビター、卵白からのオボムコイド及びロイペプ チンをモデルとして使用してBEISAを実証した。 96ウェル・ミクロタイタ・プレート（ファルコン3911）を37℃で一夜にわたっ てトリプシン卵白インヒビター（オボムコイド、4ug/100ul/ウェル）で被覆した 。PBST｛［PBS、NaCl、9.00;Na₂HPO₄、1.15;NaH₂PO₄、0.23(g/l)pH7.2］＋0.05 ％のトゥイーン-20｝を使用してプレートを１回洗浄し、５％のスキンミルク200 ulをプレートの夫々のウェルに添加し、続いて37℃で２時間インキュベートした 。プレートをPBSTで２回すすぎ、PBS 100ulを添加したカラム１中のウェル以外 のプレートの夫々のウェルにPBS50ulを添加した。未標識トリプシン(400ug/mlの 50ul)を第二カラムのウェルに添加し、続いてカラム11中のウェルまでのウェル （そのウェルを含む）中でトリプシンを連続２倍希釈した。PBS中のビオチニル 化トリプシン(約2ug/100ul/ウェルを生じるための原液の1:3000希釈液50ul)を第 一カラム中のウェル以外の夫々のウェルに添加し、続いて37℃で１時間インキュ ベートした。夫々のウェル中の最終容積は100ulであった。トリプシンを含まな いウェルのブランク組（カラム１）は陰性対照として利用でき、一方、ビオチニ ル化トリプシンを含むが、未標識トリプシンを含まないウェルの最後の組（カラ ム12）は陽性対照として利用できた。次いでプレートをPBSTで３回洗浄し、スト レプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（50mMの重炭酸塩緩衝液、pH9.5中1 :1000）100ulをプレートの夫々のウェルに添加し、プレートを室温で30分間イン キュベートした。PBSTを使用して、プレートを５回洗浄し、ｐ−ニトロフェニル ホスフェート基質（10％のジエタノールアミン緩衝液、pH9.8中１mg/ml）100ul/ ウェルをプレートに添加し、続いて周囲温度で約30分間インキュベートした。次 いでミクロプレート・リーダー(バイオ−ラド・ラボラトリ ィズ社、ミシサウガ、ON、カナダ、型式450)を使用して、吸光度を405nmで読み 取った。これらの値は３回の反復分析の平均を表す。陽性対照の吸光度±SDは1. 9±0.02光学密度(OD)単位であった。 検出することができたトリプシンの濃度は0.1〜1.0ug/ml(図９)であり、一方 、検出することができたインヒビターの濃度はオボムコイドについて１〜10ug/m l(図10A)であり、ロイペプチンについて0.03〜１ug/ml(図10B)であった。ミクロ タイタ・プレートのウェルに被覆されるオボムコイドの量を減少することにより 、アッセイの感度を増大することができる。このような条件下で、長いインキュ ベーション期間が発色酵素で必要とされる。アルカリ性ホスファターゼの多数の 単位と対にされたアビジンの使用による発色アッセイの改良は発色工程に必要と される時間の比例する減少をもたらし得る。 特別な酵素に対するBEISAの特異性はミクロプレートを被覆するのに選ばれた インヒビターの特異性に依存する。このアッセイにおいて、トリプシン卵白イン ヒビター（オボムコイド）とその他のプロテアーゼとの交差反応性はなかった（ 図11）。それ故、これらの結果は、BEISAがその他のプロテアーゼの存在下でト リプシンを特異的に定量するのに使用し得ることを示す。加えて、エラスターゼ を結合することが知られている別のインヒビターであるエラスタチナールはトリ プシンインヒビターへの標識トリプシンの結合を妨害しなかった。同様に、ウシ 血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)及びα−カゼインの如きその他 のタンパク質はアッセイを妨害しなかった。 BEISAはトリプシン及びトリプシンインヒビターを定量するのに使用し得る新 規な方法である。その方法は感度が良く、特異性であり、使用するのに簡単であ り、しかも高処理量のスクリーニング及び自動化に適応し得る。サンプルクリー ンアップは必要とされるべきではない。何となれば、発色工程を妨害する全ての 化合物が洗浄工程で排除されるからである。その操作は適当なインヒビターを有 するあらゆる酵素に適用し得る。8000のインヒビターがあり、約2000の酵素と反 応することが知られている(Zollner，1993)。 このアッセイにおける操作はミクロタイタ・プレートの表面へのインヒビター の被覆及びビオチンによる酵素の標識を伴ったが、反対の操作をまた行うことが でき、即ち、酵素をプレートの表面に被覆することができ、インヒビターをビオ チンで標識することができる。 実施例３ ビオチニル化カゼインを使用するプロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビター に関する固相アッセイ 物質：α−カゼイン、ビオチンアミドカプロエートｎ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステル(NHS-ビオチン)、トゥイーン-20、ｐ−ニトロフェニルホスフェー トニナトリウム(pNPP)、トリプシン(EC 3.4.21.4)、パパイン(EC 3.4.22．2)、 テルモリシン(EC 3.4.24.3)、コラゲナーゼ(EC 3.4.24.3)、ペプシン(EC 3.4.23 .1)、カセプシンD（EC 3.4.23.5）、エラスターゼ(EC 3.4.21.11)、プロテアー ゼIV（ストレプトミセス・カスピトサス）、プロテアーゼXXXI（バチルス・リケ ニホルミス）及びプロテアーゼXIII(アスペルギラス・サイトイ)(EC 3.4．23.18 ）及びオボムコイドはシグマ・ケミカルズ社からのものであり、ジメチルスルホ キシド(DMSO)はJ.T.ベーカー・ケミカル社からのものであり、ミクロタイタプレ ート（ファルコン3911）はベクトン・ディキンソン社からのものであり、クエン 酸塩(0.1M)-リン酸塩(0.2M)緩衝液(Stollら，1990)をパパイン（pH6.2）、プロ テアーゼXIII（pH2.8）、カセプシンD（pH3.0）、エラスターゼ（pH6.5）につい て使用し、リン酸塩(0.2M)緩衝液(Stollら，1990)をトリプシン(pH7.5)、プロテ アーゼIV（pH7.5）、プロテアーゼXXXI（pH7.5）、テルモリシン(pH7.5)及びコ ラゲナーゼ（pH7.1）について使用し、一方、10mMのHClをペプシン（pH2.0）に ついて使用した。 ビオチニル化カゼインの調製：0.1MのpH7.2の食塩加リン酸緩衝液［PBS、NaCl 、9.00;Na₂HPO₄、1.15;NaH₂PO₄、0.23(g/l)］1ml中のα−カゼイン12mgをDMSO 1 50ul中で２時間にわたって室温で穏やかに振とうしながらNHS-ビオチン3.6mgと 反応させた。 ビオチニル化カゼインを使用するプロテアーゼ活性に関するアッセイ操作： PBS中のビオチニル化α−カゼイン(0.13ug/ウェル/100ul)を使用して、８のウェ ルの第一カラム以外のミクロタイタ・プレートを被覆し、37℃で２時間インキュ ベートした。プレートを0.1MのPBST（0.05％のトゥイーン-20を含むPBS）で３回 洗浄した。図12−14中に示されたような異なる濃度の酵素溶液(100ul)を適当な 緩衝液で希釈した（表２を参照のこと）。それらを３回の反復実験でプレートの ウェルに添加し、続いて湿った雰囲気中で37℃で30分間にわたってインキュベー トした。PBSTを使用して、プレートを３回洗浄してプロテアーゼ反応を停止した 。ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ溶液(100ul/ウェル、重炭酸 塩緩衝液pH9.5中1:1000の希釈)を８のウェルの第一カラム（ブランクとして）以 外のプレート中の全てのウェルに添加し、プレートを室温で30分間インキュベー トした。ウェルのブランク組はPBSのみを含み、酵素を添加せず、ビオチニル化 カゼインで被覆しなかった。プレートを空にし、プレートをPBSTで６回洗浄する ことにより、反応を停止した。pNPP基質(100ul/ウェル、10％のジエタノールア ミン緩衝液pH9.8中１mg/ml)をプレートの夫々のウェルに添加し、続いて室温で 約20分間インキュベートした。次いでミクロプレートリーダー(バイオ−ラド・ ラボラトリィズ社、ミシサウガ、ON、カナダ、型式450)を使用して、吸光度を40 5nmで読み取った。最大吸光度がほぼ2.0の光学密度単位であった時に、最良の感 度を得た。 ビオチニル化α−カゼインを使用するインヒビターの量に関するアッセイ： その操作は、プロテアーゼ（トリプシン）の濃度が全てのウェルで同じであり（ 3.36ug/100ul/ウェル）、一方、インヒビター（オボムコイド）の濃度を変えた 以外はプロテアーゼ活性アッセイと実質的に同じであった（図15を参照のこと） 。全ての場合、プレートをインキュベーション中に覆って蒸発を防止した。 結果 ミクロタイタ・プレートのウェルの表面に結合されたビオチニル化α−カゼイ ンを異なる濃度のトリプシン（図12）、パパイン（図13）及びプロテアーゼIV（ 図14）により加水分解した。異なる酵素の濃度はトリプシンについて10〜10⁶ ng/100ul/サンプルであり、パパインについて0.5〜4ug/100ul/サンプルであり、 またプロテアーゼIVについて１〜1000ug/100ul/サンプルであった。最大吸光度 の10％の低下を生じるのに必要とされる酵素の量により測定したアッセイの感度 は夫々トリプシン、パパイン及びプロテアーゼIVについて30、700、200ng/100ul であった。10倍より大きい感度の増大が0.5時間ではなく、24時間のプロテアー ゼのインキュベーションにより得られた。同様に、感度のかなりの改良がウェル の表面への標識カゼインの少量の被覆により得られる。しかしながら、この変化 はアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体による発色の速度のほぼ比例した 減少をもたらした。 表２は、ビオチニル化カゼインがこの研究に使用したプロテアーゼの全ての基 質として使用し得ることを実証した。これらの酵素は活性化されたセリン、シス テイン、アスパルテート及び金属イオンを有するプロテアーゼを含むプロテアー ゼの四つのクラスにグルーピングし得る(IUBMB，1992)。表１に示されたアッセ イを夫々の酵素の最適pHで行った。 また、トリプシンインヒビターであるオボムコイドを用いる研究は、ビオチニ ル化カゼイン方法がサンプル中のトリプシンインヒビターの量を定量するのに使 用でき、その抑制曲線の傾斜が急勾配であることを実証した（図15）。 本件出願中、米国特許を含む種々の刊行物が引用または番号により参照される 。刊行物に関する完全な引用が以下にリストされる。これらの刊行物及び特許の そのままの開示が、本発明が関連する技術水準を充分に記載するためにこの出願 の参考として本明細書に含まれる。 本発明が説明の様式で記載され、使用された技術用語は限定ではなく、説明の 用語の性質であることが意図されていることが理解されるべきである。 明らかに、本発明の多くの改良及び変化が上記教示に鑑みて可能である。それ 故、特許請求の範囲内で、本発明は詳細に記載された以外に実施し得ることが理 解されるべきである。 表１ 異なる酵素の相対的活性¹ 酵素 起源 リケナーゼと比較した 相対的活性 （平均±SD、n=12） 純粋な酵素 リケナーゼ（エンド1,3-1,4 マグザイム・バチルス・ 100±4 グルカナーゼ） スブチリス(E.C.3.2.1.73) エンド−β−キシラナーゼ マグザイム・トリコデルマ・ 2.1±0.1 ビリデ （E.C.3.2.1.32） エキソ-1,3-β-Dグルカナーゼ マグザイム・トリコデルマ種 6.2±0.3 （E.C.3.2.1.58） 部分精製酵素 セルラーゼ(1,4-β-D- （E.C.3.2.1.4） 101±7 グルコヒドロラーゼ） プルラナーゼ（制限 （E.C.3.2.1.41） 1.8±0.1 デキストラナーゼ） α−アミラーゼ （E.C.3.2.1.1） 4.3±0.2 粗酵素RM-1² （フィンフィーズ） 108±4 ¹ アッセイ操作は図３に記載されたとおりであった。全ての酵素濃度を製造業者 により示された活性値に従って5Uの酵素活性/mLに希釈した。次いで酵素を物質 及び方法並びに図５の操作に従って分析した。全てのウェル中の基質は0.2ビオ チン−グルカン（1:50,000に希釈した）であり、加水分解時間は15分であり、発 色時間は22℃で30分であり、アッセイを夫々の酵素を用いて行った。平均CVは５ ％未満であった。² RM1は900U/gのβ−グルカナーゼ(pH5.0)及びその他の酵素の混合物を含んでい た。 表２ 異なるクラスのプロテアーゼにより加水分解されたビオチニル化α−カゼインのスペクトル プロテアーゼ¹ アッセイ プロテアーゼ 感度³ pH によるビオチン−（ng/100ul/ カゼインの サンプル） 加水分解 セリンプロテアーゼ トリプシン(EC 3.4.21.4) 7.5 Yes 30 エラスターゼ(EC 3.4.21.11) 6.5 Yes 4.4 システインプロテアーゼ パパイン(EC 3.4.22.2) 6.2 Yes 700 アスパラギン酸プロテアーゼ プロテアーゼXIII（EC 3.4.23.18） 2.8 Yes 222 ペプシン(EC 3.4.23.1) 2.0 Yes 641 カセプシンD（EC 3.4.23.5） 3.0 Yes 160 メタロプロテアーゼ テルモリシン(EC 3.4.24.27) 7.5 Yes 25 コラゲナーゼ(EC 3.4.24.3) 7.1 ？⁴ 未同定プロテアーゼ プロテアーゼIV 7.5 Yes 200 プロテアーゼXXXI 7.5 Yes 5500 1.プロテアーゼのクラスに関する更なる詳細について文献(IUBMB,1992)を参照の こと。 2.アッセイを夫々のプロテアーゼの最適pHで行った(Sigma，1997)。 3.感度をビオチニル化α−カゼインの10％を加水分解するのに必要とされる酵素 の量と定義した。 4.コラゲナーゼの量が50000ng/100ul/サンプルより多い時にのみ、ビオチニル化 α−カゼインを加水分解した（そのアッセイ媒体はメタロプロテイナーゼの要件 である添加亜鉛を含まなかった）。文献リスト

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ｇ０１Ｎ 33/573 33/573 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ハオ シャオ カナダ ブリティッシュ コロンビア ヴ ィ５ゼット １エイ１ ヴァンクーヴァー 500―524 キニテク バイオテクノロジ ー コーポレイション (72)発明者 ワン グオイーエ 中華人民共和国 ナンイン 210095（番地 なし）ナンイン アグリカルチュラル ユ ニヴァーシティー ラボラトリー アニマ ル フィジオロギー アンド バイオケミ ストリー (72)発明者 ツァン ツィークン 中華人民共和国 ナンイン 210095（番地 なし）ナンイン アグリカルチュラル ユ ニヴァーシティー ラボラトリー アニマ ル フィジオロギー アンド バイオケミ ストリー (72)発明者 ガン ツィーボ カナダ マニトバ アール３ティー ３エ ム２ ウィニペグ ダルハウジー ドライ ヴ 99 アパートメント 212

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 生物学的に活性な物質の該生物学的活性を利用して、該活性物質の生物学的 活性の程度を検出するための、固相アッセイであって、 a. 第一成分を表面に結合する工程と、ここで該第一成分は第一の指示薬と結 合しており、 b. 未知の生物学的活性をもつ第二成分を含むサンプルと、該結合した第一成 分とを、反応混合物中で、該第一および第二成分間の生物学的活性が、該第一成 分を分離しない条件下で接触させる工程と、 c. 所定の反応時間後に該サンプルを除去する工程と、 d. 結合状態を維持している第一成分の量を測定する工程とを含み、ここで該 生物学的活性の程度と、該結合状態を維持している第一成分との間には、相反的 関連性が存在することを特徴とする、上記固相アッセイ。 2. 該第二成分が酵素であり、かつ該第一成分が該酵素に対する基質である、請 求の範囲第１項に記載の方法。 3. 該酵素がポリマー型のおよび非−ポリマー型の基質からなる群から選ばれる 基質を分解することのできる酵素である、請求の範囲第２項に記載の方法。 4. 該ポリマー型基質が、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、DNAおよびRNA からなる群から選ばれる、請求の範囲第３項に記載の方法。 5. 該タンパク質が、選択されたプロテアーゼに対する基質となるように、カゼ イン、アルブミン、コラーゲンおよびゼラチンからなる群から選ばれる、請求の 範囲第４項に記載の方法。 6. 該酵素がβ−グルカナーゼであり、かつ該基質がグルカンである、請求の範 囲第２項に記載の方法。 7. 該酵素がプロテアーゼであり、かつ該基質がカゼインである、請求の範囲第 ２項に記載の方法。 8. 該酵素がキシラナーゼであり、かつ該基質がアラビノキシランである、請求 の範囲第２項に記載の方法。 9. 該酵素がセルラーゼであり、かつ該基質がセルロースである、請求の範囲第 ２項に記載の方法。 10．該測定工程が、該第一成分と結合する、標識された第二成分を添加する工程 と、結合した標識第二指示薬の量を測定する工程とを含む、請求の範囲第１項に 記載の方法。 11．該第一の指示薬が、ビオチンである、請求の範囲第10項に記載の方法。 12．該第二の指示薬が、アビジンまたはストレプタビジンである、請求の範囲第 11項に記載の方法。 13．該ラベルが、アルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダ ーゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、 トリチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第10項に 記載の方法。 14．該サンプルが抽出物である、請求の範囲第１項に記載の方法。 15．該測定工程が、残留する第一の指示薬の量を測定する工程を含む、請求の範 囲第１項に記載の方法。 16．該第一の指示薬が、アルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオ キシダーゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレア ーゼ、トリチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第 15項に記載の方法。 17．固相アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を用いて、 該活性物質の生物学的活性の阻害剤の量を検出する方法であって、 a. 第一成分を表面に結合する工程と、ここで該第一成分は第一の指示薬と結 合しており、 b. 既知量の、既知の生物学的活性をもつ第二成分および未知量の、該第二成 分の阻害剤である第三成分を含むサンプルと、該第一成分とを、反応混合物中に て、該第一および第二成分間の生物学的活性が、該第一成分を分離せず、かつ該 第三成分が、該第一および第二成分間の反応を妨害する条件下で、接触させる工 程と、 c. 該サンプルを除去する工程と、 d. 該結合状態を維持している第一成分の量を測定する工程とを含み、ここで 該結合状態を維持し、結合している第一成分と、該サンプル中の該第三成分との 間には、直接的関連性が存在することを特徴とする、上記検出方法。 18．固相アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を用いて、 該活性物質の同一性を決定する方法であって、 a. 第一成分を表面に結合する工程と、ここで該第一成分は第一の指示薬と結 合しており、 b. 一般的に既知の生物学的活性と未知の特異性とをもつ第二成分および既知 量の、該第二成分の有力な阻害剤である第三成分を含有するサンプルと、該第一 成分とを、反応混合物中で、該第一および第二成分間の該生物学的活性が、該第 一成分を分離せず、かつ該第三成分が、該第一および第二成分間の反応を妨害で きる条件下で、接触させる工程と、 c. 所定時間の経過後に、該サンプルを除去する工程と、 d. 該結合状態を維持している第一成分の量を測定する工程とを含み、ここで 該結合している第一成分の量が減少した場合には、該第三成分は該第一および第 二成分間の反応を妨害し、結果として該第二成分を同定することを特徴とする、 上記方法。 19．固相競合アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を利用 して、該活性物質の量を測定する方法であって、 a. 生物学的に活性な第二成分と結合する、既知量の第一成分を表面に結合す る工程と、 b. 未知量の、生物学的活性をもつ該第二成分と、既知量の、第一の指示薬と カップリングしている該第二成分とを含有するサンプルと、該第一成分とを、反 応混合物中で、該第一および第二成分が該生物学的活性のために相互に結合する 条件下で、接触させる工程と、 c. 該サンプルを除去する工程と、 d. 該第一成分と結合した、該第一の指示薬とカップリングしている第二成分 の量を測定する工程とを含み、ここで該第一成分と結合した、該第一の指示薬と カップリングしている第二成分の量と、該サンプル中の生物学的活性をもつ該第 二成分の未知量との間には、相反的関連性が存在することを特徴とする、上記方 法。 20．該第二成分が、酵素であり、かつ該第一成分が該酵素の阻害剤である、請求 の範囲第19項に記載の方法。 21．該第二成分がレクチンであり、かつ該第一成分がレクチンと結合できるもの である、請求の範囲第19項に記載の方法。 22．該第二成分がレセプタであり、かつ該第一成分がレセプタと結合できるもの である、請求の範囲第19項に記載の方法。 23．該酵素がトリプシンであり、かつ該阻害剤がオボムコイドまたはロイペプチ ンである、請求の範囲第20項に記載の方法。 24．該測定工程が、該第一の指示薬と結合する、標識された第二の指示薬を添加 する工程および該第一の指示薬と結合した該第二の指示薬の量を測定する工程を 含む、請求の範囲第19項に記載の方法。 25．該第一の指示薬がビオチンである、請求の範囲第24項に記載の方法。 26．該第二の指示薬がアビジンまたはストレプタビジンである、請求の範囲第25 項に記載の方法。 27．該ラベルがアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダー ゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ト リチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第24項に記 載の方法。 28．該測定工程が、残留する第一の指示薬の量を測定する工程からなる、請求の 範囲第19項に記載の方法。 29．該第一の指示薬物がアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオ キシダーゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレア ーゼ、トリチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第 28項に記載の方法。 30．該サンプルが抽出物であり、該抽出物には、既知量の、第一の指示薬とカッ プリングした該第二成分が添加されている、請求の範囲第19項に記載の方法。 31．固相競合アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を利用 して、該活性物質に結合する物質の量を測定する方法であって、 a. 生物学的活性を有する第二成分と結合する、既知量の第一成分を表面に結 合する工程と、 b. 未知量の該第一成分および既知量の、第一の指示薬とカップリングしてい る該第二成分を含有するサンプルと、該結合した第一成分とを、反応混合物中に て、該第一および第二成分が生物学的活性によって結合する条件下で、接触させ る工程と、 c. 該サンプルを除去する工程と、 d. 第一の指示薬とカップリングしている該第二成分の、該結合した第一成分 と結合する量を測定する工程とを含み、ここで該結合した第一成分と結合する、 第一の指示薬とカップリングしている該第二成分の量と、該サンプル中の該第一 成分の未知量との間に、相反的関連性があることを特徴とする、上記方法。 32．該第二成分が酵素であり、かつ該第一成分が該酵素の阻害剤である、請求の 範囲第31項に記載の方法。 33．該第二成分がレクチンであり、かつ該第一成分がレクチンと結合できるもの である、請求の範囲第31項に記載の方法。 34．該第二成分がレセプタであり、かつ該第一成分がレセプタと結合できるもの である、請求の範囲第31項に記載の方法。 35．固相競合アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を利用 して、該活性物質の量を測定する方法であって、 a. 既知量の生物学的活性を有する第二成分を表面に結合する工程と、 b. 未知量の該第二成分および既知量の、第一の指示薬とカップリングしてい る第一成分を含有するサンプルと、該結合した第二成分とを、反応混合物中で、 該第一および第二成分が生物学的活性によって結合する条件下で、接触させる工 程と、 c. 該サンプルを除去する工程と、 d. 第一の指示薬とカップリングしている該第一成分の、該結合した第二成分 と結合する量を測定する工程とを含み、ここで指示薬とカップリングしている、 該結合第一成分の量と、該サンプル中の該第二成分の該未知量との間には、相反 的関連性があることを特徴とする、上記方法。 36．該第二成分が酵素であり、かつ該第一成分が該酵素の阻害剤である、請求の 範囲第35項に記載の方法。 37．該第二成分がレクチンであり、かつ該第一成分がレクチンと結合できるもの である、請求の範囲第35項に記載の方法。 38．該第二成分がレセプタであり、かつ該第一成分がレセプタと結合できるもの である、請求の範囲第35項に記載の方法。 39．該酵素がトリプシンであり、かつ該阻害剤がオボムコイドまたはロイペプチ ンである請求の範囲第36項に記載の方法。 40．該測定工程が、該第一の指示薬と結合する、標識された第二の指示薬を添加 する工程および該第一の指示薬と結合した該第二の指示薬の量を測定する工程を 含む、請求の範囲第35項に記載の方法。 41．該第一の指示薬がビオチンである、請求の範囲第40項に記載の方法。 42．該第二の指示薬がアビジンまたはストレプタビジンである、請求の範囲第41 項に記載の方法。 43．該ラベルがアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダー ゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ト リチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第40項に記 載の方法。 44．該測定工程が、残留する第一の指示薬の量を測定する工程からなる、請求の 範囲第35項に記載の方法。 45．該第一の指示薬物がアルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュパーオ キシダーゼ、着色染料、蛍光性分子、発光分子、β−ガラクトシダーゼ、ウレア ーゼ、トリチウム、¹⁴Ｃおよびヨウ素化からなる群から選ばれる、請求の範囲第 44項に記載の方法。 46．該サンプルが抽出物であり、該抽出物には、既知量の、第一の指示薬とカッ プリングした該第二成分が添加されている、請求の範囲第35項に記載の方法。 47．固相競合アッセイを通して、生物学的に活性な物質の該生物学的活性を利用 して、該活性物質に結合する物質の量を測定する方法であって、 a. 第一成分と結合する、生物学的活性を有する第二成分の既知量を表面に結 合する工程と、 b. 既知量の、第一の指示薬とカップリングしている該第一成分および未知量 の第一成分を含むサンプルと、該第二成分とを、反応混合物中にて、該第一およ び第二成分が生物学的活性によって結合する条件下で、接触させる工程と、 c. 該サンプルを除去する工程と、 d. 第一の指示薬とカップリングしている該第一成分の、該結合した第二成分 と結合する量を測定する工程とを含み、ここで指示薬とカップリングしている、 結合した該第一成分の量と、該サンプル中の該第一成分の未知量との間には、相 反的関連性があることを特徴とする、上記方法。 48．該第二成分が酵素であり、かつ該第一成分が該酵素の阻害剤である、請求の 範囲第47項に記載の方法。 49．該第二成分がレクチンであり、かつ該第一成分がレクチンと結合できるもの である、請求の範囲第47項に記載の方法。 50．該第二成分がレセプタであり、かつ該第一成分がレセプタと結合できるもの である、請求の範囲第47項に記載の方法。 51．請求の範囲第１項に記載の方法を実施するためのキットであって、第一の指 示薬と結合している第一成分と、既知量の、生物学的に活性な第二成分と、該第 一および第二成分間の該生物学的活性が、該第一成分を分離しない条件下で反応 混合物を生成する、適当なバッファーおよび試薬と、第一の指示薬で標識された 該第一成分によって予め被覆されている反応容器と、該第一の指示薬により標識 され、該反応容器内に残留している該第一成分の量を測定するのに使用する、該 アッセイ用の物質を含むことを特徴とする、上記キット。 52．請求の範囲第17項に記載の方法を実施するためのキットであって、第一の指 示薬と結合している第一成分と、既知量の、生物学的に活性な第二成分と、コン トロールとして使用するための、該第二成分の阻害剤である第三成分と、該第一 および第二成分間の該生物学的活性が、該第一成分を分離しない条件下で反応混 合物を生成する、適当なバッファーおよび試薬と、第一の指示薬で標識された該 第一成分によって予め被覆されている反応容器と、該第一の指示薬により標識さ れ、該反応容器内に残留している、該第一成分の量を測定するのに使用する、該 アッセイ用の物質を含むことを特徴とする、上記キット。 53．請求の範囲第18項に記載の方法を実施するためのキットであって、第一の指 示薬と結合している第一成分と、阻害性第三成分の適当なパネルと、反応混合物 を生成する、適当なバッファーおよび試薬と、第一の指示薬で標識された該第一 成分により予め被覆されている反応容器と、該第一の指示薬によって標識され、 該反応容器内に残留している、該第一成分の量を測定するのに使用する、該アッ セイ用の物質を含むことを特徴とする、上記キット。 54．請求の範囲第19または31項に記載の方法を実施するためのキットであって、 第一成分と、既知量の、第一の指示薬とカップリングしている第二成分と、該生 物学的に活性な該第二成分と結合している該第一成分が解離しない条件下で、反 応混合物を生成するための、適当なバッファーおよび試薬と、該第一成分により 予め被覆されている反応容器と、該第一の指示薬により標識され、該反応容器内 に残留している、第二成分の量を測定するのに使用する、該アッセイ用の物質と を含むことを特徴とする、上記キット。 55．請求の範囲第35または47項に記載の方法を実施するためのキットであって、 第一の指示薬と結合している該第一成分と、既知量の該第二成分と、該生物学的 に活性な該第二成分と結合している該第一成分が解離しない条件下で、反応混合 物を生成するための、適当なバッファーおよび試薬と、該第二成分により予め被 覆された反応容器と、該第一の指示薬により標識され、該反応容器内に残留して いる、該第一成分の量を測定するのに使用する、該アッセイ用の物質とを含むこ とを特徴とする、上記キット。