JPH04357459A

JPH04357459A - 固定化担体の製造方法及び免疫測定方法

Info

Publication number: JPH04357459A
Application number: JP4830591A
Authority: JP
Inventors: Takenori Takahashi; 高橋　壮模
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1992-12-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定するに
際して用いられる固定化担体の製造方法及びこれを用い
ての免疫測定方法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】ところで、免疫測定方法が行われた場合に
、すなわち抗原抗体反応により生物学的流体試料中の特
定微量成分の測定が行われた場合に、いわゆるプロゾー
ンが起きて正確な測定が行われないことの有ることが指
摘されており、この問題点に対する有効な対策案は提案
されていないのが実情である。

【０００４】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を正確に、精度及び再現性良く定量できる技術を提供す
ることである。この本発明の目的は、多孔質の担体に抗
体（又は抗原）を物理的及び／又は化学的に結合させた
後、これを粉砕することを特徴とする抗体（又は抗原）
が固定化された固定化担体の製造方法によって達成され
る。

【０００５】又、抗体（又は抗原）が固定化された多孔
質担体の粉砕されたものが免疫測定に際して用いられる
ことを特徴とする免疫測定方法によって達成される。抗
体（又は抗原）が物理的及び／又は化学的に結合される
多孔質の担体は硬質なものであることが粉砕（破砕）の
面から好ましく、このような担体の材料としてはケイ藻
土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、
ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリン、ポリ
アクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、アガロース
、架橋アガロース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が
挙げられ、中でもポリアクリルアミドや架橋ポリアクリ
ルアミドが好ましい。又、このような素材の多孔質担体
であれば、抗体（又は抗原）が固定化される一次的な形
状は粒子（ビーズ）状、棒状あるいはプレート状のもの
であっても差し支えないが、粉砕のし易さからは一次的
な形状は粒子（ビーズ）状のものが好ましい。

【０００６】抗体又は抗原は、これら多孔質の不溶化担
体に、当業者で公知の方法で化学的及び／又は物理的に
直接、あるいは間接的に結合させることができる。結合
法については１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２
名編「実験と応用アフィニティクロマトグラフィー」（
第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編
「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考
にできる。結合反応後、標識抗体（又は抗原）の非特異
反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与し
ない蛋白質を担持させることができる。それらの代表的
な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、ア
ルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及び
それらの分解物質等が挙げられる。

【０００７】抗体（又は抗原）が固定化された多孔質担
体の粉砕方法は、セラミック分野で用いられている粉砕
手段を用いることができるが、粉砕のしすぎに注意する
ことが好ましい。例えば、抗体（又は抗原）を多孔質の
担体に物理的及び／又は化学的に結合させた後、これを
粒径２００μｍ以下、好ましくは０．１〜１００μｍの
ものに粉砕し、このようにして得られた不溶化微粒子抗
体（又は不溶化微粒子抗原）と酵素などで標識された抗
体（又は抗原）及び試料とを接触、免疫反応させ、Ｂ／
Ｆ分離した後、不溶化微粒子抗体（又は不溶化微粒子抗
原）に結合した酵素標識体あるいは遊離の状態で存在す
る酵素標識体の酵素活性を測定することで、試料中の抗
原（又は抗体）が簡便な操作で、感度、正確度、精度及
び再現性良く、特にプロゾーンの問題が解決され、正確
な測定が行われたのである。

【０００８】本発明の免疫測定方法においては、試料と
してあらゆる形態の溶液、コロイド溶液などが使用しう
るが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、血
漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等
が挙げられる。本発明により測定しうる流体試料中での
特定成分は、その特定成分に特異的に結合する物質が存
在しうる物質（物質群）である。すなわち、ポリペプチ
ド、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核
酸、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等
が挙げられる。具体的には、特開昭６２−９０５３９号
公報や特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（
物質群）を挙げることができるが、これらに限定される
ものではない。

【０００９】本発明において用いられる標識物質として
は、例えば、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活
性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵
素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが挙げられ
る。具体的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号
公報などに記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素
、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。これらの酵素
を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のも
のを使用できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６
０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３
−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報
、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物
質群）が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。そして、これら標識物質の抗体（抗原）への結合は
、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこと
ができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井　　潔
編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年
」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５
３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、
臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を
参考にすることができる。

【００１０】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【００１１】本発明で使用する抗原は特異抗体と反応す
るものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。本
発明の免疫測定方法による反応型式としては、競合法、
２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられるが、特に限
定はされない。又、他の生物活性物質（例えば、ビオチ
ン、アビジン）を利用した免疫測定方法も適用できる。

【００１２】本発明においては、流体試料中の特定成分
を測定するのに反応型式として免疫反応を挙げているが
、免疫反応に準ずる生物活性を示す物質の特異反応（本
明細書では、この特異反応も免疫反応に包含）を利用す
ることも可能である。標識に起因した信号は、吸光度法
（比色法）　、螢光法または発光法で検出することがで
き、測定法としては信号の経時的変化を測定するレート
測定法または一定時間後の信号を測定するエンドポイン
ト測定法で測定することができる。好ましくは吸光度法
であり、吸光度法（比色法）　では紫外線、可視光、近
赤外光を利用することができ、例えば流体試料として血
清及び血漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光
の影響を小さくするために緑色光、赤色光または近赤外
光を利用するのが好ましい。

【００１３】

〔実施例１〕

１−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗
体の作成ＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社製
）２０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２．
０ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（同仁化学研究所製）の２．
５ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド溶液７７μｌを加え
て、３０℃で２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡ含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　　６．０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラムで精製し、マレイミド化し
たＣＲＰ抗体を得た。

【００１４】次に、β−Ｄ−カラクトシダーゼ（東洋紡
社製）１０．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液１．
８ｍｌに、前記マレイミド化したＣＲＰ抗体１３．６ｍ
ｇを含む溶液３．２ｍｌを加えて、４℃で４５時間反応
後、０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７５μｌ
を加えて３０℃で２０分反応させ、０．１５Ｍ塩化ナト
リウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ　　７．
４）で平衡化したスーパーローズ６プレップグレード（
ファルマシア社製）カラムで分離、精製し、βーＤ−ガ
ラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を得た。

【００１５】１−（２）比較用のＣＲＰ抗体固定化オイ
パーギットＣ２５０Ｌの合成オイパーギットＣ２５０Ｌ（ローム＆ファーマ社製、粒
径２５０μｍ）３ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）４０ｍｌ中に分散
し、これにＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タ
ウンズ社製）１３６ｍｇを入れ、４℃で２０時間攪拌し
、反応させる。反応後、濾取し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ　　４．０）と０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ　　８．
０）とを交互に用い、十分に洗浄した。

【００１６】水洗した後、オイパーギットＣ２５０Ｌの
非特異的結合部位をブロックする為、上記のふるいをか
けたオイパーギットＣ２５０Ｌを３％スキムミルク添加
の０．１Ｍのビストリス緩衝液（ｐＨ　　７．２）５０
ｍｌ中において４℃で２０時間攪拌した。そして、水洗
し、比較用のＣＲＰ抗体固定化オイパーギットＣ２５０
Ｌを得た。

【００１７】１−（３）本発明のＣＲＰ抗体固定化オイ
パーギットＣ２５０Ｌの合成上記〔１−（２）比較用のＣＲＰ抗体固定化オイパーギ
ットＣ２５０Ｌの合成〕で得たＣＲＰ抗体固定化オイパ
ーギットＣ２５０Ｌを乳バチで充分に粉砕（粒径３０μ
ｍ以下）し、本発明のＣＲＰ抗体固定化オイパーギット
Ｃ２５０Ｌを得た。

【００１８】１−（４）ＣＲＰの測定１ｍＭ塩化マグネシウム及び３重量％ウシ血清アルブミ
ンを含有する０．３Ｍビストリス緩衝液１９０μｌに、
上記１−（２）又は１−（３）で得たＣＲＰ抗体固定化
オイパーギットＣ２５０Ｌ１５ｍｇと、上記１−（１）
で合成したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体（
１０μｇ／ｍｌ）２５μｌと、ＣＲＰ溶液（濃度０、０
．０３、０．１、０．３、１、３、１０、１００ｍｇ／
ｄｌ）７μｌを添加混合し、各々のＣＲＰ濃度について
、室温で１２分間反応させた。

【００１９】反応後の混合液は直ちに口径０．２０μｍ
のセルロースアセテートメンブランフィルター（ミリポ
ア社製）により固相と液相を分離した。次いで、この各
液相２００μｌに１ｍＭの塩化マグネシウム及びｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３．０ｍ
ｇ／ｍｌ）含有の０．１Ｍビストリス緩衝液５００μｌ
を添加し、３７℃でインキュベートしながら４０５ｎｍ
の光学濃度を測定した。５−１５分の光学濃度差（△Ｏ
Ｄ）を用いて、各ＣＲＰ濃度における△ＯＤをプロット
した結果を図１示す。

【００２０】図１から判るように、本発明により得られ
たＣＲＰ抗体固定化オイパーギットＣ２５０Ｌを用いる
と、比較用のＣＲＰ抗体固定化オイパーギットＣ２５０
Ｌを用いた場合に比べ、ＣＲＰの識別力の向上が認めら
れる。又、本発明のＣＲＰ抗体固定化オイパーギットＣ
２５０Ｌが用いられると、比較用のＣＲＰ抗体固定化オ
イパーギットＣ２５０Ｌが用いられた場合に観察された
プロゾーン現象は認められなかった。

【００２１】

【効果】本発明によればプロゾーンの問題が解決され、
流体試料中の特定成分を正確に、精度及び再現性良く定
量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】５−１５分の光学濃度差（△ＯＤ）を用いて、
各ＣＲＰ濃度における△ＯＤをプロットしたグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　多孔質の担体に抗体（又は抗原）を物
理的及び／又は化学的に結合させた後、これを粉砕する
ことを特徴とする抗体（又は抗原）が固定化された固定
化担体の製造方法。
【請求項２】　　抗体（又は抗原）が固定化された多孔
質担体の粉砕されたものが免疫測定に際して用いられる
ことを特徴とする免疫測定方法。