JP2004531390A - 機能性表面コーティング - Google Patents
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Abstract
Description
(関連出願に対するクロス・リファレンス)
本出願は、「非特異的結合特性の低い機能性表面コーティング」と題する、2001年6月26日付け出願の米国暫定特許出願(該特許出願を参照により本明細書に含める)の優先権の恩典を特許請求する。
【発明の分野】
【0002】
本発明は、一般には、支持体物質に望ましい化学的、物理的、及び生物学的特性を付与する表面コーティングの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、分子、粒子、もしくは細胞の、表面への非特異的な吸着又は結合を阻害すると共に、特定の分子、捕捉剤、薬物、粒子、もしくは細胞を当該表面又は当該表面内に固定化あるいは取り込むための手段をもたらすように意図された表面化学品(surface chemistries)に関する。本発明はさらに、化学的に異なった種々の支持体物質に施すための被覆物に関する。
【発明の背景】
【0003】
天然もしくは合成物質と生体分子含有流体との間の相互作用を抑制することが、種々の分野において益々重要になりつつある。例えば、種々の支持体物質(すなわち表面)と生体分子との相互作用が、免疫診断、遺伝子マイクロアレイとタンパク質マイクロアレイ、及びマイクロ流体“lab−on−a−chip”デバイスを含めた多くの分析システムの主流になっている。キャピラリー電気泳動法(CE)、表面プラズモン共鳴法(SPR)、及び水晶天秤法(QCM)等の分析法も、本質的に生体分子−表面の相互作用に依存している。心血管代替物(例えばカテーテル、弁、ステント)、コンタクト・レンズと眼内レンズ、シャント、フィルター、ダイヤフラム、ポンプ、膜、ドラッグデリバリーデバイス、及び外科用部品を含めた生物医学デバイスの性能も、生体分子−表面相互作用の抑制に依存している。熱交換ユニット、船上部材(例えば、船体や上部構造物)、設備(ポンプ・デリック)、ドック、及び環境的に曝露されている計器を含めた海上表面も、それらの表面への生体分子の付着(藻、真菌、微生物の滲出物)を抑制する必要がある。
【0004】
これらの分野おける共通した大きな関心事は、標的支持体及びデバイス支持体への非特異的な生体分子(例えばタンパク質、有機体、核酸)結合のレベルがどの程度かという点にある。非感知応用品(non−sensing applications)又は非診断応用品(non−diagnostic applications)においては、こうした関心は、表面誘起による生物付着(機能を低下させる生物学的物質の付着)に集中する。表面誘起による生物付着は、生物医学デバイスや海上応用品において特に問題となる。医療、食品、環境感知、及び環境診断においては、標的検体(例えばポリサッカライド、核酸、薬物、ペプチド、又はタンパク質)の特異性、シグナル−ノイズ比、及び検出限界は、しばしば非標的生体分子(例えば血清タンパク質)の環境での限定された濃度において、支持体への表面非特異的な非標的(例えばタンパク質)結合によって抑えられる。こうした非特異的な結合ノイズを減少もしくは除去できれば、デバイスの性能が高まり、多くの分析システムのシグナル−ノイズ比、検出感度、及び特異性が向上する。
【0005】
分析システムに対し、多くの生物医学デバイスの適切な機能を発揮させるには、合成物質−生物学的界面が重要である。例えば、医療インプラントの表面におけるタンパク質の非特異的結合が、異物に対する反応を引き起こす上で少なくともある程度の原因になっており、このためデバイスの機能不全や拒絶反応を引き起こすことがある、と考えられている。こうした生物付着はさらに、生体内での長期間経過後における、デバイスによる感染発病、血栓症、及びセンサー劣化の原因にもなっている。これとは別に、特定の仕方で標的生体分子と相互作用するインプラント表面を使用して自然治癒を促し、これによって生物付着による多くの好ましくない反応を避けることができる、という仮説も立てられている。さらに、多くの非分析の応用分野(non−analytical applications)と非医療の応用分野(non−medical applications)も、表面−生物学的流体の相互作用の直接的な抑制を必要とする。例としては、工業設備、コロイドと無機質のハンドリングシステム、冷却システム、海洋構造物、及び生物学的成分を使用してインビトロにて生物学的生成物を得るのに使用されるバイオリアクターのための非汚染型ペイントや抗菌性コーティングが挙げられる。
【0006】
これらの重要な分野における改良はいずれも、特異的な標的結合、標的拘束、又は標的捕捉を、望ましくない成分の非特異的な付着に対して制御することができる、という改良された表面化学品の進歩から恩恵を受けている。これら表面化学品の必須要件は、合成表面(synthetic surfaces)が、非標的、生体分子、粒子、もしくは細胞に対して減少した非特異的結合(NSB)又は限定された非特異的結合を示す、ということである。NSBは、静電結合相互作用、水和結合相互作用、疎水結合相互作用、酸−塩基結合相互作用、分散結合相互作用、及び水素結合相互作用のあらゆる組み合わせを含めた、種々の基本的な分子レベルの付着メカニズムによって起こる。例えば、可溶性のタンパク質は一般に、これらの非特異的相互作用の組み合わせを介して表面の至る所に付着し、除去するのが困難な生物学的物質の付着層を形成する(生物付着の決定的な段階)。タンパク質のNSBの結果、さらなるNSB事象(変性タンパク質の露出内部への、他のタンパク質、細胞、又は微生物等のさらなる付着)のカスケードを誘発しうる表面上においてタンパク質の変性(天然構造の消失)が起こることが多い。この生物付着によるNSBカスケードは、生物医学インプラントに対しては望ましくない感染、凝固作用、又は炎症反応;診断アッセイと診断センサーに対しては減少したシグナル−ノイズ比;海上構造物及び環境的に曝露されている構造物に対しては腐食と劣化;海上輸送に対しては乱流と推進効率の低下;並びにキャピラリー、チューブ、及びマイクロ流体チャンバーにおいては望ましくない圧力降下と流れ特性;を引き起こす。したがって、タンパク質と生体分子のNSBを抑制できることは、生物学的流体と接触し、生物学的流体と共に機能し、そして生物学的流体中にて作用する改良された合成物質を設計する上で重要な性能特長である。
【0007】
表面へのNSBは望ましくない場合がほとんどであるが、標的表面において結合させることによって、指定された生体分子、粒子、薬物、又は細胞を特異的に捕捉することは望ましいことが多い。例としては、イムノアッセイ用の表面上での生物活性抗体の特異的な結合、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は遺伝子アッセイ(マイクロアレイ)用の表面上での核酸プライマーの特異的結合、及びそれぞれ細胞の増殖を促進もしくは阻害するための、表面への増殖因子又は抗生物質の特異的結合などがある。表面へのこのような特異的結合の目標は、指定したタイプの分子、粒子、もしくは細胞だけを標的表面に結合させること、並びに特異的に結合した分子、粒子、もしくは細胞の認識活性(recognition activity)、天然構造、及び機能を保持するような仕方で結合させることにある。
【0008】
したがって、(1) 処理された表面への、望ましくない分子、粒子、又は細胞の非特異的な結合を阻害するか;(2)処理された表面への、特定の生体分子、粒子、又は細胞の結合を促進しつつ、当該表面への、望ましくない分子、粒子、又は細胞の非特異的な結合を阻害するか;あるいは(3)処理された表面への、機能的もしくは生物学的に活性な特定の生体分子、粒子、又は細胞の結合を促進しつつ、当該表面への、望ましくない分子、粒子、又は細胞の非特異的な結合を阻害する、というような機能性表面化学品が求められている。
【0009】
非特異的結合が少ないという望ましい特性を有する表面を作製するために、幾つかの方法が試みられた。これらの方法は一般に、低いNSBを示すコーティング化学品又は表面官能基を選定すること、次いで表面官能基を下側の支持体に固定することを含む。この固定工程は、物理的吸着に基づくものであってもよいし、あるいは直接的な共有結合(化学的カップリング)に基づくものであってもよい。性能上の観点から、層は、環境に対する低NSB特性を保持しつつ、下側の支持体に対して強固な結合を示さなければならない。
【0010】
合成ポリマーをベースにした表面コーティングの検討は、ほとんどが非汚染型コーティングの開発に主眼を置いている。A.S.Hoffman,“非汚染表面技術,”Journal of Biomaterials Science: Polymer Edition 10, No.10(1999):1011−1014;ポリ(エチレングリコール):化学的及び生物学的応用, ACSシンポジウムシリーズ680, J.Milton Harris と Samuel Zalipskyによる編集, 米国化学会,1997。ポリエチレングリコール(PEG)誘導体のような、親水性で、極性で、電気的に中性のポリマーが、塗被方式において、溶液からのタンパク質のNSBを少なくする能力のあることが以前から知られていることから大きな関心を受けている。問題は、これらの水溶性ポリマーや他の類似の水溶性ポリマーを、連続的なコーティングによって効果的なNSBをもたらすに足る密度にて、有用な支持体物質に効果的に固定することである。1つのアプローチは、親水性−疎水性ブロックコポリマーを疎水性の支持体に物理的に吸着させることである。支持体と疎水性ポリマーブロックとの間の疎水性相互作用は、親水性の低NSBブロックを水性環境に与えつつ、コーティングポリマー分子を支持体に結びつけるのに充分である(米国特許第5,075,400号と第6,093,559号)。しかしながら、こうした物理的吸着による皮膜は、ポリマーの脱着が可逆性である〔特に、厳しい液体環境(例えば、高い塩含量、非中性のpH、高温、剪断流れ状態など)において〕という点において、及びNSBを抑えるのに効果的な再現性のある吸着密度を達成する能力という点において問題がある。
【0011】
低い非特異的結合特性を有する表面を作製する上での別のアプローチは、低NSBコーティングポリマーの標的表面への共有カップリング(covalent coupling)に関する。例えば、PEGは、PEG分子に導入された反応性末端基を介して、共有結合によって支持体にグラフトすることができる(米国特許第5,512,329号)。アジド化学とキノン化学は、ポリマー支持体へのこのような固定に対する2種の光反応性末端基の例である。このアプローチの欠点は、こうしたカップリング化学が効果的で且つ利用可能である場合の、特定のタイプのポリマー支持体を被覆することに限定されるという点である。興味ある無機支持体(例えば、ガラスや金属)に結びつけるには、ある中間の支持体結合層が必要となり、これはコスの上昇をきたし、時間の消費量が増え、コーティング手順の全体的な効率性の低下を招く。この方法の1つの特定の例は、PEG−シランを使用して、活性な金属酸化物表面上にコーティングを作製するというものである。このシステムにおいては、PEG分子が、アルコキシシラン末端反応性基又はクロロシラン末端反応性基で誘導体化される。おそらく、反応性シランの加水分解や化学縮合が、露出された表面シラノール基でPEG分子を酸化物支持体(例えば、ガラスや酸化ケイ素)に繋ぎとめるように作用するものと思われる。最初は有望であるにもかかわらず、PEG−シラン表面は実際には再生するのが困難である。末端アルキルシラン反応性基が溶液中で加水分解し、支持体に結びつく前にバルク溶液中で互いに反応し、あまりはっきりしない皮膜を生成し(反応性基は、PEG−シランを表面に繋ぎとめるよりむしろ互いに交差反応する)、これにより、幾らかの化学的付着と混じり合った、ある程度は物理的に吸着されたポリマーコーティングが形成される、と考えられる。信頼性の高いコーティングと低NSBが得られるようにこれを制御することは困難である。
【0012】
支持体上への非特異的結合を妨げるためのポリマー皮膜を作成する別のアプローチは、生体分子−阻止工程(マスキング)を組み込んで支持体に対する非特異的結合を阻害することである。この点に関して最も普通のやり方は、可溶性のウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、又は血清を支持体に予備吸着させるというものである。これらのタンパク質(あるいは血清中のタンパク質)は水溶液からほとんどの表面に強固に吸着し、それに続く他の生体分子の非特異的結合を最小限に抑える吸着タンパク質層がもたらされる。このようなタンパク質による阻止は、機能面から効果的であることが判明しているけれども、阻止工程は多大な時間を必要とし、労働集約的であり、再現性の点で問題がある。さらに、安全性の理由から、表面化学品の用途においては動物や血清から誘導される物質の使用は避けたいという要望がある。
【0013】
したがって当業界において認識されている改良物は、ばらつきがなく強固に、しかも直接的で効果的に種々の支持体物質に結びつくことのできる固相表面コーティングである。この表面コーティングは、低い非特異的結合特性を確実に示さなければならず、また使用するのが簡単でなければならない(すなわち、阻止工程を必要としないものでなければならない)。理想的には、表面化学品は、化学反応性のカップラーすなわち官能基を表面上に固定化するための手段を提供しなければならず、これらのカップラーすなわち官能基が、所望する標的の表面への固定化に対して高い特異的結合特性を示す。技術的な困難さと現時点での限界という背景に抗して本発明が開発された。
【発明の概要】
【0014】
本発明の実施態様は、機能性固相コーティングを製造する新規の表面化学品と方法、及びNSBを抑え、且つ特異的結合を可能にする改良された特性を有する表面に関する。本発明は、酸化物支持体、金属支持体、複合材料支持体、セラミック支持体、及びポリマー支持体を含めた種々の支持体上への強固なコーティング結合をもたらすと共に、外部環境からの溶質の非特異的結合を実質的に阻害する表面特性を付与する。
【0015】
特定の理論に拘束されるつもりはないが、本発明の表面化学品における種々の成分間の相互作用(後記にてより詳細に説明する)が、化学的に異なった種々の固相支持体への強固な結びつきを伴って新規表面コーティングの強度と利点をもたらす、と考えられる。本発明のコーティングの化学品は、単一の結びつきメカニズム(すなわち、シランカップリング、物理的吸着、光化学反応、又は化学的付着など)への依存性を実質的に減少させる。その代わりに、本発明のコーティング化学品の多機能特性は、酸化物支持体、セラミック支持体、及びポリマー支持体への共有結合による結びつき;コーティング内での架橋;並びに疎水性相互作用、酸−塩基化学、又は水素結合などを介した吸着;を含めた多くの結びつきメカニズムをもたらし、これらが組み合わさって、あるいは相乗的に作用して支持体上のコーティングを安定化させ、所望の表面特性を確実にもたらす。重要なのは、塗被したコーティング自体内での化学架橋が、コーティングの凝集特性とコーティング−支持体相互作用を増大させ、支持体への結びつきの強固さを高めるということである。
【0016】
本発明は、機能性表面コーティングの形成を促進する。“機能性”という用語は、特定の化学的もしくは分析的作用を果たす能力を表わすのに使用されている。例えば、ある種類の機能性表面は、指定された溶質に対して、特定の親和性結合能力又は特定のリガンド−受容体結合能力を示すことができる。例えば、表面に均一にビオチン基を有する表面を作製することができる。ビオチン基は、ストレプタビジンタンパク質分子とそれらの突然変異体に対して、高度に特異的で高い親和性結合の相互作用を示す。したがって、この例における機能性表面は、その機能がストレプタビジンを特異的に結びつけるという能力で定義される、ビオチン化された低バックグラウンドのNSBコーティングである。
【0017】
本発明の他の実施態様においては、機能性表面は、コーティングに対するあらゆる分子の結合相互作用を阻害するように設計される。この場合、特異的な機能作用は界面的には不活性である。こうした“不活性”機能の表面の具体的なものとしては、有効密度のメトキシキャップされたエチレンオキシドオリゴマー又はエチレンオキシドポリマーを有する表面がある。このような表面基は、一般には共有結合を形成せず、一般にはタンパク質、細胞、又は粒子に対して親和性結合特性を示さず、また一般には生体分子や他の可溶性化学種の吸着を起こしにくい。本発明においては、これらの不活性基が、下側の低バックグラウンドNBSコーティング中に直接導入される。
【0018】
本発明は、低NSBで塗被可能な架橋したマトリックスと一体の指定された機能性表面基(例えば、メトキシ−PEG又はビオチン)を含むコーティング構造物を具現する。表面官能基は、立体配座のフレキシビリティを与えるように、且つ非特異的吸着に対して不活性であるように選択されるスペーサー分子を介してコーティングマトリックスに共有結合されている。低NSBマトリックスは、これらのスペーサーと他のいわゆるマトリックス形成分子とを含んでいて、これらが架橋して塗被可能なフィルムになっている。代表的なマトリックス形成分子としては、ポリサッカライド(デキストラン)、エチレンオキシド含有オリゴマー(直鎖状、ブロック状、樹枝状、又は星形のポリマー形態)、ブロックコポリマー〔ポロキサマー(Poloxamer)(登録商標)、プルロニック(Pluronics)(登録商標)〕、及び非イオン界面活性剤〔ツイーン(Tween)(登録商標)、トリトン(Triton)(登録商標)〕などがある。本発明のコーティング構造物は、物理的架橋メカニズムと化学的架橋メカニズムとの組み合わせに基づくものと考えられる。マトリックス中での大きな分子のもつれ合いに加えて、ヘテロ官能性又は二官能性の反応性架橋剤分子も含まれていて、これらがコーティング中にて化学的に活性化される。共有結合の架橋は、コーティングマトリックス中においても、支持体に対しても起こると考えられる。本発明においてヘテロ官能性架橋剤や二官能性架橋剤を使用することの利点は、化学的に異なった種々の支持体物質にコーティングを効果的に施して架橋させることができる(特定の表面結合がある場合もない場合も)という点にある。本発明において説明されているコーティングは、それ自体内においても、また種々の支持体に対しても強固な結合をもたらす。
本発明は、上記の機能を有する成分を使用して機能性表面コーティングを製造する方法を提供する。本発明の方法は、有効量の活性成分を含んだ支持体を供給すること、有効量の架橋用成分を供給すること、及び有効量のマトリックス形成用成分を供給することを含む。活性成分、架橋用成分、及びマトリックス形成用成分を支持体上に混和し、互いに一体化させて、安定で堅牢な機能性表面改良物を作製する。
【0019】
本発明はさらに、免疫検体、遺伝子検体、微生物検体、細胞検体、粒子検体、及び他の生物化学的もしくは標的検体の結合システムを実施するための機能性表面を提供する。したがって、非特異的結合性マトリックスを支持体に取り付け、その非特異的結合性マトリックス中に活性成分を混和して一体化させて、種々のアッセイフォーマット用にコーティングの選択性を付与する。
【0020】
本発明の実施態様はさらに、リガンドの付着、薬物の取り込み、及び生体内もしくは生体外における医療用インプラントデバイスの生物付着の原因となるNSBの減少による医療用インプラントデバイスに対する宿主の拒絶反応を効果的に抑えるための、医療用インプラントデバイス用の機能的に不活性な表面コーティングを提供する。
【0021】
本発明の上記特徴と他の特徴、及び本発明を特徴づける種々の利点は、以下に記載の詳細な説明を読み、特許請求の範囲を見直せば明らかとなるであろう。
(好ましい実施態様の詳細な説明)
本発明の好ましい実施態様の特徴と他の詳細について、以下により具体的に説明する。理解しておかなければならないのは、本発明の特定の実施態様が例示のために示されているのであって、本発明がこれらに限定されないという点である。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく種々の実施態様において使用することができる。
【0022】
本発明は、種々の支持体102に塗被され、支持体上に安定化された多成分・多機能性薄膜コーティング100を製造するための方法と組成物を提供する(図1を参照)。これらのコーティング100は、非標的タンパク質〔例えば、フィブリノゲン、望ましくない酵素と抗体、望ましくない核酸、ポリサッカライド、粒子、溶質、微生物、細胞、及びコロイド等(これらを総称して非標的検体と呼ぶ)〕の塗被支持体への非特異的結合又は非特異的吸着を実質的に阻害する。本発明はさらに、極めて低い非特異的結合を、そして必要であれば、高い特異的結合及び増大したアッセイ選択性とアッセイ感度を与えるような、種々の支持体102上に安定化されたこのような表面についても説明する。
【0023】
本発明の1つの実施態様による多成分・多機能性表面コーティング100の概略図を図1に示す。図1は、本発明の方法と装置の構成成分、及び考えられる相互作用を示している。図1に示すように、支持体102には、支持体102上に固定された低い非特異的結合性のマトリックス、及び塗被した非特異的結合性マトリックス104内で物理的に絡み合って共有結合している活性成分106が供給されている。本発明の好ましい実施態様による方法、コーティング、組成物、使用法、及びキットについて、以下により詳しく説明する。
【0024】
本発明の方法は、標的支持体102への、特異的結合と減少した非特異的結合のどちらか又は両方を果たすことができる機能性表面100の製造に関する。塗被方法は、有効量の活性成分106、有効量の架橋用成分108、及び有効量のマトリックス形成用成分を供給することを含む。これら3つの一般的な成分を支持体上に組み込み、機能性表面コーティング100を作製し、本発明によって説明されている特性を付与する。
【0025】
“機能性表面”100という用語は、所望の標的分子、標的粒子、及び標的細胞など(これらを総称して標的検体と呼ぶ)を外部環境から選択的に結びつけるために、及び/又は望ましくない分子、粒子、及び細胞(これらの総称して非標的検体と呼ぶ)を表面からまとめて拒絶するために特定の化学基を使用する表面を表わすのに使用されている。この定義によれば、ある種類の機能性表面は、特定の官能基110を表面に取り入れることによって特異的な結合能力を示すようになる。ある1つの例は、高いアビジン結合活性(一般には、アビジン1cm2当たり300〜500ngの範囲において)と、他の生物製剤、粒子、及び溶質に対する低NSB(一般には、1cm2当たり0.01〜50ngの範囲において)を示すビオチン化された表面である。“機能性表面”という用語はさらに、特定の範囲(一般には、1cm2当たり約0.01〜50ng)にて本質的に低いタンパク質結合又は粒子結合、あるいは本質的に低いタンパク質吸着又は粒子吸着を示すような化学基又は表面組成物を表わすのにも使用されている。したがって、この種類の表面における“機能”は、タンパク質、細胞、微生物、及び粒子の吸着に対して実質的に不活性となる。このような不活性機能の例としては、メトキシでキャップされたエチレンオキシドオリゴマー又はエチレンオキシドポリマーを取り入れた表面がある。これらの不活性表面基112は、一般には共有結合を形成せず、一般には親和性結合特性を示さず、そして一般には、生体分子、粒子、細胞、微生物、及び他の可溶性化学種(非標的検体)の吸着を起こしにくい。
【0026】
本出願の目的に適うように、“有効量”とは、他のコーティング成分と混合したときに、所望の用途(例えば、アッセイコーティングやインプラントコーティング)に対する特定の性能基準に適合したコーティングマトリックスを生成する、当該コーティング成分の量であると定義される。これらの性能基準は、“低い非特異的結合又は非特異的吸着”(“低NSB”)と“高度に選択的な特異的結合”(下記にて説明する)との両方に関して規定される。
【0027】
本出願の目的に適うように、“低い非特異的結合”、“低い非特異的吸着”、及び“低NSB”という用語は、ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング(すなわちマスキング)の現在の方法に関連して定義される。BSA−ブロッキングは、生物学的流体のセッテイングにおいて支持体を使用する前に、可溶性の血清タンパク質であるウシ血清アルブミンを溶液から支持体物質に物理的に吸着させるプロセスである。この予備吸着させたBSA層は、支持体上への溶質又は粒子のさらなる吸着を阻害するように作用する。BSAブロッキング法は、特に生物化学的アッセイとの関連において、種々の支持体への非特異的結合又は非特異的吸着を阻害するための最新の実用プロセスを表わしている。したがって、本発明の目的に適うためには、BSA−予備吸着あるいは同等のブロッキング工程を必要とすることなく、BSA−ブロッキングと類似の仕方で、又はBSA−ブロッキングより優れた仕方でNSBを阻害するコーティング構造物(a coating formulation)は、ここでは低NSB表面であると考えられる。
【0028】
“高度に選択的な特異的結合”の性能基準も、相対的な仕方で定義される。本出願の目的に適うよう、表面に取り込まれた特定の結合基が、複雑な環境から標的(検体)化学種を選択的に結合できるときに、またこのような特定の結合基が存在しない類似の表面が、標的化学種(検体)を特異的に結合する能力をほとんど又は全く示さないときに、表面は高度に選択的であると考えられる。例えば、適度な量のアビジンまたはストレプタビジンが、ビオチン化された表面に結合され、同じ結合条件下においてビオチン化されていない表面には結合されないとき、ビオチン化された表面は、ビオチン化されていない表面と比較して高度に選択的であると言われる。
【0029】
最後の性能基準は、“非選択性”と低NSBとが組み合わさったものである。この場合には、特異的であろうと非特異的であろうと、いかなる結合もしくは吸着も必要とされない。このときも、性能は、競合する方法(例えばBSA−ブロッキング)に関して規定される。
【0030】
支持体102上に表面コーティング100を取り込む工程又は固定する工程は、有効量の活性成分106、有効量の架橋用成分108、及び有効量のマトリックス形成用成分104を混合して塗被可能な混合物にすることを含むのが好ましい。この塗被可能な混合物を支持体に施し、硬化させて安定で堅牢な表面を生成させる。塗被混合物はさらに、マトリックス内で絡み合うようになる他の非共有結合的に結びついた官能基(例えばストレプタビジン)を含んでもよい。
【0031】
本発明の方法は、活性成分、マトリックス形成用成分、及び架橋用成分をキャリヤー溶媒又はキャリヤー溶媒混合物中に混合することを含むのが好ましい。使用する成分濃度の範囲は、選択する個々の塗被方法に依存する。溶媒の選択も、成分の化学、塗被方法、及び支持体物質の選択に依存し、溶媒の表面張力、溶解性パラメーター、粘度、選択した支持体との反応性等のファクターが溶媒の選択に影響を及ぼす。
【0032】
本発明において使用するための活性成分
一般には、本発明の活性成分106の実施態様は、官能基110、スペーサー基114、及び結合基116を含む(図1を参照)。非特異的結合が必要とされる場合は、官能基110の代わりに不活性官能基112を組み込むことができる、という点に留意のこと。
【0033】
より詳細に言えば、“活性成分”という用語は、
分子の一端に少なくとも1つの反応性基(例えば116)を、そして分子の両端に少なくとも1つの官能基(例えば110又は112)を含む二官能の反応性分子を表わすように意図されている。2つの基の間の距離は、当業者が必要とする最終製品によって規定される所望の特性が得られるようにスペーサー基114の長さを変えることによって変えることができる。前述したように、活性成分106は、官能基、スペーサー基、及び結合基を示す特定の化学的部分を含むのが好ましい。これらの用語の特定の定義を下記に示す。活性成分106は、これらの基が組み合わさったものであるのが好ましい。しかしながら、理解しておかねばならないのは、活性成分は、必ずしも3つの異なった基を含む必要はない、という点である。例えば、1つ基が官能基としてもスペーサー基としても作用することが可能である。例えば、官能基(例えば110又は112)と反応性基116が同じ化学構造(例えば、二官能性のホモ活性成分)を有することも可能である。活性成分は、下記に記載のように、活性成分のそれぞれの基に関して記載の機能を果たすことだけが必要であり、これらの目的を果たすのに必要とされる部分はごくわずかである。
【0034】
本明細書で使用している“官能基”110という用語は、一般に非標的化学種とは結びつかないで、表面に対して外部の標的化学種と一般的に相互作用して結合(共有結合と非共有結合の両方)を形成するような基を含むように意図されている。“官能基”という用語はさらに、不活性官能基112と呼ばれる、外部環境におけるあらゆる化学種の結合及び吸着に対して本質的に不活性であるような基を表わしてよい。
【0035】
特異的結合用に設計された表面の場合、官能基110としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基、及び所望する標的化学種を選択的に結合することのできるキレーターなどがあるが、これらに限定されない。官能基110のさらに具体的な例としては、例えば、ビオチン、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、カルボキシレート、ビニル、ビニルスルホン、金属キレート、グルタチオン、ストレプタビジン、ナイトレン、アクリレート基、フェニルボロン酸、ニトロトリ酢酸(NTA)、イミドジアセテート(IDA)、サリチルヒドロキサム酸、ヒドロキシル基(−OH)、アミン基(−NH2)、イミン基(−NHR)、カルボン酸(−COOH)、アルデヒド(−CHO)、ケトン(C=O)、エステル(−COOR)、エーテル(−C−O−C)、アミド基(−CONH2)、イミド(−CONHR)、シアニド(−CN)、ヒドラジド(−NHNH2)、スクシンイミド(−ONC4O2)、マレイミド、チオール(−SH)、ハロゲン化物(−X)、シリル(−SiH)、アジド基(−N3)、フェニル基、スルホネート(SO3 -)、イソチオシアネート、イソシアネート、エポキシド、ニトロベンジル、オキサゾリン、酸塩化物、クロロホルメート、ジスルフィドピリジル、アズラクトン、臭化シアノゲン、フルオロアレーン、フルオロカーボン、ジスルフィド、イソシアニド、スルファアミド、サルフェート、ヘパリン、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機ケイ素化合物、及び有機ホスフェート(ホスホアミダイト)化合物などがあるが、これらに限定されない。
【0036】
特異的な表面結合がほとんど又は全く要求されない表面の場合、不活性官能基112は、エチレングリコールオリゴマー、アクリルアミド、ピロリドン、ポリサッカライド、モノサッカライド、及び極性の合成ポリマー等の非反応性化学基を含む。
【0037】
官能基の選択は、それぞれの用途に適した官能基を有する誘導体の既知の結合パラメーターに基づいて当業者が行う。したがって、外部環境からの選定された標的検体を特異的もしくは非特異的に選択し、そして前記標的検体と結合するように活性成分を設計することができる。
【0038】
本明細書で使用している“スペーサー”という用語は、官能基110又は不活性官能基112を活性成分106の結合基116から隔離すべく作用する部分を含むように意図されている。スペーサー基114の長さは通常、官能基と結合基が、物理的もしくは化学的に互いに干渉することなくそれぞれの機能を果たすことができるだけの充分な長さである。スペーサーは官能基を結合基に連結し、そしてさらに、塗被した固体支持体102から官能基をある距離だけ隔離するのが好ましい。このスペーサー114は、標的化学種への官能基110の接近しやすさを増し、固体支持体102からの立体傷害、あるいは固体支持体102との結合干渉を少なくする。
【0039】
スペーサー114は、全ての官能基に同じ作用を与えるある一定の長さであるのが好ましいが、このことは必ず必要とされるわけではない。スペーサーの例としては、ヘテロ官能性、二官能性、もしくは多官能性の小さな分子又はポリマーなどがあるが、これらに限定されない。これらの分子は、固体支持体上に共有結合又は安定な皮膜を形成することができ、そして同時に、外部環境から標的化学種を特異的に結合するための官能基をもたらすことができる。例えば、二官能性で直鎖のPEG(オリゴマー又はポリマー)、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー〔プルロニック(Pluronic)(登録商標)〕、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、高分岐ポリマー、マクロモノマー、架橋用のアルキル連結カップリング剤、及びヘテロ二官能性のアルキル連結カップリング剤;二官能性で星形のPEG(オリゴマー又はポリマー)、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー(プルロニック)、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、高分岐ポリマー、マクロモノマー、架橋用のアルキル連結カップリング剤、及びヘテロ二官能性のアルキル連結カップリング剤;並びに二官能性で櫛状のPEG(オリゴマー又はポリマー)、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー(プルロニック)、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、高分岐ポリマー、マクロモノマー、架橋用のアルキル連結カップリング剤、及びヘテロ二官能性のアルキル連結カップリング剤;が適切なスペーサーである。
【0040】
本明細書で使用している“結合基”116という用語は、活性成分106をコーティングマトリックス100及び/又は下側の支持体102に結びつけることのできる部分を含むように意図されている。結合基116は、活性成分をコーティングマトリックス又は支持体に共有結合で結びつけるように選択するのが好ましい。結合基は、架橋の形でそれ自身と反応してもよい。本発明において使用するための結合基の例としては、シラン、メタクリレート、ジスルフィド、ジシラザン、スルフヒドリル、アクリレート、カルボキシレート、活性化エステル、他の活性離脱基、イソニトリル、イソシアネート、ホスホアミダイト、ナイトレン、エポキシド、ヒドロシリル、エステル、アレーン、アジド、アミン、ニトリル、ビニル基、アルキルホスホネート、及び表面への化学カップリングに関連した当業者に公知の表面カップリング用反応性化学種などがあるが、これらに限定されない。
【0041】
好ましい実施態様においては、活性成分106は、結合基部分を有するある量の反応性化学種(例えば、アミノ末端アルキルシラン)と末端官能基を有するスペーサー〔例えば、ビオチン−PEG−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS−PEG−ビオチン)〕とを化合させることによって生成される。この化合の結果、反応性基もしくは結合基として作用させるのに利用できる末端シラン、スペーサー基として作用するPEG部分、及び官能基として作用するビオチンを有する活性成分が得られる。活性成分は、X−PEG−Yという一般的な分子式を有し、このときXは官能基であり、Yは結合基である。一連の可能な官能基を前記したが、好ましい官能基の例としては、ビオチン、N−ヒドロキシスクシンイミド、ビニルスルホン、金属イオンキレート(例えば、Ni2+−NTA)、グルタチオン結合基、アミノ、アルデヒド、エポキシ、メルカプト、マレイミド、ヘパリン、メトキシ、及びスルホネートなどが挙げられる(但し、これらに限定されない)。好ましい結合基の例としては、シラン、アジド、アクリレート、アルデヒド、イソシアネート、ホスホネート、及びエポキシなどがあるが、これらに限定されない。
【0042】
本発明の方法は、ある溶媒中への活性成分106の0.001モル/リットル〜0.1モル/リットル溶液を作製することを含むのが好ましく、0.05モル/リットル〜0.02モル/リットル溶液を作製することを含むのがさらに好ましく、0.01モル/リットル溶液を作製することを含むのが最も好ましい。前述したように、活性成分106は、式X−PEG−シランの分子であるのが好ましく、このときXは官能基(例えば、ビオチン、ビニルスルホン、又はN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル)であり;PEGはポリエチレングリコールポリマー(2000〜5000原子質量単位の分子量を有するのが好ましい)であり;シランは加水分解可能なシラン前駆体基(例えば、トリアルコキシシランやトリクロロシラン)である。
【0043】
好ましい実施態様においては、活性成分106は、ビオチン−PEG−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミド〔ビオチン−PEG−NHS、分子量3400、例えばシェアウォーター社(Shearwater Corp.)のOH2Z0F02〕とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社(Gelest)のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて1:1のモル比で反応させることによって形成されるビオチン−PEG−シラン分子である。この反応は、室温で2時間行うのが好ましい。ビオチン−PEG−NHS上のN−ヒドロキシスクシンイミド基がアミノシラン上の末端アミンと確実に反応して、ビオチン−PEG−シラン活性成分を生成する。活性成分のための溶媒の例としては、N,N−ジメチルアセトアミド(DMAC、アルドリッチ27,055−5)がある。
【0044】
他の好ましい実施態様においては、2種の活性成分(ビオチン−PEG−シランとメトキシ−PEG−シラン)をコーティング混合物中に混ぜ合わせる。ビオチン官能基を“不活性”のメトキシ基中に希釈することによって、結びつけられたストレプタビジンのビオチン結合活性を増大させることができる。第1の活性成分は、上記パラグラフに記載のビオチン−PEG−シラン(分子量3400)である。第2の活性成分はメトキシ−PEG−シランであり、メトキシ−PEG−OCH2CH2−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミド(メトキシ−PEG−NHS)〔3400未満の分子量であるのが好ましく、2000の分子量であるのが最も好ましい(例えば、シェアウォーター社の2M4M0D01)〕とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて1:1のモル比で反応させることによって形成される。
【0045】
他の好ましい実施態様においては、活性成分はメトキシ−PEG−シランであり、メトキシ−PEG−OCH2CH2−CO2−N−ヒドロキシスクインイミド(分子量5000、例えばシェアウォーター社の2M4M0H01)とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて1:1のモル比で反応させることによって形成されるのが好ましい。
【0046】
他の好ましい実施態様においては、活性成分106はビニルスルホン−PEG−シランであり、ビニルスルホン−PEG−CO2−N−ヒドロキシスクインイミド(分子量3400、例えばシェアウォーター社の2Z5B0F02)とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて1:1のモル比で反応させることによって形成されるのが好ましい。
【0047】
他の好ましい実施態様においては、活性成分106はNHS−PEG−シランであり、PEGの二官能性N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(SPA−PEG−SPA、分子量3400、例えばシェアウォーター社の4M4M0F02)とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて2:1のモル比で反応させることによって形成されるのが好ましい。他の実施態様においては、活性成分106はCOOH−PEG−シランであり、COOH−PEG−N−ヒドロキシスクシンイミド(分子量3400、例えばシェアウォーター社の0Z2Z0F12)とアミノ末端アルコキシシラン〔(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン、例えばゲレスト社のSIT8398.0〕とを選定された溶媒中にて1:1のモル比で反応させることによって形成されるのが好ましい。
【0048】
本発明において使用するための架橋用成分とマトリックス形成用成分
本発明の“架橋用成分”108とはここでは、適切な刺激によって活性化されると、皮膜100内での架橋による安定化だけでなく、種々の固体支持体102への共有結合もしくは皮膜の吸着的な結びつきをもたらす、複数の反応性部分を含んだ反応性分子と定義される。
【0049】
ある実施態様においては、架橋用成分108は、アルキルシラン反応性末端基とスルホニルアジド反応性末端基を含み、これらが組み合わさると2元の反応性官能価(dual reactive functionailities)が生じ、これをキャアーすると反応が進行して、コーティング内において及び種々の支持体102に対して自発的な架橋を形成する。代表的な架橋基としては、下記の物質からの基と化合する分子が挙げられる:メタクリレート、アクリレート、エポキシド、シラン、ペルフルオロフェニルアジド、アリールアジド、ビス−ナイトレン、アシルアジド、アジドホルメート、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、β−ケト−α−ジアゾアセテート、脂肪族アゾ、ジアジリン、ケテン、光活性化ケトン、ジアルキルペルオキシダーゼ、ジアシルペルオキシダーゼ、又はキノン。1つの例としては6−アジドスルホニルヘキシルトリエトキシシランを挙げることができ、この物質は、支持体(例えば、酸化ポリマー、金属酸化物、シリコンウエハー、ケイ酸塩、チタン酸塩、アルミン酸塩、又はガラス)の表面上に存在する反応性のヒドロキシル基と共有結合を形成することができるシラン基を含む。これらのシラン基はさらに、互いに架橋することも、あるいは他のシラン基と架橋することもでき、三次元の架橋マトリックスを形成する。アジドスルホニル基は、支持体102上にて、及び/又は塗被可能な多成分マトリックス104内にて、脂肪族化合物及び芳香族化合物と共有結合を形成することができる。
【0050】
本明細書で使用している“マトリックス形成用成分”104という用語は、生物学的物質(例えば、タンパク質、ポリサッカライド、細胞、及びバクテリア)及び非生物学的物質(例えば、粒子、コロイド物質、イオン性物質、シリカ含有物質、及び炭素質物質)に対して低い非特異的結合特性を与える物理的特性を有することが当業界に知られている分子を含むように意図されている。Ostuni,E.; Chapman,R.G.; Holmlin,R.E.; Takayama,S.; Whitesides, G.M.Langmuir, 17: 5605−5620(2001)。このようなマトリックス形成用分子は一般に下記の特性の1つ以上を含む:このような分子は、極性、親水性、及び電気的に中性であり、水素結合受容体であり、一般には立体配座上のフレキシビリティを示す。
【0051】
マトリックス形成用成分104の例としては、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート(PST)、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート(PSH)、ポリオキシエチレン6トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン12トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン18トリデシルエーテル、ツイーン(Tween)(登録商標)界面活性剤、トリトン(Triton)(登録商標)界面活性剤、及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー〔例えば、BASF社から市販のプルロニック(Pluronic)(登録商標)製品シリーズやポロキサマー(Poloxamer)(登録商標)製品シリーズ〕を含めたポリエチレンベースの界面活性物質があるが、これらに限定されない。他のマトリックス形成用成分としては、デキストラン、直鎖のPEG分子(MW500〜5,000,000)、星形のPEG分子、櫛形の高分岐PEG分子、及び樹枝状の高分岐PEG分子、類似の直鎖ポリアミンポリマー、類似の星形ポリアミンポリマー、類似の樹枝状ポリアミンポリマー、種々のカーボネート化界面活性剤、種々のペルフッ素化界面活性剤〔例えば、デュポン社のゾニル(Zonyl)(登録商標)フルオロ界面活性剤〕、及び種々のケイ素化界面活性剤(例えば、ジメチルシロキサン−エチレンオキシドブロックコポリマー)などがある。生物学的物質由来のマトリックス形成用成分104としては、カゼイン、血清希釈物、ウシ血清アルブミン、糖脂質と脂質、ヘパリンとそれに関連したグリコサミノグリカン、muscin、及びポリサッカライド(デキストラン、ヒアルロナン、セファローズ、セルロース、アガロース、コンドロイチン、キトサン)などがある。
【0052】
架橋用成分108とマトリックス形成用成分104との溶液はキャリヤー溶媒中にて形成される。前述したように、マトリックス形成用成分104は、直鎖もしくは分岐鎖のポリオキシエチレン含有界面活性剤であるのが好ましい。マトリックス形成用成分104は、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート(PST、例えばアルドリッチ46,639−5)であるのが最も好ましい。マトリックス形成用成分は、最終的なコーティング混合物において0.01〜5%(vol/vol)の溶液が得られるように溶解するのが好ましい。マトリックス形成用成分は、最終的なコーティング混合物において0.5〜2%の濃度を有するのがさらに好ましい。マトリックス形成用成分104の濃度は、最終的なコーティング混合物において1%(vol/vol)であるのが最も好ましい。
【0053】
前述したように、架橋用成分108は二官能性の化学反応性化合物であるのが好ましく、分子の一端にアジド官能性を、そして分子の他端にアルキルシラン官能性を有する二官能性のヘテロ分子であるのがさらに好ましい。架橋用成分108はアジドシラン(6−アジドスルホニルヘキシル−トリエトキシシラン、95%; 例えばゲレスト社のSIA0780.0)であるのが最も好ましい。架橋用成分は、0.001〜0.5モル/リットルの溶液が得られるように溶解するのが好ましく、0.005〜0.1モル/リットルの溶液が得られるように溶解するのがさらに好ましい。架橋用成分108は、0.02モル/リットルの溶液が得られるように溶解するのが最も好ましい。架橋用成分/マトリックス形成用成分混合物のための好ましい溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO、例えばアルドリッチ47,230−1)であるが、他の溶媒も使用可能であると考えられる。
【0054】
本発明において使用するためのコーティング溶液
使用に関して説明すると、本発明のコーティング溶液100は、本発明の活性成分溶液と、本発明の架橋用成分108/マトリックス形成用成分104の混合物とを種々の異なった体積比にて混合することによって得られる。最も好ましい体積比は、活性成分溶液と架橋用成分/マトリックス形成用成分溶液との比が約1:4である。コーティング溶液における最も好ましい最終成分濃度は、活性成分(例えば、ビオチン−PEG−シラン)が0.002モル/リットル、マトリックス形成用成分(ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート)が0.009モル/リットル、及び反応性成分(アジドシラン)が0.0183モル/リットルである。
【0055】
留意しておかねばならないことは、最も好ましい最終濃度は、ある程度は、使用する塗被方法と所望するコーティング厚さに依存する、という点である。上記の最も好ましい濃度は、スピンコーティングの作製操作に関係している。しかしながら、活性成分と架橋用成分/マトリックス形成用成分との他の比、及び最終濃度も、これらの組み合わせが、所望する特異的結合特性/非特異的結合特性を示す有用なコーティング溶液をもたらす限り、本発明の範囲内であると考えられる。さらに留意しておかねばならないことは、活性成分、架橋用成分、及びマトリックス形成用成分の組み合わせ物中に他の標的タンパク質もしくは検体が含まれていてもよい、という点である。例えば、ストレプタビジンとビオチン化された活性成分とを混合してストレプタビジン−ビオチン表面を形成させ、これによりストレプタビジンをコーティングマトリックス内に固体化させた表面コーティングが得られる(ストレプタビジン−ビオチン表面と呼ぶ、後述の実施例VIIIを参照)。
【0056】
本発明において使用するための支持体
本明細書で使用している“支持体”102という用語は、当業界ではよく知られており、本発明の成分の組み合わせ物を塗被することのできるあらゆる表面を含むように意図されている。適切な支持体102としては、屈折性、透明性、吸着性、及び不透明性の固相物質がある。適切な支持体としては、金、白金、銀、銅、鉄、及びアルミニウム等の金属;ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、セルロース、ニトロセルロース、ペルフッ素化ポリマー、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ナイロン、ヒドロゲル、関連したブレンド物、及び関連したコポリマー等のポリマー;並びにシリカ、二酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化鉄、炭素、ケイ素、種々のケイ酸塩ガラスと他のガラス(例えばソーダ石灰ガラス)、セラミック、及びゾル−ゲル等の非金属;などがあるが、これらに限定されない。本発明の表面化学品は、こうしたあらゆる種類の支持体102及びそれらの誘導物質と変形体に対して固定するのが有利である。この場合も、マトリックス形成用成分、反応性成分、及び活性成分中における架橋反応と他の反応により、支持体への不必要な共有結合なしに、支持体102上の非特異的結合マトリックスの安定性が促進される、と考えられる。
【0057】
留意しておかねばならないことは、本発明において使用するためのある種の支持体102は、清浄化工程、乾燥工程、酸化工程、又はコーティング溶液100と標的支持体102との効果的で均一なコーティング相互作用を容易にするための、当業界に公知の他の処置を必要とする場合がある、という点である。例えば、一般には、高純度水中ですすぎ洗いすることによってスライドガラス支持体を“準備し”、アルカリ性のガラスクリーナー中に浸漬し、ガラスクリーナー中で約15分超音波処理し、高純度水中に浸漬し、そして最終的にはN2ガスで吹きつけ乾燥する。他の支持体調製手順については実施例において説明してあるか、あるいは当業者にとって公知である。
【0058】
支持体へのコーティング溶液の塗被
前記のコーティング混合物を標的支持体102に塗被する。支持体102へのコーティング溶液の塗被は、スピンコーティング法、ディップコーティング法、スプレーコーティング法、又は当業者に公知の他のあらゆるタイプのコーティング法もしくは塗被法によって行うのが好ましい。コーティング混合物は支持体上にスピンコーティングするのがさらに好ましい。0.5mlのコーティング混合物をスピンコーター〔例えば、ローレル・モデル(Laurell Model)WS−200−4NPP/RPM/HSP−8K/VAC〕にて塗被し、そして3500〜5000rpmにて90秒回転させることによって、コーティング溶液を支持体にスピンコーティングするのが最も好ましい。留意しておかねばならないことは、特定の用途に対しては第2の、そして場合によっては第3の、支持体へのコーティング混合物の塗り又は塗被が行われる、という点である。これらの追加塗被によって、コーティング混合物層の厚さを変えることができる。標的支持体上のコーティングの厚さは、一般には約5〜200nmであり、好ましくは約20〜30nmである。しかしながらコーティングは、本明細書に記載の機能を果たすのに充分である限り他の厚さであってもよい。
【0059】
留意しておかねばならないことは、上記成分の組み合わせ物が、当該成分のサブセットを含んだ同じコーティングより優れた性能を示すコーティング100をもたらす、という点である。後述の実施例XVに示すように、本発明の実施態様は、上記の全ての成分(活性成分106、架橋用成分108、及びマトリックス形成剤104)がコーティング表面100に存在するときに最適に機能する。しかしながら、本発明の実施態様は、上記成分のうちの1つを除外してもよく、最適とは思われない仕方での機能(特異的結合と非特異的結合)ではあるものの、それでもあるレベルの機能を維持する。
【0060】
表面塗被した標的支持体の硬化
いったん塗被した後に、公知の方法を使用して硬化することにより、支持体にコーティングが安定化される。硬化工程は、減圧オーブン中における熱的活性化であるのが好ましい。硬化工程は、減圧オーブン内の圧力を真空ポンプにより30分で150mmHg(絶対)の圧力に低下させる室温排気工程を含むのがさらに好ましく、その後にオーブンを40℃〜140℃に(最も好ましくは70℃に)加熱する。この方法では、熱硬化工程全体に約1時間かかる。硬化温度と硬化時間は、ある程度は支持体物質の物理的特性に依存する。したがって、支持体102の温度と物理的特性に応じて、より短い硬化時間又はより長い硬化時間が必要とされる。次いで塗被した表面を室温に自然冷却する。この複数工程からなる硬化プロセスは有益である。なぜなら、溶媒の除去を可能にし、堅牢で密着性の機能性コーティング100を形成させるための充分な反応時間と反応温度をもたらすからである。
【0061】
硬化工程は本発明の機能性表面を安定化させる。留意しておかねばならないことは、硬化工程は、熱による活性化(前述)、光による活性化、化学的活性化、あるいは支持体への結合だけでなく機能性表面内において架橋を生成する他のいかなるタイプの硬化であってもよい。熱活性化としては、例えばオーブン中での加熱があり、光活性化としては、例えば紫外線照射があり、化学的活性化としては、例えば架橋を化学的に起こしやすくする水中浸漬などがある。化学的架橋はさらに、外部からの刺激(例えば、縮合のようなエージングプロセス)がなくても進行してよい。他のいかなる態様の化学的・物理的な変形あるいは硬化も、当業者が周知しているように使用することができる。
【0062】
本発明において使用するための結合アッセイの例
本発明のある実施態様においては、生化学的もしくは生体分析的な結合アッセイを行うための機能性表面100が提供される。この機能性表面は、コーティングベース配合物中の適切な官能基化学を変えることによって特定の用途に適用可能な一般的なベース組成物を、幾つかの異なった種類の界面特性に容易に適合しうるカセットスタイルのフォーマットにて含む。表面コーティングは、多くの用途にまたがったプラットフォーム化学(platform chemistry)の、容易でカスタマイズされた調整を可能にする下記のような成分を含んだ状態で作製される:支持体上及び/又は支持体に固定された非特異的結合マトリックス;並びに非特異的結合マトリックスに固定された活性成分。
【0063】
活性成分106は、機能性表面100の製造法に関して前述したものと同じであるのが好ましい。非特異的結合マトリックスは、支持体上及び/又は支持体への活性成分の付着を容易にする。非特異的結合マトリックスは、マトリックス形成用成分と架橋用成分を含むのが好ましい。マトリックス形成用成分と反応性成分は、機能性の選択的結合表面を形成するための方法に関して前述したものと同じである。下側支持体上及び/又は下側支持体へのコーティングの付着は、化学反応を介しての支持体への直接的な共有結合に加えて、架橋した不溶性の皮膜マトリックスと支持体との間の複数の非共有結合的相互作用(non−covalent interactions)(例えば、物理的な絡み合いや非共有結合)によって促進されると考えられる。
【0064】
本発明の表面化学品は、免疫診断、遺伝子マイクロアレイとタンパク質マイクロアレイ、及びマイクロ流体“lab−on−a−chip”デバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。これらの分析セッティング(analytical settings)への表面化学品の適用は、本発明の組成と方法を使用して当業者に公知の仕方で行われる。本発明において使用するための分析アッセイの例としては、TMB−マイクロウェルアッセイ(後述の実施例において説明する)、スタフィロコッカル・エンテロトキシンBサンドイッチアッセイ(後述の実施例において説明する)、オリゴヌクレオチドマイクロアレイアッセイ(後述の実施例において説明する)、並びに抗原、病原体、粒子、薬物、毒素、及び代謝産物の存在を定量化する他の捕捉アッセイなどがあるが、これらに限定されない。
【0065】
留意しておかなければならないことは、本発明の表面コーティング100の異なった実施態様を、適合性のある有用な標的アッセイ成分を含んだ多くの表面コーティングと一緒にパッケージ化して、分析アッセイを行うのに適したキットを得ることができる、という点である。例えば、キットは、作製される表面コーティングの溶液、標的支持体(例えば、
下塗りしてあるスライドガラス又は下塗りしていないスライドガラス)、アッセイ成分(例えば、標識付けした抗体)、及び他の有用なツール(ピペット、フィルター、チューブなど)を含んでよい。さらに留意しておかねばならないことは、キットは、目的とする特定のアッセイに対して使用するための標的表面コーティングを予備塗被した支持体と一緒にパッケージ化することもできる、という点である。
【0066】
さらに、本発明の表面化学品を医療デバイスのインプラントの分野で利用して、埋め込まれたデバイスへの非特異的結合を抑制するか又は起こさせないようにすることができる。例としては、現行デバイス(例えば、カテーテル、シャント、ポンプ、濾過膜、ステント、弁、膜、及び他のデバイス)の表面へのコーティングが挙げられる。このようなコーティングは通常、生物学的成分、細胞、及び微生物の非特異的吸着を少なくするために使用される。
【0067】
他の有用と思われる実施態様においては、本発明の表面化学品を医療デバイスのインプラントの分野で利用して、活性な機能をもたらすコーティングを得ることができる。例えば、本発明の表面化学品を使用して、制御放出用の薬物を捕捉することができる。他の例においては、本発明の表面化学品を使用して、薬物、治療用タンパク質、又は抗菌性化合物などをデバイスの表面に拘束することができる。
【0068】
本発明を一般的に説明してきたが、下記の実施例を参照すれば本発明の理解がより深まるであろう。これらの実施例は例示のために記載されており、本発明がこれらの実施例によって限定されることはない。
【0069】
(実施例I)
SiO 2 /Si支持体に対する低い非特異的結合(NSB)のビオチン化表面コーティング化学品
本実施例は、処理されたSiO2/Si支持体へのタンパク質のNSBを制限する上での、本発明の実施態様の有用性を説明している。コーティング溶液を調製し、これを使用して、フラットのSiO2/Si支持体上に低NSBのビオチン化表面コーティングを形成させた。本実験では、未処理のSiO2/Si支持体に対する、又は低NSBでビオチン化された、表面塗被したSiO2/Si支持体に対する非特異的結合のレベルを調べた。
【0070】
コーティング溶液の調製: ポリプロピレンのバイアル中にて、26.5μlの(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン(ゲレスト社)を10mlの有機溶媒中に加えることによって、アミノシランの有機溶媒溶液を調製した。ジメチルスルホキシド(DMSO)又はN,N−ジメチルアセトアミド(DMAC)を溶媒として使用することができる(どちらもアルドリッチ社から市販)。次いで、この溶液の1.0mlを40mgの量のビオチン−PEG−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミジル(ビオチン−PEG−NHS、シェアウォーターポリマー社)(PEGは分子量3400のポリエチレングリコールである)に加えた。ビオチン−PEG−NHSのNHS基がアミノシラン上の末端アミンと反応してビオチン−PEG−シラン分子を形成する。ビオチン−PEG−シラン/DMAC溶液を溶液Aと呼ぶ。
【0071】
別のバイアルにおいて、70.6μlの6−アジドスルホニルヘキシル−トリエトキシシランを10mlのDMSOに加えた。この溶液に125μlのマトリックス形成剤(ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、PST、アルドリッチ)を加えて溶液Bを得た。溶液Aと溶液Bとを1:4の体積比で混合(1mlの溶液Aを4mlの溶液Bに加える)して、標的支持体上へのスピンコーティングに使用するための最終的なコーティング溶液混合物を得た。
【0072】
スピンコーティング: 5インチのシリコンウエハー(p型又はn型、片面研磨の試験グレードウエハー)をスピンコーター(ローレル・テクノロジー社)に設置し、5000rpmで回転させた。回転しているウエハー上にコーティング溶液(0.5ml)を施し、ウエハーを90秒回転させた。
【0073】
塗被したシリコンウエハーを、真空ポンプにて30分で150mmHg(絶対)の減圧に下げた減圧オーブン中に30分置いた。オーブンのスイッチを入れ、約140℃に加熱した。熱処理(加熱の傾斜と加熱の保持)の合計は2時間であった。次いで、ウエハーを周囲空気中にて室温に自然冷却した。
【0074】
シリコーン接着剤のボーダー・パターン(border pattern)を表面上にスタンピングすることによって、ウエハー上に直径6mmのサンプルスポットを限定した。ウエハーを、当業界によく知られているようにさいの目に切断し、種々のアッセイにおいて使用した。
【0075】
非特異的タンパク質結合(NSB)アッセイ: 下記のアッセイは、コーティング溶液で処理したウエハー表面上への、可溶性球状血清タンパク質モデルの非特異的結合のレベルを示している。非特異的結合タンパク質のモデルとしては、免疫グロブリンG(IgG)抗体(160kDa)を使用した。具体的には、ウサギの抗ヒツジIgG(KPLラボラトリーズ)のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解して、一連のIgG濃度(0.1〜10μg/mlの範囲)を得た。アッセイしようとするサンプル(“試験片”)を先ず高純度水で3回すすぎ洗いし、N2ガスの流れで吹きつけ乾燥した。20μlの種々の濃度のIgG−PBS溶液をテストスポット上に置き、100%(公称)湿度のチャンバー中にて37℃で30分インキュベートした。種々のIgG試験濃度を下記のように使用した。インキュベーション後、テストスポットを再び高純度水で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。次いで、20μl小滴の市販のテトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質をそれぞれのテストスポットに加えた。各試験片を、100%(公称)湿度のチャンバー中にて37℃で30分インキュベートした。
【0076】
このアッセイにおいては、HRPが不溶性の表面付着膜の形成を触媒し、こうした形成は比色分析によって、あるいは偏光解析法によって検知することができる。したがって、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したIgGの試験片へのNSBのレベルが高くなるほど、表面付着膜のレベルが高くなる。
【0077】
対照標準実験:ベース支持体とBSAブロッキング 上記のコーティング溶液で処理した支持体の他に、2つのNSB対照標準実験も並行して行った:(1)裸のSiO2/Siウエハー支持体;及び(2)ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックしたSiO2/Siウエハー。BSA−ブロッキングは、バイオアッセイ表面上への非特異的なタンパク質結合を阻害するための、現在最も広く使用されている方法である。短時間にて、未処理のシリコンウエハー片を高純度水で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。PBS中に溶解して得た1%BSA溶液の40μl小滴を、6mmの各テストスポット上に置いた。小滴がテストスポット全体を覆い、次いでこれを、37℃の温度及び100%(公称)の相対湿度にて1時間インキュベートした。BSA溶液を高純度水ですすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥し、BSAブロックのSiO2/Si支持体に対して上記のNSBアッセイを行った。
【0078】
図2のデータから、本実施例の塗被又は処理されたSiO2/Si支持体が、いずれの試験濃度においても検出可能なIgG非特異的結合を殆どもしくは全く示さなかったことがわかる(ぬりつぶした棒線)。これとは対照的に、BSAブロックのウエハーは、はるかに高いレベルのIgG NSBを示した(ぬりつぶしていない棒線)。留意しておかなければならないことは、BSAブロック表面のデータには大きな誤差棒線が示されており、このことはブロッキング法の場合には、一般にIgG NSBにばらつきが生じることを示している。裸のSiO2/Siウエハーの場合にはNSBがかなり高く、1μg/mlと10μg/mlのIgGタンパク質の負荷に対してはオフスケール(off−scale)を増した(データは図示せず)。
【0079】
このデータから、SiO2/Si支持体へのタンパク質のNSBを抑制するか又は起こさせないようにするのに本発明のビオチン機能性表面が効果的である、という結論が支持される。これとは対照的に、裸のSiO2/Si支持体とBSAブロックのSiO2/Si支持体(より程度は小さい)は、より高いレベルの非特異的タンパク質結合を示し、この点からも、本発明の機能性表面が効果的であることがわかった。
【0080】
(実施例II)
SiO 2 /Si支持体に対する、低い非特異的結合(NSB)でチオール反応性の表面コーティング化学品
本実施例は、処理されたSiO2/Si支持体へのタンパク質のNSBを制限する上で、本発明の他の実施態様が有用であることを示す。コーティング溶液を調製し、これを使用して、SiO2/Si支持体上に低NSBでチオール反応性の表面コーティングを形成させた。未処理のSiO2/Si支持体への、又は低NSBでチオール反応性の表面塗被したSiO2/Si支持体への非特異的結合のレベルを調べるために実験を行った。
【0081】
コーティング溶液の調製: 実質的に実施例Iに記載のようにコーティング溶液を調製した。但し、ビオチン−PEG−NHSをビニルスルホン−PEG−NHS(シェアウォーター)で置き換えた。スピンコーティングも、実質的に実施例Iに記載のように行った。
【0082】
スピンコーティングしたウエハーを、真空ポンプにて30分で150mmHg(絶対)の減圧にした真空オーブン中に置いた。オーブンのスイッチをいれ、約70℃に加熱した。熱処理(加熱の傾斜と加熱の保持)の合計時間は4時間であった。次いで、ウエハーを周囲空気中にて室温に冷却した。
【0083】
シリコーン接着剤のボーダー・パターンを表面上にスタンピングすることによって、ウエハー上に直径6mmのサンプルスポットを限定した。ウエハーをさいの目に切断し、種々のアッセイにおいて使用した。
【0084】
非特異的タンパク質結合(NSB)アッセイ: 可溶性のTMB−マイクロウェルアッセイを使用して非特異的タンパク質結合を評価した。簡単に言えば、実施例1に記載のように、各試験片を高純度水ですすぎ洗いし、乾燥し、ウサギの抗ヒツジIgGのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体の溶液を使用してインキュベートした。留意しておかなければならないことは、本実施例のPBS溶液が0.1%のツイーン20界面活性剤を含んでいたという点である。タンパク質のインキュベーションとすすぎ洗いの後、市販のテトラメチルベンジジン(TMB)の可溶性ペルオキシダーゼ基質溶液の20μl小滴を、それぞれのテストスポットに加えた。37℃の温度と100%(公称)の相対湿度で30分インキュベーションした後、それぞれのTMB小滴に20μlの停止液を加えた。この停止液により、酵素反応が停止し、小滴の色の変化が固定される。マイクロピペットを使用して小滴を合わせ、80μlのサンプルを試験片からマイクロタイタープレートに移した。450nmでの光学濃度をモニターするプレートリーダーを使用して、ペルオキシダーゼ反応(この反応は、各試験片に非特異的に結合したIgG−HRPの量に直接関係している)の程度を定量化した。
【0085】
対照標準実験:裸の支持体とBSAブロッキング 上記のコーティング溶液で処理した支持体の他に、2つのNSB対照標準実験も並行して行った:(1)裸のSiO2/Siウエハー支持体;及び(2)ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックしたSiO2/Siウエハー。実施例1に記載のように、BSA−ブロッキングは、バイオアッセイ表面上への非特異的なタンパク質結合を阻害するための、現在最も広く使用されている方法である。BSAブロッキングのプロトコルは、実施例Iに記載のものと実質的に同じである。試験片を高純度水で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。PBS中に溶解して得た1%BSA溶液の40μl小滴を、6mmの各テストスポット上に置いた。小滴がテストスポット全体を覆い、次いでこれを室温及び100%(公称)の相対湿度にて1時間インキュベートした。BSA溶液を高純度水ですすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。
【0086】
NSBの結果 図3のデータから、本実施例の塗被又は処理されたSiO2/Si支持体が、試験したIgG濃度のいずれにおいても検出可能なIgG結合を殆どもしくは全く示さなかったことがわかる(ぬりつぶした棒線)。これとは対照的に、BSAブロックのウエハーは、はるかに高いレベルのIgG NSBを示した(斜線入り棒線)。留意しておかなければならないことは、BSAブロック表面のデータには大きな誤差棒線が示されており、このことはブロッキング法の場合には、一般にIgG NSBにばらつきが生じることを示している。裸のSiO2/Siウエハーの場合にはNSBがかなり高く(ぬりつぶしていない棒線)、1μg/mlと10μg/mlのIgGタンパク質の負荷に対してはオフスケールを増した(データは図示せず)。
【0087】
このデータから、SiO2/Si支持体へのタンパク質のNSBを抑制するか又は起こさせないようにするのに本発明のチオール反応性の機能性表面が効果的である、という結論が支持される。これとは対照的に、裸のSiO2/Si支持体とBSAブロックのSiO2/Si支持体(より程度は小さい)は、より高いレベルの非特異的タンパク質結合を示し、この点からも、本発明の機能性表面が効果的であることがわかった。
【0088】
(実施例III)
プラスチック(ポリマー)支持体に対する、低い非特異的結合(NSB)のビオチン化 表面コーティング化学品
本実施例は、プラスチック(ポリマー)支持体へのタンパク質のNSBを制限する上で、本発明の他の実施態様が有用であることを示す。コーティング溶液を調製し、これを使用して、プラスチック支持体(例えば、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルイミド、及びポリエーテルスルホン)上に低NSBでビオチン化された表面コーティングを形成させた。未処理のプラスチック支持体への、又は低NSBでビオチン化・表面塗被したプラスチック支持体への非特異的結合のレベルを調べるために実験を行った。
【0089】
ポリスチレン(PS) ポリスチレン支持体は、厚さが約2mmで3インチの親水性ディスクで構成された。細菌学的グレードのポリスチレンペトリ皿(VWR)からディスクを切断した。コーティング溶液の調製は、実施例Iに記載の手順と同じであった。ポリスチレンペトリ皿にコーティング溶液を塗被する前に、疎水性のポリスチレン表面に酸化工程を施した。ディスクを濃硫酸(95%H2SO4、マリンクロット)中に2分浸漬することによって、表面の酸化を行った。ディスクを高純度水で充分にすすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。ディスクをスピンコーターに据え付け、5000rpmで回転させた。回転しているディスク上にコーティング溶液(0.5ml)を分与し、90秒間回転させた。この時点でさらに0.5mlのコーティング溶液を分与し、90秒間回転させた。このようにして、PS表面に対し、回転プロセス中にコーティング溶液を2回塗被した。
【0090】
塗被したPSディスクを、150mmHg(絶対)に排気した真空オーブン中に室温にて30分置いた。ポンプで30分引いた後、オーブンのスイッチを入れ、減圧下にてサンプルを90℃に加熱した。熱処理の合計時間(加熱の傾斜と加熱の保持)は4時間であった。次いで各サンプルを、周囲雰囲気にて室温に自然冷却した。冷却後、シリコーン接着剤のボーダー・パターンをスタンピングすることによって、表面上に6mmのサンプルスポットを限定した。
【0091】
ポリスルホン(PSU)、ポリエーテルイミド(PEI)、及びポリエーテルスルホン(PES) これらの支持体は、0.02インチ厚さの市販のフィルム素材から切断した2インチの正方形クーポンから構成された。これらのクーポンを、非イオン性洗剤(トリトンX−100)の浴中で15分超音波処理することによって清浄化した。高純度水で充分すすぎ洗いした後、クーポンをエタノール/水(50/50)溶液中でさらに15分超音波処理し、水ですすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。
【0092】
コーティング溶液の調製は、実施例Iに記載の手順と実質的に同じであった。クーポンをスピンコーターに据え付け、5000rpmで回転させた。0.3mlのコーティング溶液を分与し、90秒回転させた。真空ポンプにより30分で150mmHg(絶対)の減圧にした真空オーブン中にクーポンを配置した。次いでオーブンのスイッチを入れ、約140℃に加熱した。熱処理の合計時間(加熱の傾斜と加熱の保持)は2時間であった。クーポンを周囲空気にて室温に冷却した。表面上にシリコーン接着剤をスタンピングすることによって、ウエハー上に直径6mmのサンプルスポットを限定した。
【0093】
非特異的結合(NSB)アッセイ 可溶性のTMB−マイクロウェルアッセイを使用して、非特異的タンパク質結合を評価した。最初に、塗被したPS表面、PSU表面、PEI表面、又はPES表面をすすぎ洗いし、ウサギの抗ヒツジIgGのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体(実施例Iに記載)と共にインキュベートした(但し、リン酸緩衝生理食塩水も0.1%のツイーン20界面活性剤を含有した)。タンパク質のインキュベーションとすすぎ洗いの後、市販のテトラメチルベンジジン(TMB)の可溶性ペルオキシダーゼ基質溶液の20μl小滴を、それぞれのテストスポットに加えた。37℃の温度と100%(公称)の相対湿度で30分インキュベーションした後、それぞれのTMB小滴に20μlの停止液を加えた。この停止液により、酵素反応が停止し、小滴の色の変化が固定される。マイクロピペットを使用して小滴を合わせ、80μlのサンプルを試験片からマイクロタイタープレートに移した。450nmでの光学濃度をモニターするプレートリーダーを使用して、ペルオキシダーゼ反応(この反応は、各試験片に非特異的に結合したIgG−HRPの量に直接関係している)の程度を定量化した。
【0094】
NSBの結果 図4は、代表的な非特異的タンパク質(IgG)結合の結果を示している。これらのデータは、従来のウシ血清アルブミン(BSA)によるブロッキング(ぬりつぶしていない棒線)に対する我々の表面コーティング(ぬりつぶした棒線)の性能を比較している。これらのデータは、それぞれのプラスチック支持体に対する10μg/mlでのインキュベーションに対応しており、これらの広く使用されているプラスチック支持体に対し、NSBを阻害する上ではBSAブロッキングよりも我々の表面コーティングのほうがより効果的であることを示している。
【0095】
(実施例IV)
金属/金属酸化物支持体に対する、低い非特異的結合(NSB)のビオチン化表面コーティング化学品
本実施例は、金属/金属酸化物支持体へのタンパク質のNSBを制限する上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。コーティング溶液を調製し、これを使用して、金属/金属酸化物支持体上に低NSBでビオチン化された表面コーティングを形成させた。BSAブロックされた金属/金属酸化物支持体への、又は低NSBでビオチン化・表面塗被した金属/金属酸化物支持体への非特異的結合のレベルを調べるために実験を行った。
【0096】
金属支持体は、5インチのシリコンウエハー上に蒸着させた30nmの金フィルムで構成された。金と酸化ケイ素との間に、約5nmのクロムの密着中間層を使用した。コーティング溶液の調製は、実施例Iに記載の手順と同じであった。金で被覆されたウエハーをスピンコーター中に据え付け、5000rpmで回転させた。0.5mlのコーティング溶液をウエハー上に分与し、90秒回転させた。0.5mlのコーティング溶液をウエハー上にもう一度分与し、さらに90秒回転させた。したがって、金属/金属酸化物支持体表面に対し、回転プロセス中にコーティング溶液を2回塗被した。
【0097】
塗被したウエハーを、ポンプで150mmHg(絶対)の減圧にした真空オーブン中に30分置いた。オーブンのスイッチを入れ、約140℃に加熱した。熱処理の合計時間(加熱の傾斜と加熱の保持)は2時間であった。次いでウエハーを、周囲雰囲気にて室温に自然冷却した。シリコーン接着剤のボーダー・パターンを表面上にスタンピングすることによって、ウエハー上に直径6mmのサンプルスポットを限定した。実施例IIに記載の可溶性TMB比色分析法を使用して、タンパク質の非特異的結合を評価した。
【0098】
NSBの結果 図5は、代表的な非特異的タンパク質(IgG)結合の結果を示している。これらのデータは、従来のウシ血清アルブミン(BSA)によるブロッキングに対する我々の表面コーティングの性能を比較している。これらのデータは、10μg/mlのIgGタンパク質溶液の負荷においては、塗被した表面(ぬりつぶした棒線)のほうが従来のBSAブロッキング法(ぬりつぶしていない棒線)より優れている、ということを示している。より低いタンパク質濃度においては、どちらの表面もNSBを阻害するのに効果的である。
【0099】
このデータから、本発明のビオチン化された反応性機能性表面は、金属/金属酸化物支持体へのタンパク質のNSBを制限するか又は起こさせないようにするのに効果的である、という結論が支持される。これとは対照的に、BSAでブロックした金属/金属酸化物支持体は、10μg/ml以上の濃度においては、より高いレベルの非特異的タンパク質結合を示しており、このことからも本発明が有用であることがわかる。
【0100】
(実施例V)
顕微鏡用スライドガラスに対する、低い非特異的結合(NSB)のチオール反応性表面コーティング化学品
本実施例は、顕微鏡用スライドガラスへのタンパク質のNSBを制限する上で本発明の実施例が有用であることを示す。コーティング溶液を調製し、これを使用して、スライドガラス支持体上に低NSBでチオール反応性の表面コーティングを形成させた。
裸のスライドガラス、BSAでブロックしたスライドガラス、又は低NSBでチオール反応性の表面コーティングを施したスライドガラスへの非特異的結合のレベルを調べるために実験を行った。
【0101】
本実施態様において使用した支持体(スライドガラス)は、供給メーカー〔テレケム・スーパークリーン(TeleChem SuperClean)(商標)〕から入手した研磨済みの25×75mm顕微鏡用スライドガラスであり、受け入れたままの状態で使用した。しかしながら、留意しておかなければならないことは、普通のソーダ石灰スライドガラスを含めて、幾つかの顕微鏡用スライドガラス支持体も適切に使用できた、という点である。
【0102】
コーティングの前に、下記のプロトコルに従ってスライドガラスを清浄化した。先ず、スライドガラスを高純度(18MΩ−cm)水ですすぎ洗いした。スライドガラスをガラス・ステイニング・ラック(a glass staining rack)中に入れ、60℃の1%アルコノックス(Alconox)溶液(アルカリ性のガラスクリーナー)中に浸漬し、15分超音波処理した。次いでスライドガラスを多量の高純度水ですすぎ洗いし、高純度水中でさらに15分超音波処理した。次いでスライドガラスを新鮮な超純水中に浸漬した。最後に、スライドガラスをN2ガスで吹きつけ乾燥した。清浄化から2時間以内に、スライドガラスに塗被を行った。
【0103】
予備下塗りしたスライドガラスに対する塗被も適切に行われた。下塗りは、蒸着させたSiO2層とスピンオンガラス配合物〔例えば、セラミック(Seramic)(商標)(ゲレスト)〕を含む。
【0104】
コーティング溶液を実施例IIに記載のように調製した。スピンコーティングは次のように行った:スピンコーターの真空チャック上にスライドガラスを据え付け、静止状態のスライドガラス上に0.5mlのコーティング溶液を分与し、スピナーのスイッチを入れ、3500rpmに加速して90秒回転させた。
【0105】
減圧プロセスと熱硬化プロセスは、実施例IIに記載の手順と同じであった。NSBアッセイ実験と対照標準実験を、以下のような点を変えて、実施例IVに記載のように行った。TMBペルオキシダーゼ基質のインキュベーションを5分行った後、テストスポットに20μlのTMB停止液を加えて比色反応を停止させた。96ウェルプレートホルダー上に据え付けたスライドガラスについて光学濃度を直接読み取った(マイクロタイタープレートへの液の移動は認められなかった)。
【0106】
結合結果: 得られた結果を図6に示す。これらの結果から、塗被したガラス表面(ぬりつぶした棒線)が、BSAでブロックした支持体(斜線入り棒線)及び裸のガラス支持体(ぬりつぶしていない棒線)よりかなり低い非特異的タンパク質結合を示していることがわかる。
【0107】
このデータは、本発明のチオール反応性の機能性表面が、スライドガラス支持体へのタンパク質のNSBを制限するか又は起こさせないようにする上で効果的である、という結論を支持する。これとは対照的に、裸のスライドガラスとBSAでブロックしたスライドガラスはより高いレベルの非特異的タンパク質結合を示しており、したがって本発明の機能性表面が効果的であることがわかる。
【0108】
(実施例VI)
塗被した表面へのフィブリノゲンの低い非特異的結合(NSB)
本実施例は、本発明の塗被表面へのフィブリノゲンのNSBを制限する上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。コーティング溶液を調製し、これを使用して、SiO2/Si支持体上に低NSBでチオール反応性の表面コーティングを形成させた。裸の支持体、BSAでブロックした支持体、又は低NSBでチオール反応性の表面塗被支持体への、フィブリノゲンの非特異的結合のレベルを調べるために実験を行った。
【0109】
塗被表面は実施例IIに記載のように調製した。
フィブリノゲンの非特異的タンパク質結合アッセイ 非特異的なフィブリノゲン結合を、可溶性のTMB−マイクロウェルアッセイを使用して次のように評価した:試験片をすすぎ洗いし、ヒトフィブリノゲン〔Sigma(シグマ)〕のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中への連続的希釈物を含んだ試験ウェルを30分インキュベートした。タンパク質をインキュベーションした後、支持体をPBST(0.01%のツイーン20を含んだPBS)で3回、及び清浄水で1回すすぎ洗いし、次いで吹きつけ乾燥した。ペルオキシダーゼで標識付けした抗ヒトフィブリノゲン〔アブカム(Abcam)〕をPBST中に1:8000の比で希釈し、得られた希釈物の20μl小滴を含んだ各試験ウェルを30分インキュベートした。スライドガラスを前述のようにすすぎ洗いし、市販のテトラメチルベンジジン(TMB)可溶性ペルオキシダーゼ基質溶液の20μl小滴を塗被した。TMBアッセイと光学濃度の測定を、実施例IVに記載のように行った。
【0110】
対照標準実験:裸の支持体とBSAブロッキング 塗被した支持体のほかに、2つのNSB対照標準実験を、実施例IIの場合と実質的に同様の手順で並行して行った。
NSBの結果 非特異的結合の結果を図7に示す。塗被した表面(ぬりつぶした棒線)は、裸の表面(ぬりつぶしていない棒線)及びBSAでブロックした表面(斜線入り棒線)と比較して極めて低い非特異的フィブリノゲン結合を示している。
【0111】
このデータから、本発明のチオール反応性の機能性表面が、標的支持体へのフィブリノゲンのNSBを制限するか又は起こさせないようにする上で効果的である、という結論が支持される。これとは対照的に、処理していない支持体及びBSAでブロックした支持体は、より高いレベルの非特異的フィブリノゲン結合を示しており、特に、血清タンパク質としてフィブリノゲンが比較的豊富に存在していることを考慮すると、本発明が有用であることがわかる。
【0112】
(実施例VII)
塗被した表面に対する選択的タンパク質結合と非特異的タンパク質結合の実証
本実施例は、ビオチン化コーティング上への選択的タンパク質(ストレプタビジン)結合と非特異的タンパク質結合との状況を実証する上で本発明の実施態様が有用であることを示す。本実験での試験片はフィルムコートしたシリコンウエハーであり、このときビオチン化コーティングは実施例Iに記載のように作製した。対照標準の試験片も、前述のように作製した。但し対照標準表面は、ビオチンの代わりにメトキシキャップの非反応性PEG分子を使用して作製した。具体的には、これらのコーティングは、実施例Iにおけるビオチン−PEG−NHS分子をメトキシ−PEG−スクシンイミジルプロピオネートで置き換えることによって作製した。その他の点では、プロセス工程は全て実施例Iの場合と同じであった。
【0113】
実施例IIに記載のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−ストレプタビジン接合体〔SA−HRP、ピアース(Pierce)〕と可溶性TMB−マイクロウェルアッセイを使用して、これらの表面へのストレプタビジン結合を評価した。0.01%のツイーン20界面活性剤を含んだリン酸緩衝生理食塩水中に加えて、種々の濃度のSA−HRPを調製した。20μl小滴のSA−HRP溶液をテストスポット上に置き、これを37℃の温度及び100%(公称)の相対湿度で30分インキュベートした。次いでテストスポットを高純度水ですすぎ洗いした。実施例IIに記載の可溶性TMB−マイクロウェルアッセイを使用して結合を評価した。
【0114】
結合の結果: 図8は代表的な結果を示している。これらの結果は、ビオチン化機能性表面(ぬりつぶしていない棒線)が、メトキシ−PEG対照標準表面(“不活性”表面)(ぬりつぶした棒線)と比較してストレプタビジンをはるかに多く結びつける、ということを示している。前述の特異的タンパク質結合アッセイの結果を考慮して(実施例Iを参照)、SAがビオチン化コーティングと特異的に結合している、と我々は結論を下している。10μg/mlのSA負荷量に対してメトキシキャップのPEGサンプル上に観察される小さなシグナルは、少量の非特異的ストレプタビジン結合の結果によるものと思われる。
【0115】
このデータから、本発明の機能性表面が、塗被した支持体上への選択的な結合部位もたらすのに効果的であり、一方、本発明の不活性機能性表面が、塗被した表面上への非特異的結合を制限するのに効果的である、という結論が支持される。
【0116】
(実施例VIII)
ストレプタビジン−ビオチン塗被表面へのビオチン化分子結合の実証
本実施例は、ストレプタビジン−ビオチン表面の作製と、それに引き続いたこの表面へのビオチン化分子の選択的結合を実証する上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。
【0117】
コーティング溶液の調製 ポリプロピレン製のバイアル中にて、26.5μlの(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン(ゲレスト)を10mlのN,N−ジメチルアセトアミド(DMAC)に加えることによって、第1のアミノシラン溶液を調製した。次いでこの溶液1.0mlを40mgのビオチン−PEG−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ビオチン−PEG−NHS、シェアウォーター社)に加えた。このときPEGは分子量3400のポリエチレングリコールである。NHS基がアミノシラン上の末端アミンと反応してビオチン−PEG−シラン分子を形成する。このビオチン−PEG−シラン/DMAC溶液を溶液Aと呼ぶ。別のバイアルにおいて、70.6μlの6−アジドスルホニルヘキシル−トリエトキシシランを10mlのDMSOに加えた。次いでこの溶液に、125μlのマトリックス形成剤(ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、PST、アルドリッチ)を加えた。こうして得られた溶液を溶液Bと呼ぶ。溶液Aと溶液Bとを1:4の体積比(1mlの溶液Aを4mlの溶液Bに加える)で混合して、ビオチン−PEG−溶液と呼ぶ最終混合物を得た。
【0118】
ポリプロピレン製のバイアル中にて、48.4μlの(3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン(ゲレスト)を10mlのN,N−ジメチルアセトアミド(DMAC)に加えることによって、第2のアミノシラン溶液を調製した。次いでこの溶液1.0mlを40mgのメトキシ−PEG−スクシンイミジルプロピオネート(mPEG−SPA、シェアウォーター社)に加えた。このときPEGは分子量2000のポリエチレングリコールである。NHS基がアミノシラン上の末端アミンと反応してメトキシ−PEG−シラン分子を形成する。このメトキシ−PEG−シラン/DMAC溶液を溶液Cと呼ぶ。溶液Cと溶液B(上記)とを1:4の体積比(1mlの溶液Aを4mlの溶液Bに加える)で混合して、メトキシ−PEG−溶液と呼ぶ最終混合物を得た。
【0119】
次いで、ビオチン−PEG−溶液とメトキシ−PEG溶液を1:4の体積比で混合した。この最終混合物を使用してシリコン支持体を塗被した。
スピンコーティング スピンコーティングと熱硬化を実施例Iに記載のように行った。シリコーン接着剤のボーダーパターンを表面上にスタンピングすることによって、直径6mmのサンプルスポットをウエハー上に限定した。次いでウエハーをさいの目に切断し、種々のアッセイに対して使用した。
【0120】
ストレプタビジン層の形成 ストレプタビジン〔プロザイム社(Prozyme, Inc.)〕をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に希釈して100μg/mlの濃度にした。次いで40μlの小滴をサンプルスポット中に置き、室温で1時間インキュベートした。ウエハー上の幾つかのスポットを、PBSだけを使用してインキュベートした。これらは“ストレプタビジンなし”の対照標準スポットである。インキュベーション後、ウエハーをPBS−ツイーン20(PBST)で3回と超純水で1回すすぎ洗いし、次いで吹きつけ乾燥した。このプロセスの結果、ストレプタビジンがコーティングマトリックス内に固定された。
【0121】
特異的結合アッセイと非特異的結合アッセイ ビオチン化したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ビオチン−HRP、ピアース)をPBST中に希釈して10μg/mlの濃度にした。次いで20μl小滴をテストスポットに置き、室温で30分インキュベートした。ペルオキシダーゼで標識付けしたウサギの抗ヒツジIgG(IgG−HRP)を非ビオチン化対照標準分子として使用した。IgG−HRPをPBS(ツイーン20なし)中に希釈して10μg/mlの濃度にし、20μl小滴をテストスポット上に置いて室温で30分インキュベートした。
【0122】
得られた結果を図9に示す。ストレプタビジン−ビオチン表面は、非ビオチン化IgG−HRP(ぬりつぶしていない棒線)に対してより、ビオチン−HRP(ぬりつぶした棒線)に対してかなり高いシグナルを示している。ストレプタビジン表面と比較して、ストレプタビジンなしの対照標準に対しては、ビオチン−HRPもIgG−HRPもそれほどの結合を示していない。ストレプタビジンなしの表面に関して、IgG−HRPに対するシグナルのほうが幾分高いのは、異なったインキュベーション緩衝液によるものと考えられる。緩衝液中にツイーン20が存在しない場合、IgG−HRPは、幾分かはより高い非特異的結合を示す。
【0123】
このデータから、ビオチン化分子が本発明のストレプタビジン−ビオチン表面に特異的に結合し、これとは逆に、非特異的結合性のタンパク質が、これらの同じ塗被表面には限定された結合を示す、という結論が支持される。本実施例も、本発明の有用性を強く示している。
【0124】
(実施例IX)
ポリマー支持体上のチオール反応性コーティングへのチオール化タンパク質結合の実証
本実施例は、チオール化タンパク質を、チオール反応性コーティング化学品に従ってプラスチック支持体上に選択的に結びつける上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。プラスチック支持体上への、不活性対照標準表面化学品に対するチオール化タンパク質の結合について、結果が比較されている。
【0125】
コーティング溶液の調製 コーティング溶液は実施例Iに記載のように調製した。但し、ビオチン−PEG−NHSをビニルスルホン−PEG−NHS(シェアウォーター)で置き換えた。組織培養用ポリスチレン(TCPS)上へのスピンコーティングを実施例IIIに記載のように行った。
【0126】
塗被したウエハーを真空オーブン中に置き、引き続き30分にわたって150mmHg(絶対)の減圧になるまでポンプで引いた。次いでオーブンのスイッチを入れ、約70℃に加熱した。熱処理の合計時間(加熱の傾斜と加熱の保持)は4時間であった。支持体を周囲空気中にて室温に自然冷却した。シリコーン接着剤のボーダー・パターンを表面上にスタンピングすることによって、直径6mmのサンプルスポットを表面上に限定した。
【0127】
不活性コーティングの調製 不活性の対照標準表面を実施例IIに記載の手順と全く同じ手順で調製した。
特異的結合アッセイは室温にて次のように行った:先ず表面を超純水(18MΩ−cm)で3回すすぎ洗いし、次いでN2ガスで吹きつけ乾燥した。チオール化ストレプタビジンをホウ酸塩緩衝溶液(50mMのホウ酸塩、1mMのEDTA、pH9.0、0.01%のツイーン20)中に混合して得た混合物の20μl小滴を置いた各テストスポットをインキュベートした。インキュベーションは室温にて30分であった、いかなるブロッキング工程も使用していないという点に留意しておかねばならない。インキュベーション後、表面をPBST(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2、0.01%のツイーン20)で3回すすぎ洗いし、吹きつけ乾燥した。ビオチン化ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ピアース)の1:100希釈物を置いたテストスポットを30分インキュベートし、PBSTですすぎ洗いし、次いで吹きつけ乾燥した。次いでTMB基質の20μl小滴を置いたテストスポットをインキュベートした。酵素触媒作用による比色TMB反応を5分進行させ、この時点で、20μl小滴の停止液を施すことによって反応を停止させた。標準的なプレートリーダーを使用して、450nmでの光学濃度を読み取った。
【0128】
結合の結果: 塗被した組織培養用ポリスチレン支持体に対する特異的結合の結果を図10に示す(留意しておかなければならないのは、それぞれの濃度について実験を3回行い、誤差バーはこのセットにおける1つの標準偏差を示している、という点である)。チオール反応性コーティングへのチオール化ストレプタビジンの結合が実証されている(ぬりつぶしていない棒線)。チオール反応性コーティングの目盛に関して見ると、チオール化ストレプタビジン濃度の増大と共に結合量が増えている。不活性表面に及ぼすペルオキシダーゼの活性はごくわずかである。不活性表面上への非特異的結合があまり起こらないということは、チオール反応性コーティングへのストレプタビジンの結びつきが共有結合によるものであるということの確実な証拠となる。
【0129】
(実施例X)
顕微鏡用スライドガラス上のアミン反応性コーティングに対するタンパク質結合の実証
本実施例は、アミン含有タンパク質を、アミン反応性コーティング化学品に従って顕微鏡用スライドガラス上に選択的に結びつける上で、本発明の実施態様が有用であることを示す(不活性化された対照標準表面と比較している)。
【0130】
コーティング溶液の調製 コーティング溶液は実施例Iに記載のように調製した。但し、ビオチン−PEG−NHSを80mgのSPA−PEG−SPA(シェアウォーター)で置き換えた(SPAは、アミン基に対して反応性を示す、プロピオン酸のスクシンイミジル誘導体である)。25×75mmの顕微鏡用スライドガラスフォーマットのガラス支持体を高周波スパッタリングによる約400オングストロームの酸化ケイ素層で被覆し、次いで以下のようなプロトコルに従って清浄化した。先ずスライドガラスを高純度水(18MW−cm)ですすぎ洗いして、大体の不純物を除去した。スライドガラスをガラス・ステイニング・ラック中に入れ、60℃の脱気した1%アルコノックス溶液(アルカリ性のガラスクリーナー)中に浸漬し、15分超音波処理した。次いでスライドガラスを多量の高純度水ですすぎ洗いし、60℃の高純度水中でさらに15分超音波処理した。次いでスライドガラスを多量の高純度水ですすぎ洗いし、乾燥工程にかけるまで新鮮な超純水中に浸漬した。スライドガラスを圧縮N2ガスで充分に吹きつけ乾燥し、使用するまで乾燥状態のまま保存した。清浄化し、予備処理したスライドガラスをスピンコーター中に据え付け、3500rpmで回転させた。予備処理したスライドガラス上に0.5mlのコーティング溶液を分与し、90秒回転させた。
【0131】
塗被した25×75mmのスライドガラスを真空オーブン中に入れ、引き続き真空ポンプで150mmHg(絶対)の圧力になるまで30分減圧した。オーブンのスイッチを入れ、約70℃に加熱した。熱処理の合計時間(加熱の傾斜と加熱の保持)は1時間であった。次いで支持体を周囲空気中にて室温に自然冷却した。表面上にシリコーン接着剤のボーダー・パターンをスタンピングすることによって、直径6mmのサンプルスポットを限定した。
【0132】
特異的結合アッセイ: 特異的結合アッセイを室温にて以下のように行った。先ず表面を超純水(18MΩ−cm)で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。50mMのホウ酸塩緩衝液中50mMエタノールアミン溶液(pH9.0)を使用して、1時間にわたってアミン反応性コーティングを化学的に不活性化させることによって不活性の対照標準表面を作製した。次いで、50mMのホウ酸塩緩衝液中ストレプタビジン溶液(pH7.0)の20μl小滴を置いた各テストスポットをインキュベートした。インキュベーションは室温で60分行った。いかなるブロッキング工程も使用しなかった。インキュベーション後、表面をPBST(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2、0.01%のツイーン20)で3回すすぎ洗いし、吹きつけ乾燥した。ビオチン化ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ピアース)の1:100希釈物を置いたテストスポットを30分インキュベートし、PBST(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2)ですすぎ洗いし、吹きつけ乾燥した。次いでTMB基質の20μl小滴を置いたテストスポットをインキュベートした。酵素触媒作用による比色TMB反応を5分進行させ、この時点で、20μl小滴の停止液を施すことによって反応を停止させた。標準的なプレートリーダーを使用して、450nmでの光学濃度を読み取った。
【0133】
結合の結果: アミン反応性コーティングに対する特異的結合の結果を表11に示す。アミン反応性コーティングへのストレプタビジンの固定化が示されている(ぬりつぶしていない棒線)。アミン反応性コーティングの目盛に関して見ると、ストレプタビジン濃度の増大と共に結合量が増えている。不活性化された表面に及ぼすペルオキシダーゼの活性はごくわずかである(ぬりつぶした棒線)。不活性化されたコーティング上への非特異的結合が殆ど起こらないということは、アミン反応性コーティングへのストレプタビジンの結びつきが共有結合によるものであるということの確実な証拠となる。
【0134】
(実施例XI)
ストレプタビジン塗被表面へのビオチン化抗体の選択的結合の実証
本実施例は、本発明の塗被表面へのビオチン化抗体の選択的結合を実証する上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。
【0135】
表面の作製 アミン反応性の表面化学品を含んだ顕微鏡用スライドガラスを実施例Xに記載のように調製した。表面上にシリコーン接着剤のボーダー・パターンをスタンピングすることによって、直径6mmのサンプルスポットをウエハー上に限定した。下記の手順を使用して、表面のアミンによりストレプタビジンを共有結合させた。ストレプタビジン(プロザイム社)をリン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH7.0)中に希釈して100μg/mlの濃度にした。本溶液の40μl小滴を、サンプルスポット中にて室温で1時間インキュベートした。スライドガラスをすすぎ洗いし、50mMリン酸塩緩衝液中に50mMのエタノールアミンを混合してなる不活性化溶液(pH7)中に浸漬した。不活性化を1時間進行させ、この時点で溶液からスライドガラスを取り出し、水ですすぎ洗いし、そして乾燥した。
【0136】
アッセイ ビオチン化ヤギ抗体(ヤギ抗マウスIgG、ビオチンで標識付け、ピアース)をポジティブサンプルとして使用した。対照標準は非ビオチン化ヤギ抗体(ヤギ抗ヒトミオグロビン、ICN)であった。どちらの抗体も、0.005%のツイーン20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBST)中に希釈して100μg/mlの濃度にした。各抗体溶液の20μl小滴を、サンプルスポットにて室温で30分インキュベートした。PBSTだけ(抗体なし)を置いた幾つかの対照標準スポットもインキュベートした。スライドガラスをPBSTで3回と超純水で1回すすぎ洗いし、そして乾燥した。表面に固定化されたヤギ抗体を、免疫化学を使用して評価した。具体的には、ペルオキシダーゼで標識付けした抗ヤギ抗体(ウサギ抗ヤギIgG−HRP、KPL社、PBST中への1:100希釈物)の20μl小滴を、全てのテストスポット上にて室温で30分インキュベートした。スライドガラスを上記のようにすすぎ洗いし、ペルオキシダーゼ基質(TMB、HPL社)の20μl小滴を使用して5分インキュベートし、この時点で、TMB停止液を使用して比色反応を停止させた。小滴を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、プレートリーダー〔オプシス(Opsys)MR、サーモ・ラブシステムズ(Thermo Labsystems)〕を使用して450nmでの光学濃度を測定した。
【0137】
結合の結果: 得られた結果を表12に示す。このデータから、第1の層の捕捉抗体が存在しない場合(捕捉抗体濃度=0)、検出抗体(抗ヤギ、HRP)の非特異的結合は極めて少ない(ぬりつぶしていない棒線)。ヤギ抗体を使用してインキュベートした表面に対する結果は、ビオチン化抗体だけがかなり大きなシグナルを与えることを示している(ぬりつぶした棒線)。これらの結果から、本発明の表面実施態様はビオチン化抗体に対して選択的である、ということがわかる。
【0138】
(実施例XII)
塗被表面に関する改良されたイムノアッセイ性能の実証
下記の実施例は、標準的な診断アッセイに関して、本発明のコーティング化学品のアッセイ性能と検出限界とを比較することによって、本発明の実施態様が有用であることを示す。この比較は、スタフィロコッカル・エンテロトキシンB(SEB)に対するサンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)に基づいている。
【0139】
塗被した支持体に対するSEBサンドイッチアッセイのプロトコル 本アッセイに対する支持体は、低NSBのビオチン化表面コーティングで被覆されたSiO2/Siウエハーで構成された。25mg/ml(ストレプタビジンをPBST中に溶解)の小滴(20μl)を、それぞれ6mmのテストスポットにてインキュベートすることによって、ストレプタビジンを表面に結合させた。インキュベーションは37℃で30分行った。各試験片を高純度水(18MΩ−cm)で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。20μl小滴のビオチン抗SEB(トキシンテクノロジー)を使用してインキュベートすることによって、捕捉抗体を各テストスポットに結合させた。インキュベーションを37℃で30分行い、次いで高純度水で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥した。0.01ng/ml〜1.0ng/mlの濃度範囲のSEB抗原溶液の20μl小滴を使用して、テストスポットをインキュベートした。この場合も、インキュベーションは37℃で30分行った。試験片を高純度水で3回すすぎ洗いし、吹きつけ乾燥した。検出抗体(抗SEB−HRPをPBST中に溶解、20μl小滴、トキシンテクノロジー)を37℃で30分インキュベートし、高純度水で3回すすぎ洗いし、吹きつけ乾燥した。市販のプレシピテートTMBアッセイ(a commercial, precipitate TMB assay)を使用して最終的なインキュベーションを行った。TMB−膜基質(KPL社)の20μl小滴を各テストスポットに加え、37℃で30分インキュベートした。前述したように、HRPは、表面上への不溶性付着物の形成を触媒する。試験片に乾燥N2を吹きつけた後、特注の偏光解析器(表面における抗原の間接的・定量的な測定を可能にする)を使用して付着層の厚さを定量化した。
【0140】
SEBサンドイッチELISAプロトコル 上記の塗被表面に対し、SEBサンドイッチアッセイと比較するために標準的なELISAフォーマットのアッセイを行った。簡単に説明すると、捕捉抗体(ビオチン抗−SEB、トキシンテクノロジー)をPBS−ツイーン(0.01%)中に溶解して得た溶液100μlを96ウェルマイクロタイタープレート〔ダイネックス・テクノロジーズ(Dynex Technologies)、イムロン(Immulon)2HB〕のウェルに加え、37℃で120分インキュベートした。ウェルをPBS溶液で3回すすぎ洗いし、それぞれのすすぎ洗いの後に、プレートを軽くたたいて液を除去した。次いで、PBST中に1%のウシ血清アルブミン(BSA)を溶解して得た溶液200μlをウェルに加え、37℃で1時間インキュベートすることによってウェルをBSAでブロックした。SEB抗原溶液(トキシンテクノロジー、PBST中0.01ng/ml〜1.0ng/mlの範囲の濃度を有する溶液100μl)をマイクロウェルに加え、37℃で60分インキュベートした。ウェルをPBSTですすぎ洗いし、プレートを逆さにして軽くたたいて液を除去した。検出抗体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼが接合した抗−SEB(トキシンテクノロジー)であった。各ウェル中の100ml容量を37℃で60分インキュベートした。再びウェルをPBSTで洗浄した。市販のTMBペルオキシダーゼ基質(TMB−マイクロウェル、KPL社)を加えることによって、ウェル中に色を発生させた。100μl容量の顕色剤をウェルに加え、37℃で60分インキュベートした。60分後、100mlのTMB停止液を各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーを使用して、450nmでの光学濃度を読み取った。
【0141】
結合の結果 代表的なアッセイ結果を図13Aに、そして標準的なマイクロタイタープレートELISAアッセイの結果を図13Bに示す(ELISAアッセイに対する結果は、本発明の機能性塗被表面に対して行ったものである)。観察で得られる重要な点は、本発明の塗被表面(サンドイッチアッセイに対しては、特異的に結合されたストレプタビジンをもたらす)が、従来のサンドイッチELISAと比較して、アッセイの感度において相当程度の向上を可能にする、ということである。具体的には、マイクロタイタープレートELISAアッセイにおけるより低い検出限界は約1.0ng/mlSEBであった。本発明の塗被表面の場合、より低い検出限界は0.1ng/mlSEBであった。
【0142】
(実施例XIII)
オリゴヌクレオチドマイクロアレイフォーマットにおける表面化学品の比較
本実施例は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイフォーマットにおいて使用するための表面化学品として本発明の実施態様が有用であることを示す。本実施例に記載の実験は、本発明の1つのコーティング化学品実施態様を、現在の“最新の”市販ポリマー化学品及びシラン化学品と並行して評価する。特に、アミンで標識付けしたオリゴヌクレオチドを使用するマイクロアレイフォーマットにおける化学品に関して、シグナルレベル、ノイズレベル、及びシグナル対ノイズレベルを比較する。
【0143】
コーティングの調製: 本発明のコーティング化学品は、実施例Xに記載の通りに調製した。現時点における最新の市販のポリマー化学品は、アミン標識のオリゴヌクレオチドに対して高い負荷容量を有する、スライドガラス支持体上への三次元ポリマーコーティングとして宣伝されている。市販のシラン化学品は、スライドガラス支持体上への低バックグラウンドのシランコーティングとして宣伝されている。市販の化学品は、メーカーが指示するプロトコル(これらのタイプの支持体に対して公知であり、一定の方式に従っている)に従って処理した。このような2つのメーカーとしては…がある。
【0144】
マイクロアレイプリンティング: 5’アミン結合及び3’ビオチン標識のオリゴヌクレオチド〔オペロン(Operon)〕を300mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)中に20μMの濃度にて懸濁させた。コーティング化学品を超純水(18MΩ−cm)で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥してからアレイング(arraying)を行った。市販の化学品を箱から出して使用した。SMP3Bピン〔テレケム(Telechem)〕を取り付けたスポット・ボット(SpotBot)マイクロアレイヤー(テレケム)を使用して、市販の化学品上に一連のスポットをプリントした。市販のポリマー化学品とコーティング化学品を75%の相対湿度で5時間インキュベートした。ポリマー化学品、シラン化学品、及びコーティング化学品を、使用する前に室温で72時間乾燥保存した。リン酸塩緩衝液(pH7.0)中50mMエタノールアミンを使用して、コーティング化学品を1時間不活性化した。
【0145】
特異的結合アッセイ: 0.1M Tris(pH9.0)中50mMエタノールアミン及び1%SDS溶液を使用して、市販のポリマー化学品を50℃で20分不活性化した。市販のシラン化学品を80℃で2時間ベークし、次いでウシ血清アルブミンで1時間ブロックした。特異的結合アッセイを室温で次のように行った:PBST(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2、0.01%のツイーン20)中に10μg/mlのCy5標識ストレプタビジン〔アマーシャム(Amersham)〕を溶解して得た溶液を140μl使用して化学品をインキュベートした。40mmのリフター・スリップ(Lifter Slip)〔エリー(Erie)〕を使用して、スライドガラス化学品の表面上に液体を均一に広げた。化学品をハイブリダイゼーション・チャンバー中に30分置いた。スライドガラス化学品からリフター・スリップを取り除き、スライドガラスをPBSTで3回、次いで超純水(18MΩ−vm)ですすぎ洗いし、乾燥した。スライドガラス化学品をジェネピックス(GenePix)4000Bスキャナー〔アクソン(Axon)〕中に配置し、市販のポリマースライドガラス化学品に対して設定を最適にした。最終的なスキャナーのセッティングは、光電子増倍管に対して100%のレーザー出力及び500ボルトの設定であった。
【0146】
結合の結果: 本発明のコーティング化学品と市販化学品に対する特異的結合の結果を図14Aに示す。シグナルの強度が相対蛍光単位にて示されている。図14Aは、本実験においては、本発明のコーティング化学品(ぬりつぶしていない棒線)が、ポリマー化学品(斜線入り棒線)及びシラン化学品(ぬりつぶした棒線)より高いシグナル強度を有する、ということを示している。
【0147】
Cy5チャンネルにおいてバックグラウンドをモニターした。ノイズのレベルが相対蛍光単位にて示されている。スキャンした画像の代表的な斑点なしエリアを使用して、グローバルバックグラウンド値を算出した。Cy5チャンネルのシグナルは、バックグラウンドシグナルに対する非特異的結合の寄与の大きさを示している。図14Bは、本発明のコーティング化学品(ぬりつぶしていない棒線)が、ポリマー化学品(斜線入り棒線)及びシラン化学品(ぬりつぶした棒線)より大幅に低いCy5バックグラウンドを有する、ということを示している。本発明のコーティング化学品は、Cy5ストレプタビジンの表面非特異的結合が少ないのでより低いバックグラウンドシグナルを有する。
【0148】
Cy5チャンネルにおけるシグナル対ノイズ比をスライドガラス化学品に対して算出し、得られたデータが図14Cに示されている。本発明のコーティング化学品(ぬりつぶしていない棒線)は、市販のポリマー化学品(斜線入り棒線)より約3倍大きいシグナル対ノイズ比を、そして市販のシラン化学品(ぬりつぶした棒線)より約6倍大きいシグナル対ノイズ比を示している。
【0149】
(実施例XIV)
タンパク質マイクロアレイにおける抗体−抗体相互作用の実証
本実施例は、本発明の塗被表面上への一連のビオチン化抗体の作製、及び抗体−抗体認識を使用するその後のビオチン化抗体の検出を明示する上で、本発明の実施態様が有用であることを示す。
【0150】
表面の作製 アミン反応性の表面化学品を含んだ顕微鏡用スライドガラスを実施例Xに記載のように調製した。下記の手順を使用して、ストレプタビジンを表面に共有結合させた。先ず、接着性のハイブリダイゼーションチャンバー〔シュライヒャーとシュエル(Schleicher and Schuell)〕をガラス支持体上に配置した。ストレプタビジン(プロザイム社)をリン酸塩緩衝液(50mのリン酸ナトリウム、pH7.0)中に希釈して100μg/mlの濃度にし、約700μlをハイブリダイゼーションチャンバーに加え、反応を1時間にわたって進行させた。チャンバーを取り出し、スライドガラスをすすぎ洗いし、次いで50mMリン酸塩緩衝液(pH7)中に50mMのエタノールアミンを含んだ不活性化溶液中にスライドガラスを浸漬した。不活性化を1時間進行させ、この時点で溶液からスライドガラスを取り出し、水ですすぎ洗いし、乾燥した。
【0151】
マイクロアレイプリンティング: 凍結乾燥したビオチン化ヤギ抗体(ヤギ抗マウスIgG、ビオチンで標識付け、ピアース)を、15mg/mlのウシ血清アルブミンを含んだリン酸緩衝生理食塩水(再構成用緩衝液)中にて1mg/mlの濃度にて再構成した。この原液を、種々の濃度のツイーン20界面活性剤を含んだリン酸緩衝生理食塩水中に希釈して100μg/ml抗体の濃度にした。20μl小滴の抗体溶液を使用して384ウェルのソースプレートを調製し、このときツイーン20の含量が、0、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、及び0.05容量%になるように調製した。コーティング化学品を超純水(18MΩ−cm)で3回すすぎ洗いし、N2ガスで吹きつけ乾燥してからアレイングを行った。SMP3Bピン(テレケム)を取り付けたスポット・ボット・マイクロアレイヤー(テレケム)を使用して、コーティング化学品上に一連のスポットをプリントした。スポットがプリントされたスライドガラスを、75%の相対湿度にて1.5時間インキュベートした。
【0152】
特異的結合アッセイ: 特異的結合アッセイを、室温にて次のように行った:接着性のハイブリダイゼーションチャンバー(前述)を使用し、10μg/mlのCy3標識したウサギ抗ヤギIgG(シグマ)をPBS(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2)中に溶解して得た溶液700μlを使用してコーティング化学品をインキュベートした。スライドガラスを30分インキュベートした。ハイブリダイゼーションチャンバーを取り出し、スライドガラスをPBST(0.1Mのリン酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2、0.05%のツイーン20)で3回、次いで超純水(18MΩ−cm)ですすぎ洗いし、そして乾燥した。スライドガラス化学品をジェネピックス4000Bスキャナー(アクソン)中に配置し、最良のシグナル対ノイズ性能が得られるように設定を最適にした。最終的なスキャナーのセッティングは、光電子増倍管に対して100%のレーザー出力及び460ボルトの設定であった。
【0153】
結合の結果: 代表的なアレイ画像を図15に示す。画像中のスポットは全て、同じ抗体濃度(100μg/ml)を使用してプリントした。各行は緩衝液中のツイーン20の濃度が異なっていて、ツイーン20の濃度は、一番上の行の0%から一番下の行の0.05%まで増大している。各行には5つのスポットがプリントされている。先ず最初に観察されるのは、配列された抗体が蛍光標識の検出抗体によって認識されるということであり、このことはプリントされた抗体が表面に固定されていることを示している。プリント用緩衝液にツイーン20を加えると、プリントされたスポットの大きさと強度が増大する。一番下の行のスポットは約9000相対蛍光単位(RFU)の特異的結合シグナルを有しており、このときローカルバックグラウンドは約1000RFUである。
【0154】
(実施例XV)
塗被された支持体の非特異的結合特性を改良する上での、コーティング成分の相乗効果の実証
本実施例は、本発明において具現化されている成分の組合わせが、これらの成分のサブセットで構成されるコーティングより優れた性能をもたらす、ということを示すように意図されている。
【0155】
“標準処方”のコーティング溶液中の成分は、以下のように略記することができる:
ビオチン−PEG ビオチンPEG−CO2−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(シェアウォーター社)
アミノシラン (3−トリメトキシシリルプロピル)−ジエチレントリアミン(ゲレスト)
アジドシラン 6−アジドスルホニルヘキシル−トリエトキシシラン(ゲレスト)
PST ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート(アルドリッチ)
本実験の場合、コーティング溶液は、標準処方(実施例Iに記載)にて、並びにこれらの成分を種々除いたり、また種々組み合わせたりして調製した。いずれの場合も、キャリヤー溶媒の容量と比(DMAC/DMSO=1/4)を一定に保持した。
【0156】
顕微鏡用スライドガラスを実施例Vに記載のように塗被した。次いで、実施例IIに記載の手順を使用して、表面を非特異的結合に関してアッセイした。
結合の結果: 得られた結果を図16に示す。これらの結果から、標準処方が、他の全ての成分組合わせ物と比較して最も良好なNSB性能をもたらすことがわかる〔但し、“アジドシランなし”処方(この処方は、本アッセイにおいては同等のNSBを示す)を除く〕。それに引き続く実験によれば、“アジドシランなし”処方のほうが、標準処方より保存寿命が劣るということが明らかになっている。具体的に言うと、いったん表面を水によるすすぎ洗いにさらすと、“アジドシランなし”処方の低NSB特性が、標準処方のそれよりはるかに急激に悪化する(日数対週数又は月数)。このことは、アジドシランが、表面コーティングにおいてある程度の架橋/安定化の役割を果たしている、という考え方と矛盾しない。
【0157】
本実施例からのデータは、表面コーティングの全ての成分が存在するときに、本発明の実施態様が最適の性能にて機能する、ということを示している。
(実施例XVI)
コーティング配合物中のさらなるマトリックス形成用成分の明示
本実施例では、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート(PST)と比較した場合の、代替のマトリックス形成用分子を使用した本発明の実施態様が有用であることを明らかにする。ここに記載の実験は本発明の他の実施態様を示しており、これらの実施態様においては、代替のマトリックス形成用分子が良好な非特異的結合・特異的結合性能をもたらしている。
【0158】
コーティング溶液は実施例IIに記載のように調製した。さらに、PSTを市販の界面活性剤(すなわち、トリトンX−100やツイーン20)で置き換えたコーティング溶液も調製した。対照標準として、配合物中のマトリックス形成用成分をグリセロールで置き換えた。グリセロールは同等のマトリックス形成能を示すとは考えられない、という点に留意しておかねばならない。
【0159】
コーティング溶液をシリコンウエハー上にキャストし、実施例IIに記載のように硬化させた。非特異的結合アッセイを実施例IIに記載のように行った。特異的結合アッセイは実施例IXに記載のように行った。
【0160】
結合の結果: 得られた結果を図17に示す。図17Aは、3種の全てのマトリックス形成用成分が、NSB実験においてBSAブロッキングより優れた性能を有することを示している。試験した3種のうち、PSTの性能が最も良く、次いでツイーン20とトリトンX−100である。予想されたように、グリセロールを代替物として使用して調製したコーティングはかなり高いNSBを示した。
【0161】
図17Bは、特異的結合性能が3種の全てのマトリックス形成用成分に対して同等であることを示している。グリセロールも高いシグナルを与えているが、これは、NSB実験によって示されているように、特異的結合よりむしろ非特異的結合の結果によるものと思われる。
【0162】
(実施例XVII)
塗被された表面上における細胞増殖の阻害
本実施例では、本発明の1つの実施態様に関して、培養組織からの哺乳類細胞増殖の阻害について説明する。コーティングは、組織培養用ポリスチレン支持体上に、実施例IIIに記載の手順に従って作製した。
【0163】
細胞培養: 無菌処理法及び市販の細胞培養基と細胞株を使用する通常の細胞培養法を使用した。2種の細胞株を使用した〔L929線維芽細胞であるATCCとヒトの臍静脈内皮細胞であるHUVEC(Bio Whittaker)〕。L929培養のための細胞培養基(3日ごとに変えた)は、抗生物質サプリメントを含んだDMEM塩水中に市販の10%ウシ胎仔血清を混合して得た。対照標準表面は、同一の条件にさらされる細胞を含んだ、塗被されていない無菌の組織培養用ポリスチレンペトリ皿であった。培養された株細胞を市販の培養容器からトリプシン化(trypsinized)し、集密相に達した後に、ペトリ皿1つ当たり105の密度にて培養し、市販の細胞インキュベーター中において5%CO2の雰囲気下にて37℃でインキュベートした。
【0164】
結果: 図18は、3日間の増殖後におけるL929線維芽細胞培養表面の顕微鏡画像を示している。塗被された表面である図18Aは、TCPS対照標準である図18Bと比較して細胞が少ないことがわかる。このことは、これら細胞の培養にとって一般的な付着性細胞単層による被覆が起きていることを示している。塗被表面上に存在している細胞は丸みを帯びていて、ゆるく結合したクラスターの状態になっているようであり、明らかに表面接触を避けていて、集密的細胞単層又は安定した細胞結合を生成させることができない。形状が丸いということは、これら結合依存性の細胞が圧力を受けている状態にあることを示している。対照標準表面は、生存可能な細胞の培養に対して通常観察される、広がった付着性細胞を示している。塗被表面への細胞外マトリックスタンパク質の付着を阻害すれば、線維芽細胞の増殖が抑制される、と考えられる。バクテリアの付着と増殖についても、予備実験にて詳細に調べた。シュウドモナス・アエルギノサ菌株PA01(ATCC、マナッサス、バージニア州)を、トリプシン大豆ブロス(TSB)中にて、通常の微生物学的方法に従って約109CFU/mlの培養密度になるように培養し、TSBを使用しているこの原液から、塗被されたポリスチレンペトリ皿上に種々の希釈度にて接種した。細菌学的グレードのポリスチレン(BD)を対照標準表面として使用した。培養インキュベーター中にて37℃で24時間インキュベーションし、TSBですすぎ洗いした後、位相差顕微鏡法を使用して調べたところ、塗被表面上には付着性の微生物が殆ど観察されなかった。これとは対照的に、対照標準表面には、付着性の生存有機体でコロニーが高密度でつくられ、培養基によるすすぎ洗いでは除去できなかった(データは図示せず)。
【0165】
言うまでもないが、本発明は、これまでに説明してきた目的や利点だけでなく、本発明に固有の目的や利点を達成するように適切に適応させることができる。本発明の開示内容の目的に適うよう、現時点で好ましい実施態様について説明してきたが、本発明の範囲内において種々の変更や改良を行ってよいのはもちろんである。当業者にとって容易に想起しうる他の多くの変更、及び本明細書に開示の本発明の精神に包含され、特許請求の範囲において規定されている他の多くの変更も行ってよい。
【0166】
本明細書中に引用した全ての刊行物を参照により本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【0167】
【図1】本発明の1つの実施態様による機能性表面の概略図である。活性成分、架橋用成分、及びマトリックス形成用成分を含んだ塗被可能な実施態様が、支持体上の一体化されたコーティング内におけるそれらの機能を表わすように概略的に示されている。本発明を構成している成分の概略的表示が上部に、推定されるコーティング構造の断面表示が中央部に、そして推定されるコーティング構造の三次元表示が下部に示されている。
【図2】SiO2/Siウエハー上の本発明の実施態様によるビオチン機能性表面上へのタンパク質の非特異的結合を、BSAでブロックされたSiO2/Siウエハーの場合と比較して示している。
【図3】SiO2/Siウエハー上の本発明の実施態様によるチオール反応性機能性表面上へのタンパク質の非特異的結合を、BSAでブロックされたSiO2/Siウエハー及び裸のSiO2/Siウエハーの場合と比較して示している。
【図4】BSAでブロックされた支持体、及び種々のプラスチック支持体上の本発明の1つの実施態様による機能性表面への、タンパク質の非特異的結合を示している。
【図5】BSAでブロックされた支持体、及び金属支持体(特に金支持体)上の本発明の1つの実施態様による機能性表面への、タンパク質の非特異的結合を示している。
【図6】ガラス支持体上の本発明の1つの実施態様による機能性表面、BSAでブロックされたガラス支持体、及び裸のガラス支持体への、タンパク質の非特異的結合を示している。
【図7】裸のガラス、BSAでブロックされたガラス、及び本発明の1つの実施態様による機能性表面への、フィブリノゲンの非特異的結合を示している。
【図8】本発明の1つの実施態様によるビオチン機能性表面への、ストレプタビジンの特異的結合を示している。
【図9】ガラス支持体上の本発明の1つの実施態様によるストレプタビジン機能性表面への、ビオチン化ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの特異的結合を示している。
【図10】プラスチック支持体上の本発明の1つの実施態様によるチオール反応性機能性表面への、チオール化ストレプタビジンの特異的結合を示している。それぞれの濃度について3回行い、誤差バーは当該セットにおける1つの標準偏差を示している。
【図11】下塗りしたガラス支持体上の本発明の1つの実施態様によるアミン反応性機能性表面への、ストレプタビジンの特異的結合を示している。それぞれの濃度について3回行い、誤差バーは1つの標準偏差を示している。
【図12】ガラス支持体上の本発明の1つの実施態様によるストレプタビジン機能性表面への、ビオチン化抗体の特異的結合を示している。
【図13A】本発明の1つの実施態様による機能性表面に関して、スタフィロコッカル・エンテロトキシンBに対する改良されたアッセイ感度を示している。図13Aは450nmでの光学濃度を示しており、図13Bは膜の厚さを示している、という点に留意のこと。
【図13B】本発明の1つの実施態様による機能性表面に関して、スタフィロコッカル・エンテロトキシンBに対する改良されたアッセイ感度を示している。図13Aは450nmでの光学濃度を示しており、図13Bは膜の厚さを示している、という点に留意のこと。
【図14A】オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの応用に対して本発明の1つの実施態様を使用することを示しており、特に、アミン反応性機能性表面にてオリゴヌクレオチドを使用することを、最新の市販のポリマー化学品およびシラン化学品と比較して示している。図14Aは、3’ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドに結合したCy5ストレプタビジンの蛍光検出を示している。シグナルの強度は、相対蛍光単位にて記載されている。データは3つの代表的な実験から得られており、誤差バーは1つの標準偏差を示している。図14Bは蛍光バックグラウンドの測定値を示しており、ノイズレベルは相対蛍光単位にて記載されている。ある1つのスライドガラスと誤差バーから得られたデータが1つの標準偏差を示している。図14Cは、本発明のコーティング化学品に対するシグナル対ノイズ比(S/N)を、ポリマースライドガラス化学品及びシランスライドガラス化学品の場合と比較して示している。データポイントに従って1つのスライドガラスを示した。
【図14B】オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの応用に対して本発明の1つの実施態様を使用することを示しており、特に、アミン反応性機能性表面にてオリゴヌクレオチドを使用することを、最新の市販のポリマー化学品およびシラン化学品と比較して示している。図14Aは、3’ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドに結合したCy5ストレプタビジンの蛍光検出を示している。シグナルの強度は、相対蛍光単位にて記載されている。データは3つの代表的な実験から得られており、誤差バーは1つの標準偏差を示している。図14Bは蛍光バックグラウンドの測定値を示しており、ノイズレベルは相対蛍光単位にて記載されている。ある1つのスライドガラスと誤差バーから得られたデータが1つの標準偏差を示している。図14Cは、本発明のコーティング化学品に対するシグナル対ノイズ比(S/N)を、ポリマースライドガラス化学品及びシランスライドガラス化学品の場合と比較して示している。データポイントに従って1つのスライドガラスを示した。
【図14C】オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの応用に対して本発明の1つの実施態様を使用することを示しており、特に、アミン反応性機能性表面にてオリゴヌクレオチドを使用することを、最新の市販のポリマー化学品およびシラン化学品と比較して示している。図14Aは、3’ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドに結合したCy5ストレプタビジンの蛍光検出を示している。シグナルの強度は、相対蛍光単位にて記載されている。データは3つの代表的な実験から得られており、誤差バーは1つの標準偏差を示している。図14Bは蛍光バックグラウンドの測定値を示しており、ノイズレベルは相対蛍光単位にて記載されている。ある1つのスライドガラスと誤差バーから得られたデータが1つの標準偏差を示している。図14Cは、本発明のコーティング化学品に対するシグナル対ノイズ比(S/N)を、ポリマースライドガラス化学品及びシランスライドガラス化学品の場合と比較して示している。データポイントに従って1つのスライドガラスを示した。
【図15】本発明の1つの実施態様をタンパク質マイクロアレイの用途に使用することを示しており、特に、ガラス支持体上へのビオチン化抗体の選択的捕捉に対してストレプタビジン機能性表面を使用することを示している。
【図16】種々の塗被表面の非特異的結合を示しており、本発明の1つの実施態様による機能性表面の相乗効果を示している。
【図17A】低い非特異的タンパク質結合と高い特異的タンパク質結合を示す本発明の幾つかの実施態様において、異なったマトリックス形成用成分を使用していることを示している。
【図17B】低い非特異的タンパク質結合と高い特異的タンパク質結合を示す本発明の幾つかの実施態様において、異なったマトリックス形成用成分を使用していることを示している。
【図18A】本発明の塗被表面実施態様(A)での3日間培養後の線維芽細胞増殖の抑制を、組織培養ポリスチレン対照標準(B)の場合と比較して示している。
【図18B】本発明の塗被表面実施態様(A)での3日間培養後の線維芽細胞増殖の抑制を、組織培養ポリスチレン対照標準(B)の場合と比較して示している。
Claims (80)
- 支持体を供給すること;
有効量の活性成分を供給すること;
有効量の架橋用成分を供給すること;
有効量のマトリックス形成用成分を供給すること;
前記活性成分、前記架橋用成分、及び前記マトリックス形成用成分を前記支持体上に固定し、これによって機能性表面を形成させること;
を含む、機能性表面の製造法。 - 前記固定処理がさらに、前記活性成分、前記架橋用成分、及び前記マトリックス形成用成分を前記支持体上に塗被すること、被覆された支持体を作製すること、並びに前記被覆支持体を硬化させることを含む、請求項1記載の製造法。
- 前記硬化処理が、熱による活性化、光による活性化、又は化学的活性化からなる群から選択される、請求項2記載の製造法。
- 前記活性成分が、官能基、スペーサー基、及び結合基を含む、請求項1記載の製造法。
- 前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、カルボキシレート、ビニル、ナイトレン、アルデヒド基、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アミド基、イミド、シアニド、ヒドラジド、スクシンイミド、マレイミド、チオール、ハロゲン化物、アジド基、フェニル基、スルホネート、イソチオシアネート、イソシアネート、オキサゾリン、エポキシド、ニトロベンジル、オキサゾリン、酸塩化物、クロロホルメート、ジスルフィドピリジル、アズラクトン、臭化シアノゲン、フルオロアレーン、フルオロカーボン、ジスルフィド、イソシアニド、サルフェート、ヘパリン、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機ケイ素化合物、有機ホスフェート化合物、エチレングリコールオリゴマー、アクリルアミド、ピロリドン、ポリサッカライド、及び極性の合成ポリマーからなる群から選択される、請求項4記載の製造法。
- 前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、ビニル−スルホン、スクシンイミジルプロピオネート、又はストレプタビジンである、請求項4記載の製造法。
- 前記官能基がビオチンである、請求項4記載の製造法。
- 前記官能基がスクシンイミジル誘導体である、請求項4記載の製造法。
- 前記スペーサー基が、二官能性で直鎖のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;二官能性で星形のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;並びに二官能性で櫛状のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;からなる群から選択される、請求項4記載の製造法。
- 前記スペーサー基が、直鎖のPEG分子、星形のPEG分子、又は櫛状のPEG分子である、請求項4記載の製造法。
- 前記スペーサー基が直鎖のPEG分子である、請求項4記載の製造法。
- 前記結合基が、シラン、メタクリレート、ジスルフィド、ジシラザン、スルフヒドリル、アクリレート、カルボキシレート、イソニトリル、イソシアネート、ホスホアミダイト、ナイトレン、エポキシド、ヒドロシリル、エステル、アレーン、アジド、ニトリル、キノン、及びビニル基からなる群から選択される、請求項4記載の製造法。
- 前記結合基がアルコキシシラン又はクロロシランである、請求項4記載の製造法。
- 前記結合基がアルコキシシランである、請求項4記載の製造法。
- 前記結合基がスクシンイミジル誘導体である、請求項4記載の製造法。
- 前記架橋用成分が、メタクリレート、アクリレート、エポキシド、シラン、ペルフルオロフェニルアジド、アリールアジド、アシルアジド、アジドホルメート、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、β−ケト−α−ジアゾアセテート、脂肪族アゾ、ジアジリン、ケテン、光活性化ケトン、ジアルキルペルオキシダーゼ、ジアシルペルオキシダーゼ、及びキノンからなる群から選択される少なくとも2種の反応性基を含む分子である、請求項1記載の製造法。
- 前記架橋用成分がアジドシランである、請求項1記載の製造法。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、ポリオキシエチレン6トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン12トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン18トリデシルエーテルを含めたポリオキシエチレンベースの界面活性物質;ツイーン(Tween)(登録商標)界面活性剤;トリトン(Triton)(登録商標)界面活性剤;ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー;直鎖のPEG分子、星形のPEG分子、櫛形の高分岐PEG分子、及び樹枝状の高分岐PEG分子;カーボンネート化界面活性剤、ペルフッ素化界面活性剤、及びケイ素化界面活性剤;カゼイン;血清希釈物;ウシ血清アルブミン;糖脂質及び脂質;ヘパリンもしくは他のグリコサミノグリカン;マスシン(muscin);プロテオグリカン;並びにポリサッカライド;からなる群から選択される分子の1種以上で構成されている、請求項1記載の製造法。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ツイーン(Tween)(商標)界面活性剤、プルロニック(Pluronic)(商標)ブロックコポリマー、又は極性で非イオン性の類似した化学組成を有する合成コポリマーである、請求項1記載の製造法。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートである、請求項1記載の製造法。
- 有効量の活性成分を有する支持体;
有効量の架橋用成分;及び
有効量のマトリックス形成用成分;
を含み、前記活性成分、前記架橋用成分、及び前記マトリックス形成用成分が、外部環境における非標的分子に対して低い非特異的結合特性を有する機能化された表面をもたらす一体になって網の目状に絡み合ったマトリックスを形成する、非標的検体に対して低い非特異的結合特性を有する機能性表面。 - 前記活性成分が、官能基、スペーサー基、及び結合基を含む、請求項21記載の機能性表面。
- 前記官能基が標的検体への選択的結合を容易にし、前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、カルボキシレート、ビニル、ナイトレン、アルデヒド基、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、カルボン酸、酸塩化物、ハロアルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アミド基、イミド、シアニド、ヒドラジド、スクシンイミド、マレイミド、チオール、ハロゲン化物、アジド基、フェニル基、スルホネート、イソチオシアネート、イソシアネート、エポキシド、ニトロベンジル、オキサゾリン、酸塩化物、クロロホルメート、ジスルフィドピリジル、アズラクトン、臭化シアノゲン、フルオロアレーン、フルオロカーボン、ジスルフィド、イソシアニド、サルフェート、ヘパリン、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機ケイ素化合物、有機ホスフェート化合物、エチレングリコールオリゴマー、アクリルアミド、ピロリドン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリサッカライド、及び極性の合成ポリマーからなる群から選択される、請求項22記載の機能性表面。
- 前記官能基が標的検体への選択的結合を容易にし、前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、スクシンイミジルプロピオネート、ストレプタビジン、又はアルデヒドである、請求項22記載の機能性表面。
- 前記官能基が標的検定への選択的結合を容易にし、前記官能基がビオチンである、請求項22記載の機能性表面。
- 前記スペーサー基が、二官能性で直鎖のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;二官能性で星形のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;並びに二官能性で櫛状のポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、テレケリックブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、デンドリマー、及び高分岐ポリマー;からなる群から選択される、請求項22記載の機能性表面。
- 前記スペーサー基が、直鎖のポリエチレングリコール、星形のPEG分子、又は櫛状のPEG分子である、請求項22記載の機能性表面。
- 前記スペーサー基が直鎖のPEG分子である、請求項22記載の機能性表面。
- 前記結合基が、シラン、メタクリレート、ジスルフィド、ジシラザン、スルフヒドリル、アクリレート、カルボキシレート、イソニトリル、イソシアネート、ホスホアミダイト、ナイトレン、エポキシド、ヒドロシリル、エステル、アレーン、アジド、ニトリル、キリン、及びビニル基からなる群から選択される、請求項22記載の機能性表面。
- 前記結合基がアルコキシシラン又はクロロシランである、請求項22記載の機能性表面。
- 前記結合基がアルコキシシランである、請求項22記載の機能性表面。
- 前記架橋用成分が、メタクリレート、アクリレート、エポキシド、シラン、ペルフルオロフェニルアジド、アリールアジド、アシルアジド、アジドホルメート、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、β−ケト−α−ジアゾアセテート、脂肪族アゾ、ジアジリン、ケテン、光活性化ケトン、ジアルキルペルオキシダーゼ、ジアシルペルオキシダーゼ、及びキノンからなる群から選択される少なくとも2種の反応性基で構成されている分子である、請求項21記載の機能性表面。
- 前記架橋用成分がアジドシランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、ポリオキシエチレン6トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン12トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン18トリデシルエーテルを含めたポリオキシエチレンベースの界面活性物質;ツイーン(Tween)(登録商標)界面活性剤;トリトン(Triton)(登録商標)界面活性剤;ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー;直鎖のPEG分子、星形のPEG分子、櫛形の高分岐PEG分子、及び樹枝状の高分岐PEG分子;直鎖のポリアミンポリマー、星形のポリアミンポリマー、櫛形のポリアミンポリマー、及び樹枝状のポリアミンポリマー;カーボネート化界面活性剤、ペルフッ素化界面活性剤、及びケイ素化界面活性剤;カゼイン;血清希釈物;ウシ血清アルブミン;糖脂質及び脂質;ヘパリンもしくは他のグリコサミノグリカン;muscin;並びにポリサッカライド;からなる群から選択される、請求項21記載の機能性表面。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ツイーン(Tween)(商標)界面活性剤、プルロニック(Pluronic)(商標)ブロックコポリマー、又は極性で非イオン性の類似した化学組成を有する親水性合成コポリマーである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記マトリックス形成用成分がポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記活性成分がビオチン−PEG−シランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記支持体がSiO2/Siで構成されている、請求項37記載の機能性表面。
- 前記支持体が熱可塑性ポリマー又は熱硬化性ポリマーで構成されている、請求項37記載の機能性表面。
- 前記支持体が金属/金属酸化物で構成されている、請求項37記載の機能性表面。
- 前記活性成分がメトキシ−PEG−シランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記活性成分がメトキシ−PEG−シランとビオチン−PEG−シランとの組み合わせ物である、請求項21記載の機能性表面。
- 網の目に絡み合ったマトリックス内に固定化されたストレプタビジンをさらに含む、請求項42記載の機能性表面。
- 前記活性成分がビニルスルホン−PEG−シランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記支持体がガラスで構成されている、請求項44記載の機能性表面。
- 前記活性成分がNHS−PEG−シランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記活性成分がCOOH−PEG−シランである、請求項21記載の機能性表面。
- 前記活性成分がSPA−PEG−SPAである、請求項21記載の機能性表面。
- 支持体;
前記支持体に固定された非特異的結合性マトリックス;及び
前記非特異的結合性マトリックスに固定された活性成分、これにより生化学的結合アッセイのための機能性表面が形成される;
を含む、生化学的結合アッセイを実施するための機能性表面。 - 前記非特異的結合性マトリックスが、前記機能性表面の架橋安定化と前記支持体への結合をもたらす架橋用成分とマトリックス形成用成分とをさらに含む、請求項49記載の機能性表面。
- 前記活性成分が、官能基、スペーサー基、及び結合基をさらに含み、前記結合基が前記非特異的結合性マトリックスに固定されている、請求項49記載の機能性表面。
- 前記官能基が前記活性成分への標的タンパク質の特異的結合を容易にする、請求項51記載の機能性表面。
- 前記活性成分がビオチンである、請求項52記載の機能性表面。
- 前記活性成分がビニルスルホンである、請求項52記載の機能性表面。
- 前記活性成分がNHSである、請求項52記載の機能性表面。
- 前記活性成分がSPAである、請求項52記載の機能性表面。
- 前記非特異的結合性マトリックスが、有効量のアジド−シラン及びポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートで構成されている、請求項49記載の機能性表面。
- 前記支持体が、シリカベースの支持体、金属支持体、金属酸化物支持体、ヒドロゲル支持体、ガラス支持体、及びポリマー支持体からなる群から選択され、請求項49記載の機能性表面。
- 前記架橋用成分がアジド−シランである、請求項49記載の機能性表面。
- 前記マトリックス形成用成分がポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートである、請求項49記載の機能性表面。
- 有効量の活性成分、有効量の架橋用成分、及び有効量のマトリックス形成用成分を含み、前記活性成分、前記架橋用成分、及び前記マトリックス形成用成分が、低い非特異的結合特性を有する機能化された表面をもたらす一体になって網の目状に絡み合ったマトリックスを形成する、支持体に施すのに適した、低い非特異的結合特性を有する機能化された表面を作製するためのパッケージ配合物;及び前記成分を支持体表面上に施すための使用説明書。
- 前記活性成分が、官能基、スペーサー基、及び結合基を含む、請求項61記載のパッケージ配合物。
- 前記官能基が特定の検体の結合を容易にし、前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、カルボキシレート、ビニル、ナイトレン、アルデヒド基、フェニルボロン酸、サリチルヒドロキサム酸、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アミド基、イミド、シアニド、ヒドラジド、スクシンイミド、マレイミド、チオール、ハロゲン化物、アジド基、フェニル基、スルホネート、イソチオシアネート、イソシアネート、エポキシド、ニトロベンジル、オキサゾリン、酸塩化物、クロロホルメート、ジスルフィドピリジル、アズラクトン、臭化シアノゲン、フルオロアレーン、フルオロカーボン、ジスルフィド、イソシアニド、サルフェート、ヘパリン、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機ケイ素化合物、有機ホスフェート化合物、エチレングリコールオリゴマー、アクリルアミド、ピロリドン、ポリサッカライド、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、及び極性の水溶性合成ポリマーからなる群から選択される、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記官能基が特定の検体の結合を容易にし、前記官能基が、ビオチン、メトキシ−ポリエチレングリコール、スクシンイミド、スクシンイミジルプロピオネート、ストレプタビジン、又はアルデヒドである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記官能基が特定の検体の結合を容易にし、前記官能基がビオチンである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記スペーサー基が、二官能性で直鎖のポリエチレングリコールすなわちPEGオリゴマーもしくはPEGポリマー、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリピロリドン、ポリホスファゼン、表面活性のテレケリックブロックコポリマー、例えばプルロニック(Pluronic)(商標)、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、サッカライドモノマー、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、デンドリマー、又は高分岐ポリマー;二官能性で星形のポリエチレングリコールすなわちPEGオリゴマーもしくはPEGポリマー、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリピロリドン、ポリホスファゼン、表面活性のテレケリックブロックコポリマー、例えばプルロニック、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、サッカライドモノマー、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、デンドリマー、又は高分岐ポリマー;及び二官能性で櫛状のポリエチレングリコールすなわちPEGオリゴマーもしくはPEGポリマー、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリウレタン、タンパク質、ポリ(アミノ酸)、ポリピロリドン、ポリホスファゼン、表面活性のテレケリックブロックコポリマー、例えばプルロニック、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリサッカライド、サッカライドモノマー、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、デンドリマー、又は高分岐ポリマー;からなる群から選択される、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記スペーサー基が、直鎖のポリエチレングリコールすなわちPEGオリゴマーもしくはPEGポリマー、星形のPEG分子、又は櫛状のPEG分子である、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記スペーサー基が直鎖のPEG分子である、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記結合基が、シラン、メタクリレート、SPA、ジスルフィド、ジシラザン、スルフヒドリル、アクリレート、カルボキシレート、イソニトリル、イソシアネート、ホスホアミダイト、ナイトレン、エポキシド、ヒドロシリル、エステル、アレーン、アジド、ニトリル、キノン、及びビニル基からなる群から選択される、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記結合基がアルコキシシラン又はクロロシランである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記結合基がアルコキシシランである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記結合基がSPAである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記架橋用成分が、メタクリレート、アクリレート、エポキシド、シラン、ペルフルオロフェニルアジド、アリールアジド、アシルアジド、アジドホルメート、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、β−ケト−α−ジアゾアセテート、脂肪族アゾ、ジアジリン、ケテン、光活性化ケトン、ジアルキルペルオキシダーゼ、ジアシルペルオキシダーゼ、及びキノンからなる群から選択される少なくとも2種の反応性基で構成される分子である、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記架橋用成分がアジドシランである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、ポリオキシエチレン6トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン12トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン18トリデシルエーテルを含めたポリオキシエチレンベースの界面活性物質;ツイーン界面活性剤;トリトン界面活性剤;ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー;直鎖のPEG分子、星形のPEG分子、櫛形の高分岐PEG分子、及び樹枝状の高分岐PEG分子;直鎖のポリアミンポリマー、星形のポリアミンポリマー、及び樹枝状のポリアミンポリマー;カーボネート化界面活性剤、ペルフッ素化界面活性剤、及びケイ素化界面活性剤;カゼイン;血清希釈物;ウシ血清アルブミン;糖脂質及び脂質;ヘパリン;muscin;並びにポリサッカライド;からなる群から選択される、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記マトリックス形成用成分が、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ツイーン界面活性剤、又はプルロニックブロックコポリマーである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 前記マトリックス形成用成分がポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートである、請求項62記載のパッケージ配合物。
- 生体分析アッセイにおいて標的検体を検出するのに使用するための機能性表面であって、
生体分析アッセイを行うための支持体;及び
前記標的検体の検出時に非特異的結合を制限するための、前記支持体上に被覆される手段;
を含む前記機能性表面。 - 前記生体分析アッセイがマイクロアレイである、請求項78記載の機能性表面。
- 前記マイクロアレイがオリゴヌクレオチドのマイクロアレイである、請求項79記載の機能性表面。
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