JP2009276353A

JP2009276353A - バイオセンサの基板のパターン製造方法およびそれを用いたバイオセンサ

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Publication number: JP2009276353A
Application number: JP2009120251A
Authority: JP
Inventors: Hyobong Hong; ヒョボンホン; Hyungjoong Yoon; ヒュンジョンヨン; Myungae Cung; ミュンゲチュン
Original assignee: Electronics and Telecommunications Research Institute ETRI
Current assignee: Electronics and Telecommunications Research Institute ETRI
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2029-05-18
Also published as: KR100956447B1; US8187829B2; KR20090119476A; JP4797084B2; US20090283426A1

Abstract

【課題】バイオセンサの基板のパターン製造方法およびそれを用いたバイオセンサを提供する。
【解決手段】本発明により、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて基板上にアミン基を形成し、生体物質を固定化しようとするサイトをマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）した後、紫外線を照射するだけで基板上に所望の形状のパターンを形成することができる、バイオセンサの基板のパターン製造方法、および前記方法で得られたパターン上に生体物質を固定化させたバイオセンサを提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明はバイオセンサの基板のパターン製造方法およびそれを用いたバイオセンサに関する。

バイオセンサとは特定物質に対する認識機能を有する生物学的収容体が電気または光学的変換器（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）と結合して生物学的相互作用および認識反応を電気的または光学的信号に変換することによって分析しようとする物質を選択的に検知できる素子であり、ここで、物質はＤＮＡ又は血糖のような生体物質だけでなく、一般的な化学物質を含む。生物学的収容体は分析物質を選択的に認識すると同時に変換器が測定できる信号を発生させる役割をする生体物質であり、酵素、タンパク質、ＤＮＡ、細胞、ホルモン、生体膜（ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ）、組織（ｔｉｓｓｕｅ）等が用いられる。発生した生体信号または認識反応などを有用な信号に変換させるのに電気化学、光学、磁気、圧電、電子などの様々な物理化学的な方法が適用されており、究極的には電気信号が得られる。バイオセンサは特定物質に対する認識過程が可逆的に進行されるために連続した測定が可能である。バイオセンサ中、抗原−抗体の相互作用またはＤＮＡのハイブリッド形成のように認識過程がほぼ非可逆的に進行される場合があるが、このような検出器概念のバイオセンサはバイオチップに区分される。しかし、今日ではバイオセンサとバイオチップの境界が曖昧となり、技術的互換が活発に進行されており、バイオセンサとバイオチップをあえて区別しない現状である。

バイオセンサの特定区域上に生体活性化合物を固定化することはバイオセンサの製造に必須である。大部分のバイオセンサは基板、化学的リンカー、および生物学的インターフェース（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）から構成される。ガラス、石英、シリコンウェハまたはポリマーが一般的に基板として用いられる。しかし、これらの基板は生体物質に直接に結合するための特定結合特性を有しない。よって、基板と生物学的インターフェースとの間の結合を許容するために表面の改質（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が必要である。

基板そのものを改質する時または有機フィルムに様々な試薬を添加する時、特定結合特性を有する化学的リンカーが基材表面に生成されるかまたは添加され得る。表面改質のために、通常の技術は物理的吸着、化学的結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）、配位子−収容体の結合、およびこれらの組み合わせをベースにする。前記目的のための技術の選択は、基板および／または生物学的インターフェースの特定の化学的または物理的特性をベースにする。たとえ基板の改質のために多くの化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および材料が用いられても、化学的リンカーとして作用する材料および化学物質の大部分は基板および生物学的インターフェースの全てに結合する二官能性（ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）でなければならない。

ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ）はこの目的のために用いられるポリマーのうちの一つである。このポリマーは、細胞、ＤＮＡ、およびタンパク質の固定化のために、また、細胞株のトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにも用いられてきた。ＰＥＩは高密度アミン基を有する分岐（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ポリマーである。純粋ＰＥＩは複数のアミンを有し、フィルムと生体活性化合物との間のリンカーとして主に用いられるスクシンイミジルエステル、スルホニルクロライド、およびイソチオシアネートのような他の分子と共有結合することができる。また、ＰＥＩは自然吸収（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）によってシリコンオキサイドフィルム上に固定化できると知られている。これらの特性がＰＥＩを表面改質に好適な材料にする。

従来、パターンをなして生体物質を固定化する方法としては主にエッチング工程を利用する技術が用いられてきた。例えば、フォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）法を利用してポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を基板上に固定する方法は、チップを製造する時ごとにそれぞれのパターンを有するマスク（ｍａｓｋ）を製作しなければならず、工程ごとに洗浄とマスク配列過程が行われなければならない。これにより、工程が複雑になり、高価の装置を必要とするために費用が高くなる問題点がある。それと共に、パターンデザインの制限性、そして非環境親和的な問題点を抱いていた。

基板に生体物質を固定させるにおいて、生体物質の固定化率が高くなければならないことは勿論、所望のパターン（好ましくは微細パターン）で固定されなければならない。特に、生体物質をできるだけマイクロメータ大きさ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓｃａｌｅ）の特定領域（ｓｐｏｔ）に高密度で集積させ固定化させることが何より重要である。高密度で集積された場合、それだけ遺伝情報を解読できる能力が向上するためである。しかし、センサの非常に小さい領域に生体物質をスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）したり塗布したりするためには、マイクロアレイヤー（ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙｅｒ）のような非常に高価の装置が要求されており、これは、バイオセンサのセンシング要素（ｓｅｎｓｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）が非常に小さい領域を占有するためである。全体センサがより大きいとしても、前記領域は一般的にｎｍ〜μｍ範囲である。よって、固定化または付着を制御するための新しい方法の開発が要求される。

そこで、本発明者らは、ＵＶ照射により、基板表面に形成されたＰＥＩ層のアミン基が除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）されてスクシンイミジルエステルに対する結合特性（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を失うことと、基板表面をパターン化できることを発見し、前記パターン化された表面上に固定化させた生体物質（例：ビオチン）に選択的に結合した物質（例：ストレプトアビジン）のシグナルを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明はバイオセンサの基板のパターン製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記方法で製造されたバイオセンサの基板のパターンに生体物質が固定されていることを特徴とするバイオセンサを提供することを他の目的とする。
また、本発明は、前記バイオセンサを用いた生体物質と結合する標的物質の検出方法を提供することをまた他の目的とする。

前記目的を達成するために、本発明は、
（ａ）基板にシリコンオキサイドフィルムを蒸着するステップ；
（ｂ）前記シリコンオキサイドフィルム上にポリエチレンイミン層を形成するステップ；
（ｃ）前記ポリエチレンイミン層上の、生体物質を固定化しようとするサイトを選択的にマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）するステップ；および
（ｄ）前記基板を紫外線で照射するステップ；
を含んでなっていることを特徴とする、バイオセンサの基板のパターン製造方法を提供する。

本発明において、前記基板は、シリコン（ｓｉｌｉｃｏｎ）、石英（ｑｕａｒｔｚ）およびガラス（ｇｌａｓｓ）を含む群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする。
本発明において、前記マスキングはテフロン（登録商標）テープ、アルミ箔およびエナメル銅線を含む群から選択されたいずれか一つを用いて行われることを特徴とする。

本発明において、前記照射は２２０ｎｍ〜３００ｎｍの紫外線で１０分〜１時間行うことを特徴とする。
また、本発明は、前記方法で製造された基板のパターン上に生体物質が固定されていることを特徴とするバイオセンサを提供する。
本発明において、前記生体物質はアミン−反応性基と共有結合を形成するリンカーを介して前記基板に固定されることを特徴とする。

本発明において、前記アミン−反応性基は、カルボン酸エステル、酸クロライド、スルホニルクロライド、無水物、ケトン、アルデヒド、ハロ、イソチオシアネート、チオイソシアネート、エポキシド、活性化されたヒドロキシル基、オレフィン、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、エポキシおよびエテンスルホニル基を含む群から選択された一つ以上の基であることを特徴とする。

本発明において、前記生体物質は、酵素、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、微生物、動植物細胞および器官、および神経細胞からなる群から選択されることを特徴とする。

また、本発明は、（ｉ）前記バイオセンサに標的物質を含有する試料を適用するステップ；および（ｉｉ）前記バイオセンサ上の生体物質と特異的に結合する標的物質を検出するステップ；を含む、バイオセンサを用いた生体物質と結合する標的物質の検出方法を提供する。

以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係るバイオセンサの基板のパターン製造方法をステップ別に説明すれば下記の通りである：
（ａ）基板にシリコンオキサイドフィルムを蒸着するステップ；
（ｂ）前記シリコンオキサイドフィルム上にポリエチレンイミン層を形成するステップ；
（ｃ）前記ポリエチレンイミン層上の、生体物質を固定化しようとする所定のサイトを選択的にマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）するステップ；および
（ｄ）前記基板を紫外線で照射するステップ；
を含んでなっていることを特徴とする、バイオセンサの基板のパターン製造方法を提供する。

本発明に用いられる基板はその上に密着性皮膜の形成を許容するものであれば特に限定されず、特にＰＥＩ層を形成するためにはガラス、石英、シリコンウェハなどの基板が好ましい。前記基板は、使用前にＲＣＡ方法などの通常の方法で洗浄し乾燥して用いることが好ましい。

本発明では前記基板にシリコンオキサイド（ＳｉＯ₂）フィルムを蒸着し、これは、ＰＥＩが自然吸収（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）によってシリコンオキサイドフィルム上に固定化され得るためである。シリコンオキサイドフィルムの蒸着は、例えば、熱化学気相蒸着（ｔｈｅｒｍａｌＣＶＤ）法などによって行うことができ、その層の厚さは約５００Å〜２０００Åになるようにすることが好ましいが、これに限定されない。

上記のようにシリコンオキサイドフィルムが形成された基板を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液に１時間〜６時間、好ましくは２時間〜４時間ディッピング（ｄｉｐｐｉｎｇ）方法によって浸漬して基板上にアミン基を形成する。

上記のようにアミン基が形成された基板上に、形成しようとするパターンの形状をしたマスクを配置する。この時、前記ＵＶに対するマスキングを行うためのマスク（ｍａｓｋ）として、その材料は光を遮断できる光不透過性の材料であれば特に制限されず、その形態はパターン化しようとする形状によって制限されず、一例としてプレート（ｐｌａｔｅ）形状であってもよく、線（ｌｉｎｅ）形状であってもよい。本発明ではテフロン（登録商標）材質のテープを用い、この他にもアルミ箔、エナメル銅線なども用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明においてパターンの形状は制約的ではない。例えば、前記パターンは、固定化しようとする生体物質の使用目的または集積度に応じ、線形、円形、三角形、四角形などの様々な形状であってもよい。また、円形、三角形、四角形などのパターンが碁盤形態で配列されたものを含む。また、本発明の表面パターンは直径（円形の場合）または一面の長さ（三角形、四角形の場合）が最小５マイクロメータ（μｍ）を有し得、具体的な例としては、ＤＮＡ（又はＣｅｌｌ）チップの製作時、２０マイクロメータ（μｍ）〜１００マイクロメータ（μｍ）を有し得る。

上記のようにマスクを配置した基板を、紫外線（以下、ＵＶと記載することもある）領域を含む光を利用して照射すれば、前記マスキングされない表面のアミン基は除去され、これは構造的変化によるものと推定される。前記ＵＶ照射のためには、紫外線領域、好ましくは２２０ｎｍ〜３００ｎｍ波長範囲の紫外線、特に好ましくは２６０ｎｍ以下の短波長紫外線を放射できる光源を用いて１０分〜１時間照射を行い、前記光源としては市販製品を容易に入手することができる。また、表面と光源との間の距離は、表面上に到達するエネルギー強度を最大化できるように近いほど良く、例えば、２ｃｍ以下、特に好ましくは０．５ｃｍである。上記のように紫外線で照射した基板は後処理を行うことなく直ちに用いることができる。すなわち、従来のフォトリソグラフィ法におけるパターン形成後のエッチング、剥離などのステップを行う必要がない。

上記のように製造されたパターン上には、すなわちマスキングされた部分にはアミン基がそのまま付着しており、該アミン基を利用して生体物質を固定化してバイオセンサとして用いることができる。これにより、本発明は、前記方法で製造された基板のパターン上に生体物質が固定されていることを特徴とするバイオセンサを提供する。

本発明において、前記生体物質はアミン−反応性基と共有結合を形成したリンカーを介して前記基板に固定されており、本発明では、一端にはスクシンイミジルエステル基を有し、他端にはビオチンを有するリンカーが固定化され、ここにストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子が結合されて生体物質との結合可能性を示しているが、これに限定されない。前記リンカーはチップ表面の官能基と反応して表面に固定化し、同時に生体物質が有する官能基とカップリング反応できる反応基を末端に有している化合物を通称するものであり、前記アミン−反応性基はカルボン酸エステル、酸クロライド、スルホニルクロライド、無水物、ケトン、アルデヒド、ハロ、イソチオシアネート、チオイソシアネート、エポキシド、活性化されたヒドロキシル基、オレフィン、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、エポキシおよびエテンスルホニル基を含む群から選択された一つ以上の基であることを特徴とする。

また、本発明は、
（ｉ）上記のように製造されたバイオセンサに標的物質を含有する試料を流すか、前記試料溶液に浸漬する方法などを利用して試料を適用するステップ；および
（ｉｉ）前記バイオセンサ上の生体物質と特異的に結合する標的物質を検出するステップ；を含む、バイオセンサを用いた生体物質と結合する標的物質の検出方法を提供する。

本発明において、基板上に固定される生体物質は、一般的に分析しようとする標的物質と特異的に反応する特性を有することが一般的である。例えば、前記生体物質が核酸である場合、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸と混成化反応を介して相互反応することができる。前記生体物質がタンパク質である場合、抗原および抗体反応、配位子および収容体間の相互反応、酵素と基質間の相互反応などを介して互いに特異的に相互反応することができる。また、前記生体物質が多糖類である場合、多糖類を認知するタンパク質または抗体によって特異的に認知され得る。このような生体物質と標的物質の特異的相互作用とこのような相互作用の結果を検出できる検出システムを利用して、本発明の生体物質を基板上に固定化して得られるバイオセンサを色々な分析に用いることができる。

本発明のパターン製造方法は、ＰＥＩ層を形成した後に紫外線を照射するだけでバイオセンサの基板上に所望の形状のパターンを形成することができるため、複雑な工程および高価の装置を必要とする従来のバイオセンサの基板のパターン製造技術の短所を克服することができる。また、生体物質の固定化が基板のパターン製造後になされるため、生体物質の固定化率が高くなり得る長所を有する。

本発明の好ましい一実施例によるバイオセンサの基板のパターン製造方法を示す概略図である。本発明の好ましい一実施例によるバイオセンサの基板のパターンを蛍光顕微鏡で観察した写真である。ＵＶに露出されない部分が十字形パターンで形成されている。ポリエチレンイミンとＮＨＳ−ビオチンが結合された分子構造である。ＰＥＩ層上のビオチンの固定化に対するＵＶの効果を示すＡＲ−ＸＰＳスペクトルである。本発明の好ましい一実施例によるバイオセンサの基板のパターン上にストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子の固定化を示す写真である。

以下、本発明について実施例を用いてより詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明が下記実施例によって限定されるものではなく、様々に修正および変更することができる。

実施例１．バイオセンサの基板上パターンの形成
本実施例の概略図を図１に示す。シリコンウェハ（Ｎａｎｏｆａｂｃｅｎｔｅｒ、大田、韓国）上にＳｉＯ₂フィルム（１０．０ｎｍ）を熱蒸着（ｔｈｅｒｍａｌｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）した。前記サンプルを１ｃｍ×１ｃｍ大きさに切って試片を作った。通常のＲＣＡ方法（先ず、ＳｉＯ₂表面上の有機物質を除去するために、温度３８０Ｋの加熱浴において溶液（ＮＨ₄ＯＨ：Ｈ₂Ｏ₂：脱イオン水＝１：１：５）で１０分間洗浄した。その次、表面に存在する重金属成分を除去するために、温度３８０Ｋの加熱欲において溶液（ＨＣｌ：Ｈ₂Ｏ₂：脱イオン水＝１：１：５で１０分間洗浄する）で前記試片の有機物を除去した。ＭｅＯＨ：ＨＣｌ（１：１ｖ／ｖ）溶液を利用して前記試片の表面をシラノール（ｓｉｌａｎｏｌ）形態に変換させた。５０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃（ｐＨ８．２）に溶かした１０％ＰＥＩ（ｃａｔ＃．Ｐ３１４３、ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）溶液に３時間浸漬させるディッピング（ｄｉｐｐｉｎｇ）方法によってＳｉ−ウェハ表面をＰＥＩ層でコーティングした。インキュベーション後、脱イオン水で過量のＰＥＩを除去し、水分は窒素ガスで除去した。生体物質を固定化しようとする基板表面上に特定パターン（本実施例では基板上に交差する十字形状で形成）を有するテフロン（登録商標）テープを貼り付けた。暗室において、前記シリコンウェハを２５４ｎｍの紫外線で１時間照射した。シリコンウェハとＵＶランプ（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ、ＥＮＦ−２６０Ｃ、ＵＳＡ）との間の距離は０．５ｃｍであった。

実験例１．表面特性分析
ＵＶによる基板上のパターン形成を測定するために下記の２つの方法を使った。
［蛍光顕微鏡分析］
表面に対するＵＶ照射の効果を確認するために蛍光顕微鏡を使って分析した。この実験のために、分子の一端にはスクシンイミジルエステルを有し、他端には３５４ｎｍにおいて最大吸収波長、４４２ｎｍにおいて最大放出波長を有する蛍光化合物からなるＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥ［６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸，スクシンイミジルエステル］（Ａｎａｓｐｅｃ、ＵＳＡ）を使った。ＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥは生体物質をタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）するために最も広く用いられる蛍光分子のうちの一つであり、その部分（Ｍｏｉｅｔｙ）の一端にスクシンイミジルエステルを有する。したがって、これは、抗体およびタンパク質のようにアミンを含有する分子と水溶液内で反応することができる。また、アミノヘキサノイル領域（ｓｐａｃｅ）もコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）する間、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）のクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を減少させることができる。

ＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥストック（ｓｔｏｃｋ）はＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥ１０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯに溶かして準備した。表面に塗布する前、貯蔵溶液を無−アミンＰＢＳ（ａｍｉｎｅ−ｆｒｅｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）と２５：７５の比率で混合した。実施例１で準備した基板を該溶液にディッピングし、３０分間インキュベートした。最後に、サンプルをアルゴンガスで乾燥させた。蛍光イメージを、３５０ｎｍ放出波長を有する蛍光源を備えた顕微鏡で観察した。ＵＶに露出されたサイトから蛍光が観察されなかったり、または同一基板上の遮断されたサイトから蛍光が観察されたりとすれば、基板のアミン基に対するＵＶ照射の効果を間接的に立証することができるのである。

蛍光顕微鏡で観察した結果によれば、ＵＶ照射部からはいかなる蛍光も示されなかったが、テフロン（登録商標）テープでカバーしたＵＶ遮断部からは蛍光が観察された（図２参照）。この結果に基づき、ＵＶ遮断部、すなわちパターン形成部において、選択的にアミンとＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥの結合がなされたことが分かる。

［ＡＲ−ＸＰＳ分析］
ＰＥＩ−コーティングされた表面上の化学的結合状態（ｃｈｅｍｉｃａｌｂｏｎｄｉｎｇｓｔａｔｅ）の確認および定量化のために、ＡＲ−ＸＰＳ（Ａｘｉｓ−ＮＯＶＡ、Ｋｒａｔｏｓ社、ＵＫ）およびスルホスクシンイミジル−６−［ビオチン−アミノ］ヘキサン（ＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−ビオチン、ＰＩＥＲＣＥ社、ＵＳＡ）を用いたが、これは、この分子が生体物質に対する化学的リンカーとして最も広く用いられる分子のうちの一つであり、また、シリコンウェハおよびＰＥＩの構成成分ではない硫黄を含有しているためである。

測定前に、試片を５００μlのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）に２．２ｍｇのＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−Ｂｉｏｔｉｎを溶かした溶液に３０分間沈積した。その次、試片を脱イオン水で洗浄し、窒素ガスで処理した。ＸＰＳ分析に用いられた放射線源（ｒａｄｉａｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅ）としてはｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃＡｌ−Ｋα（１４８６．６ｅＶ）を用い、半球形分析器を使った。陰極電力（ａｎｏｄｅｐｏｗｅｒ）はＵＨＶ（１．０×１０^-9Ｔｏｒｒ）において７５Ｗ（５ｍＡ、１５ｋＶ）を維持した。表面感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を増加させるために、ＡＲ−ＸＰＳは分析器に対し０〜６０°の範囲にかけてｔａｋｅ−ｏｆｆａｎｇｌｅ（ＴＯＡ）を変更しながら行った。

ＵＶ照射部および遮断部から収得された、１．２ｅＶのスプリティング（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）を有するＳ２ｐスペクトルを図４に示す。前記ＡＲ−ＸＰＳ結果はＵＶ照射区域とＵＶ遮断区域との間に有意な相異性があることを示す。１６４．０ｅＶにおけるＳ２ｐピークはＳ²⁺から発生したものであり、これは、ＵＶ遮断部にビオチンが結合されたことを示す。

上記のような蛍光顕微鏡およびＡＲ−ＸＰＳの結果から、短波長ＵＶ照射（２５４ｎｍ）がシリコンオキサイドフィルム上のＰＥＩ層の表面を確実に改質させたことが分かった。蛍光顕微鏡およびＡＲ−ＸＰＳを介してＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥとＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−ｂｉｏｔｉｎのコンジュゲーションを確認できなかった反面、ＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥおよびＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−ｂｉｏｔｉｎとＰＥＩ層のアミンとのコンジュゲーションを介してＵＶ照射の効果を確認した。

前記の結果により、ＰＥＩ表面改質はＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−ｂｉｏｔｉｎのような化学的リンカーの固定化を制御するのに用いられ得ることが分かり、これは、全体ポリマー層の特定部分を改質させることによって特定化学的リンカーの付着を制御できることが分かる。

実験例２．パターン上のビオチン−ストレプトアビジン結合の分析
前記実施例１で製造されたバイオセンサの基板のパターンにタンパク質であるストレプトアビジンを固定するために、実施例１で準備した試片を５００μlのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）に２．２ｍｇのＮＨＳ−スルホ−ビオチン（ＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ−Ｂｉｏｔｉｎ）を溶かした溶液に３０分間沈積した。

表面にストレプトアビジンがコーティングされた磁性粒子であるＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）−２８０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＤｙｎａｌＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）懸濁液１００μlをＰＢＳバッファで洗浄した後、前記洗浄後の磁性粒子１００μlをＰＢＳバッファ１００μlで再び浮遊させ、磁性粒子溶液１００μlを製造した。室温において、前記磁性粒子溶液に、前記ビオチンを結合させた試片を３０分間沈積した後に取り出し、３次蒸留水で３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光反応は前記で言及したＡＭＣＡ−Ｘ，ＳＥを利用して観察した。

図５に示すように、パターン化した表面上に固定化されたビオチンに選択的に結合したストレプトアビジン磁性粒子の蛍光シグナルを確認することができた。

Claims

（ａ）基板にシリコンオキサイドフィルムを蒸着するステップ；
（ｂ）前記シリコンオキサイドフィルム上にポリエチレンイミン層を形成するステップ；
（ｃ）前記ポリエチレンイミン層上の、生体物質を固定化しようとするサイトを選択的にマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）するステップ；および
（ｄ）前記基板を紫外線で照射するステップ；
を含んでなっていることを特徴とする、バイオセンサの基板のパターン製造方法。
前記基板は、シリコン（ｓｉｌｉｃｏｎ）、石英（ｑｕａｒｔｚ）およびガラス（ｇｌａｓｓ）を含む群から選択されたいずれか一つからなる基板であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサの基板のパターン製造方法。
前記マスキングは、テフロン（登録商標）テープ、アルミ箔およびエナメル銅線を含む群から選択されたいずれか一つを用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサの基板のパターン製造方法。
前記照射は、２２０ｎｍ〜３００ｎｍの紫外線で１０分〜１時間行うことを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサの基板のパターン製造方法。
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載された方法で製造された基板のパターン上に生体物質が固定されていることを特徴とするバイオセンサ。
前記生体物質は、アミン−反応性基と共有結合を形成するリンカーを介して前記基板に固定されていることを特徴とする、請求項５に記載のバイオセンサ。
前記アミン−反応性基は、カルボン酸エステル、酸クロライド、スルホニルクロライド、無水物、ケトン、アルデヒド、ハロ、イソチオシアネート、チオイソシアネート、エポキシド、活性化されたヒドロキシル基、オレフィン、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、エポキシおよびエテンスルホニル基を含む群から選択された一つ以上の基であることを特徴とする、請求項６に記載のバイオセンサ。
前記生体物質は、酵素、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、微生物、動植物細胞および器官、および神経細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のバイオセンサ。
（ｉ）請求項５に記載されたバイオセンサに標的物質を含有する試料を適用するステップ；および
（ｉｉ）前記バイオセンサ上の生体物質と特異的に結合する標的物質を検出するステップ；
を含む、バイオセンサを用いた生体物質と結合する標的物質の検出方法。