KR100956447B1 - 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법 및 이를 이용한바이오센서 - Google Patents

바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법 및 이를 이용한바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 기판 상에 아민기를 형성하고, 생체물질을 고정화하고자 하는 사이트를 마스킹(masking)한 후, 자외선을 조사하는 것만으로 기판 상에 원하는 형상의 패턴 형성이 가능한, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법, 및 상기의 방법으로 수득된 패턴 상에 생체물질을 고정화시킨 바이오센서를 제공할 수 있다.
Figure R1020080045547
바이오센서, 패턴, 표면 개질, 폴리에틸렌이민, UV

Description

바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법 및 이를 이용한 바이오센서 {A method for fabricating patterned biosensor substrate and a biosensor using the same}
본 발명은 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명은 정보통신부 및 정보통신연구진흥원의 IT원천기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제관리번호: 2006-S-074-02, 과제명: 나노 입자를 이용한 고성능 바이오 센서 시스템].
바이오센서란 특정한 물질에 대한 인식기능을 갖는 생물학적 수용체가 전기 또는 광학적 변환기(transducer)와 결합되어 생물학적 상호작용 및 인식반응을 전기적 또는 광학적 신호로 변환함으로써 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 소자이며, 여기서 물질은 DNA와 혈당과 같은 생체물질뿐만 아니라 일반적인 화학물질을 포함한다. 생물학적 수용체는 분석물질을 선택적으로 인식함과 동시에 변환기가 측정할 수 있는 신호를 발생시키는 역할을 하는 생체물질로서 효소, 단백질, DNA, 세포, 호르몬, 생체막(membrane), 조직(tissue) 등이 사용된다. 발생된 생체신호 또는 인식반응 등을 유용한 신호로 변환시키는 데 전기화학, 광학, 자 기, 압전, 전자 등 다양한 물리화학적인 방법이 적용되고 있으며, 궁극적으로는 전기신호가 얻어진다. 바이오센서는 특정한 물질에 대한 인식 과정이 가역적으로 진행되기 때문에 연속적인 측정이 가능하다. 바이오센서 가운데 항원-항체 상호작용 또는 DNA의 하이브리드 형성과 같이 인식 과정이 거의 비가역적으로 진행되는 경우가 있는데 이러한 검출기 개념의 바이오센서는 바이오칩으로 구분된다. 그러나 근래에는 바이오센서와 바이오칩의 경계가 모호해지고 있으며, 기술적 호환이 활발하게 진행되고 있어 바이오센서와 바이오칩을 굳이 구별 짓지 않고 있는 실정이다.
바이오센서의 특정 구역 상에 생체활성 화합물을 고정화하는 것은 바이오센서의 제조에 필수적이다. 대부분의 바이오센서는 기판, 화학적 링커 및 생물학적 인터페이스(interface)로 구성된다. 유리, 석영, 실리콘 웨이퍼 또는 폴리머가 일반적으로 기판으로 사용된다. 그러나, 이들 기판은 생체물질에 직접적으로 결합하기 위한 특정 결합 특성을 갖지 않는다. 따라서, 기판과 생물학적 인터페이스 사이의 결합을 허용하기 위해서 표면의 개질(modification)이 필요하다.
기판 자체의 개질 시 또는 유기 필름에 다양한 시약의 첨가시, 특정 결합 특성을 갖는 화학적 링커가 기재 표면에 생성되거나 또는 첨가될 수 있다. 표면 개질을 위해, 통상적인 기술은 물리적 흡착, 화학적 결합(bonding), 리간드-수용체 결합, 및 이들의 조합을 기초로 한다. 상기 목적을 위한 기술의 선택은 기판 및/또는 생물학적 인터페이스의 특정 화학 또는 물리적 특성을 기초로 한다. 비록 기판의 개질을 위해 많은 화학물질(chemicals) 및 재료가 사용되지만, 화학적 링커로서 작용하는 재료 및 화학물질의 대부분은 기판 및 생물학적 인터페이스 모두에 결 합하는 이작용성(bi-functional)이어야 한다.
폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI)은 이 목적을 위해 사용되는 폴리머 중 하나이다. 이 폴리머는 세포, DNA, 및 단백질의 고정화를 위해, 또한 세포주의 트랜스펙션(transfection)을 위해서도 사용되어 왔다. PEI는 고밀도 아민기를 갖는 분지된(branched) 고분자이다. 순수 PEI는 다수의 아민을 가지며, 필름과 생체활성 화합물 사이의 링커로서 주로 사용되는 숙신이미딜 에스테르, 술포닐 클로라이드, 및 이소티오사이시아네이트와 같은 다른 분자와 공유 결합할 수 있다. 또한, PEI는 자발 흡수(spontaneous absorption)를 통해 실리콘 옥사이드 필름 상에 고정화될 수 있는 것으로 알려졌다. 이들 특성이 PEI를 표면 개질에 적합한 재료로 만든다.
종래, 패턴을 이뤄 생체물질을 고정화하는 방법에는 주로 식각공정을 이용하는 기술이 이용되어 왔다. 예를 들어, 포토리소그래피(photolithography)법을 이용하여 폴리펩타이드(polypeptide)를 기판 상에 고정하는 방법은 칩을 제조할 때마다 각각의 패턴을 갖는 마스크(mask)를 제작하여야 하고, 각 공정마다 세척과 마스크 배열 과정이 수행되어야 한다. 이에 따라, 공정이 복잡해지고, 고가의 장비를 필요로 하여 가격이 높아지는 문제점이 있다. 아울러, 패턴 디자인의 제한성, 그리고 비(非)환경친화적인 문제점을 안고 있었다.
기판에 생체물질을 고정시키는 것에 있어서, 생체물질의 고정화율이 높아야 함은 물론이고, 원하는 패턴(바람직하게는 미세 패턴)으로 고정되어야 한다. 특히, 생체물질을 가능한 한 마이크로미터 크기(micrometer scale)의 특정된 영 역(spot)에 고밀도로 집적시켜 고정화시키는 것이 무엇보다 중요하다. 고밀도로 집적된 경우, 그만큼 유전 정보를 해독할 수 있는 능력이 향상되기 때문이다. 그러나, 센서의 매우 작은 영역에 생체물질을 스포팅(spotting)하거나 도포하기 위해서는, 마이크로어레이어(micro-arrayer)와 같은 매우 고가의 장비가 요구되는데, 이는 바이오센서의 센싱 요소(sensing element)가 매우 작은 영역을 점유하기 때문이다. 전체 센서가 더욱 클지라도, 상기 영역은 일반적으로 nm 내지 um 범위이다. 따라서, 고정화 또는 부착을 제어하기 위한 새로운 방법의 개발이 요구된다.
이에 본 발명자들은 UV 조사에 의해, 기판 표면에 형성된 PEI 층의 아민기가 제거(elimination)되어 숙신이미딜 에스테르에 대한 결합 특성(capability)을 잃는 것과, 기판 표면을 패턴화할 수 있는 것을 발견하고, 상기 패턴화된 표면 상에 고정화시킨 생체물질(예: 비오틴)에 선택적으로 결합한 물질(예: 스트렙트아비딘)의 시그널을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 제조된 바이오센서의 기판의 패턴에 생체물질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 이용한 생체물질과 결합하는 표적물질의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
(a) 기판에 실리콘 옥사이드 필름을 증착하는 단계;
(b) 상기 실리콘 옥사이드 필름 상에 폴리에틸렌이민 층을 형성하는 단계;
(c) 상기 폴리에틸렌이민 층 상의, 생체물질을 고정화하고자 하는 사이트를 선택적으로 마스킹(masking)하는 단계; 및
(d) 상기 기판을 자외선으로 조사하는 단계;
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz) 및 유리(glass)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 마스킹은 테플론 테이프, 알루미늄 호일 및 에나멜 구리 전선을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 조사는 220nm~300nm의 자외선으로, 10분 내지 1시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기한 방법으로 제조된 기판의 패턴 상에 생체물질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 생체물질은 아민-반응성 기와 공유결합을 형성하는 링커를 통해 상기 기판에 고정될 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 아민-반응성 기는 카르복실산 에스테르, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 무수물, 케톤, 알데히드, 할로, 이소티오시아네이트, 티오이소시아네이트, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 말레이미도, 에폭시 및 에텐술포닐기를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 생체물질은 효소, 단백질, DNA, RNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 바이오센서에 표적물질을 함유하는 시료를 적용하는 단계; 및 (ii) 상기 바이오센서 상의 생체물질과 특이적으로 결합하는 표적물질을 검출하는 단계;를 포함하는, 바이오센서를 이용한 생체물질과 결합하는 표적물질의 검출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법을 단계별로 설명하면 하기와 같다:
(a) 기판에 실리콘 옥사이드 필름을 증착하는 단계;
(b) 상기 실리콘 옥사이드 필름 상에 폴리에틸렌이민 층을 형성하는 단계;
(c) 상기 폴리에틸렌이민 층 상의, 생체물질을 고정화하고자 하는 소정의 사이트를 선택적으로 마스킹(masking)하는 단계; 및
(d) 상기 기판을 자외선으로 조사하는 단계;
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 기판은 그 위에 밀착성 피막의 형성을 허용하는 것이면 특별하게 한정되지 않지만, 특히 PEI층을 형성하기 위해서는 유리, 석영, 실리콘 웨이퍼 등의 기판이 바람직하다. 상기 기판은 사용 전 RCA 방법 등의 통상적인 방법으로 세정하고 건조하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서는, 상기 기판에 실리콘 옥사이드(SiO2) 필름을 증착했으며, 이는 PEI가 자발 흡수(spontaneous absorption)를 통해 실리콘 옥사이드 필름 상에 고정화될 수 있기 때문이다. 실리콘 옥사이드 필름의 증착은 예를 들어 열 화학기상증착(thermal CVD)법 등을 통해 수행할 수 있으며, 그 층의 두께는 약 500Å 내지 2000Å이 되도록 함이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같이 실리콘 옥사이드 필름이 형성된 기판을, 폴리에틸렌이민(PEI) 용액에 1시간 내지 6시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 디핑(dipping)방법으로 침지하여 기판 상에 아민기를 형성한다.
상기와 같이 아민기가 형성된 기판 상에, 형성하고자 하는 패턴의 형상을 한 마스크를 배치한다. 이때, 상기 UV에 대한 마스킹을 수행하기 위한 마스크(mask)로서, 그 재료는 빛을 차단할 수 있는 광(光)불투과성인 재료라면 제한되지 않으며, 그 형태는 패턴화하고자 하는 형상에 따라 제한되지 않으며, 일례로서 플레이트(plate) 형상일 수도 있고, 선(line) 형상일 수도 있다. 본 발명에서는 테플론 재질의 테이프를 사용하였으며, 이 외에도 알루미늄 호일, 에나멜 구리 전선 등도 사용 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서 패턴의 형상은 제한적이지 않다. 예를 들어, 상기 패턴은 고정화시키고자 하는 생체물질의 사용목적 또는 집적도에 따라 선형, 원형, 삼각형, 사각형 등의 다양한 형상을 가질 수 있다. 그리고 원형, 삼각형, 사각형 등의 패턴이 바둑판 형태로 배열된 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 표면 패턴은 직경(원형인 경우) 또는 한 면의 길이(삼각형, 사각형인 경우)가 최소 5 마이크로미터(㎚)를 가질 수 있으며, 구체적인 예로는 DNA (Cell) 칩 제작 시 20 마이크로미터(㎛) 내지 100 마이크로미터(㎛)를 가질 수 있다.
상기와 같이 마스크를 배치한 기판을, 자외선(이하 UV라고도 기재함) 영역을 포함하는 빛을 이용해 조사하면, 상기 마스킹되지 않은 표면의 아민기는 제거되며, 이는 구조적 변화에 의한 것으로 추정된다. 상기 UV 조사를 위해서는, 자외선 영 역, 바람직하게는 220㎚ ~ 300㎚ 파장 범위의 자외선, 특히 바람직하게는 260㎚ 이하의 단파장 자외선을 방사할 수 있는 광원을 사용하여 10분 내지 1시간 동안 조사를 수행하며, 상기 광원은 시판되는 제품을 쉽게 입수할 수 있다. 또한, 표면과 광원 사이의 거리는 표면상에 도달하는 에너지의 강도를 최대화할 수 있도록 가까울수록 좋으며, 예를 들어 2cm 이하, 특히 바람직하게는 0.5 cm일 수 있다. 상기와 같이 자외선으로 조사한 기판은 후처리 없이 바로 사용할 수 있다. 즉, 종래의 포토리소그래피법에서의 패턴 형성 후의 식각, 박리 등의 단계를 수행할 필요가 없는 것이다.
상기와 같이 제조된 패턴 상에는, 즉 마스킹 된 부분에는 아민기가 그대로 부착되어 있어, 이 아민기를 이용해 생체물질을 고정화하여 바이오센서로서 사용할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 기판의 패턴 상에 생체물질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 생체물질은 아민-반응성 기와 공유결합을 형성한 링커를 통해 상기 기판에 고정되어 있으며, 본 발명에서는 일단에 숙신이미딜 에스테르기를 가지고 타단에 비오틴을 갖는 링커가 고정화되고, 여기에 스트렙트아비딘으로 코팅된 자성입자가 결합되어 생체물질과의 결합 가능성을 나타내고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 링커는 칩 표면의 기능기와 반응하여 표면에 고정화되며, 동시에 생체물질이 갖는 기능기와 커플링 반응을 할 수 있는 반응기를 말단에 갖고 있는 화합물을 통칭하는 것으로, 상기 아민-반응성 기는 카르복실산 에스테르, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 무수물, 케톤, 알데히드, 할로, 이소 티오시아네이트, 티오이소시아네이트, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 말레이미도, 에폭시 및 에텐술포닐기를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한,
(i) 상기와 같이 제조된 바이오센서에 표적물질을 함유하는 시료를 흘려주거나, 상기 시료 용액에 침지하는 방법 등을 이용해 시료를 적용하는 단계; 및
(ii) 상기 바이오센서 상의 생체물질과 특이적으로 결합하는 표적물질을 검출하는 단계;를 포함하는, 바이오센서를 이용한 생체물질과 결합하는 표적물질의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 기판 상에 고정되는 생체물질은 일반적으로 분석하고자 하는 표적물질과 특이적 반응하는 특성을 가지고 있는 것이 일반적이다. 예를 들면, 상기 생체물질이 핵산인 경우 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산과 혼성화 반응을 통하여 상호 반응할 수 있다. 상기 생체물질이 단백질인 경우, 항원 및 항체 반응, 리간드 및 수용체 사이의 상호 반응, 효소와 기질 사이의 상호 반응 등을 통해 서로 특이적으로 상호 반응할 수 있다. 또한, 상기 생체물질이 다당류인 경우, 다당류를 인지하는 단백질 또는 항체에 의하여 특이적으로 인지될 수 있다. 이러한 생체물질과 표적물질의 특이적 상호작용과 이러한 상호작용의 결과를 검출할 수 있는 검출 시스템을 이용하여, 본 발명의 생체물질을 기판상에 고정화하여 수득될 수 있는 바이오센서를 여러 분석에 사용할 수 있다.
본 발명의 패턴의 제조 방법은, PEI층을 형성한 후 자외선을 조사하는 것만으로 바이오 센서의 기판 상에 원하는 형상의 패턴 형성이 가능하므로, 복잡한 공정 및 고가의 장비를 필요로 하는 종래의 바이오센서의 기판 패턴 제조 기술의 단점을 극복할 수 있다. 또한, 생체물질의 고정화가 기판의 패턴 제조 후 이뤄지므로 생체물질 고정화율이 높아질 수 있다는 장점을 갖는다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실시예 1. 바이오 센서의 기판 상 패턴의 형성
본 실시예의 개략도를 도 1에 나타내었다. 실리콘 웨이퍼(Nano fab center, 대전, 한국) 상에 SiO2 필름(10.0 nm)을 열 증착(thermal deposition)하였다. 상기 샘플을 1㎝ X 1㎝의 크기로 잘라 시편을 만들었다. 통상적인 RCA 방법(먼저, SiO2 표면상의 유기물질을 제거하기 위해, 온도 380K의 가열욕에서 용액(NH4OH:H2O2:탈이온수=1:1:5)으로 10분간 세척한다. 그 후, 표면에 존재하는 중금속 성분을 제거하기 위해, 온도 380K의 가열욕에서 용액(HCl:H2O2:탈이온수=1:1:5)으로 10분간 세척한다)으로 상기 시편의 유기물을 제거하였다. MeOH: HCl (1:1 v/v) 용액을 이용하 여 상기 시편의 표면을 실란올(silanol) 형태로 변환시켰다. 50mM Na2CO3 (pH 8.2)에 녹인 10% PEI(cat #. P3143, SIGMA, USA) 용액에 3시간 동안 담그는 디핑(dipping) 방법으로 Si-웨이퍼 표면을 PEI 층으로 코팅하였다. 인큐베이션 후, 탈이온수로 과량의 PEI를 제거하고, 수분은 질소 가스로 제거하였다. 생체물질을 고정화하고자 하는 기판 표면 상에 특정 패턴-본 실시예에서는 기판 상에 교차하는 십자 형상으로 형성-을 갖는 테플론 테이프를 붙였다. 암실에서, 상기 실리콘 웨이퍼를 254nm의 자외선으로 1시간 동안 조사하였다. 실리콘 웨이퍼와 UV 램프(Spectroline, ENF-260 C, USA) 사이의 거리는 0.5cm였다.
실험예 1. 표면 특성 분석
UV에 의한 기판 상의 패턴 형성을 측정하기 위해, 하기의 2가지 방법을 사용하였다.
[형광현미경 분석]
표면에 대한 UV 조사의 효과를 확인하기 위해, 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 이 실험을 위해, 분자의 한쪽 끝에 숙신이미딜 에스테르를 가지고, 다른 쪽은 354nm에서 최대 흡수 파장, 442nm에서 최대 방출 파장을 갖는 형광 화합물로 구성된 AMCA-X,SE [6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산, 숙신이미딜 에스테르] (Anaspec, USA)를 사용하였다. AMCA-X,SE는 생체물질을 태 깅(tagging)하기 위해 가장 널리 사용되는 형광 분자 중 하나로서, 모이어티의 한쪽 끝에 숙신이미딜 에스테르를 갖는다. 따라서, 이는 항체 및 단백질과 같이 아민을 함유하는 분자와 수용액 내에서 반응할 수 있다. 아미노헥사노일 영역(space) 또한 컨쥬게이션(conjugation) 동안 형광발색단(fluorophore)의 퀀칭(quenching)을 감소시킬 수 있다.
AMCA-X,SE 저장품(stock)은 AMCA-X,SE 10mg을 1.0ml의 DMSO에 녹여 준비했다. 표면에 도포하기 전, 저장 용액을 무-아민 PBS(amine-free phosphate buffer saline)와 25:75의 비율로 혼합하였다. 실시예 1에서 준비한 기판을 이 용액에 디핑하고, 30분간 인큐베이트하였다. 마지막으로, 샘플을 아르곤 가스로 건조시켰다. 형광 이미지를 350 nm 방출 파장을 갖는 형광원을 장착한 현미경으로 관찰하였다. 만약 UV에 노출된 사이트에서 형광이 관찰되지 않았거나 또는 동일 기판 상의 블로킹된 사이트에서 형광이 관찰되었다면, 기판의 아민기에 대한 UV 조사의 효과를 간접적으로 입증할 수 있는 것이다.
형광 현미경으로 관찰한 결과에 의하면, UV 조사부에서는 어떠한 형광도 나타내지 않았으나, 테플론 테이프로 커버했던 UV 블로킹부에서는 형광이 관찰되었다 (도 2 참조). 이 결과를 기초로, UV 블로킹부, 즉 패턴 형성부에서 선택적으로 아민과 AMCA-X,SE의 결합이 이뤄졌음을 알 수 있다.
[AR-XPS 분석]
PEI-코팅된 표면 상의 화학적 결합 상태(chemical bonding state)의 확인 및 정량화를 위해, AR-XPS(Axis-NOVA, Kratos사, UK) 및 술포숙신이미딜-6-[비오틴-아미노]헥산 (NHS-Sulfo-biotin, PIERCE사, USA)을 사용하였는데, 그 이유는 이 분자가 생체물질에 대한 화학적 링커로서 가장 널리 사용되는 분자 중 하나이며, 또한 실리콘 웨이퍼 및 PEI의 구성 성분이 아닌 황을 함유하고 있기 때문이다.
측정 전에, 시편을 500 ul의 PBS 버퍼(pH 7.4)에 2.2mg의 NHS-Sulfo-Biotin을 녹인 용액에 30분간 침적하였다. 그 후 시편을 탈이온수에 헹구고 질소 가스로 처리하였다. XPS 분석에 사용된 방사선원(radiation source)으로는 monochromatic Al-Kα(1486.6 eV)을 사용하였으며, 반구형 분석기를 사용하였다. 음극 전력(anode power)은 UHV(1.0 x 10-9 Torr)에서 75 W(5mA, 15kV)로 유지하였다. 표면 민감도(sensitivity)를 증가시키기 위해, AR-XPS는 분석기에 대해 0 내지 60°의 범위에 걸쳐 take-off angle(TOA)를 변경하며 수행하였다.
UV 조사부 및 블로킹부로부터 수득된, 1.2 eV의 스플릿(splitting)을 갖는 S2p 스펙트럼을 도 4에 나타내었다. 상기 AR-XPS 결과는 UV 조사 구역과 UV 블로킹 구역 사이에 유의한 상이성이 있음을 나타낸다. 164.0 eV에서의 S2p 피크는 S2 +로부터 발생된 것으로 이는 UV 블로킹부에 비오틴이 결합되었음을 나타낸다.
상기한 바와 같은 형광 현미경 및 AR-XPS의 결과로부터 단파장 UV 조사 (254 nm)가 실리콘 옥사이드 필름 상의 PEI 층 표면을 성공적으로 개질시켰음을 알 수 있었다. 형광 현미경 및 AR-XPS을 통해 AMCA-X,SE과 NHS-Sulfo-biotin의 컨쥬게이 션을 확인하지 못한 반면, AMCA-X,SE 및 NHS-Sulfo-biotin과 PEI층의 아민과의 컨쥬게이션을 통해 UV 조사의 효과를 확인하였다.
상기의 결과에 따라, PEI 표면 개질은 NHS-Sulfo-biotin과 같은 화학적 링커의 고정화를 제어하는데 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 이는 전체 폴리머 층의 특정 부분을 개질시킴으로써 특정 화학적 링커의 부착을 제어할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 패턴 상의 비오틴-스트렙트아비딘 결합 분석
상기 실시예 1에서 제조된 바이오센서 기판 패턴에 단백질인 스트렙트아비딘을 고정하기 위해, 실시예 1에서 준비한 시편을 500 ul의 PBS 버퍼(pH 7.4)에 2.2mg의 NHS-술포-비오틴(NHS-Sulfo-Biotin)을 녹인 용액에 30분간 침적하였다.
표면에 스트렙트아비딘이 코팅된 자성입자인 Dynabeads®-280(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway) 현탁액 100㎕을 PBS buffer로 세척한 후, 상기 세척 후의 자성입자 100㎕을 PBS buffer 100㎕로 다시 부유시켜, 자성입자 용액 100㎕을 제조하였다. 실온에서, 상기 자성입자 용액에, 상기 비오틴을 결합시킨 시편을 30분간 침적한 후 꺼내어 3차 증류수로 3회 세척하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 형광 반응은 상기 언급한 AMCA-X,SE를 이용하여 관찰하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 패턴화된 표면 상에 고정화된 비오틴에 선택적으로 결합한 스트렙트아비딘 자성입자의 형광 시그널을 확인할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법을 도시한 개략도.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 바이오센서의 기판의 패턴을 형광 현미경으로 관찰한 사진. UV에 노출되지 않은 부분이 십자 패턴으로 형성되어 있다.
도 3은 폴리에틸렌이민과 NHS-biotin이 결합된 분자 구조.
도 4는 PEI 층 상의 비오틴의 고정화에 대한 UV의 효과를 나타내는 AR-XPS 스펙트럼.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 바이오센서의 기판의 패턴 상에 스트렙트아비딘으로 코팅된 자성입자의 고정화를 나타낸 사진.

Claims (9)

  1. (a) 기판에 실리콘 옥사이드 필름을 증착하는 단계;
    (b) 상기 실리콘 옥사이드 필름 상에 폴리에틸렌이민 층을 형성하는 단계;
    (c) 상기 폴리에틸렌이민 층 상의, 생체물질을 고정화하고자 하는 사이트를 선택적으로 마스킹(masking)하는 단계;
    (d) 상기 기판을 자외선으로 조사하는 단계;
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz) 및 유리(glass)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 기판인 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 마스킹은 테플론 테이프, 알루미늄 호일 및 에나멜 구리 전선을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조사는 220nm~300nm의 자외선으로, 10분 내지 1시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이오센서의 기판의 패턴의 제조 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 기판의 패턴 상에 생체물질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 생체물질은 아민-반응성 기와 공유결합을 형성하는 링커를 통해 상기 기판에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 아민-반응성 기는 카르복실산 에스테르, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 무수물, 케톤, 알데히드, 할로, 이소티오시아네이트, 티오이소시아네이트, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 말레이미도, 에폭시 및 에텐술포닐기를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 생체물질은 효소, 단백질, DNA, RNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  9. (i) 청구항 5에 기재된 바이오센서에 표적물질을 함유하는 시료를 적용하는 단계; 및
    (ii) 상기 바이오센서 상의 생체물질과 특이적으로 결합하는 표적물질을 검 출하는 단계;
    를 포함하는, 바이오센서를 이용한 생체물질과 결합하는 표적물질의 검출 방법.
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